JP4870085B2 - 新たなクラスのウイロソーム粒子 - Google Patents
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Description
ウイルス由来の又は組み換えられた包膜蛋白質を精製し、追加の脂質の存在下又は非存在下でプロテオリポソームへ調製される。この純粋なインビトロのアプローチにより、包膜ウイルスの外殻、包膜の生成を達成できるが、これはウイルスの核、ヌクレオカプシドを含んでいない。異なったウイルス由来の包膜蛋白質を組み込んだ、キメラのウイロソーム構造の例がある。再構成されたウイルス包膜も、遺伝子(DNA又はRNA)の移入に成功裏に使用されているが、これらの方法は機能を有し、蛋白質に基づいたヌクレオカプシドのパッケージングには依存しておらず、むしろ、核酸と再構成された包膜との直接的な結合に依存している。
単離された組み換えウイルス蛋白質は自己会合し、ウイルス様の構造(VLPs): HPV(酵母、バキュロ)、HCV(バキュロ)、HBs抗原(酵母、CHO)、HBc(大腸菌)となることができる。これらのアプロ−チの全てに共通することとして、自己会合は異種の細胞発現システム中で起こり、引き続いてウイルス様の粒子が精製される。そこで会合はインビトロでは起こらないが、細胞システムを頼りにする。VLPsはワクチン及びワクチン担体として使用されてきた(Pumpens, P.;Grens, E. (2001) Interviology 44 (2-3); 98-114; Noad R, Roy P. (2003) Trnds Microbiol. 11 (9): 438-44)。
このアプローチは、別々に精製された成分に基づいている。脂質膜に基づいた包膜が存在しないために、非包膜ウイルスは構造においてより単純であり、もし全ての必要な成分が正しい化学量論で存在していれば、インビトロである条件下において自己会合することができる。同様に包膜ウイルスの内部核、脂質がないヌクレオカプシド、又はそれらのサブユニットが、例えばインフルエンザウイルスの精製された組み換え成分からインビトロで再構成されている(Martin-Benito J. et al. (2001) EMBO Rep. 2 (4): 313-7)。
多くの異なった型のウイルスからヌクレオカプシドが抽出され単離され、それらの組成の特性解析が行われてきた。ウイルスのレスキューを目的として、これらの調製物を感染しやすい細胞のトランスフェクションのために使用することもできる。成功裏のウイルスレスキューは、機能を有するヌクレオカプシドが単離され、宿主細胞の細胞質へ運ばれることを意味する。しかしこれは、機能を有する包膜ウイルスの再構成の成功を示すものではない。なぜならば、機能を有する包膜に依存する天然の感染経路は形質転換体の使用によってバイパスされ、後者は宿主細胞の細胞質へヌクレオカプシドを直接的に運搬することを仲介している。
このインビボのアプローチは、実験室規模のキメラウイルス又はベクター(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、及びAAV)の産生において、広範かつ成功裏に使用されている。偽タイピングされたウイルスの産生の鍵となる要素は、ビリオン中へ組み込まれるべき全ての蛋白質を共発現し、ビリオンの組み立てを仲介するヘルパーウイルスである。対照的に、包膜ウイルスのインビトロの会合は、規定された、別々に産生及び精製がなされた成分に基づいており、物理的な結合はインビトロで制御された条件の下で行われる(Sandrin V. et al. (2003) Curr Rop Microbiol Immunol.; 281: 137-78)。
(a)少なくとも1つの脂質、及び包膜ウイルスの包膜蛋白質を備えるウイロソーム膜と、
(b)ウイロソームの内側及び外側に位置し、前記包膜蛋白質に付着した前記包膜ウイルスのヌクレオカプシド粒子
を備えるウイロソームを提供する。
・ 抗原のHAを介したMHC−1提示、及び抗原に対するTh1免疫反応
・ 反復したウイルス様構造の中の抗原の提示
・ 抗原提示細胞の標的化
・ 細胞外分解からの保護
(a) 界面活性剤溶液中において脂質存在下で包膜ウイルスの包膜蛋白質を可溶化し;
(b) 溶液中の界面活性剤の濃度を低下させ;
(c) 前記包膜ウイルスのヌクレオカプシド粒子を工程(b)で取得した溶液に加え;
(d) ウイロソームが産生されるように界面活性剤又はレシチンを除去する;
という工程を含むウイロソームの産生方法を提供する。
本発明の文脈中において「濃度を低下させ」という言葉は、前記の界面活性剤が入っていない溶液を加えること、又は前記の界面活性剤の濃度が工程(a)において取得した溶液に比べて低い溶液を加えることを含むと理解される。
