NO337659B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine. - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine. Download PDFInfo
- Publication number
- NO337659B1 NO337659B1 NO20130773A NO20130773A NO337659B1 NO 337659 B1 NO337659 B1 NO 337659B1 NO 20130773 A NO20130773 A NO 20130773A NO 20130773 A NO20130773 A NO 20130773A NO 337659 B1 NO337659 B1 NO 337659B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antigen
- thiomersal
- vaccine
- hbsag
- adjuvant
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 70
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 162
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 161
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 161
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 54
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 claims description 54
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 46
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 35
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 33
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 19
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 7
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical group [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 claims description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical group O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 23
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 8
- 108010084884 GDP-mannose transporter Proteins 0.000 description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 7
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 6
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 6
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 6
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 5
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 5
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 5
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 5
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 5
- 102100037831 DNL-type zinc finger protein Human genes 0.000 description 4
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 4
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 4
- 150000007949 saponins Chemical group 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- PMTMAFAPLCGXGK-JMTMCXQRSA-N (15Z)-12-oxophyto-10,15-dienoic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@H]1[C@@H](CCCCCCCC(O)=O)C=CC1=O PMTMAFAPLCGXGK-JMTMCXQRSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical class [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- PMTMAFAPLCGXGK-UHFFFAOYSA-N OPDA Natural products CCC=CCC1C(CCCCCCCC(O)=O)C=CC1=O PMTMAFAPLCGXGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101100028078 Oryza sativa subsp. japonica OPR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 208000016350 chronic hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272478 Aquila Species 0.000 description 1
- 241000408930 Astictopterus jama Species 0.000 description 1
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical class [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 229940032024 DPT vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical class [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000656 anti-yeast Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- PJDVOLYULHZZAG-UHFFFAOYSA-N ethylmercury Chemical compound CC[Hg] PJDVOLYULHZZAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 229960004443 hemophilus influenzae b vaccines Drugs 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011551 log transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- NZMAJUHVSZBJHL-UHFFFAOYSA-N n,n-dibutylformamide Chemical compound CCCCN(C=O)CCCC NZMAJUHVSZBJHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
- A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en ny fremgangsmåte for fremstilling av en hepatitt B-vaksine for anvendelse ved behandling eller forebygging av hepatitt B-virus-(HBV) infeksjoner.
Kronisk hepatitt B-virus-(HBV) infeksjon som det for tiden er begrenset behandling for, utgjør et globalt offentlig helseproblem av enorme dimensjoner. Kroniske bærere av HBV, beregnet til et antall på mer enn 300 millioner verden over, har risiko for utvikling av kronisk aktiv hepatitt, cirrhose og primært hepatocellulært karsinom.
Mange vaksiner som for tiden er tilgjengelige krever et konserveringsmiddel for å forhindre forringelse. Et ofte anvendt konserveringsmiddel er tiomersal som er en kvikksølv-inneholdende forbindelse.
WO 9945957 A2 vedrører kombinerte vaksinepreparater som omfatter hepatitt B virus antigen (HBsAg) og et herpes simplex virus antigen (HSV) og en TH1 induserende adjuvans slik som 3D-MPL og QS21.
EP 314240 omhandler et preparat av HBsAg hvor tiomersal er inkludert i det endelige vaksi nepreparatet.
Noe bekymring er fremsatt omkring anvendelse av kvikksølv i vaksiner, selv om kommentatorer har understreket at de potensielle faremomenter med tiomersal-inneholdende vaksiner ikke bør overdrives (Offit; P.A. JAMA Vol,283; Nr:16). Allikevel ville det være fordelaktig å finne nye og potensielt sikrere fremgangsmåter for fremstilling av vaksiner for å erstatte anvendelse av tiomersal i framstillingsprosessen. Det er således et behov for å utvikle vaksiner som er tiomersal-frie, spesielt hepatitt B-vaksiner.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en stabil, immunogen hepatitt B vaksine uten spor av tiomersal, som omfatter: (a) å uttrykke hepatitt B overflateantigen (HBsAg) som et rekombinant protein i Saccharomyces cerevisiae; (b) bearbeide gjærcellene for å tilveiebringe et urenset antigen preparat;
(c) underkaste det urensede antigenpreparatet for
gelpermeasjonskromatografi, hvor elueringsbufferen som anvendes i gelpermeasjonskromatografien ikke inneholder tiomersal; (d) underkaste den antigen-inneholdende eluat fra trinn (c) for ionebytterkromatografi; (e) tilsette cystein til den antigen-inneholdende eluat-samling oppnådd etter trinn (d);
(f) underkaste preparatet fra trinn (e) for cesiumklorid
ultrasentrifugering; og
(g) kombinere det rensede HBsAg med en farmasøytisk aksepterbar eksipiens for å fremstille en stabil, immunogen hepatitt B vaksine;
hvor ikke noe tiomersal er tilsatt til den oppnådde vaksinen.
Antigenpreparatet er generelt uten spor av tiomersal når tiomersal ikke er detekterbar i det rensede antigenprodukt ved anvendelse av absorpsjonsspektrofotometri for kvikksølv, som beskrevet her.
Rensingen blir utført i fravær av tiomersal, og det rensede antigen er fullstendig fritt for tiomersal.
Fortrinnsvis er antigenet stabilt, hensiktsmessig i det vesentlige like stabilt som et hepatitt-antigen renset i nærvær av tiomersal, som for eksempel beskrevet i Referanseeksempel 1 her.
Vaksinen fremstilt ifølge oppfinnelsen omfattendehepatitt-antigenet er en immunogen vaksine.
Reduksjonsmiddel blir tilsatt i løpet av antigen-renseprosessen etter vekst av celler som uttrykker antigenet.
Reduksjonsmidlet er cystein.
Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en stabil immunogen hepatitt B-antigen vaksine uten spor av tiomersal som omfatter rensning av antigenet i nærvær av cystein.
Fortrinnsvis blir rensning utført i nærvær av en cysteinløsning.
Fortrinnsvis blir cysteinet, i løsning- eller pulver-form, tilsatt i løpet av prosessen til en endelig konsentrasjon på mellom 1 og 10 mM, fortrinnsvis 1 til 5 mM. Mer fortrinnsvis blir cysteinet tilsatt til en endelig konsentrasjon på ca. 2 mM.
Fortrinnsvis er cysteinet L-cystein.
Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en stabil hepatitt B-antigen vaksine uten spor av tiomersal hvor det rå antigen blir underkastet gelpermeasjonskromatografi, underkastet ionebytterkromatografi og blandet med et reduksjonsmiddel slik som cystein som har en fri -SH gruppe.
Fortrinnsvis er ionebytterkromatografi anionbytterkromatografi.
Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen tilveiebringer således en vaksine omfattende et hepatitt B-antigen, som er fri for tiomersal og hvor antigenet er minst like immunogent og antigent som hepatitt B-antigenet fremstilt i nærvær av tiomersal.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer således en vaksine omfattende et immunogent hepatitt B-antigen som har et gjennomsnittlig ELISA proteinforhold større enn 1,5 og et RF1-innhold med minst en 3-ganger lavere IC50-verdi enn den til hepatitt B-overflateantigen fremstilt i nærvær av tiomersal.
Den oppnådde vaksinen omfattende hepatitt B-antigenet kan anvendes enten for behandling eller forebygging av hepatitt B-infeksjoner, spesielt behandling eller forebygging av for eksempel kroniske hepatitt B-infeksjoner.
