TW201735945A - 包括b型肝炎病毒之表面及核殼體抗原的藥學組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明揭露包括B型肝炎病毒(HBV)之表面抗原(HBsAg)以及相同病毒之核殼體(或核心)的抗原(HBcAg)的藥學組成物。該組成物之HBcAg含有呈一超過在此抗原中之核糖核酸(RNA)總量的45%之比例的信使核糖核酸(mRNA)。由於形成本發明組成物的該等抗原之組成改變,本發明的組成物對於慢性B型肝炎之預防或治療是有用的。本發明亦涵蓋此藥學組成物在用於對抗HBV感染之免疫-預防或免疫療法之藥物的生產上之用途,及其用於提升對抗一與這些抗原之混合物共-投藥的額外抗原之免疫反應的用途。
Description
發明領域 本發明是有關於醫學領域,具體地是疫苗學的分支,且特別地是具有經提升的效力之疫苗組成物的開發。這些組成物包括在其化學組成上有經過修改的B型肝炎病毒(HBV)之抗原,該修改意外地增加了其免疫原性。在其化學組成上有經過修改的HBV抗原為表面抗原(surface antigen, HBsAg)及核心抗原(core antigen, HBcAg)。
發明背景 世界衛生組織(WHO)認為:基於感染之血清學標記(serological markers)的存在,近一半的世界人口已受到HBV感染。已有估計:大約5至10%的成人及高達90%的受HBV感染的新生兒會發展出慢性B型肝炎(CHB)。現今,350百萬的人具有持續性或慢性感染。歷時長時間期間的病毒持續複製會導致肝發炎性進程,其造成25%之受感染人口因為肝硬化、肝細胞癌或是由於其他併發症(諸如腹水、食道出血以及脾腫大)而死亡。儘管近年來普遍有對新生兒與孩童進行疫苗接種因而伴隨著減少新HBV感染的發生,在全球規模上來說CHB仍然是一個重大的健康問題(Hilleman, M.R. Vaccine (2001), 19, 1837-48)。
使用下述藥物來治療是CHB治療法的最新技術,即干擾素α (IFN-α)、其聚乙二醇化變異體(pegilated variant)(PegIFN)以及核苷酸與核苷類似物(nucleoside analogues)[諸如泰諾福韋(Tenofovir)、恩替卡韋(Entecavir)、拉米夫定(Lamivudin)]。一般而言,在治療後,這些藥物在持續清除HBV的方面上具有較差的效力,而且它們的使用與重大的不良事件(adverse events, AE)有關,而此是被廣泛地承認的(Nash K. Adv Ther (2009), 26:155-169; Yang N, Hepatol Int. 2015 Sep 12. (Epub ahead of print) PubMed PMID: 26363922)。
如同免疫療法的策略,在CHB治療中使用疫苗配方是一個令人感興趣的嘗試。病毒的持續存在(viral persistence)已與抗-HBV之細胞免疫力的發展缺陷被聯想在一起。自1980年代初期起,疫苗策略就已經被聚焦在提升及增強CHB病患的T細胞的微弱反應上。起初這些免疫療法策略使用市售的抗-HBV疫苗是為了導入抗HBV的特異性CD4+與CD8+反應及用於控制病毒複製之促-發炎細胞激素。因此,幾乎所有的市售預防性疫苗皆是單獨地被測試或與傳統的抗病毒療法一起被測試。在先前的治療性疫苗的研究中,疫苗是連同或不連同其他抗病毒治療法而被施予。此外,使用市售疫苗的免疫療法也提出了具有較大接種量的計畫,且替代的非經腸道之途徑也被探討。主要的研究被概述如下。
一在CHB病患中使用Genhevac B®
(Aventis Pasteur,法國,在-CHO哺乳類細胞中被製造)的試驗性疫苗接種研究顯示出,HBV複製在大約50%的慢性帶原者中減少(Pol S,et al
. C R Acad Sci III (1993), 316:688-91)。另一個有安慰劑對照的多中心研究(placebo controlled multi-center study)亦評估了Genhevac B®
疫苗及酵母菌所生產的疫苗(yeast produced vaccine) Recombivax®
(Merck Sharp Dohme-Chibret,法國)。在第六個月時,在分別被接種以Genhevac®
及Recombivax®
的組別中有觀察到顯著的差異(3%、20%以及22%)。然而,該差異在第12個月消失(Pol S, J Hepatol (2001); 34:917-21)。被推論的是:沒有觀察到明顯的效益,而且存在於Genhevac®
中的pre-S2抗原似乎不具有任何的額外效用。
其他評估治療性的Genhevac®
疫苗的研究(Yalcin K,et al.
Infection (2003), 31: 221-225; Dikici B,et al.
J Gastroenterol Hepatol(2003), 18(2): 218-22)僅顯示出些微與治療相關的效益。
CHO所生產的疫苗Hepagene®
(Medeva Ltd., UK)包括三種HBsAg的變異體(L、S與M),而它們在健康的自願者及不反應者(non-responders)中的結果顯示出高位準的免疫原性(Page M,et al.
Intervirology (2001), 44:88-97; Yap I,et al.
Ann Acad Med Singapore (1996), 25: 120-122; Zuckerman JN,et al.
BMJ (1997), 314: 329; Jones CD,et al.
Vaccine (1999), 17(20-21): 2528-37)。將此納入考量後,有一研究被執行以評估其治療潛力。以其間具有5個月間隔之兩個4次接種的循環來施予8次20 μg之疫苗的給藥(Carman WF,et al.
J Hepatol (2001); 34:917–921)。在計畫終止時,22位完成該計畫的病患中的8位具有持續的HBV廓清(sustained clearance of the HBV),並且7位病患清除了HBeAg。無對照限制測試(uncontrolled limited test)之後有一個使用了更大數量病患的對照測試(controlled test)。在這個使用了103名HBeAg陽性之慢性病患的第二個臨床試驗中,疫苗或安慰劑的四次給藥是以一個月及8個月的間隔來施予,且隨後,令所有個體以一個月的間隔來接受8次額外的給藥。在治療終止時,沒有獲得顯著的臨床效益(Medeva PLC. http://www.investegate.co.uk/article.aspx?id=200001171532169093D (於Oct 20, 2015參考))。
為了有助於抗病毒之免疫反應的進展,在治療上已將治療性疫苗與傳統的抗病毒療法相結合。這個策略將拉米夫定在提升特異性T-HBV細胞在末梢血液中的頻率上之效用(由於病毒複製的抑制所導致)的發現納入考量(Bertoletti Aet al.
