BG107545A - Пречистване на hbv антигени за използване във ваксини - Google Patents

Пречистване на hbv антигени за използване във ваксини Download PDF

Info

Publication number
BG107545A
BG107545A BG107545A BG10754503A BG107545A BG 107545 A BG107545 A BG 107545A BG 107545 A BG107545 A BG 107545A BG 10754503 A BG10754503 A BG 10754503A BG 107545 A BG107545 A BG 107545A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
antigen
hepatitis
vaccine
thiomersal
free
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
BG107545A
Other languages
English (en)
Other versions
BG66038B1 (bg
Inventor
Koen De Heyder
Peter Schu
Michelle Serantoni
Omer Van Opstal
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0019728.5A external-priority patent/GB0019728D0/en
Priority claimed from GB0101334A external-priority patent/GB0101334D0/en
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Publication of BG107545A publication Critical patent/BG107545A/bg
Publication of BG66038B1 publication Critical patent/BG66038B1/bg
Anticipated expiration legal-status Critical
Active legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
    • A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Изобретението се отнася до нов метод за производство на хепатит В ваксина за използване при лечението или профилактиката на хепатит В вирусни (HBV) инфекции. Също така то се отнася до HBV ваксина, получена по новия метод на изобретението.
Хроничната хепатит В вирусна (HBV) инфекция, за която до този момент съществува ограничено лечение, представлява глобален обществен здравен проблем с различни измерения. Хроничното носителство на HBV, установено при повече от 300 милиона души по света, е рисков фактор за развитието на хроничен активен хепатит, цироза и първичен хепатоцелуларен карцином.
Много от ваксините, които в момента се използват, изискват консерванти за да се предотврати тяхното разрушаване. Един често използван консервант е тиомерзал, който е живак-съдържащо съединение. Възникнали са някои въпроси, свързани с използването на живак във ваксините, въпреки че коментаторите подчертават, че потенциалните рискове от живак-съдържащи ваксини не трябва да се преувеличават (Offit; Р. A. JAMA Vol. 283; No: 16).
Въпреки това е желателно да се открият нови и потенциално посигурни методи за получавене на ваксини, които да заместят използването на тиомерзал в производствения процес. По този начин възниква необходимост от разработването на ваксини, които са свободни на тиомерзал, по специално хепатит В ваксини.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
В един първи аспект, настоящето изобретение осигурява метод за получаване на хепатит В антиген, подходящ за използване във ваксина, като методът включва пречистване на антигена в присъствието на редуциращ агент, съдържащ една свободна -SH група.
Настоящето изобретение за предпочитане осигурява метод за получаване на стабилен хепатит В антиген, без следи от тиомерзал, който включва пречистване на антигена в присъствието на редуциращ агент, съдържащ една свободна -SH група.
Антигенният препарат най-общо е без следи от тиомерзал, когато тиомерзалът не е установим в пречистения антегенен продукт при използването на абсорбционна спектрофотометрия за живак, както е описано тук.
Хепатитният антигенен препарат за предпочитане съдържа по-малко от 0.025 pg живак за 20 pg протеин, измерено чрез абсорбционна спектрофотометрия.
За предпочитане пречистването се провежда в отсъствие на тиомерзал и пречистеният антиген е напълно свободен на тиомерзал.
За предпочитане антигенът е стабилен до степен, доколкото е стабилен един хепатитен антиген, пречистен в присъствието на тиомерзал, както например е описано в Пример 1.
За предпочитане хепатитният антиген е имуногенен.
За предпочитане редуциращият агент е добавен по време на процеса на пречистване на антигена, предпочитано след развитието на клетките, експресиращи антигена.
За предпочитане редуциращият агент е цистеин, дитиотреитол, βмеркаптоетанол или глутатион, като най-предпочитан е цистеинът.
Следователно, настоящето изобретение предпочитано осигурява метод за получаване на стабилен имуногенен хепатит В антиген, без следи от тиомерзал, който включва пречистване на антигена в присъствието на цистеин.За предпочитане пречистването се провежда в присъствието на цистеинов разтвор.
За предпочитане, цистеинът е под формата на разтвор или прах и се добавя по време на процеса до крайна концентрация между 1 и 10 шМ, за предпочитане 1 до 5 шМ.
Още повече за предпочитане, цистеинът се добавя до крайна концентрация от около 2 шМ.
За предпочитане цистеинът е L-цистеин.
Изобретението също така осигурява метод за получаване на стабилен хепатит В антиген, без следи от тиомерзал, където суровият антиген е подложен на гел проникваща хроматография, на йонообменна хроматография и смесване с редуциращ агент, притежаващ една свободна -SH група.
За предпочитане, йонообменната хроматография е анион-обменна хроматография.
Изобретението също така осигурява хепатит В антиген, свободен на тиомерзал, получен по метода, за производство от настоящето изобретение, където антигенът е поне толкова имуногенен и антигенен, колкото хепатит В антиген, произведен в присъствието на тиомерзал.
Изобретението освен това осигурява имуногенен хепатит В антиген, притежаващ средно ELISA протеинно съотношение по-високо от 1.5 и RF1 съдържание с поне 3 кратно по-ниска IC50 стойност, отколкото тази на хепатит В повърхностен антиген, произведен в присъствието на тиомерзал.
В друг аспект, изобретението се отнася до метод за получаване на хепатитен антиген, подходящ за използване във ваксина, като методът включва пречистване на антигена в присъствие на тиомерзал и последващо обработване на антигена в присъствието на редуциращ агент, съдържащ една свободна -SH група.
Обработването се последва от пречистващ етап, като диализен етап за отстраняване на тиомерзала.
За предпочитане, редуциращият агент е цистеин, DTT, глутатион или 2-меркаптоетанол.
Хепатит В антигена от изобретението може да бъде използван или за лечението или за профилактиката на хепатит В инфекции, поспециално например за лечение или профилактика на хронични хепатит В инфекции.
Настоящето изобретени също така осигурява ваксинна формула, включваща хепатит В антиген от изобретението, заедно с адювант. За предпочитане, адювантът е алуминиева сол или селективен стимулатор на ТН1 клетъчния отговор.
За предпочитане, антигенът е хепатит В повърхностен антиген.
Получавенето на хепатит В повърхностен антиген е добре известно. Виж например, Harford et. al. in Develop. Biol. Standard 54, page 125 (1983), Gregg et. al. in Biotechnology, 5, page 479 (1987), EP-A-0 226 846, EP-A-0 299 108 и цитираните там препратки.
Както тук е използван изразът “ хепатит В повърхностен антиген” или “ HBsAg”, включва всеки HBsAg антиген или фрагмент от него, проявяващ антигенност на HBV повърхностен антиген. Ще бъде разбрано, че в допълнение към 226 амино киселинна последователност на HBsAg S антигена (виж Tiollais et. al. Nature, 317, 489 (1985) и направените там цитати) HBsAg, така като тук е описан, може, ако е желателно да съдържа цялата или част от npe-S последователност, както е описано в горните документи и в ЕР-А- 0 278 940. HBsAg, както тук е описан може да се отнася до варианти, например, “escape mutant”, описан в WO 91/14703.
HBsAg може също да се отнася до полипептиди, описани в ЕР 0 198 474 или ЕР 0 304 578.
Обикновено, HBsAg ще бъде под формата на частички. В особено предпочитано изпълнение, HBsAg ще се състои главно от HBsAg Sантиген, споменат по-горе.
Ваксината може преимуществено да включва фармацевтично приемлив ексципиент, като един подходящ адювант. Подходящи адюванти са търговски достъпни, като например, Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, MI) ; Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); алуминиеви соли, като алуминиев хидроксиден гел (алум) или алуминиев фосфат; соли на калций, желязо или цинк; неразтворима суспензия на ацилиран тирозин; ацилирани захари; катионни или анионни производни полизахариди; полифосфазени; биоразграждащи се микросфери; монофосфорил липид А или гуил А цитокини, като GM-CSF или интерлевкин-2, -7, или -12, могат също да бъдат използвани като адюванти.
Във формите на изобретението се предпочита адювантният състав да индуцира имунен отговор главно от ТН1 тип. Високите нива на Thlтип цитокини (например, IFN-γ, TNFa, IL-2 и IL-12) водят до индуциране на клетъчно медииран имунен отговор спрямо приложения антиген. В едно предпочитано изпълнение, в което отговорът е преимуществено Thlтип, нивото на Th 1-тип цитокини ще се увеличи до известна степен, в сравнение с нивото на ТИ2-тип цитокините. Нивата на тези цитокини могат лесно да бъдат определени с използването на стандартни анализи. За преглед на фамилиите цитокини, виж Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol.7:145-173,1989.
Съобразно c това, подходящите адюванти за предизвикване на преимуществено Th 1-тип отговор включват например, комбинация от монофосфорил липид А, за предпочитане 3-де-0-ацилиран монофосфорил липид A (3D-MPL) заедно с алуминиева сол.
