JPS61289882A - ウイルスの熱不活性化方法および蛋白性塊 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はワクチンまたはワクチン中間体として有用な粒
子の溶液または懸澗液に関する。さらに詳しく　ｊＡ＜
べろと、本発明は免疫原性の高い新規な形態の粒子を保
有する肝炎Ｂ型表面抗原（ｌＩＢｓＡｇ）の製法に関す
る。更に詳しくは、不発明番：ｌ、高淵縮抗原塊すなわ
ち蛋白例えばアルブミンを加えることによる希釈を行な
っていないものに加熱を使用して不活性化を実施する、
抗原含有環の不活性化方法に関する。本発明は前記の抗
原組成物の製法、および動物特に人間を免疫にするその
使用に関する。

肝炎Ｂ型表面抗原（）ｌＢｓＡｇ）として現在３ｉｊべ
られていることと肝炎Ｂ型ウィルスとの関係は、アルフ
レッド・Ｍ・ブリンス（八１ｆｒｅｄ　Ｍ、ｒ’ｒｉｎ
ｃｅ）によって何年も前に明確に確立されている〔プロ
・ナショ・アカデ・サイ　（ニー・ニス）　（ｒ’ｒｏ
、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、５ｃｉ（Ｕ、Ｓ、）６０：　８１４−８２Ｌ
　１９６８　）　、この抗原は約１８〜２４ｎｍの粒度
を有するリボ蛋白粒子および同様な直径を有するフィラ
メントの膜内に内在する蛋白質上において主に見い出さ
れる。これらは＋１ＶＢのピリオンを包囲しているもの
と同様な膜のフラグメントに相当することが知られてお
り、また「ゾーン（Ｄａｎｅ）　ｊ粒子としても知られ
ている。

その後、このような粒子を含むワクチンはプルムバーグ
（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）等の米国特許第３，６３６，１９
１号に開示された。さらにその後、プリンスおよび他の
人々によって、ゾーン粒子およびフィラメントから誘導
した膜蛋白を含む他の肝炎Ｂ型ウィルスワクチンが開示
された。これらのゾーン粒子およびフィラメントは肝炎
Ｂ型ウィルスの多くの慢性保菌者内に見い出された肝炎
Ｂｅ抗原を含んでおり、またはこれらと一体化されてい
た。

上記研究が行われて以来、肝炎Ｂ型ウィルスに対するワ
クチンがｔｌ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子と共に米国に紹介さ
れるようになった。上記の米国特許第３，６３６，１９
１号に多少述べられているように、このワクチンは慢性
的に感染している。ＩＩＢＶ保菌者の血傾から誘導され
た粒子を含むＨＢ！３Ａｇの酵素消化によって作られて
いる。このワクチンはかなりの免疫原性損失を伴う高価
な精製方法によって製造されている。

この結果、充分な免疫応答を得るためには、得られた抗
原（ＩＩＢｓＡｇ）を比較的多量に投与しなｌればなら
ない。このためワクチンを入手するためには、約３０．
００ドル／服用量以上の比較的高い費用を支払わなけれ
ばならなかった。肝炎Ｂ型ウィルスに対する免疫を得る
ためには、最初の注射および２回のブースターが要求さ
れるので、米国において現在約１００．００ドルの費用
がかかり、このワクチンが最も必要な世界の国々におい
ては」二記費用は支払い不可能な額である。

従って、ずっと少ない投与量で安価に使用することがで
きるように、著しく高い免疫原性を有するほとんど純粋
な形で肝炎Ｂ型表面抗原を含む肝炎Ｂ型ワクチンを提供
することが望まれていた。

もちろん、出発血漿中に存在する伝染性ウィルスを完全
に不活性化して伝染の危険性をなくすことも必須の要件
である。

肝炎Ｂ型の大部分は、公衆衛生措置の資金が限られてい
るアジアおよびアフリカにおりる発展途上国の人々に感
染している。肝炎Ｂ型ウィルスの感染、その結果による
肝硬変および肝臓癌に発達する危険性にさらされている
多くの人々を救済するために、そのようなワクチンを提
供すること、およびこのワクチンを安価に提供すること
はこの２０世紀における義務である。発展途上国の多く
の地方においては、ワクチンを使用する必要がある場合
、免疫に要する費用は１人あたり１．００ドル未満でな
げればならない。

本発明者は、既に米国特許出願箱６５６．８３３号に、
天然には決して見られない新規な形態（ｍｏｒｐｈｏｌ
ｏｇｙ）を有する形に著しく形質転換（ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍ）され、かつ驚くほど免疫原性が高められたＨＢｓ
抗原を含む粒子を特徴とするワクチンまたはワクチン中
間体の製法を開示した。そこに開示された実験によれば
、濃縮１１　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ含有量は次の段階によって
製造される： Ａ、　　ＨＢｓＡｇを含む血漿例えばヒトの血漿をポリ
エチレングリコールと接触させて、その中に含まれる他
の血清蛋白質からＨＢｓＡｇを分離させることにより血
漿からＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇを沈澱させ；Ｂ、そのよう
に分離したｔｌ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの負吸着を水酸燐灰石
上で行い、血清蛋白の大部分をさらに除去し； Ｃ６そのように吸着したＨＢｓＡｇを等密度遠心法で処
理して、残存する完全ゾーン粒子を分離するとともにわ
ずかに残存している混入血清蛋白をさらに除去し； Ｄ、上記遠心法によってそのように分離した粒子を０．
５〜１０ｍｇ／ｍβの濃度で１０１〜１０４°Ｃの温度
で２〜５分間加熱することにより上記粒子に対して熱不
活性化を行い、その後、例えばそれらを氷水浴に導入す
ることにより加熱粒子を冷却することによって生成され
る。