Expert Rev Gastroenterol Hepatol(2009), 3(5): 561-9)。
雖結合有抗病毒疫苗接種策略應有助於一針對HBV的較大T細胞反應性,但該策略被認為是更安全的,因為其會避免因免疫系統的活化所造成的肝損傷。無論如何,沒有證據顯示:在CHB病患中由疫苗所造成之特異性免疫反應的活化會引起猛爆性肝炎。
一個於2002年發表的研究在帶有CHB的病患中評估了Engerix B®
(GlaxoSmithKline)疫苗與拉米夫定之經皮內的(ID)投藥(Dahmen A,et al
. J Med Virol 2002; 66:452-60)。合併以拉米夫定的每日投藥,每月一次,六次Engerix B®
的給藥被使用。一額外的組別接受了相同治療,連同每日經皮下的(SC)介白素2(IL-2)之投藥。完成該療法以後,9位第一組病患中的7位以及5位第二組病患中的2位已將其病毒量(viral load)減低至無法測得的位準。四位反應者(responders)清除了病毒並且使轉胺酶正常化。在另一臨床試驗中,評估了透過ID途徑之治療性疫苗接種的組合,其使用一含有配於明礬(alum)中的HBsAg之疫苗及拉米夫定的每日投藥歷時一年(Horiike N,et al
. J Clin Virol (2005), 32: 156–161)。這些研究顯示:對CHB病患而言,該合併療法是有效的並且伴隨著少許的併發症。無論如何,在這兩種案例中有使用ID途徑,而且這可能有助於疫苗的免疫原性。
在一使用拉米夫定的合併療法中,被配製於一強效的佐劑中的相同表面抗原並非有效的,因此暗示:免疫接種途徑的效用不應被忽略,而且這對於疫苗接種的未來而言可能是一個關鍵的要素。
針對病毒負荷量抑制(viral load suppression)的情況,終止了長臨床評估期的疫苗候選者之研究是Vandepapeliere等人的報告(Vandepapeliere P,et al
. Vaccine (2007) Dec 12; 25(51):8585-97)。這是一個對以一被吸附的HBsAg配方為基礎的疫苗候選者進行臨床評估的研究,其透過肌肉內(IM)途徑注射以100 μg的HBsAg,並連同一油性佐劑及強效的免疫-調控子,諸如單磷醯脂質A (lipid monophosphoryl A)以及皂素QS21 (saponin QS21)。當相較於單獨使用抗病毒劑予以治療的對照組時,在經降低的病毒負荷量情況下的十次投藥沒有顯示出與病毒學反應相關的優勢。
在宿主的免疫反應之特性上的知識量及在傳統疫苗之治療性用途上的知識量建議:以朝向誘導出一強烈且持續的對抗HBV抗原之T細胞反應活性為目標的策略是可行的,並且代表了令人滿意的CHB病患治療的希望。
抗核殼體抗原之免疫刺激的不存在可能是以HBsAg為基礎之治療性疫苗接種失效的一個主要免疫學標記。事實上,治療性疫苗接種在CHB中的目標是引發相同的自然免疫機制,其在急性B型肝炎期間生效並且是受自我控制的(self-controlled)或在CHB中歷經血清抗體轉換(seroconversion)。若一免疫療法未能激發出這些免疫反應,其將可能無法誘導出血清抗體轉換。
對於抗原的挑選與疫苗接種策略而言,配方的改良也許是突破這些困境的一個方式。套膜之蛋白質特性提供了將其納入治療性疫苗的理由。實際上,套膜的蛋白質含有許多B與T細胞的抗原決定位(Penna A,et al
. J Virol (1992), 66(2):1193-6; Nayersina R,et al
. J Immunol (1993), 150:4659-71),而且被估計的是:抗-套膜的抗體藉由下述方式扮在病毒抑制上演一關鍵的角色,即自循環中移除自由病毒顆粒(free viral particles)以及預防可感染性細胞(susceptible cells)的再-感染的方式。另一方面,高位準的HBsAg在CHB病患的血清中循環;這個現象可能藉由T細胞的耗竭(exhaustion)以及抗-HBs抗體生成的抑制而在維持免疫耐受性上扮演一主要的角色(Nagaraju K,et al
. J Viral Hepat (1997), 4:221-30)。
在此意義下已暗示著:HBcAg是應當被包括在一用於CHB的治療性疫苗內之主要的抗原候選者。在急性自癒性肝炎期間,T細胞的抗原決定位反應被強烈地促進,並且在自發性的或治療所引起的CHB中之血清抗體轉換期間是顯著的(Ferrari C,et al
. J Clin Invest (1991), 88:214-22; Marinos G,et al
. Hepatology (1995), 22:1040-9; Tsai SL,et al
. Clin Invest (1992), 89:87-96)。
至今,沒有抗-B型肝炎的市售疫苗已顯示出足夠的臨床結果而能容許其與目前的治療法相競爭或能單純地支持將其引入醫療實務中。然而,這些疫苗已在治療領域創造出極高的期待,不只是在抗-B型肝炎的免疫療法的環境中,亦在諸如人類免疫缺乏病毒(HIV)的感染與癌症之其他疾病以及其他無論可傳染(contractible)與否的慢性疾病的環境中。因此,此策略要求:要對新的疫苗構思進行臨床評估並且對所有相關因子進行最佳化。在此意義下,除了HBsAg之外還包括HBcAg的治療性疫苗候選者是這些免疫療法策略的發展結果。
基因工程與生物技術中心(the Center for Genetic Engineering and Biotechnology, CIGB)生產出HBsAg,其為在宿主酵母菌嗜甲醇酵母菌(Pichia Pastoris
)中所獲得之重組型蛋白。自1990年代初期起,此抗原已被包括在預防性疫苗Heberbiovac HB®
中(Muzio V,et al
. Biotecnología Aplicada (2001) 18; 103-104; ul-Haq N,et al
. Vaccine (2003) 21:3179-85)。
