RU2639491C2 - Вирионы и вирусоподобные частицы вируса мозаики альтернантеры как усилители иммунного ответа - Google Patents
Вирионы и вирусоподобные частицы вируса мозаики альтернантеры как усилители иммунного ответа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639491C2 RU2639491C2 RU2015136916A RU2015136916A RU2639491C2 RU 2639491 C2 RU2639491 C2 RU 2639491C2 RU 2015136916 A RU2015136916 A RU 2015136916A RU 2015136916 A RU2015136916 A RU 2015136916A RU 2639491 C2 RU2639491 C2 RU 2639491C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- particles
- hpv
- vmalt
- virions
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 241001672114 Alternanthera mosaic virus Species 0.000 title claims abstract description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 title description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 27
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 241000428811 Alternanthera Species 0.000 claims description 2
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 101900318283 Alfalfa mosaic virus Capsid protein Proteins 0.000 abstract 2
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 55
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 53
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 241000709995 Papaya mosaic virus Species 0.000 description 9
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 241000710007 Potexvirus Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710195101 Flagellar filament outer layer protein Proteins 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219173 Carica Species 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000850834 Malva mosaic virus Species 0.000 description 1
- 240000000982 Malva neglecta Species 0.000 description 1
- 235000000060 Malva neglecta Nutrition 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000984340 Papaya mosaic potexvirus Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 102220539644 Piwi-like protein 1_K97V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 240000005860 Portulaca grandiflora Species 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 240000002439 Sorghum halepense Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940033324 influenza A vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения вирусоподобных частиц вируса мозаики альтернантеры. Для этого вирусоподобные частицы получают in vitro из белка оболочки вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт) в отсутствие РНК. Вирусоподобные частицы получают в физиологических условиях посредством инкубирования белка оболочки ВМАльт в 0.15 М NaCl при рН 7,0-7,5. Группа изобретений относится также к способу усиления иммунного ответа на антиген при иммунизации животных или человека смесью антигена и адъюванта, где в качестве адъюванта используют вирусоподобные частицы ВМАльт, полученные вышеуказанным способом. Использование данной группы изобретений позволяет получать стабильные и высокоиммуногенные вирусоподобные частицы, не отличающиеся по размерам и морфологии от полноценных вирусных частиц, при этом белок оболочки ВМАльт в физиологических условиях in vitro может реполимеризоваться в длинные спиральные структуры в отсутствие РНК. 2 н.п. ф-лы, 6 пр., 6 ил.
Description
Область техники
Изобретение относится к области вирусологии и иммунологии, а именно к способу получения вирусоподобных частиц и способам усиления иммунного ответа на антигены, смешанные с вирусоподобными частицами или нативным вирусом. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии и биотехнологии для получения антител.
Уровень техники
Вакцинация является основным способом профилактики инфекционных заболеваний. Цель вакцинации - создание сильного иммунного ответа, обеспечивающего длительную защиту от инфекции.
Основные типы вакцин, лицензированных для клинического использования, - живые аттенуированные, инактивированные и субъединичные, содержащие белки возбудителей заболевания или их отдельные фрагменты - эпитопы. Основным преимуществом вакцин нового поколения (субъединичных) является их безопасность, однако такие вакцины обычно обладают низкой иммуногенностью, что приводит к необходимости многократной иммунизации и применению адъювантов.
Адъювантами называют неспецифические стимуляторы иммунного ответа или соединения, создающие депо для антигена в организме хозяина, которые объединяются с вакциной для усиления иммунного ответа. Несмотря на прогресс в понимании механизмов действия адъювантов и разработки новых препаратов, при вакцинации человека традиционно используют водно-масляные эмульсии, соединения алюминия (алюминиевые квасцы, фосфат и гидроокись алюминия) и химические полимеры. При введении подкожно или внутримышечно они могут вызывать побочные эффекты, такие как гранулемы, абсцессы и рубцы, эффективность действия некоторых из этих адъювантов зависит от состава антигена или они являются слабыми иммуностимуляторами.
Один из подходов к повышению эффективности и безопасности вакцинации является использование вирусоподобных частиц (ВПЧ). Вирусоподобные частицы формируются в результате самосборки вирусных структурных белков в отсутствие вирусного генома и по своему строению и морфологии схожи с нативными вирионами. ВПЧ могут быть использованы в качестве вакцины для гомологичного вируса, из которого получены, в качестве платформы для презентации чужеродных эпитопов при производстве вакцин и для усиления иммунного ответа. Интерес к новым ВПЧ связан с разработкой и успешным применением ВПЧ вакцин против гепатита В и вируса папилломы человека.