Други известни адюванти, които предпочитано индуцират ТН1 тип имунен отговор включват CpG съдържащи олигонуклеотиди. Олигонуклеотидите се характеризират с това, че CpG динуклеотидът е неметилиран. Такива олигонуклеотиди са добре известни и са описани, например в WO 96/02555. Имуностимулиращите DNA последователности са също описани, например от Sato et al., Science 273: 352,1996. Друг предпочитан адювант е сапонин, за предпочитане QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, МА), който може да бъде използван самостоятелно или в комбинация с други адюванти. Например една подсилена система включва комбинацията от монофосфорил липид А и сапонинови деривати, като комбинация от QS21 и 3D-MPL, както е описано в WO 94/00153, или един по-малко реактивен състав, където QS21 е реагирал с холестерол, както е описано в WO 96/33739. Други предпочитани форми включват маслено-водни емулсии и токоферол. Една особено ефективна адювантна форма включва QS21, 3D-MPL и токоферол в маслено-водна емулсия, както е описано в WO 95/17210.
Една особено ефективна адювантна форма включваща QS21, 3DMPL и токоферол в маслено-водна емулсия, както е описано в WO 95/17210 и е предпочитана форма.
Съгласно едно изпълнение на настоящето изобретение, е осигурена ваксина, включваща хепатит В повърхностен антиген от настоящето изобретение, който допълнително съдържа един ТН-1 индуциращ адювант. Едно предпочитано изпълнение е ваксина, в която ТН-1 индуциращият адювант е избран от групата адюванти, включващи: 3DMPL, QS21, смес от QS21 и холестерол и CpG олигонуклеотиди. Друго предпочитано изпълнение е ваксина, включваща хепатит В повърхностен антиген, и адювант монофосфорил липид А или негови деривати, QS21 и токоферол в маслено-водна емулсия.
За предпочитане ваксината допълнително съдържа сапонин, попредпочитано QS21. Друга особено подходяща адювантна форма
Ч·» включваща CpG и сапонин, е описана в WO 00/09159 и е предпочитана форма. Най-предпочитано в тази конкретна форма, сапонинът е QS21. За предпочитане формата допълнително съдържа една маслено-водна емулсия и токоферол.
Настоящето изобретение също така осигурява ваксинна форма, включваща хепатит В повърхностен антиген от изобретението, заедно с адювант и допълнително един или повече антигени, избрани от групата, състояща се от: дифтериен токсоид (D), тетаничен токсоид (Т), ацелуларни коклюшни антигени (Ра), инактивиран полио вирус (IPV), хемофилус инфлуенца антиген (Hib), хепатит А антиген, херпес симплекс вирус (HSV), хламидия, GSB, HPV, стрептококус пневмоние и нейсерия антигени. Антигените, предоставящи защита срещу други заболявания, могат също да бъдат комбинирани във ваксинната форма на настоящето изобретение.
В едно конкретно изпълнение, ваксинната форма съдържа хепатит В повърхностен антиген, получен по метода за производство, съгласно изобретението заедно с адювант и инактивиран полио вирус.
Настоящето изобретение също осигурява метод за лечение и/или профилактика на хепатит В вирусни инфекции, който включва прилагане на човешки или животински обект, страдащ от или възприемчив към хепатит В вирусна инфекция на безопасно и ефективно количество от ваксината на настоящето изобретение за профилактика и/или лечение на хепатит В инфекции.
Освен това, настоящето изобретение осигурява използването на хепатит В повърхностен антиген от изобретението за производството на медикамент за лечение на пациенти, страдащи от хепатит В вирусни инфекции, като хроничен хепатит В вирусна инфекция.
Ваксината от настоящето изобретение ще съдържа имунопротективно количество от антигена и може да бъде приготвена по конвенционални техники.
Ваксинният препарат е описан в Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U. S. A. 1978. Енкапсулирането в липозоми е описано например от Fullerton, U. S. Патент 4,235,877. Конюгацията на протеина към микромолекулите е разкрито например от Likhite, U. S. Патент 4,372,945 и от Armor et al., U.S Патент 4,474,757. Използването на Quil А е разкрито от Dalsgaard et al„ Acta Vet Scand, 18: 349 (1977). 3D-MPL е достъпен от Ribi immunochem, USA и е разкрит в Британска заявка No. 2220211 и US Патент 4912094. QS21 е разкрит в US Патент No. 5057540.
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящето изобретение е илюстрирано, но не и ограничено от следните примери, където:
Фигура 1 илюстрира процеса на получаване на Engerix В ™ в отсъствие на тиомерзал.
Фигура 2 илюстрира SDS-PAGE анализ на сериите основна маса антиген;
Фигура 3 илюстрира остатъчните дрождени протеини в сериите основна маса антиген, получени съгласно процеса в отсъствие на тиомерзал.
Пример 1:
Процес на получаване на Хепатит В повърхностен антиген в присъствие на тиомерзал
Хепатит В повърхностен антиген (HBsAg) на SB Biologicals hepetitis В моновалентна ваксина (Engerix В ™) е експресиран като рекомбинантен протеин в Saccharomyces cerevisiae (виж Harford et. al. loc. cit.). 24 kD протеин е получен интрацелуларно и акумулиран в рекомбинантните дрождени клетки. В края на ферментацията, дрождените клетките се събират и се разрушават в присъствието на умерен сърфактант като Tween 20 за освобождаване на желания протеин. След това клетъчният хомогенат, съдържащ разтворими частици повърхностен антиген се подлага на предварително пречистване в серия от преципитации и после се концентрира чрез ултрафилтрация.
По-нататъшното пречистване на рекомбинантния антиген се извършва в последващи хроматографски сепарации. В първия етап, суровият антигенен концентрат се подлага на гел проникваща хроматография върху Sepharose 4В среда. Тиомерзалът е представен в отмиващ буфер при 4В проникващ хроматографски етап. Отмиващият буфер притежава следният състав: 10тМ Tris, 5% етилен гликол, pH 7.0, 50 mg/L тиомерзал. Тиомерзалът е включен в този буфер за да контролира биотовара. Повечето от този тиомерзал е отделен по време на последващия пречистващ етап, включващ йонообменна хроматография, ултрацентрофугиране и изсолване (гел проникване, така че пречистените основна маса антигенни препарати, получени по оригиналния метод, съдържат около 1.2 pg и е по-малко от 2 pg тиомерзал за 20 pg от протеина.
Йонообменен хроматографски етап се извършва при използването на DEAE-матрикс и този пул след това се подлага на цезий-градиентна ултрафилтрация върху 4 предварително установени слоеве от различни цезиево хлоридни концентрации. Антигенните частички са разделени от контаминираните клетъчни съставки, съобразно тяхната плътност в градиента и отмити в края на центрофугиращия процес. Тогава цезиевият хлорид се отделя от този пул чрез второ гел проникване върху Sepharose гел.
Когато HBsAg е приготвен чрез процес, съдържащ тиомерзал в 4В гел проникващ буфер, концентрациите на протеините от над 30 mg/ml се възстановяват в пула HBsAg, съдържащ фракции от CsCl градиент, съответстващ на една еквивалентна концентрация HBsAg, както е изследвано от AUSZYME кит от Abbott Laboratories.
CsCl ултрацентрофугиращият етап успешно елиминира остатъчните липиди, DNA и малки протеинни контаминации от HBsAg препарата. Той се извършва чрез зонално центрофугиране в Ti 15 ротор от Beckman Instruments, Fullerton, California при скорост от 30,000 rpm за около 40 до 60 часа. Пробата, която трябва да се пречисти се поставя върху пластове от CsCl разтвор при крайни концентрации от 0.75, 1.5, 2.5 и 3.25 М CsCl. В края на центрофугирането градиента е отмит във фракции. Фракциите, съдържащи HbsAg могат да бъдат идентифицираничрез UV абсорбация при 280 пгп или чрез тестващи разреждания на фракциите с AUSZYME □ кит. HBsAg зоната е с плътност от 1.17 до 1.23 g/cm .
Разтворът, съдържащ пречистен HBsAg се филтрува в стерилни условия преди да бъде използван за получаването на ваксинна форма.
Пречистването на дрождения клетъчен лизат е комплексно, тъй като антигенът е получен интрацелуларно и се провежда необходима серия от сепарационни техники за елиминиране на различните видове (дрождени) контаминации за да се получи чиста основна маса антиген. Етапите на пречистване са важни, тъй като продуктът, който следва да се пречисти представлява липопротеинна частица, съдържаща множество копия от повърхностно антигенния полипептид и тази структура трябва да бъде поддържана по време на целия пречистващ процес. Това е особенността на този процес, който води до получаване на повърхностно антигенни частици, които са напълно имуногенни, без необходимост от понататъшно химическо обработване за повишаване на имуногенността (сравни с ЕР 0135435).
Подробностите на процеса на получаване по-нататък са описани в Европейски патент 0199698.
Пример 2
Получаване и характеристика на получен от дрожди HBsAg чрез метод в отсъствие на тиомерзал.
1. Получаване и пречистване на HBsAg, получен от дрожди
1.1 Схематично представяне на процеса на получаване
Хепатит В повърхностен антиген може да бъде получен чрез ферментация на подходящ щам Saccharomyces cerevisiae, например, както това е описано в Haford et al.
В края на ферментацията на рекомбинантния дрожден щам, клетките се събират и разрушават в присъствие на умерен сърфактант като
Tween 20. След това повърхностният антиген се изолира чрез многоетапна екстракция и пречистваща процедура точно, както е описано по-горе в Пример 1 до етапа на първото гел проникване върху Sepharose 4В.
