PL204736B1 - Sposób wytwarzania stabilnej immunogennej szczepionki, bez śladów tiomersalu, przeciw zapaleniu wątroby typu B - Google Patents
Sposób wytwarzania stabilnej immunogennej szczepionki, bez śladów tiomersalu, przeciw zapaleniu wątroby typu BInfo
- Publication number
- PL204736B1 PL204736B1 PL362322A PL36232201A PL204736B1 PL 204736 B1 PL204736 B1 PL 204736B1 PL 362322 A PL362322 A PL 362322A PL 36232201 A PL36232201 A PL 36232201A PL 204736 B1 PL204736 B1 PL 204736B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- antigen
- thiomersal
- lane
- vaccine
- hef
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 185
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 183
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 183
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 75
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 104
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 20
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 71
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 claims description 71
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 42
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 34
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 10
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 8
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical group [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 4
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 230000000656 anti-yeast Effects 0.000 claims description 3
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 claims description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical group O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 12
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 26
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 25
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 24
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 21
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 11
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 5
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 5
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 5
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 5
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100037831 DNL-type zinc finger protein Human genes 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 4
- 150000007949 saponins Chemical group 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- PMTMAFAPLCGXGK-JMTMCXQRSA-N (15Z)-12-oxophyto-10,15-dienoic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@H]1[C@@H](CCCCCCCC(O)=O)C=CC1=O PMTMAFAPLCGXGK-JMTMCXQRSA-N 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 108010084884 GDP-mannose transporter Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- PMTMAFAPLCGXGK-UHFFFAOYSA-N OPDA Natural products CCC=CCC1C(CCCCCCCC(O)=O)C=CC1=O PMTMAFAPLCGXGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100028078 Oryza sativa subsp. japonica OPR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-fluorophenyl)methyl]piperazine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1CN1CCNCC1 OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)sulfonylaniline Chemical compound NC1=CC=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(N)C=CC=2)=C1 LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272478 Aquila Species 0.000 description 1
- 241000408930 Astictopterus jama Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 229940032024 DPT vaccine Drugs 0.000 description 1
- -1 DTT Natural products 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101710112523 GDP-mannose transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000940612 Medina Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001586 anionic polysaccharide Chemical class 0.000 description 1
- 150000004836 anionic polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016350 chronic hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052593 corundum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O KDQPSPMLNJTZAL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- QWUGXIXRFGEYBD-UHFFFAOYSA-M ethylmercuric chloride Chemical compound CC[Hg]Cl QWUGXIXRFGEYBD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PJDVOLYULHZZAG-UHFFFAOYSA-N ethylmercury Chemical compound CC[Hg] PJDVOLYULHZZAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004443 hemophilus influenzae b vaccines Drugs 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011551 log transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 239000013636 protein dimer Substances 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 229910001845 yogo sapphire Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
- A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania stabilnej immunogennej szczepionki, bez śladów tiomersalu, przeciw zapaleniu wątroby typu B, do stosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV).
Przewlekłe zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV), którego leczenie jest jak dotychczas ograniczone, stanowi ogólnoświatowy problem zdrowotny o ogromnym wymiarze. U przewlekłych nosicieli HBV, których liczbę na świecie szacuje się na ponad 300 milionów, występuje wysokie ryzyko rozwoju przewlekłego aktywnego zapalenia wątroby, marskości wątroby i pierwotnego raka wątrobowokomórkowego.
Wiele szczepionek obecnie dostępnych wymaga dodania środków konserwujących zapobiegających degradacji. Często stosowanym środkiem konserwującym jest tiomersal, który jest związkiem zawierającym rtęć. Niejednokrotnie poruszano problemy stosowania rtęci w szczepionkach, jednakże eksperci stwierdzili, że potencjalne niebezpieczeństwo stosowania szczepionek zawierających tiomersal nie powinno być wyolbrzymiane (Offit; P.A. JAMA, tom 283; nr 16). Niemniej jednak, korzystne byłoby znalezienie nowych i potencjalnie bezpieczniejszych sposobów wytwarzania szczepionek, aby wyeliminować stosowanie tiomersalu w sposobie wytwarzania. Zatem istnieje potrzeba opracowania szczepionek nie zawierających tiomersalu, w szczególności szczepionek przeciw zapaleniu wątroby typu B.
Zatem wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania stabilnej immunogennej szczepionki, bez śladów tiomersalu, przeciw zapaleniu wątroby typu B, który charakteryzuje się tym, że (a) eksprymuje się antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) jako białko rekombinowane w szczepie Saccharomyces cerevisiae;
(b) przetwarza się komórki drożdży, z wytworzeniem surowego preparatu antygenu;
(c) surowy preparat antygenu poddaje się chromatografii żelowej, przy czym bufor do wymywania w etapie chromatografii żelowej nie zawiera tiomersalu;
(d) zawierający antygen eluent z etapu (c) poddaje się chromatografii jonowymiennej;
(e) do zawierającego antygen zebranego eluentu z etapu (d) dodaje się cysteiny;
(f) poddaje się preparat z etapu (e) ultrawirowaniu z chlorkiem cezu;
(g) łączy się oczyszczony HBsAg z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, z wytworzeniem stabilnej immunogennej szczepionki przeciw zapaleniu wątroby typu B;
przy czym do powstałej szczepionki nie dodaje się tiomersalu.
Korzystnie w sposobie według wynalazku cysteinę dodaje się do stężenia końcowego 1-10 mM.
Korzystniej w sposobie według wynalazku cysteinę dodaje się do stężenia końcowego około 2 mM.
Korzystnie w sposobie według wynalazku chromatografią jonowymienną jest chromatografia anionowymienna.
Korzystnie w sposobie według wynalazku szczepionkę łączy się ponadto z adiuwantem.
Korzystnie w sposobie według wynalazku adiuwantem jest sól glinu.
Korzystniej w sposobie według wynalazku adiuwantem jest żel wodorotlenku glinu lub fosforan glinu.
