KR100804922B1 - 백신에 사용하기 위한 ｈｂｖ 항원의 정제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시스테인의 존재하에서 항원을 정제하는 것을 포함하여, 백신에 사용하기에 적합한 B형 간염 항원을 제조하는 방법, 및 이러한 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다.

Description

백신에 사용하기 위한 ＨＢＶ 항원의 정제 {PURIFICATION OF HBV ANTIGENS FOR USE IN VACCINES}
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 B형 간염 백신의 새로운 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 새로운 방법에 의해 수득가능한 HBV 백신에 관한 것이다.
만성 B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 현재 치료가 제한되어 있고, 전세계적으로 매우 중요한 공중 보건 문제가 되고 있다. HBV의 만성 보균자는 전세계적으로 3억이 넘는 것으로 추정되며, 이들은 만성 활동성 간염, 간경화 및 원발성 간세포 암종으로 발병할 위험이 있다.
현재 사용가능한 많은 백신들은 부패를 방지하기 위해 보존제를 필요로 한다. 자주 사용되는 보존제는 수은 함유 화합물인 티오메르살이다. 백신에 수은을 사용하는 것에 대해 다소 우려가 있어 왔으나, 논평자들은 티오메르살 함유 백신의 잠재적인 위험성이 과장되어서는 안된다고 강조하고 있다[Offit; P. A. JAMA Vol. 283; No: 16]. 그럼에도 불구하고, 제조 과정에서 티오메르살의 사용을 대신할 새롭고 잠재적으로 보다 안전한 백신 제조 방법을 찾는 것이 유리할 것이다. 따라서, 티오메르살을 함유하지 않는 백신, 특히 B형 간염 백신의 개발이 요구된다.
제 1측면에서, 본 발명은 유리 SH기를 포함하는 환원제의 존재하에서 항원을 정제시키는 것을 포함하여, 백신에 사용하기에 적합한 B형 간염 항원을 제조하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 유리 SH기를 포함하는 환원제의 존재하에서 항원을 정제시키는 것을 포함하여, 티오메르살의 흔적량이 없는 안정한 B형 간염 항원을 제조하는 방법을 제공한다.
일반적으로, 항원 제제는 본원에서 기술된 바와 같은 수은의 흡수 분광광도법을 사용하여, 정제된 항원 생성물중에 티오메르살이 검출되지 않는 경우에 티오메르살의 흔적량이 없다.
간염 항원 제제는, 적합하게는 흡수 분광광도법에 의해 측정하여 단백질 20㎍당 0.025㎍ 미만의 수은을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 정제는 티오메르살의 부재하에서 수행되며, 정제된 항원은 티오메르살을 전혀 함유하지 않는다.
바람직하게는, 항원은 안정하며, 적합하게는 예시를 위해 본원의 실시예 1에서 개략적으로 나타낸 바와 같이 티오메르살의 존재하에서 정제된 간염 항원과 실질적으로 동일하게 안정하다.
바람직하게는, 간염 항원은 면역원성이다.
바람직하게는, 환원제는 항원 정제 공정 동안 첨가되며, 바람직하게는 항원을 발현하는 세포의 증식후에 첨가된다.
바람직하게는, 환원제는 시스테인, 디티오트레이톨, β-머캅토에탄올 또는 글루타티온이며, 시스테인이 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명은 바람직하게는 시스테인의 존재하에서 항원을 정제시키는 것을 포함하여, 티오메르살의 흔적량이 없는 안정한 면역원성 B형 간염 항원을 제조하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 정제는 시스테인 용액의 존재하에서 수행된다.
바람직하게는, 시스테인은 용액 또는 분말 형태로 공정 동안 1 내지 10mM, 바람직하게는 1 내지 5 mM의 최종 농도로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 시스테인은 약 2mM의 최종 농도로 첨가된다.
바람직하게는, 시스테인은 L-시스테인이다.
본 발명은 미정제 항원을 겔 투과 크로마토그래피로 처리하고, 이온 교환 크로마토그래피로 처리하고, 유리 SH기를 갖는 환원제와 혼합하여 티오메르살 흔적량이 없는 안정한 B형 간염 항원을 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
바람직하게는, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다.
본 발명은 티오메르살 존재하에서 제조된 B형 간염 항원과 동일하거나 그 이상의 면역원성 및 항원성을 갖는, 본 발명의 제조 방법에 의해 수득가능한 티오메르살 비함유 B형 간염 항원을 추가로 제공한다.
본 발명은 1.5를 초과하는 평균 ELISA 단백질비를 갖고, 티오메르살 존재하에서 제조된 B형 간염 표면 항원 보다 3배 이상 더 낮은 IC50 값을 갖는 RF1 함량을 갖는 면역원성 B형 간염 항원을 추가로 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 티오메르살의 존재하에서 항원을 정제한 후, 항원을 유리 SH기를 포함하는 환원제의 존재하에서 처리하는 것을 포함하여, 백신에 사용하기에 적합한 간염 항원을 제조하는 방법에 관한 것이다.
적합하게는, 상기 처리후에 투석 단계와 같은 정제 단계를 수행하여 티오메르살을 제거한다.
바람직하게는, 환원제는 시스테인, DTT, 글루타티온 또는 2-머캅토에탄올이다.
본 발명의 B형 간염 항원은 B형 간염 감염의 치료 또는 예방, 특히 만성 B형 간염 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 B형 간염 항원을 애쥬번트와 함께 포함하는 백신 제형을 제공한다. 바람직하게는, 애쥬번트는 알루미늄염 또는 TH1 세포 반응의 선택적인 자극제(preferential stimulator)이다.
바람직하게는, 항원은 B형 간염 표면 항원이다.
B형 간염 표면 항원 제제는 많은 문헌에 기록되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조할 수 있다: [Harford et. al. in Develop. Biol. Standard 54, page 125 (1983), Gregg et. al. in Biotechnology, 5, page 479 (1987), EP-A-0 226 846, EP-A-0 299 108] 및 본원의 참고문헌.
본원에서 사용된 표현 "B형 간염 표면 항원" 또는 "HBsAg"는 HBV 표면 항원의 항원성을 나타내는 임의의 HBsAg 항원 또는 이의 단편을 포함한다. HBsAg S 항원[Tiollais et. al. Nature, 317,489 (1985) 및 본원의 참고문헌들]의 226개 아미노산 서열 뿐만 아니라, 본원에서 기술된 HBsAg가 소망에 따라, 상기 문헌들과 EP-A-0 278 940에 기술된 프리-S 서열의 전부 또는 일부를 함유할 수 있음은 물론이다. 본원에서 기술된 HBsAg는 변종, 예를 들어 WO 91/14703에 기재된 "이스케입 뮤턴트(escape mutant)"를 의미할 수 있다.
HBsAg는 또한 EP 0 198 474 또는 EP 0 304 578에 기재된 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
통상적으로 HBsAg는 입자 형태일 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, HBsAg는 본질적으로 전술한 HBsAg S-항원으로 구성될 것이다.
백신은 유리하게는 적절한 애쥬번트와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 적절한 애쥬번트는 프로인트 불완전 애쥬번트(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 애쥬번트(Complete Adjuvant)(Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크 애쥬번트(Merck Adjuvant) 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 수산화알루미늄겔(명반) 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄염; 칼슘, 철, 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온 또는 음이온 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어; 모노포스포릴 리피드 A 및 퀼(quil) A와 같이 시판된다. GM-CSF 또는 인터류킨-2, -7, 또는 -12와 같은 사이토카인도 애쥬번트로 사용될 수 있다.
본 발명의 제형에서, 애쥬번트 조성물은 주로 TH1 타입의 면역 반응을 유도하는 것이 바람직하다. 높은 수준의 Th1 타입 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대해 세포매개 면역 반응의 유도에 유리한 경향이 있다. 반응이 주로 Th1 타입인 바람직한 구체예에서, Th1 타입 사이토카인의 수준은 Th2 타입 사이토카인의 수준을 초과할 정도로 증가할 것이다. 이들 사이토카인의 수준은 표준 검정법을 사용하여 용이하게 평가될 수 있다. 사이토카인 패밀리(family)에 대해서는 문헌[Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989]을 참조할 수 있다.
