JP2008511556A - Ｃ型肝炎ウイルスに対するワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｃ型肝炎の治療処置及び予防治療のためのワクチン組成物に関する。本発明の組成物は、Ｃ型肝炎ウイルスに対する免疫応答の発生に増強効果を発揮する、適当な割合のＣ型肝炎ウイルス構造タンパク質を含有する。本発明はまた、前記ワクチン組成物を含む、病原性実体に対する複数の混合ワクチンにも関する。

Description

本発明は、免疫学の分野に関し、特に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する強力で多様な免疫応答を誘導することが可能なワクチン抗原組成物、及びこのワクチン組成物を含む、病原性実体に対する混合ワクチンに関する。

幾つかの障害が、ＨＣＶに対する有効なワクチンの生成を妨げているが、これはＲＮＡウイルスであるこのウイルスが、環境に応じて急速に変異できるためである。これは、世界中で同定された多重のウイルス単離に由来する配列の高度な多様性が原因である。主な異質性は、正確には中和エピトープを含む、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質にフレームされた超可変領域に集中している（Ｂｕｋｈら 米国特許第６，１１０，４６５号）。ＨＣＶは、有効な免疫応答の存在にもかかわらず、免疫力を有する者において持続感染を引き起こす。（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２０００年）Ｃ型肝炎のためのワクチン開発。（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２０：２１１〜２２６頁）。ＨＣＶ複製をサポート、中和抗体の存在を評価するために有効な動物モデル又はインビトロでの細胞培養系はない。この疾患の進行又は予防に関連付けられる免疫学的パターンは、完全に明確にはされていない。強力で、多重特異的な、長期の、体液性及び細胞性の両方の免疫応答は、恐らく、ＨＣＶ感染を解明するために必要とされる（Ｌｅｃｈｍａｎｎら（２０００年）Ｃ型肝炎のためのワクチン開発。（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２０：２１１〜２２６頁）。

ＨＣＶに対するワクチン開発のため、幾つかのアプローチが使用されている。これらのうち、組換えタンパク質、合成ペプチド、ウイルス様粒子、裸のＤＮＡ及び組換えウイルスは、広く評価されている（Ｄｅｐｌａら 米国特許第６，６３５，２５７号；Ｌｉａｎｇら 米国特許第６，３８７，６６２号；Ｐａｃｈｕｋら 米国特許第６，２３５，８８８号；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら 米国特許第６，６８５，９４４号）。

フラビウイルス科では、エンベロープタンパク質に対する抗体が防御をもたらすことができるため、タンパク質サブユニットに基づくワクチン開発は、ＨＣＶについて評価されたかつての戦略の１つであった（Ｍｉｎら 米国特許第５，９８５，６０９号）。ＨＣＶ構造抗原に基づく幾つかの戦略は、動物モデルにおいてウイルスに対する限られた防御を誘導した。これは、Ｅ１及びＥ２のオリゴマーで免疫されたチンパンジーの事例である。７頭のチンパンジーがワクチン接種され、７頭中５頭は防御され、２頭は発病したが、慢性期に達する前に治癒した（Ｃｈｏｏら（１９９４年）Ｃ型肝炎ウイルス感染に対するチンパンジーのワクチン接種。（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：１２９４〜９８頁）。このような防御は、ヒト細胞へのＥ２の結合を阻害できる抗体（Ａｂｓ）の存在と相関していた（Ｒｏｓａら（１９９６年）Ｃ型肝炎ウイルスに対する中和抗体を推定するための定量試験：標的細胞に結合しているエンベロープ糖タンパク質２の細胞蛍光評価。（Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｅｓｔ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ２ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ．）ＰＡＮＳ ＵＳ、９３：１７５９〜６３頁）。

遺伝子型１ｂ分離株由来の組換えＥ１タンパク質は、大きさ約９ｎｍの粒子に付随するホモニ量体として精製された（Ｍａｅｒｔｅｎｓら（２０００年）ＨＣＶ Ｅ１タンパク質を伴う治療ワクチン接種後の慢性感染チンパンジーにおける慢性活性Ｃ型肝炎の改善。（Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｃｔｉｖｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＨＣＶ Ｅ１ ｐｒｏｔｅｉｎ．）Ａｃｔａ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｂｅｌｇ．６３：２０３頁）。ＨＣＶに慢性感染したチンパンジー２頭は、組換えＥ１タンパク質５０μｇを９回服用した。ワクチン接種は、肝組織像を改善し、肝臓におけるウイルス抗原の消失及びアラニンアミノトランスフェラーゼ値（ＡＬＴ）の低下が検出された。治療中、血清ＡＲＮ値は変化しなかったが、治療終了後、肝臓の炎症及びウイルス抗原が再び現れた。Ｅ１に対する高い抗体レベル及び疾患の改善との間に相関が観察された（Ｍａｅｒｔｅｎｓら（２０００年）ＨＣＶ Ｅ１タンパク質を伴う治療ワクチン接種後の慢性感染チンパンジーにおける慢性活性Ｃ型肝炎の改善。（Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｃｔｉｖｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＨＣＶ Ｅ１ ｐｒｏｔｅｉｎ．）Ａｃｔａ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｂｅｌｇ．６３：２０３頁）。

組換えタンパク質由来のウイルス様粒子の形成、及びこのワクチンとしての使用は、これらの構造が、該ウイルスの特性を模倣していることが多いため、きわめて魅力的である（Ｌｉａｎｇら米国特許第６，３８７，６６２号）。ＨＣＶ構造抗原の配列を有する組換えバキュロウイルスで感染した昆虫の細胞から得られたこの性質を有する粒子は、このような抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を発生させることができる（Ｂａｕｍｅｒｔら（１９９９年）有力なワクチン候補としての昆虫細胞で合成されたＣ型肝炎ウイルス様粒子。（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ．）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１７：１３９７〜４０７頁；Ｌｅｃｈｍａｎｎら（１９９９年）昆虫細胞由来ＨＣＶ様粒子でのワクチン接種によるネズミにおける体液性及び細胞性免疫応答の誘導。（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｃｔ−ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ＨＣＶ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３０：４２３−２９頁）。

一方、幾つかのウイルス組換えベクターがＨＣＶに対する組換えワクチンを開発するために評価されている。特に、組換え欠損アデノウイルスは、その肝指向性（ｈｅｐａｔｒｏｐｉｓｍ）、体液性及び細胞性免疫を誘導する能力、並びに非経口及び経口経路による投与の可能性のため、魅力的な候補である。ＨＣＶ構造タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えアデノウイルスは、これらのタンパク質に対する抗体反応を誘発する（Ｍａｋｉｍｕｒａら（１９９６年）。組換えアデノウイルスを用いたマウスにおけるＣ型肝炎ウイルスの構造タンパク質に対する抗体誘導。（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １４：２８〜３６頁）。さらに、コア及びＥ１抗原を含有する組換えアデノウイルスによるマウスのワクチン接種後、これらの抗原に対するＴ細胞障害性特異的反応が検出された（Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏら（１９９７年）欠損組換えアデノウイルスを用いたＣ型肝炎ウイルス構造抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞反応の誘導。（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２５：４７０〜７７頁）。これらの結果は有望ではあったが、遺伝子治療における組換えアデノウイルスの使用に関する昨今の問題は、ヒトにおけるこの使用について幾つかの疑問を提起している。さまざまなＨＣＶ遺伝子を有する、ワクシニアウイルスなどの他の組換えウイルスの使用が、マウスにおける強力なＴ細胞毒性反応及びＴヘルパー反応を誘導した（Ｓｈｉｒａｉら（１９９４年）マウス及びヒトにおける細胞障害性Ｔ細胞により認識されたＣ型肝炎ウイルスのコア領域中のエピトープ。（Ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ．）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３３３４〜４２頁；Ｌａｒｇｅら（１９９９年）Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質による宿主免疫応答の抑制：Ｃ型肝炎ウイルス持続に対する影響の可能性（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：９３１〜３８頁）。それにもかかわらず、これらの組換えウイルス、並びにセムリキ森林ウイルスのようなアルファウイルスの他の変異体の使用は、これらの適用に関連した規制問題及び安全性問題により影響を受ける（Ｖｉｄａｌｉｎら（２０００年）Ｃ型肝炎ウイルスのコア及びＥ２抗原に対する免疫応答誘導のための従来型核酸ベース又は複製核酸ベースのワクチン及び組換えセムリキ森林熱ウイルス由来粒子の使用。（Ｕｓｅ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｏｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ａｎｄ Ｅ２ ａｎｔｉｇｅｎｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ ２７６：２５９〜２７０頁）。