Использование вирусов растений и ВПЧ на основе фитовирусов для презентации чужеродных эпитопов описано в ряде работ и патентах [Canizares et al. Use of virus vectors for vaccine production in plants. Immunol. Cell. Biol. 2005, 83, 263-270; Turpen et al. Production of peptides in plants as viral coat protein fusions. US Patent 5977438. Nov. 1999; Werner et al. International Patent Application PCT/EP2006/009029 (WO/2007/031339); Werner et al. Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103, 17678-17683; McCormick & Palmer. Genetically engineered Tobacco mosaic virus as nanoparticle vaccines. Expert Rev Vaccines. 2008, 7, 33-41; Steinmetz et al., Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2009, 327, 23-58; Denis et al., Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to a hepatitis С virus epitope: evidence for the critical function of multimerization. Virology 2007, 363, 59-68; Acosta-Ramirez et al., Translating innate response into long-lasting antibody response by the intrinsic antigen-adjuvant properties of papaya mosaic virus. Immunology, 2007, 124, 186-197; Lacasse et al., Novel plant virus-based vaccine induces protective cytotoxic T-lymphocyte-mediated antiviral immunity through dendritic cell maturation. J. Virology, 2008, 82, 785-794; Leclerc et al., Adjuvant viral particle. US Patent 7641896, Jan. 5 2010].
Получение новых типов вакцин на основе химерных вирусов растений и ВПЧ имеет ряд преимуществ: вирусы растений не патогенны для млекопитающих, в том числе для человека, обладают высокой иммуногенностью и способностью вызывать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. В некоторых случаях такие вакцины не требуют применения адъювантов [Marusic et al. Chimeric plant virus particles as immunogenes for inducing murine and human immune response against human immunodeficiency virus type 1. J. Virology 2001, 75, 8434-8439; Saini & Vrati. A Japanese encephalitis virus peptide present on Johnson grass mosaic virus-like particles induces virus-neutralizing antibodies and protects mice against lethalchallenge. J. Virology 2003, 77, 3487-3494].
Недавние исследования демонстрируют, что вирусоподобные частицы, полученные из структурных белков вируса мозаики папайи (ВМП) и вируса мозаики мальвы, принадлежащих к роду потексвирусов, обладают сильной адъювантной активностью и могут быть использованы для усиления иммунного ответа при вакцинации. Вирусы рода Potexvirus семейства Flexivirda представляют собой нитевидные вирионы длиной 470-580 нм и шириной 13-15 нм с однонитевой позитивной геномной РНК.
Показано, что вирусоподобные частицы ВМП, полученные в результате самосборки рекомбинантного белка оболочки (БО) ВМП при экспрессии в E. coli, можно использовать в качестве адъюванта при иммунизации животных химерными ВПЧ, несущими на своей поверхности М2е эпитопы вируса гриппа. Адъювантная активность оценивается по увеличению уровня IgG к пептиду М2е более чем в 10 раз по сравнению с иммунизацией без адъюванта. Сильное повышение иммуногенности ВПЧ-М2е содержащей вакцины, приводит к 100% защите мышей от заражения летальными дозами вируса гриппа. Механизм усиления иммунного ответа не известен, однако авторы отмечают значительную разницу в длине химерных ВПЧ и ВПЧ, используемых в качестве адъюванта - средняя длина 100 и 150 нм соответственно. Похожие результаты получены при совместной иммунизации мышей и хорьков ВПЧ ВМП и коммерческой трехвалентной инактивированной вакциной против гриппа. Показано усиление гуморального ответа на НА и NP белки вируса гриппа и клеточно-опосредованного иммунного ответа на NP и M1 белки, представленные в вакцине, но не иммуногенные, а также длительная защита животных к заражению гетеросубтипическим штаммом вируса гриппа (WSN/33). На лабораторных животных продемонстрировано применение ВПЧ ВМП как иммуностимулятора для профилактики вирусных и бактериальных заболеваний, вызываемых вирусом гриппа и пневмококком. [Mathieu et al., Induction of innate immunity in lungs with virus-like nanoparticles leads to protection against influenza and Streptococcus pneumoniae challenge. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013, 9, 839-848; Savard. et al., Improvement of the trivalent inactivated Flu vaccine using PapMV nanoparticles. PLoS One. 2011; 6: e21522; Rioux et al., PapMV nanoparticles improve mucosal immune responses to the trivalent inactivated flu vaccine. J. Nanobiotechnology 2014, 12,19; Denis et al., Development of a universal influenza A vaccine based on the M2e peptide fused to the papaya mosaic virus (PapMV) vaccine platform. Vaccine. 2008, 26 (27-28), 3395-403; Leclerc, Malva mosaic virus and virus-like particles and uses thereof. Patent WO 2009033276 A1 2009].
В нескольких работах показано, что иммуногенность ВПЧ зависит от их структуры и длины: так называемые диски, построенные из 20 субъединиц рекомбинантного белка оболочки, слитого с целевым пептидом, не иммуногены. Содержание дисков в препаратах ВПЧ ВМП может достигать 80%, в зависимости от метода получения.