1.2 Пречистващ процес в отсъствие на Тиомерзал
При процеса в отсъствие на Тиомерзал са въведени следните две промени в сравнение с процеса, описан в Пример 1.
1. Отмиващият буфер при 4В гел проникващ хроматографски етап не съдържа тиомерзал.
2. Цистеинът (2 mM крайна концентрация) е добавен към отмития пул от анион-обменния хроматографски етап.
Беше установено, че пропускане на тиомерзал от 4В гел проникващ буфер меже да доведе до преципитация на HBsAg частичките по време на етапа на CsCl градииращо плътността центрофугиране със загуба на продукт и агрегация или аглутинация на възстановения антиген.
Добавянето на цистеин при 2 шМ крайна концентрация към отмития пул от предшестващия анион обменен хроматографски етап, предотвратява преципитацията и загубата на антиген по време на CsCl плътностно центрофугиране.
Цистеинът е предпочитано вещество за това третиране, тъй като е природна аминокиселина и може да бъде отстранен през следващ изсолващ етап върху гел проникваща колона, използвайки Sepharose 4BCLFF като колонен матрикс.
Няма други промени в производствения процес в сравнение с процеса, описан в Пример 1.
Процесът в отсъствие на тиомерзал, води до получаването на основна маса антиген с чистота и свойства, които са сравними с антигена от процеса в Пример 1.
1.2а.
Смята се, че добавният тиомерзал към 4В буфер при 50 pg/ml води до декомпозиране и полученият етил живак може да се прикрепи ковалентно към свободните сулфхидрилни групи върху цистеиновите остатъци на протеина. Протеинът съдържа 14 цистеинови остатъка, от които 7 са локализирани между позиции 101 и 150.Този участък на протеина се счита, че е локализиран на повърхността на частичката и съдържа главния антигенен участък на HBsAg, включително имунодоминантния а участък и разпознавателното място за RF1 моноклоналното антитяло (Waters J et al, Postgrad. Med. J., 1987: 63 (Suppl. 2): 51-56. and Ashton-Rickardt and Murray J. Med. Virology, 1989: 29: 196).
Антиген, пречистен c тиомерзал в 4B гел проникващия буфер, съдържа около 0.5-0.6 pg живак в края на пречистващия процес. Този живак не е напълно отстраним чрез обикновена диализа. В един експеримент беше измерено 0.56 pg желязо за 20 pg протеин в основната маса антигенен препарат. Този препарат беше диализиран за 16 часа при стайна температура в 150 mM NaCl, ЮтМ NaPO4 буфер pH 6.9. В края на диализата беше измерена една концентрация от 0.33 pg Hg за 20 pg протеин.
Докато диализата в присъствие на редуциращ агент като L-цистеин при 0.1 до 5.0 mg/ml, DTT при 50 шМ или 2-меркаптоетанол при 0.5 М, последвана от втора диализа за отстраняване на редуциращия агент, води до намаляване съдържанието на живак на антигенния препарат до помалко от 0.025 pg живак за 20 pg протеин. Това е най-ниската граница на откриване от метода.
Живачното съдържание беше определено чрез абсорбционна спектрофотометрия. Антигенът е резреден в разтвор, съдържащ 0.01 %w/v калиев бихромат (К2Сг 2 Ογ) и 5% v/v азотна киселина. Приготвени са стандартни разтвори с тиомерзал като източник на живак. Атомната абсорбция на пробите и стандартните разтвори е измерена след изпаряване в парен генератор със специфичен живачен катод при 253.7 шп Атомната абсорбция на разреждащата течност е измерена като празна проба. Живачното съдържание на пробите се изчислява чрез калибрационни криви, получени от стандартните разтвори. Резултатите са изразени като pg живак за 20 pg протеин.
1.3 Получаване на свободен на тиомерзал основна маса антиген
Етапите на процеса на пречистване на основната маса антиген са представени на Фигура 1.
1.4 Състав на ваксинна форма без тиомерзал.
Един типичен количествен състав за хепатит В ваксина, без консервант и формулирана от антиген, получен по метода в отсъствие на тиомерзал, е представен в Таблица 1.
ТАБЛИЦА 1:
Съставки Количество за ml
Активна съставка - Протеин, от който поне 95% е HBsAg 20 pg
Алуминиев хидроксид (адсорбент) (представен като А12О3) 0.95 mg
Натриев хлорид 9.0 mg (максимално)
Динатриев фосфат дихидрат 0.9 mg
Натриев дихидроген фосфат дихидрат 0.71 mg
Вода за инжеккция-колкото е необходимо до 1.0 ml
Съставът може да бъде променян чрез добавянето на 3D-MPL и/или други адюванти.
2. Характеризиране на основната маса антиген и ваксината, получени по метода в отсъствие на тиомерзал.
2.1 Тестове и оценка на пречистен основна маса антиген
2.1.1 Основа за сравнение
Три серии основна маса антиген бяха получени по метода в отсъствие на тиомерзал, съгласно този пример (Пример 1.2) и са идентифицирани като HEF001, HEF002 и HEF003. Те бяха сравнени със една серия основня маса антиген (НЕР2055), получена по предишния метод (както е описано в Пример 1) в присъствие на тиомерзал.
2.1.2. Тестове и оценка на основна маса антиген
Три серии основна маса антиген, получени по метода в отсъствие на тиомерзал бяха тествани и резултатите са обобщени в Таблица 2.
Протеинното съдържание беше измерено по метода на Lowry et al (J. Biol. Chem. 1951: 193: 265). Съдържанието на ендотоксини беше измерено по Limulus gel clotting technique c при използването на търговски достъпен кит от Саре Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA. Реагентът е стандартизиран no US Pharm. Endotoxin Reference Standard. Tween 20 беше измерен по метода на Huddleston and Allred (J. Amer. Oil Chemist Soc., 1965: 42: 983).
HBsAg съдържание беше измерено чрез търговски достъпния AUZYME кит от Abbott Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, USA. Беше използвана оценъчна процедура В на производителя. Една партида основна маса антиген, пречистен по метода, съдържащ тиомерзал беше използван като стандарт за получаване кривата на дозата. Полизахаридте бяха измерени по метода на Dubois et al (Anal. Chem. 1956: 28: 350). Липидите бяха измерени чрез използване на търговски достъпен кит (Merkotest Total Lipids 3321) от Е. Merck, В. Р. 4119, Darmstad D-6100, Germanny. DNA съдържанието беше измерено по Threshold метода, използващ апарат и реагенти, достъпни от Molecular Devices Corp., Gutenbergstrasse 10, Ismaning, Munich, Germany.
Установените стойности в тестовете и оценките са в границите, наблюдавани за серии основна маса антиген, произведени при използването на тиомерзал в отмиващ буфер на Sepharose 4В гел проникващия етап, с изключение на антигенната активност по ELISA. Стойностите от това измерване за три HEF препарата са по-високи (1.632.25), .отколкото бяха установени за серия основна маса антиген НЕР2055, който има ELISA/протеин съотношение от 1.13. ELISA/протеин съотношенията, измерени чрез AUSZYME кит за тиомерзал, съдържащ партиди от основна маса антиген са обикновено около 1.0 в границите на 0.8-1.2 и много рядко надвишават 1.4.
2.1.3 SDS-PA GE гел анализ
Бяха анализирани основна маса антиген препарати чрез SDS-PAGE в редукционни условия и Coomassie синъо оцветяване. Всички проби показаха основна зона при 24К със следи от димерен протеин. Пробите бяха оценени като такива с висока чистота (>99% чистота) по липсата на видими зони от контаминирани протиени.
Пробите (1 pg) от основна маса антиген препарати бяха анализирани чрез SAS-PAGE в редукционни и нередукционни условия и сребърно оцветяване (Фигура 1). В редукционни условия пробите показаха една интензивна зонална миграция при 24К със следи от димер и мултимерни форми. Гелните образци са неразличими от тази НЕР2055, като сравнение. Също така, пробите бяха поставени в нередукционни условия. При тези условия, по-малка част от материала мигрира при 24К и количеството полипептиди, мигриращо към димерни и мултимерни позиции е повишено. Свободните на тиомерзал серии основна маса антиген, изглежда притежават някаква по-висока степен на полимеризация, отколкото НЕР2055 за сравнение.
Идентификацията на 24К полипептид, проявена чрез Coomassie синъо или сребърно оцветяване, беше потвърдена чрез Western blotting със заешки поликлонални антитела, получени срещу плазмен HbsAg. Препаратите основна маса антиген показват една голяма зона при 24К, заедно с димерни и тримерни форми. Техниката показва малки следи от увредени продукти на повърхностния антигенен протиен. Няма разлика между основната маса антиген, получен по метода в отсъствие на тиомерзал и НЕР2055 серията.
Присъствието на остатъчни дрождени протиени беше изследвано чрез SDS-PAGE анализ в редукционни условия и Western blotting със заешки поликлонален антисерум, получен срещу дрождени протеини (Фигура 3). Техниката е количествена и не позволява качественото определяне на примеси.
Една постоянен образец е показана за три серии основна маса антиген, получени по метода в отсъствие на тиомерзал и НЕР2055 серия с едно изключение.