Ponadto korzystnie w sposobie według wynalazku adiuwantem jest adiuwant indukujący Th1.
Korzystniej w sposobie według wynalazku adiuwant indukujący Th1 jest wybrany z grupy obejmującej 3D-MPL; QS21; 3D-MPL i QS21; oraz oligonukleotyd CpG.
Szczególnie korzystnie w sposobie według wynalazku adiuwantem jest 3D-MPL i sól glinu.
Sposób wytwarzania antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B odpowiedniego do stosowania w szczepionce, polega na oczyszczaniu antygenu w obecności środka redukującego zawierającego wolną grupę -SH.
Korzystnie sposób wytwarzania trwałego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B bez śladów tiomersalu, polega na oczyszczaniu antygenu w obecności środka redukującego zawierającego wolną grupę -SH.
Preparat antygenu ogólnie nie zawiera śladów tiomersalu, gdy tiomersal nie jest wykrywalny w oczyszczonym produkcie antygenowym metodą spektrofotometrii absorpcyjnej rtę ci, jak tutaj opisano.
Preparat antygenu zapalenia wątroby korzystnie zawiera mniej niż 0,025 μg rtęci na 20 μg białka, jak odpowiednio zmierzono metodą spektrofotometrii absorpcyjnej.
PL 204 736 B1
Korzystnie oczyszczanie prowadzi się bez stosowania tiomersalu, a oczyszczony antygen jest całkowicie wolny od tiomersalu.
Korzystnie antygen jest trwały, korzystnie zasadniczo tak trwały jak antygen zapalenia wątroby oczyszczony w obecności tiomersalu, jak tutaj wskazano w przykładzie 1.
Korzystnie antygen zapalenia wątroby jest immunogenny.
Korzystnie środek redukujący dodaje się w trakcie oczyszczania antygenu, korzystnie po hodowli komórek eksprymujących antygen.
Korzystnie środkiem redukującym jest cysteina, ditiotreitol, β-merkaptoetanol lub glutation, przy czym cysteina jest najkorzystniejsza.
Sposób wytwarzania trwałego immunogennego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B bez śladów tiomersalu, polega na oczyszczaniu antygenu w obecności cysteiny.
Korzystnie oczyszczanie prowadzi się w obecności roztworu cysteiny.
Korzystnie cysteinę, w postaci roztworu lub proszku, dodaje się w trakcie procesu do końcowego stężenia 1-10 mM, korzystnie 1-5 mM. Najkorzystniej cysteinę dodaje się do końcowego stężenia około 2 mM.
Korzystnie cysteiną jest L-cysteina.
Sposób wytwarzania trwałego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B bez śladów tiomersalu, polega na tym, że surowy antygen poddaje się chromatografii żelowej, poddaje się chromatografii jonowymiennej i miesza ze środkiem redukującym zawierającym wolną grupę -SH.
Korzystnie chromatografią jonowymienną jest chromatografia anionowymienna.
Antygen wirusa zapalenia wątroby typu B wolny od tiomersalu, jest otrzymywany powyższym sposobem wytwarzania, przy czym antygen ten jest co najmniej tak immunogenny i antygenowy jak antygen wirusa zapalenia wątroby typu B wytworzony w obecności tiomersalu.
Immunogenny antygen wirusa zapalenia wątroby typu B cechuje się średnim stosunkiem ELISA/białko wyższym niż 1,5 oraz zawartością RF1 o co najmniej trzykrotnie niższej wartości IC50 w porównaniu z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B wytworzonym w obecności tiomersalu.
Sposób wytwarzania antygenu zapalenia wątroby odpowiedniego do stosowania w szczepionce polega na oczyszczaniu antygenu w obecności tiomersalu, a następnie podziałaniu na antygen środkiem redukującym zawierającym wolną grupę -SH.
Korzystnie po tym podziałaniu prowadzi się etap oczyszczania, taki jak etap dializy, w celu usunięcia tiomersalu.
Korzystnie środkiem redukującym jest cysteina, DTT, glutation lub 2-merkaptoetanol.
Antygen wirusa zapalenia wątroby typu B można stosować w leczeniu lub profilaktyce zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B, a zwłaszcza w leczeniu lub profilaktyce np. przewlekłych zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B.
Preparat szczepionki zawiera antygen wirusa zapalenia wątroby typu B w połączeniu z adiuwantem. Korzystnie adiuwantem jest sól glinu lub preferencyjny stymulator odpowiedzi komórek TH1.
Korzystnie antygen jest antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B.
Preparat antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B został dobrze opisany. Patrz np. Harford i inni, w Develop. Biol. Standard 54, str. 125 (1983), Gregg i inni, w Biotechnology, 5, str. 479 (1987), EP-A-0226846, EP-A-0299108 oraz podane tam odnośniki literaturowe.
Stosowane tutaj wyrażenie „antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B lub „HBsAg obejmuje jakikolwiek antygen HBsAg lub jego fragment wykazujący antygenowość antygenu powierzchniowego HBV. Należy zdawać sobie sprawę, że oprócz sekwencji antygenu HBsAg S o długości 226 aminokwasów (patrz Tiollais i inni, Nature, 317, 489 (1985) oraz odnośniki podane tam literaturowe) HBsAg tutaj opisany, gdy jest to konieczne, zawiera całą sekwencję lub część sekwencji pre-S, jak opisano w powyższych odnośnikach literaturowych oraz w EP-A-0278940. HBsAg tutaj opisany może także odnosić się do wariantów, np. do „escape mutant opisanego w WO 91/14703.
HBsAg może także odnosić się do polipeptydów opisanych w EP 0198474 lub EP 0304578.
Normalnie HBsAg jest w postaci cząstek. W szczególnie korzystniej postaci HbsAg zawiera zasadniczo antygen HbsAg S wspomniany powyżej.