此外,CIGB發展出一延長抗B型肝炎的免疫反應的配方;此配方包括作為主要組份的HBsAg以及HBcAg;該等抗原透過黏膜途徑來投藥以生成系統性及黏膜性反應(歐洲專利序號EP 1136077)。在此同一中心的另一份專利文件中,描述了形成粒子之經凝集的抗原結構的生成。此文件顯示:凝集作用、脫脂作用或氧化作用與30-500 nm之粒子的挑選以及適當地調配這些凝集體(aggregates)有助於所形成之抗原製劑的免疫原性(歐洲專利序號EP1346727)。將在這二篇專利文件中所敘述的策略相結合,CIGB發展出被稱為NASVAC的治療性疫苗候選者(Lobaina Y,et al
. Mol Immunol (2015), 63:320-327),其是透過免疫接種途徑的組合來投藥。該疫苗配方的臨床結果相當引人注目;然而,該產品的效力需使用更強效的免疫原來予以提升。
包括主要HBV抗原(諸如HBsAg以及HBcAg)的疫苗策略已生產出具有某種抗病毒效力的配方。然而,為了提升具有持續的抗病毒反應的病患數目並達成將HBsAg血清抗體轉換為抗-HBsAg的病患數目,該策略的改良是需要的。
發明概要 本發明藉由提供一藥學組成物來幫助解決如上所述的問題,該藥學組成物之特徵在於:1) HBV的HBcAg抗原,其包括呈一超過此抗原之總核糖核酸(RNA)的45%之比例的信使核糖核酸(mRNA),以及2) HBV的HBsAg抗原。在本發明的一個具體例中,該藥學組成物包含有HBsAg,其包括呈一超過形成此抗原之總脂質的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。
將以此特定方式修改化學組成的HBsAg及HBcAg抗原納入有助於此組成物對於免疫療法之免疫學及抗病毒特性。然而,上述的修改不影響本發明的HBsAg及HBcAg抗原的蛋白質組成,因為相較於其未經修改的變異體,其一級、二級和三級結構仍維持相同。儘管如此,這些修改引發了這些抗原的意外特性,而產生了更強效的免疫原。再者,這些經修改的抗原的結合致使一對於CHB治療具有更高的治療性抗病毒效力的配方。
在本發明中該HBcAg是以呈一超過45%之位準的mRNA而獲得。在一個特定的情況下,此經修改的抗原是由於結合了其發酵製程參數上的改變而獲得。在此情況下,使用一化學限定培養基及低的比生長速率,產生出一HBcAg的變異體,其中mRNA的比例相較於存在於其中的其餘RNA是增加的。
雖然在大腸桿菌(Escherichia coli
)中所獲得的HBcAg之高免疫原性以及一個核酸組份在完全顆粒化的抗原(complete particulated antigens)(共183個胺基酸)之免疫原性中的關係已經被描述過,直到本發明為止,各個RNA變異體對HBcAg的最終免疫原性的具體貢獻之相對影響仍是未知的。意外發現是:相較於未經修改的HBcAg,具有一超過45%之mRNA位準的HBcAg是更具免疫原性的,並且發展出一更強的Th1反應。
所偵測到的mRNA比例改變未影響存在於該粒子內之總RNA的含量(相對於蛋白質含量)。意外地,被發現的是:相較於所獲得之在其mRNA含量上沒有經過修改的HBcAg,在總RNA內含有超過45% mRNA的HBcAg具有一較高的免疫原性。此免疫原性的增加包括在對CHB基因轉殖小鼠及病患進行免疫接種後Th1細胞激素的顯著增加,以及經提升之清除循環HBsAg(circulating HBsAg)的能力。
另一方面,在本發明中我們評估了含有磷脂醯絲胺酸的HBsAg,該磷脂醯絲胺酸是呈一超過存在於此脂蛋白抗原中之磷脂總量的5%之位準。特別地,磷脂醯絲胺酸比例增加至超過磷脂總量的5%證明了與參數的變化(諸如發酵培養基中鈣與鎂的濃度增加、低比生長速率以及低pH值)有相關性。然而,本發明不受限於在這些條件下所獲得的HBsAg。在與具有較低的此磷脂含量的HBsAg相較之下,磷脂醯絲胺酸比例有增加至超過5%是與所形成的抗原之免疫原性的增加有相關性。在以含有超過5%的磷脂醯絲胺酸(相對於磷脂之總%)之HBsAg來對HBsAg基因轉殖小鼠及CHB病患進行免疫接種後,可觀察到Th1細胞激素顯著增加以及更強之清除循環HBsAg的能力。
在本發明中,與使用未經修改的抗原的配方相較之下,該經特定修改的HBsAg與HBcAg抗原已基於較高強度的免疫與抗病毒反應而被選用。
此外,當相較於被分開投藥的抗原時,含有這二種抗原的配方能在較多數量的個體中產生血清抗體轉換而將HBsAg轉換成抗-HBsAg,證明了在形成本發明組成物之部分的抗原中所偵測到的修改的重要性與功能性,以及經合併之配方相較於個別抗原的優越性。
對於當前技術中普遍對於新配方的需求之問題,本發明提供了一個新穎的解決方法,該方法使增強抗-HBsAg與抗-HBcAg之免疫反應變的可能,而可針對由HBV所引起的慢性感染之控制達成更有效的治療。因為其是所述抗原之新穎特徵的鑑定結果,本發明之議題不會被認為是顯而易見的,或是具有通常知識者可自當前技術所推知的。雖然這些經修改的抗原令其蛋白質組成維持不變,該等抗原相對於與其相關的分子的化學組成是不同的。
此發明的概要是,經修改的HBcAg是一來自HBcAg的製劑,其包括呈一超過該抗原的總RNA的45%之比例的mRNA。同時,經修改的HBsAg是HBsAg之製劑,其含有呈一超過此抗原之磷脂總量的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。
在本發明的一個具體例中,具有HBV的HBcAg抗原(具有呈一超過此抗原之總RNA的45%之比例的mRNA)以及HBsAg抗原的組成物是具有特徵的,因為該組成物是被配製成藉由非經腸道及黏膜途徑來投藥。為了經由黏膜途徑(特別是經鼻途徑)來投藥本發明的組成物,可使用已被開發或商業化之用於透過該途徑來投藥藥學配方的裝置。
在一特定的具體例中,此組成物額外的特徵在於具有一疫苗佐劑。舉例來說,在可能存在於本發明的組成物內的疫苗佐劑之中,我們供給在此技術領域中具有通常知識者所熟知的疫苗佐劑,諸如鋁鹽、油包水乳液、針對人類使用所發展之免疫系統的刺激劑等。