Силно оцветената зона, присъстваща при ±23К в НЕР2055 основна маса антиген, фактически отсъства в 3 HEF препаратите. Western blotting показва, че процесът в отсъствие на тиомерзал води до един по-чист антигенен продукт.
ТАБЛИЦА 2: Резултати от тестове и анализи на пречистен, свободен на тиомерзал основна маса антиген
ТЕСТ РЕЗУЛТАТ
HEF001 HEF002 HEF003 HEP2055
РН 6.8 6.8 6.8 6.8
Протеинно съдържание по Lowry 1312 pg/ml 888 gg/ml 913 gg/ml 995 pg/ml
Съдържание на ендотоксин < 0.25 EU < 0.25 EU < 0.25 EU < 0.25 EU
Tween 20 съдържание 7-1 gg 6.6 gg 7-4 gg 5.8 pg
Антигенна активност по ELISA 2957 gg/ml 1505 gg/ml 1486 gg/ml 1128 pg/ml
ELISA/протеинно отношение 2.25 1.69 1.63 1.13
Полизахаридно съдържание О.зз gg 0.35 gg 0.33 gg 0.34 pg
Липидно съдържание 13-7 gg 12.8 pg 12.9 pg 11.8 pg
DNA съдържание по Threshold < 1 pg <pg < 1 Pg <ipg
2.1.4 Други биохимични тестове и анализи
2.1.4.1. Съдържание на DNA
Съдържанието на DNA на три серии основна маса антиген беше измерено по метода на Threshold (Molecular Devices Corp.). Измерените количества бяха по-малко от 10 pg DNA за 20 pg протеин (Таблица 2); същото ниво на DNA съдържание се наблюдаваше при основна маса антиген, получен по съответния одобрен метод.
2.1.4.2 Аминокиселинен състав
Аминокиселинният състав на три HEF серии основна маса антиген бяха определени след киселинна хидролиза с 6N НС1 чрез хроматография на аминокиселините върху йонообменна колона с колонна нинхидринова детекция. Пролин и триптофан не бяха определени. Резултатите са представени в Таблица 3.
Съставите са в добро съответствие с това, което е определено за НЕР2055 и с очаквания състав, получен от DNA последователност. Въпреки че няколко глицинови остатъка, измерени за НЕР2055 са близки до очаквания състав, стойности от 16 до 17 остатъка е по-обичайно измерено за основната маса антигенни препарати. Средният брой намерени цистеинови остатъка и очакваният-14 и показва, че няма допълнителни цистеини, свързани към частиците, като резултат от обработването при CsCl градиентен етап.
2.1.4.3 Качествено определяне на свободен цистеин
Качеството на свободния цистеин, присъстващ в основна маса антиген препарати, получени съгласно описания метод, беше определено след окисление на частиците с пермравчена киселина без предварителна киселинна хидролиза. Окисленитес цистеинови остатъци бяха разделени върху йонообменна колона с пост колонна детекция чрез нинхидрин. Границата на детекция на цистеина по този метод е 1 μβ за милилитър.
В 3 HEF антигенните препарати не можа да бъде измерен свободен цистеин, когато се тестваше при начална протеинна концентрация, представена в Таблица 2.
Техниката измерва свободните цистеинови остатъци, присъстващи в буфера и цистеиновите остатъци, които са прикрепени към HBsAg протиен чрез дисулфидно свързване, но които не образуват част от полипептидната последователност.
2.1.4.4 Анализ на N-терминалната последователност
Присъствието на възможни протеинни контаминации и деградационни продукти в три серии основна маса антиген, получени по модифицирания процес бяха изследвани чрез анализ на N-терминалната последователност на базата на Edman разпадане. N-терминалната последователност MENITS...Ha HBsAg протеин беше определена без намеса от други последователности. N-терминалната последователност беше също потвърдена от 60-75% блокиране чрез ацетилиране, както беше наблюдавано за HBsAg полипептид, получен по рутинния метод.
ТАБЛИЦА 3: Аминокиселинен състав на HBsAg
Аминокиселини HEF001 HEF002 HEF003 Средно съдърж. HEP2055 Очаквано съдърж
Asp 11.3 11.3 11.3 11.3 11.5 10
Thr 17.5 17.4 17.2 17.4 17.8 17
Ser 21.4 21.6 21.4 21.5 20.9 23
Glu 11 11 11 11.0 10.5 9
Pro nd nd nd nd 24
Gly 17.1 16.8 16.7 16.9 14.6 14
Ala 7.5 7.4 7.4 7.4 7.2 6
Cys 12.3 14.95 14.9 14.1 13.2 14
Vai 10.9 11 10.9 10.9 10.7 11
Met 6.8 6.7 7.1 6.9 7.1 6
lie 12.3 12.4 12.5 12.4 12.2 16
Leu 26.3 26.6 26.2 26.4 26.7 33
Tyr 6.8 6.8 6.8 6.8 7 6
Phe 13.8 13.9 13.8 13.8 13.9 15
His 3 2.8 3.3 3.0 3.3 1
Lys 4 4 3.9 4.0 4.2 3
Arg 5.7 5.8 5.7 5.7 6.1 5
Tip nd nd nd nd 13
2.1.4.5 Анализ с лазерно светлинно разпръскване
Сравнеяване на размера на частиците беше извършено чрез лазерно светлинно разпръскване между HBsAg частици, получени при използването на модифицирания процес и НЕР2055 еталонна серия (Таблица 4).
Установените средните молекулни тегла показват добра последователност между препаратите.
ТАБЛИЦА 4: Молекулни тегла на HBsAg частици, измерени чрез лазерно светлинно разпръскване
Антигенна серия Молекулно тегло (Далтони)
HEF001 3.07 х 106
HEF002 2.76 х 106
HEF003 2.76 х 106
НЕР2055 3.34 х 106
2.1.4.6 Електронна микроскопия
Основната маса антиген препарати бяха изследвани чрез електронно микроскопиране след фиксиране и оцветяване с уранил ацетат. Във всички проби наблюдаваните частички бяха подобни и това беше потвърдено за ±20 nm субсферични или заоблени частички, типични за HesAg. Частичките, наблюдавани в 3HEF серии бяха неразличими от НЕР2055.
2.1.5 Имунологичен анализ
2.1.5.1. Реактивност с RF1 моноклонално антитяло
Три препарата основна маса антиген бяха тествани за реактивност с RF1 моноклонално антитяло чрез ELISA инхибиращ анализ. RF1 моноклоналното антитяло показва защита на шимпанзета срещу HBV и се счита, че разпознава протективния съответстващ епитоп върху HBsAg частичките. (Iwarson S et al, 1985, J. Med, Virol., 16: 89-96).
RF1 хибридомата може да бъде размножена в перитонеалната кухина на Balb С мишки или в тъканна култура.
Асцитна течност, разредена в 1/50 000 наситен буфер (PBS съдържащ 1% BSA, 0.1% Tween 20) беше смесена 1:1 с различни разредители в PBS от HBsAg проби за тестване ( крайна концентрация в границите между lOOpg и 0.05 pg). Смесите бяха инкубирани в Nunc имунопластини (96U) за един час при 37° С преди да бъдат трансферирани за 1 час при 37° С върху панички, покрити със слой стандартен препарат на HBsAg. Стандартният HBsAg препарат беше една серия основна маса антиген (Нер 286), пречистен по метод в присъствието на тиомерзал. След етапа на промиване с PBS съдържащ 0.1% Tween 20, беше добавен биотин свързан овчи анти миши IgG, разреден 1/1000 в наситен буфер и инкубиран за 1 час при 37° С. След етап на промиване, беше добавен стрептавидин-биотинилиран пероксидазен комплекс, разреден 1/1000 в наситен буфер в същите ямки и инкубиран за 30 минути при 37° С. Паничките бяха промити и инкубирани с разтвор на OPDA 0.04%, Η 2Ο2 0.03% в 0.1М цитратен буфер pH 4.5 за 20 минути при стайна температура. Реакцията беше спряна с 2N H2SO4 и оптическите плътности (OD) бяха измерени при 490/630 шп и представени графично. IC50, дефинирана като концентрацията на антиген (инхибираща концентрация), която инхибира 50% от антитяло-свързването към нанесения HBsAg беше изчислена при използването на уравнение с 4 параметъра и изразена в ng/ml.
Една от НЕР антигенни серии, включително НЕР2050 също бяха м. тествани, заедно с Херпес симплекс gD антиген като негативна контрола. Анализът измерва способността на всеки тест антиген да инхибира свързването на RF1 към стандартен антигенен препарат (НЕР 286), свързан с микротитърните панички.
Таблица 5 представя концентрацията на всеки установен антиген, която инхибира 50% от RF1 свързването към фиксиран антиген.
ТАБЛИЦА 5: Инхибиране свързването на RF1 моноклонално антитяло към HBsAg
Основна маса антиген IC50(ng/ml)*
НЕР286 3834
НЕР673 3437
НЕР720 3150
НЕР2055 2384
HEF001 468
HEF002 574
HEF003 540
*1С50=концентрация на антиген (ng/ml), инхибираща 50% от RFI свързване към фиксиран антиген
Тези резултати показват, че е необходим от 4 до 7 кратно по-малко HEF антиген за инхибиране на RF1 свързване (Таблица 5.) Това показва, че антигенът, който е получен по моцифицирания процес, притежава повишено представяне на RF1 епитоп в сравнение с НЕР основна маса антиген.