따라서, 주로 Th1 타입 반응을 일으키는 데 사용하기에 적합한 애쥬번트는, 예를 들어 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A(3-DMPL)와 알루미늄염의 배합물을 포함한다. 선택적으로 TH1 타입 면역 반응을 유도하는 기타 공지된 애쥬번트는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 CpG 디뉴클레오티드가 메틸화되지 않음을 특징으로 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 잘 알려져 있으며, 예를 들어 WO 96/02555에 기재되어 있다. 면역자극성 DNA 서열도, 예를 들어 문헌[Sato et al., Science 273: 352, 1996]에 기재되어 있다. 다른 바람직한 애쥬번트는 사포닌, 바람직하게는 QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)이며, 단독으로 사용되거나 다른 애쥬번트와 배합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 향상된 시스템은 모노포스포릴 리피드 A 및 사포닌 유도체의 배합물, 예를 들어 WO 94/00153에 기재된 QS21 및 3-DMPL의 배합물, 또는 WO 96/33739에 기재된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 켄칭된 덜 반응원성인 조성물을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 수중유 에멀션 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀션중에 QS21, 3-DMPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬번트 제형이 WO 95/17210에 기재되어 있다.
수중유 에멀션중에 QS21, 3-DMPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬번트 제형이 WO 95/17210호에 기재되어 있으며 바람직한 제형이다.
따라서, 본 발명의 한 구체예에서 본 발명의 B형 간염 표면 항원을 포함하고, 추가로 TH-1 유도 애쥬번트를 포함하는 백신이 제공된다. 바람직한 구체예는 TH-1 유도 애쥬번트가 3-DMPL, QS21, QS21과 콜레스테롤의 혼합물, 및 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함하는 애쥬번트 군으로부터 선택된 백신이다. 다른 바람직한 구체예는 수중유 에멀션중의 모노포스포릴 리피드 A 또는 이의 유도체, QS21 및 토코페롤로 면역보강된 B형 간염 표면 항원을 포함하는 백신이다.
바람직하게는, 백신은 추가로 사포닌, 보다 바람직하게는 QS21을 포함한다. CpG 및 사포닌을 포함하는 특히 적합한 다른 애쥬번트 제형이 WO 00/09159에 기재되어 있으며 바람직한 제형이다. 가장 바람직하게는, 특정 제형중의 사포닌은 QS21이다. 바람직하게는, 상기 제형은 수중유 에멀션 및 토코페롤을 추가로 포함한다.
본 발명은 본 발명의 B형 간염 표면 항원과 애쥬번트를 함께 포함하고 디프테리아 톡소이드(D), 파상풍 톡소이드(T), 무세포 백일해 항원(Pa), 불활성화 폴리오 바이러스(IPV), 헤모필루스 인플루엔자 항원(Hib), A형 간염 항원, 단순포진 바이러스(HSV), 클라미디아, GSB, HPV, 폐렴 연쇄구균 및 나이세리아 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 추가로 포함하는 백신 제형을 제공한다. 또한, 다른 질환에 대한 방어를 부여하는 항원이 본 발명의 백신 제형에 배합될 수 있다.
한 특정 구체예에서, 백신 제형은 애쥬번트와 함께 본 발명의 제조 방법에 의해 수득가능한 B형 간염 표면 항원 및 불활성화 폴리오 바이러스를 포함한다.
본 발명은 또한 B형 간염 바이러스에 감염되거나 감염되기 쉬운 사람 또는 동물 피검자에게 B형 간염의 예방 및/또는 치료를 위해 본 발명의 안전 유효량의 백신을 투여하는 것을 포함하는 B형 간염의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 B형 간염 바이러스 감염, 예를 들어 만성 B형 간염 바이러스 감염 환자의 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 B형 간염 표면 항원의 용도를 추가로 제공한다.
본 발명의 백신은 면역보호량의 항원을 함유할 것이고 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.
백신 제제는 문헌[Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenurn Press, 1995, New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 일반적으로 기재되어 있다. 리포솜내의 캡슐화는, 예를 들어 문헌[Fullerton, U.S. Patent 4,235,877]에 기재되어 있다. 단백질과 고분자의 콘쥬게이션은, 예를 들어 문헌[Likhite, U.S. Patent 4,372,945 and Armor et al., U.S. Patent 4,474,757]에 기재되어 있다. 퀼(Quil) A의 사용은 문헌[Dalsgaard et al., Acta Vet Scand, 18:349 (1977)]에 기재되어 있다. 3-DMPL은 리비 이뮤노켐(Ribi immunochem, USA)에서 시판되고, 영국 특허 출원 2220211호 및 미국 특허 4912094호에 기재되어 있다. QS21은 미국 특허 5057540호에 기재되어 있다.
본 발명은 하기 실시예에 예시되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 엔제릭스(Engerix) B™에 대한 티오메르살 비함유 공정을 도시한다.
도 2는 벌크 항원 롯트(lot)의 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 3은 티오메르살 비함유 공정에 의해 생성된 벌크 항원 롯트의 잔류 효모 단백질을 도시한다.
실시예 1:
티오메르살 존재하에서의 B형 간염 표면 항원의 제조 방법
에스비 바이오로지칼스(SB Biologicals) B형 간염 1가 백신(엔제릭스 B™)의 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)[Harford et. al. loc. cit.]에서 재조합 단백질로서 발현시켰다. 24kD 단백질이 세포내에서 생성되었고 재조합 효모 세포에 축적되었다. 발효 종료시에, 효모 세포를 수집하고 트윈 20과 같은 순한 계면활성제의 존재하에서 파괴하여 목적 단백질을 유리시켰다. 이어서, 가용성 표면 항원 입자를 함유하는 세포 균질화물을 일련의 침전물로 예비정제한 다음, 한외여과에 의해 농축시켰다.
재조합 항원의 추가 정제를 후속 크로마토그래피 분리에서 수행하였다. 제 1단계에서, 미정제 항원 농축물을 세파로오스 4B 매질상에서 겔 투과 크로마토그래피로 처리하였다. 티오메르살은 4B 겔 투과 크로마토그래피 단계에서 용리 완충액중에 존재하였다. 용리 완충액은 하기 조성을 갖는다: 10mM Tris, 5% 에틸렌 글리콜, pH 7.0, 50mg/L 티오메르살. 티오메르살은 생물적재물(bioburden)을 억제하기 위해 이 완충액에 포함시켰다. 이러한 티오메르살의 대부분을 이온 교환 크로마토그래피, 초원심분리 및 탈염(겔 투과)을 포함하는 후속 정제 단계 동안 제거하여 최초 공정에 의해 제조된 정제된 벌크 항원 제제가 단백질 20㎍당 약 1.2㎍ 및 2㎍ 미만의 티오메르살을 함유하도록 하였다.
DEAE-매트릭스를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행한 다음, 이 풀(pool)을 다양한 세슘 클로라이드 농도의 4개의 사전설정된(pre-established) 층상에서 세슘 구배 초원심분리로 처리하였다. 항원 입자를 밀도 구배에 따라 오염 세포 구성성분으로부터 분리하고 원심분리 공정 종료시에 용리시켰다. 이후, 세슘 클로라이드를 세파로오스 겔상에서 2차 겔 투과에 의해 이 풀로부터 제거하였다.
HBsAg를, 4B 겔 투과 완충액에 티오메르살을 함유하는 공정에 의해 제조한 경우, CsCl 구배로부터의 분획을 함유하는 풀링된(pooling) HBsAg에서 30mg/ml를 초과하는 단백질 농축물을 회수하였고, 이는 애보트 라보라토리스(Abbott Laboratories)의 AUSZYME 키트에 의해 분석한 HBsAg의 균등한 농축물에 상응하였다.