此外,本發明提供HBcAg抗原(包括呈一超過此抗原之總RNA的45%之比例的mRNA)以及HBsAg抗原於製造一擬用於對抗HBV感染之免疫預防或免疫療法的藥物之用途。在本發明的一個具體例中,形成此藥物的部分的HBsAg具有呈一超過此抗原之總磷脂的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。在一個特定的具體例中,此藥物是被配製成藉由非經腸道及黏膜途徑來投藥。在一個較佳的具體例中,具有HBcAg(具有呈一超過此抗原的總RNA的45%之比例的mRNA)以及HBsAg抗原的藥物被用於治療CHB病患或帶有共-感染(感染的病毒之其中一者為HBV)的病患中。此外,在以此藥物來治療CHB病患時,該用途導致衍生自HBV感染的肝細胞癌之預防。
當該具有HBcAg(具有呈一超過此抗原的總RNA的45%之比例的mRNA)以及HBsAg抗原的藥物被用於以免疫療法來治療CHB病患時,其能透過細胞刺激以一主動的形式(透過使用此藥物對病患進行免疫接種)或一被動的形式而進行。由於其組份,本發明的藥學配方可以被使用於自體細胞或異體細胞的刺激中。因此,本發明帶來了一使用此配方的細胞刺激方法以及隨後對於帶有CHB的病患的被動免疫接種,而該免疫接種是以在活體內或在活體外對於自體或異體細胞(包括樹突細胞、B細胞以及巨噬細胞)的最大刺激為基礎。
再者,目前本發明揭露一種用於抗HBV感染的免疫預防或免疫療法的方法,其是具有特徵的,由於該方法是對於一需要其的個體投藥以一有效量的藥學組成物,該藥學組成物包含有HBV的HBcAg抗原以及HBsAg抗原,該HBcAg抗原具有呈一超過此抗原之總RNA的45%之比例的mRNA。在本發明的一個具體例中,該HBsAg包含有呈一超過此抗原之磷脂總量的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。在本發明的一個具體例中,此藥學組成物是藉由非經腸道及黏膜途徑投藥。在一個較佳的具體例中,接受該免疫療法的個體是一帶有CHB的病患。在此情況下,本發明方法針對CHB病患的免疫療法的應用致使對於衍生自HBV感染的肝細胞癌之預防。
本發明的目的亦在於使用HBcAg抗原(具有呈一超過此抗原的總RNA的45%之比例的mRNA)以及HBsAg抗原來增加對抗一與這些抗原之混合物共-投藥的額外抗原之免疫反應。在本發明的一個具體例中,形成該抗原混合物的部分的該HBsAg具有呈一超過此抗原之磷脂總量的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。
如上所述的抗原的混合物可以被使用於抗CHB的免疫反應的增強中(在一個治療的方案中)或是用於多價疫苗之預防性疫苗接種的策略中。如此是因為,除了以一特定形式修改的HBsAg和HBcAg抗原的免疫原性增加以外,可能可以去驗證其能夠誘發異體抗原之免疫原性的增強效應。實驗的評估結果顯示:在多價配方中所存在的這些抗原對於預防性或是治療性用途可能是有用的。
雖然可以避免使用與在目前本發明中的配方有關的佐劑、安定劑或其他添加劑,這沒有限制採用不會降低所投藥的配方或是所形成的最終產品之免疫原性或配方之抗病毒效力的添加劑、賦形劑、稀釋劑。
相較於此技術領域中所熟知的組成物與方法,使用本發明之用於免疫預防或免疫療法的藥學組成物及方法,達成了一持續的抗病毒反應,並且達至HBsAg轉換成抗-HBsAg之血清抗體轉換的病患數目增加。
實施例1.
獲得具有不同比例之RNA
的HBcAg
蛋白質變異體
HBcAg是獲自於以帶有編碼此抗原之基因的一質體基因轉形的一大腸桿菌(E. Coli
)菌株(Anguilar JC,et al
. Immunol Cell Biol (2004) 82:539-46)。
對HBcAg之粒子(獲自於在不同時間期間內所進行的發酵製程)進行特徵鑑定時,所觀察到的是:在以較長的發酵期間生產之HBcAg製劑中所併入的mRNA比例上有一增加。如同在表1中所觀察到的,相較於在直到14小時的製程中所獲得的HBcAg,在20小時的發酵之後該抗原中之mRNA位準增加了超過20%。因為在總RNA位準或在RNA含量/蛋白質含量的比值中沒有發現顯著的差異,在該粒子中RNA總量上沒有偵測到顯著的改變。然而,當相較於其他的變異體時,在mRNA之位準上有顯著的增加,特別地,核醣體RNA(rRNA)伴隨著mRNA之增加而在其存在上顯示出降低。在進行藉由質譜法的試驗或其他化學及物理研究時,在混合至HBcAg中的次要組分或在特定的汙染物中沒有發現其他相關的變化。 表1. 與在HBcAg中主要類型的RNA有關的百分比依據發酵過程之持續時間的變化
結果代表五次測定的平均值。在被標示為“變異型”的欄位中,發酵之持續時間是被表示在括號內。tRNA:轉送RNA,rRNA:核醣體RNA,以及mRNA:信使RNA。(*):顯著差異(p<0.05
)。在Balb/c 小鼠中評估 具有被併入不同百分比的mRNA 之HBcAg 變異體之免疫原性
在獲得具有被併入粒子內部不同百分比的mRNA之不同的HBcAg變異體(表1)之後,這些製劑的免疫學評估在Balb/c小鼠中來進行。為了此研究,我們使用年齡介於8至12週之間的雌性小鼠,其在第0天以及第15天透過SC途徑來接受兩次免疫接種,該免疫接種是使用1 μg的HBcAg之劑量[配於磷酸緩衝的鹽水溶液(PBS)中]來投予一為100 μL之最終體積。其計畫之詳細說明被顯示在表2內。 表2. 設計用以評估被併入在HBcAg粒子中的mRNA百分比在此抗原的免疫原性上之影響的免疫接種計畫
為了評估免疫接種所生成之特異性抗體反應,抽血是在第二次給藥的10天後執行。抗-HBcAg抗體反應之量測是使用ELISA技術來進行。