Същият тип инхибиращ анализ беше извършен при използване на човешки серум от Engerix В™ ваксини вместо RFI mAb и не показа разлика между НЕР антигенни серии и HEF антигените.
2.1.5.2 Афинитет на свързване с моноклонално RF1
Кинетичните параметри на RF1 моноклонално антитяло свързване към 3 HEF антигенни серии и към НЕР2055 бяха измерени чрез повърхностен плазмонен резонанс, при използване на Biacore 2000 апарат от Amersham Pharmacia Biotech, Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, UK. Измерените кинетични параметри са:
ка: асоциационната степенна константа (МА1) kd: дисоциационната степенна константа (S’1)
Ка: равновесната или афинитетна константа (М'1)
Където Ка= ка/kd
Установените стойности са представени в Таблица 6.
ТАБЛИЦА 6: Афинитетни константи на RF1 свързване с HbsAg
Основна маса антиген ка (х 10’3) kd (х 105) Ка (х ю’7)
HEF001 6.81 3.21 21.97
HEF002 6.89 3.73 18.83
HEF003 7.39 4.67 15.80
НЕР2055 3.31 6.30 5.31
Трите HEF антигенни серии показаха подобна асоциациационни/ дисоциационни константи и свързани афинитетни стойности). За разлика от тях, НЕР2055 притежава по-слаб афинитет на свързване към RF1.
Това е в съответствие с резултатите от ELISA инхибиращия анализ, който показа, че антигенът, получен по метода в отсъствие на тиомерзал, притежава повишено присъствие на RF1 епитоп.
2.2. Тест и оценка на ваксина, формулирана с антиген, получен по модифицирания метод
Трите HEF антигенни серии бяха адсорбирани върху алуминиев хидроксид и формулирани като ваксина, съгласно съставът, представен в Таблица 1. Представени са като дози за възрастни в стъклени шишенца (20 pg антигенен протиен за 1 ml). Сериите са идентифицирани като DENS001A4, DENS002A4 и DENS003A4.
Ефикасността на ваксината беше измерена чрез in vitro анализ на антигенно съдържание с използване на Abbott Laboratories AUSZYME ELISA кит и една класическа серия ваксина, формулирана с 50 pg/ml тиомерзал като стандарт. Ваксинната ефикасност беше определена чрез метод В, както е описан във Pharma Europa Special Issue Bio97-2 (December 1997). Трите HEF серии показват високи стойности за антигенно съдържание, почти два пъти над определеното съдържание от 20 pg антигенен протеин.
2.2.1 Реактивност на DENS ваксина с RF1 моноклонално антитяло.
Антигенността на адсорбираната ваксина след това беше тествана в инхибиращ анализ с RF1 моноклонално антитяло. Анализът изследва способността на ваксинната проба да инхибира RF1 свързването към фиксирана основна маса антиген (НЕР286).
Асцитна течност, разредена в 1/50 000 наситен буфер (PBS съдържащ 1% BSA, 0.1% Tween 20) беше смесена 1:1 с различни разредители в PBS от ваксинната проба за да бъде изследвана (концентрацията беше в границите между 20 pg и 0.5 pg/ml).
Смесите бяха инкубирани в Nunc имунопластини (96U) за два часа при 37° С с разбъркване преди да бъдат трансферирани върху панички, покрити HBsAg. HBsAg препаратът, използван за покриване беше серия от основна маса антиген (Нер 286), пречистен по метод в присъствието на тиомерзал. Тези панички след това се инкубираха за два часа при 37° С с разбъркване. След етапа на промиване с PBS съдържащ 0.1% Tween 20, беше добавен биотин свързан овчи анти миши IgG, разреден 1/1000 в наситен буфер и инкубиран за 1 час при 37° С. След етап на промиване, беше добавен стрептавидин-биотинилиран пероксидазен комплекс, разреден 1/1000 в наситен буфер в същите ямки и инкубиран за 30 минути при 37° С. Паничките бяха промити и инкубирани с разтвор, съдържащ OPDA 0.04%, Н2О2 0.03% в 0.1М цитратен буфер pH 4.5 за 20 минути при стайна температура. Реакцията беше спряна с 2N H2SO4 и оптическите плътности (OD) бяха измерени при 490/630 шп и представени графично.
IC50, дефинирана като концентрацията на антиген (инхибираща концентрация), която инхибира 50% от антитяло свързването към нанесения HBsAg беше изчислена при използването на уравнение с 4 параметъра и изразена в ng/ml.
Ваксината, приготвена от основна маса антиген, получен по модифицирания процес, беше сравнена с Engerix В™ ваксина, формулирана от класически НЕР основна маса антиген и без тиомерзал като консервант.
Анализите бяха проведени трикратно.
Резултатите са представени в Таблица 7 и показват, че около половината от количеството DENS ваксина е необходимо за постигане на
50% инхибиране на RF1 свързване в сравнение с свободната на консервант Engerix™ ваксина. Това отразява едно повишено представяне на RFlenmon върху HEF/DENS антигена и неговата съвместимост с тестовете, направени с RF1 антитяло върху пречистената основна маса антиген.
ТАБЛИЦА 7: Инхибиране на RF1 свързването чрез формулираната ваксина
Ваксинни серии IC-50 (ng/ml)(1)
1 Експеримент 2 3 Средно
DENS001A4 913 662 603 726
DENS002A4 888 715 521 708
DENS003A4 817 685 582 695
ENG5100A2 1606 1514 1481 1534
ENG3199B9 1329 1170 1286 1262
ENG3328A9 1417 1194 1334 1315
2.2 Имуногенност на DENS ваксина при мишки
Беше проведено едно изследване с Balb/C мишки за да се сравни имуногенността на три DENS последователни серии с Engerix В™, получен съгласно настоящия процес за производство на антиген и формулиран с тиомерзал.
Бяха изследвани следните серии:
#DENS001A4 #DENS002A4 #DENS003A4 &ENG2953A4/Q като еталон
Накратко, групи от 12 мишки бяха имунизирани интрамускулно двукратно през 2 седмичен интервал с ваксинна доза, съответстваща на 1/10 (2pg) или 1/50 (0.4 pg) от човешката доза за възрастни. Антитялоотговорът към HBsAg и изотипния профил, индуцирани от ваксинирането бяха отчетени от серума, взет на 28 ден.
Експериментални данни
Групи от 12 Balb/C мишки бяха имунизирани интрамускулно в двата крака (2x5 Opg) в дните 0 и 15 със следните дози от ваксината:
ТАБЛИЦА 8: Групи и дози на ваксината
Група Ваксина Обем Доза антиген
1 DENS001A4 -> 100р1 2 pg
2 Разр.5ХвРО4ЖаС1 lOOpl 0.4 pg
3 DENS002A4 -> 100р1 2 pg
4 Разр.5ХвРО4/№С1 100р1 0.4 pg
5 DENS003A4 -> 100pl 2 pg
6 Разр.5ХвРО4/№С1 lOOpl 0.4 pg
7 ENG2953A4/Q 100 pl 2 pg
8 —>Разр.5ХвРО4/№С1 lOOpl 0.4 pg
На 15 ден (2 седмици след I) и 28 ден (две седмици след II) беше взета кръв от ретроорбиталния синус.
За определяне на този експеримент (4 форми х 2 дози с 12 мишки за група), силата беше преценена a priori с PASS статистическа програма. PASS (power and Sample Size) статистическата програма беше получена от NCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037. За двата начина на анализ на вариантите, 2.5 кратна разлика на GMT между формите с алфа грешка от 5% трябва да бъде отчетена със сила > 90%.
РЕЗУЛТАТИ
Серология:
Хуморалните отговори (Тотални Ig и изотипове) бяха определени чрез ELISA анализ при използване на HBsAg Hep28b като покриващ агент и биотин-свързани анти миши антитела за показване анти-HBs на антитяло свързването. Беше анализиран само серум след II имунизирането.
Таблица 9 показва средните и GMT и анти-Hbs Ig антитялоотговори, измерени в индивидуален серум 2 седмици след II имунизиране.
Сравними антитяло отговори са индуцирани с DENS и класическа хепатит В форма: GMT в границите между 2304 и 3976 EU/ml за DENS серии в сравнение с 2882 EU/ml за SB Biological hepatitis В моновалентна ваксина (Engerix В tm) при 2 pg доза и GMT в границите между 696 и 1182 EU/ml за DENS лотове в сравнение с 627 EU/ml за SB Biological hepatitis В моновалентна ваксина (Engerix В tm) при 0.4 pg доза.
Както се очакваше, се наблюдава един отчетлив ефект от антигенната доза за всички форми при 2 pg и 0.4 pg доза с 3 до 6 кратна разлика в GMTs.
Четири мишки без отговор (титри <50 EU/ml) бяха наблюдавани без ясна връзка с антигенните дози или използваните за инжектиране серии (Групи 1, 2, 3 и 8; една мишка за група).
На базата на статистическия анализ (Grubbs Test) тези мишки отпаднаха от следващия анализ.