CsCl 초원심분리 단계는 잔류 지질, DNA 및 소량의 단백질 오염물을 HBsAg 제제로부터 제거하는데 유용하다. 상기 초원심분리는 베크만 인스트루먼츠(Beckman Instruments, Fullerton, California)의 Ti 15 로터(rotor)에서 약 40 내지 60시간 동안 30,000rpm의 속도로 구역 원심분리(zonal centrifugation)함으로써 수행하였다. 정제하려는 샘플을 최종 농도 0.75, 1.5, 2.5 및 3.25M CsCl인 CsCl 용액층에 적용하였다. 원심분리 종료시에, 구배가 분획내로 용리되었다. HBsAg를 함유하는 분획은 280nm에서 UV 흡광도에 의하거나, AUSZYME 키트로 분획의 희석물을 시험하여 확인할 수 있다. HBsAg 밴드는 1.17 내지 1.23g/㎤의 밀도에 있다.
정제된 HBsAg를 함유하는 용액은 백신 제형을 제조하는데 사용하기 전에 멸균 여과하였다.
효모 세포 용해물로부터의 정제는, 항원이 세포내에서 생성되고 상이한 타입의 (효모) 오염물을 제거하도록 고안된 일련의 분리 기술이 순수한 벌크 항원을 수득하는 데 필요하기 때문에 복잡하다. 정제의 단계들은, 정제하려는 생성물이 표면 항원 폴리펩티드의 다수의 복제물을 함유하는 지질단백질 입자이고, 이 구조가 정제 공정을 통해 유지되어야 하기 때문에 중요하다. 면역성을 증가시키기 위해 추가로 화학 처리할 필요 없이 완전한 면역원성인 표면 항원 입자가 수득된다는 것이 이 공정의 특징이다(EP0135435와 비교).
자세한 생성 공정은 유럽 특허 0199698에 더 기재되어 있다.
실시예 2
티오메르살 비함유 공정에 의한 효모 유래 HBsAg의 제조 및 특성화
1. 효모 유래 HBsAg의 생성 및 정제
1.1 생성 공정의 개요
B형 간염 표면 항원은 문헌[Harford et. al. (loc. cit.)]에 기재된 사카로마이세스 세레비지애의 적당한 균주의 발효에 의해 생성될 수 있다.
재조합 효모 균주의 대규모 발효의 종료시에, 세포를 수집하고 트윈 20과 같은 순한 계면활성제의 존재하에서 파괴하였다. 그 다음, 표면 항원을 실시예 1에서 전술한 바와 같이 다단계 추출 및 정제 과정을 세파로오스 4B상에서 1차 겔 투과 단계까지 수행함으로써 분리하였다.
1.2 티오메르살 비함유 정제 공정
티오메르살 비함유 공정에서는, 실시예 1에서 기술한 공정과 비교하여 다음 2가지를 변화시켰다.
1. 4B 겔 투과 크로마토그래피에서 용리 완충액은 더 이상 티오메르살을 함유하지 않는다.
2. 시스테인(2mM 최종 농도)을 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터의 용리액 풀에 첨가한다.
4B 겔 투과 완충액으로부터 티오메르살을 제외시키면 CsCl 밀도 구배 원심분리 단계 동안 HBsAg 입자의 침전과 함께 생성물의 손실 및 회수된 항원의 응집 또는 덩어리를 초래할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
시스테인을 2mM 최종 농도로 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터의 용리액 풀에 첨가하면 CsCl 밀도 원심분리 동안 침전 및 항원의 손실이 방지된다.
시스테인은 천연 아미노산이고 세파로오스 4BCLFF를 칼럼 매트릭스로 사용하여 겔 투과 칼럼상에서 후속 탈염 단계에서 제거될 수 있기 때문에, 이러한 처리에 바람직한 물질이다.
실시예 1에 기재된 방법과 비교하여 제조 방법에 다른 변화는 없었다.
티오메르살 비함유 공정은 실시예 1의 공정으로부터 얻은 항원과 유사한 순도 및 성질을 갖는 벌크 항원을 생성시킨다.
1.2a
50㎍/ml로 4B 완충액에 첨가된 티오메르살은 분해되는 것으로 생각되며 생성된 에틸수은은 단백질의 시스테인 잔기상의 유리 설프히드릴기에 공유 결합될 수 있다. 단백질은 14개의 시스테인 잔기를 함유하며, 이중 7개는 101번과 150번 위치 사이에 위치한다.
단백질의 이 영역은 입자의 표면에 위치하는 것으로 생각되며 면역지배적 (immunodominant) a 영역을 포함하는 HBsAg의 주항원성 영역 및 RF1 모노클로날 항체에 대한 인식 부위를 함유한다[Waters J et al, Postgrad. Med. J., 1987: 63 (Suppl. 2): 51-56. and Ashton-Rickardt and Murray J. Med. Virology, 1989: 29: 196)]. 4B 겔 투과 완충액에 존재하는 티오메르살과 함께 정제된 항원은 정제 공정의 종료시에 약 0.5 내지 0.6㎍ 수은을 함유한다. 이 수은은 간단한 투석에 의해 완전히 제거되지 않는다.
한 실험에서, 단백질 20㎍당 수은 0.56㎍이 벌크 항원 제제에 대해 측정되었다. 이 제제를 실온에서 16시간 동안 150mM NaCl, 10mM NaP04 완충액(pH 6.9)에 대해 투석하였다. 투석 종료시에, 단백질 20㎍당 수은 0.33㎍의 농도가 측정되었다.
대조적으로, 0.1 내지 5.0mg/ml의 L-시스테인, 50mM DDT, 또는 0.5M 2-머캅토에탄올과 같은 환원제의 존재하에서 투석하면 항원 제제의 수은 함량이 단백질 20㎍당 수은 0.025㎍으로 감소된다. 이것은 상기 방법의 최저 검출 한계이다.
수은 함량은 흡수 분광광도법에 의해 측정하였다. 항원을 0.01%(w/v) 중크롬산칼륨(K2Cr207) 및 5%(v/v) 질산을 함유하는 용액에 희석시켰다. 표준 용액을 수은 공급원으로서 티오메르살을 사용하여 제조하였다. 샘플 및 표준 용액의 원자 흡수를, 증기 발생기에서 기화시킨 후 253.7nm에서 수은 특이적 캐소드를 사용하여 측정하였다. 희석액의 원자 흡수를 공시험(blank)으로서 측정하였다. 샘플의 수은 함량은 표준 용액으로부터 구한 캘리브레이션 곡선에 의해 계산하였다. 결과를 단백질 20㎍당 수은의 ㎍수로서 나타내었다.
1.3 티오메르살 비함유 벌크 항원의 제조
벌크 항원의 정제를 위한 공정 단계는 도 1에 도시되어 있다.
1.4 티오메르살을 함유하지 않도록 제형화된 백신의 조성
보존제를 함유하지 않고 티오메르살 비함유 공정에 의해 제조된 항원으로부터 제형화된 B형 간염 백신에 대한 전형적인 정량 조성은 표 1에 제시되어 있다.
성분 ml당 함량
활성 성분 - 95% 이상이 HBsAg인 단백질 20㎍
수산화알루미늄(흡착제) (Al203로 표시) 0.95mg
염화나트륨 9.0mg(최대)
인산이나트륨 이수화물 0.98mg
인산이수소나트륨 이수화물 0.71mg
주사용수, 기재된 양까지 적당량 1.0ml

상기 조성은 3-DMPL 및/또는 다른 애쥬번트의 첨가에 의해 변화될 수 있다.
2. 티오메르살 비함유 공정에 의해 제조된 벌크 항원 및 백신의 특성화
2.1. 정제된 벌크 항원에 대한 시험 및 검정
2.1.1 비교의 기초
벌크 항원의 3개 롯트를 본 실시예(실시예 1.2)에 따라 티오메르살 비함유 공정에 의해 제조하였고, 이들은 HEF001, HEF002, 및 HEF003인 것으로 확인되었다. 이들을 티오메르살의 존재하에서 이전 공정(실시예 1)에 의해 제조된 벌크 항원 롯트(HEP2055)와 비교하였다.