如同在顯示各研究組別所獲得的抗-HBcAg之IgG抗體效價的圖1中所觀察到的,對於接受HBcAg且HBcAg具有呈超過45%之併入的mRNA的組別(表2的第3組至第6組),所生成的抗-HBcAg IgG反應顯著地較高。雖然有一些微傾向於IgG反應的增加與在被併入的mRNA百分比上的增加相關之趨勢存在,在第3、4、5以及6組之間,沒有偵測到顯著的差異。這個結果顯示:相對於被併入的總RNA,當被併入HBcAg粒子內部之mRNA的比例增加至超過至45%的位準,會賦予此蛋白質一較大的體液免疫原性。IgG亞型之型式的初步分析顯示出在細胞型免疫反應的位準上也有類似的情況。實施例2. 獲得具有不同比例之磷脂醯絲胺酸的HBsAg 之類病毒粒子(virus like particles, VLP)
重組型HBsAg是獲自於以編碼此抗原的基因來基因轉形的一嗜甲醇酵母菌(P. pastoris
)菌株(歐洲專利序號EP 480525)。已被知曉的是:在此酵母菌物種中所表現的HBsAg含有磷脂醯絲胺酸在其結構性脂質內(Lobaina Y,et al
. Biotecnologia Aplicada (2008), 25:325-331)。然而,直至本發明為止,此脂質之存在對於此抗原之免疫原性的影響尚未被探討。
為了研究磷脂醯絲胺酸的比例是如何影響HBsAg的免疫原性,我們在不同的發酵條件下獲得了此VLP之製劑。在重組型酵母菌發酵槽中培養的期間,我們使培養基中的Mg(2+)
濃度增加,至介於1.0與2.0%之間的百分比,其導致了混合至HBsAg之VLP中的磷脂增加。這是在不同生長條件下對所獲得的HBsAg進行特徵鑑定的期間藉由使用薄層層析法所偵測到的。
具有已知脂質特性,磷脂醯絲胺酸會混合至HBsAg之VLP中。在表3中所顯示之結果代表五次不同重複之平均值。用於在不同實驗條件下所生產的所有HBsAg製劑之純化是類似的。如同在該表中所觀察到的,當發酵是以含有一少於1.2%之Mg(2+)
濃度的培養基來進行時,沒有在所獲得的樣品中偵測到磷脂醯絲胺酸。於使用含有2.0% Mg(2+)
的培養基所獲得之製劑中所發現的磷脂醯絲胺酸之位準是顯著地高於使用含有1.4% Mg(2+)
的培養基所獲得的製劑(變異體C)中所發現的位準。 表3. 獲得具有增加的磷脂醯絲胺酸含量之HBsAg變異體
ND:未被偵測出。Mg(2+)
(%):存在於培養基的鹽水添加劑中的Mg離子濃度(以百分比表示)。FS (%):在總磷脂質中磷脂醯絲胺酸的百分比,在經純化的HBsAg的萃取後所測定。(*):顯著差異(p<0.05
),(**):高度顯著差異(p<0.01
)。
依據用以研究其一級、二級以及三級結構而執行之特徵鑑定,在表3中所呈現的HBsAg製劑在其蛋白質組成上是相同的,可相比於原始的變異體。重要而應指出的是:對於本研究中任一個變異體而言,脂質濃度/蛋白質濃度比值並未改變。相同的發現也在使用總磷脂質vs.總蛋白質含量的比例而獲得。如同使用質譜法來分析HBsAg的組成之結果,在分析HBsAg的雜質或其他次要的化合物的期間,沒有發現其他顯著的改變。實施例3. 展現不同磷脂醯絲胺酸百分比之HBsAg 製劑的免疫學評估
為了評估磷脂醯絲胺酸的存在是否會影響抗HBsAg的免疫反應,我們在血清中表現有HBsAg的基因轉殖小鼠中進行了一免疫原性研究(Castro FO,et al
. Interferón y Biotecnología (1989) 6:251–257; Pérez A,et al
. Acta Biotechnol (1993) 13: 373-383)。使用了七個各六隻小鼠的組別。這些是經由鼻內途徑(IN)而被免疫接種之年齡為8-12週的雌性小鼠。該研究之前六組接受5 μg之表3中所述之各個不同的HBsAg變異體與弗倫式佐劑。第七組是用來當作對照組,並接受PBS 1X。所有處理組別皆接受10次免疫原的給藥,其每14天進行投藥。抽血是在最初的免疫接種之前以及每一次給藥的10天後進行,直到第三次給藥為止。在表4中顯示了基因轉殖小鼠血液中HBsAg的位準以及脾細胞培養物(在施予10次給藥後所分離)的上清液中所誘導的細胞激素[IFN伽瑪(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α),以及IL-2]之位準。此評估是使用ELISA技術來進行。
在以10次連續的免疫接種經由IN途徑來投予5 μg的HBsAg之後,當在此HBsAg內的磷脂醯絲胺酸位準為5%或更多時(實施例2,表3中的變異體D、E,以及F),在HBsAg的基因轉殖小鼠血液中的HBsAg濃度顯著地減少。同樣地,相較於具有較低位準的變異體(變異體C)或無法測得磷脂醯絲胺酸的變異體,具有5%或更多磷脂醯絲胺酸之HBsAg變異體顯著地誘導出較高的IFN-γ、TNF-α以及IL-2位準,並顯示出一劑量-依賴的效應(dose-dependent effect)。這是在表4中所觀察到的。
當相較於不含有任何磷脂醯絲胺酸的HBsAg時,以含有超過5%之位準的磷脂醯絲胺酸之HBsAg變異體(表4,變異體D至F)來對基因轉殖小鼠進行免疫接種之後,有顯著的Th1細胞激素之增加及較高的循環HBsAg的去除能力被發現到。針對變異體D-F所發現的細胞激素位準是顯著地高於條件A-C的位準。D-F變異體誘發了HBsAg濃度的最大減少,並且在活體外對被免疫接種的基因轉殖動物的脾臟細胞進行刺激之後,誘發了最強效的細胞激素分泌。 表4. 在以具有不同百分比之磷脂醯絲胺酸的HBsAg變異體來對基因轉殖小鼠進行免疫接種之後評估循環HBsAg及細胞激素之位準
A-F:表3中所示,所生成之在其組成中具有增加之磷脂醯絲胺酸位準的HBsAg變異體。(*):顯著差異(p<0.05
),(**)高度顯著差異(p<0.01
)。
如同所觀察到的,藉由使用具有一較高的磷脂醯絲胺酸含量之HBsAg變異體來對HBsAg基因轉殖小鼠進行免疫接種,有Th1細胞激素的顯著增加以及較大的循環HBsAg去除能力,因而證實了該抗原的免疫原性會隨著此脂質組份在混合至此抗原所形成之VLP中的脂質內之比例增加而增加。