Таким образом, метод, используемый для получения и выделения ВПЧ, явно имеет решающее значение для достижения более высоких уровней иммуногенности.
Известен способ получения вирусоподобных частиц из белка оболочки ВМП in vitro при рН 4,0 и низкой ионной силе, однако, такие частицы не стабильны при 5,0 и 6,0, а также в присутствии 0.2М Na Cl. При рН 8,0 сборка БО ВМП ограничивается образованием небольших агрегатов со спиральной структурой с коэффициентами седиментации 13-33S [Erickson & Bancroft. The Assembly of Papaya Mosaic Virus Protein. Virology 1976, 72, 514-517].
Известен способ получения вирусоподобных частиц ВМП в результате самосборки рекомбинантного белка оболочки ВМП при экспрессии в E. coli., однако, такие ВПЧ содержат РНК бактериального происхождения. [Tremblay et al. Effect of mutations K97A and E128A on RNA binding and self assembly of papaya mosaic potexvirus coat protein. FEBS J. 2006, 273, 14-25].
В качестве прототипа изобретения может быть рассмотрен патент [US 20140255439: Leclerc & Savard. Virus-like particles and process for preparing same, дата публикации 11.09.2014]. Способ получения ВПЧ in vitro из рекомбинантного белка и фрагмента РНК вируса мозаики папайи включает конструирование рекомбинантной плазмиды, кодирующей белок оболочки ВМП, экспрессию полученного гена в бактериальных клетках, выделение рекомбинантного белка с помощью металл-аффинной хроматографии, конструирование плазмиды, имеющей промотор для ДНК-зависимой РНК-полимеразы и фрагмент кДНК ВМП, получение РНК методом транскрипции in vitro и, наконец, инкубацию рекомбинантного белка и РНК при нейтральных рН и температуре от 2 до 37°. Полученные ВПЧ могут быть использованы в качестве адъювантов и, когда белок оболочки слит с антигеном, в качестве вакцин. Рассмотренный способ получения ВПЧ из рекомбинантного белка и РНК вируса мозаики папайи имеет ряд слабых сторон. Во-первых, он представляет собой сложный, многоступенчатый и дорогостоящий процесс. Во-вторых, препараты рекомбинантного белка ВМП, полученные из лизата E. coli, могут содержать неидентифицированные бактериальные компоненты, присутствие которых является нежелательным из-за потенциальных рисков или побочных эффектов. Наконец, РНК, входящая в состав ВПЧ, может стимулировать Т-клеточный ответ посредством активации Толл-подобных рецепторов. Как известно, активация Т-клеточных ответов может приводить к серьезным побочным действиям. [Bachmann et al. Patent. Vlp-antigen conjugates and their uses as vaccines WO 2006037787 A2 2006]. Тем не менее, данный метод применяется, так как авторы не смогли получить ВПЧ ВМП в отсутствие РНК в физиологических условиях.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка простого и эффективного способа получения вирусоподобных частиц in vitro из белка оболочки вируса растения со спиральной структурой в отсутствие РНК в физиологических условиях и их использование в качестве адъюванта для усиления иммунного ответа.
Поставленная задача решается тем, что вирусоподобные частицы получают in vitro из белка оболочки вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт) в отсутствие РНК. При этом вирусоподобные частицы получают в физиологических условиях посредством инкубирования белка оболочки ВМАльт в 0.15М NaCl при рН 7,0-7,5.
Поставленная задача решается также тем, что вирусоподобные частицы и вирионы ВМАльт используются для усиления иммунного ответа на чужеродные белки, находящиеся с ними в смеси при иммунизации. При этом иммунизация животных или человека проводится смесью антигена и адъюванта, где в качестве адъюванта используют вирусоподобные частицы ВМАльт стабильные в физиологических условиях. Возможен вариант, когда для усиления иммунного ответа на антиген при иммунизации животных или человека в качестве адъюванта используют вирионы ВМАльт.
Краткое описание рисунков
Рисунок 1 представляет внешний вид вирионов ВМАльт, выделенного из растений. Электронная микроскопия (А), атомно-силовая микроскопия (Б).
Рисунок 2 представляет электрофоретический анализ в 8-20%-ном ДСН-ПААГ препарата очищенного БО ВМАльт, показывающий белок оболочки ВМАльт с м.м. 23 кДа.
Рисунок 3 представляет внешний вид ВПЧ, полученных из белка оболочки ВМАльт в воде до (А) и после добавления 0.15М NaCl (Б); в 0.01 М Трис-HCl буфере, рН 7,4 до (В) и после добавления 0.15М NaCl (Г); в 0.15М NaCl (Д). Электронная микроскопия. Контрастирование 2% раствором уранил ацетата. Размер метки, 200 нм.