しかしながら、前記工程りの熱不活性化工程は、粒子の
変性を回避するために安定性濃度の蛋白質の存在下で実
施する必要があるものと考えられていた。

驚ろくべきことに、工程Ｃから得られる塊の熱不活性化
は、ＨＢｓＡｇの安定剤の添加を全く行うことなく、す
なわちアルブミン等の材料によるｌＩＢｓＡｇ含有粒子
の希釈を行うことなく、実施できることが今や見出され
た。更に、本発明者が見出したところによれば、前記の
熱不活性化がアルブミン不合組成物を提供するだけでな
く、得られる組成物は、その中において１ｌＢｓＡＨの
新規形態学的形状が電子顕微鏡によって更に容易に見る
ことのできるものである組成物である。

血清例えばヒトの血清中に存在する他のウィルスも同じ
様に不活性化することができるものと考えられ、そして
その結果、他の病原体特にウィルスを本発明によってす
なわち安定剤例えばカプリル酸ナトリウム安定化アルブ
ミンの添加を行わずに熱不活性化する場合には、他の病
原体特にウィルスの濃厚抗原性組成物を同様にしてワク
チンまたはワクチン中間体として使用することができる
ものと考えられる。ここで、できるだけ純粋なワクチン
、すなわちできるだけ外来蛋白質例えばアルブミンの含
有量の少ないワクチンを提供するのが有利である点に注
意されたい。

従って、広義には、本発明はウィルスおよびその抗原性
成分を含有する濃厚塊中において熱不活性化によってウ
ィルスを不活性化する改良された方法であって、前記の
濃厚塊が前記ウィルス含有血清（この血清からは実質的
な■の血清蛋白質が除去されているものとする）から得
たものであり、そして安定化（例えば蛋白性）希釈剤に
よる希釈を行ずに前記濃厚塊を熱不活性化処理する、前
記の方法に関する。抗原性成分の濃縮の際またはウィル
スの熱不活性化の際のいかなる時点でも蛋白質を加えな
い態様で全工程を実施するのが好ましい。その後、所望
により、濃厚塊を例えば蛋白質例えば血清アルブミンま
たはアジュバントによって希釈することができる。更に
、食塩水で希釈して、すぐ投与できるまたは更に加工で
きる塊を形成することができる。ウィルスの熱不活性化
は、し抗原性成分例えばＨＢｓＡｇ粒子を含む濃厚塊を
濃度０．５〜１９ｍｇ／ｍＩ！、および温度１０１〜１
０４°Ｃで２〜５分間加熱し、そして続いて、加熱され
た粒子を、例えばそれらを水浴中に導入することによっ
て冷却することによって行う。

全体として、肝炎Ｂ型ワクチンは、本発明により次の工
程によって製造される。

ｉ’、、　　ＨＢｓＡｇを含む＊脩イ列えばヒ１への面
別をポリエチレングリコールと接触させて、その中に含
まれる他の血清蛋白質からＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　Ｂを分離
させることにより血漿からＩｔ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｚを沈澱
させ；Ｂ、そのように分離したＨＢｓＡｇの負吸着を水
酸燐灰石上で行い、血清蛋白質の大部分をさらに除去し
； Ｃ０そのように吸着したＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇを等密度
遠心法で処理して、残存する完全ゾーン粒子を分離する
とともにわずかに残存している混入血清蛋白質をさらに
除去し； Ｄ、上記遠心法によってそのように分離した粒子を、蛋
白質によるその希釈を行わずに、０．５〜１０ｍｇ／ｒ
ｎ２の濃度で１０１〜１０４°Ｃの温度で２〜５分間加
熱することにより上記粒子に対して熱不活性化を行い、
その後、例えばそれらを氷水浴に導入することにより加
熱粒子を冷却することによって生成される。

本発明によれば、前記の工程へ〜Ｔ稈Ｃは、被処理塊が
ＨＢｓＡｇ含有粒子少なくとも９５重１ｄ％好ましくは
９９重量％（蛋白質の総重量を基（□１（とする）を含
むように実施する。熱不活性化の際には、組成物を安定
化するためにＨ１■成物に対して希釈剤例えばカプリル
酸すトリウムで安定化したアルブミンは加えない。従っ
て、熱不活性化プロセスは、安定剤の不存在下で、特に
他の血漿蛋白質の不存在下で実施する。

不活性化段階は、２．５〜６．０分間の全滞留時間の間
、工程Ｃから得られた非希釈化精製粒子溶液を１０１〜
１０４℃の熱媒体（例えば油浴）浸漬した直径２鶴の管
（例えば青銅またはステンレススチール製）に通過させ
ることにより１０１〜１０４°Ｃの温度で行うことが好
ましい。注意すべきこととして、本発明方法を実施する
場合、管内部の溶液を１０１〜１０４°Ｃに加熱するた
めには、いくらかの時間が必要であり、従って「全沸留
時間」は溶液が実際に１０１〜１０４°Ｃで加熱される
時間よりも長くなる。もちろん、この滞留時間は流量に
よって異なってくる。