ウイルスＨＣＶポリタンパク質における幾つかのＴ ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エピトープの同定は、このウイルスの解明に重要である可能性があり、これは、合成ペプチドをこの病原体に対するワクチン候補として使用する戦略を裏付けるものである（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら 米国特許第５，９８０，８９９号）。コア、ＮＳ４及びＮＳ５タンパク質由来のＨＣＶエピトープを含有する、単独又は脂質化されたさまざまなペプチドは、マウスにおける強力なＴ細胞毒性反応を誘導した（Ｓｈｉｒａｉら（１９９６年）細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープペプチドワクチンによる抗Ｃ型肝炎ウイルスＣＴＬのインビボ誘導のための内因性及び外因性ヘルパーエピトープの使用。（Ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｈｅｌｐｅｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（ＣＴＬ）ｗｉｔｈ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｉｎｅｓ．）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７３：２４〜３１頁；Ｈｉｒａｎｕｍａら（１９９９年）ヘルパーＴ細胞決定基ペプチドはＣ型肝炎ウイルスに対するペプチドワクチンによる細胞性免疫応答の誘導に寄与する。（Ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１８７〜１９３頁；Ｏｓｅｒｏｆｆら（１９９８年）複合的ＨＢＶ及びＨＣＶ ＣＴＬエピトープ反応に最も重要な脂質化ＨＴＬ−ＣＴＬ構築物のプール。（Ｐｏｏｌｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄａｔｅｄ ＨＴＬ−ＣＴＬ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｐｒｉｍｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＢＶ ａｎｄ ＨＣＶ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ、１６：８２３〜８３３頁）。

ＨＣＶに対するワクチン開発に使用される別の戦略は、線状エピトープに対する抗体産生の可能性に基づいている。この代替方法は、ウサギ及びチンパンジーにおいて、ＨＣＶ超可変領域１（ＨＶＲ−１）に対する抗体を産生させることで主に評価され、幾つかの有力な結果が得られている（Ｅｓｕｍｉら（１９９９年）チンパンジーにおけるＣ型肝炎ウイルスの組換えＥ１及びＥ２糖タンパク質並びに超可変領域１ペプチドの実験的ワクチン活性。（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ１ ａｎｄ Ｅ２ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ １ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ．）Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１４４：９７３〜９８０頁；Ｓｈａｎｇら（１９９９年）ウサギにおけるＣ型肝炎ウイルスの超可変領域１に対し幅広い交差反応性、高親和性を示す抗体。（Ｂｒｏａｄｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ，ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ．）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５８：３９６〜４０５頁）。ＨＶＲをＨＣＶワクチンの標的に選択することの主な問題は、このゲノム領域中の疑似種（ｑｕａｓｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）の存在に基づいている。

ペプチド性ワクチンアプローチの主な障害は、ヘルパー機能のないこれらのペプチドが、免疫原に乏しいことがある点に帰着し、ワクチンの有効性は、さまざまな抗原に対するきわめて幅広いスペクトルを伴う多価反応の誘導に基づく場合がきわめて多い。これらの限界は、この戦略の短所である。

ＤＮＡ免疫は、ＨＣＶに対するワクチンの開発のため幅広く研究されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら 米国特許第６，６５３，１２５号）。コアタンパク質は、完全長のこのタンパク質又はこのタンパク質の切断変異体を用いて、幾つかの発現ベクターに取り込まれている（Ｌａｇｇｉｎｇら（１９９５年）Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡに対する免疫応答。（Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５８５９〜５８６３頁；Ｃｈｅｎら（１９９５年）Ｃ型肝炎ウイルスコアタンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドによるマウスの遺伝子免疫。（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ．）Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓ．４：１３５〜１４４頁）。

他の遺伝子構築物には、５’非翻訳領域も含まれる（Ｔｏｋｕｓｈｉｇｅら（１９９６年）Ｃ型肝炎ウイルスコアＤＮＡベースのワクチン構築物に対する発現及び免疫応答。（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２４：１４〜２０頁）。ＨＢ表面抗原に対する融合変異体及び他のウイルス由来の融合変異体も研究されている（Ｍａｊｏｒら（１９９５年）Ｃ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドに対する免疫応答誘導のためのキメラベクターによるＤＮＡベースの免疫化。（ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ．）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５７９８〜８０５頁）。これらのベクターによる免疫化は主に、検出可能なリンパ球増殖反応及びＴ細胞リンパ球の細胞毒性反応を誘導している。

ＨＣＶエンベロープタンパク質も、この種の技術に対して興味深い標的を成している。Ｅ２の場合、体液性免疫応答は、ＨＶＲ−１に対するもののように思われる（Ｌｅｅら（１９９８年）Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープＤＮＡベースの免疫は体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｅｌｉｃｉｔｓ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ ８：４４４〜４５１頁）。免疫化が、Ｅ１及びＥ２タンパク質の分泌型変異体ベクターにより行われた際、非分泌型変異体と比較して免疫応答における差は検出されなかった（Ｌｅｅら（１９９８年）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子遺伝子を接種した２シストロン性プラスミドＤＮＡによるＣ型肝炎ウイルスエンベロープ特異的免疫の最適な誘導。（Ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｂｉｃｉｃｔｒｏｎｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ．）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４３０〜８４３６頁）。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ１及びＥ２タンパク質をコード化する遺伝子を独立に発現する２シストロン性プラスミドの接種は、体液性及び細胞性免疫応答を発生させ及び増加させる。最近では、両者が２シストロン性ベクターに含まれた場合の、これらのタンパク質の免疫原性効果が調べられ、インビボでのヘテロ２量体形成の可能性は、増加したり消失したりした。このような複合体が形成される場合、抗体反応は得られないことが確認された。著しい対照をなすものとしては、立体構造及び線状決定基に対する高い抗体価が、動物が両方の構造タンパク質の切断型を発現するプラスミドで免疫された場合に生じた。したがって、両方の抗原による免疫化を行う場合、良好な抗体反応を得るためには、ヘテロ２量体形成を回避する必要があると思われる（Ｆｏｕｒｎｉｌｌｉｅｒら（１９９９年）非共有結合Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープＥ１−Ｅ２複合体の発現は、ＤＮＡ免疫後の中和特性による抗体誘導に必要ではない。（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｅ１−Ｅ２ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４９７〜５０４頁）。

非構造タンパク質も、この技術を介して評価された。ＮＳ３タンパク質のＣ末端ドメインをコード化する領域は、このタンパク質及びＩＬ−２の同時又は独立の発現を可能にするベクターに取り込まれ、良好な結果を得ている（Ｐａｐａら（１９９８年）ＨＣＶ ＤＮＡ免疫のための多遺伝子プラスミドベクターの開発。（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ＨＣＶ ＤＮＡ ｉｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．）Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１４９：３１５〜３１９頁）。ＮＳ４及びＮＳ５タンパク質は、同様の方法でリンパ球Ｔ細胞毒性反応及び抗体反応を発生した（Ｅｎｃｋｅら（１９９８年）遺伝子免疫はネズミモデルにおけるＣ型肝炎ウイルスの非構造タンパク質に対する細胞性及び体液性免疫応答を発生する（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４９１７〜４９２３頁）。

最近では、ウイルスの非構造タンパク質をコードする遺伝子構築物（ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含め、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５）の使用が、強力な抗体反応を発生するほか、非構造タンパク質の各々に対するＴ細胞増殖反応の増加を生じることが確認された（Ｃｈｏら（１９９９年）筋肉内ＤＮＡ免疫における顆粒球マクロファージコロニー刺激因子遺伝子の共投与により増強されたＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質に対する細胞性免疫。（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１１３６〜１１４４頁）。