Vaksinen kan videre kombineres med et adjuvans. Fortrinnsvis er adjuvanset et aluminiumsalt eller en preferensiell stimulator av TH1-celle-respons.
Fremstilling av hepatitt B-overflate-antigen er veldokumentert. Se for eksempel Harford et. al. i Develop. Biol. Standard 54, side 125 (1983), Gregg et. al. i Biotechnology, 5, side 479 (1987), EP-A- 0 226 846, EP-A-0 299 108 og referanser der.
Som anvendt her omfatter uttrykket "hepatitt B-overflateantigen" eller "HBsAg" hvilket som helst HBsAg-antigen eller fragment derav som oppviser antigenisiteten til HBV-overflateantigen. Det vil forstås at i tillegg til 226 aminosyresekvensen av HBsAg S-antigen (se Tiollais et. al. Nature, 317, 489 (1985) og referanser deri) kan HBsAg som her beskrevet, om ønsket, inneholde alle eller en del av en pre-S-sekvens som beskrevet i referansene ovenfor og i EP-A-0 278 940. HBsAg som her beskrevet kan også referere til varianter, for eksempel "fluktmutanten" beskrevet i WO 91/14703.
HBsAg kan også referere til polypeptider beskrevet i EP 0 198 474 eller EP 0 304 578.
Normalt vil HBsAg være i partikkelform. I en spesielt foretrukket utførelsesform vil HbsAg bestå i det vesentlige av HbsAg S-antigenet nevnt ovenfor.
Vaksinen kan som nevnt fordelaktig omfatte et farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel så som et egnet adjuvans. Egnede adjuvantia er kommersielt tilgjengelige så som for eksempel Freund's ukomplette adjuvans og komplette adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); aluminiumsalter så som aluminiumhydroksydgel (alun) eller aluminiumfosfat; salter av kalsium, jern eller sink; en uoppløselig suspensjon av acylert tyrosin; acylerte sukkere; kationiske eller anioniske derivatiserte polysakkarider; polyfosfazener; bionedbrytbare mikrokuler; monofosforyl-lipid A og quil A. Cytokiner, så som GM-CSF eller interleukin-2, -7, eller -12, kan også anvendes som adjuvantia.
Vaksinen kan omfatte en adjuvans som fremkaller en immunrespons overveiende av TH1-type. Høye nivåer av Th1-type cytokiner ( f. eks. IFN-y, TNFa, IL-2 og IL-12) tenderer til å favorisere fremkalling av cellemedierte immunresponser på et administrert antigen. I det tilfellet hvor en respons er overveiende Th1-type, vil nivået av Th1-type cytokiner øke i større grad enn nivået av Th2-type cytokiner. Nivåene av disse cytokiner kan lett bedømmes ved anvendelse av standard forsøk. For en oversikt over familiene av cytokiner, se Mosmann og Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.
Egnede adjuvantia for anvendelse for fremkalling av en overveiende Th1-type respons inkluderer for eksempel en kombinasjon av monofosforyl-lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL) sammen med et aluminiumsalt. Andre kjente adjuvantia som preferensielt fremkaller en TH1-type immunrespons omfatter CpG-inneholdende oligonukleotider. Oligonukleotidene erkarakterisert vedat CpG-dinukleotidet er umetylert. Slike oligonukleotider er velkjente og er beskrevet i for eksempel WO 96/02555. Immunostimulerende DNA-sekvenser er også beskrevet, for eksempel av Sato et al., Science 273:352, 1996. Et annet foretrukket adjuvans er et saponin, fortrinnsvis QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), som kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre adjuvantia. For eksempel involverer et forbedret system kombinasjonen av et monofosforyl-lipid A og saponin-derivat, så som kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153, eller et mindre reaktogent preparat hvor QS21 blir dempet med kolesterol, som beskrevet i WO 96/33739. Andre foretrukne preparater omfatter en olje-i-vann emulsjon og tocopherol. Et spesielt kraftig adjuvanspreparat som omfatter QS21, 3D-MPL og tocopherol i en olje-i-vann-emulsjon er beskrevet i WO 95/17210.
En spesielt kraftig adjuvansformulering som omfatter QS21, 3D-MPL & tokoferol i en olje-i-vann emulsjon er beskrevet i WO 95/17210 og er en foretrukket formulering.
Følgelig, i én utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en vaksine omfattende et hepatitt B-overflateantigen som i tillegg omfatter TH-1-induserende adjuvans. Det TH-1-induserende adjuvans er valgt fra gruppen adjuvantia som omfatter: 3D-MPL, QS21, en blanding av QS21 og kolesterol, og et CpG-oligonukleotid. En vaksine omfattende et hepatitt B-overflate-antigen kan ha fått tilsatt monofosforyl-lipid A eller derivat derav, QS21 og tokoferol i en olje-i-vann-emulsjon.
En vaksine kan i tillegg omfatte et saponin, mer foretrukket QS21. En annen spesiell egnet adjuvans-formulering omfattende CpG og et saponin er beskrevet i WO 00/09159 og er en foretrukket formulering. Mest foretrukket er saponin i den spesielle formuleringen QS21. Fortrinnsvis omfatter formuleringen i tillegg en olje-i-vann-emulsjon og tokoferol.
En vaksine fremstilt ifølge oppfinnelse omfattende et hepatitt B-overflate-antigen sammen med et adjuvans kan i tillegg omfatte ett eller flere antigener valgt fra gruppen bestående av: difteritoksoid (D), tetanustoksoid (T) acellulære pertussis-antigener (Pa), inaktivert poliovirus (IPV), haemophilus influenzae antigen (Hib), hepatitt A-antigen, herpes simplex virus (HSV), chlamydia, GSB, HPV, streptococcus pneumoniae- og neisseria-antigener. Antigener som gir beskyttelse for andre sykdommer kan også inkluderes i vaksinen.
Vaksinen omfattende et hepatitt B-overflateantigen kan omfatte et adjuvans og et inaktivert poliovirus.
Behandling og/eller forebygging av hepatitt B-virusinfeksjoner er beskrevet, som omfatter administrering til et menneske eller dyr, som lider av eller er mottagelig for, hepatitt B-virusinfeksjon, av en sikker og effektiv mengde av en vaksine fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse for forebygging og/eller behandling av hepatitt B-infeksjon.
Et hepatitt B-overflateantigen kan anvendes for behandling av pasienter som lider av en hepatitt B-virusinfeksjon, så som kronisk hepatitt B-virusinfeksjon.
Vaksinen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse vil inneholde en immunobeskyttende mengde av antigenet.
Vaksinefremstilling er generelt beskrevet i Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, ed. Powell og Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Innkapsling i liposomer er for eksempel beskrevet av Fullerton, U.S. patent 4.235.877. Konjugering av proteiner til makromolekyler er beskrevet, for eksempel av Likhite, U.S. patent 4,372,945 og av Armor et al., U.S. patent 4,474,757. Anvendelse av Quil A er beskrevet av Dalsgaard et al., Acta Vet Scand, 18:349 (1977). 3D-MPL er tilgjengelig fra Ribi Immunochem, USA, og er beskrevet i britisk patentsøknad Nr. 2220211 og US-patent 4912094. QS21 er beskrevet i US patent nr. 5057540.
Foreliggende oppfinnelse blir illustrert det følgende eksempler og referanseeksempel, hvor: Figur 1 illustrerer tiomersal-fri produksjonsprosess for Engerix B™;
Figur 2 illustrerer SDS-PAGE analyse av bulk antigenpartier; og
Figur 3 illustrerer gjenværende gjærproteiner i bulk antigenpartier produsert ved den tiomersal-frie prosess.