配慮すべきこととして、溶液の温度を１００°Ｃ以上に
する時、連続流のフラッシュ加熱は溶液の気化を防止す
るために高圧の下で行わなければならない。このことは
高圧液体クロマトグラフィーポンプおよび受器から発す
る静水圧ヘッドを用いることにより容易に行われる。

任意であるが、追加の不活性化は工程Ｃからの精製抗原
をトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　　８０のような洗浄剤で
処理することにより、例えば２％のトウィーン８０水溶
液の等容量を加えることにより行うことができる。この
処理はワクチンの安全性をさらに高めるものである。し
かしながら不活性化工程において洗浄剤処理を行わなく
とも免疫性の高い生成物が得られる時には、洗浄剤処理
を行わない方がよい。

フラッシュ加熱不活性化工程に続いて、回復し、精製し
およびウィルスを不活性化した粒子溶液は、所望ならば
、燐酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムゲルに対
する吸着によってアジュバント処理される。熱帯地方に
おいて使用する場合、所望ならば、ミョウバンゲルの添
加に先立ってワクチンを凍結乾燥し、再水和後ミョウバ
ンゲルを加えることは望ましいことである。

その後、溶液は０９１５モルのＮａｃβのような生理学
的に問題のない媒体で希釈することにより最終ワクチン
として仕上げられる。

最終ワクチンにおいて、ＨＢｓＡｇを含む蛋白質濃度は
０．１〜１０．ｕｇ／ｍ７である。注射による望ましい
投与量はレシピエンドの年齢によって決定される。大人
の男性の場合、ＩＩＢｓＡＨの一般的な投与量は１〜１
０μｇであり、筋肉内、皮下または皮肉に注入される。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

肝炎Ｂ型表面抗原の、血漿からの精製は、ポリエチレン
グリコールによる沈澱、水酸燐灰石による吸着および臭
化カリウム中での等密度遠心法（後述する）の連続工程
によって実施する。

その後、組成物は０．２２ミクロンのフィルターを通し
て濾過され、安定剤または蛋白希釈剤の添加を行うこと
なく、上記組成物は、」二記においてｊホべたように加
圧下１０２〜１０５℃に保持されている油浴中におｌる
０、１〜］０＋＋１１場合により１〜３闘の直径を有す
るステンレススチール管を１ＪＩｌ遇させながら、１０
１〜１０４°Ｃで１〜１５分間場合により２〜５分間加
熱不活性化処理される。」二記圧力は沸騰を防止するの
に充分高くなげればならず、即ち８００〜１１０００１
Ｉｎ１１、特に９００〜１０００宵１１ｇでなければな
らない。

このように加熱された塊は、次に例えば氷水浴中におけ
る容器に入れることにより冷却される。

一般に加熱処理の終了後、２〜４℃までの冷却が５分以
内の全行われる。しかしながら、２０〜１００°Ｃ特に
７５〜９０°Ｃの任意の誘導温度にセットした浴中にお
ける第２コイルに溶液を通過させ、最適結果を得ること
が望ましいことがある。

精製されかつフラッシュ加熱不活性化されたＩＩ　Ｂ　
ｓ　Ａ　ｇ含有原料は次に燐酸アルミニラ１、アジュバ
ントを用いて好適に処理される。一般的に、予備滅菌さ
れた燐酸アルミニウムは、無菌条件の下で、不活性化希
釈化抗原に加えられ、希釈された抗原（７１）１．ｍ１
２当り０．３〜０．６　ｍ　ｇの燐酸アルミニウムの濃
度とする。その後、アジュバント処理された３、■酸物
は適当な容器に無菌充填される。最終容器は追加の滅菌
段階として６５°ｃ（ｒ低温殺菌法」）で１０時間さら
に保持されて、ｉｙＬ終生酸生成物全性をさらに確実な
ものとすることができる。ワクチンは免疫処理のために
使用される前に、３年以内の間２〜６℃の温度に保持さ
れる。

上記に述べた方法でＨＢｓＡｇを精製し、そして非希釈
ＨＢｓＡｇ含有粒子に前記加熱処理を与えた結果として
、前記米国特許出願第６５６，８３３号によって形成さ
れる型の普通の形状でばないＨＢｓＡｇ含有粒子が生成
するが、勿論、安定剤は共存しない。この方法は安定剤
／希釈剤の添加に伴うコス１−を回避するだけではなく
、系の監視がより容易になりそれらの新規形態学的形状
の生成を保証することができる。なぜなら、本発明方法
によれば、新規形態学的形状を、電子顕微鏡下で、より
容易に見ることができるからである。最初のＩＩ　Ｂ　
ｓ　Ａ　ｇ含有粉子は通常球形であり、大部分１８〜２
４ｎｍの大きさを有しているが（第３図）、本発明の方
法により製造された粒子は特に第１図、第４図および第
６図に見られるように、種々の形態を有するフィラメン
トに殆ど変形されている。第４図から第７図、特に第５
図には、これまでに見たことのない特に著しく変形され
たフィラメントが示されている。