在HBsAg的粒子內插入磷脂醯絲胺酸,先前已在最新的技術中被報導過。然而,此組份之比例對於這些粒子的免疫原性的影響方式尚未被探討。儘管在2008年Lobaina等人已推測磷脂醯絲胺酸在嗜甲醇酵母菌中所生成之較多的HBsAg中的角色(Lobaina Y,et al
. Biotecnologia Aplicada (2008), 25:325-331),在此同一報告中證實的是:以在同一宿主內所生成的HBsAg為基礎之兩個疫苗在免疫原性的方面上是不一致的,儘管磷脂醯絲胺酸位準假定上為相同(因為生成它的酵母菌物種)。實施例4. 證明具有較高比例之被囊封的(encapsulated) mRNA 的HBcAg 變異體在帶有CHB 之病患內之免疫原性的增加
在實施例1中已在小鼠中證明的是:隨著在被囊封的RNA總量內mRNA比例的增加,在HBcAg的免疫原性上有一增加。考量這些結果後,針對包括HBcAg以及HBsAg這兩者(分別在其mRNA以及磷脂醯絲胺酸上有經過修改)之配方的免疫學行為以及在活體內之抗病毒反應來進行特徵鑑定。
為此,在慢性B型肝炎病患中,一隨機化且雙盲之第二期臨床試驗被進行。所選用的病患在研究開始時具有超過10000 copies/mL的高病毒量,且HBeAg為陽性。將該等病患分配在6組(各組15名病患)中,對其施予表5內所述之處理。總計施予了10次給藥,其分為兩個各5次給藥的循環,其間有一個月的間隔。前5次給藥是單獨經由IN途徑來施予,其餘的5次給藥是同時進行IN/SC施予。在這兩次投藥循環中該等給藥皆是以14天之間隔來施予。 表5. 執行HBcAg以及HBsAg抗原(分別在mRNA與磷脂醯絲胺酸的含量上有經過修改)的評估的第二期臨床試驗中之處理組別
mHBcAg:含有呈一為此抗原之總RNA的50%之比例的mRNA的HBcAg;mHBsAg:在VLP的脂質組份中含有7%之磷脂醯絲胺酸的HBsAg。
意外地,在被處理以含有二者皆經修改的抗原之配方(亦即,含有具有超過5%之磷脂醯絲胺酸位準的HBsAg以及具有超過45%之mRNA的HBcAg之配方)的病患之組別中,當相較於被處理以不具有這些特性的配方的病患組別,發現到顯著較高位準之針對HBeAg與HBsAg的血清抗體轉換(參見表6)。這顯示了這些修改與病患所生成的抗-病毒反應之品質提升有相關性。
在人類中,該抗原是在從每次給藥每個抗原50 μg至每次給藥每個抗原1000 μg之濃度範圍中並使用抗病毒反應之證據來評估,該抗病毒反應之證據是依據在處理終止後超過一年針對HBsAg與HBeAg之血清抗體轉換、病毒學控制以及被維持在每mL低於10000個複本的HBV的DNA之病毒學反應。 表6. 在使用HBcAg以及HBsAg(分別在其mRNA與磷脂醯絲胺酸含量上有經過修改)的第二期臨床試驗中處理終止的一年後,具有針對HBeAg以及HBsAg的血清抗體轉換的病患之頻率
類似的結果亦有在HBsAg基因轉殖小鼠之模型中發現,其中,進行了一試驗以評估處理組別(類似於在表5中所述的組別),而就接受含有具有如上所述修改的抗原之配方的組別,有獲得循環HBsAg的更大減少以及更高的抗-HBsAg抗體效價,並且具有更早的出現時間。
令人感興趣地,在針對HBV而為基因轉殖的小鼠中以及在病患中,相較於含有未經修改之抗原的配方,或是僅含有這些經修改之抗原中的一者的配方,含有經修改之HBcAg以及HBsAg變異體的配方發展出更強效的Th1免疫原性。實施例5. HBcAg 以及HBsAg 抗原( 分別在其mRNA 以及磷脂醯絲胺酸含量上有經過修改) 在多價配方中的佐劑效應
在此研究中,透過非經腸道及黏膜途徑,在經修改的重組型HBcAg與HBsAg蛋白質(分別在其mRNA與磷脂醯絲胺酸含量上有經過修改)之混合物以及未經修改的HBcAg與HBsAg之混合物之間,佐劑能力(亦即,對於被共-投藥之抗原的免疫反應的提升)被比較。為了此目的,選用了重組型嵌合蛋白質CR3;此為HIV-1之多抗原決定位抗原(Iglesias Eet al
. J Biochem Mol Biol & Biophys (2001) 1:109-122)。八個八隻年齡為6-8週之雌性Balb/c (H-2d
)小鼠的組別被接種以:1)透過SC免疫接種的PBS (安慰劑)[其在此將被指稱為安慰劑(SC)];2)透過IN免疫接種的鈉醋酸鹽緩衝液(NaAc)(pH = 5.2)[安慰劑(IN)];3)透過SC途徑的HBcAg (C)與 HBsAg (S)之混合物[C+S (SC)];4)透過SC途徑之含有呈一此抗原之總RNA的50%之比例的mRNA的HBcAg (mC)與在它的脂質組份中含有7%磷脂醯絲胺酸的HBsAg (mS)之混合物[mC+mS (SC)];5)透過IN途徑的C+S [C+S (IN)];6)透過IN途徑的mC+mS [mC+mS (IN)];7)透過SC途徑的CR3與HBcAg (C)以及HBsAg (S)之混合物[CR3+C+S (SC)];8) CR3+mC+mS (SC);9) CR3+C+S (IN),以及10) CR3+mC+mS (IN)。經由各途徑的各個抗原所使用之劑量為5 μg;且該等免疫原是在免疫計畫(schedule)的第0、7以及21天被投藥。為了SC免疫接種,將該等蛋白質溶於PBS中並吸附於1.4 mg/mL的氫氧化鋁(Superfos Biosector A/S, Vedbaek, Denmark)中。為了IN途徑,將該等蛋白質溶於NaAc(pH = 5.2)中。該等動物是位於一仰臥姿勢下藉由腹膜內(IP)投藥以30 μL的氯胺酮(10mg/mL)來進行麻醉,且使用一吸量管尖管(pipette tip)而將該等免疫原緩慢地配於50 μL (25 μL/每鼻孔)中。免疫接種的十天後,收集所有動物的血清,並且為了細胞免疫反應之研究,在本研究終止時將五隻動物進行犧牲(以一隨機方式),俾以獲得牠們的脾臟。
血清中的IgG反應是透過間接的ELISA來評估,其中,培養盤被塗佈以CR3蛋白質。用於定量以CR3予以刺激之培養物的上清液中IFN-γ的分泌的方法學先前已被報告(Garcia Diaz Det al