Referanseksempel 1:
Produksjonsprosess for Hepatitt B- overflateantigen i nærvær av tiomersal
Hepatitt B-overflate-antigen (HBsAg) i SB Biologicals hepatitt B monovalente vaksine (Engerix B™) blir uttrykt som et rekombinant protein i Saccharomyces cerevisiae (se Harford et. al. loe, ert.). 24 kD proteinet blir produsert intracellulært og akkumulert i de rekombinante gjærceller. Ved slutten av fermenteringen blir gjærcellene høstet og oppbrutt i nærvær av et mildt overflateaktivt middel så som Tween 20 for å frigjøre det ønskede protein. Deretter blir cellehomogenatet, inneholdende de oppløselige overflate-antigenpartikler, for-renset ved en serie av presipitasjoner og deretter konsentrert ved ultrafiltrering.
Ytterligere rensning av det rekombinante antigen blir utført ved påfølgende kromatografiske separeringer. I et første trinn blir det rå antigen-konsentrat underkastet gelpermeasjon-kromatografi på Sepharose 4B medium. Tiomersal er til stede i elueringsbufferen ved 4B gelpermeasjon-kromatografitrinnet. Elueringsbufferen har den følgende sammensetning: 10mM Tris, 5% etylenglykol, pH 7,0, 50 mg/l tiomersal. Tiomersal er inkludert i denne buffer for å kontrollere biobelastningen. Mesteparten av denne tiomersal blir fjernet i løpet av de påfølgende rensningstrinn omfattende ionebytter-kromatografi, ultrasentrifugering og avsalting (gelpermeasjon) slik at rensede bulk antigenpreparater fremstilt ved den opprinnelige prosess inneholder ca. 1,2 ug og mindre enn 2 ug tiomersal pr. 20 ug protein.
Et ionebytter-kromatografitrinn blir utført ved anvendelse av en DEAE-matriks og denne samling blir deretter underkastet en cesium-gradient ultrasentrifugering på 4 preetablerte lag med forskjellige cesiumklorid-konsentrasjoner. Antigenpartiklene blir separert fra forurensende celle-bestanddeler i henhold til deres densitet i gradienten og eluert ved slutten av sentrifugeringsprosessen. Cesium-klorid blir deretter fjernet fra denne samling ved en andre gelpermeasjon på Sepharose-gel.
Når HBsAg blir fremstilt ved fremgangsmåten inneholdende tiomersal i 4B gelpermeasjonsbuffer, blir proteinkonsentrasjoner på over 30 mg/ml gjenvunnet i de samlede HBsAg-inneholdende fraksjoner fra CsCI-gradient, svarende til en ekvivalent konsentrasjon av HBsAg som analysert med AUSZYME-sett fra Abbott Laboratories.
CsCI-ultrasentrifugeringdtrinnet fjerner hensiktsmessig gjenværende lipider, DNA og mindre proteinforurensninger fra HBsAg-preparatet. Det blir utført ved sonesentrifugering i en Ti 15 rotor fra Beckman Instruments, Fullerton, California ved en hastighet på 30.000 rpm i omtrent 40 til 60 timer. Prøven som skal renses blir påført lag av CsCI-løsning med endelige konsentrasjoner på 0,75,1,5, 2,5 og 3,25 M CsCI. Etter sentrifugen ngen blir gradienten eluert i fraksjoner. Fraksjoner inneholdende HBsAg kan identifiseres ved UV-absorbans ved 280 nm eller ved testing av fortynninger av fraksjonene med AUSZYME-settet. HbsAg-båndet har en densitet på 1,17 til 1,23 g/cm<3>.
Løsningen inneholdende det rensede HBsAg blir sterilfiltrert før den blir anvendt til å fremstille et vaksinepreparat.
Rensning fra gjærcelle-lysat er kompleks ettersom antigenet blir produsert intracellulært og en serie av separeringsteknikker utformet for å fjerne forskjellige typer av (gjær) forurensninger er nødvendige for å oppnå rent bulk-antigen. Trinnene med rensning er viktig, ettersom produktet som skal renses er en lipoproteinpartikkel inneholdende multiple kopier av overflate-antigen-polypeptid og denne struktur må holdes gjennom hele renseprosessen. Det er et særtrekk ved denne prosessen at den gir overflate-antigenpartikler som er fullstendig immunogene uten behov for ytterligere kjemisk behandling for å forbedre immunogenisitet (sammenlign EP0135435).
Detaljer ved produksjonsprosessen er ytterligere beskrevet i europeisk patent 0199698.
Eksempel 2
Produksjon og karakterisering av gjær-avledet HBsAg ved en tiomersal-fri prosess.
1. Produksjon og rensning av gjær- avledet HBsAg
1.1 Oversikt over produksjonsprosessen
Hepatitt B-overflate-antigen kan produseres ved fermentering av en passende stamme av Saccharomyces cerevisiae, for eksempel den beskrevet i Harford et. al. (loe. eit.).
Etter stor-skala-fermentering av den rekombinante gjærstamme blir cellene høstet og brutt opp i nærvær av et mildt overflateaktivt middel så som Tween 20. Overflate-antigenet blir deretter isolert ved en flertrinns ekstraksjon- og renseprosedyre nøyaktig som beskrevet ovenfor i Eksempel 1 inntil trinnet med den første gelpermeasjon på Sepharose 4B.
1.2 Tiomersal-fri renseprosess
I den tiomersal-frie prosess blir de følgende to endringer utført sammenlignet med fremgangsmåten beskrevet i Referanseeksempel 1. 1. Elueringsbuffer for 4B gelpermeasjonskromatografitrinnet inneholder ikke lenger tiomersal. 2. Cystein (2mM endelig konsentrasjon) blir tilsatt til eluatsamlingen fra anionbytter-kromatografitrinnet.
Det ble funnet at utelatelse av tiomersal fra 4B gelpermeasjonsbuffer kan resultere i utfelling av HBsAg-partiklene i løpet av CsCI densitet-gradient-sentrifugeringstrinnet med tap av produkt og aggregering eller klumping av det utvunnede antigen.
Tilsetning av cystein med 2 mM endelig konsentrasjon til eluat-samlingen fra det foregående anionbytter-kromatografitrinn forhindrer utfelling og tap av antigen under CsCI-densitet-sentrifugering.
Cystein er en foretrukket substans for denne behandling ettersom den er en naturlig forekommende aminosyre og kan fjernes ved det påfølgende avsaltingstrinn på en gelpermeasjonskolonne ved anvendelse av Sepharose 4BCLFF som kolonnematriks.
Det er ingen andre endringer i framstillingsprosessen sammenlignet med fremgangsmåten beskrevet i Referanseeksempel 1.
Den tiomersal-frie prosess gir bulk-antigen med en renhet og med egenskaper sammenlignbare med antigen fra fremgangsmåten ifølge Referanseeksempel 1.
1.2a
Tiomersal tilsatt til 4B buffer med 50 ug/ml er antatt å dekomponere og det resulterende etylkvikksølv kan binde kovalenttil frie sulfhydrylgrupper på cysteinrester i proteinet. Proteinet inneholder 14 cysteinrester av hvilke 7 er lokalisert mellom posisjoner 101 og 150.