一般に、ＤＮＡ免疫後のさまざまなＨＣＶ抗原に対する抗体の産生に加え、有効な発現も報告されている。レベルは、試験での組合せによれば、１：１００〜１：１０００００の範囲であった（Ｉｎｃｈａｕｓｐｅら（１９９７年）Ｃ型肝炎タンパク質に対する免疫応答誘導のためのＤＮＡワクチン。（ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １５：８５３〜８５６頁）。また、特定の細胞毒性及びリンパ球増殖の改善も確認されている（Ｉｎｃｈａｕｓｐｅら（１９９７年）肝炎の分泌型又は非分泌型を発現するプラスミドＤＮＡの遺伝子免疫後の抗体及びＴヘルパー反応に関する比較研究。（Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｏｒ ａ ｎｏｎｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．）ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６：１８５〜１９５頁）。しかし、さまざまなＨＣＶタンパク質に対する十分に強力な体液性及び細胞性免疫応答を得るには、この方法を改善する必要がある。この意味で、ＤＮＡワクチン後に誘導される免疫応答を改善する幾つかの変異体が評価されている。これらは、アジュバントとしてのリポソームの使用（Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉら（１９９８年）ヨザルにおけるＢ型肝炎ＤＮＡワクチンに対する免疫応答：ワクチン剤形、投与経路及び投与方法の比較（Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ａｏｔｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ：Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ｒｏｕｔｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．）Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：１０９〜１１８頁）、モノホスホリル脂質Ａ及びサポニンＱＳ−２１（Ｓａｓａｋｉら（１９９８年）筋肉内及び経鼻経路を介したＱＳ−２１サポニンアジュバントを配合したＤＮＡワクチンによるヒト免疫不全ウイルス１型に対する全身性及び粘膜性免疫応答の誘導。（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｙ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｂｙ ａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＱＳ−２１ ｓａｐｏｎｉｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ｖｉａ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｒｏｕｔｅｓ．）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４９３１〜４９３９頁）である。一方、ＤＮＡ免疫における生物学的アジュバントとして樹状細胞が研究されている。ウイルスベクターを用いて腫瘍抗原を発現するためにエクスビボで遺伝的に改変された、マウスの骨髄由来樹状細胞で構成されるワクチンが使用され、マウスの腫瘍に対して細胞で媒介される、特異的腫瘍Ｔ細胞反応及び予防免疫を刺激するこのワクチンの能力が証明された（Ｓｐｅｃｈｔら（１９９７年）レトロウイルスによりモデル抗原遺伝子を形質導入された樹状細胞は確定した肺転移に対する治療に有効である。（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｄｅｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅ ａｒｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１２１３〜１２２１頁）；Ｂｒｏｓｓａｒｔら（１９９７年）ＣＴＬ誘導のための樹状細胞への抗原エピトープのウイルス媒介性送達。（Ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｍｅａｎｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＣＴＬ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３２７０〜３２７６頁）；Ｓｏｎｇら（１９９７年）モデル抗原のｃＤＮＡをコードするアデノウイルスベクターによる遺伝子改変樹状細胞は、予防的及び治療的抗腫瘍免疫を誘導する。（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ａ ｍｏｄｅｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１２４７〜１２５６頁）、ｏ ＡＲＮ（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら（１９９６年）ＲＮＡでパルスされた樹状細胞は、インビトロ及びインビボにおける強力な抗原提示細胞である。（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ ＲＮＡ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：４６５〜４７２頁）。

現在、発現抗原に対する免疫応答を増強するためのＣｐＧモチーフの挿入を含むベクターの改善、及びプラスミドの放出システムの改善は、この技術の限界を克服するための研究における不可欠の目的となっている（Ｈａｓａｎら（１９９９年）核酸免疫：第３世代ワクチンに伴う概念及び方法。（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２９：１〜２２頁）。

ＨＣＶにより提示される課題、及びこの病原体に対する防御と相関のある免疫学的パラメーターの明確な定義の欠如により、ＨＣＶに対する有効なワクチンは、免疫応答のさまざまな態様を刺激する多変量アプローチが必要であったと考えられる。この問題の解決は、これまでに調べられた幾つかのワクチンアプローチを組み合わせることにあると考えられる。この意味において、ＤＮＡワクチンによる初回免疫投与と、タンパク質又は組換えウイルスベクターのいずれか一方による追加免疫投与とを組み合わせる免疫スケジュールが評価され、たとえ陽性であっても、成分（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）の組合せによりＨＣＶに対する予防免疫を誘導することができたことを明らかにするためには、追加の検討が必要であるという結果が得られている（Ｈｕら（１９９９年）ＤＮＡベースの免疫により誘導されたＣ型肝炎ウイルスコアに対する体液性及び細胞性免疫応答の評価。（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：３１６０〜３１７０頁；Ｐａｎｃｈｏｌｉら（２０００年）ポリシストロン性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子によるＤＮＡプライム−カナリア痘ブーストは、ＨＣＶ構造タンパク質及び非構造タンパク質に対する強力な免疫応答を発生する。（ＤＮＡｐｒｉｍｅ−ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｂｏｏｓｔ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ｇｅｎｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＨＣＶ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８２：１８〜２７頁）。

さらに、Ｂ型肝炎モデルでは、Ｂ型肝炎表面抗原と、ＨＢｓＡｇに対するモノクローナル抗体及びこの抗原をコード化するプラスミドとの複合体により構成されたワクチン製剤が、評価されている（Ｗｅｎら 米国特許第６，２２１，６６４号）。この製剤は、さまざまな経路による抗原提示、及び別々の成分（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）により発生したものより高い免疫応答の迅速な誘導を可能にした。このように、有効なワクチン開発はきわめて重要であり、この著しい成功が見られるほかは、依然として検討中の課題である。

本発明では、Ｃ型肝炎ウイルスの構造抗原（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ）で構成されたワクチン製剤を記載する。Ｅ１及びＥ２タンパク質のみが使用された（単独又は併用で）、タンパク質を基にした以前のワクチン製剤とは対照的に、我々のワクチン製剤には、ＨＣＶコア抗原も含まれる。このワクチン組成物の柔軟性は、このワクチン製剤に使用される抗原量の範囲にある。これは、さらに、マウスモデルにおける組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する防御反応のほか、さまざまな抗原に対する強力な免疫応答（体液性及び細胞性）を同時に発生することが可能になる。

ＨＣＶに対する信頼性の高い、有効な治療ワクチンの開発が急務であることは、文献では十分に定着している。したがって、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの構造抗原の混合物で構成されたワクチン製剤を提供する。この場合、コアタンパク質、構造タンパク質Ｅ１及び構造タンパク質Ｅ２は、依然として慢性（だがこればかりではない）のＨＣＶ患者において、ＨＣＶに対する体液性及び細胞性の特異的免疫応答を誘導することができる。

本発明の新規性は、一定範囲の抗原の関係（ａ ｒａｎｇ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）、及び試験混合物で免疫した後に得られる防御効果が得られることにより与えられる。試験抗原は、ＨＣＶに対する免疫応答を発生することができる方法により魅力的なワクチン標的物となる。

特定の実現化では、ワクチン製剤は、この混合物中に存在し、コアタンパク質、Ｅ１及びＥ２がそれぞれ、（１．５〜２．５）：（１〜２．５）：（１〜２）の間で構成された抗原の一定範囲の関係を利用して、最適な体液性免疫応答を発生させる。別の実現化では、抗原は、コアタンパク質、Ｅ１及びＥ２がそれぞれ、（１．５：１．１：１）の関係で使用される。

本発明の具体的態様では、ワクチン製剤は、コアタンパク質、Ｅ１及びＥ２がそれぞれ、（１：５０）：（１２０〜１８０）：（１２０〜１８０）の間で構成された混合物中に存在する抗原の一定範囲の関係を利用して、最適な細胞性免疫応答を発生させる。別の具体的態様では、タンパク質抗原は、コアタンパク質、Ｅ１及びＥ２がそれぞれ、（１：１６０：１６０）の関係で使用される。

本発明のワクチン製剤は、経口及び非経口注射（すなわち、静脈内、皮下又は筋肉内）を含め、ワクチン投与に便利な任意の方法で、固形製品、液体製品又はエアロゾルとして投与することができ、さらに、この組成物は、アジュバント化される前にタンパク質抗原を混合する、又は抗原を個々にアジュバント化し、後でこれらを混合することのいずれかにより調製することができる。

本発明による抗原は、自然源から、又は以下に実証されているような任意の発現系の組換えＤＮＡ技術により得ることができる。本発明の具体的態様では、本発明に含まれるワクチン製剤は、さまざまな免疫スケジュールで投与することができる。

同様の方法で、他の多糖類抗原（結合又は非結合していない）及び／又はウイルス抗原及び／又は細菌抗原と混合されたこれらの抗原の組合せによる免疫は、したがって、結果的に、幅広いスペクトルの感染実体に対する免疫応答を発生させる。

本発明の別の具体的態様では、ワクチン製剤には、ＨＣＶ構造抗原と、ウイルス性及び／又は細菌性疾患に対する感染実体由来の抗原をコードするプラスミドとの組合せが挙げられる。

本発明の好ましいワクチン組成物は、その他の含有ウイルス抗原が、Ｂ型肝炎のコア及び／又は表面抗原、細菌抗原としての髄膜炎菌由来のプロテオリポソーム又は髄膜炎菌由来の精製外膜タンパク質、及びさらにキャリアタンパク質と結合した又は結合していない多糖類抗原である製剤である。これらは、ウイルス実体及び細菌実体に対する製剤中の有効成分として使用することができる。