(i) 膜貫通蛋白質、インフルエンザ包膜(HAとNA)及びHBs(HBV包膜)がウイロソーム膜中に組込まれなければならず、また
(ii) HBc粒子が膜に固定されたHBsと効率的に結合しなければならない。
(b’)工程(b)で得られた希釈液の無菌濾過。
溶液の無菌濾過の手段と方法は当技術分野において公知である。無菌濾過は添付した実施例で説明するように例えば0.22μmのフィルターを通して段階工程(b)で取得した溶液を濾過することを含むことが出来る。
(i)Bio-Beads SM-2を加え回転させながらインキュベーションすること;及び
(ii)Bio-Beads SM-2を溶液から除去すること
によって達成することが出来る。
(e) 工程(d)で得られた希釈液の無菌濾過。
上記の対象者が人間であると特に好適である。
個々の成分と結果として生じるHBウイロソームの構造を描いた概略図が図1に示してある。分析的データは提案された構造と一致している。
調製過程のフローチャートが図2に示してある。HBウイロソームの詳細な調合プロトコルは添付した実施例に記述してある。
図3はHBウイロソームのSDS-PAGE分析の結果を示している。SDS-PAGE分析に基づくHBウイロソーム及び最初の材料(インフルエンザ、HBs、及びHBc)の蛋白質組成が図3に示してある。
HBウイロソームの予測される物理的構造は以下の分析データによって確認されている(図4−7)。
図4は個々の成分の粒度と比較したHBウイロソームの粒度の分析の結果を示している。HBウイロソームは個々の成分とは全く異なる単一種類の粒子から構成され、光子相関分析の粒子の粒度の分布において1つの狭いピークを形成している。
図5はHBウイロソームの勾配分画分析の結果を示している。ショ糖勾配中でHBウイロソームを超遠心した後、全ての抗原が同一の勾配分画で見え、それらの物理的な結合を示唆している。
図6はHBウイロソームのSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析の結果を示している。抗HA又は抗HBs抗体のいずれかを使用したHBウイロソームの免疫沈降では、両方の場合で全ての抗原(HBs、HBc、及びHA)の共沈降が起こった。界面活性剤の添加によってHBウイロソーム構造が破壊されると、抗体によって直接認識される抗原しか沈降されない(それぞれHA又はHBs)。この所見は全ての抗原が1粒子中で結合していることを確かめている。
図7はHBウイロソームのSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析の結果を示している。HBウイロソームがトリプシン処理に晒された場合、両方のHBV抗原が部分的に保護された(ウェスタンブロットによれば50%)。トリプシン中でインキュベーションする前に界面活性剤の添加によってウイロソーム構造が破壊されると、HBV抗原は短時間のうちに完全に分解された。
図8はマウス免疫化の後のHBウイロソームに対する抗体免疫反応の試験の結果を示している。この時点ではHBウイロソームの免疫原性に関して予備的なデータのみ利用可能である。付加的なアジュバント無しのHBウイロソームを用いてマウスで実験を行った。マウスは異なる量のHBウイロソームの筋内注射によって免疫化され、高い抗体力価が異なる3つの抗原に対して検出された。
図9はマウス免疫化の後のHBウイロソームに対する細胞免疫反応の試験の結果を示している。3回目の増強の後、免疫化された動物より胸腺細胞が精製され、それぞれの抗原を用いた試験管内での再刺激の後、インターフェロンγに対するELISPOTによって細胞反応を決定した。注目すべきはこの方法はCD4型とCD8型反応を区別しないことである。
要約表はHBウイロソームによる免疫化の後これまでに取得した免疫学的データを示している。免疫化した動物においてHBs及びHBcの両方に対する体液性と細胞性の応答が検出可能であった。
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The structure of Hepadnaviral core antigens
Preikschat el al., Journal of General Virology 1999, 80: 1777-1788
Expression, assembly competence and antigenic properties of hepatitis B virus core gene deletion variants from infected liver cells.