Denne region av proteinet er antatt å være lokalisert på overflaten av partikkelen og inneholde den større antigen-region av HBsAg omfattende den immunodominante a region og gjenkjennelsessetet for RF1 monoklonalt antistoff (Waters J et al, Postgrad. Med. J., 1987:63 (Suppl. 2): 51-56 og Ashton-Rickardt og Murray J. Med. Virology, 1989: 29:196). Antigen renset med tiomersal til stede i 4B gelpermeasjons-buffer inneholder omtrent 0,5-0,6 ug kvikksølv ved slutten av renseprosessen. Dette kvikksølv blir ikke fullstendig fjernet ved enkel dialyse.
I ett forsøk ble 0,56 ug kvikksølv pr. 20 ug protein målt i bulk antigenpreparatet. Dette preparatet ble dialysert i 16 timer ved romtemperatur mot 150mM NaCI, 10mM NaPCMbuffer pH 6,9. Ved slutten av dialysen ble en konsentrasjon på 0,33 ug Hg pr. 20 ug protein målt.
I motsetning resulterer dialyse i nærvær av et reduksjonsmiddel så som L-cystein med 0,1 til 5,0 mg/ml, DTT med 50 mM eller 2-merkaptoetanol med 0,5 M, fulgt av en andre dialyse for å fjerne reduksjonsmidlet, i reduksjon av kvikksølv-innholdet i antigenpreparatet til mindre enn 0,025 ug kvikksølv pr. 20 ug protein. Dette er den laveste grense for deteksjon ved metoden.
Kvikksølv-innholdet ble bestemt ved absorpsjons-spektrofotometri. Antigenet blir fortynnet i en løsning inneholdende 0,01% vekt/volum av kalium- bikromat (foC^O) og 5% volum/volum av salpetersyre. Standard løsninger blir fremstilt med tiomersal som kvikksølvkilde. Atomisk absorpsjon av prøve og standardløsninger blir målt etter fordampning i en dampgenerator, med en kvikksølv-spesifikk katode ved 253,7 nm. Atomisk absorpsjon av fortynningsvæsken er målt som blank. Kvikksølv-innhold av prøven er beregnet ved kalibreringskurver oppnådd fra standard-løsninger. Resultater er uttrykt som ug kvikksølv pr. 20 ug protein.
1.3 Produksjon av tiomersal-fritt bulk-antigen
Prosesstrinn for rensning av bulk-antigen er vist i Figur 1.
1.4 Sammensetning av vaksine formulert uten tiomersal.
En typisk kvantitativ sammensetning av en hepatitt B-vaksine uten konserveringsmiddel og formulert fra antigen fremstilt ved den tiomersalfrie prosess er gitt i Tabell 1.
Preparatet kan varieres ved tilsetning av 3D-MPL og/eller andre adjuvantia.
2. Karakterisering av bulk- antigen og vaksine produsert ved den tiomersal- frie prosess 2.1. Tester og forsøk med renset bulk-antigen
2. 1. 1 Basis for sammenligning
Tre partier av bulk-antigen ble fremstilt ved den tiomersal-frie prosess i henhold til dette eksempel (Eksempel 1.2) og er identifisert som HEF001, HEF002 og HEF003. Disse ble sammenlignet med et parti av bulk-antigen (HEP2055) fremstilt ved den tidligere prosess (som beskrevet i Eksempel 1) i nærvær av tiomersal.
2.12 Tester og forsøk med bulk- antigen
De tre bulk-antigenpartier produsert ved den tiomersal-frie prosess ble testet og resultatene er oppsummert i Tabell 2.
Protein-innhold ble målt ved metoden ifølge Lowry et al (J. Biol. Chem. 1951:193:265).
Endotoksin-innhold ble målt ved en Limulus gelkoagulasjonsteknikk ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett fra Cape Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA. Reagenset er standardisert mot US Pharm. Endotoxin Reference Standard.
Tween 20 ble målt ved metoden ifølge Huddleston og Allred (J. Amer. Oil Chemist Soc, 1965:42:983).
HbsAg-innhold ble målt med det kommersielt tilgjengelige AusZYME-sett fra Abbott Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, USA. Forsøksprosedyre B fra produsenten ble anvendt. En porsjon av bulk antigen renset ved fremgangsmåten inneholdende tiomersal ble anvendt som standard for å etablere doserespons-kurve.
Polysakkarider ble målt ved metoden ifølge Dubois et al (Anal. Chem. 1956:28:350).
Lipider ble målt ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett (Merkotest Total Lipids 3321) fra E.Merck, B.P. 4119, Darmstad D-6100, Tyskland.
DNA-innhold ble målt ved terskelmetoden ved anvendelse av apparat og reagenser tilgjengelig fra Molecular Devices Corp., Gutenbergstrafte 10, Ismaning, Munchen, Tyskland.
Verdiene funnet i testene og forsøkene er i området sett for bulk antigenpartier fremstilt ved anvendelse av tiomersal i elueringsbufferen i Sepharose 4B gelpermeasjonstrinnet, med unntak av antigen-aktiviteten ved ELISA. Verdiene for denne måling for de tre HEF-preparater er høyere (1,63-2,25) enn den funnet for bulk antigenpartiet HEP2055 som har et ELISA/proteinforhold på 1,13. ELISA/proteinforholdet målt med AUSZYME-settet for tiomersal-inneholdende porsjoner av bulk antigen er generelt omtrent 1,0 og innen området 0,8 -1,2 og overstiger meget sjelden 1,4.
2. 1. 3 SDS- PA GE gelanalyse
Bulk-antigenpreparatene ble undersøkt ved SDS-PAGE analyse under reduserende betingelser og Coomassie-blå merking. Alle prøver viste et hoved-bånd ved 24K med spor av et dimer-protein. Prøvene ble bedømt å ha høy renhet (> 99% rene) som bedømt ved fravær av synlige bånd fra forurensende proteiner.
Prøver (Vg) av bulk-antigenpreparatene ble undersøkt ved SDS-PAGE under reduserende og ikke-reduserende betingelser og sølv-merking (Figur 2). Ved reduserende betingelser viste prøvene en intens bånd-migrering ved 24K med spor av dimere og multimere former. Gelmønstrene kan ikke skilles fra det til HEP2055 som komparator. Prøvene ble også kjørt under ikke-reduserende betingelser. Under disse betingelser migrerer mindre av materialet ved 24K og mengden av polypeptid-migrering ved dimere og multimere posisjoner er øket. De tiomersal-frie bulk-antigenpartier synes å ha en noe høyere grad av polymerisering enn komparator-HEP2055-partiet.
Identiteten til 24K polypeptidet avslørt ved Coomassie-blå eller sølv-merking ble bekreftet ved Western blotting med kanin polyklonale antistoffer fremkalt mot plasma HBsAg. Bulk-antigenpreparatene viser et hovedbånd ved 24K sammen med dimere og trimere former. Teknikken avslører mindre spor av nedbrytningsprodukter av overflate-antigenprotein. Det er ingen forskjeller mellom bulk-antigen fremstilt ved den tiomersal-frie prosess og HEP2055-partiet.
Tilstedeværelse av gjenværende gjærproteiner ble undersøkt ved SDS-PAGE-analyse under reduserende betingelser og Western-blotting med kanin polyklonalt antiserum fremkalt mot gjærproteiner (Figur 3). Teknikken er kvalitativ og tillater ikke kvantifisering av urenheter.
Et konstant båndmønster er vist over de tre bulk-antigenpartier fremstilt ved den tiomersal-frie prosess og HEP2055-partiet med ett unntak.