本明細書に記載されたワクチン組成物は、ＤＮＡワクチンに基づく他のワクチン候補、すなわち、生きた組換えベクター、ペプチド及びタンパク質、との併用スケジュールにより投与することができる。これらは、肝硬変及び肝癌を伴う慢性Ｃ型肝炎患者におけるＨＣＶに対する免疫を誘導するために使用することもできる。

実現された方法での詳細な提示／実施例
（実施例１）
ＨＣＶタンパク質ワクチン製剤で免疫したマウスにおける、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する体液性、リンパ球増殖性及び機能的応答。
本ワクチン製剤投与後のＨＣＶに対する特異的及び機能的免疫応答の発生を示すため、ＨＣＶコア、Ｅ１及びＥ２抗原を混合し、水酸化アルミニウムでアジュバント化した後、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹の群）に腹腔内経路で接種した。免疫スケジュールとしては、０、７、１４日目の３度の接種があった。組換えワクシニアウイルスｖｖＲＥ（ＨＣＶ構造タンパク質を含む）への曝露に対する防御のほか、体液性及び細胞性免疫応答（リンパ球増殖反応）を、最後の接種から１５日後に試験した。この試験群を、表１に示す。

表１：本試験で使用される免疫原の調製

ＨＣＶ構造タンパク質に対する体液性免疫応答は、免疫酵素分析（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ポストテストとして、クルスカルワリス一元配置分散分析（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｏｎｅ Ｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ）及びダン法（Ｄｕｎｎ’ｓ Ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、結果を統計的に分析した。ｐ＜０．０５の結果を、統計的有意差とみなした。図１は、３種類のＨＣＶ構造抗原を特定の関係で投与する場合、これらの抗原に特異的な体液性免疫応答を得ることができることを示している。幾つかの組合せは、ＨＣＶタンパク質（コア、Ｅ１及びＥ２）に対する高い抗体価を提供したが、これらは、マウスを独立したタンパク質又はアジュバント単独で免疫した対照群で得られたものより、統計的に高かった。

ＨＣＶ構造抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）に対するリンパ球増殖反応（図２）は、各組合せに特徴的な挙動を示した。最適な細胞性免疫応答を発生させるため、これらのデータを後で用いて、最適な変異体（抗原の関係）を計算した。この結果を、免疫した動物の脾細胞の刺激指数で示す（^３Ｈ−チミジン取り込みにより計算）。図２に表された実験群は、表１に示されたものに対応し、水酸化アルミニウムのみで免疫したマウスに対応する陰性対照（群１７）も示されている。

試験製剤により発生した機能的免疫応答は、ｖｖＲＥに曝露した後に評価した。この動物を、免疫スケジュール終了後１５日目に、腹腔内経路で１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥに曝露させ、マウスの卵巣におけるウイルスの存在を、ウイルス接種後５日目に評価した。図３は、得られた結果を示しており、ここで、群１３は、陰性対照群と比べてウイルス価の２Ｌｏｇの低下を示した。図３に表された実験群は、表１に示されたものと対応した。

使用した変数（ワクシニアウイルスへの曝露に対する抗体反応、リンパ球増殖反応及び防御（図４））の機能性に基づいた表面応答分析を行い、変数の１つ１つについて最適な反応を得るための最良の抗原の関係を計算した。抗体反応では、使用される最適な抗原関係は、（１．５：１．１：１）：（コア：Ｅ１：Ｅ２）に対応するのに対し、最適な細胞反応を得るには、免疫に使用される最良の抗原関係は、（１：１６０：１６０）：（コア：Ｅ１：Ｅ２）であった。

（実施例２）
さまざまな範囲の抗原関係性を有するＨＣＶタンパク質製剤による免疫後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の評価。
良好な免疫応答を得るための、ワクチン製剤に使用される抗原の範囲を評価するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、実施例１で述べたのと同じ免疫スケジュール下、腹腔内で免疫した。ＨＣＶ抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）の関係を、表２に示す。この試験に使用した抗原量は、実施例１の表面応答分析の結果であった。体液性免疫応答では、試験した関係の範囲は、（１．５〜２．５）：（１〜２．５）：（１〜２）：（コア：Ｅ１：Ｅ２）であったのに対し、細胞性免疫応答では、試験した関係の範囲は、（１：５０）：（１２０〜１８０）：（１２０〜１８０）：（コア：Ｅ１：Ｅ２）であった。

表２．本試験で使用される免疫原の調製

ＨＣＶ構造タンパク質に対する体液性免疫応答を、図５に示す。試験された関係は、ＨＣＶ抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）に特異的な免疫応答を発生する。さまざまな変異体（細胞性応答に最適な変異体及び体液性応答に最適な変異体）により発生した体液性応答では、特定の抗原ごとに差異が観察されたにもかかわらず、統計的な差を見出すことはできなかった。図５に示された実験群は、表２に示されたものに対応した。

リンパ球増殖反応を、免疫したマウスの脾細胞を刺激した後、脾細胞における^３Ｈ−チミジン取り込みにより評価した。試験抗原に特異的なリンパ球増殖反応を、免疫したマウスで発生させた（図６）。図６に示された表示群は、表２に示されたものに対応し、さらに別の陰性対照（群１７）は、免疫していないマウスに対応する。試験した変異体の１つごと（それぞれ、細胞性応答に最適な変異体及び体液性応答に最適な変異体）に得られた刺激指数の間に、統計的有意差は観察されなかった。

免疫したマウスを、腹腔内経路で１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥに曝露した。ウイルス価を、ウイルス接種後５日目に、免疫したマウスの卵巣において評価した。図７は、得られた防御レベルを示している。ウイルス量の減少は、陰性対照と比べ混合物で免疫したマウスにおいて、主に、動物が、細胞性免疫応答を発生させるのに最適な変異体で免疫されたこれらの群において、統計的に有意であった（約２．５Ｌｏｇのウイルス価の低下）。図７に表された分析群は、表２に示されたものに対応し、さらに追加の陰性対照（群１７）は、免疫していないマウスに対応する。

（実施例３）
さまざまな免疫スケジュールに従いＨＣＶタンパク質製剤で免疫することによりＢＡＬＢ／ｃマウスに発生した免疫応答の評価。
免疫応答の発生における免疫時間の影響を分析するため、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、実施例１で述べた通り、最適な細胞性免疫応答を発生する変異体で、さまざまな時間間隔にて腹腔内経路により免疫した。群１は、０、１及び２週目に免疫した。群２は、０、２及び４週目に免疫した。群３は、０、３及び６週目に免疫したのに対し、群４は、０、４及び８週目に免疫した。ＨＣＶコア、Ｅ１及びＥ２タンパク質に対する抗体価は、ＥＬＩＳＡで評価した。この結果を図８に示す。最終免疫後１５日目にこれらを評価したとき、Ｅ１及びＥ２に対する抗体価に有意な統計的差は見られなかった。群１（０、１、２週目の免疫スケジュール）及び残りの群の間で、コア抗原に対する抗体価に有意な統計的差が観察された。

免疫したマウスのリンパ球増殖反応を、最終免疫後１５日目に評価した。試験変異体の各々の刺激指数の差と同様に、これらは統計的有意差ではなかった。得られた結果を、図９に示す。ここには、追加の陰性対照群も含まれており（群５）、免疫していないマウスに対応した。

ウイルス曝露に対する免疫したマウスの防御を、他の実施例で既に説明した通りに評価した。動物は、免疫スケジュール終了後１５日目に、腹腔内経路で１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥに曝露させ、マウスの卵巣におけるウイルスの存在を、ウイルス接種後５日目に評価した。図１０は、得られた結果を示している。ここでは、さまざまなスケジュールで免疫した群のウイルス価で観察された差は、統計的に有意ではなかった。この図には、別の陰性対照群も含まれており（群５）、免疫していないマウスに対応した。

（実施例４）
さまざまな経路で投与したＨＣＶタンパク質製剤による免疫後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の評価。
さまざまな免疫経路を介したワクチン製剤の投与も、試験した態様の１つであった。メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、さまざまな経路でＨＣＶ製剤で免疫し、最適な細胞性及び体液性免疫応答を発生させた。群１：皮下（ｓ．ｃ．）経路による体液性応答に最適な製剤、群２：腹腔内（ｉ．ｐ．）経路による体液性応答に最適な製剤、群３：筋肉内（ｉ．ｍ．）経路による体液性応答に最適な製剤、群４：鼻内（ｉ．ｎ．）経路による体液性応答に最適な製剤、群５：ｓ．ｃ．経路による細胞性応答に最適な製剤、群６：ｉ．ｐ．経路による細胞性応答に最適な製剤、群７：ｉ．ｍ．経路による細胞性応答に最適な製剤、群８：ｉ．ｎ．経路による細胞性応答に最適な製剤。