Рисунок 4 представляет собой график, иллюстрирующий результаты определения титра мышиных антисывороток к модельному антигену - БО вируса табачной мозаики (ВТМ), полученных при иммунизации животных смесью антигена и ВПЧ ВМАльт. ИФА.
Рисунок 5 представляет собой график, иллюстрирующий результаты определения титра мышиных антисывороток к модельному антигену - БО ВТМ, полученных при иммунизации животных смесью антигена и вирионов ВМАльт. ИФА
Рисунок 6 представляет собой график, иллюстрирующий влияние дозы вирионов и ВПЧ ВМАльт на интенсивность стимуляции иммунного ответа к антигену. ИФА.
Осуществление изобретения
Препаративное выделение вирионов ВМАльт осуществляют стандартным методом, разработанным для потексвирусов. БО ВМАльт, выделенный обработкой вирусной суспензии в Трис-HCl буфере, рН 7.4 нейтральным солевым раствором LiCl, с концентрацией 1-5 мг/мл инкубируют в течение 20 мин в 0.01М Трис-HCl буфере, рН 7,4 или в воде в присутствие 0.15 М NaCl или в 0.01 М Трис-HCl буфере, рН 7,4 или в воде и добавляют NaCl до конечной концентрации 0.15М. Полученные ВПЧ или вирионы ВМАльт смешивают с антигеном в массовом соотношении 3:1. Смесь готовят непосредственно перед инъекцией или за некоторое время до нее. Животному внутрибрюшинно или подкожно вводят смесь антигена и вирусных частиц. В результате введения такой смеси у животного развивается иммунный ответ на введенный антиген, выражающийся в появлении в сыворотке крови антител, специфичных к данному антигену.
Пример 1. Выделение и очистка вирионов ВМАльт.
Для препаративного выделения вирионов ВМальт листья зараженных растений портулака Portulaca grandiflora гомогенизировали с помощью ножевого гомогенизатора (число оборотов 800 об/мин) в двух объемах 0,05 М Трис-HCl буфера, рН 8,0, содержащего 10 мМ ЭДТА. После гомогенизации измельченную растительную массу, содержащую частицы ВМальт, очищали от крупных частиц (неразрушенные клетки, ядра, крупные фрагменты клеточной стенки и др.) фильтрацией под вакуумом через двойную марлевую ткань. Дальнейшая очистка гомогената листьев осуществлялась низкоскоростным центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин (ротор JA-14, «Beckman») при t+4°C. К осветленному гомогенату добавляли 1/5 часть хлороформа (по объему) и непрерывно встряхивали полученную смесь в течение 10 мин. Методом низкоскоростного центрифугирования при 10000 об/мин (15 мин, t+4°C, ротор JA-14, «Beckman») осуществляли разделение фаз в полученной эмульсии. Верхнюю водную фазу, содержащую вирусные частицы, аккуратно отбирали и добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Мr 6000) до конечной концентрации 5% и NaCl до 2%. После полного растворения компонентов раствор выдерживали в течение 2 ч при t+4°C. Образовавшийся осадок вируса отделяли центрифугированием при 10000 об/мин и растворяли в мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5) при постоянном перемешивании при t+4C. Полученный экстракт осветляли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин при t+4°C. Дальнейшую очистку вируса проводили с помощью двух циклов ультрацентрифугирования. При первом цикле осветленный экстракт ультрацентрифугировали с использованием 30%-ной сахарозной подушки в роторе Ti-50 при 32000 об/мин в течение 180 мин, t+4°C. Полученные осадки растворяли в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5). При втором цикле раствор осветленного вируса ультрацентрифугировали без сахарозной подушки в роторе Ti-50 при 32000 об/мин в течение 120 мин, t+4°C. Вирусный осадок растворяли 0.01М Трис-HCl буфера, рН 7.5 Концентрацию вируса определяли спектрофотометрически используя коэффициент экстинкции: Е260нм 0.1%=2,84. Анализ препарата ВМАльт методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) представлен на Рис. 1.
Пример 2. Выделение белка оболочки ВМАльт и получение ВПЧ в физиологических условиях.
Белок оболочки ВМАльт выделяли обработкой вирусной суспензии в Трис-HCl буфере, рН 7.5 нейтральным солевым раствором LiCl, доводя его до конечной концентрации 2 М, помещали на -20°C на ночь, после чего проводили центрифугирование при 10000 об/мин 15 мин (центрифуга «Eppendorf»). Супернатант, содержащий БО диализовали против тридистилированной воды, проводя смену воды три раза. Белок после диализа ультрацентрифугировали в роторе Ti-50 при 40000 об/мин 1 час. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции: E280нм 0.1%=0.7. Очищенный препарат БО при электрофоретическом анализе в денатурирующем полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) был представлен единственным компонентом с мол. массой 23 кДа (Рис. 2, дорожки 2, 3).