Et sterkt merkende bånd til stede ved + 23K for HEP2055-bulk-antigen er praktisk talt fraværende for de 3 HEF-preparater. Western blotting viser at den tiomersal-frie renseprosess resulterer i et renere antigenprodukt.
2. 1. 4 Andre biokjemiske tester og forsøk
2. 1. 4. 1 DNA- innhold
DNA-innhold av de 3 bulk-antigenpartier ble målt ved terskelmetoden (Molecular Devices Corp). De målte mengdene var mindre enn 10 pg DNA pr. 20^g protein (Tabell 2); samme nivå av DNA-innhold sett ved bulk-antigen produsert ved den rådende godkjente prosess.
2. 1. 4. 2 Aminosvresammensetning
Aminosyre-sammensetningen av de tre HEF bulk-antigenpartier ble bestemt etter syrehydrolyse med 6N HCI ved kromatografi av aminosyrene på en ionebytter-kolonne med postkolonne ninhydrin-deteksjon. Prolin og tryptofan ble ikke bestemt. Resultatene er gitt i Tabell 3.
Sammensetningen funnet er i god overensstemmelse med den bestemt for HEP2055 og med den forventede sammensetning avledet fra DNA-sekvensen. Selv om antallet glycin-rester målt for HEP2055 er nær den forventede sammensetning, blir en verdi på 16 til 17 rester mer vanlig målt for bulk-antigenpreparater. Det gjennomsnittlige antall cysteinrester funnet er de forventede 14, som viser at ingen ekstra cysteiner er bundet til partikkelen som et resultat av behandlingen i CsCI-gradienttrinnet.
2.1.4.3 Kvantifisering av fri cystein
Mengden av fri cystein til stede i bulk-antigenpreparater oppnådd i henhold til metoden beskrevet ble målt etter oksydasjon av partiklene med permaursyre uten tidligere syrehydrolyse. Oksyderte frie cysteinrester ble separert på en ionebytterkolonne med postkolonne-deteksjon med ninhydrin. Grensen for deteksjon av cystein ved denne metoden er 1ug pr. ml.
Intet fritt cystein kunne måles i 3 HEF antigenpreparatene når testet ved de innledende proteinkonsentrasjoner gitt i Tabell 2.
Teknikken måler både frie cysteinrester til stede i bufferen og cysteinrester som er bundet til HBsAg-protein ved disulfid-binding, men som ikke utgjør del av polypeptid-sekvensen.
2. 1. 4. 4 N- terminal sekvensanalyse
Tilstedeværelsen av mulige proteinforurensninger og nedbrytningsprodukter i de tre bulk-antigenpartier produsert ved den modifiserte prosess ble bedømt ved N-terminal sekvensanalyse basert på Edman-nedbrytning. Den N-terminale sekvens MENITS... av HBsAg-proteinet ble detektert uten noen interferens fra andre sekvenser. Det N-terminale metionin ble også bekreftet å være 60-75% blokkert ved acetylering, som observert tidligere for HbsAg-polypeptid produsert ved rutineprosessen.
2. 1. 4. 5 Laserlysspredning- analyse
Partikkelstørrelse-sammenligninger ble utført ved laserlysspredning mellom HBsAg-partikler produsert ved anvendelse av den modifiserte prosess og HEP2055 referanse-partiet (Tabell 4).
De gjennomsnittlige molekylvekter bestemt viser god konsistens mellom preparatene.
2. 1. 4. 6 Elektronmikroskopi
Bulk-antigenpreparatene ble undersøkt ved elektronmikroskopi etter fiksering og merking med uranyl-acetat.
De observerte artiklene var lignende i alle prøvene og var i overensstemmelse med + 20 nm subsfæriske eller brosten-lignende partikler typiske for HBsAg. Partiklene observert i de 3 HEF-partiene kunne ikke skjelnes fra HEP2055.
2. 1. 5 Immunologiske analyser
2. 1. 5. 1 Reaktivitet med RF1 monoklonalt antistoff
De tre bulk-antigenpreparatene ble testet for deres reaktivitet med RF1 monoklonalt antistoff ved ELISA hemningsforsøk. RF1 monoklonalt antistoffer vist å beskytte sjimpanser mot utfordring med HBV og er antatt å gjenkjenne en beskyttende konformasjonell epitop på HBsAg-partikkelen (Iwarson S et al, 1985, J.Med, Virol., 16: 89-96).
RF1 hybridomet kan propageres i peritonealhulen til BalbC-mus eller i vevkultur.
Ascitesvæske fortynnet 1/50000 i metningsbuffer (PBS inneholdende 1% BSA, 0,1% Tween 20) ble blandet 1:1 med forskjellige fortynninger i PBS av HBsAg-prøver som skal testes (endelige konsentrasjoner i området mellom 100 ug og 0,05 ug/ml).
Blandinger ble inkubert i Nunc Immunoplater (96U) i 1 time ved 37°C før de ble overført i 1 time ved 37°C på plater belagt med et standard preparat av HBsAg. Standard HBsAg-preparatet var et parti bulk-antigen (Hep 286) renset ved den tiomersal-inneholdende prosess. Etter et vasketrinn med PBS inneholdende 0,1% Tween 20, ble biotin-konjugert sau anti-mus IgG fortynnet 1/1000 i metningsbuffer tilsatt og inkubert i 1 time ved 37°C. Etter et vasketrinn ble streptavidin-biotinylert peroksydase-kompleks fortynnet 1/1000 i metningsbuffer tilsatt til samme brønner og inkubert 30 min. ved 37°C. Platene ble vasket og inkubert med en løsning av OPDA 0,04%, H2O20,03% i 0,1 M citratbuffer pH 4,5 i 20 min. ved romtemperatur. Reaksjonen ble stanset med 2N H2SO4og de optiske densiteter (O.D.) ble målt ved 490/630 nm og plottet grafisk.
IC50, definert som den konsentrasjon av antigen (inhibitor-konsentrasjon) som hemmer 50% av antistoff-binding til belagt HBsAg ble beregnet ved anvendelse av en 4 parameter ligning og uttrykt i ng/ml.
En serie av HEP-antigenpartier omfattende HEP2055 ble også testet, sammen med Herpes simplex gD antigen som negativ kontroll. Forsøket måler evnen til hvert test-antigen til å hemme binding av RF1 til et standard antigenpreparat (HEP286) bundet til mikrotiter-plater.
Tabell 5 gir konsentrasjonene av hvert antigen funnet å hemme 50% av RF1-binding til det fikserte antigen.
<*>IC50 = antigenkonsentrasjon (ng/ml) som hemmer 50% av RF1 -binding til fiksert antigen
Resultatene viser at 4 til 7 ganger mindre HEF-antigen er nødvendig for å hemme RF1-binding (Tabell 5). Dette viser at antigen fremstilt ved den modifiserte prosess har en øket presentasjon av RF1-epitopen sammenlignet med HEP bulk-antigen.
Samme type hemningsforsøk ble utført ved anvendelse av humane sera fra Engerix B™ vaksiner istedenfor RF1 mAb og viste ikke forskjeller mellom HEP- antigenpartiene og HEF-antigenene.