ＨＣＶ構造抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）に対する体液性免疫応答を、免疫スケジュール（０、１及び２週目）が終了した１５日後に試験した。得られた結果は、抗体レベルに統計的有意差があるにもかかわらず、使用した抗原に特異的な免疫応答が発生したことを示している。これらの差は、使用した免疫スケジュールによるものであり、この免疫スケジュールでは、免疫応答動態のため、幾つかの変異体については抗体反応の発生のほうが優遇される。ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．及びｉ．ｍ．経路を使用した場合、統計的有意差は観察されなかった。しかし、ｉ．ｐ．経路を使用すると、結果は上昇し、ｉ．ｎ．経路を使用すると低下した。この場合は、統計的有意差が観察された。この結果を、図１１に示す。

ウイルス抗原に対するマウスのリンパ球増殖性免疫応答を、最終免疫後１５日目に評価した。体液性免疫応答と同様に、試験群における刺激指数の差は、ｉ．ｎ．経路の場合は使用した抗原量によるものであり、全般としては（残りの免疫経路では）、免疫動態により免疫応答を発生した。各ＨＣＶ抗原に特異的なリンパ球増殖反応が発生した。それにもかかわらず、ｉ．ｎ．経路により得られた刺激指数は、他の免疫経路と比べ統計的に有意に低かった。図１２は、得られた結果を示している。この分析では、別の陰性対照群も含まれており（群９）、免疫していないマウスに対応している。

免疫したマウスのウイルス曝露に対する防御を、免疫スケジュールが終了した１５日後に、１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥの接種により評価した。曝露後５日目に、ウイルス量を、免疫し曝露したマウスの卵巣で判定した。図１３は、得られた結果を示している。ここでは、さまざまな免疫スケジュールに違いは観察されなかったが、ｉ．ｎ．経路では、ウイルス価の１Ｌｏｇの低下を示した。この実験には、免疫されていないマウスに対応する別の陰性対照群を含めた（群９）。

（実施例５）
さまざまなアジュバントを用いたＨＣＶタンパク質製剤による免疫後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の評価。
ワクチン製剤により発生させた免疫応答を増強するアジュバントの使用も、試験した。メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、以下の通り、最適な細胞性又は最適な体液性免疫応答を発生させるいずれか一方のワクチン製剤でｉ．ｐ．で免疫した。群１：水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ_３）における体液性応答に最適な変異体、群２：リン酸アルミニウムにおける体液性免疫応答に最適な変異体、群３：フロインドアジュバントにおける体液性免疫応答に最適な変異体、群４：油性アジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１）における体液性免疫応答に最適な変異体、群５：アジュバントなしの体液性免疫応答に最適な変異体、群６：水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ_３）における細胞性免疫応答に最適な変異体、群７：リン酸アルミニウムにおける細胞性免疫応答に最適な変異体、群８：フロインドアジュバントにおける細胞性免疫応答に最適な変異体、群９：油性アジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１）における細胞性免疫応答に最適な変異体、群１０：アジュバントなしの細胞性免疫応答に最適な変異体。免疫スケジュール（０、１及び２週目）の終了後１５日目に、ＨＣＶ構造ＨＣＶ抗原（コア。Ｅ１及びＥ２）に対する体液性応答を試験した。この結果は、全ての群で抗体価に差が認められたにもかかわらず、ＨＣＶ抗原に特異的な反応が発生したことを示している。抗体レベルは、水酸化アルミニウム（ＡｌＯＨ_３）及びリン酸アルミニウム中のワクチン変異体で免疫した群で類似していた。フロインドアジュバント中の製剤で免疫した群は、最も高い抗体価に達し、次いで、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１中の製剤で免疫した群が続いた。アジュバントなしの製剤で免疫した群では、特異的抗体反応があったが、得られた抗体価は、最も低かった。これらの結果を、図１４に示す。

ＨＣＶウイルス構造抗原に対するリンパ球増殖性免疫応答を、免疫スケジュールの終了した１５日後に、免疫したマウス由来脾細胞で評価した。最も高いリンパ球増殖指数は、それぞれフロインドアジュバント及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１において、細胞性応答に最適な変異体で免疫した群で観察された。水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム中の製剤で免疫した群のリンパ球増殖指数は、類似していた。細胞性免疫応答の最も低いレベルは、製剤をアジュバントなしで投与した場合に観察された。これらの結果を、図１５に示す。ここでは、免疫していないマウスに対応する陰性対照（群１１）を含めた。

ウイルス曝露に対する防御を、免疫スケジュールが終了した１５日後に、１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥの接種により評価した。曝露後５日目に、ウイルス価をマウスの卵巣で評価した。この結果を、免疫していないマウスに対応する追加の陰性対照（群１１）を含め、図１６に示す。体液性免疫応答に最適な変異体及び細胞性免疫応答に最適な変異体で免疫したマウスでは、どちらもフロインドアジュバントにおいて、それぞれ１．７及び２．４Ｌｏｇのウイルス価の低下が観察された。マウスでは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１中でアジュバント化した、体液性免疫応答に最適な変異体及び細胞性免疫応答に最適な変異体で免疫したマウスでは、それぞれ１．９及び２．５Ｌｏｇのウイルス価の低下が観察された。アルミニウム塩中の製剤で免疫したマウスでは、マウスの卵巣におけるウイルス価の低下は、最適な体液性免疫応答を誘導するための変異体及び細胞性免疫応答に最適な変異体の場合、それぞれ１．４Ｌｏｇ及び２．１Ｌｏｇであった。アジュバントなしで免疫した動物では、ウイルス価のわずかな低下しか観察されなかった。

（実施例６）
他のウイルス抗原と混合したＨＣＶタンパク質製剤による免疫後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の評価。
ＨＣＶ製剤（最適な細胞性免疫応答を発生するＨＶＣ製剤）と混合した他のウイルス抗原（Ｂ型肝炎表面抗原−ＨＢｓＡｇ、Ｂ型肝炎コア抗原−ＨＢｃＡｇ）による免疫応答の発生又は増強を、マウスで評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、以下によりｉ．ｐ．で免疫した。群１：ＨＢｓＡｇ−ＨＣＶワクチン製剤、群２：ＨＢｃＡｇ−ＨＣＶワクチン製剤、群３、ＨＣＶワクチン製剤、群４ ＨＢｓＡｇ及び群５ ＨＢｃＡｇ。使用した免疫スケジュールは、０、２及び４週目の接種であり、免疫応答は、最終免疫の１５日後に試験した。抗体反応は、ＨＣＶ構造抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）、並びにＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇに対して評価した。抗原特異的免疫応答の発生が確認された。ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇに特異的な抗体が発生した。群２（ＨＢｃＡｇ−ＨＣＶワクチン製剤）のＨＢｃＡｇに対する抗体価は、対照群（群５−ＨＢｃＡｇ単独）で発生したものと比べ、わずかに低かったが、これらの差は、統計的に有意ではなかった。ＨＢｓＡｇに対する抗体価は、対照群４（ＨＢｓＡｇ単独）と比べた場合、群１（ＨＢｓＡｇ−ＨＣＶワクチン製剤）で高く、この抗原に対する免疫応答の増強傾向を示しているが、観察された差は、統計的に有意ではなかった。これらの結果を、図１７に示す。

免疫したマウス由来脾細胞におけるリンパ球増殖性免疫応答を、免疫スケジュールの終了した１５日後に、ＨＣＶ構造ウイルス抗原、並びにＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇに対して評価した。図１８に示されている通り、ＨＣＶワクチン製剤及びウイルス抗原ＨＢｃＡｇ又はＨＢｓＡｇの混合物を対応する対照と比較した場合、刺激指数の差は観察されなかった。各ケースで、抗原特異的免疫応答が発生した。試験群の刺激指数を比較したところ、統計的有意差は観察されなかった。この実験には、免疫していないマウスに対応する、追加の陰性対照群（群６）を含めた。

免疫したマウスのウイルス曝露に対する防御を、免疫スケジュールが終了した１５日後に、１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥの接種により評価した。曝露後５日目に、ウイルス価をマウスの卵巣で評価した。図１９は、得られた結果を示している。ここでは、ＨＢＶウイルス抗原（ＨＢｓＡｇ又はＨＢｃＡｇ）と混合した又は混合していないＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウス群でのみ、ウイルス価の約２．５Ｌｏｇの低下が検出されたことが観察された。ウイルス価を比較したところ、統計的有意差は観察されなかった。ＨＣＶの陰性対照群では、曝露マウス由来の卵巣におけるウイルス量の減少は検出されなかった。免疫していないマウスに対応する追加の陰性対照（群６）を、この実験に含めた。

（実施例７）
細菌抗原と混合したＨＣＶタンパク質製剤による免疫後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の評価。
ＨＣＶワクチン製剤（ＨＣＶ最適細胞性免疫応答を発生する製剤）と、細菌抗原（髄膜炎菌由来の外膜タンパク質−ＯＭＰ）との組合せによる免疫応答の発生又は増強を、マウスを免疫した後に評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、以下によりｉ．ｐ．で免疫した。群１ ＯＭＰ−ＨＣＶワクチン製剤、群２、ＨＣＶワクチン製剤、及び群３、水酸化アルミニウムでアジュバント化したＯＭＰ。マウスは、０、２及び４週目に免疫し、免疫応答は、免疫スケジュールを終えた１５日後に試験した。体液性免疫応答は、ＨＣＶ構造抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）、及びキューバ株ＣＵ ３８５／８３の髄膜炎菌由来のＯＭＰ製剤に対して評価した。図２０は、ＨＣＶワクチン製剤と複数のＯＭＰとの組合せにより発生した抗体レベルは、ＨＣＶ非依存性抗原及びＯＭＰに対する反応を測定した場合、ＯＭＰ単独及びＨＣＶワクチン製剤により発生したものより高かったことを示している。これらの差は、統計的に有意ではなかった。

免疫したマウス由来の脾細胞におけるリンパ球増殖反応を、免疫スケジュール終了後１５日目に、ＨＣＶ構造抗原、及び髄膜炎菌ＣＵ ３８５／８３キューバ分離株由来のＯＭＰに対して評価した。図２１に示されている通り、ＯＭＰ−ＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスの脾細胞における刺激指数は、これらをＨＣＶ構造抗原及びＯＭＰで刺激した場合、対照群で観察されたものを考慮すると、増加が見られた。この刺激は、抗原特異的であった。この実験には、免疫していないマウスに対応する、追加の陰性対照群（群４）を含めた。

免疫したマウスにおけるウイルス曝露後の防御を、免疫スケジュール終了後１５日目に、１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥの接種により評価した。曝露後５日目に、ウイルス価を曝露したマウスの卵巣で評価した。得られた結果を、図２２に示す。両群（ＨＣＶワクチン製剤及びＯＭＰ−ＨＣＶワクチン製剤）で、ウイルス価の２Ｌｏｇの低下が見られた。対照群（ＯＭＰで免疫したマウス）では、卵巣におけるウイルス価の低下は観察されなかった。同様のことが、この実験に含めた、マウスを免疫しなかった別の陰性対照群（群４）で起こった。

髄膜炎菌に対し発生した抗体の機能活性を、血清殺菌力アッセイにより評価した。このアッセイでは、外因性補体源の存在下、抗体のインビトロでの殺菌能が測定される。表３に示された結果は、殺菌価が群１及び３で類似していたため、ＨＣＶワクチン製剤とＯＭＰとの混合物は、髄膜炎菌に対する特異的な機能性抗体の発生を阻害も増強もしないことを示している。

表３．ＣＵ ３８５／８３髄膜炎菌株に対する血清殺菌活性

^ａ殺菌価は、本アッセイで使用された初回細菌接種材料の５０％を致死させることができる最終血清希釈のＬｏｇ_２として表されている。

（実施例８）
多糖類と混合したＨＣＶタンパク質製剤による免疫後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の評価。
ＨＣＶワクチン製剤（最適な細胞性免疫応答を誘導するワクチン製剤）と混合した莢膜多糖類（Ｐ６４ｋキャリアタンパク質と結合した、髄膜炎菌血清型Ｃ由来の莢膜多糖類）により発生した免疫応答に対する影響を、以下により、ＢＡＬＢ／ｃマウスのｉ．ｐ．免疫後に評価した。群１：複合（ＭｅｎＣ−Ｐ６４ｋ）−ＨＣＶワクチン製剤、群２：ＨＣＶワクチン製剤、群３：複合（ＭｅｎＣ−Ｐ６４ｋ）。

免疫スケジュールは、０、２、４週目の接種から成り、免疫応答は、最終免疫後１５日目に試験した。

体液性免疫応答を、ＨＣＶ構造抗原（コア、Ｅ１及びＥ２タンパク質）、及び髄膜炎菌血清型Ｃ莢膜多糖類に対して評価した。

図２３は、この複合体と混合したＨＣＶワクチン製剤の組合せにより発生した抗体レベルを、ＨＣＶ構造タンパク質、及び血清型Ｃ由来の髄膜炎菌莢膜多糖類に対する反応を評価した場合、両方の成分の単独により得られたものと類似していたことを示している。

免疫したマウスの脾細胞におけるリンパ球増殖反応を、ＨＣＶ構造タンパク質に対して評価した。図２４に示されている通り、ワクチンコンビネーションＭｅｎＣ−Ｐ６４ｋ−ＨＣＶワクチン製剤及びＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスの脾細胞は、複合体でのみ免疫した対照群とは対照的に、ＨＣＶ構造領域由来抗原で刺激された。この実験には、免疫していないマウスを含む、別の陰性対照群、群４を含めた。

ウイルス曝露後の免疫したマウスの防御を、免疫スケジュール終了後１５日目に、１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥの接種により評価した。曝露後５日目に、免疫し曝露したマウスの卵巣におけるウイルス量の滴定量を評価した。図２５は、この結果を示し、複合体（ＭｅｎＣ−Ｐ６４ｋ）を伴う又は伴わないＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスの卵巣において測定したウイルス量に差は見られなかった。対照群と比べて、両群でウイルス価の２．１Ｌｏｇの低下が観察された。これらの群のウイルス価を、陰性対照群（複合ＭｅｎＣ−Ｐ６４ｋでのみ免疫したマウス）と比較した場合、この差は統計的に有意であった。免疫していないマウスに対応する追加の陰性対照（群４）を、この実験に含めた。

髄膜炎菌血清型Ｃに対して発生した抗体の機能活性を、外因性補体源が存在する場合の、抗体のインビトロでの殺菌能を測定する、殺菌力アッセイにより評価した。この意味で、表４に示された結果は、ＨＣＶワクチン製剤−ＭｅｎＣ−Ｐ６４Ｋ複合体の混合物は、複合ＭｅｎＣ−Ｐ６４Ｋにより生成した、髄膜炎菌に対する特異的及び機能的抗体の発生に影響しなかったことを示している。

表４．髄膜炎菌血清型Ｃに対する殺菌価

^ａ殺菌価は、本アッセイで使用された細菌接種材料の５０％を致死させることができる血清の最終希釈のＬｏｇ_２として表されている。

（実施例９）
ウイルス抗原をコードするプラスミドと混合したＨＣＶタンパク質製剤で免疫した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫応答の評価。
Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ｐＡＥＣ−Ｍ７−ＨＢｓＡｇ）及びコア抗原（ｐＡＥＣ−Ｍ７−ＨＢｃＡｇ）をコードするＤＮＡ免疫プラスミドの、ＨＣＶワクチン製剤（細胞性応答に最適な変異体）と混合した場合の免疫応答の発生における影響を、以下によりＢＡＬＢ／ｃマウスの筋肉内免疫後に試験した。群１−ｐＡＥＣ−Ｍ７、群２−ｐＡＥＣ−Ｍ７−ＨＣＶワクチン製剤、群３−ｐＡＥＣ−Ｍ７−ＨＢｓＡｇ、群４−ｐＡＥＣ−Ｍ７−ＨＢｓＡｇ−ＨＣＶワクチン製剤、群５−ｐＡＥＣ−Ｍ７−ＨＢｃＡｇ、群６−ｐＡＥＣ−Ｍ７−ＨＢｃＡｇ−ＨＣＶワクチン製剤、群７−ＨＣＶワクチン製剤。動物は、０、２、４及び６週目に免疫した。ＨＣＶ構造抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）、並びにＢ型肝炎ウイルス表面（ＨＢｃＡｇ）及びコア（ＨＢｃＡｇ）抗原に対する体液性免疫応答を評価した。得られた結果を、図２６に示す。ここでは、評価した抗原の各々に対する特異的応答の発生を観察することができる。一般に、プラスミドをＨＣＶワクチン製剤と混合した場合、ＨＣＶ構造抗原に対する抗体価は、ＨＣＶワクチン製剤単独により発生したものより高かった。これは、１つの傾向ではあったが、観察された差は、統計的に有意ではなかった。動物を、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをコードするプラスミド単独で、又はＨＣＶワクチン製剤との混合のいずれかで免疫した場合、これらの抗原に対する抗体価は類似していた。