ＨＢｓＡｇ抗原性を含むそのようなフィラメントは枝分
れまたは環形状によって特徴づけられている。

これらの形状は曲線状または直線状である。一般的に言
って、フィラメントは少なくとも５０ｎｍの長さを有し
、通常１００〜１１０００ｎである。

フィラメント状構造が枝分れしている時、枝分れ部分の
構造は少なくとも５０ｎｍ、Ｌばしば１００〜３００ｎ
ｍの長さを有する。本発明の方法によって得られるフィ
ラメントのいくつかは、１つのフィラメント構造に対し
て少なくとも３つの枝を有し、かつ不規則な形状を有し
ており、その最小の長さは少なくとも１１００ｎであり
、好ましくは２００〜１１０００ｎである。

第４図から第７図の電子顕微鏡写真において、本発明の
ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ含有粒子としては環状形粒子、枝分れ
フィラメントおよび直線形フィラメント状粒子ならびに
直径１６〜２５ｎｍの球形ＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ粒子が
あることが観察される。

前記の形態学的形状としては、突出状のフィラメント状
部分を有する環状形粒子がある。フィラメント状粒子は
通常少なくとも５０ｎｍの長さを有し、一般的に１００
〜３００ｎｍの長さを有する。

洗浄剤処理を用いる時、枝分れしていないフィラメント
は２０℃で１．２１０〜１．２３０Ｇｍ／ｃｃ　（平均
１．２２４Ｇｍ／ｃｃ）の密度を有することを特徴とし
、従っていわゆるゾーン粒子および／または関連フィラ
メントを有する慢性ＨＢｓＡｇ保菌者の血漿内に見られ
る枝分れしていないフィラメントと区別される。後者の
フィラメントは１．２００の平均密度を有する。

「環状形」粒子としては、はとんど完全な円形または環
状形ならびにほぼ密閉状のものを生成する粒子がある。

包囲状のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ含有塊によって区画される領
域は長円形またはドーナツ形を含む任意の形であり、即
ちその領域は規則的または不規則的な形状を有すること
ができる。

上記の観察される形態学的形状は従来記載されたミセル
状粒子とは全く異なっている。後者のミセル状粒子はポ
リペプチド鎖の疎水性端部から成る中央ハブを特徴とし
ており、このペプチド鎖の親水性部分はほぼ球形の粒子
の表面上に延びている。しかしながら本発明によって製
造されたフィラメントは中央ハブに接続されていない。

フィラメントのいくつかは不規則な環状形をしており、
これら自身突出状のフィラメントを有している。

しかしながら通常そのような突出状フィラメントは３つ
以下であり、通常２つまたは単に１つである。もちろん
本発明の粒子は外４ｐｊ　ｌこ突出するフィラメントを
有する濃密な芯部を有していない。

本発明を肝炎Ｂ型ワクチンに至るＩＩＢνの不活性化に
関して特に説明してきた。しかしながら、本発明方法は
、他の生ウィルス〔特には、リピド被覆ウィルス、レト
ロ（ｒｅｔｒｏ）ウィルス、アゾノウイルス、ヘルペス
ウィルス、ポックスウィルス、レオウィルス、ミクソウ
ィルス、はしかウィルス、流行化耳下腺炎ウィルス、お
よびロイコ（ｌｅｕｋｏ）ウィルスを含む〕およびその
ウィルスに対する抗原性成分を含有する濃度塊において
前記他の生ウィルスを前記の態様で不活性化するのに有
用である。本発明によりワクチン調製に至る抗原性環中
で不活性化することのできる特定のウィルスとしては、
インフルエンザウィルス、例えばその各種の菌株例えば
株Ｘ−３１およびジャパン株、エプスタイン−バール（
Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、
ジフテリア、鳥類肉腫（ａｖｉａｎ　ｓａｒｃｏｍａ）
　、家禽斑（ｆｏｗｌ　ｐｌａｑｕｅ）　、足部および
口部疾病、コレラ、Ａ型肝炎、ＩＩＴＬＶ−３、狂犬病
、ならびに天然痘が含まれる。

本発明および本発明を実施する方法をさらに充分説明す
るために、次の実施例を提示する。

実膳貫１ 慢性ＨＢｓＡｇ保菌者から得られたＨＢｅＡｇおよびＨ
ＢｓＡｇの両方を含む貯蔵血漿をｐｌ＋４．６に調整し
、ウエストファリア（ｍｅｓｔｐｈａｌｉａ）連続流遠
心分前機において１０．００ＯＲＰＭで清澄化する。清
澄した上澄み液は最終濃度４％ＰＥＧ、６０００に４℃
で調整し、２０分間攪拌する。沈澱物を遠心分離によら
ず２時間沈降させることにより回収し、ｐｎを７．５〜
８．０に調整することによって最初の容量の１７５の蒸
留水中に溶解する。次にｐｎを５．０まで下げ、得られ
た沈澱物を遠心分離により回収する。次に上澄み液のｐ
’Ｈを４．６に調整し、ＰＥＧを加えて最終濃度を３％
にする。

４℃で一晩沈降した後、沈澱物を中和により再溶解し、
この懸濁液を、上記のようにｐＨを５．０に下げた後、
清澄化する。この材料をｐＨ６，８に調整し、０．００
５Ｍ燐酸塩緩衝液の添加後、等量の充填水酸燐灰石（ｈ
ｙｄｒｏｘｙ　Ｉａｐａｔｉｔｅ）で２〜３回連続吸着
することによりさらに精製する。その後、水酸燐灰石沈
降物を０．０２および０．０５Ｍの燐酸塩緩衝液で洗浄
する。最後に、最初の上澄み液および水酸燐灰石沈降物
の洗浄物を貯蔵し、遠心分離により清澄化し、アミコン
（Ａｍｉｃｏｎ）中空繊維カートリソジで最初の血漿の
容量の約０．３％まで濃縮する。