. Immunol Lett (2013) 149:77-84)。
為供數據之統計學分析,高斯分布(Gaussian distribution)是以克默果夫-史密諾夫檢定(Kolmogorov-Smirnov test)予以評估,並以巴特力檢定法(Bartlett test)評估變異數之相等性。具有常態分布(或是高斯分布所推定的那些者)以及具有相等變異數的樣本是以參數檢定來比較;否則,使用替代的非參數檢定。為了達到數值之常態分佈,將所有的IgG效價皆轉換為log 10。將未達至血清抗體轉換的動物之血清指定成一為1:10之任意效價,以利統計學處理。將一為<0.05
的p
值認為是統計學顯著的。
在圖2中所觀察到的,抗-CR3 IgG抗體(HIV-1)測定之結果顯示,在分別被免疫接種以CR3+mC+mS之混合物(第8與第10組) vs CR3+C+S (第7與第9組)之動物的組別中,在透過SC與IN途徑投藥後有一更強的反應(p
<0.05)。如同在表7中所觀察到的,與先前結果一致,亦在來自相同組別之小鼠的培養物之上清液中觀察到更多的IFN-γ分泌。為了此分析,最後一次免疫接種的十天後(第31天),對來自每一組別的五隻小鼠的脾細胞進行培養。針對安慰劑組別,製備個別動物的脾細胞懸浮液。它們是以2.5 μg/mL的CR3蛋白質予以離體(ex vivo
)刺激歷時五天。在上清液中,CR3-特異性之IFN-γ是以夾心式ELISA來定量。偵測極限為0.80 ng/mL。 表7. 在培養物之上清液中所量測到的IFN-γ分泌
最後,在經由SC途徑而被免疫接種的組別中,比較在離體刺激後對於CR3 (HIV-1)具特異性之CD8+細胞的頻率。在圖3中所觀察到的,在經刺激的組別CR3+mC+mS (SC) vs CR3+C+S (SC)中獲得了較高的CD8+細胞的頻率(p<0.05
)。
整體而言,這些結果顯示出,經由非經腸道及黏膜途徑,具有超過45%之mRNA的HBcAg (mC)以及超過5%之磷脂醯絲胺酸位準的HBsAg (mS)之混合物具有一較高的Th1佐劑效應。特別地,因為抗病毒之Th1反應已被連結至對抗AIDS的感染與進展之保護,對於抗HIV的疫苗接種而言,此結果相當重要。
雖然此實驗的目的並非量測抗HBsAg與HBcAg抗原(在此實施例中簡稱為S與C)的體液反應,當相較於未經修改的HBsAg與HBcAg之混合物(C+S,數據未顯示)時,在被免疫接種以經修改的HBsAg與HBcAg抗原之混合物(mC+mS)的小鼠的組別中,我們觀察到較高且具統計學顯著性之抗-HBcAg及抗-HBsAg IgG的反應。這證實了上述的結果。實施例6. 透過將免疫接種以HBsAg 與HBsAg( 分別在其mRNA 以及磷脂醯絲胺酸的含量上有經過修改) 之配方的Balb/c 小鼠細胞接受性轉移(adoptive transfer) 至表現HBsAg 的基因轉殖Balb/c 小鼠中來 進行被動免疫接種
在本發明中我們希望能透過使用一含有HBsAg與HBcAg抗原(分別包括在其磷脂醯絲胺酸以及mRNA的含量上有經過修改)的配方之個體的主動免疫接種來加強在供體(donor)內之抗-HBsAg以及抗-HBcAg的免疫反應,並且令要被轉移的細胞在轉移前在活體外被活化,藉此當將該等細胞接種至受體生物(receptor organism)內時,抗這些抗原的反應會為最大值。因此,一種不存在於人體內的反應類型,會以一人工方式而獲得,使得提升對於帶有類似之單套型(haplotype)的人的供體範圍(margin of donors)變的可能,無論他們已經受到HBV感染。
在目前的實施例中,我們在一表現HBsAg的基因轉殖小鼠之環境(一HBV的持續感染的模型)下,透過細胞的接受性轉移來評估疫苗接種所產生的免疫反應的效用,該疫苗接種是使用一由HBsAg以及HBcAg抗原(分別在其磷脂醯絲胺酸以及mRNA的含量上有經過修改)所組成之配方,並且是經由IN/非經腸道之途徑來施用。本研究的其中一個目的是評估被轉移之免疫反應對於基因轉殖小鼠血清中的HBsAg濃度[抗原血症(antigenemia)]之效用。再者,相較於由於僅在活體內或在體外被刺激以HBsAg的細胞之轉移所產生的效果,針對HBsAg與HBcAg抗原之配方的投藥,我們將由IN/非經腸道之途徑的組合所誘發之反應的效果拿來作比較。此外,在針對此抗原之基因轉殖小鼠的環境下來探討所轉移的抗-HBsAg抗體反應的動力學。我們使用了Balb/c小鼠以及HBsAg (+)基因轉殖的小鼠(於CIGB所獲得,具有Balb/c小鼠之遺傳背景)。在Balb/c 小鼠中抗 -HBsAg 免疫力之生成
一免疫接種計畫於年齡為8至12週的Balb/c 雌性小鼠中進行。該等小鼠是同時經由IN及非經腸道之途徑而被免疫接種以一含有經修改的抗原HBsAg (具有超過5%之磷脂醯絲胺酸含量)以及HBcAg (具有超過45%之mRNA含量)之疫苗製劑。在非經腸道之途徑中,我們測試了IM、SC以及ID途徑。給藥(以100 μL之體積)是在第0天與第14天來施予,以及一追加注射(booster shot)是在第100天且在轉移前來施予。抽血是在第2、10以及25天於眼窩後靜脈叢來進行。表8顯示包括各組所接受的處理之免疫接種計畫的設計。 表8. 在非-基因轉殖的Balb/c小鼠中之免疫接種計畫
mHBcAg:含有呈一此抗原之總RNA的50%之比例的mRNA的HBcAg;mHBsAg:在VLP的脂質組份中含有7%之磷脂醯絲胺酸的HBsAg。
由這些處理所生成的體液免疫反應之評估是在各接種後,藉由使用ELISA技術來量測IgG反應及抗-HBsAg之IgG亞型來進行。為了評估細胞免疫反應,在第一次投藥的10天後,我們進行了一ELISPOT類型之試驗,以藉由來自脾臟的CD8+淋巴細胞來量測對抗HBsAg的特異性IFN-γ之分泌。這些評估的結果顯示:第5組產生了最大的細胞反應,並且產生無異於所研究的其餘組別的體液反應。有鑒於此,我們從此組別中選擇了兩隻動物作為用於接受性轉移之脾細胞供體。免疫原的選擇是於一為1:1之比例(HBsAg:HBcAg)下來進行。獲得免疫- 脾細胞