免疫したマウス由来脾細胞におけるリンパ球増殖反応を、免疫スケジュール終了後１５日目に、ＨＣＶ構造抗原、並びにＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対して評価した。図２７に示されている通り、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ又はＨＢｃＡｇ）をコードするプラスミドと混合したＨＣＶワクチン製剤を、対応する対照と比較した場合、刺激指数の統計的な差は観察されなかった。この実験には、免疫していないマウスを含む、追加の陰性対照群（群８）を含めた。各ケースで、抗体特異的反応が発生した。刺激指数において検出された差は、試験群を比較した場合、統計的に有意ではなかった。同時に、プラスミドと混合した又は混合していないＨＣＶワクチン製剤のいずれかで免疫したマウスの統計的に有意な群間差は、脾細胞をＨＣＶ構造抗原で刺激した場合には観察されなかった。

免疫したマウスのウイルス曝露後の防御を、免疫スケジュール終了後１５日目に、１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥの接種により評価した。曝露後５日目に、免疫し曝露したマウスの卵巣におけるウイルス量を評価した。図２８は、得られた結果を示している。ここでは、プラスミドと混合した又は混合していないＨＣＶワクチン製剤のいずれかで免疫した群でのみ、ウイルス価の約２Ｌｏｇの低下が見られた。これらの群間でウイルス価を比較した場合、統計的有意差は見られなかった。ＨＣＶ陰性対照群では、免疫したマウスの卵巣におけるウイルス量は減少しなかった。この実験には、免疫していないマウスに対応する、追加の陰性対照群（群８）を含めた。

（実施例１０）
ＨＣＶ構造領域をコードするＤＮＡ製剤によりプライミング免疫し、試験したＨＣＶタンパク質製剤によるブースティング後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の評価。
ＤＮＡプライミングと（最適な細胞性免疫応答のための）ＨＣＶワクチン製剤によるブースティングとの組合せを、ＢＡＬＢ／ｃマウスで試験した。免疫スケジュールを、表５に示す。

表５．ＤＮＡとＨＣＶワクチン製剤によるブースターとの組合せの試験における免疫スケジュール

ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＤＮＡプラスミド製剤（Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａら（２００２年）ポリタンパク質をコードするプラスミドを用いるＤＮＡワクチン接種後にＣ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質に対して発生した免疫応答の増強。（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｓ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、３５、２０５〜２１２頁）でｉ．ｍ経路により免疫し、追加免疫投与量を、ｉ．ｍ経路により投与した。

体液性免疫応答を、ＨＣＶ構造抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）に対して評価した。得られた結果を、図２９に示す。ＨＣＶコア抗原に対する抗体反応の増強の証拠は見られなかった。タンパク質変異体で免疫した群で検出された抗体レベルは、ＤＮＡで免疫した群のものより高かったが、この差は統計的に有意ではなかった。

Ｅ１タンパク質に対する体液性免疫応答が、ＨＣＶワクチン製剤によるブースターを投与した場合に増強された。この場合、高い抗体レベルは、ＤＮＡで免疫した群と比較して、タンパク質変異体で免疫したマウス群で検出された。追加免疫投与の前後で、Ｅ１に対する抗体レベルに観察された差は、統計的に有意ではなかった。

この免疫レジメンを用いてＥ２タンパク質に対して検出された抗体レベルは、ＤＮＡで免疫したマウスで得られた抗体反応と比較して、タンパク質製剤で免疫した動物において高かった。追加免疫投与後、Ｅ２タンパク質に対して検出された抗体レベルは、変化しなかった。

免疫したマウスの脾細胞におけるリンパ球増殖反応を、最終免疫後１５日目に、構造ＨＣＶウイルス抗原に対して評価した。図３０が示す通り、タンパク質製剤で追加免疫されたマウス由来の脾細胞では、リンパ球増殖指数が上昇したが、この差は統計的に有意ではなかった。同様に、ＤＮＡで免疫され、タンパク質で追加免疫されたマウスのＨＣＶ構造抗原に対するリンパ球増殖反応は、Ｅ１タンパク質に対して著しく増加した。群間差は、統計的に有意ではなかった。

免疫したマウスのウイルス曝露に対する防御を、最終免疫後１５日目に、１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥの接種により評価した。曝露後５日目に、免疫し曝露したマウスの卵巣におけるウイルス価を測定した。図３１は、得られた結果を示している。ここでは、最適な細胞性ワクチン製剤で免疫した動物において、ウイルス量の約２Ｌｏｇ低下が検出された。ＤＮＡで免疫したマウスは、ウイルス価の１．２Ｌｏｇの低下を示した。最適な細胞性免疫応答のためのワクチン製剤による追加免疫投与後、ウイルス価の６．６Ｌｏｇ低下が、最適な細胞性応答のための製剤で最初に免疫した動物で観察された。ウイルス価の１．８Ｌｏｇ低下は、ＤＮＡで初回免疫され、ＨＣＶワクチン製剤で追加投与されたマウスで観察された。他の群では、マウスの卵巣におけるウイルス量の減少は観察されなかった。

（実施例１１）
さまざまな調製方法を考慮した、ＨＣＶタンパク質製剤による免疫後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫応答の評価。
組換えＨＣＶ構造タンパク質に対する免疫応答の誘導を、さまざまな形態による免疫原の調製後に試験した。以下の変異体を試験した：（１）３種類の抗原を混合し、その後水酸化アルミニウムでアジュバント化した、（２）各抗原を、初めに水酸化アルミニウムゲルで別々にアジュバント化し、その後混合して最終製剤を作製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、両方の製剤で免疫した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける最適な細胞性応答を誘導するためのワクチン製剤を使用した。

確立された免疫スケジュールは、０、２及び４週目であった。免疫応答を、免疫スケジュールを終了した１５日後に試験した。

抗体反応は、ＨＣＶワクチン製剤（コア、Ｅ１及びＥ２）中に存在する抗原に対して評価した。図３２は、各抗原に対して発生した抗体レベルが類似していたことを示している。試験群間の差は、統計的に有意ではなかった。

免疫したマウスの脾細胞におけるリンパ球増殖反応を、ＨＣＶ構造抗原に対して評価した。図３３に示されている通り、ＨＣＶ免疫原を調製する方法は、抗体特異的リンパ球増殖反応に影響しなかった。差は、試験群間で統計的に有意ではなかった。免疫していないマウスに対応する、別の対照群（群３）をこの実験に含めた。

ウイルス曝露に対する免疫したマウスの防御を、最終免疫後１５日目に、１０^６ｐｆｕのｖｖＲＥの接種により評価した。曝露後５日目に、免疫し曝露したマウスの卵巣におけるウイルス価を判定した。ウイルス価の対数で表された、免疫したマウスの卵巣で検出されたウイルス量は、試験群間の差が、統計的に有意ではないことを示した。これらの結果を、図３４に示す。免疫していないマウスに対応する別の対照群を、この実験に含めた（群３）。