濃縮したＨＢｓＡｇを次に固体のＫＢｒで１．２５ｇ／
ｒｌ！の密度に調節し、１．３ｇ／ｍａクッション上に
おいて直線状１．０５〜１．２　ｇ　／　ｍ＃　ＫＢｒ
勾配の下でベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｔｉ−１４
ローター内に充填する。

この勾配を２８．　ＯＯＯｒｐｍで１８時間遠心分離し
、ローターの中央にポンプで水を供給することにより分
別する。１．１７〜１．２２　ｇ　／　ｍ　Ｒの密度に
相当する両分を貯蔵する。

３．７３に基ツ＜）の濃度に調節し、０．２２ミクロン
のミリポア（Ｍｉｌｌｆｐｏｒｅ）フィルターを通して
濾過する。その後精製した抗原は、９５０ｍｍ１１ｇ圧
力の下で、１０２℃の温度に保持されている油浴中に懸
架されている直径２１１１のステンレススチール製コイ
ルを通過させ、この場合原料が１０２℃で２分間保持さ
れるような速度で送り込まれる。このためには２分４０
秒の全滞留時間が必要である。希釈に続いて、得られた
組成物を無菌燐酸アルミニウムでアジュバント処理する
。最終ミョウバン吸着ワクチンは追加的ウィルス不活性
化工程として６５“Ｃで１０時間さらに処理することが
できる。

且漣月嫉Ｌ １０２℃で行う加熱不活性化工程およびその後の工程を
除いて、実施例１の方法をほぼ同様に繰返す。これによ
り、実施例１に述べられているような１．１８ｍｇ／ｍ
ｌの蛋白質濃度を有するＨＢｓＡｇ含有塊が含有量る。

ＨＢｓＡｇの純度は、多価および１価抗ヒト血清蛋白抗
血清についてのゲル拡散研究によると、９５％以上であ
る。従って組成物は検出できる量のヒト血清蛋白をほと
んど含んでいない。試料の一部分を、２％燐タングステ
ン酸によるネガ染色後に、１９５，０００倍の電子顕微
鏡写真に撮る。この試料の電子顕微鏡写真を第３図に示
す。

災厳骸 実施例２に述べた試料の一部分を、その後、２分４０秒
間の全滞留時間の間１０２°Ｃの油浴中に浸漬されてい
る直径２ｎのステンレススチール管に通過させることに
より、１０２℃にさらして加熱処理する。１０２℃の温
度に到達するまで４０秒かかる。従って、蛋白質組成物
は約２分間１０２℃で加熱されるわけである。試料はわ
ずかに乳白光を放ち、若干の凝集性を示す。試料の一部
をネガ染色し、それを電子顕微鏡写真に撮る。第４図に
示すように、直線状、枝分れ状および一般に円形のフィ
ラメント形状を有する表面抗原粒子が加熱後に現れる。

これらの粒子は最初の製剤中には存在していない。これ
らの粒子は単純な凝集からよりもむしろ実際の膜融合か
ら生ずる。なぜならば、これら粒子を３０分間も超音波
にさらしても、これら粒子の形態は何ら影響されないか
らである。

フィラメント状および球形状粒子の相対的免疫原性を測
定するために、これら粒子を遠心分離により相互部分的
に分離する。

実施撚↓ 実施例３の加熱製剤を８０００　ｇで２０分間遠心分離
し、上澄み画分に分離し、この両分を、濾過による損失
を減少させるために５０μＩｔ／ｍβのトウィーン２０
を添加した後に０．２２ミクロンのミリポア膜を通して
さらに濾過する。この上澄み留分の一部をネガ染色し、
電子顕微鏡写真に撮る。得られた電子顕微鏡写真を第５
図に示す。

実施冊立 実施例４において濾過により得られた沈降物を等張塩水
に再懸濁し、最初の容量とし、ネガ染色して電子顕微鏡
写真に撮る。その顕微鏡写真を第６図に示す。

カプリル酸ナトリウムによって安定化された３ｍｇ／ｍ
［のヒト血清アルブミンの存在の下で、実施例３におい
て述べたように製剤をフラッシュ加熱した。多形態フィ
ラメントが再び生成された（第７図）。

実施例２および３の組成物の３０ミクロリツトル、実施
例４の組成物の４０ミクロリツトルおよび実施例５の組
成物の９０ミクロリツトルをそれぞれ１０ｍ１の無菌標
準塩水に加え、０Ｄ２８゜に対して推定４ミクログラム
／　ｍ　ｅを生じる。これは、加熱工程から得られる乳
白光により蛋白濃度のおよその推定値であると認められ
る。これら試料の最も正確な蛋白質含有量はビオラド（
Ｂｌｏｔ？＾Ｄ）蛋白質検定によって得られる。各溶液
はオランダＢ１１ｔｈｏｖｅｎのｔｈｅ　Ｒｉｊｋｓ　
Ｉｎ５ｔ、　ｖｏｏｒ　ｄｅ　Ｖｏｌｋｓｇｅ−ｓｕｎ
ｄｈｅｉｄ、によって調整された燐酸アルミニウムゲル
（１，２ｍｇ／ｍβ）の等容量で調節し、０．３ｍｇの
燐酸アルミニウム（ミョウバンホスフェート）ゲルに吸
着された０、５ｍｊ！用量に対して推定１ミクログラム
を生成する。