2.1.2 벌크 항원에 대한 시험 및 검정
티오메르살 비함유 공정에 의해 제조된 3개의 벌크 항원 롯트를 시험하고 그 결과를 표 2에 요약하였다.
단백질 함량을 로우리 등(Lowry et al)의 방법[J. Biol. Chem. 1951: 193: 265]에 의해 측정하였다.
엔도톡신 함량을, 케이프 코드 어소시에이츠(Cape Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA)에서 시판되는 키트를 사용하는 리물루스(Limulus) 겔 응고 기술에 의해 측정하였다. 시약을 유에스 팜 엔도톡신 참조 표준물질(US Pharm. Endotoxin Reference Standard)에 대해 표준화하였다.
트윈 20을 허들레스톤 및 알레드(Huddleston and Allred)의 방법[J. Amer. Oil Chemist Soc., 1965: 42: 983]에 의해 측정하였다.
HBsAg 함량을 애보트 라보라토리스(Abbott Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, USA)에서 시판되는 AusZYME 키트에 의해 측정하였다. 제조업자의 분석 과정 B를 사용하였다. 티오메르살을 함유하는 공정에 의해 정제된 벌크 항원의 뱃치(batch)를 표준물질로 사용하여 용량 반응 곡선을 작성하였다.
다당류를 뒤보아 등(Dubois et al)의 방법[Anal. Chem. 1956: 28: 350]에 의 해 측정하였다.
지질을 이. 머크(E. Merck, B. P. 4119, Darmstad D-6100, Germanny)에서 시판되는 키트(Merkotest Total Lipids 3321)를 사용하여 측정하였다.
DNA 함량을 몰레큘라 디바이시스 코프.(Molecular Devices Corp., Gutenbergstrasse 10, Ismaning, Munich, Germany)에서 시판되는 장치 및 시약을 사용하여 트레숄드법(Threshold method)으로 측정하였다.
상기 시험 및 검정에서 측정된 값은 ELISA에 의한 항원 활성을 제외하고는, 세파로오스 4B 겔 투과 단계의 용리 완충액에 티오메르살을 사용하여 제조된 벌크 항원 롯트에 대해 나타난 범위 이내이다. 3개 HEF 제제에 대한 이러한 측정값은 ELISA/단백질비가 1.13인 벌크 항원 롯트 HEP2055에 대해 측정된 것보다 더 높다(1.63 내지 2.25). 티오메르살을 함유하는 벌크 항원의 뱃치에 대해 AUSZYME 키트에 의해 측정한 ELISA/단백질비는 일반적으로 약 1.0이고 0.8 내지 1.2의 범위이며 매우 드물게는 1.4를 초과한다.
2.1.3 SDS-PAGE 겔 분석
벌크 항원 제제를 환원 조건에서 SDS-PAGE 분석 및 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다. 모든 샘플은 이량체 단백질의 흔적량과 함께 24K에서 주밴드를 나타내었다. 샘플은 오염 단백질의 가시 밴드의 부재에 의해 평가되는 바와 같이, 고순도( > 99 % 순도)인 것으로 판정되었다.
벌크 항원 제제의 샘플(1㎍)을 환원 및 비환원 조건에서의 SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 분석하였다(도 2). 환원 조건에서, 샘플은 이량체 및 다량체 형태의 흔적량과 함께 24K에서 이동하는 강한 밴드를 나타내었다. 겔 패턴이 비교물인 HEP2055의 패턴과 구별되지 않았다. 또한 샘플을 비환원 조건에서 시험하였다. 이러한 조건에서 24K에서 물질이 덜 이동하고, 이량체 및 다량체 위치에서 이동하는 폴리펩티드의 양이 증가하였다. 티오메르살 비함유 벌크 항원 롯트는 비교물인 HEP2055 롯트보다 약간 높은 중합도를 나타내었다.
쿠마시 블루 또는 은 염색에 의해 나타난 24K 폴리펩티드의 동정은 혈장 HBsAg에 대해 초래되는 토끼 폴리클로날 항체로 웨스턴 블롯하여 확인하였다. 벌크 항원 제제는 이량체 및 삼량체 형태와 함께 24K에서 주밴드를 나타내었다. 상기 기술은 표면 항원 단백질의 분해 생성물의 약한 흔적량을 나타내었다. 티오메르살 비함유 공정에 의해 제조된 벌크 항원과 HEP2055 롯트간에 차이는 없었다.
잔류 효모 단백질의 존재는 환원 조건에서 SDS-PAGE 분석 및 효모 단백질에 대해 생성된 토끼 폴리클로날 항혈청으로 웨스턴 블롯하여 분석하였다(도 3). 상기 기술은 정성적이며 불순물의 정량을 허용하지 않는다.
티오메르살 비함유 공정에 의해 제조된 3개의 벌크 항원 롯트와 HEP2055 롯트에 대해 한가지를 제외하고는 일정한 밴드 패턴이 나타났다.
HEP2055 벌크 항원에서 ±23K에 존재하는 심하게 염색된 밴드는 3개의 HEF 제제에는 실질적으로 존재하지 않았다. 웨스턴 블롯은 티오메르살 비함유 정제 공정이 보다 순수한 항원 생성물을 생성함을 입증한다.
정제된 티오메르살 비함유 벌크 항원에 대한 시험 및 검정 결과
시험 결과
HEF001 HEF002 HEF003 HEP2055
pH 단백질 함량(Lowry) 엔도톡신 함량 트윈 20 함량 항원 활성(ELISA) ELISA/단백질비 다당류 함량 지질 함량 DNA 함량(Threshold) 6.8 1312㎍/ml < 0.25 EU 7.1㎍ 2957㎍/㎖ 2.25 0.33㎍ 13.7㎍ <1pg 6.8 888㎍/ml < 0.25 EU 6.6㎍ 1505㎍/㎖ 1.69 0.35㎍ 12.8㎍ <1pg 6.8 913㎍/ml < 0.25 EU 7.4㎍ 1486㎍/㎖ 1.63 0.33㎍ 12.9㎍ <1pg 6.8 995㎍/ml < 0.25 EU 5.8㎍ 1128㎍/㎖ 1.13 0.34㎍ 11.8㎍ < 1pg
2.1.4 기타 생화학적 시험 및 검정
2.1.4.1 DNA 함량
3개 벌크 항원 롯트의 DNA 함량을 트레숄드법(Molecular Devices Corp)에 의해 측정하였다. 측정된 양은 단백질 20㎍당 DNA 10pg 미만이었고(표 2), 본 승인된 공정에 의해 제조된 벌크 항원에서 나타난 것과 동일한 DNA 수준이었다.
2.1.4.2 아미노산 조성
3개의 HEF 벌크 항원 롯트의 아미노산 조성은 6N HCl을 사용한 산가수분해 후에 이온 교환 칼럼상에서 아미노산의 크로마토그래피 및 후칼럼(post column) 닌히드린 검출에 의해 측정하였다. 프롤린 및 트립토판은 측정되지 않았다. 결과는 표 3에 제시되어 있다. 측정된 조성은 HEP2055에 대해 측정된 것과 DNA 서열로부터 추론되는 예상 조성과 잘 일치하였다. HEP2055에 대해 측정된 글리신 잔기의 수는 예상 조성과 유사하지만, 16 내지 17개 잔기의 값이 벌크 항원 제제에 대해 보다 일반적으로 측정된다. 측정된 시스테인 잔기의 평균수는 예측된 14였고, 이는 CsCl 구배 단계에서 처리한 결과 추가의 시스테인이 입자에 결합되어 있지 않음을 나타낸다.
2.1.4.3 유리 시스테인의 정량
기술된 방법에 따라 수득된 벌크 항원 제제에 존재하는 유리 시스테인의 양은 입자를 사전 산가수분해 없이 입자를 과포름산으로 산화시킨 후 측정하였다. 산화된 유리 시스테인 잔기를 이온 교환 칼럼상에서 분리하고 닌히드린에 의해 후칼럼 검출하였다. 이 방법에 의한 시스테인의 검출 한계는 1㎍/ml이다. 유리 시스테인은 표 2에 제시된 초기 단백질 농도에서 시험할 때 3개의 HEF 항원 제제에서 측정할 수 없었다. 상기 기술은 완충액에 존재하는 유리 시스테인 잔기 및 이황화 결합에 의해 HBsAg 단백질과 결합하지만 폴리펩티드 서열의 일부를 형성하지 않는 시스테인 잔기 둘 모두를 측정한다.