Szczepionka może korzystnie zawierać dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę, taką jak odpowiedni adiuwant. Odpowiednie adiuwanty są dostępne w handlu, takie jak, np. Niekompletny Adiuwant i Kompletny Adiuwant Freunda (Difco Laboratories, Detroit, MI); Adiuwant Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sole glinu, takie jak żel wodo4
PL 204 736 B1 rotlenku glinu (ałun) lub fosforan glinu; sole wapnia, żelaza lub cynku; nierozpuszczalna zawiesina acylowanej tyrozyny; acylowane cukry; kationowe lub anionowe pochodne polisacharydów; polifosfazeny; biorozkładalne mikrosfery; monofosforylolipid A oraz quil A. Cytokiny, takie jak GM-CSF lub interleukiny 2, 7 lub 12, można także stosować jako adiuwanty.
W preparatach wedł ug wynalazku korzystne jest aby kompozycja adiuwantowa indukowa ł a odpowiedź immunologiczną głównie typu TH1. Wysoki poziom cytokin typu Th1 (np. IFN-γ, TNFa, IL-2 i IL-12) prowadzi do faworyzowania pośredniczonej przez komórkę odpowiedzi immunologicznej na podany antygen. W korzystnej postaci, w której odpowiedź jest głównie typu Th1, poziom cytokin Th1 wzrasta w większym stopniu niż poziom cytokin typu Th2. Poziomy tych cytokin można łatwo oszacować za pomocą standardowych testów. Praca przeglądowa na temat rodzin cytokin, patrz Mosmann i Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.
Zgodnie z tym korzystne adiuwanty do stosowania w wywoływaniu głównie odpowiedzi typu Th1 obejmują, np. połączenie monofosforylolipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A (3D-MPL) z solą glinu. Inne znane adiuwanty, które preferencyjnie indukują odpowiedź immunologiczną typu TH1 obejmują oligonukleotydy zawierające CpG. Oligonukleotydy charakteryzują się tym, że dinukleotyd CpG nie jest zmetylowany. Takie oligonukleotydy są dobrze znane i opisane np. w WO 96/02555. Immunostymulacyjne sekwencje DNA także opisano np. w Sato i inni, Science 273:352, 1996. Innym korzystnym adiuwantem jest saponina, korzystnie QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), którą można stosować samą lub w połączeniu z innymi adiuwantami. Przykładowo rozszerzony układ obejmuje połączenie monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, takie jak połączenie QS21 i 3D-MPL jak opisano w WO 94/00153, lub mniej reaktogenną kompozycję, w której QS21 jest tłumione przez cholesterol, jak opisano w WO 96/33739. Inne korzystne preparaty zawierają emulsję olej w wodzie i tokoferol. Szczególnie silny preparat adiuwantowy zawierający QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej w wodzie opisano w WO 95/17210.
Szczególnie silny preparat adiuwantowy zawierający QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej w wodzie opisano w WO 95/17210 i jest to korzystny preparat.
Szczepionka zawierająca antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B dodatkowo może zawierać adiuwant indukujący TH1. Adiuwant indukujący TH1 jest wybrany z grupy adiuwantów obejmującej: 3D-MPL, QS21, mieszaninę QS21 i cholesterolu oraz oligonukleotyd CpG. Szczepionka może zawierać antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B adiuwantowany monofosforylolipidem A lub jego pochodną, QS21 i tokoferolem w emulsji olej w wodzie.
Korzystnie szczepionka dodatkowo zawiera saponinę, korzystniej QS21. Inny szczególnie korzystny preparat adiuwantowy zawierający CpG i saponinę opisano w WO 00/09159 i jest on korzystnym preparatem. Najkorzystniej saponiną w konkretnym preparacie jest QS21. Korzystnie preparat dodatkowo zawiera emulsję olej w wodzie i tokoferol.
Preparat szczepionki zawiera antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B w połączeniu z adiuwantem oraz może dodatkowo zawierać jeden lub większą liczbę antygenów wybranych z grupy obejmującej: toksoid błonicy (D), toksoid tężca (T), antygeny krztuśca acelularnego (Pa), inaktywowany wirus polio (IPV), antygen pałeczek grypy (Hib), antygen zapalenia wątroby typu A, antygeny wirusa opryszczki (HSV), chlamydii, GSB, HPV, paciorkowca zapalenia płuc oraz dwoinek (Neisseria). Antygeny wywołujące ochronę przeciw innym chorobom można także połączyć w preparacie szczepionki.
Preparat szczepionki może zawierać antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B uzyskiwany powyżej opisanym sposobem wytwarzania w połączeniu z adiuwantem i inaktywowanym wirusem polio.
Szczepionka zawiera immunoochronną ilość antygenu i może być wytwarzana znanymi sposobami.
Preparat szczepionki ogólnie opisano w Pharmaceutical Biotechnology, tom 61, Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, red. Powell i Newman, Plenum Press, 1995; New Trends and Developments in Vaccines, red. Voller i inni, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Kapsułkowanie w liposomach opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4235877 (Fullerton). Sprzęganie białek do makrocząstek ujawniono np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4372945 (Likhite) oraz w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4474757 (Armor i inni). Zastosowanie Quil A ujawniono w Dalsgaard i inni, Acta Vet. Scand. 18:349 (1977). 3D-MPL jest dostępny z Ribi immunochem, USA i ujawniony w brytyjPL 204 736 B1 skim zgłoszeniu patentowym nr 2220211 oraz w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4912094. QS21 ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5057540.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady, nie ograniczające jego zakresu, przy czym:
Fig. 1 przedstawia sposób wytwarzania Engerix B™ bez użycia tiomersalu;
Fig. 2 przedstawia analizę SDS-PAGE partii antygenu; a
Fig. 3 przedstawia pozostałe białka drożdżowe w partiach antygenu wytworzonych sposobem bez użycia tiomersalu.