各抗原の１／４および１／１６の量を含む塩水中におけ
る希釈物質を、同様に上記のようなミョウバンアジュバ
ントに吸着し、０．２５および０．６ミクログラムの推
定用量を得る。また対照を、抗原溶液の代わりに塩水を
用いて調整する。

ヱ立久見慶捜 体重２０〜２２ｇの２０匹のメスの■ＣＲスイスマウス
の各グループを、種々の製剤０．５ｃｃで腹膜３．ｌ織
内に接種する。すなわち各試料を６０匹のマウスに接種
し、２０匹には３つの希釈物質のそれぞれを注入する。

１０匹のマウスは対照アジュバントを接種する。

すべてのマうスを心臓放血により出血させる。

血液を各管に集め、室温で凝塊し、４℃で一晩保持し、
そして遠心分離した（３０００ｒｐｍ　、１５分）凝塊
から血清を回収する。

各血清はオーサブ（ＡＵＳＡＢ）　（商品名）試験キッ
ト（Ａｂｂｏｔｔ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＨイリノ
イ州シカゴ）を用いて、定量平衡ラインラジオイムアッ
セイによって試験する。この試験は１００国際単位（Ｉ
Ｕ）／ｍＡを含むＷＨＯ国際国際ＨＢｒ準標準較する。

希釈および負の対照の平均カウント７分（ＣＰＭ）を差
し引いたＣＰＭに関する一次曲線内における値よりも大
きな放射活性を与える試料を、１：１０および１：１０
０の希釈割合で再びテストする。試料のＨＢｓＡｇ抗原
性は、アウスリア（ＡＩＩＳＰＴＡ）　（商品名）試験
キット（Ａｂｂｏｔｔ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＨイ
リノイ州ノースジカゴ）を用いて平衡ラインラジオイム
ノアッセイにより評価され、この評価はＩｌ、Ｓ、Ｆ、
１１．Ａにより提供された暫定ＨＢｓＡｇ／ａｄ標ｔｉ
ｔと比較される。この標準によって得られた結果は、ジ
ャーマンナショナル（Ｇｅｒｍａｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ
）　ｌ１ｒｌｓＡＨ／ａｄ標準を用いて独自に得られた
ものと一致する。

下記の第１表は実施例２から実施例５の異なる試料の蛋
白含有量および抗原性ならびにこれら値の割合、即ち「
比抗原性」を表している。理解されるように、比抗原性
は加熱により約５０％減少しでいる。このことは第６図
に見られるようなフィラメント形態の割合が高い実施例
５において特に著しい。

第８図は４つの製剤の希釈物を１回注射し２８〜３０日
後における抗１１１１ｓの少なくとも１ｍ１Ｕ／ｍｌで
発育しているマウスの割合を示している。この判断基準
によれば、加熱処理した製剤は著しく高い免疫性を有し
ていることがわかる。下記第２表のデータが示している
ように、マウスの５０％を血清変換させるのに必要な推
定投与量から見て加熱処理は免疫性を７．４倍増強して
いることがわかる。

丁 実施例５のフィラメント画分は最も免疫性が高く、２９
．５倍に増強されている。

第１表 ２ｔｅ夕ｎＪ’ｌ　ＨＢｓＡｇ　　　　　１．４４　　
　　　０．５５　　　　　　　　　　’０．３８　　　
　　　　１＋Ｘ１４１０２℃で２分間　　０．７４　　
　０．２３　　　　　　０．３１　　　　　８１８０［
Ｘ）ｇの上澄み液 ５１０２℃で２分間　　０．３５　　　０．０２　　　
　　　０．０６　　　　　１６８０００ｇ勃は １　バイオラド蛋白検定による値 第２表 マウスに衿ける　　９ご衿番付１１１１Ｂｓ八　　の翠
汗姑性化Φ効宋工要約゛　２　　　」ξ夕４Ｐ■ＩＩＢ
ｓｈ　　　　　　２．９１　　　　　　８１３　　　　
　　　１．０２□ＨＢｓＡｇ　　３．１８　１５００　
　１．０上記データから次のことが結論づけられる。即
ち上記分離方法によって得られた本質的に純粋なＨＢｓ
Ａｇ粒子の加熱はＨＢｓＡｇの免疫原性を実際に高め、
これにより抗体水準を増加させる。定量パラメーターは
１．５　ｌｏｇ＋ｏｍＴＵ／ｍｚ　（３２ｍｌＵ）の幾
何平均抗１１Ｂｓレベルを供給するのに必要な投与量を
推定することにより誘導される。このパラメーターを用
いて１０２°Ｃで２分間加熱することは、免疫原性を６
倍増加させると推定される。従って本発明の蛋白性塊は
、直径１８〜２４ｎｍの球形ＨＢｓＡｇ粒子から木質的
になる蛋白性塊の免疫原性より４〜１０倍、好ましくは
６〜８倍大きな免疫原性を有することを特徴とすること
ができる。もちろん直径１８〜２４ｎｍの円形粒子から
本発明のフィラメント構造を分離すると、実施例５の組
成物に関する上記データから明らかなように、得られた
組成物は２０〜３０の更に大きな免疫原性を有すること
ができる。

従って、本発明の方法によって精製されたＨＢｓＡｇを
上記のように１０２℃で２分間不活性化すると、意図し
たように残留する感染性が低下するのみならず、予想外
のこととして免疫原性が劇的に増加することが意外にも
わかった。この高い免疫原性のために、低蛋白含有量の
ワクチンを製造することができ、従ってワクチンの全体
的な製造コストを現在市販のワクチンよりもずっと低く
抑えることができる。

上記に述べた方法に従って、ポリエチレングリコールで
ＨＢｓＡｇを２回沈澱させ、水酸燐灰石に対する負吸着
および等密度遠心法によって精製した。

この部分的に精製した原料はここで試料Ａとする。

他の部分的に精製したＨＢｓＡｇ組成物（試料Ｂ）はブ
ルメルヒュース（Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉｓ）等〔肝炎Ｂ
型ワクチンにおける熱不活性化による肝炎Ｂ型ワクチン
の製造（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｌｅｐａｔ
ｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖａｃｃｉｎｅｂｙ　Ｈｅａｔ　Ｉｎａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｅ　ａｔｉｔｉｓ　Ｂ　
Ｖａｃｃｉｎｅ）、　　　　　１第１８回セラム・シン
ポジウム（Ｓｅｒｕｍ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　）、ピー
・モーバス（Ｐ　Ｍａｕｐａｓ）およびピー・グースリ
ー（Ｐ　Ｇｕｅｓｒｙ）共著、エルセピア／ノース−オ
ランダ・バイオメジカル・プレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／
Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　
Ｐｒｅｓｓ　１９８１　）　）によって提案された方法
に従って製造した。

試料Ａは燐酸緩衝塩水で１ｍｇ／ｍＩｌ、２ｍｇ／ｍｌ
ｌ　、４ｍｇ／ｍｌｌおよび５ｍｇ／ｍＡ！まで希釈さ
れ、下記において述べるように熱処理した。

プルメルヒュースの方法に従って、２０μｇＨＢｓＡｇ
　／　ｍ　Ｉｔの濃度に調節したＨＢｓＡｇの懸濁最終
ビレットを用いて、試料Ｂを熱処理した。試料Ａおよび
Ｂを金属管に入れた。なおこの金属管は２ｍｍの内径を
有し、短いシリコンゴム管で延長され、かつ金属ねしク
ランプで密閉されていた。１０２℃に加熱された熱安定
油浴に蒸気管を浸漬ことにより熱不活性化を行った。１
０２℃の温度における試料ＡおよびＢの滞留時間は２分
であった。その後これら試料を冷却用氷水浴に移した。

実施例３からと６と同じネガ染色方法により、即ち燐タ
ングステン酸ネガ染色の後、得られた精製物の試料を電
子顕微鏡で撮影した。試料Ａ四〜６ｍｇ／ｒｌりの電子
顕微鏡写真は、第４図がら６図に示されているのと同じ
多形態フィラメントを生じた。ネザーランド・レッド・
クロース（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓ
ｓ）の方法に従って製造した不活性化試料、即ち試料Ｂ
はＩｔ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの他に少なくとも約３ｍｇ／ｍ
１２の他の血清蛋白を含んでいた。その電子顕微鏡写真
はＨＢｓＡｇのフィラメント粒子をほとんど表示しなか
った。実施例６におけるような１〜３ｍｇ／ｍｅのカプ
リル酸ナトリウムで安定化したアルブミンを添加するこ
とは、多形態（第７図）への変質または免疫性の増加を
変更さゼ°るものではないことがわ力１った。ＩＩ　Ｒ
ｓ　Ａ　ｇを精製する方法ならびに加熱時における濃度
はその後のフラッシュ加熱処理を決定するものであり、
ＨＢｓＡｇ粒子は第４図から第６図に示されている新規
で特別な形態に変質される、ということが結論づけられ
た。従って、熱不活性化それ自体は形態の結果を決定す
るものではなくて、むしろ免疫原性を増加させる新規な
形態は使用する精製技術および実際の熱不活性化の組み
合せによって生ずる。

上記事項は本発明を行うために現在考えられる最も好ま
しい方法について述べている。Ｉｔ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの
特別な形態形成に関する初期の研究において、適合可能
蛋白例えば血清アルブミンで精製ｌｌＲ５Ａｇを希釈し
て、加熱不活性による有害作用からＨＢｓＡｇを保護し
、即ちｔｌＢｓＡｇを変性から保護した。本発明は前記
の希釈をしなくとも不活性化を行うことができるという
発見に基づくものであり、本発明を行う好ましい方法は
精製され希釈されていないＨＢｓＡｇに対して不活性化
を行うことである。

本発明の特徴、即ち高濃度精製膜製側のフラッシュ加熱
不活性化による脂質膜免疫原の免疫原性増加は、真核細
胞中において精製された組みかえ型ＤＮＡ誘導ワクチン
のような他のワクチン例えば酵母または細胞培養からの
組みかえ型１）ＮＡを基質とする肝炎Ｂおよび他のワク
チン、ならびにインフルエンザ、狂犬病、麻疹、ヘルペ
ス群ウィルスＨＴＬＶＩ、ＩＩおよび■のようなレトロ
ウィルス用の現在の不活性ワクチン、寄生虫用ワクチン
および現在入手可能な、または現在開発中のワクチンの
有効性を高めるために、および／またはそれらの必要な
投与量を減少させるために容易に適合できるものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図はフラッシュ加熱によって小さな球形粒子から調
製されたフィラメント形態を示す説明図であり、ａは直
線状フィラメント；ｂは閉鎖円形または環状フィラメン
ト；Ｃは枝分れフィラメント；ｄは開放円形フィラメン
ト；ｅは枝分れ環状フィラメント；およびｆは多数枝分
れフィラメントである。 第２図は本発明のワクチンを製造する方法を示す流れ図
である。 第３図は上記工程Ａ−Ｃに従って得られ、燐タングステ
ン酸でネガ染色したＲＢｓＡｇを含む粒子（これら粒子
は本発明のフラッシュ加熱処理を受けておらず、主に１
８〜２４ｎｍの大きさを有する球形ＨＢｓＡｇ粒子から
成っている）の電子顕微鏡写真である。 第４図は、第１図のものと同様に熱処理を受け、直線状
、枝分れ状および円形状フィラメント形態に変形された
ＩＩ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ含有粒子の形状を示す電子顕微鏡
写真である。 第５図は、第４図に示されている溶液を８．０００ｇで
２０分間遠心分離し、更に得られた上澄み液を濾過した
後に得られた上澄み液画分の、第３図および第４図と同
様の電子顕微鏡写真である。 第６図は、８，０００ｇで２０分間遠心分離するこ七に
より得られかつ最初の容量まで等張塩水中に再懸濁され
た沈降物の第３図から第５図と同様な電子顕微鏡写真で
ある。 第７図は、カプリル酸ナトリウムで処理した血清アルブ
ミン３ｍｇ／ｒｒ＋ｊ！の存在の下でフラッシュ加熱処
理したＨＢｓＡｇ含有粒子の第３図から第６図と同様の
電子顕微鏡である。同じ形態学的構造が得られるが、カ
プリル酸ナトリウムで処理した血清アルブミンの共存に
より、電子顕微鏡写真中で観察することが容易ではない
。 第８図は第３〜６図に示されている形態を有する製剤の
、マウスにおける精製１１１１ｓＡｇの免疫原性に及ぼ
す加熱不活性化の効果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウィルスおよびその抗原成分を含有する濃厚塊中で
   のウィルスの熱不活性化方法において、前記濃厚塊の熱
   不活性化を、蛋白性材料によるその希釈を行ずに実施す
   ることを特徴とする、前記の熱不活性化方法。 ２、前記の濃厚塊をいかなる安定性材料によっても希釈
   しない特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記ウィルスを含有する血清から、他の血清蛋白質
   を除去することによって前記濃厚塊を得る特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ４、他の血清蛋白質を除去することによる前記濃厚塊の
   生成工程を、ウィルス含有塊の蛋白質による希釈を行ず
   に実施する特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、抗原性含有粒子が少なくとも１ｍｇ／ｍｌの量で存
   在する濃厚塊に対して熱不活性化を実施する特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 ６、濃厚塊を１０１〜１０５℃の温度に１〜１５分間さ
   らす特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、濃厚塊がＨＢｓＡｇ粒子を含有しており、そして加
   熱の後で粒子を冷却する特許請求の範囲第６項記載の方
   法。 ８、Ａ、血漿をポリエチレングリコールと接触させるこ
   とによって血漿からＨＢｓＡｇを沈澱させて、血漿内に
   含まれている他の血 清蛋白質からＨＢｓＡｇを分離し、 Ｂ、分離したＨＢｓＡｇの負吸着を水酸燐灰石上で行い
   、 Ｃ、そのように吸着したＨＢｓＡｇを等密度遠心法で処
   理する ことによって、ＨＢｓＡｇ含有粒子を得る特許請求の範
   囲第７項記載の方法。 ９、加熱媒体中に懸架している直径０．１〜１０ｍｍの
   管中で、１〜１５分間１０１〜１０５℃で８００〜１０
   ００ｍｍＨｇの圧力下で粒子の加熱を行う特許請求の範
   囲第８項記載の方法。 １０、ウィルスおよびその抗原成分を含有する濃厚塊中
   でのウィルスの熱不活性化方法であって、前記濃厚塊の
   熱不活性化を、蛋白性材料によるその希釈を行ずに実施
   する前記の熱不活性化方法によって製造した蛋白性塊。 １１、濃厚塊がＨＢｓＡｇ粒子を含有しており、そして
   加熱の後で粒子を冷却する特許請求の範囲第１０項記載
   の蛋白性塊。 １２、Ａ、血漿をポリエチレングリコールと接触させる
   ことによって血漿からＨＢｓＡｇを沈澱させて、血漿内
   に含まれている他の血 清蛋白質からＨＢｓＡｇを分離し、 Ｂ、分離したＨＢｓＡｇの負吸着を水酸燐灰石上で行い
   、 Ｃ、そのように吸着したＨＢｓＡｇを等密度遠心法で処
   理する ことによって、ＨＢｓＡｇ含有粒子を得る特許請求の範
   囲第１１項記載の蛋白性塊。