2.1.4.4 N-말단 서열 분석
변형된 방법에 의해 제조된 3개의 벌크 항원 롯트중에 가능한 단백질 오염물질 및 분해 생성물의 존재는 에드만 분해에 기초한 N-말단 서열 분석에 의해 평가하였다. HBsAg 단백질의 N-말단 서열 MENITS...을 다른 서열로부터의 방해 없이 검출하였다. N-말단 메티오닌은 통상적인 공정에 의해 제조된 HBsAg 폴리펩티드에 대해 이전에 관찰된 바와 같이 아세틸화에 의해 60 내지 75% 차단된 것으로 확인되었다.
HBsAg의 아미노산 조성
아미노산 HEF001 HEF002 HEF003 평균 조성 HEP2055 예측 조성
Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe His Lys Arg Trp 11.3 17.5 21.4 11 nd 17.1 7.5 12.3 10.9 6.8 12.3 26.3 6.8 13.8 3 4 5.7 nd 11.3 17.4 21.6 11 nd 16.8 7.4 14.95 11 6.7 12.4 26.6 6.8 13.9 2.8 4 5.8 nd 11.3 17.2 21.4 11 nd 16.7 7.4 14.9 10.9 7.1 12.5 26.2 6.8 13.8 3.3 3.9 5.7 nd 11.3 17.4 21.5 11.0 16.9 7.4 14.1 10.9 6.9 12.4 26.4 6.8 13.8 3.0 4.0 5.7 11.5 17.8 20.9 10.5 nd 14.6 7.2 13.2 10.7 7.1 12.2 26.7 7 13.9 3.3 4.2 6.1 nd 10 17 23 9 24 14 6 14 11 6 16 33 6 15 1 3 5 13

2.1.4.5 레이저 광산란 분석
변형된 방법을 사용하여 제조된 HBsAg 입자와 HEP2055 참조 롯트간에 입자 크기 비교를 레이저 광산란에 의해 수행하였다(표 4). 측정된 평균 분자량은 제제간의 양호한 일치성을 나타낸다.
레이저 광산란에 의한 HBsAg 입자 분자량
항원 롯트 MW(달톤)
HEF001 3.07 x 106
HEF002 2.76 x 106
HEF003 2.76 x 106
HEP2055 3.34 x 106

2.1.4.6 전자 현미경측정
벌크 항원 제제를 고정시키고 우라닐 아세테이트로 염색한 후 전자 현미경법에 의해 검사하였다. 관찰된 입자는 모든 샘플에서 유사하였고, HBsAg의 전형적인 ±20nm 구형 또는 자갈모양의 입자와 합치하였다. 3개의 HEF 롯트에서 관찰된 입자는 HEP2055와 차이가 없었다.
2.1.5 면역학적 분석
2.1.5.1 RF1 모노클로날 항체와의 반응성
3개의 벌크 항원 제제를 ELISA 억제 검정에 의해 RF1 모노클로날 항체와의 반응성에 대해 시험하였다. RF1 모노클로날 항체는 침팬지를 HBV 접종에 대해 보호하는 것으로 나타났고, HBsAg 입자상의 보호 형태 에피토프를 인지하는 것으로 간주된다[Iwarson S et al, 1985, J. Med, Virol., 16: 89-96].
RF1 하이브리도마는 BalbC 마우스의 복강 또는 조직 배양물에서 증식할 수 있다.
포화 완충액(1% BSA, 0.1% 트윈 20을 함유한 PBS)에 1/50000로 희석된 복수액을, 시험하려는 HBsAg 샘플의 PBS의 다양한 희석액(최종 농도 범위 100㎍ 내지 0.05㎍/ml)과 1:1로 혼합하였다.
혼합물을 눈크(Nunc) 면역플레이트(96U)에 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, HBsAg의 표준 제제로 피복된 플레이트상에 1시간 동안 37℃에서 옮겼다. 표준 HBsAg 제제는 티오메르살 함유 공정에 의해 정제된 벌크 항원의 롯트(Hep 286)였다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS를 사용한 세척 단계 후에, 포화 완충액에 1/1000으로 희석된 비오틴-콘쥬게이션된 양(sheep) 항-마우스 IgG를 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세척 단계 후에, 포화 완충액에 1/1000으로 희석된 스트렙타비딘-비오틴화된 퍼옥시다제 복합체를 동일한 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 0.1M 시트레이트 완충액(pH 4.5)중의 OPDA 0.04%, H2O2 0.03% 용액과 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 2N H2SO4로 정지시키고 광학 밀도(O.D.)를 490/630nm에서 측정하고 그래프를 작성하였다. 피복된 HBsAg와 항체의 결합을 50% 억제하는 항원의 농도(억제제 농도)로 정의되는 IC50을 4 파라미터 방정식으로 계산하여 ng/ml으로 표시하였다.
또한, HEP2055를 포함하는 일련의 HEP 항원 롯트를, 음성 대조로서 단순포진 gD 항원과 함께 시험하였다. 상기 검정은 RF1이 마이크로타이터 플레이트에 결합된 표준 항원 제제(HEP286)와 결합하는 것을 억제하는 각 시험 항원의 능력을 측정한다.
표 5에 고정된 항원과 RF1의 결합을 50% 억제하는 것으로 나타난 각 항원의 농도가 제시되어 있다.
HBsAg에 대한 RF1 모노클로날 항체의 결합 억제
벌크 항원 IC50(ng/ml)*
HEP286 HEP673 HEP720 HEP2055 HEF001 HEF002 HEF003 3834 3437 3150 2384 468 574 540
*IC50 = 고정된 항원과 RF1의 결합을 50% 억제하는 항원 농도(ng/ml)

상기 결과는 RF1 결합을 억제시키는데 4 내지 7배 더 적은 HEF 항원이 필요함을 나타낸다(표 5). 이는 변형된 방법에 의해 제조된 항원이 HEP 벌크 항원과 비교하여 RF1 에피토프의 제시가 증가됨을 나타낸다.
동일한 유형의 억제 검정이 RF1 mAb 대신에 엔제릭스 B™백신으로부터의 사람 혈청을 사용하여 수행되었고, 이는 HEP 항원 롯트와 HEF 항원간의 차이를 나타내지 않았다.
2.1.5.2. 모노클로날 RF1에 대한 결합 친화도
3개의 HEF 항원 롯트 및 HEP2055에 대한 RF1 모노클로날 항체 결합의 속도론적 파라미터를, 바이아코아(Biacore) 2000 장치(Amersham Pharmacia Biotech, Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, UK)를 사용하여 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정하였다.
측정된 속도론적 파라미터는 다음과 같았다:
ka: 결합 속도 상수(M-1S-1)
kd: 해리 속도 상수(S-1)
Ka: 평형 또는 친화도 상수(M-1)
Figure 112003004513549-pct00001
측정된 값은 표 6에 제시되어 있다.
HBsAg와 RF1 결합의 친화도 상수
벌크 항원 ka (x 10-3) kd (x 105) Ka(x 10-7)
HEF001 HEF002 HEF003 HEP2055 6.81 6.89 7.39 3.31 3.21 3.73 4.67 6.30 21.97 18.83 15.80 5.31

3개의 HEF 항원 롯트는 유사한 결합/해리 상수 및 결합 친화도 값을 나타내었다. 대조적으로, HEP2055는 RF1에 대한 결합 친화도가 약하였다.
이것은 ELISA 억제 검정 결과와 일치하며, 이는 티오메르살 비함유 공정에 의해 제조된 항원이 RF1 에피토프의 제시를 증가시켰음을 나타내었다.