在接受追加注射的十五天後,將來自第5組的兩隻小鼠以及來自第7組(安慰劑)的三隻小鼠犧牲,且對牠們的脾臟進行萃取。將來自第5組的脾臟以及第7組的脾臟分別分組。對該等脾臟進行處理,直到獲得脾細胞。將它們分成30 x 106
個細胞的等分(aliquot)(配於100 μL之PBS 1X中),以供其轉移至受體小鼠。免疫力之接受性轉移
被用來當作受體之表現HBsAg的基因轉殖小鼠是介於16-20週的年齡且來自兩種性別。牠們被分配至如在表9中所示之不同的處理組別。在脾細胞轉移前,進行部分抽血,以檢查在血清中的HBsAg位準。隨後,我們接種(透過IP途徑)了30 x106
個脾細胞(配於一為100 μL之體積的1X PBS中)。為了評估免疫力之接受性轉移的效果,抽血是每週經由眼窩後靜脈叢來進行,歷時5週。轉移後的第8週,該等動物被放血並被犧牲。 表9. 免疫力之接受性轉移的實驗設計 HBsAg 基因轉殖小鼠的血清中的HBsAg 之定量
血清中的HBsAg位準是藉由ELISA來定量。培養盤被塗佈以被稱為Hep4之抗-HBsAg單株抗體(由CIGB所生產)。獲自於轉移後一週之評估,接受具有一對於HBsAg的事先免疫之細胞的所有小鼠顯示出,在血清中的HBsAg有明顯減少,並且在第零時以及第2週與第3週之間有顯著差異(p<0.05
)。自第四週起(第35天),我們觀察到血清中的HBsAg濃度開始增加,因此顯示出經轉移的免疫力所造成之抗原血症的控制正在降低。自此時間點起,直到第8週(第63天),在抗原血症上與在試驗的第零時所報導者之間並無差異。
在接受具有抗HBsAg之特異性免疫力之脾細胞轉移的小鼠的情況下,我們偵測到血清中之HBsAg明顯減少,在第7與28天之間更為明顯。然而,對於接受安慰劑脾細胞轉移或PBS的小鼠,雖然在血清中HBsAg的濃度有所變化,其相較於第零時從未達到一顯著差異,而且從未偵測到低於5 μg/ml之數值。
這些結果顯示:透過由細胞所媒介之免疫力的接受性轉移來有效地減少循環HBsAg在此蛋白質的基因轉殖動物之血清中的位準是可能的。藉由在此情況下所轉移的免疫反應,於抗原血症上設立控制是有效的,並且在一單一細胞轉移後持續了約3週。血清中之抗-HBsAg IgG 反應
抗HBsAg之特異性IgG抗體反應是針對所有接受具有對此抗原之事先免疫的脾細胞的轉移之小鼠來偵測。此與所獲得的抗原血症的結果一致。在具有抗-HBsAg反應之動物的情況下,所偵測到之效價為高的(效價>104
),而且自第三週起開始降低,其可能與大約在第4週(第35天)時針對這些動物所觀察到的抗原血症之增加有關。接受安慰劑細胞轉移或PBS的組別沒有顯示出特異性抗體。
(無)
圖1. 於施予二次給藥後的抗-HBcAg IgG抗體之反應。
圖2. 抗-CR3 IgG抗體。
圖3. CD8+ CR3 (HIV-1)-特異性T細胞之增生反應。
(無)
Claims (17)
- 一種藥學組成物,其特徵在於:B型肝炎病毒(HBV)之核心抗原(HBcAg)以及B型肝炎病毒之表面抗原(HBsAg),該HBcAg包括呈一超過此抗原之核糖核酸(RNA)總量的45%之比例的信使核糖核酸(mRNA)。
- 如請求項1的組成物,其中該HBsAg包括呈一超過此抗原之磷脂總量的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。
- 如請求項2的該組成物,其特徵在於:配製成藉由非經腸道及黏膜途徑來投藥。
- 如請求項2的該組成物,其特徵在於:其額外地包括一疫苗佐劑。
- 一種B型肝炎病毒之核心抗原(HBcAg)以及B型肝炎病毒之表面抗原(HBsAg)於製造一擬用於對抗由B型肝炎病毒(HBV)所造成之感染的免疫-預防或免疫療法的藥物之用途,該HBcAg包括呈一超過此抗原之核糖核酸(RNA)的總量的45%之比例的信使核糖核酸(mRNA)。
- 如請求項5的用途,其中該HBsAg包括呈一超過此抗原之總磷脂的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。
- 如請求項6的用途,其中該藥物是被配製成透過非經腸道及黏膜途徑投藥。
- 如請求項6的用途,其中該藥物是被用於帶有慢性B型肝炎(CHB)之病患或帶有其中感染的病毒之一者為HBV的共-感染的病患之治療。
- 如請求項8的用途,其中該CHB病患的治療是被使用於衍生自HBV感染的肝細胞癌之預防。
- 如請求項6的用途,其中該免疫療法是透過細胞刺激以一主動或被動的形式而進行。
- 一種用於對抗B型肝炎病毒(HBV)之感染的免疫預防或免疫療法的方法,其特徵在於:將一有效量的一藥學組成物投藥給一需要的個體,該藥學組成物包括B型肝炎病毒之核心抗原(HBcAg)以及B型肝炎病毒之表面抗原(HBsAg),該HBcAg包括呈一超過此抗原之總核糖核酸(RNA)的45%之比例的信使核糖核酸(mRNA)。
- 如請求項11的方法,其中該HBsAg包括呈一超過此抗原之磷脂總量的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。
- 如請求項12的方法,其中該藥學組成物是藉由非經腸道及黏膜途徑投藥。
- 如請求項12的方法,其中接受該免疫治療的個體是一帶有慢性B型肝炎(CHB)的病患。
- 如請求項14的方法,其中該CHB病患之免疫療法是被使用於衍生自HBV感染的肝細胞癌之預防。
- 一種B型肝炎病毒之核心抗原(HBcAg)以及B型肝炎病毒之表面抗原(HBsAg)用於增加對抗一與這些抗原之混合物共-投藥的額外抗原之免疫反應的用途,該HBcAg包括呈一超過此抗原之核糖核酸(RNA)總量的45%之比例的信使核糖核酸(mRNA)。
- 如請求項16的用途,其中該HBsAg包括呈一超過此抗原之磷脂總量的5%之比例的磷脂醯絲胺酸。
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