P r z y k ł a d 1
Sposób wytwarzania antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B w obecności tiomersalu
Antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) z jednoważnej szczepionki przeciw zapaleniu wątroby typu B firmy SB Biologicals (Engerix B™) jest eksprymowany jako zrekombinowane białko w Saccharomyces cerevisiae (patrz Harford i inni, loc. cit.). Białko o masie 24 kD jest produkowane wewnątrzkomórkowo i gromadzi się w zrekombinowanych komórkach drożdży. Pod koniec fermentacji komórki drożdżowe zbiera się i rozbija w obecności łagodnego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak Tween 20, w celu uwolnienia żądanego białka. Następnie homogenat komórkowy, zawierający rozpuszczalne cząstki antygenu powierzchniowego, wstępnie oczyszcza się w serii wytrą ceń i zag ę szcza przez ultrafiltrację .
Dalsze oczyszczanie zrekombinowanego antygenu prowadzi się w kolejnych procesach rozdziału chromatograficznego. W pierwszym etapie surowy koncentrat antygenu poddaje się chromatografii żelowej na złożu Sepharose 4B. W etapie chromatografii żelowej na 4B w buforze wymywającym obecny jest tiomersal. Bufor wymywający ma następujący skład: 10 mM Tris, 5% glikol etylenowy, pH 7,0, 50 mg/l tiomersalu. Tiomersal wprowadza się w tym etapie dla kontrolowania biozanieczyszczeń. Większość tiomersalu jest usuwana podczas kolejnych etapów oczyszczania obejmujących chromatografię jonowymienną, ultrawirowanie i odsalanie (przesączenie przez żel), tak że większość oczyszczonych preparatów antygenu wytworzonych oryginalnym sposobem zawiera około 1,2 μg i mniej niż 2 μg tiomersalu na 20 μg białka.
Etap chromatografii jonowymiennej prowadzi się z użyciem złoża DEAE i połączone frakcje poddaje się ultrawirowaniu w gradiencie cezu na czterech wcześniej wytworzonych warstwach chlorku cezu w różnym stężeniu. Cząstki antygenu oddziela się od zanieczyszczających składników komórkowych pod względem ich gęstości w gradiencie i wymywa na końcu procesu wirowania. Następnie chlorek cezu usuwa się z tej frakcji przez drugie przesączenie przez żel Sepharose.
Gdy HBsAg wytwarza się sposobem z użyciem tiomersalu w buforze do sączenia przez żel 4B, odzyskuje się białko w stężeniu ponad 30 mg/ml w połączonych frakcjach zawierających HBsAg z gradientu CsCl, odpowiadających równoważnemu stężeniu HBsAg przy oznaczaniu za pomocą zestawu AUSZYME z Abbott Laboratories .
Etap ultrawirowania CsCl korzystnie eliminuje pozostałe lipidy, DNA i drobne zanieczyszczenia białkowe z preparatu HbsAg. Prowadzi się je przez wirowanie w trybie strefowym w rotorze Ti 15 z Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornia przy prędkości 30000 obrotów/minutę przez około 40 - 60 godzin. Oczyszczaną frakcję nanosi się na warstwy roztworu CsCl o końcowych stężeniach 0,75, 1,5, 2,5 i 3,25 M CsCl. Pod koniec wirowania gradient eluuje się w frakcjach. Frakcje zawierające HBsAg można zidentyfikować przez pomiar absorpcji UV przy 280 nm lub zbadania rozcieńczeń frakcji z użyciem zestawu AUSZYME. Prążek HBsAg występuje przy gęstości 1,17 - 1,23 g/cm3.
Roztwór zawierający oczyszczony HBsAg poddaje się wyjałowieniu przez filtrację przed użyciem do wytwarzania preparatu szczepionki.
Oczyszczanie z lizatu komórek drożdżowych jest złożone, gdyż antygen jest wytwarzany wewnątrzkomórkowo i dla uzyskania czystego antygenu koniecznych jest kilka metod rozdzielania zaprojektowanych dla usunięcia różnych typów (drożdżowych) zanieczyszczeń. Te etapy oczyszczania są istotne, gdyż oczyszczany produkt jest cząstką lipoproteinową zawierającą wiele kopii polipeptydu antygenu powierzchniowego i struktura ta musi być utrzymywana podczas procesu oczyszczania. Tym co wyróżnia ten proces jest fakt otrzymywania cząstek antygenu powierzchniowego, które są w pełni immunogenne bez potrzeby dalszej chemicznej obróbki dla wzmocnienia immunogenności (porównaj EP0135435).
Szczegóły procesu wytwarzania ponadto opisano w opisie patentu europejskiego 0199698.
P r z y k ł a d 2
Wytwarzanie i charakteryzacja HBsAg pochodzącego z drożdży sposobem bez udziału tiomersalu
PL 204 736 B1
1. Wytwarzanie i oczyszczanie HbsAg pochodzącego z drożdży
1.1 Zarys sposobu wytwarzania
Antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B można wytwarzać przez fermentację z użyciem odpowiedniego szczepu Saccharomyces cerevisiae, np. jak opisano w Harford i inni (loc. cit.).
Pod koniec fermentacji w dużej skali zrekombinowanego szczepu drożdży komórki zbiera się i rozbija w obecności łagodnego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak Tween 20. Następnie antygen powierzchniowy izoluje się w wieloetapowej procedurze ekstrakcji i oczyszczania, dokładnie tak jak opisano powyżej w przykładzie 1 do etapu pierwszego przesączenia przez żel Sepharose 4B.
1.2 Sposób oczyszczania bez udziału tiomersalu
W sposobie bez udział u tiomersalu wprowadzono nastę pują ce dwie zmiany w porównaniu ze sposobem opisanym w przykładzie 1.
1. Bufor do wymywania w etapie chromatografii żelowej przez 4B nie zawiera tiomersalu.
2. Do połączonych frakcji wymytych w etapie chromatografii jonowymiennej dodaje się cysteiny (końcowe stężenie 2 mM).
Stwierdzono, że pominięcie tiomersalu w buforze do przesączenia przez żel 4B może spowodować wytrącanie cząstek HBsAg podczas etapu wirowania w gradiencie gęstości CsCl z utratą produktu i agregacją lub zlepianiem się odzyskiwanego antygenu.
Dodanie cysteiny do końcowego stężenia 2 mM do połączonych frakcji wymytych w etapie chromatografii jonowymiennej przeciwdziała wytrącaniu lub utracie antygenu podczas wirowania w gradiencie gęstości CsCl.
Cysteina jest korzystną substancją w tym przypadku, gdyż jest ona naturalnie występującym aminokwasem i może być usunięta w kolejnym etapie odsalania w kolumnie do przesączenia przez żel przy użyciu kolumny ze złożem Sepharose 4BCLFF.
Brak jest innych zmian w sposobie wytwarzania w porównaniu ze sposobem opisanym w przykładzie 1.
Sposób bez udziału tiomersalu pozwala wytworzyć antygen o czystości i właściwościach porównywalnych z antygenem ze sposobu z przykładu 1.
1.2a
Uważa się, że tiomersal dodany do buforu 4B w stężeniu 50 μg/ml ulega rozkładowi i powstała etylortęć może się kowalencyjnie połączyć z wolnymi grupami sulfhydrylowymi przy resztach cysteiny białka. Białko zawiera 14 reszt cysteiny, z których 7 jest umiejscowionych pomiędzy pozycjami 101 a 150.
Uważa się, że ten region białka jest zlokalizowany na powierzchni cząstki i zawiera główny region antygenowy HbsAg, włącznie z immunodominującym regionem a i miejscem rozpoznania dla przeciwciała monoklonalnego RF1 (Waters J i inni, Postgrad. Med. J., 1987:63 (dodatek 2): 51-56 oraz Ashton-Rickardt i Murray J. Med. Virology, 1989:29:196). Antygen oczyszczony z użyciem buforu do przesączenia przez żel 4B zawierającego tiomersal zawiera około 0,5 - 0,6 μg rtęci pod koniec procesu oczyszczania. Ta rtęć nie jest w pełni usuwana przez prostą dializę.
W jednym doświadczeniu zmierzono 0,56 μg rtęci na 20 μg białka w preparacie antygenu. Preparat ten dializowano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej względem buforu 150 mM NaCl, 10 mM NaPO4, pH 6,9. Pod koniec dializy zmierzono stężenie 0,33 μg Hg na 20 μg białka.
W porównaniu z tym, dializa w obecności środka redukującego, takiego jak L-cysteina w stężeniu 0,1 - 5,0 mg/ml, 50 mM DTT lub 0,5 M 2-merkaptoetanolu, a następnie druga dializa dla usunięcia środka redukującego, powoduje zmniejszenie zawartości rtęci w preparacie antygenu do mniej niż 0,025 μg rtęci na 20 μg białka. Jest to najniższa granica wykrywalności w tej metodzie.
Zawartość rtęci zmierzono metodą spektrofotometrii absorpcyjnej. Antygen rozcieńczono w roztworze zawierającym 0,01% wag./obj. dichromianu potasu (K2Cr2O7) i 5% obj. kwasu azotowego. Roztwory wzorcowe przygotowano z użyciem tiomersalu jako źródła rtęci. Absorpcję atomową próbki i roztworów wzorcowych mierzono po odparowaniu w generatorze parowym, ze specyficzną dla rtęci katodą przy 253,7 nm. Absorpcję atomową roztworu rozcieńczającego zmierzono jako próbę ślepą. Zawartość rtęci w próbce obliczono z krzywych kalibracyjnych uzyskanych z roztworów wzorcowych. Wyniki wyrażono w μg rtęci na 20 μg białka.
1.3 Wytwarzanie antygenu wolnego od tiomersalu
Etapy sposobu oczyszczania antygenu przedstawiono na fig. 1.
1.4 Kompozycja szczepionki formułowanej bez tiomersalu
PL 204 736 B1
Typowy skład ilościowy szczepionki przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B bez środków konserwujących i formułowanej z użyciem antygenu wytworzonego w procesie bez udziału tiomersalu przedstawiono w tabeli 1.
T a b e l a 1
| Składnik | Ilość na ml |
| Składnik czynny - Białko którego co najmniej 95% stanowi HBsAg | 20 pg |
| Wodorotlenek glinu (adsorbent) (wyrażony jako AI2O3) | 0,95 mg |
| Chlorek sodu | 9,0 mg (maksimum) |
| Dihydrat fosforanu disodowego | 0,98 mg |
| Dihydrat diwodorofosforanu sodowego | 0,71 mg |
| Woda do iniekcji, ile potrzeba | 1,0 ml |
Kompozycję można zmienić przez dodanie 3D-MPL i/lub innych adiuwantów.
2. Charakteryzacja antygenu i szczepionki wytworzonej w sposobie bez udziału tiomersalu
2.1. Testy i oznaczenia na oczyszczonym antygenie
2.1.1 Podstawa porównania
Wytworzono trzy partie antygenu sposobem bez udziału tiomersalu według tego przykładu (przykład 1.2) i oznaczono jako HEF001, HEF002 i HEF003. Porównano je z partią antygenu (HEP2055) wytworzoną według poprzedniego sposobu (jak opisano w przykładzie 1) w obecności tiomersalu.
2.1.2 Testy i oznaczenia antygenu
Zbadano trzy partie antygenu wytworzone sposobem bez udziału tiomersalu i wyniki podano w tabeli 2.
Zawartość białka zmierzono metodą Lowry i inni (J. Biol. Chem. 1951:193:265).
Zawartość endotoksyn zmierzono stosując metodę żelowego wykrzepiania Limulus (ang. Limulus gel clotting technique) z użyciem dostępnego w handlu zestawu z Cape Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA. Miano odczynnika nastawiono względem US Pharm. Endotoxin Reference Standard.
Tween 20 zmierzono metodą Huddleston i Allred (J. Amer. Oil Chemist Soc, 1965:42:983).