2.2. 변형된 방법에 의해 제조된 항원으로 제형화된 백신에 대한 시험 및 검정
3개의 HEF 항원 롯트를 수산화알루미늄상에 흡착시키고 표 1에 제시된 조성에 따라 백신으로서 제형화하였다. 표시량은 바이알중의 성인 용량(1ml중 항원 단백질 20㎍)이다. 롯트는 DENS001A4, DENS002A4 및 DENS003A4로 확인되었다.
백신 역가(potency)는 애보트 라보라토리스 AUSZYME ELISA 키트 및 표준물질로서 티오메르살 50㎍/ml와 함께 제형화된 전형적인 백신 롯트를 사용하여 시험관내 항원 함량 검정에 의해 측정하였다. 백신 역가는 문헌[PharmaEuropa Special Issue Bio97-2 (December 1997)]에 기재된 방법 B를 사용하여 측정하였다. 3개의 HEF 롯트는 항원 함량에 대하여 높은 값을 나타내었고, 20㎍ 항원 단백질 표시 함량의 거의 2배였다.
2..2..1 RF1 모노클로날 항체와 DENS 백신의 반응성
흡착된 백신의 항원성을 RF1 모노클로날 항체를 사용한 억제 검정에서 추가로 시험하였다. 상기 검정은 고정된 벌크 항원(HEP286)에 대한 RF1 결합을 억제하는 백신 샘플의 능력을 측정한다.
포화 완충액(1% BSA, 0.1% 트윈 20을 함유한 PBS)에 1/50000로 희석된 복수액을, 시험하려는 백신 샘플의 PBS중의 다양한 희석액(농도 범위 20㎍ 내지 0.05㎍/ml)과 1:1로 혼합하였다.
혼합물을 눈크(Nunc) 면역플레이트(96U)에 2시간 동안 37℃에서 교반하면서 인큐베이션한 후, HBsAg 피복 플레이트상에 옮겼다. 피복에 사용된 HBsAg 제제는 티오메르살 함유 공정에 의해 정제된 벌크 항원의 롯트(Hep 286)였다. 이들 플레이트를 교반하면서 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS를 사용한 세척 단계 후에, 포화 완충액에 1/1000으로 희석된 비오틴-콘쥬게이션된 양 항-마우스 IgG를 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세척 단계 후에, 포화 완충액에 1/1000으로 희석된 스트렙타비딘-비오틴화된 퍼옥시다제 복합체를 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 0.1M 시트레이트 완충액(pH 4.5)중의 OPDA 0.04%, H2O2 0.03% 용액과 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 2N H2SO4로 정지시키고 광학 밀도(O.D.)를 490/630nm에서 측정하고 그래프를 작성하였다.
피복된 HBsAg와 항체의 결합을 50% 억제하는 항원의 농도(억제제 농도)로 정의되는 IC50을 4 파라미터 방정식으로 계산하여 ng/ml로 표시하였다.
변형된 공정에 의해 제조된 벌크 항원으로 제조된 백신을, 보존제로서 티오메르살을 사용하지 않고 전형적인 HEP 벌크 항원으로부터 제형화된 엔제릭스 B™백신과 비교하였다. 검정은 삼중(triplicate)으로 수행하였다.
결과는 표 7에 제시되어 있고, 보존제를 함유하지 않는 엔제릭스 B™백신과 비교하여 RF1 결합을 50% 억제하는데 DENS 백신의 약 절반량이 필요한 것으로 제시되어 있다. 이것은 HEF/DENS 항원상의 RF1 에피토프의 제시가 증가됨을 반영하며, 정제된 벌크 항원에 대하여 RF1 항체를 사용하여 수행된 시험과 일치하였다.
제형화된 백신에 의한 RF1 결합의 억제
백신 롯트 IC-50(ng/ml)(1)
실험 1 실험 2 실험 3 평균
DENS001A4 913 662 603 726
DENS002A4 888 715 521 708
DENS003A4 817 685 582 695
ENG5100A2 1606 1514 1481 1534
ENG3199B9 1329 1170 1286 1262
ENG3328A9 1417 1194 1334 1315
(1) 고정 항원에 대한 RF1 항체 결합을 50% 억제하는 백신의 농도

2..2..2 마우스에서의 DENS 백신의 면역원성
3개의 DENS 컨시스턴시(consistency) 롯트를 현재의 항원 제조 방법에 의해 제조되고 티오메르살과 함께 제형화된 엔제릭스 B™백신과 비교하기 위하여 Balb/C 마우스에서 시험을 수행하였다.
하기 롯트를 시험하였다:
# DENS001A4
# DENS002A4
# DENS003A4
# ENG2953A4/Q (참조물질)
간단하게, 12마리의 마우스로 구성된 군을 성인 사람 용량의 1/10(2㎍) 또는 1/50(0.4㎍)에 상응하는 백신 용량을 사용하여 2주 간격으로 2회 근육내로 면역화시켰다. HBsAg에 대한 항체 반응 및 백신접종에 의해 유도된 이소타입 프로필은 28일째에 채취한 혈청으로부터 모니터링하였다.
실험 디자인
12마리의 Balb/C 마우스군을 0일째 및 15일째에 양각(2x50㎍)에 하기 백신 용량을 사용하여 근육내로 면역화시켰다:
군 및 백신 용량
군 백신 부피 항원 용량
1 2 DENS001A4 →PO4/NaCl로 5X 희석 100㎕ 100㎕ 2㎍ 0.4㎍
3 4 DENS002A4 →PO4/NaCl로 5X 희석 100㎕ 100㎕ 2㎍ 0.4㎍
5 6 DENS003A4 →PO4/NaCl로 5X 희석 100㎕ 100㎕ 2㎍ 0.4㎍
7 8 ENG2953A4/Q →PO4/NaCl로 5X 희석 100㎕ 100㎕ 2㎍ 0.4㎍

15일째(2주 post I) 및 28일째(2주 post II)에 후안와동(retroorbital sinus)으로부터 채혈하였다. 본 실험의 디자인(군당 12마리 마우스에서 4개 제형 x 2개 용량)에 있어서, PASS 통계 프로그램을 사용하여 연역적으로 검정력을 예측하였다. PASS (Power and Sample Size) 통계 프로그램은 NCSS(329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037)로부터 구입하였다. 2원 분산 분석에 있어서, 5%의 알파 오차를 갖는 제형간의 GMT의 2.5배 차이가 검정력 > 90%와 함께 검출되어야 한다.
결과
혈청학:
체액성 반응(전체 Ig 및 이소타입)을 피복 항원으로서 HBsAg(Hep286) 및 비오틴 콘쥬게이션된 항-마우스 항체를 사용하는 ELISA 검정에 의해 측정하여 항-HBs 항체 결합을 밝혔다. post II 혈청만을 분석하였다.
표 9는 2주 post II에서 개체의 혈청에 대해 측정된 평균 및 GMT 항-HBs Ig 항체 반응을 나타낸다.
유사한 항체 반응이 DENS 및 전형적인 B형 간염 제형에 의해 유도되었다: GMT는, 2㎍ 용량에서 에스비 바이오로지칼스 B형 간염 1가 백신(엔제릭스 B™)에 대한 2882EU/ml와 비교하여, DENS 롯트에 대해서 2304 내지 3976EU/ml의 범위였고, 0.4㎍ 용량에서 에스비 바이오로지칼스 B형 간염 1가 백신(엔제릭스 B™)에 대한 627EU/ml와 비교하여, DENS 롯트에 대해서 696 내지 1182EU/ml의 범위였다.
·예측된 바와 같이, 2㎍ 및 0.4㎍ 용량에서 모든 제형에 대해 명백한 항원 용량 범위 효과가 관찰되었고 GMT는 3 내지 6배 차이가 있었다.
·4마리의 미반응 마우스(역가 < 50EU/ml)가 주사에 사용된 항원 용량 또는 롯트와 명백한 관련성 없이 관찰되었다(1, 2, 3 및 8군, 각 군당 1마리)
통계적 분석(Grubbs Test)을 기초로, 이들 마우스를 추가 분석으로부터 제외하였다.
28일째에서의 마우스의 항체 반응(2주 post II)
군 백신 용량 수 ELISA 역가(Ig)
평균 GMT
1 2 DENS001A4 2㎍ 0.4㎍ 11 11 3466 1283 2971 1182
3 4 DENS002A4 2㎍ 0.4㎍ 11 12 2436 984 2304 786
5 6 DENS003A4 2㎍ 0.4㎍ 12 12 4583 997 3976 696
7 ENG2953A4/Q 2㎍ 0.4㎍ 12 11 3999 737 2882 627
통계 분석:
인자(factor)로서 백신(4개 롯트) 및 항원 용량(2㎍ 및 0.4㎍)을 사용하여 post II 데이터의 로그 변환후에, 항-HBs 역가에 대하여 2원 분산 분석을 수행하였다. 이 분석 결과 2가지 항원 용량간에 통계적 유의차가 관찰되었음(p 값 < 0.001)이 입증되었고, 백신 롯트간에는 유의차가 인정되지 않았다(p 값 = 0.2674). 전술한 바와 같이, 검정력을 연역적으로 예측하였고, 실험 디자인은 제형간에 알파 오차가 5%인 GMT의 2.5배 차이가 검정력 > 90%와 함께 검출될 수 있도록 하였다.
이소타입 프로필:
표 10은 post II에서 풀링된 혈청에 대한 분석으로부터 계산된 이소타입 재분배(IgG1, IgG2a 및 IgG2b)를 나타낸다.
·예측된 바와 같이, 주로 IgG1 항체가 관찰되었기 때문에, 명백한 TH2 반응이 이들 명반을 기초로 한 백신에 의해 유도되었다.
DENS 롯트간에 또는 에스비 바이오로지칼스 B형 간염 1가 백신간에 이소타입 프로필 측면에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
28일째에 풀링된 혈청에서의 IgG 이소타입의 재분배
군 백신 용량 이소타입(%)
IgG1 IgG2a IgG2b
1 2 DENS001A4 2㎍ 0.4㎍ 91 87 4 8 5 5
3 4 DENS002A4 2㎍ 0.4㎍ 97 87 2 6 1 7
5 6 DENS003A4 2㎍ 0.4㎍ 98 93 1 4 1 3
7 8 ENG2953A4/Q 2㎍ 0.4㎍ 88 88 8 9 4 3
실시예 3 혼합 백신의 제형화
본 발명의 벌크 항원은 IPV를 포함하는 혼합 백신에서 제형화하기에 특히 적합하다.
DTPa-HBV-IPV 혼합 백신의 초기 롯트에 대해 수행된 안정성 시험은, 시험관내 면역검정(ELISA에 의한 D-항원 함량의 측정) 및 생체내 랫트 역가 검정을 사용할 경우, IPV 성분, 특히 타입 1 소아마비 항원의 역가가 감소하는 것을 입증하였다. 타입 3에 대해서는 역가 손실이 관찰되지 않았다. 타입 2의 경우, 예측되는 범위내에서 역가 손실이 있었다(저장 년수당 10% 이하 손실).
DTPa-HBV-IPV 복합 백신에서 이러한 역가 손실의 원인을 결정하기 위한 시험이 개시되었다. 에스비 바이오로지칼스의 DTPa-IPV 백신에서 IPV의 안정성이 만족스럽다(저장 년수당 10% 이하의 항원 함량 손실)는 결과로부터, HBV 성분이 DTPa-HBV-IPV 백신에서 IPV의 불안정성을 초래하는 것 같다는 결론이 내려졌다.
초기 DTPa-HBV-IPV 제형에 사용된 HBV 성분은 에스비 바이오로지칼스 B형 간염 1가 백신의 제조에 사용되고 실시예 1에서 기술된 바에 따라 제조되는 정제된 r-DNA, 효모 유래의 HBsAg이다.
HBV 성분의 어떠한 요소가 IPV에 유해한가를 결정하기 위한 최초의 시도로서, HBsAg 벌크를 티오메르살의 존재에 대하여 분석하였다. DTP 백신에서 보존제로서 사용되는 티오메르살이 DTP-IPV 배합물에서 "소아마비 바이러스에 유해하다"는 것은 종래에 알려져 있었다[Davisson et al., 1956, J. Lab. Clin. Med 47: 8-19]. 이러한 관찰은, IPV 함유 백신을 제형화하기 위해 티오메르살 대신 다른 보존제를 사용한 백신 제조업자에 의해 고려되었다. 보다 최근에는, +4℃의 장기 저장 조건하에서 IPV 역가에 대한 티오메르살의 효과가 재조사되었다. 타입 1 소아마비 바이러스 항원의 역가가 4 내지 6개월 후에 검출되지 않는 수준으로 손실되는 것으로 보고되었다[Sawyer, L. A. et al. 1994, Vaccine 12 : 851-856)].
원자 흡수 분광법을 사용하여, HBsAg 20㎍당 수은(Hg) 약 0.5㎍이 실시예 1에 따라 정제된 항원에서 검출되었다.
이러한 수은의 양(티오메르살과 티오메르살의 분해 생성물인 염화에틸수은으로서의 양)은 37℃에서 7일 동안 인큐베이션된 IPV 벌크 농축물에서 D-항원 타입 1 함량에 대한 ELISA 반응을 검출되지 않는 수준으로 감소시킬 수 있다.
HBsAg 벌크에 존재하는 수은을 유리시키는 방법은 확립되어 있다. 수은은 HBsAg 입자상의 티올기와 결합할 수 있으므로, 환원제의 존재하에서 유리될 수 있다는 가정을 세웠다. 다른 환원제로 실험한 후에, HBsAg 입자로부터 수은의 유리를 위한 제제로서 L-시스테인이 선택되었다. 5.7mM L-시스테인을 함유하는 식염수에 대하여 HBsAg 벌크를 투석한 후에, 잔류물중에 수은은 검출되지 않았다(시험 방법의 검출 한계: 25ng Hg/20㎍ HBsAg). 투석된 항원을 IPV 벌크 농축물과 혼합하고 37℃에서 7일 동안 인큐베이션한 후에 D-항원 함량을 측정함으로써 타입 1 바이러스의 안정성을 평가하였다. 비혼합형 IPV 벌크 농축물 및 시스테인으로 처리되지 않은 HBsAg와 혼합된 IPV 벌크 농축물을 대조로서 사용하였다. 참조 ELISA 역가를 +2℃내지 +8℃에서 7일 동안 저장한 샘플에 대하여 구하였다. 결과를 표 11에 요약하였다:
샘플 D-항원 함량(타입 1)(1) 손실
7일/4℃ 7일/37℃
IPV(비혼합형) 31.6 24.2 23%
IPV+HBsAg-비처리 31.1 18.1 42%
IPV+HBsAg-시스테인 처리 31.4 27.6 12%
IPV+티오메르살(1㎍/ml) 30.5 11.0 74%
(1) D-항원 유닛(DU)으로 표시
이들 실험 제제에 대해 얻은 데이터는 HBsAg를 IPV와 혼합하기 전에 시스테인으로 처리하여 잔류 수은을 제거하면 타입 1 폴리오 바이러스의 안정성이 현저히 개선됨을 명백히 입증한다.
또한 상기에서 제시된 데이터는 37℃에서 7일 동안 인큐베이션한 후에 참조 IPV 제제에 대해 23%의 D-항원 함량의 손실을 나타낸다. 이것은 종래에 보고된 바와 같이[Sawyer, L.A. et al. (1994), Vaccine 12: 851-856], 타입 1 마호니(Mahoney) 폴리오 바이러스의 고유한 불안정성을 확인해 주고 있다.
DTPa-HBV-IPV 및 DTPa-HBV-IPV/Hib 백신의 상업적 롯트가 잔류 수은을 제거하고 IPV의 안정성을 보존하기 위하여 5.7mM L-시스테인을 사용한 투석 공정을 사용하여 제조되었으나, 투석 공정은 대규모 제조에는 적합하지 아니하며, 티오메르살 또는 수은 비함유 HBsAg를 제조하기 위해 일련의 추가 단계를 필요로 한다. 대조적으로, 티오메르살 없이 제조된 본 발명의 HBsAg는 복합 백신, 특히 IPV를 함유한 백신의 제형에 직접 사용될 수 있다.
4. 요약
효모 유래의 표면 항원 정제에 사용된 종래의 방법은 생물적재물을 억제하기 위해 수은 함유 항균 화합물인 티오메르살이 용리 완충액에 포함되는 겔 투과 단계를 포함한다. 티오메르살은 상기 방법의 후속 단계 동안 완전히 제거되지 않아 단백질 20㎍당 티오메르살 약 1.2㎍이 정제된 벌크 항원에 존재하게 된다.
티오메르살(수은)이 완전히 제거된 벌크 항원을 제조하기 위해서, 정제 공정은 2가지 단계에서 변경되었다.
·티오메르살을 4B 겔 투과 단게에서 용리 완충액으로부터 제외한다.
·시스테인(2mM 최종 농도)을 음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 얻은 용리액 풀에 첨가한다. 이것은 CsCl 밀도 구배 원심분리 동안 항원의 침전을 방지한다.
제조 방법에 다른 변화는 없었다.
변형된 방법에 의해 제조된 벌크 항원을 특성화하였다. 물리화학적 시험 및 검정 결과 티오메르살 비함유 항원은 종래에 사용된 방법에 의해 제조된 항원과 성질에 차이가 없는 것으로 나타났다. 항원 입자는 동일한 성분을 갖는다. HBsAg 폴리펩티드의 동일성 및 완전성은 SDS-PAGE 분석, 폴리클로날 항-HBsAg 항체를 사용한 웨스턴 블롯, N-말단 서열 분석 및 아미노산 조성에 의해 판단할 때 변형된 방법에 의해 영향을 받지 않았다. 전자현미경 및 레이저 광산란 분석 결과 입자는 효모 유래의 HBsAg에 대해 예측된 전형적인 형태 및 크기인 것으로 나타났다. 항-효모 단백질 혈청을 사용한 웨스턴 블롯에 의한 분석 결과 티오메르살 비함유 공정에 의해 제조된 항원은 유사한 패턴의 오염 효모 단백질을 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 23K에서 이동하는 오염 밴드의 양은 변형된 방법을 사용하여 제조된 3개의 HBsAg 롯트에서 크게 감소되었다.
면역학적 분석 결과 티오메르살 비함유 입자는 증가된 항원성을 갖는 것으로 나타났다. 입자는 애보트 AUSZYME 키트(모노클로날 항체의 혼합물을 함유)와 보다 반응성이며 1.6 내지 2.25인 ELISA/단백질 비를 나타낸다. 이러한 증가된 항원성은 또한 보호 RF1 모노클로날 항체에 있어서 나타난다. 표준 고정 항원과 RF1의 결합을 억제하기 위하여 약 4 내지 7배 적은 량의 티오메르살 비함유 항원이 요구된다. 티오메르살 비함유 항원 및 통상적인 항원의 결합 억제 곡선은 2가지 상이한 종류가 된다. 이러한 차이는 또한 표면 플라스몬 공명을 사용한 RF1에 대한 결합 친화도 상수의 측정에 의해 증명된다. 티오메르살 비함유 제제의 결합 친화도는 통상적인 벌크 항원의 롯트에 비해 3 내지 4배 더 높다.
벌크 항원 제제는 보존제 없이 수산화알루미늄상의 흡착에 의해 백신으로서 제형화되었다. 애보트 AUSZYME ELISA 키트 및 표준물질로서 티오메르살 함유 에스비 바이오로지칼스 B형 간염 1가 백신을 사용하여 시험관내 역가에 대해 시험한 결과 높은 시험관내 역가를 달성한 것으로 나타났다. 이 시험에 의해 측정한 항원 함량은 ml당 20㎍의 단백질 표시값의 거의 2배였다.
티오메르살 비함유 항원으로 제조한 백신의 증가된 반응성은 또한 고정 항원과의 결합을 위한 RF1 모노클로날 항체를 사용한 억제 검정에서도 증명되었다. 종래의 방법에 의해 정제되고 보존제 없이 제형화된 항원에 비해 고정 항원과 RF1의 결합을 50% 억제하기 위해 티오메르살 비함유 백신의 약 절반량이 요구되었다. RF1에 관하여 티오메르살 비함유 백신의 증가된 항원성은, 벌크 항원 제제에 대해 수행한 시험관내 역가 시험(항원 함량) 및 RF1 항체 시험의 결과와 일치한다. 마우스 면역원성 시험을, 2주 간격의 초회(priming) 및 부스터 백신접종 및 2 및 0.4㎍의 항원 용량을 사용하여 수행하였다. 마우스를 부스터 접종후 28일, 및 14일째에 채혈하였다. 혈청을 항체 역가 및 이소타입 조성에 대해 분석하였다. 2가지 투여 용량에 대해 명백한 항원 용량 효과가 관찰되었으나, 티오메르살 비함유 백신 및 보존제 비함유 백신 사이에 항체 역가(GMT)의 측면에서 반응에 통계학적 유의차는 없었다. 이소타입 프로필에서 실질적인 차이는 관찰되지 않았다.

Claims (27)

  1. 단백질 20㎍당 수은 0.025㎍ 미만을 포함하는 정제된 B형 간염 표면 항원과 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 B형 간염 백신을 제조하는 방법으로서, 항원이 유리 SH기를 갖는 환원제의 존재하에서 정제되는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 백신이 보존제를 함유하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 보존제가 티오메르살임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 간염 항원을 수산화알루미늄상에 흡착시킴을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 미정제 B형 간염 항원 제제를
    (a) 겔 투과 크로마토그래피로 처리하고;
    (b) 이온 교환 크로마토그래피로 처리하고;
    (c) 유리 SH기를 갖는 환원제와 혼합시킴을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 시스테인, 글루타티온, 디티오트레이톨, 또는 β-머캅토에탄올임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 환원제가 시스테인임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 시스테인을 1 내지 10mM의 최종 농도로 첨가함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 시스테인을 약 2mM의 최종 농도로 첨가함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 항원을 환원제로 처리하기 전에 티오메르살의 존재하에서 정제함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 정제된 항원이 티오메르살을 전혀 함유하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 백신이 티오메르살 비함유 백신임을 특징으로 하는 방법.
  13. 삭제
  14. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 백신이 애쥬번트를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 애쥬번트가 알루미늄염임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 알루미늄염이 수산화알루미늄임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14항에 있어서, TH1 유도 애쥬번트를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, TH1 유도 애쥬번트가 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (3-DMPL), 퀼라자 사포나리아 몰리나 분획 21 (QS21), 3-DMPL과 QS21, 및 메틸화되지 않은 시토신-포스페이트-구아닌 (CpG) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 14항에 있어서, 백신이 디프테리아 톡소이드(D), 파상풍 톡소이드(T), 무세포 백일해 항원(Pa), 불활성화 폴리오 바이러스(IPV), 헤모필루스 인플루엔자 항원(Hib), A형 간염 항원, 단순 포진 바이러스(HSV), 클라미디아, 인간 유두종바이러스(HPV), 폐렴 연쇄구균 및 나이세리아 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  20. 삭제
  21. 유리 SH기를 갖는 환원제의 존재하에서 항원을 정제하는 것을 포함하여, 백신에 사용하기에 적합한 B형 간염 표면 항원을 제조하는 방법으로서, 항원을 환원제로 처리하기 전에 티오메르살의 존재하에서 정제하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 정제된 항원 생성물이 단백질 20㎍당 수은 0.025㎍ 미만을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 미정제 B형 간염 항원 제제를
    (a) 겔 투과 크로마토그래피로 처리하고;
    (b) 이온 교환 크로마토그래피로 처리하고;
    (c) 유리 SH기를 갖는 환원제와 혼합시킴을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 환원제가 시스테인, 글루타티온, 디티오트레이톨, 또는 β-머캅토에탄올임을 특징으로 하는 방법.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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