ТАБЛИЦА 9: Антитяло отговор при мишки на 28 ден (2 седмици след I)
Група Ваксина Доза Номер ELISA титри (Ig)
Средно GMT
1 DENS001A4 2 Hg 11 3466 2971
2 0.4 pg 11 1283 1182
3 DENS002A4 2 pg 11 2436 2304
4 0.4 pg 12 984 786
5 DENS003A4 2 pg 12 4583 3976
6 0.4 pg 12 997 696
7 ENG2953A4/Q 2 pg 12 3999 2882
0.4 pg 11 737 627
Статистически анализ:
Беше проведен анализ на вариантите върху анти-Hbs титри след log трансформация на данните след II ваксиниране, при използване на ваксините (4 серии) и антигенни дози (2 pg и 0.4 pg) като фактори. Този анализ потвърди, че статистически значима разлика беше наблюдавана между двете антигенни дози ( р стойност < 0.001) и не показа никаква значителна разлика между ваксинните серии ( р стойност = 0.2674). Както преди това беше споменато, силата беше преценена a priori и експериментът беше такъв, че 2.5 кратна разлика на GMT с алфа грешка от 5% може да бъде отчетена между формите със сила > 90%.
Изотипен профил:
Таблица 10 показва изотипното преразпределение (IgGl, IgG2a и IgG2b) изчислено от анализа на серума при II ваксиниране.
Както се очакваше, се индуцира един ясен ТН2 отговор от тези ваксини, основани на алум, като основно се наблюдаваха IgGl антитела.
Не се наблюдава разлика между DENS сериите или SB Biologicals hepatitis В моновалентна ваксина от гледна точка на изотипния профил.
ТАБЛИЦА 10: Преразпределение на IgG изотипи в събрания на 28 ден серум
Изотип (%)
Група Ваксина Доза IgGl IgG2a IgG2b
1 DENS001A4 2Hg 91 4 5
2 0.4 pg 87 8 5
3 DENS002A4 2 pg 97 2 1
4 0.4 pg 87 6 7
5 DENS003A4 2 Hg 98 1 1
6 0.4 pg 93 4 3
7 ENG2953A4/Q 2 Rg 88 8 4
0.4 pg 88 9 3
Пример 3 Формулиране на комбинирани ваксини
Основната маса антиген от изобретението е особено подходяща за формулиране на комбинирана ваксина, съдържаща IPV.
Проведените изследвания на стабилността на начални серии от комбинирана DTPa-HBV-IPV ваксина показват намаляване на ефективността на IPV компонента, по-специално на тип 1 полиомиелитен антиген, когато се използва in vitro имуноанализ ( определяне на Dантигенно съдържание чрез ELISA) и in vivo плъши тест за ефективност. Не беше наблюдавана загуба на ефективността за тип 3, загубата на ефективност беше в границите на очакваното (не повече от 10% загуба за съхранение 1 година).
Направиха се изследвания за определяне на причината за загубата на ефективността при комбинираната DTPa-HBV-IPV ваксина. От наблюдението, че стабилността на IPV в SB Biologicals’ DTPa-IPV ваксина е задоволителна (не повече от 10% загуба на антигенно съдържание за съхранение 1 година), се отчете, че HBV компонента вероятно е отговорен за нестабилността на IPV в DTPa-HBV-IPV ваксината.
HBV компонентът, използван за начално DTPa-HBV-IPV формулиране, е пречистеният r-DNA, получен от дрожди HbsAg също използван за производство на SB Biologicals hepatitis В моновалентна ваксина и приготвен, както е описано в Пример 1.
Като първи опит за определяне на това, кой елемент в HBV компонента е вреден за IPV, основната маса HbsAg беше анализирана за присъствие на тиомерзал. Предварително беше установено (Davisson et al., 1956, J. Lab. Clin. Med 47: 8-19), че тиомерзалът, използван като консервант в DTP ваксините, “е нежелателен за полиомиелитния вирус” в една DTP-IPV комбинация. Тези наблюдения бяха взети под внимание от производителите на ваксини, които замениха тиомерзала с други консерванти при формулирането на техните IPV-съдържащи ваксини. Напоследък беше изследван ефекта на тиомерзал върху IPV ефективността при условия на продължително съхраняване при + 4°С. Беше докладвана загубата на ефективност на тип 1 полио вирусен антиген към неустановими нива след 4-6 месеца (Sawyer, L.A. et al. 1994, Vaccine 12:851-856).
При използването на атомна адсорбционна спектроскопия, беше измерено приблизително 0.5 pg живак (Hg) за 20 pg HbsAg в антиген, пречистен съгласно Пример 1.
Това количество живак (като тиомерзал и етил живачен хлорид, диомерзал деградационен продукт) може да редуцира до неустановими нива ELISA отговори за D-антиген тип 1 съдържание в основна маса IPV концентрат, инкубиран при 37° С за 7 дни.
Беше проведен един метод за разкриване на живачно присъствие в основна маса HbsAg . Беше прието, че живакът може да се свърже към тиолови групи върху HbsAg частиците и по този начин може да бъде освободен в присъствие на редуциращи групи. След експериментиране с други редуциращи агенти, беше избран L-Цистеинът като агент за освобождаване на живак от HbsAg частиците. След диализа на HbsAg основна маса в солеви разтвор, съдържащ 5.7 шМ L-Цистеин, в ретентата не беше установен живак (граница на установяване на тестващия метод: 25ng Hg/20 pg HbsAg). Диализираният антиген беше смесен с основна маса IPV концентрат и беше определена стабилността на тип 1 вируса чрез измерване на D-антигенното съдържание след инкубиране при 37° С за 7 дни. IPV основна маса концентрат, който не е бил смесен или е бил смесен с HbsAg, който не е обработен с цистеин, беше използван като контрола. Съответните ELISA титри бяха получени за проби, съхранявани при +2° С до +8° С за 7 дни.
Резултатите са обобщени в Таблица 11: ТАБЛИЦА 11
Проба D-антигенно съдържание (тип 1)(1) 7 дни/4°С 7 дни/37°С Загуба
IPV (несмесен) 31.6 24.2 23%
IPV+HbsAg необработен 31.1 18.1 42%
IP V+Hbs Ag-цистеинобработен 31.4 27.6 12%
IPV+тиомерзал (1 Pg/ml) 30.5 11.0 74%
(1 Изразено в D-антигенни единици (DU)
Данните, получени от тези лабораторни препарати, ясно показват, че стабилността на тип 1 полио вирус е значително подобрена, ако HbsAg е обработен с цистеин за отстраняване на остатъчния живак преди смесване с IPV.
Данните, представени по-горе, също показват загуба на D-антигенно съдържание от 23% за съответния IPV препарат след инкубиране за 7 дни при 37° С. Това потвърждава вродената нестабилност на тип 1 Mahoney polio virus, както предварително е докладвано (Sawyer, L.A. et al. 1994, Vaccine 12: 851-856).
Въпреки че търговските серии DTPa-HBV-IPV и DTPa-HBV-IPV/Hib ваксини са получавани при използване на диализен процес с 5.7 mM LЦистеин за отстраняване на остатъчния живак и запазване на стабилността на IPV, диализният процес не е подходящ за производство в големи мащаби и включва серия от допълнителни стъпки за получаване на свободен на тиомерзал или живак HbsAg. За разлика от това, HbsAg от настоящето изобретение, приготвен без тиомерзал, може директно да бъде използван за формулиране на комбинирани ваксини, специално на тези, съдържащи IPV.
РЕЗЮМЕ
Методът, който преди това е използван за пречистване на повърхностен антиген, получен от дрожди, включва гел проникващ етап, при което живак съдържащото антимикробно съединение тиомерзал е включено в отмиващ буфер за контролиране на биотовара. Тиомерзалът не е напълно очистен по време на последващите етапи на процеса, така че около 1.2 pg тиомерзал за 20 pg протеин присъства в пречистена антигенна маса. За да се получи напълно свободна на тиомерзал (живак) антигенна маса, пречистващият процес е променен на два етапа.
1. Тиомерзалът е пропуснат в отмиващия буфер при 4Вгел проникващия етап.
2. Цистеин (2 тМ крайна концентрация) се добавя към отмиващия пул в етапа на анион обменна хроматография. Това предотвратява преципитацията на антигена по време на CsCl градиентно центрофугиране.
Не са направени други промени в процеса на получаване.
Антигенната маса, получена по модифицирания процес, беше охарактеризирана. Физико-химичните методи и анализи показват, че свободният на тиомерзал антиген не се различава по свойствата си от антигена, получен по предишния процес. Антигенните частички притежават същите съставки. Идентификацията и интегритетът на HBsAg полипептиди не са засегнати от модифицирания процес, както е установено чрез SDS-PAGE анализ, Western blotting, използващ поликлонални анти- HesAg антитела, анализ на N-терминалната секвенция и аминокиселинен състав. Електронната микроскопия и лазерния светлинно разпръскващ анализ показват, че частичките притежават типичната форма и размер, както и при FtesAg, получен от дрожди. Анализът чрез Western blotting с анти-дрожден протеинен серум показва, че антигенът, получен чрез метода в отсъствие на тиомерзал, има подобна характеристика на контаминиращи дрождени протиени. Количеството на контаминиращите зони, мигриращи при 23К обаче, е много редуцирано при 3 HesAg серии, получени при използването на модифицирания процес.