2. 1. 5. 2. Affinitet av binding til monoklonal RF1
De kinetiske parametere for RF1 monoklonalt antistoff-binding til 3 HEF antigenpartiene og til HEP2055 ble målt ved overflate-plasmon-resonans ved anvendelse av et Biacore 2000 apparat fra Amersham Pharmacia Biotech, Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, UK. De målte kinetiske parametere var:
ka: assosiasjonshastighet-konstant (M-1S-1)
kd: dissosiasjonshastighet-konstant (S-1)
Ka: likevekts- eller affinitets-konstant (M-1)
Verdiene funnet er gitt i Tabell 6.
De tre HEF-antigenpartier ga lignende assosasjons/dissosiasjons-konstanter og bindingsaffinitets-verdier. I motsetning har HEP2055 en svakere affinitet for binding til RF1.
Dette er i overensstemmelse med resultatene fra ELISA-hemningsforsøk som viste at antigen fremstilt ved den tiomersal-frie prosess hadde en øket presentasjon av RF1-epitopen.
2. 2. Test og forsøk med vaksine formulert med antigen produsert ved den modifiserte prosess
De tre HEF-antigenpartier ble adsorbert på aluminiumhydroksyd og formulert som vaksine i henhold til sammensetningen vist i Tabell 1. Presentasjonen er dose for voksne i medisinglass (20^g antigenprotein i 1ml). Partiene er identifisert som DENS001A4, DENS002A4 og DENS003A4.
Vaksinestyrken ble målt ved et in-vitro antigeninnholds-forsøk ved anvendelse av Abbott Laboratories AUSZYME ELISA sett og et klassisk parti av vaksine formulert med 50 ng/ml tiomersal som standard. Vaksinestyrken ble målt ved anvendelse av metode B som beskrevet i PharmaEuropa Special Issue Bio97-2 (Desember1997). De tre HEF-partiene gir høye verdier for antigen-innhold, nesten to ganger det angitte innhold av 20 \ ig antigenprotein.
2. 2. 1 Reaktivitet til DENS vaksine med RF1 monoklonalt antistoff
Antigenisiteten av den adsorberte vaksine ble videre testet i et hemnings-forsøk med RF1 monoklonalt antistoff. Forsøket måler evnen til vaksineprøven til å hemme RF1-binding til fiksert bulk-antigen (HEP286).
Ascitesvæske fortynnet 1/50000 i metningsbuffer (PBS inneholdende 1% BSA, 0,1% Tween 20) ble blandet 1:1 med forskjellige fortynninger i PBS av vaksineprøver som skal testes (konsentrasjon i området mellom 20 ug og 0,05 ug/ml).
Blandinger ble inkubert i Nunc Immunoplater (96U) i 2 timer ved 37°C med agitering før de ble overført på HBsAg-belagte plater. HBsAg-preparatet anvendt for belegg var et parti bulk-antigen (Hep 286) renset ved den tiomersal-inneholdende prosess. Disse plater blir deretter inkubert i 2 timer ved 37°C med agitering. Etter et vasketrinn med PBS inneholdende 0,1% Tween 20 ble biotin-konjugert sau anti-mus IgG fortynnet 1/1000 i metningsbuffer tilsatt og inkubert i 1 time ved 37°C. Etter et vasketrinn ble streptavidin-biotinylert peroksydase-kompleks fortynnet 1/1000 i metningsbuffer tilsatt til brønnene og inkubert i 30 min. ved 37°C. Platene ble vasket og inkubert i 20 min. ved romtemperatur med en løsning inneholdende OPDA 0,04%, H2O20,03% i 0,1 M citratbuffer pH 4,5. Reaksjonen ble stanset med 2N H2SO4og optiske densiteter (O.D.) ble målt ved 490/630 nm og plottet grafisk.
IC50, definert som den konsentrasjon av antigen (inhibitor-konsentrasjon) som hemmer 50% av antistoff-bindingen til belagt HBsAg, ble beregnet ved anvendelse av en 4 parameter ligning og uttrykt i ng/ml.
Vaksine fremstilt fra bulk-antigen produsert ved den modifiserte prosess ble sammenlignet med Engerix B™ vaksine formulert fra klassisk HEP bulk-antigen og uten tiomersal som konserveringsmiddel.
Forsøkene ble kjørt in triplo.
Resultatene er gitt i Tabell 7 og viser at omtrent halve mengden av DENS vaksine er nødvendig for å oppnå 50% hemning av RF1-binding sammenlignet med den konservenngsmiddel-frie Engerix BTM vaksine. Dette reflekterer en øket presentasjon av RF1-epitop på HEF/DENS-antigen og er konsistent med testene utført med RF1 -antistoff på det rensede bulk-antigen.
2. 2. 2 Immunogenisitet av DENS- vaksine i mus
En undersøkelse ble utført på Balb/C-mus for å sammenligne immunogenisiteten av de tre DENS-konsistens partiene med Engerix BTM produsert i henhold til rådende antigen-fremstillingsprosess og formulert med tiomersal.
De følgende partier ble testet:
# DENS001A4
# DENS002A4
# DENS003A4
# ENG2953A4/Q som referanse
Grupper på 12 mus ble immunisert intramuskulært to ganger med 2 ukers mellomrom med vaksinedoser svarende til 1/10 (2^g) eller 1/50 (0,4^g) av voksen human dose. Antistoff-respons til HBsAg og den isotypiske profil fremkalt ved vaksinasjon ble overvåket fra sera tatt på dag 28.
EKSPERIMENTELL DESIGN
Grupper på 12 Balb/C-mus ble immunisert intramuskulært i begge ben (2 x 50 pl) på dager 0 og 15 med de følgende vaksinedoser:
På dager 15 (2 uker etter I) og 28 (2 uker etter II) ble blod tatt fra retroorbital sinus.
For utformingen av dette forsøket (4 preparater x 2 doser med 12 mus pr. gruppe), ble styrken beregnet a priori med PASS statistisk program. PASS (Power and Sample Size) statistisk program ble anskaffet fra NCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037. For 2 veis variansanalyse, skulle 2,5 ganger forskjell i GMT mellom preparater med en alfa-feil på 5% detekteres med en styrke > 90%.
RESULTATER
Serologi:
Humorale responser (Total lg og isotyper) ble målt ved ELISA-forsøk ved anvendelse av HBsAg (Hep286) som belegg-antigen og biotin-konjugert anti-mus antistoffer for å avsløre anti-HBs antistoff-binding. Bare etter II ble sera analysert.
Tabell 9 viser gjennomsnitt og GMT anti-HBs lg antistoff-responser målt i individuelle sera 2 uker etter II.
Sammenlignbare antistoff-responser blir fremkalt med DENS og klassiske hepatitt B-preparater: GMT i området mellom 2304 og 3976 EU/ml for DENS- partiene sammenlignet med 2882 EU/ml for SB Biologicals hepatitt B monovalente vaksine (Engerix B™) med 2ug dose, og GMT i området mellom 696 og 1182 EU/ml for DENS-partiene sammenlignet med 627 EU/ml for SB Biologicals hepatitt B monovalente vaksine (Engerix B™) med 0,4 ug dose. • Som forventet er en klar antigen-doseavhengig effekt observert for alle preparater med 2 \ ig og 0,4 ug doser med en 3 til 6 ganger forskjell i GMT. • Fire ikke-responderende mus (titere < 50 EU/ml) ble observert uten klare forbindelser til antigen-dosene eller partiene anvendt for injeksjonen (Grupper 1, 2, 3 og 8; én mus pr. gruppe). Basert på statistisk analyse (Grubbs Test) ble disse musene tatt bort fra ytterligere analyse.