ВПЧ получали двумя способами:
1. Препарат БО ВМАльт с концентрацией 1-5 мг/мл инкубировали в воде или в 0.01М Трис-HCl рН 7,4 в течение 20 мин и добавляли 5 М NaCl до конечной концентрации 0.15 М.
2. Препарат БО ВМАльт с концентрацией 1-5 мг/мл инкубировали в воде или в 0.01М Трис-HCl рН 7,4 в присутствие 0.15М NaCl в течение 20 мин.
Пример 3. Анализ препаратов ВМАльт и ВПЧ ВМАльт методами просвечивающей электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии.
Для приготовления образцов для просвечивающей электронной микроскопии исследуемые образцы сорбировали на медных сетках для электронной микроскопии, покрытых формваровой пленкой (при нанесении пленки использовали 0,5% раствор формвара в дихлорэтане) в течение 15-20 секунд, после чего сетки негативно контрастировали 2% раствором уранилацетата. Наблюдения проводили с помощью электронных микроскопов JEM-1011 (JEOL, Japan) с цифровой фотокамерой GATAN ES500W и LEO-912AB (LEO, Germany).
Для приготовления образцов для атомно-силовой микроскопии на свежесколотую слюду или высокоориентированный пиролитический графит на 5-10 минут наносили 5-10 мкл исследуемого препарата. Затем образец два раза промывали в капле дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Сканирование проводили на микроскопах Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa Barbara, США) и SmartSPM (Аист-НТ, Россия) в резонансном режиме на воздухе. Типичная скорость сканирования - 1 Гц. Использовали кантилеверы fpN01S с резонансной частотой 118-190 кГц, жесткостью 5,3 Н/м и гарантированным радиусом закругления иглы 10 нм (НИИФП им. Ф.В. Лукина, Россия).
Для обработки и анализа АСМ-изображений использовали программу ФемтоСкан Онлайн (Центр перспективных технологий, Россия). Среднюю высоту частиц по АСМ-изображениям определяли при помощи автоматизированной функции программы ФемтоСкан, которая основана на пороговом анализе. Пороговая плоскость вычислялась как средняя высота поверхности, определенная по максимуму на гистограмме, плюс двойное среднеквадратичное отклонение (удвоенный уровень шума). Все части изображения, находящиеся выше этого порогового уровня, считались объектами, и их высота над пороговой плоскостью вычислялась автоматически. При статистическом анализе учитывались только отдельно лежащие частицы.
Анализ препарата ВМАльт методами ПЭМ и АСМ показал, что в поле зрения можно увидеть длинные гибкие нитевидные частицы, имеющие характерный для потексвирусов вид (Рис. 1). Статистический анализ показал, что средняя длина вирионов ВМАльт составила по данным электронной микроскопии 520-570 нм и средний диаметр -11 нм. Анализ препаратов с помощью АСМ позволил измерить среднюю высоту частиц, которая составила 6-8 нм.
Анализ препарата ВПЧ методами ПЭМ и АСМ проводили для изучения структуры и свойств ВПЧ, образованных из БО ВМАльт в разных условиях: в 0.15 М NaCl, а также в воде и в 0.01 М Трис-HCl буфере, рН 7,4 до и после добавления NaCl. Во всех случаях (Рис 3 А-Д) наблюдались длинные гибкие нитевидные частицы однородные по ширине и высоте, не отличающиеся по морфологии от вирионов ВМАльт. Средняя высота ВПЧ, как и случае вирионов ВМАльт, составила 6-8 нм. Средняя длина ВПЧ составила 400 нм, дисков не наблюдали. Средняя длина ВПЧ ВМП, полученных способом, описанном в прототипе составляла 90 нм (Mathieu et al., Induction of innate immunity in lungs with viruslike nanoparticles leads to protection against influenza and Streptococcus pneumoniae challenge. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013, 9, 839-848). Больший размер ВПЧ, приближающийся к размерам вириона обеспечивает более эффективную стимуляцию иммунного ответа.
Ранее нами было показано (Mukhamedzhanova et al., Characterization of Alternanthera mosaic virus and its Coat ProteinOpen Virol J. 2011; 5: 136-140), что БО ВМАльт в отсутствии РНК способен полимеризоваться in vitro с образованием вирусоподобных частиц и протяженных пучков при рН 4,0 и низкой ионной силе и в отличие от БО ВМП при рН 8,0. Представленные результаты показывают, что БО ВМАльт образует нитевидные ВПЧ и при нейтральных рН: в 0,01 М Трис-HCl буфере, рН 7,4 или в воде он формирует ВПЧ, сравнимые по размерам с вирусными частицами или превосходящие их по длине. После добавления к ВПЧ 0.15 М NaCl их структура остается неизменной. Также показано, что ВПЧ могут быть получены из БО ВМАльт инкубацией в 0,01 М Трис-HCl буфере, рН 7,4 или в воде в присутствие 0.15 М NaCl. Полученные ВПЧ оставались стабильными, по крайне мере, в течение 6 месяцев при 4°C.
Таким образом, результатом изобретения является новый способ получения ВПЧ ВМАльт в физиологических условиях.
Пример 4. Выделение белка оболочки ВТМ.
В качестве модельного антигена был выбран БО ВТМ, вируса относящегося к другой таксономической группе и не родственного антигенно с БО ВМАльт. Для получения БО ВТМ сначала были выделены вирионы ВТМ. Для этого листья зараженных ВТМ растений табака гомогенизировали с помощью ножевого гомогенизатора (число оборотов 800 об/мин) в двух объемах 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,8), содержащем 20 мМ ЭДТА и 0,1% β-меркаптоэтанол. После гомогенизации измельченную растительную массу очищали фильтрацией под вакуумом через двойную марлевую ткань. Дальнейшая очистка гомогената листьев осуществлялась низкоскоростным центрифугированием, при 10000 об/мин в течение 20 мин (ротор JA-14, «Beckan») при t+4°C. К осветленному гомогенату добавляли 1/5 часть хлороформа (по объему) и непрерывно встряхивали полученную смесь в течение 10 мин. Методом низкоскоростного центрифугирования при 10000 об/мин (15 мин, t+4°C, ротор JA-14, «Beckan») осуществляли разделение фаз в полученной эмульсии. Верхнюю водную фазу аккуратно отбирали и добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Мr 6000) до конечной концентрации 2% и NaCl до 1%. После полного растворения компонентов раствор выдерживали в течение 2 ч при t+4°C. Образовавшийся осадок вируса отделяли центрифугированием при 10000 об/мин и растворяли в мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,8) при постоянном перемешивании при t+4C. Полученный экстракт осветляли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин при t+4°C. Окончательную очистку вируса проводили путем ультрацентрифугирования препарата с использованием 20%-ной сахарозной подушки в роторе Ti-50 при 32000 об/мин в течение 120 мин, t+4°C. Полученные осадки растворяли в 10 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,8) или в воде.
Белок оболочки ВТМ выделяли ацетатным методом. Суспензию вируса с концентрацией 3 мг/мл помещали в ледяную баню и по каплям при перемешивании добавляли двойной объем ледяной уксусной кислоты. Смесь инкубировали до выпадения осадка РНК. Хлопьевидный осадок РНК отделяли центрифугированием (10000 об/мин, центрифуга «Eppendorf») +4°C в течение 20 мин. К супернатанту, содержащему белок, добавляли равный объем воды и диализовали в течение суток против двух-трех смен воды (по 1 л) при +4°C. При достижении рН 4.5 (что соответствует изоэлектрической точке БО ВТМ) белок выпадал в осадок, который собирали центрифугированием (10000 об/мин, центрифуга «Eppendorf») в течение 20 мин. Осадок растворяли в воде.
Пример 5. Способность ВПЧ и вирионов ВМАльт усиливать иммунный ответ при совместной иммунизации с белком оболочки ВТМ.
Беспородных белых мышей иммунизировали внутрибрюшинно смесью ВПЧ или вирионов ВМАльт и антигена - БО ВТМ, в массовом соотношении 3:1. Доза ВПЧ или вирионов ВМАльт составляла 30 мкг, а БО ВТМ - 10 мкг на 1 инъекцию. Контрольную группу мышей иммунизировали по такой же схеме одним БО. Смесь для инъекции готовили непосредственно перед иммунизацией. Объем инъецируемой смеси составлял 0,5 мл на 1 животное. Каждая группа состояла из 5 животных. Проведено 3 иммунизации с двухнедельным интервалом между ними. Кровь, индивидуально от каждой мыши, брали из хвостовой вены через неделю после последней иммунизации. Кровь выдерживали 2 ч при комнатной температуре до формирования сгустка, помещали на ночь в холодильник и на следующий день сгусток отделяли центрифугированием 10000 g 10 мин. Полученную сыворотку использовали для определения титра антител к БО ВТМ. Титр определяли в пуле, полученном путем смешивания равных объемов антисывороток от каждого животного, с помощью непрямого метода иммуноферментного анализа (ИФА). На планшетах MaxiSorp (Nunc) БО ВТМ (5 мкг/мл в в деионизованной воде) в объеме 100 мкл на лунку. Планшеты выдерживали ночь в холодильнике, промывали PBST (PBS, 0,1% Твин 20, рН 7,4) 5 раз по 200 мкл на лунку и вносили тестируемые антисыворотки в двойных серийных разведениях, приготовленных на PBST, начиная с разведения 1/1000. В качестве отрицательного контроля использовали преиммунную мышиную сыворотку.
Инкубировали 1 ч при 37°C на термостатируемом шейкере, промывали, как описано и добавляли противомышиные Ig, конъюгированные с пероксидазой хрена (Promega) в рабочем разведении 1/20000, приготовленном на PBS, содержащим 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Инкубировали 1 ч при 37°C на шейкере, промывали, как описано и добавляли субстрат - ABTS с перекисью водорода в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере рН 4,4. Оптическую плотность в лунках определяли на ридере Titerteck Multiscan при длине волны 405 нм через 20 мин после добавления субстрата. Титром антисыворотки считали ее последнее разведение, оптическая плотность в котором втрое превышала соответствующее значение преиммунной мышиной сыворотки.
Результаты определения титров антисывороток показывают, что иммунизация животных смесью ВПЧ или вирионов ВМАльт и БО ВТМ приводит к десятикратному увеличению концентрации антител к БО ВТМ в крови иммунизированного животного по сравнению с иммунизацией одним БО. Титр антител на 7 день после последней иммунизации смесью ВПЧ ВМАльт или вирионов ВМАльт и БО составил 1/600000 и 1/580000 соответственно (Рис. 4 и 5).
В прототипе, титр антисыворотки к модельному антигену - нуклеопротеину вируса гриппа на 21 день после инъекции составил 1/200000.
Данный пример показывает, что адъювант на основе ВПЧ или вирионов ВМАльт более эффективен при равном количестве антигена, использованного для иммунизации, чем адъювант на основе ВПЧ ВМП.
Таким образом, другим результатом изобретения является создание нового эффективного адъюванта на основе ВПЧ или вирионов ВМАльт.
Пример 6. Влияние дозы ВПЧ и вирионов ВМАльт на образование антител к БО ВТМ вирусу при совместной иммунизации с белком-антигеном.
Беспородных белых мышей иммунизировали внутрибрюшинно смесью ВПЧ или вирионов ВМАльт и БО ВТМ в массовом соотношении 5:1, 3:1 и 1:1. Доза ВПЧ или вирионов ВМАльт составляла 50 мкг, 30 мкг и 10 мкг и БО ВТМ - 10 мкг на 1 инъекцию. Для иммуноферментного определения титра антител к БО и к вирусу на планшетах MaxiSorp (Nunc) сорбировали БО ВТМ (5 мкг/мл в деионизованной воде) в объеме 100 мкл на лунку. Остальные процедуры осуществляли, как описано в Примере 5.
Результаты определения титров мышиных антисывороток, представленные на рисунке 6, показали, что при совместной иммунизации животных смесью БО и ВПЧ или вирионов ВМАльт в массовом соотношении 5:1, 3:1 и 1:1, в крови иммунизированных животных возникают антитела к БО. Титр антител на 7 день после последней иммунизации составил 1/500000-1/530000-1/590000 для ВПЧ и 1/490000-1/520000-1/570000 для вирионов ВМАльт-MU. Следовательно, в выбранном интервале концентраций доза не оказывала ощутимого влияния на эффективность стимуляции иммунного ответа.
Данный пример показывает, что ВПЧ или вирионы ВМАльт, используемые в качестве адъюванта, обладают высокой иммуногенностью в широком интервале концентраций.
Claims (2)
1. Способ получения вирусоподобных частиц вируса мозаики альтернантеры, характеризующийся тем, что вирусоподобные частицы получают in vitro из белка оболочки вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт) в отсутствие РНК, отличающийся тем, что вирусоподобные частицы получают в физиологических условиях посредством инкубирования белка оболочки ВМАльт в 0.15 М NaCl при рН 7,0-7,5.