Gluck R., 1995, Journal of Liposome Research 1995 5(3), 467-479:
Liposomal Hepatitis A Vaccine and Liposomal multiantigen combination vaccines
HBウイロソームへのHBs及びHBc成分の定量的な組込みを達成するために、インフルエンザウイロソームに関して確立された調製過程は大幅に修正され、多数の変数に関して最適化された。標準的なインフルエンザウイロソームのプロトコルを用いると、HBV抗原の組込み率及び過程の再現性が不満足なものとなるとことが分かった。
共にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入った、2mgのHAを含む不活化されたインフルエンザウイルス(シンガポールA型)及び2mgの精製された組換えHBs抗原を混合し、100000g、4℃で2時間遠心した。結果として生じる沈殿を1mlの100mM PBS-OEGを含むPBS中に可溶化した。
異なる供給源(CHO由来のHBs、酵母由来のHBs)、サブタイプ(ayw 及びadv HBV核粒子)、又は変異体(HBV核の全長又は短縮型)からのHBV抗原を含むHBウイロソームを同様の方法で調製した。上記で説明した再構成HBVウイロソームの製剤は、粒度と抗原組込み率に関しての重要な変数を同定するために行った一連の調製の結果であり、最終濾過滅菌に適した均一な粒度の粒子への抗原の良好な組込みを可能にした。異なるリン脂質組成(異なる比率のフォスファチジルエタノールアミンとフォスファチジルコリン)による調合は、粒度とフォスファチジルエタノールアミン量の間の逆相関の関係を示した。蛋白質に対する脂質の比(2.5、5、6、7.5)の粒度と抗原組込みに対する影響は一連の調製の中で調べている。異なる抗原の相対量が組込みに影響することが示されており、調合において(HBc抗原無しで)HAの濃度を増やすことがHBs抗原の組込みの増加につながり、1対1の比率の80%まで届いた。以下の変数を系統的に試験し最適化した:
我々の手では最適な脂質:蛋白質比は5:1であったが、リン脂質を使用するなら抗原組込みが最大となるのは20:1から1:10の範囲であることは考えられる。他の脂質(合成脂質、ステロイド型脂質)又は異なる脂質の組み合わせを使用するなら、脂質:蛋白質比は更に異なる可能性がある。
PCのみのHBウイロソームを産生することはでき、我々の手では粒度と均一性に関してPEが22%であることが最適であった。もう一度言うが、他の脂質を使用するならば、これらの比は大幅に異なる可能性がある。
我々の手では1:1:1という比が最適であると分かった。しかし、修正した脂質組成と脂質:蛋白質比では、抗原組込みが最大となる最適量は変わる可能性が高い。それに加え、HAの一切無い調製物も同様に所望の粒子構造を作り出した。
選択した界面活性剤は50mMの濃度のOEGである。しかし、組成や比率を修正する時には20から100mMの範囲が適切である可能性がある。他の非イオン性、イオン性、又は双極性の性質の界面活性剤をOEGの代わりに調製過程で使用してもよい。
HBウイロソームの徹底した物理化学的な分析は、調製過程の最適化と将来の製品の品質管理に必須の要素である。それ故、HBウイロソームの内容と構造を調べる測定法の開発に莫大な努力が費やされた。アジュバント効果(MHC-1提示)がHBウイロソームの物理的構造に直接依存するため、ワクチンのHBV成分をウイロソーム担体に物理的に結合させる単一の粒子型の証明に特に重点を置いた。
蛋白質(SDS-PAGE)
HBs(ELISA、ウェスタンブロット)
HBc(ELISA、ウェスタンブロット)
HA(SRD)
リン脂質(酵素測定法)
ウイロソーム構造:
光子相関法
免疫共沈降法
密度勾配超遠心法
トリプシン処理
電子顕微鏡(計画中)
蛋白質濃度は260、280、320nmの波長のUV吸光度によって測定し、以下の公式に従って計算した:1.55×(A280 - A320) - 0.76×(A260 - A320)。結果はmg / mlで表示した。