Zawartość HBsAg zmierzono z użyciem dostępnego w handlu zestawu AusZYME z Abbott Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, USA. Zastosowano procedurę oznaczeń B według producenta. Porcję antygenu oczyszczonego sposobem z użyciem tiomersalu zastosowano jako wzorzec dla ustalenia krzywej odpowiedzi na dawkę.
Polisacharydy zmierzono metodą Dubois i inni (Anal. Chem. 1956:28:350).
Lipidy zmierzono z użyciem zestawu dostępnego w handlu (Merkotest Total Lipids 3321) z E.Merck, B.P. 4119, Darmstad D-6100, Niemcy.
Zawartość DNA zmierzono metodą Threshold stosując aparat i odczynniki dostępne z Molecular
Devices Corp., Gutenbergstraβe 10, Ismaning, Monachium, Niemcy.
Wartości określone w tych testach i oznaczeniach były w zakresie stwierdzonym dla partii antygenu wytworzonych z użyciem tiomersalu w buforze do wymywania w etapie przesączenia przez żel Sepharose 4B, z wyjątkiem aktywności antygenowej w ELISA. Wartości tych pomiarów dla trzech preparatów HEF są wyższe (1,63-2,25) niż stwierdzone dla partii antygenu HEP2055, który ma stosunek ELISA/białko 1,13. Stosunki ELISA/białko zmierzone z użyciem zestawu AUSZYME dla porcji zawierających tiomersal wynoszą zwykle około 1,0 i są z zakresu 0,8 - 1,2, a bardzo rzadko przewyższają 1,4.
2.1.3 Analiza żelowa SDS-PAGE
Preparaty antygenu zbadano metodą analizy SDS-PAGE w warunkach redukujących z wybarwieniem błękitem Coomassie. Wszystkie próbki wykazały główny prążek przy 24K ze śladami dimeru białka. Próbki oceniono jako czyste w wysokim stopniu (> 99% czystości) co stwierdzono przez brak widocznych prążków zanieczyszczających białek.
Próbki (1 μg) preparatów antygenu zbadano metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących i nieredukujących oraz przez barwienie srebrem (fig. 2). W warunkach redukujących próbki wykazały intensywny prążek migrujący przy 24K ze śladami dimeru i form multimerycznych. Wzór żelu nie różnił
PL 204 736 B1 się w porównaniu z HEP2055. Próbki zbadano także w warunkach nieredukujących. W tych warunkach mniej materiału migrowało przy 24K oraz wzrosła ilość polipeptydu migrującego w postaci form dimerycznych i multimerycznych. Wolne od tiomersalu partie antygenu wydawały się mieć w pewnym stopniu wyższy stopień polimeryzacji w porównaniu z partią HEP2055.
Tożsamość polipeptydu 24K ujawnionego przez barwienie błękitem Coomassie lub srebrem potwierdzono metodą analizy Western blot z króliczymi poliklonalnymi przeciwciałami przeciw osoczowemu HBsAg. Preparaty antygenu ujawniły główny prążek przy 24K razem z formami dimerycznymi i trimerycznymi. Metoda ta ujawniła niewielkie ś lady produktów rozpadu białka antygenu powierzchniowego. Nie było różnic pomiędzy antygenem wytworzonym sposobem bez udziału tiomersalu a partią HEP2055.
Obecność pozostałych białek drożdżowych zbadano metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących z analizą Western blot z użyciem króliczej surowicy poliklonalnej przeciw białkom drożdżowym (fig. 3). Metoda ta jest jakościowa i nie pozwala na ilościowe oznaczenie zanieczyszczeń.
Stwierdzono stały wzór prążków we wszystkich trzech partiach antygenu wytworzonych sposobem bez tiomersalu oraz w partii HEP2055 z jednym wyjątkiem.
Silnie barwiący się prążek przy ± 23K w antygenie HEP2055 był praktycznie nieobecny w trzech preparatach HEF. Analiza Western blot pokazała, że oczyszczanie sposobem bez udziału tiomersalu umożliwia otrzymanie czystszego produktu antygenowego.
T a b e l a 2. Wyniki testów i oznaczeń na oczyszczonych antygenach, wolnych od tiomersalu
| TEST | WYNIK | |||
| HEF001 | HEF002 | HEF003 | HEP2055 | |
| PH | 6,8 | 6,8 | 6,8 | 6,8 |
| Zawartość białka metodą Lowry | 1312 pg/ml | 888 pg/ml | 913 pg/ml | 995 pg/ml |
| Zawartość endotoksyn | <0,25 EU | <0,25 EU | <0,25 EU | <0,25 EU |
| Zawartość Tween 20 | 7,1 pg | 6,6 pg | 7,4 pg | 5,8 pg |
| Aktywność antygenowa metodą ELISA | 2957 pg/ml | 1505 pg/ml | 1486 pg/ml | 1128 pg/ml |
| Stosunek ELISA/białko | 2,25 | 1,69 | 1,63 | 1,13 |
| Zawartość polisacharydów | 0,33 pg | 0,35 pg | 0,33 pg | 0,34 pg |
| Zawartość lipidów | 13,7 pg | 12,8 pg | 12,9 pg | 11,8 pg |
| Zawartość DNA metodą Threshold | <1 pg | <1 pg | <1 pg | <1 pg |
2.1.4 Inne testy i oznaczenia biochemiczne
2.1.4.1 Zawartość DNA
Zawartość DNA w trzech partiach antygenu zmierzono metodą Threshold (Molecular Devices
Corp). Zmierzone ilości były niższe niż 10 pg DNA na 20 μg białka (tabela 2); ten sam poziom zawartości DNA stwierdzono w antygenie wytworzonym obecnie zaakceptowanym sposobem.
2.1.4.2 Skład aminokwasowy
Skład aminokwasowy trzech partii HEF antygenu oznaczono po kwasowej hydrolizie za pomocą 6N HCl metodą chromatografii aminokwasów w kolumnie jonowymiennej z detekcją ninydryną po kolumnie. Nie oznaczano proliny i tryptofanu. Wyniki podano w tabeli 3.