Statistisk analyse:
En 2 veis variansanalyse ble utført på anti-HBs titere etter log transformasjon av post II data, ved anvendelse av vaksinene (4 partier) og antigendosene (2 ug og 0,4 ug) som faktorer. Denne analyse bekreftet at en statistisk betydelig forskjell ble observert mellom de to antigendoser (p verdi < 0,001) og ikke viste noen betydelig forskjell mellom vaksine-partiene (p verdi = 0,2674). Som tidligere nevnt ble styrken beregnet a priori og utformingen av forsøket var slik at en 2,5 ganger forskjell i GMT med en alfa feil på 5% kunne detekteres mellom preparater med en styrke
>90%.
Isotypisk profil:
Tabell 10 viser den isotypiske repartisjon (lgG1, lgG2a og lgG2b) beregnet fra en analyse av samlet sera etter II.
Som forventet blir en klar TH2-respons fremkalt av disse alun-baserte vaksiner ettersom
hovedsakelig lgG1-antistoffer er observert.
Ingen forskjell er observert mellom DENS-partiene eller SB Biologicals hepatitt B monovalente vaksine når det gjelder isotypisk profil.
Eksempel 3
Formulering av kombinerte vaksiner
Bulk-antigen ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt egnet for formulering i en kombinert vaksine omfattende IPV.
Stabilitetsundersøkelser utført på opprinnelige partier av en kombinert DTPa-HBV-IPV vaksine viste en nedgang i styrken av IPV-komponent, spesielt av type 1 poliomyelitt-antigen, ved anvendelse av et in vitro immunoassay (bestemmelse av D-antigen-innhold ved ELISA) og en in vivo styrketest. Intet styrketap ble observert for type 3. For type 2 var styrketapet innenfor det forventede område (ikke mer enn 10% tap pr. år med lagring).
Undersøkelser ble initiert for å bestemme årsaken til dette tap av styrke i den samlede DTPa-HBV-IPV vaksine. Fra observasjonen at stabiliteten til IPV i SB Biologicals DTPa-IPV vaksine er tilfredsstillende (ikke mer enn 10% antigen-innhold-tap pr. år lagring), ble det konkludert at HBV-komponenten sannsynligvis var ansvarlig for ustabiliteten av IPV i DTPa-HBV-IPV-vaksinen.
HBV-komponenten anvendt i den opprinnelige DTPa-HBV-IPV-formuleringen er renset r-DNA, gjær-avledet HBsAg også anvendt for fremstilling av SB Biologicals hepatitt B monovalent vaksine og fremstilt som beskrevet i Eksempel 1.
Som et første forsøk på å bestemme hvilket element i HBV-komponenten som var skadelig for IPV, ble HBsAg-bulk analysert for tilstedeværelse av tiomersal. Det er tidligere funnet (Davisson et al., 1956, J. Lab. Clin. Med 47: 8-19) at tiomersal anvendt som konserveringsmiddel i DTP-vaksiner "var skadelig for poliomyelitt-virus" i en DTP-IPV-kombinasjon. Denne observasjon ble tatt i betraktning av vaksineprodusenter som har erstattet tiomersal med andre konserveringsmidler for formulering av deres IPV-inneholdende vaksiner. Senere er effekten av tiomersal på IPV-styrke under betingelser med langvarig lagring ved + 4 °C blitt undersøkt påny. Tap av styrke av type 1 poliovirus-antigen til udetekterbare nivåer etter 4-6 måneder ble rapportert (Sawyer, L.A. et al. 1994, Vaccine 12: 851-856).
Ved anvendelse av atomisk adsorpsjonsspektroskopi ble omtrent 0,5 ug kvikksølv (Hg) pr.
20 ug av HBsAg detektert i antigen renset i henhold til Eksempel 1.
Denne mengde av kvikksølv (som tiomersal og etylkvikksølv-klorid, tiomersal-nedbrytningsprodukt) kan reduseres til udetekterbare nivåer ELISA-respons for D-antigen type 1-innhold i et IPV bulk-konsentrat inkubert ved 37°C i 7 dager.
En metode ble etablert for frigjøring av kvikksølv til stede i HBsAg-bulk. Det ble postulert at kvikksølv kunne være bundet til tiolgrupper på HBsAg- partikkelen og derfor kunne bli frigjort i nærvær av reduksjonsmidler. Etter eksperimentering med andre reduksjonsmidler ble L-cystein valgt som midlet for frigjøring av kvikksølv fra HBsAg-partikkelen. Etter dialyse av HBsAg-bulk mot saltvannsløsning inneholdende 5,7mM L-cystein, ble intet kvikksølv detektert i retentatet (deteksjonsgrense for testingsmetoden: 25 ng Hg/20 ug HBsAg). Det dialyserte antigen ble blandet med IPV-bulk-konsentrat og stabiliteten til type 1 virus ble bedømt ved å måle D-antigen-innholdet etter inkubering ved 37°C i 7 dager. IPV-bulk-konsentrat som var ikke-blandet og blandet med HBsAg ikke behandlet med cystein ble anvendt som kontroller. Referanse ELISA-titere ble oppnådd for prøver lagret ved +2°C til +8°C i 7 dager.
Resultatene er oppsummert i Tabell 11:
Dataene oppnådd for disse laboratorie-preparater demonstrerer klart at stabiliteten til type 1 poliovirus blir betydelig forbedret hvis HBsAg blir behandlet med cystein for å fjerne gjenværende kvikksølv før blanding med IPV.
Dataene presentert ovenfor viser også tap av D-antigen-innhold på 23% for referanse-IPV-preparatet etter inkubering i 7 dager ved 37°C. Dette bekrefter den iboende ustabilitet av type 1 Mahoney poliovirus, som tidligere rapportert (Sawyer, L.A. et al. (1994), Vaccine 12: 851-856).
Selv om kommersielle partier av DTPa-HBV-IPV og DTPa-HBV-IPV/Hib vaksiner er fremstilt ved anvendelse av en dialyseprosess med 5,7 mM L-cystein for å fjerne gjenværende kvikksølv og opprettholde stabiliteten til IPV, er dialyse-prosessen ikke egnet for storskala-produksjon og involverer en serie av supplementære trinn for å fremstille tiomersal- eller kvikksølv-fri HBsAg. I motsetning kan HBsAg fremstilt uten tiomersal, anvendes direkte i preparater av kombinerte vaksiner spesielt de inneholdende IPV.
4. Oppsummering
Den tidligere anvendte prosess for rensning av gjær-avledet overflate-antigen omfatter et gelpermeasjonstrinn hvor den kvikksølv-inneholdende anti-mikrobielle forbindelse tiomersal er inkludert i elueringsbufferen for å kontrollere biobelastningen.
Tiomersal blir ikke fullstendig utskilt under de påfølgende trinn av fremgangsmåten, slik at ca. 1,2 \ ig tiomersal pr. 20 \ ig protein er til stede i det rensede bulk-antigen.
For å produsere et fullstendig tiomersal-(kvikksølv) fritt bulk-antigen blir renseprosessen endret i to trinn.
• Tiomersal blir utelatt fra elueringsbufferen ved 4B gelpermeasjonstrinnet.
• Cystein (2 mM endelig konsentrasjon) blir tilsatt til eluatsamlingen fra anionbytter-kromatografitrinnet. Dette forhindrer utfelling av antigen under CsCI densitetsgradient-sentrifugering.
Det er ingen andre endringer i produksjonsprosessen.