2. Способ усиления иммунного ответа на антиген при иммунизации животных или человека смесью антигена и адъюванта, отличающийся тем, что в качестве адъюванта используют вирусоподобные частицы ВМАльт, полученные способом по п. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015136916A RU2639491C2 (ru) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | Вирионы и вирусоподобные частицы вируса мозаики альтернантеры как усилители иммунного ответа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015136916A RU2639491C2 (ru) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | Вирионы и вирусоподобные частицы вируса мозаики альтернантеры как усилители иммунного ответа |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015136916A RU2015136916A (ru) | 2017-03-10 |
| RU2639491C2 true RU2639491C2 (ru) | 2017-12-21 |
Family
ID=58454066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015136916A RU2639491C2 (ru) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | Вирионы и вирусоподобные частицы вируса мозаики альтернантеры как усилители иммунного ответа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2639491C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2483751C2 (ru) * | 2005-10-18 | 2013-06-10 | Новавакс, Инк. | ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ ГРИППА (VLPs) |
-
2015
- 2015-08-31 RU RU2015136916A patent/RU2639491C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2483751C2 (ru) * | 2005-10-18 | 2013-06-10 | Новавакс, Инк. | ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ ГРИППА (VLPs) |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| IVANOV P.A. et al. The complete nucleotide sequence of Alternanthera mosaic virus infecting Portulaca grandiflora represents a new strain distinct from phlox isolates. Virus Genes. 2011 Apr., 42(2), РР. 268-271. * |
| PETROVA E.K. et al. Comparison of assembly efficiency of cognate and artificial Potexvirus ribonucleoproteins. FEBS EMBO 2014 Conference, Тезисы, С. 620-621. * |
| М. В. АРХИПЕНКО и др. Искусственные вирусоподобные частицы, полученные in vitro из белка оболочки Х-вируса картофеля и чужеродных вирусных РНК. Acta naturae, Экспериментальные статьи, Т. 3, 3, 10, 2011, С.620-621. * |
| М. В. АРХИПЕНКО и др. Искусственные вирусоподобные частицы, полученные in vitro из белка оболочки Х-вируса картофеля и чужеродных вирусных РНК. Acta naturae, Экспериментальные статьи, Т. 3, 3, 10, 2011, С.620-621. PETROVA E.K. et al. Comparison of assembly efficiency of cognate and artificial Potexvirus ribonucleoproteins. FEBS EMBO 2014 Conference, Тезисы, С. 620-621. * |
| ПЕТУХОВА Н.В. И ДР. Вирусоподобные частицы - новая стратегия для создания противогриппозных вакцин. Вопросы вирусологии, 2013, 2, С.10-15. * |
| ПЕТУХОВА Н.В. И ДР. Вирусоподобные частицы - новая стратегия для создания противогриппозных вакцин. Вопросы вирусологии, 2013, 2, С.10-15. IVANOV P.A. et al. The complete nucleotide sequence of Alternanthera mosaic virus infecting Portulaca grandiflora represents a new strain distinct from phlox isolates. Virus Genes. 2011 Apr., 42(2), РР. 268-271. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015136916A (ru) | 2017-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Denis et al. | Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to a hepatitis C virus epitope: evidence for the critical function of multimerization | |
| US20190125853A1 (en) | Norovirus vaccine formulations | |
| RU2571223C2 (ru) | Вирусоподобные частицы, содержащие белки-мишени, слитые с белками оболочки растительных вирусов | |
| Zinkhan et al. | The impact of size on particle drainage dynamics and antibody response | |
| TW201217530A (en) | Norovirus capsid and rotavirus VP6 protein for use as combined vaccine | |
| WO2012078069A1 (en) | Spherical nano- and microparticles derived from plant viruses for the display of foreign proteins or epitopes | |
| US20180028635A1 (en) | Composition and uses thereof | |
| TW201803907A (zh) | 作為抗瘧疾疫苗之生物融合蛋白 | |
| CN109303916A (zh) | 焦亡相关蛋白gsdmd在制备菌蜕疫苗中的应用 | |
| AU2005280896B2 (en) | Vaccine for oral administration | |
| US20170166612A1 (en) | Method for enhancing immunogenicity of epitope peptide of hpv antigen, virus-like particle, and method for preparing hpv vaccine | |
| WO2006045532A2 (en) | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus | |
| CN102327611A (zh) | 以HBeAg蛋白和/或HBeAg抗原表位多肽作为免疫原的疫苗 | |
| RU2639491C2 (ru) | Вирионы и вирусоподобные частицы вируса мозаики альтернантеры как усилители иммунного ответа | |
| JP2022513452A (ja) | 融合によって修飾されたｃｍｖのウイルス様粒子 | |
| RU2266754C2 (ru) | Способ получения антигенных агрегатов и их применение в препаратах | |
| EP1802746B1 (en) | Virosome particles comprising antigens from influenza virus and hepatitis b virus | |
| RU2442604C1 (ru) | Способ усиления иммунного ответа | |
| CN113278634A (zh) | 一种预防和治疗默克尔细胞癌的新型疫苗 | |
| JP2013545733A (ja) | ヒト免疫不全ウィルス（ｈｉｖ）の組換えエンベロープ蛋白質及びそれを含むワクチン | |
| CN111166881A (zh) | 一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用 | |
| RU2660563C2 (ru) | Вакцина против краснухи на основе структурно-модифицированного вируса растений и способ ее получения | |
| JP2021514391A (ja) | ノロウイルスに対する免疫応答を生成するための免疫原性組成物及びワクチン | |
| RU2440140C1 (ru) | Иммуногенная композиция, содержащая чужеродные антигены на поверхности сферических носителей, полученных при термической денатурации спиральных вирусов | |
| Zinkhan et al. | ournal of Controlled Release |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190326 Effective date: 20190326 |