Oznaczone składy zgadzają się ze składem określonym dla HEP2055 oraz z oczekiwanym składem wynikającym z sekwencji DNA. Jakkolwiek liczba reszt glicyny zmierzona dla HEP2055 była bliska przewidywanego składu, dla preparatów antygenowych zazwyczaj uzyskano wartość 16 - 17 reszt. Średnia określona liczba reszt cysteiny wynosiła oczekiwane 14, co pokazało, że żadna dodatkowa cysteina nie została związana z cząstką w wyniku działania w etapie z gradientem CsCl.
2.1.4.3 Ilościowe oznaczanie wolnej cysteiny
Ilość wolnej cysteiny w preparatach antygenu uzyskanych według opisanej metody zmierzono po utlenieniu cząstek kwasem nadmrówkowym bez wcześniejszej hydrolizy kwasowej. Utlenione wolne reszty cysteiny rozdzielono w kolumnie jonowymiennej z detekcją ninhydryną po kolumnie. Granica detekcji cysteiny w tej metodzie wynosi 1 μg na ml.
PL 204 736 B1
Nie można było zmierzyć wolnej cysteiny w trzech preparatach antygenu HEF przy badaniu przy wyjściowych stężeniach białka podanych w tabeli 2.
Metodą tą oznacza się zarówno wolne reszty cysteiny obecne w buforze, jak i reszty cysteiny przyłączone do białka HBsAg przez mostki disulfidowe, ale nie stanowiące części sekwencji polipeptydów.
2.1.4.4 Analiza sekwencji N-końca
Obecność możliwych zanieczyszczeń białkowych oraz produktów rozpadu w trzech partiach antygenu wytworzonych zmodyfikowanym sposobem zbadano drogą analizy sekwencji N-końca w oparciu o degradację Edman. Stwierdzono sekwencję N-końca MENITS... białka HBsAg bez ingerencji innych sekwencji. Potwierdzono także, że N-końcowa metionina jest zablokowana w 60-75% przez acetylację, co stwierdzono wcześniej dla polipetydu HBsAg wytworzonego rutynowym sposobem.
T a b e l a 3. Skład aminokwasowy HBsAg
| Aminokwas | HEF001 | HEF002 | HEF003 | Obliczona średnia | HEP2055 | Oczekiwana średnia |
| Asp | 11,3 | 11,3 | 11,3 | 11,3 | 11,5 | 10 |
| Thr | 17,5 | 17,4 | 17,2 | 17,4 | 17,8 | 17 |
| Ser | 21,4 | 21,6 | 21,4 | 21,5 | 20,9 | 23 |
| Glu | 11 | 11 | 11 | 11,0 | 10,5 | 9 |
| Pro | nb | nb | nb | nb | 24 | |
| Gly | 17,1 | 16,8 | 16,7 | 16,9 | 14,6 | 14 |
| Ala | 7,5 | 7,4 | 7,4 | 7,4 | 7,2 | 6 |
| Cys | 12,3 | 14,95 | 14,9 | 14,1 | 13,2 | 14 |
| Val | 10,9 | 11 | 10,9 | 10,9 | 10,7 | 11 |
| Met | 6,8 | 6,7 | 7,1 | 6,9 | 7,1 | 6 |
| Ile | 12,3 | 12,4 | 12,5 | 12,4 | 12,2 | 16 |
| Leu | 26,3 | 26,6 | 26,2 | 26,4 | 26,7 | 33 |
| Tyr | 6,8 | 6,8 | 6,8 | 6,8 | 7 | 6 |
| Phe | 13,8 | 13,9 | 13,8 | 13,8 | 13,9 | 15 |
| His | 3 | 2,8 | 3,3 | 3,0 | 3,3 | 1 |
| Lys | 4 | 4 | 3,9 | 4,0 | 4,2 | 3 |
| Arg | 5,7 | 5,8 | 5,7 | 5,7 | 6,1 | 5 |
| Trp | nb | nb | nb | nb | 13 |
2.1.4.5. Analiza z rozpraszaniem światła laserowego
Porównania wielkości cząstek HBsAg wytworzonych zmodyfikowanym sposobem i partii porównawczej HEP2055 dokonano metodą analizy z rozpraszaniem światła laserowego (tabela 4).
Oznaczone wartości średniej masy cząsteczkowej wykazywały dużą zgodność pomiędzy preparatami.
T a b e l a 4. Masa cząsteczkowa cząstek HBsAg oznaczona metodą analizy z rozpraszaniem światła laserowego
| Partia antygenu | MW (Daltony) |
| HEF001 | 3,07 x 106 |
| HEF002 | 2,76 x 106 |
| HEF003 | 2,76 x 106 |
| HEP2055 | 3,34 x 106 |
PL 204 736 B1
2.1.4.6 Mikroskopia elektronowa
Preparaty antygenu zbadano metodą mikroskopii elektronowej po utrwaleniu i wybarwieniu octanem uranylu.
Obserwowane cząstki były podobne we wszystkich próbkach i miały konformację ± 20 nm cząstek subsferycznych lub w kształcie otoczaków typowych dla HBsAg. Cząstki obserwowane w trzech partiach HEF nie różniły się od HEP2055.
2.1.5 Analizy immunologiczne
2.1.5.1 Reaktywność z przeciwciałem monoklonalnym RF1
Trzy preparaty antygenu zbadano pod względem reaktywności z przeciwciałem monoklonalnym RF1 za pomocą testu hamowania ELISA. Wykazano, że przeciwciało monoklonalne RF1 chroni szympansy przed prowokacją HBV i uważa się, że rozpoznaje ono ochronny epitop konformacyjny na cząstce HBsAg (Iwarson S i inni, 1985, J. Med. Virol., 16:89-96).
Hybrydomę RF1 można propagować w jamie otrzewnowej myszy BalbC lub w hodowli tkankowej.