Имунологичните анализи показват, че свбодните на тимерзал частички притежават повишена антигенност. Частичките са по-реактивни с Abbot AUSZYME кит (съдържащ смес от монклонални антитела), представящ ELISA/протеинни съотношения от 1.6 до 2.25. Тази повишена антигенност също е показана с протективното RF1 моноклонално антитяло. Необходимо е около 4 до 7 кратно по-малко свободен на тиомерзал антиген за инхибиране на RF1 свързването към стандартно фиксиран антиген. Кривите на свързване на свободна на тиомерзал и класическа антигенна инхибиция, се отнасят към две различни фамилии. Разликата също е показана чрез измервания на асоциационната афинитета константа за RF1 при използване на повърхностен плазмонен резонанс. Афинитетите на свързване на свободните на тиомерзал препарати са 3 до 4 кратно по-високи в сравнение със серията от класическа антигенна маса.
Антигенните препарати бяха формулирани като ваксина чрез адсорбция върху алуминиев хидроксид и без консервант.
Тестването за in vitro ефективност с използването на Abbot AUSZYME ELISA кит и съдържаща тиомерзал SB Biologicals hepatitis В моновалентна ваксина, като стандарт, показа че достигнати високи стойности на потентността in vitro. Измереното чрез този тест антигенното съдържание беше почти двойно на установените стойности от 20 pg протеин за милилитър.
Беше наблюдавана повишена реактивност на ваксината, приготвена от свободен на тиомерзал антиген в инхибиращ анализ с RF1 моноклонално антитяло за свързване към фиксиран антиген.Беше необходимо около половината количество свободна на тиомерзал ваксина за да се получи 50% инхибиране на RF1 свързването към фиксиран антиген, в сравнение с антигена, пречистен чрез преди това използвания метод и формулиран без консервант.
Повишената антигенност на свбодната на тиомерзал ваксина по отношение на RF1 е в съответствие с резултатите, от in vitro теста (антигенно съдържание) и с RF1 антитяло тестове, проведени с антигенни препарати.
Беше проведен имуногенен тест при мишки с използване на първоначална и активна ваксинации в две отделни седмици в дози от 2 и 0.4 pg антиген. Беше взета кръв на 28-ия ден, две седмици след активната ваксинация. Серумът беше анализиран за титър на антитела и изотипен състав. Беше наблюдаван отчетлив антиген/доза ефект при двете приложени дози, но нямаше статистически значима разлика в отговора по отношение на титрите на антителата (GMT) между свободната на тиомерзал и свободната на консервант ваксини.
Не бяха наблюдани значителни различия в изотипните профили.

Claims (27)

1. Метод за получаване на хепатит В ваксина, която ваксина включва пречистен хепатит В повърхностен антиген, като антигенът съдържа по-малко от 0.025 pg живак за 20 pg протеин, характеризиращ се с това, че антигенът е пречистен в присъствието на редуциращ агент, притежаващ една свободна -SH група и фармацевтично приемлив ексципиент.
2. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ваксината не съдържа /е свободна на/ консервант.
3. Метод, съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че консервантът е тиомерзал.
4. Метод, съгласно всяка една от претенции от 1-3, характеризиращ се с това, че хепатитният антиген е адсорбиран върху алуминиев хидроксид.
5. Метод, съгласно всяка една от предишните претенции, характеризиращ се с това, че суровият хепатитен В антигенен препарат е а/ подложен на гел проникваща хроматография;
Ь/ подложен на йонообменна хроматография; и с/ смесен с редуциращ агент, притежаващ една свободна -SH група
6. Метод, съгласно всяка една от предишните претенции, характеризиращ се с това, че редуциращият агент е цистеин, глутатион, дитиотреитол или β-меркаптоетанол.
7. Метод, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че редуциращият агент е цистеин.
8. Метод, съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че цистеинът е добавен до крайна концентрация от между 1-10 шМ.
9. Метод, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че цистеинът е добавен до крайна концентрация от около 2 тМ.
10. Метод, съгласно всяка една от предишните претенции, характеризиращ се с това, че антигенът е пречистен в присъствието на тиомерзал преди третиране с редуциращия агент.
11. Метод, съгласно всяка една от претенции от 1-9, характеризиращ се с това, че пречистеният антиген е напълно свободен на тиомерзал.
12. Метод, съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че ваксината е тиомерзал свободна ваксина.
13. Състав на ваксина, включващ пречистен хепатит В антиген, като антигенът съдържа по-малко от 0.025 pg живак за 20 pg протеин, и антигенът е получен по метода, съгласно всяка една от претенции 1-12.
14. Състав на ваксина, съгласно претенция 13, заедно с адювант.
15. Състав на ваксина, съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че адювантът е алуминиева сол.
16. Състав на ваксина, съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че алуминиевата сол е алуминиев хидроксид.
17. Състав на ваксина, както е заявен в претенции 13-16, който съдържа ТН-1 индуциращ адювант.
18. Състав на ваксина, съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че ТН-1 индуциращият адювант е избран от групата включваща: 3DMPL, QS21, 3-DMPL и QS21 и CpG олигонуклеотид.
19. Състав на ваксина, както е заявен във всяка от претенции 13-18, който допълнително съдържа един или повече адюванти, избрани от групата, включваща: дифтериен токсоид (D), тетаничен токсоид (Т), ацелуларни коклюшни антигени (Ра), инактивиран полио вирус (IPV), хемофилус инфлуенца антиген (Hib), хепатит А антиген, херпес симплекс вирус (HSV), хламидия, GSB, HPV, стрептококус пневмоние и нейсерия антигени.
20. Използване на хепатит В повърхностен антиген, съдържащ помалко от 0.025 pg живак за 20 pg протеин за получаването на свободна на консервант хепатитна ваксина, като антигенът е получен чрез пречистване в присъствието на редуциращ агент, притежаващ свободна -SH група.
21. Метод за получаване на хепатит В повърхностен антиген, подходящ за използване във ваксина, който метод включва пречистване на антигена в присъствието на редуциращ агент, притежаващ свободна -SH група, характеризиращ се с това, че антигенът е пречистен в присъствие на тиомерзал преди третиране с редуциращия агент.
22. Метод за получаване на хепатит В антиген, съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че пречистеният антигенен продукт съдържа по-малко от 0.025 pg живак за 20 pg протеин.
23. Метод за получаване на хепатит В антиген, съгласно претенция 21 или 22, характеризиращ се с това, че суровият хепатит В антигенен препарат е:
а/ подложен на гел проникваща хроматография;
Ь/ подложен на йонообменна хроматография; и с/ смесен с редуциращ агент, притежаващ една свободна -SH група.
24. Метод за получаване на хепатит В антиген, съгласно претенции 21-23, характеризиращ се с това, че редуциращият агент е цистеин, глутатион, дитиотреитол или β-меркаптоетанол.
25. Имуногенен хепатит В антиген, където антигенът съдържа помалко от 0.025 pg живак за 20 pg протеин и е получен чрез пречистване в присъствието на редуциращ агент, притежаващ свободна -SH група и където антигенът е пречистен в присъствие на тиомерзал преди третиране с редуциращия агент.
26. Ваксина, включваща хепатит В антиген, както е заявено в претенция 25.
27. Метод за лечение и/или профилактика на хепатит В вирусни инфекции, който метод включва прилагането на човешки или на животински обект, страдащ от или възприемчив към хепатит В инфекция на безопасно и ефективно количество от ваксината, съгласно всяка от претенции 13-19 и 26.