Bulk-antigen produsert ved den modifiserte prosess er blittkarakterisert. Fysisk-kjemiske tester og forsøk viser at det tiomersal-frie antigen i egenskaper ikke kan skilles fra antigen produsert ved den tidligere anvendte prosess. Antigenpartiklene har samme bestanddeler.
Identitet og integritet av HBsAg-polypeptid er upåvirket av den modifiserte prosess som bedømt ved SDS-PAGE-analyse, Western blotting ved anvendelse av polyklonale anti-HBsAg-antistoffer, N-terminal sekvensanalyse og aminosyre-sammensetning. Elektronmikroskopi og laserlys-sprednings-analyse viser at partiklene har typisk form og størrelse forventet for gjær-avledet HBsAg. Analyse med Western blotting med anti-gjær protein-serum viser at antigenet produsert ved den tiomersal-frie prosess har et lignende mønster av forurensende gjær-proteiner. Imidlertid er mengden av et forurensende bånd som migrerer ved 23K sterkt redusert i de 3 HBsAg-partier produsert ved anvendelse av den modifiserte prosess.
Immunologiske analyser viser at de tiomersal-frie partikler har en øket antigenisitet. Partiklene er mer reaktive med Abbott AUSZYME-settet (inneholdende en blanding av monoklonale antistoffer) som gir ELISA/protein-forhold på 1,6 til 2,25. Denne økede antigenisitet er også vist med det beskyttende RF1 monoklonale antistoff. Omtrent 4 til 7 ganger mindre tiomersal-fritt antigen er nødvendig for å hemme RF1-binding til et standard fiksert antigen. Den tiomersal-frie og klassiske antigenhemning av bindings-kurver faller inn i to distinkte familier. Denne forskjell er også vist ved måling av bindingsaffinitets-konstant for RF1 ved anvendelse av overflate-plasmon-resonans. Bindingsaffiniteter av de tiomersalfrie preparater er 3 til 4 ganger høyere sammenlignet med partiet med klassisk bulk-antigen.
Bulk-antigenpreparatene ble formulert som vaksine ved adsorpsjon på aluminiumhydroksyd og uten konserveringsmiddel.
Testing for in vitro styrke ved anvendelse av Abbott AUSZYME ELISA-sett og tiomersal-inneholdende SB Biologicals hepatitt B monovalente vaksine som standard viste at høye in vitro styrkeverdier ble oppnådd. Antigeninnhold målt ved denne test var nesten det dobbelte av den angitte verdi på 20 \ ig protein pr. ml.
En øket reaktivitet av vaksine fremstilt fra tiomersalfritt antigen ble også sett i et hemningsforsøk med RF1 monoklonalt antistoff for binding til fiksert antigen. Omtrent halve mengden av den tiomersalfrie vaksine var nødvendig for å gi 50% hemning av RF1-binding til fiksert antigen sammenlignet med antigen renset ved den tidligere anvendte prosess og formulert uten konserveringsmiddel.
Denne økede antigenisitet av den tiomersalfrie vaksine med hensyn til RF1 er overensstemmende med resultatene fra in vitro styrketesten (antigeninnhold) og med RF1-antistoff-tester utført på bulk-antigenpreparatene.
En muse-immunogenisitetstest ble utført ved anvendelse av priming og booster vaksinasjoner med to ukers mellomrom og doser på 2 og 0,4 ug antigen. Blod ble tappet fra
musene på dag 28,14 dager etter booster-vaksinen. Sera ble analysert for antistofftiter og isotype-sammensetning. En klar antigen doseeffekt ble observert for de to doser administrert, men det var ingen statistisk betydelig forskjell i respons når det gjelder antistofftitere (GMT) mellom tiomersalfrie og konserveringsmiddelfrie vaksiner.
Ingen vesentlige forskjeller ble observert i isotype-profilene.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av en stabil, immunogen hepatitt B vaksine uten spor av tiomersal, som omfatter: (a) å uttrykke hepatitt B overflateantigen (HBsAg) som et rekombinant protein i Saccharomyces cerevisiae; (b) bearbeide gjærcellene for å tilveiebringe et urenset antigen preparat; (c) underkaste det urensede antigenpreparatet for
gelpermasjonskromatografi, hvor elueringsbufferen som anvendes i gelpermasjonskromatografien ikke inneholder tiomersal; (d) underkaste den antigen-inneholdende eluat fra trinn (c) for ionebytterkromatografi; (e) tilsette cystein til den antigen-inneholdende eluat-samling oppnådd etter trinn (d); (f) underkaste preparatet fra trinn (e) for cesiumklorid
ultrasentrifugering; og (g) kombinere det rensede HBsAg med en farmasøytisk aksepterbar eksipiens for å fremstille en stabil, immunogen hepatitt B vaksine;
hvor ikke noe tiomersal er tilsatt til den oppnådde vaksinen.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor cysteinet tilsettes til en sluttkonsentrasjon på mellom 1 og 10 mM.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, hvor cysteinet tilsettes til en sluttkonsentrasjon på omtrent 2 mM.
4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor ionebytterkromatografi er anionbytterkromatografi.
5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor vaksinen videre kombineres med et adjuvans.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor adjuvanset er et aluminumsalt.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvor adjuvanset er aluminumhydroksidgel eller aluminumfosfat.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor adjuvanset er et Th-1-induserende adjuvans.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor det Th1-induserende adjuvans er 3D-MPL; QS21; 3D-MPL og QS21; eller et CpG oligonukleotid.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor adjuvanset er 3D-MPL og et aluminumsalt.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0019728.5A GB0019728D0 (en) | 2000-08-10 | 2000-08-10 | Novel treatment |
| PCT/EP2001/009100 WO2002012287A1 (en) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Purification of hbv antigens for use in vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20130773L NO20130773L (no) | 2003-04-01 |
| NO337659B1 true NO337659B1 (no) | 2016-05-30 |
Family
ID=9897396
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20130773A NO337659B1 (no) | 2000-08-10 | 2013-06-04 | Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| GB (1) | GB0019728D0 (no) |
| NO (1) | NO337659B1 (no) |
| ZA (1) | ZA200301046B (no) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111110876A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-08 | 华兰生物工程重庆有限公司 | 一种特异性人免疫球蛋白病毒灭活工艺 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0314240A2 (en) * | 1987-10-26 | 1989-05-03 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| WO1999045957A2 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Combined vaccine compositions |
-
2000
- 2000-08-10 GB GBGB0019728.5A patent/GB0019728D0/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-02-06 ZA ZA200301046A patent/ZA200301046B/en unknown
-
2013
- 2013-06-04 NO NO20130773A patent/NO337659B1/no not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0314240A2 (en) * | 1987-10-26 | 1989-05-03 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| WO1999045957A2 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Combined vaccine compositions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20130773L (no) | 2003-04-01 |
| GB0019728D0 (en) | 2000-09-27 |
| ZA200301046B (en) | 2004-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5559847B2 (ja) | ワクチンに使用するためのｈｂｖ抗原の精製 | |
| AU2001282073A1 (en) | Purification of HBV antigens for use in vaccines | |
| WO2003066094A2 (en) | Hepatitis b vaccines | |
| JPH09510740A (ja) | クイラヤ サポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤 | |
| US20090104223A1 (en) | Method for Obtaining Antigenic Aggregates and the Use Thereof in Formulations | |
| NO337659B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine. | |
| EP0005864A1 (en) | Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same | |
| TWI311563B (en) | Method for production a stable,immunogenic hepatitis b vaccine without trace of thiomersal |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |