JP2012255015A - ワクチンに使用するためのhbv抗原の精製 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】痕跡量のチオメルサールも含まない安定な免疫原性B型肝炎ワクチンの製造方法であって、(a)サッカロミセス・セレビシエ中で組換えタンパク質としてB型肝炎表面抗原を発現させる;(b)該サッカロミセス・セレビシエ細胞を処理して粗製の抗原調製物を産生する;(c)該粗製の抗原調製物をゲル浸透クロマトグラフィーに供することによって抗原含有溶離液を産生する。ここで使用する溶離バッファーはチオメルサールを含有しない;(d)ステップ(c)後に得られた該抗原含有溶離液をアニオン交換クロマトグラフィーに供する。;(e)ステップ(d)後に得られた該抗原含有溶離液にシステインを添加する;(f)ステップ(e)からの調製物をCsCl密度勾配遠心分離に供することによって、精製されたB型肝炎表面抗原を得る、前記方法。
【選択図】なし
Description
チオメルサールの存在下でのB型肝炎表面抗原の調製方法
SB Biologicals社のB型肝炎1価ワクチン(Engerix B(商標))のB型肝炎表面抗原(HBsAg)をSaccharomyces cerevisiae中で組換えタンパク質として発現させる(Harfordら、上記引用文献参照)。24 kDタンパク質を細胞内で産生させ、組換え酵母細胞中に蓄積させる。発酵の終わりに酵母細胞を回収し、Tween 20などの温和な界面活性剤の存在下で破壊して、所望のタンパク質を遊離させる。次に、可溶性の表面抗原粒子を含有している細胞ホモジネートを一連の沈殿で予備精製し、その後限外濾過によって濃縮する。
この調製方法の詳細は欧州特許第0199698号にさらに記載されている。
チオメルサールフリーの方法による酵母由来のHBsAgの調製および特性決定
1.酵母由来のHBsAgの調製および精製
1.1 調製方法の概要
B型肝炎表面抗原は、例えばHarfordら(上記引用文献)に記載されるような、適切なSaccharomyces cerevisiae株の発酵によって生産することができる。
チオメルサールフリーの方法では、実施例1に記載した方法に対して以下の2つの変更を導入した。
1. 4Bゲル浸透クロマトグラフィー工程の溶離バッファーがここではチオメルサールを含まない。
2. アニオン交換クロマトグラフィー工程からの溶離液プールにシステイン(最終濃度 2 mM)を添加する。
実施例1に記載した方法に対して、その他に調製方法の変更はない。
4Bバッファーに50μg/mlで添加されたチオメルサールは分解すると考えられ、生成するエチル水銀がタンパク質のシステイン残基上の遊離スルフヒドリル基に共有結合することがある。このタンパク質は14個のシステイン残基を含有し、そのうち7個が101位と150位の間に位置している。
バルク抗原を精製するためのプロセス工程を図1に示す。
チオメルサールフリーの方法によって調製した抗原から製剤化された、保存剤を含まないB型肝炎ワクチンの典型的な量的組成を表1に示す。
2.1 精製したバルク抗原の試験およびアッセイ
2.1.1 比較の基準
この実施例(実施例1.2)に従うチオメルサールフリーの方法によって3ロットのバルク抗原を調製した。これをHEF001、HEF002およびHEF003と命名する。これらを、チオメルサールの存在下で従来の方法(実施例1に記載)によって調製した1ロットのバルク抗原(HEP2055)と比較した。
チオメルサールフリーの方法によって調製した3ロットのバルク抗原を試験した。その結果を表2に要約する。
タンパク質含量はLowryらの方法(J. Biol. Chem. 1951:193:265)によって測定した。
エンドトキシン含量は、Cape Cod Associates(704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA)から市販されているキットを使用し、リムルス(Limulus)ゲル凝固法によって測定した。試薬は米国薬局方エンドトキシン標準品(US Pharm. Endotoxin Reference Standard)に対して標準化する。
HBsAg含量は、Abbot Laboratories(One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, USA)から市販されているAusZYMEキットによって測定した。製造元のアッセイ手順Bを採用した。用量応答曲線を確立するための標準として、チオメルサールを使用する方法で精製したバルク抗原のバッチを使用した。
脂質はE.Merck(B.P.4119, Darmstad D-6100, Germany)の市販キット(Merkotest Total Lipids 3321)を使用して測定した。
DNA含量は、Molecular Devices Corp.(Gutenbergstrasse 10, Ismaning, Munich, Germany)から入手し得る装置および試薬を使用してThreshold法によって測定した。
還元条件でのSDS-PAGE分析およびクーマシーブルー(Coomassie blue)染色によってバルク抗原調製物をアッセイした。全サンプルが24 Kに主要バンドを示し、痕跡量の二量体タンパク質が存在した。混在タンパク質の目視できるバンドの消失によって評価して、サンプルは高純度(純度>99%)であると判定した。
2.1.4.1 DNA含量
Threshold法(Molecular Devices Corp)によって、3つのバルク抗原ロットのDNA含量を測定した。測定した量はタンパク質20μgにつきDNA 10 pg未満であり、現在承認されている方法によって調製されたバルク抗原で見られるDNA含量と同レベルであった。
3つのHEFバルク抗原ロットのアミノ酸組成は、6N HClでの酸加水分解後、イオン交換カラムによるアミノ酸のクロマトグラフィーおよびカラム後のニンヒドリン検出によって測定した。プロリンとトリプトファンは測定しなかった。結果を表3に示す。
記載した方法に従って取得したバルク抗原調製物中に存在する遊離システインの量を、事前の酸加水分解をせずに過ギ酸による粒子の酸化後に測定した。酸化した遊離システイン残基をイオン交換カラムで分離し、カラム後にニンヒドリンによって検出した。この方法によるシステインの検出限界は1μg/mlである。
この技法では、バッファー中に存在する遊離システイン残基と、ジスルフィド結合によってHBsAgタンパク質に結合しているがポリペプチド配列の一部を構成するものではないシステイン残基の両方が測定される。
改変方法によって調製された3つのバルク抗原ロット中の混在タンパク質および分解産物の存在を、エドマン分解を基礎とするN-末端配列分析によって評価した。HBsAgタンパク質のN-末端配列 MENITS...は、他の配列に干渉されることなく検出された。通常の方法によって調製されたHBsAgポリペプチドについて以前に観察されたように、N-末端メチオニンがアセチル化によって60〜75%ブロックされることも確認された。
改変方法を使用して調製したHBsAg粒子とHEP2055参照ロットとの間で、レーザー光散乱によって粒子サイズの比較を実施した(表4)。
測定された平均分子量は両調製物間で良好な一致を示す。
バルク抗原調製物を、固定および酢酸ウラニルによる染色後、電子顕微鏡検査で試験した。
観察された粒子は全サンプルにおいて類似しており、HBsAgに典型的な±20 nmの不完全球形または玉石様粒子であった。3つのHEFロットにおいて観察された粒子はHEP2055のものと区別できなかった。
2.1.5.1 RF1モノクローナル抗体との反応性
ELISA阻害アッセイによって、3つのバルク抗原調製物をそれらのRF1モノクローナル抗体との反応性について試験した。RF1モノクローナル抗体は、HBVチャレンジからチンパンジーを防御することがわかっており、このことからHBsAg粒子上の防御性立体配座エピトープを認識すると考えられる(Iwarson Sら、1985, J. Med, Virol., 16:89-96)。
飽和バッファー(1% BSA、0.1% Tween 20を含有するPBS)で1/50000に希釈した腹水を、試験するHBsAgサンプルのPBS中の各種希釈物(100μg〜0.05μg/mlの範囲の最終濃度)と1:1に混合した。
3つのHEF抗原ロットおよびHEP2055へのRF1モノクローナル抗体結合の速度論的パラメーターは、Amersham Pharmacia Biotech (Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, UK) 製のBiacore 2000装置を使用して、表面プラズモン共鳴により測定した。測定した速度論的パラメーターは以下のものである:
ka:会合速度定数(M-1S-1)
kd:解離速度定数(S-1)
Ka:平衡もしくは親和定数(M-1)
ここで、Ka=ka/kd
得られた数値を表6に示す。
3つのHEF抗原ロットを水酸化アルミニウムに吸着させ、表1に示した組成に従ってワクチンとして製剤化した。この表示はバイアル中の成人用量である(1ml中に抗原タンパク質 20μg)。これらのロットをDENS001A4、DENS002A4およびDENS003A4として識別する。
吸着させたワクチンの抗原性を、RF1モノクローナル抗体による阻害アッセイにおいてさらに試験した。このアッセイでは、固定したバルク抗原(HEP286)へのRF1結合を阻害するワクチンサンプルの能力を測定する。
飽和バッファー(1% BSA、0.1% Tween 20を含有するPBS)で1/50000に希釈した腹水を、試験するワクチンサンプルのPBS中の各種希釈物(20μg〜0.05μg/mlの範囲の最終濃度)と1:1に混合した。
とされるDENSワクチンの量は、保存剤を含まないEngerix B(商標)ワクチンに比較して、約半量であることがわかる。これはHEF/DENS抗原上のRF1エピトープ提示の増加を反映しており、精製バルク抗原についてRF1抗体を用いて実施した試験と一致している。
Balb/Cマウスにおいて、3つのDENSコンシステンシーロットの免疫原性を、現在の抗原調製法に従って調製しチオメルサールを用いて製剤化したEngerix B(商標)の免疫原性と比較するための研究を実施した。
#DENS001A4
#DENS002A4
#DENS003A4
#ENG2953A4/Q(参照)
簡単に述べると、12匹/群のマウスを免疫するために、成人用量の1/10(2μg)または1/50(0.4μg)に相当するワクチン用量を2週間おきに2回筋内注射した。28日目に採取した血清から、HBsAgに対する抗体応答およびワクチン接種によって誘発されたアイソタイププロファイルをモニターした。
以下のワクチン用量を0日目および15日目に12匹/群のマウスの両足に筋内注射(2x50μl)した。
この実験の計画(12匹/群のマウスを用いて4製剤×2用量)のために、PASS統計プログラムによって演繹的に効力を概算した。PASS(Power and Sample Size)統計プログラムはNCSS (329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037)から入手した。二元分散分析については、α誤差5%を有する製剤間の2.5倍のGMTの差はpower>90%で検出すべきである。
血清学:
抗HBs抗体の結合を明らかにするため、コーティング抗原としてのHBsAg(Hep286)およびビオチン結合抗マウス抗体を使用するELISAアッセイによって、体液性応答(総Igおよびアイソタイプ)を測定した。2回目後の血清のみを分析した。
表9は、2回目の2週間後の各血清について測定した、平均およびGMT抗HBs Ig抗体応答を示す。
匹敵する抗体応答がDENSおよび従来のB型肝炎製剤によって誘発される。すなわち、2μg用量では、SB Biologicals社のB型肝炎1価ワクチン(Engerix BTM)が2882 EU/mlであるのに対して、DENSロットは2304〜3976 EU/mlの範囲のGMTであり、0.4μg用量では、SB Biologicals社のB型肝炎1価ワクチン(Engerix BTM)が627 EU/mlであるのに対して、DENSロットは696〜1182 EU/mlの範囲のGMTである。
・注射に使用した抗原用量またはロットとは明確な関連なしに、4匹の非応答マウス(力価<50 EU/ml)が観察された(1、2、3および8群;各群に1匹)。統計的分析(Grubbs検定)に基づいて、これらのマウスを以後の分析から除外した。
ワクチン(4ロット)および抗原の用量(2μgおよび0.4μg)を要因として使用して、2回目後のデータのlog変換後の抗HBs力価について二元分散分析を実施した。この分析により、2つの抗原用量間で統計的有意差が認められた(p値<0.001)が、ワクチンロット間では有意差が認められなかった(p値=0.2674)。先に記載したように、効力は演繹的に概算され、実験の設計は、α誤差5%を有する2.5倍のGMTの差がpower>90%で製剤間に検出されるようにした。
表10は、2回目後にプールした血清の分析から算出したアイソタイプ再分割(IgG1、IgG2aおよびIgG2b)を示す。
複合ワクチン製剤
本発明のバルク抗原はIPVを含む複合ワクチン製剤に特に好適である。
酵母由来の表面抗原を精製するためにこれまで使用されてきた方法は、ゲル浸透工程を含むが、この工程ではバイオバーデンを防ぐために水銀含有抗微生物化合物のチオメルサールが溶離バッファー中に添加される。このチオメルサールは精製法の後続の工程で完全には除去されず、タンパク質20μgにつき約1.2μgのチオメルサールが精製バルク抗原中に存在する。完全にチオメルサール(水銀)フリーのバルク抗原を調製するため、この精製法は2工程が変更された:
・4Bゲル浸透工程の溶離バッファーからチオメルサールを排除する。
・アニオン交換クロマトグラフィー工程からの溶離液プールにシステイン(最終濃度 2 mM)を添加する。これはCsCl密度勾配遠心分離中の抗原の沈殿を防止する。
調製方法にその他の変更はない。
Claims (10)
- 痕跡量のチオメルサールも含まない安定な免疫原性B型肝炎ワクチンの製造方法であって、
(a)サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)中で組換えタンパク質としてB型肝炎表面抗原を発現させること、
(b)該サッカロミセス・セレビシエ細胞を処理して粗製の抗原調製物を産生すること、
(c)該粗製の抗原調製物をゲル浸透クロマトグラフィーに供することによって抗原含有溶離液を産生すること、ここで該ゲル浸透クロマトグラフィーに使用する溶離バッファーはチオメルサールを含有しない、
(d)ステップ(c)後に得られた該抗原含有溶離液をアニオン交換クロマトグラフィーに供すること、
(e)ステップ(d)後に得られた該抗原含有溶離液にシステインを添加すること、
(f)ステップ(e)からの調製物をCsCl密度勾配遠心分離に供することによって、精製されたB型肝炎表面抗原を得ること、及び、
(g)該精製されたB型肝炎表面抗原を製薬上許容される添加剤と組み合わせて、安定な免疫原性B型肝炎ワクチンを製造すること、
を含み、
該B型肝炎表面抗原はステップ(a)〜(g)の間、可溶性形態で維持され、且つ該ワクチンはチオメルサール保存剤を含まない、前記方法。 - システインを1〜10mMの最終濃度で添加する、請求項1に記載の方法。
- システインを2mMの最終濃度で添加する、請求項2に記載の方法。
- 前記ワクチンがアジュバントを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- アジュバントがアルミニウム塩である、請求項4に記載の方法。
- アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである、請求項5に記載の方法。
- 前記肝炎抗原が水酸化アルミニウムに吸着されている、請求項6に記載の方法。
- アジュバントがTH-1誘発性アジュバントである、請求項4に記載の方法。
- TH-1誘発性アジュバントが3-DMPL、QS21、3-DMPL及びQS21、並びにCpGオリゴヌクレオチドを含む群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記ワクチンが、ジフテリアトキソイド(D)、破傷風トキソイド(T)、無細胞百日咳抗原(Pa)、不活化ポリオウイルス(IPV)、インフルエンザ菌(haemophilus influenzae)抗原(Hib)、A型肝炎抗原、単純ヘルペスウイルス(HSV)、クラミジア、GSB、HPV、肺炎連鎖球菌(streptococcus pneumoniae)及びナイセリア抗原から成る群から選択される抗原1種以上をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
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