HBウイロソームに組込まれたHBs及びHBc抗原の量は定量的Elisa測定法により決定した。抗原に対する最大限の接触をもたらすために、基準抗原とHBウイロソーム試料を最初の希釈時にPBS-OEGに溶解し、次に連続する希釈はPBSにて行った。HBs測定は市販のHBs Elisa detection kit (DADE Behring)を使用して行い、同じ測定法にて測定する精製したHBs抗原の希釈系列が、HBsウイロソーム試料中の抗原の量の決定を可能にした。定量的HBc ELISAでは、マイクロタイタープレートを、50mM Na2CO3 (PH 9.6) に入ったHBcに対するモノクローナル抗体(mAb)(クローン7E6、Biogenesis、希釈率1:1000)によってコートした。その後プレートを1% BSA、5%ショ糖、0.05% NaN3入りのPBSで室温で少なくとも1時間ブロックし、0.05% Tween20 (v/v)入りのPBS(洗浄バッファー)で洗浄した。試料(0.1ml)を載せ、室温で1時間インキュベートした。第2の、HBcに対するビオチン化されたmAb(クローン4H5、Biogenesis)を0.05% Tween20、0.1% BSA入りのPBS(希釈バッファー)中で1:1000に希釈し、プレートに加え(1ウェルあたり0.1ml)、室温で1時間インキュベートした。4回の洗浄の後、プレートをストレプトアビジン(希釈バッファー中で1:5000)の存在下で室温で1時間インキュベートした。更なる4回の洗浄の後、TMB(1ウェルあたり0.075ml)を30分インキュベートし、発色反応を1M H2SO4(1ウェルあたり75μl)で停止し、450nmにおける光学密度を測定した。
HBウイロソームのHAの量は標準的な一元免疫拡散(SRD)法を使用して決定した。この試験はウイロソームワクチンの分析に関して有効な測定法であり、エパキサール(Epaxal:登録商標)に関するそれぞれの標準操作手順に従ってBerna Biotch Ltd. QC departmentによって行われた。
HA、HBs又はHBc抗原のHBウイロソームにおける存在を証明するために、調製物、勾配分画、プロテアーゼ処理、又は免疫共沈降法からの試料をMESバッファーを用いNuPage Bis-Tris SDS-PAGE pre-cast gel(Invitrogen)上で分離し、製造者の使用説明書に従いニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを5%ミルク入りのPBST(1% Tween 20入りのPBS)でブロックし、抗原特異的な抗体の1:1000の希釈液中で室温で1時間インキュベートした。メンブレンを洗浄し、その後ペルオキシダーゼ標識の抗ウサギ又は抗ヒツジ免疫グロブリンの1:10000の希釈液中で1時間インキュベートした。蛋白質をECL Plus 基質溶液 (Amersham Pharmacia, Piscataway, N.J.)を用いて可視化した。
ゲルの銀染色は製造者の使用説明書(Invitrogen)に従って行った。
最初の材料及び調製したHBウイロソームの流体力学的径、多分散性係数、及び統計的粒度分布を光子相関法又は動的光散乱によって決定した。この方法は、光散乱の時間変動として測定される、ブラウン運動の粒度依存的な速度に基づいている。生データ、つまり光強度の変動からの変数の計算のためのソフトウェアを含め、Malvern Zetasizer 1000HS(Malvern Ltd, Malvern, UK)をこの目的に使用した。試料を測定のためにPBS中に十分に希釈し、1mlの希釈液を25℃の標準条件下で分析した。
個々の成分の異なる密度に基づいて、HBウイロソーム構造への抗原の組込みを推定するための分析的方法として、不連続ショ糖勾配を通した超遠心を行った。PBS中のHBウイロソーム調製物の一部を、PBS中の20-60% (w/v)不連続ショ糖勾配の上に載せ、4℃で24時間100000gで遠心した。次に回収した分画を密度と蛋白質量に関して分析し、また異なる抗原の存在に関してウェスタンブロットを用いて分析した。
HBウイロソーム粒子の抗原の組込み及び最後の皮膜化を部分トリプシン処理によって調査した。次に処理後の試料を、蛋白質分解抵抗性の断片又は保護された全長蛋白質に関して、ウェスタンブロットによって分析した。HBウイロソームをPBSバッファー(無傷の粒子=自然条件)、又は0.5% デオキシコール酸ナトリウム及び1% Triton X-100入りのPBS(ウイロソーム構造の破壊=変性条件)のいずれかで希釈した。プロテアーゼ処理は5%トリプシン(w/w 蛋白質)を用いて、室温で0、2、5、及び10時間行った。トリプシン処理に対する個々の成分の効率的な接触可能性のコントロールとして、同濃度の異なる抗原の混合物を同じ条件下で処理した。反応は4×SDS-PAGEサンプルバッファーを加えることにより停止した。95℃での10分間の変性の後、試料をSDS-PAGE電気泳動、及びHBsとHBcに対する免疫ブロット分析にかけた。
HBウイロソーム構造中でのHA、HBs、HBc抗原の物理的結合は、(トリプシン処理に関して説明したような)天然及び変性条件下におけるそれぞれの抗原に対する別々の(個別の)免疫共沈降法、及びそれに続くウェスタンブロット分析による免疫共沈降された抗原の同定によって証明した。HBウイロソーム調合の免疫共沈降法は、HA、HBc、HBsに対する特異的抗体の存在下に、同時平行の実験で行われた。次に免疫複合体をプロテインGセファロースビーズ(Promega)と共に4時間インキュベーションし、遠心した。結果として生じる沈殿をPBSで5回洗浄した。免疫沈降された蛋白質をサンプルバッファー中で10分間煮沸することにより再懸濁し、SDS-PAGEとウェスタンブロットによって分析した。それぞれの抗原の存在はそれぞれの特異的抗体と共にインキュベーションすることにより調査した。
HBウイロソームの免疫原性に関してはこの時点で予備的なデータのみが利用可能である。HBウイロソームに加え、付加的なアジュバントRC529(Corixa)がある条件と無い条件で、マウスにおける実験を行った。マウスは異なる量のHBウイロソームの筋内注射によって免疫化され、全ての3つの抗原に対する高い抗体力価が検出された(図8)。3回目の増強の後、免疫化動物から脾臓細胞を精製し、それぞれの抗体を用いた試験管内での再刺激の後、インターフェロンγに対するELISPOTによって細胞反応を決定した(図9)。注目すべきはこの方法はCD4型とCD8型反応を区別しないことである。それに加え、免疫化動物からの脾細胞をFACSによって分析した(図10)。新しい脾細胞はHBc特異的5量体によって抗CD8抗体と共に直接染色された。別個に、脾細胞はCD8特異的ペプチド又は全蛋白質によって刺激され、次に細胞内インターフェロンγに対して抗CD4と抗CD8抗体のいずれかと共に染色された。
異なるウイルス蛋白質間の相互作用はビリオンの組立に重要であり、全てのウイルスに見られる一般原則である。包膜ウイルス粒子は組立に関して細胞膜構造に依存している。核酸と蛋白質の複合体であるヌクレオカプシドは、成熟したウイルス構造を形成するために、膜に結合したウイルス蛋白質と結合する。我々はB型肝炎ウイルスに関して、インビトロで、細胞膜構造のない条件で、異なる組換え供給源からのウイルス蛋白質を利用して、この過程が模倣できることを示した。ウイルス抗原の組換え供給源が量と質に関して好適であるが、インフルエンザHAに関して本明細書で適用したように、ウイルス蛋白質は同様に元のウイルスに由来してもよい。インビトロの調製物の柔軟性は異なる供給源からの多数の抗原の包含を可能にする。(HBVとインフルエンザに関して示したように)複数のウイルスからの蛋白質を含む多面的調製物は、この原理に基づいて物理的安定性、免疫学的性質、又はワクチンの防御範囲を改善する可能性がある。
C型肝炎を引き起こす原因としてのHCVは世界的な健康問題となっている。世界人口の内 %がこのウイルスに感染していると推定されている。予防的又は治療的用途のための、HCVに対するワクチンは現在存在しない。細胞システムにおけるウイルス様粒子の組立は実現されている(Baumert et al, Journal of Virology 1998, 75: 3827-3838; Hepatitis C virus structural proteins assemble into virus-like particles in isect cells)。HBVのように、核蛋白質の1量体が結合して膜に結合した包膜蛋白質(E1、E2)と相互作用する20面体のヌクレオカプシドとなる。
HCVとは別に、多数の重要なヒト病原体がフラビウイルス科ファミリーに含まれる(ウェストナイルウイルス、クンジンウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、黄熱ウイルス、及びダニ媒介脳炎ウイルス)。HCV(及びHBV)との構造レベルでの類似性は高く、それ故ウイルス様粒子のインビトロの再組み立ては可能だと思われる。
HIVはレトロウイルス科ファミリーの中で最も著名なメンバーである。繰り返すが、切迫した医療需要があるにも関わらず、効果的なワクチンは存在しない。これらのウイルスは更に複雑なヌクレオカプシドを形成するが、同じ原理に基づいた多抗原ワクチンのインビトロの調製は可能だと思われる。
Claims (24)
- ビロソームであって、
(a)少なくとも1種の脂質、及びインフルエンザウイルス及びB型肝炎ウイルス(HBV)の包膜タンパク質を備えるビロソーム膜、及び
(b)ビロソームの内側及び外側に位置し、前記包膜タンパク質に付着するHBVのHBcタンパク質を備えるヌクレオカプシド粒子、
を具えるビロソーム。 - 前記少なくとも1種の脂質には、少なくとも1種のリン脂質が包含される、請求項1のビロソーム。
- 前記リン脂質には、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンが包含される、請求項2のビロソーム。
- インフルエンザウイルスの前記包膜タンパク質が、ヘマグルチニン(HA)及び/又はノイラミニダーゼ(NA)である、請求項1から3の何れか1項のビロソーム。
- 前記HBVの包膜タンパク質がHBsタンパク質である、請求項1から4の何れか1項のビロソーム。
- ワクチンであって、請求項1から5の何れか1項のビロソーム、及び随意に製薬上許容される担体又は希釈剤及び/又はアジュバントを具える、ワクチン。
- アジュバントがRC529(Corixa(コリクサ社))である、請求項6記載のワクチン。
- ビロソームの生産方法であって、次の、即ち
(a)包膜ウイルスであるインフルエンザウイルス及びHBVの包膜タンパク質を脂質の存在下で洗浄剤溶液において可溶化する工程、
(b)洗浄剤の濃度を溶液において低下させる工程、
(c)HBcタンパク質を備えるHBVのヌクレオカプシド粒子を工程(b)で取得される溶液に加える工程、及び
(d)ビロソームが生産されるように洗浄剤を除去する工程
を具える、方法。 - 前記脂質には、少なくとも1種のリン脂質が包含される、請求項8の方法。
- 前記リン脂質には、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンが包含される、請求項9の方法。
- インフルエンザウイルスの前記包膜タンパク質が、ヘマグルチニン(HA)及び/又はノイラミニダーゼ(NA)である、請求項8から10の何れか1項の方法。
- 前記HBVの包膜タンパク質がHBsタンパク質である、請求項8から11の何れか1項の方法。
- さらに、工程(b)に続いて行われる以下の工程(b’)、即ち
(b’)工程(b)において取得される希釈物の滅菌濾過
を具える、請求項8から12の何れか1項記載の方法。 - さらに、工程(e)、即ち
(e)工程(d)において取得される希釈物の滅菌濾過
を具える、請求項8から13の何れか1項記載の方法。 - 洗浄剤が非イオン性界面活性剤である、請求項8から14の何れか1項記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤がオクタエチレングリコールモノ(N-ドデシル)エーテル(OEG)である、請求項15記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、工程(b)において、20mMから100mMの範囲内の濃度に適合される、請求項15又は16記載の方法。
- 脂質:タンパク質の比が1:1及び10:1の間の範囲内にある、請求項8から17の何れか1項記載の方法。
- 脂質:タンパク質の比が約5:1である、請求項18記載の方法。
- ビロソームにおけるホスファチジルコリンの割合が22%である、請求項10から19の何れか1項記載の方法。
- HA:ウイルス包膜タンパク質:ウイルスカプシドタンパク質の比が1:1:1である、請求項11から20の何れか1項記載の方法。
- さらに、工程(d)におけるビロソームの生産に先立つアジュバントの添加を具える、請求項8から21の何れか1項記載の方法。
- ビロソームの使用であって、請求項1から5の何れか1項記載の、又は請求項8から22の何れか1項記載の方法により取得されるビロソームの、ワクチンの調製のための使用。
- ビロソームの使用であって、請求項1から5の何れか1項記載の、又は請求項8から22の何れか1項記載の方法により取得されるビロソームの、HBV感染の予防、軽減又は処置のためのワクチンの調製のための使用。
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