ＥＬＩＳＡで評価したＨＣＶ構造タンパク質に対する体液性免疫応答；（Ａ）ＨＣＶコア抗原に対する応答、（Ｂ）Ｅ１タンパク質に対する応答、（ｃ）Ｅ２タンパク質に対する応答。 試験において組合せワクチンで免疫したマウス由来脾細胞における、ＨＣＶ構造タンパク質に対するリンパ球増殖性免疫応答；ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 組換えワクシニアウイルスに曝露後に評価した試験ワクチン製剤の機能的応答。 ＨＣＶワクチン製剤中に存在する成分の、（Ａ）体液性免疫応答、（Ｂ）リンパ球増殖性免疫応答、（Ｃ）組換えワクシニアウイルスへの曝露、に与える影響の解析。 （Ａ）ＨＣＶコア抗原、（Ｂ）Ｅ１タンパク質、（Ｃ）Ｅ２タンパク質に対するＨＣＶワクチン製剤に使用される抗原の相対的範囲による、体液性免疫応答に与える影響。 ＨＣＶワクチン製剤に使用される抗原の相対的範囲による、免疫したマウスの脾細胞におけるＨＣＶ構造タンパク質に対するリンパ球増殖性免疫応答への影響。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 ＨＣＶワクチン製剤に使用される抗原の相対的範囲による、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する、マウスで評価した機能的応答に与える影響。 さまざまな時間間隔（さまざまな免疫スケジュール）で免疫した後、ＥＬＩＳＡで評価したＨＣＶ構造タンパク質に対する体液性免疫応答。（Ａ）ＨＣＶコア抗原に対する応答、（Ｂ）Ｅ１タンパク質に対する応答、（Ｃ）Ｅ２タンパク質に対する応答。 さまざまな時間間隔（さまざまな免疫スケジュール）で免疫したマウスの脾細胞における、ＨＣＶ構造タンパク質に対するリンパ球増殖性免疫応答。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 さまざまな時間間隔で免疫したマウスの、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する機能的応答。 さまざまな経路によりＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスの、ＥＬＩＳＡで評価したＨＣＶ構造タンパク質に対する体液性免疫応答。（Ａ）ＨＣＶコア抗原に対する応答、（Ｂ）Ｅ１タンパク質に対する応答、（ｃ）Ｅ２タンパク質に対する応答。 さまざまな経路で投与された、ＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスの脾細胞における、ＨＣＶ構造タンパク質に対するリンパ球増殖性免疫応答。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 さまざまな経路で投与された、ＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスにおける、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対して評価された機能的免疫応答。 さまざまなアジュバントを用いたＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスにおける、ＥＬＩＳＡで評価したＨＣＶ構造タンパク質に対する体液性免疫応答。（Ａ）ＨＣＶコア抗原に対する応答、（Ｂ）Ｅ１タンパク質に対する応答、（ｃ）Ｅ２タンパク質に対する応答。 さまざまなアジュバントの、免疫したマウスの脾細胞におけるＨＣＶ構造タンパク質に対するリンパ球増殖性免疫応答に与える影響の図である。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 さまざまなアジュバントの、免疫したマウスにおける組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する機能的免疫応答に与える影響。 ＨＣＶワクチン製剤及びウイルス抗原の混合物でマウスを免疫した後、ＥＬＩＳＡで評価した体液性免疫応答。（Ａ）ＨＣＶコア抗原に対する応答、（Ｂ）Ｅ１タンパク質に対する応答、（Ｃ）Ｅ２タンパク質に対する応答、（Ｄ）ＨＢｓＡｇに対する応答及び（Ｅ）ＨＢｃＡｇに対する応答。 ＨＣＶワクチン製剤及びウイルス抗原の組合せで免疫したマウスの脾細胞におけるＨＣＶ構造タンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２）、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対するリンパ球増殖性免疫応答。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 ＨＣＶワクチン製剤及びウイルス抗原の組合せで免疫したマウスにおける、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する機能的免疫応答。 ＨＣＶワクチン製剤及び細菌抗原（髄膜炎菌由来の外膜タンパク質）の混合物で免疫した後、ＥＬＩＳＡで評価した体液性免疫応答。（Ａ）ＨＣＶコア抗原に対する応答、（Ｂ）Ｅ１タンパク質に対する応答、（Ｃ）Ｅ２タンパク質に対する応答、（Ｄ）髄膜炎菌由来の外膜タンパク質に対する応答。 ＨＣＶワクチン製剤及び細菌抗原（ＯＭＰ、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質）の組合せで免疫したマウスの脾細胞における、ＨＣＶ構造タンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２）及び髄膜炎菌由来の外膜タンパク質に対するリンパ球増殖性免疫応答。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリスから産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 ＨＣＶワクチン製剤及び細菌抗原（ＯＭＰ、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質）の組合せで免疫したマウスにおける、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する機能的免疫応答。 ＨＣＶワクチン製剤及び複合莢膜多糖類の混合物で免疫したマウスの、ＥＬＩＳＡで評価した体液性免疫応答。（Ａ）ＨＣＶコア抗原に対する応答、（Ｂ）Ｅ１タンパク質に対する応答、（Ｃ）Ｅ２タンパク質に対する応答、（Ｄ）髄膜炎菌由来血清型Ｃの莢膜多糖類に対する応答。 ＨＣＶワクチン製剤及び複合莢膜多糖類の混合物で免疫したマウスの脾細胞における、ＨＣＶ構造タンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２）に対するリンパ球増殖性免疫応答。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリスから産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 ＨＣＶワクチン製剤及び複合莢膜多糖類の混合物で免疫したマウスにおける、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する機能的免疫応答。 ＨＣＶワクチン製剤並びにＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをコードするプラスミドの混合物で免疫した後、ＥＬＩＳＡで評価した体液性免疫応答。（Ａ）対ＨＣＶコア抗原、（Ｂ）対Ｅ１タンパク質、（Ｃ）対Ｅ２タンパク質、（Ｄ）対ＨＢｓＡｇ、及び（Ｅ）対ＨＢｃＡｇ。 ＨＣＶワクチン製剤並びにＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをコードするプラスミドの組合せで免疫したマウスの脾細胞における、ＨＣＶ構造タンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２）、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇに対するリンパ球増殖性免疫応答。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 ＨＣＶワクチン製剤並びにＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原をコードするプラスミドの組合せで免疫したマウスの、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する機能的免疫応答。 ＤＮＡ、及びＨＣＶワクチン製剤による追加免疫投与の組合せで免疫したマウスの、ＥＬＩＳＡで評価した体液性免疫応答。（Ａ）対ＨＣＶコア抗原、（Ｂ）対Ｅ１タンパク質、（Ｃ）対Ｅ２タンパク質。 ＤＮＡ、及びＨＣＶワクチン製剤による追加免疫投与の組合せで免疫したマウスの脾細胞における、ＨＣＶ構造タンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２）に対するリンパ球増殖性免疫応答。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリスから産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 ＤＮＡ、及びＨＣＶワクチン製剤による追加免疫投与の組合せで免疫したマウスにおける、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する機能的免疫応答。 さまざまな様式で作製された、ＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスにおける、ＨＣＶ構造タンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２）に対する体液性免疫応答の図である。 さまざまな様式で作製された、ＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスの脾細胞における、ＨＣＶ構造タンパク質（コア、Ｅ１、Ｅ２）に対するリンパ球増殖性免疫応答。ＨＣｃＡｇ（ＨＣＶコア抗原）、Ｅ２−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ２）、Ｅ２−ｌｅｖ（酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）から産生され精製されたＥ２）、Ｅ１−ｃｏｌｉ（大腸菌から産生され精製されたＥ１）。 さまざまな様式で作製された、ＨＣＶワクチン製剤で免疫したマウスにおける、組換えワクシニアウイルスへの曝露に対する機能的免疫応答。

Claims (13)

1. Ｃ型肝炎ウイルス構造抗原（コア、Ｅ１及びＥ２）の最適な組合せを特徴とし、任意のタイプのアジュバントを用いて投与される、Ｃ型肝炎ウイルス感染に対する防御的な細胞性及び体液性免疫応答を発生させるためのワクチン組成物。
2. 最適な体液性免疫応答を発生させるために、使用される抗原量が、割合［（１．５〜２．５）：（１〜２．５）：（１〜２）］：［コア：Ｅ１：Ｅ２］の範囲にある、請求項１に記載のワクチン組成物。
3. 使用される抗原量が、割合（１．５：１，１：１）：（コア：Ｅ１：Ｅ２）に相当する、請求項２に記載のワクチン組成物。
4. 最適な細胞性免疫応答を発生させるために、使用される抗原量が、割合［（１：５０）：（１２０〜１８０）：（１２０〜１８０）］：［コア：Ｅ１：Ｅ２］の範囲にある、請求項１に記載のワクチン組成物。
5. 使用される抗原量が、割合（１：１６０：１６０）：（コア：Ｅ１：Ｅ２）に相当する、請求項４に記載のワクチン組成物。
6. このワクチン組成物が、さまざまな免疫スケジュールで投与される、請求項１から５に記載のワクチン組成物。
7. 請求項１から５に従う、有効成分であるＣ型肝炎ウイルス構造抗原の混合物が、（複合又は非複合）多糖類並びに／又はウイルス及び／若しくは細菌抗原と組合わされている、ウイルス性及び／又は細菌性疾患に対する混合ワクチン組成物。
8. 請求項１から５に従う、有効成分であるＣ型肝炎ウイルス構造抗原の混合物が、感染体の抗原をコードするプラスミドと組合わされている、ウイルス性及び／又は細菌性疾患に対する混合ワクチン組成物。
9. 使用されるウイルス抗原が、Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原及び／又は表面抗原である、請求項７に記載の混合ワクチン組成物。
10. 使用される細菌抗原が、独立した又はワクチン製剤に含まれた、髄膜炎菌由来の外膜タンパク質である、請求項７に記載の混合ワクチン組成物。
11. キャリアタンパク質と結合した又は結合していない多糖類抗原が、病原体に対する製剤中の有効成分として使用される、請求項７に記載の混合ワクチン組成物。
12. ＤＮＡ構築物、生きたウイルスベクター、ペプチド及びタンパク質に基づく他のワクチン候補との併用スケジュールで投与される、請求項１から５に記載のワクチン組成物。
13. 慢性Ｃ型肝炎、肝硬変及び肝臓癌患者におけるＣ型肝炎ウイルスに対する免疫を誘発するための、請求項１から５に記載のワクチン組成物。