BG107545A 2000-08-10 2003-02-07 Пречистване на hbv антигени за използване във ваксини Active BG66038B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0019728.5A GB0019728D0 (en) 2000-08-10 2000-08-10 Novel treatment
GB0101334A GB0101334D0 (en) 2001-01-18 2001-01-18 Novel compounds
PCT/EP2001/009100 WO2002012287A1 (en) 2000-08-10 2001-08-07 Purification of hbv antigens for use in vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG107545A true BG107545A (bg) 2004-01-30
BG66038B1 BG66038B1 (bg) 2010-11-30

Family

ID=26244821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG107545A Active BG66038B1 (bg) 2000-08-10 2003-02-07 Пречистване на hbv антигени за използване във ваксини

Country Status (36)

Country Link
US (3) US20030235590A1 (bg)
EP (2) EP1307473B1 (bg)
JP (2) JP2004505992A (bg)
KR (1) KR100804922B1 (bg)
CN (1) CN1468256B (bg)
AP (1) AP2003002734A0 (bg)
AR (1) AR030325A1 (bg)
AT (2) ATE412665T1 (bg)
AU (2) AU2001282073B2 (bg)
BG (1) BG66038B1 (bg)
BR (1) BRPI0113155C1 (bg)
CA (2) CA2427475C (bg)
CY (2) CY1106310T1 (bg)
CZ (1) CZ303217B6 (bg)
DE (2) DE60116107T2 (bg)
DK (2) DK1666487T3 (bg)
DZ (1) DZ3470A1 (bg)
EA (1) EA006433B1 (bg)
EG (1) EG25829A (bg)
ES (2) ES2254464T3 (bg)
HK (1) HK1056884A1 (bg)
HU (1) HU228932B1 (bg)
IL (2) IL154301A0 (bg)
MX (1) MXPA03001235A (bg)
MY (1) MY128999A (bg)
NO (1) NO20030635L (bg)
NZ (1) NZ524012A (bg)
OA (1) OA12361A (bg)
PE (1) PE20020287A1 (bg)
PL (1) PL204736B1 (bg)
PT (1) PT1666487E (bg)
SI (2) SI1307473T1 (bg)
SK (2) SK288079B6 (bg)
UA (1) UA79735C2 (bg)
UY (1) UY26882A1 (bg)
WO (1) WO2002012287A1 (bg)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
GB0202901D0 (en) * 2002-02-07 2002-03-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
SG163572A1 (en) * 2005-07-11 2010-08-30 Globeimmune Inc Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies
ATE526036T1 (de) * 2005-08-02 2011-10-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Reduzierung der interferenz zwischen ölhaltigen adjuvanzien und surfactanthaltigen antigenen
GB0522765D0 (en) * 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB0612142D0 (en) 2006-06-20 2006-08-02 Secr Defence Spreading modulation spectrum control
EP2097102B1 (en) 2006-09-07 2012-05-30 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Combination vaccine having reduced polio virus antigen quantities
EP2682127A1 (en) 2007-05-02 2014-01-08 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine
WO2009057699A1 (ja) * 2007-10-30 2009-05-07 Kyocera Corporation 弾性波装置
US8250102B2 (en) * 2008-03-14 2012-08-21 Microsoft Corporation Remote storage and management of binary object data
KR100959145B1 (ko) 2008-03-21 2010-05-25 중앙대학교 산학협력단 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법
EP2293813A4 (en) 2008-05-23 2012-07-11 Univ Michigan NANOEMULSION VACCINES
NZ596501A (en) * 2009-05-27 2013-11-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Casb7439 constructs
DK2705365T3 (en) * 2011-01-14 2016-10-24 Hal Allergy Holding B V Immunoassay for the direct determination of the antigen content in the products containing the adjuvant-linked antigen particles
GB201105981D0 (en) 2011-04-08 2011-05-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
CN106222129A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
GEP20227386B (en) 2017-07-18 2022-06-10 Serum Institute Of India Pvt Ltd Immunogenic composition having improved stability, enhanced immunogenicity and reduced reactogenicity and process for preparation thereof
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
JP2022524007A (ja) 2019-03-05 2022-04-27 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｂ型肝炎免疫化レジメンおよび組成物

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1030777A (en) * 1963-12-06 1966-05-25 Ciba Ltd Method of preparing a vaccine against trypanosoma cruzi infections
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4720385A (en) * 1983-03-29 1988-01-19 Miles Laboratories, Inc. Protein compositions substantially free from infectious agents
JPS6013718A (ja) 1983-07-05 1985-01-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｂ型肝炎ワクチン
KR850001534A (ko) 1983-08-22 1985-03-30 제임스 에프. 나우톤 형질전환된 효모로 부터 유도된 면역원성 HBsAg
US4683294A (en) 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
US4895800A (en) 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
EP0278940A3 (en) 1987-01-30 1988-12-07 Smithkline Biologicals S.A. Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
ES2056799T3 (es) 1987-07-17 1994-10-16 Rhein Biotech Ges Fur Biotechn Moleculas de adn codante para las regiones de control fmdh y gen estructural para una proteina que tiene una actividad de fmdh y su uso.
EP0314240A3 (en) 1987-10-26 1990-03-28 Merck & Co. Inc. Process for purifying recombinant hepatitis antigens
JPH085804B2 (ja) 1988-04-28 1996-01-24 財団法人化学及血清療法研究所 Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5242812A (en) * 1989-02-07 1993-09-07 Bio-Technology General Corp. Method for production and purification of hepatitis B vaccine
US5274081A (en) * 1989-09-20 1993-12-28 Immuno A.G. Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen
GB9007024D0 (en) 1990-03-29 1990-05-30 Imperial College Novel vaccine
AU9052091A (en) 1990-12-20 1992-07-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
JP3026029B2 (ja) 1991-04-26 2000-03-27 財団法人阪大微生物病研究会 組換え水痘ウイルスとその作製法
AU657168B2 (en) 1991-09-18 1995-03-02 Amgen, Inc. Hepatitis B vaccine with bile salt adjuvant
US6620414B2 (en) * 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
ES2143716T3 (es) 1992-06-25 2000-05-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna que contiene adyuvantes.
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
DE69535905D1 (de) 1994-07-15 2009-02-26 Coley Pharm Group Inc Immunomodulatorische Oligonukleotide
NZ295998A (en) * 1994-10-24 1999-10-28 Ophidian Pharm Inc Neutralizing antitoxins against clostridium difficile and clostidium botulinum toxins
KR960023066A (ko) * 1994-12-10 1996-07-18 성재갑 전에스 (s) 2 펩티드 함유 비 (b) 형 간염 표면항원의 정제 방법
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
HUP0101047A3 (en) * 1998-03-09 2004-10-28 Smithkline Beecham Biolog Combined vaccine compositions
AU773204C (en) 1998-08-10 2005-05-19 Antigenics Llc Compositions of CPG and saponin adjuvants and methods thereof
EP1140155A4 (en) * 1998-12-23 2004-11-03 Merck & Co Inc IMPROVED RECOMBINATION HEPATITIS B ENVELOPE ANTIGEN
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах

Also Published As

Publication number Publication date
SK288079B6 (sk) 2013-06-03
HUP0302951A2 (hu) 2003-12-29
BG66038B1 (bg) 2010-11-30
EG25829A (en) 2012-09-02
PL204736B1 (pl) 2010-02-26
EP1666487B1 (en) 2008-10-29
CA2427475C (en) 2011-07-05
US8624004B2 (en) 2014-01-07
UY26882A1 (es) 2002-03-22
PT1666487E (pt) 2008-12-26
HU228932B1 (en) 2013-06-28
SI1307473T1 (sl) 2006-04-30
SK1692003A3 (en) 2003-08-05
JP2012255015A (ja) 2012-12-27
AU8207301A (en) 2002-02-18
EP1307473A1 (en) 2003-05-07
HK1056884A1 (en) 2004-03-05
JP5559847B2 (ja) 2014-07-23
SK288069B6 (sk) 2013-05-03
PL362322A1 (en) 2004-10-18
HUP0302951A3 (en) 2004-10-28
BR0113155A (pt) 2003-07-08
AP2003002734A0 (en) 2003-03-31
NO20030635D0 (no) 2003-02-07
CZ2003385A3 (cs) 2003-06-18
EA006433B1 (ru) 2005-12-29
MY128999A (en) 2007-03-30
KR100804922B1 (ko) 2008-02-20
NO20030635L (no) 2003-04-01
ES2314555T3 (es) 2009-03-16
US20090123496A1 (en) 2009-05-14
SI1666487T1 (sl) 2009-02-28
BRPI0113155B1 (pt) 2018-11-21
CN1468256B (zh) 2010-10-27
DK1666487T3 (da) 2009-01-12
ATE412665T1 (de) 2008-11-15
CN1468256A (zh) 2004-01-14
DE60136400D1 (de) 2008-12-11
WO2002012287A1 (en) 2002-02-14
MXPA03001235A (es) 2004-07-16
CA2427475A1 (en) 2002-02-11
BRPI0113155C1 (pt) 2021-05-25
DE60116107D1 (de) 2006-01-26
KR20030029127A (ko) 2003-04-11
EP1307473B1 (en) 2005-12-21
EP1666487A1 (en) 2006-06-07
DE60116107T2 (de) 2006-08-03
NZ524012A (en) 2004-02-27
AU2001282073B2 (en) 2005-01-20
JP2004505992A (ja) 2004-02-26
OA12361A (en) 2004-04-13
US20060159705A1 (en) 2006-07-20
UA79735C2 (uk) 2007-07-25
IL154301A0 (en) 2003-09-17
PE20020287A1 (es) 2002-06-20
DZ3470A1 (fr) 2002-02-14
ATE313558T1 (de) 2006-01-15
BRPI0113155B8 (pt) 2019-08-13
CZ303217B6 (cs) 2012-05-30
IL154301A (en) 2009-11-18
CY1106310T1 (el) 2011-10-12
CA2740282A1 (en) 2002-02-11
US20030235590A1 (en) 2003-12-25
CY1108789T1 (el) 2014-04-09
ES2254464T3 (es) 2006-06-16
EA200300129A1 (ru) 2003-10-30
DK1307473T3 (da) 2006-05-01
AR030325A1 (es) 2003-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5559847B2 (ja) ワクチンに使用するためのｈｂｖ抗原の精製
KR100365373B1 (ko) B형간염백신
AU2001282073A1 (en) Purification of HBV antigens for use in vaccines
WO2003066094A2 (en) Hepatitis b vaccines
JPH09510740A (ja) クイラヤ サポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤
JP4974441B2 (ja) 抗原性凝集物を得る方法と製剤におけるその使用
EP0005864A1 (en) Antigenic composition useful as a vaccine or vaccine intermediate, and process for preparing same
NO20130773L (no) Metode for fremstilling av en vaksine
TWI311563B (en) Method for production a stable,immunogenic hepatitis b vaccine without trace of thiomersal