Płyn puchlinowy w rozcieńczeniu 1/50000 w buforze nasyceniowym (PBS zawierająca 1% BSA, 0,1% Tween 20) zmieszano w stosunku 1:1 z badanymi próbkami HBsAg w różnych rozcieńczeniach w PBS (końcowe stężenia od 100 μg do 0,05 μ/ml).
Mieszaniny inkubowano na płytkach Nunc Immunoplates (96U) przez 1 godzinę w 37°C przed przeniesieniem na 1 godzinę w 37°C na płytki powleczone standardowym preparatem HBsAg. Wzorcowym preparatem HBsAg była partia antygenu (Hep 286) oczyszczona sposobem z tiomersalem. Po etapie przemycia PBS z dodatkiem 0,1% Tween 20, dodano sprzężone z biotyną owcze przeciw-mysie IgG rozcieńczone 1/1000 w buforze nasyceniowym i inkubowano przez 1 godzinę w 37°C. Po etapie przemycia, do tych samych studzienek dodano kompleks streptawidyna-biotynylowana peroksydaza rozcieńczony 1/1000 w buforze nasyceniowym i inkubowano przez 30 minut w 37°C. Płytki przemyto i inkubowano w roztworze OPDA 0,04%, H2O2 0,03% w 0,1 M buforze cytrynianowym, pH 4,5, przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano dodawszy 2N H2SO4 oraz zmierzono wartości gęstości optycznej (O.D.) przy 490/630 nm i przedstawiono je graficznie.
Wartość IC50, zdefiniowaną jako stężenie antygenu (stężenie inhibitora) które hamuje w 50% wiązanie przeciwciała z powlekającym HbsAg, obliczono stosując równanie czteroparametrowe i wyrażono w ng/ml.
Zbadano także partie antygenu HEP włącznie z HEP2055, razem z antygenem wirusa opryszczki gD jako kontrolą negatywną. Test pozwala określić zdolność każdego badanego antygenu do hamowania wiązania RF1 wzorcowego preparatu antygenowego (HEP286) związanego z płytkami do mikromianowania.
W tabeli 5 podano stężenie każdego antygenu, które hamują w 50% wiązanie RF1 z utrwalonym antygenem.
T a b e l a 5. Hamowanie wiązania przeciwciała monoklonalnego RF1 z HBsAg
| Antygen | IC50 (ng/ml)* |
| HEP286 | 3834 |
| HEP673 | 3437 |
| HEP720 | 3150 |
| HEP2055 | 2384 |
| HEF001 | 468 |
| HEF002 | 574 |
| HEF003 | 540 |
*IC50 = stężenie antygenu (ng/ml) hamujące w 50% wiązanie RF1 z utrwalonym antygenem
Wyniki wykazują, że 4 do 7 razy mniej antygenu HEF jest wymagane do zahamowania wiązania RF1 (tabela 5). Pokazuje to, że antygen wytworzony zmodyfikowanym sposobem ma zwiększoną prezentację epitopu RF1 w porównaniu z antygenem HEP.
Taki sam test hamowania wykonano z ludzką surowicą ze szczepionek Engerix B™ zamiast mAb RF1 i nie stwierdzono różnic pomiędzy partiami antygenu HEP a antygenami HEF.
PL 204 736 B1
2.1.5.2 Powinowactwo wiązania z przeciwciałem monoklonalnym RF1
Zmierzono parametry kinetyczne wiązania przeciwciała monoklonalnego z trzema partiami antygenu HEF i HEP2055 metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego z użyciem aparatu Biacore 2000 z Amersham Pharmacia Biotech, Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, UK.
Mierzono następujące parametry kinetyczne: ka: stała szybkości wiązania (M-1S-1) kd: stała szybkości dysocjacji (S-1)
Ka: stała równowagi lub powinowactwa (M-1) gdzie Ka = — kd
Zmierzone wartości podano w tabeli 6.
T a b e l a 6. Stałe powinowactwa wiązania RF1 z HBsAg
| Antygen | ka (x 10-3) | kd (x 10-5) | Ka (x 10-7) |
| HEF001 | 6,81 | 3,21 | 21,97 |
| HEF002 | 6,89 | 3,73 | 18,83 |
| HEF003 | 7,39 | 4,67 | 15,80 |
| HEP2055 | 3,31 | 6,30 | 5,31 |
Trzy partie antygenu HEF dały podobne wartości stałych wiązania/dysocjacji i powinowactwa wiązania. W odróżnieniu od tego HEP2055 ma słabsze powinowactwo wiązania z RF1.
Zgadzało się to z wynikami uzyskanymi w teście hamowania ELISA, które wykazały, że antygen wytworzony sposobem wolnym od tiomersalu wykazywał podwyższoną prezentację epitopu RF1.
2.2 Test i oznaczenia szczepionki formułowanej z użyciem antygenu wytworzonego zmodyfikowanym sposobem
Trzy partie antygenu HEF zaadsorbowano na wodorotlenku glinu i sformułowano w postaci szczepionki według składu przedstawionego w tabeli 1. Postacią była dawka dla dorosłych w fiolkach (20 pg białka antygenu na 1 ml). Partie oznaczono jako DENS001A4, DENS002A4 i DENS003A4.
Siłę szczepionki zmierzono w teście in vitro zawartości antygenu z użyciem zestawu AUSZYME ELISA Abbott Laboratories i zwykłej partii szczepionki sformułowanej z użyciem 50 pg/ml tiomersalu jako wzorca. Skuteczność szczepionki zmierzono stosując metodę B opisaną w PharmaEuropa, wydanie specjalne Bio97-2 (grudzień 1997). Trzy partie HEF dały wysokie wartości zawartości antygenu, prawie dwukrotnie wyższe od podanej zawartości 20 pg białka antygenu.
2.2.1 Reaktywność szczepionki DENS z przeciwciałem monoklonalnym RF1
Antygenowość zaadsorbowanej szczepionki dalej badano w teście hamowania z przeciwciałem monoklonalnym RF1. Test ten pozwala zmierzyć zdolność próbki szczepionki do hamowania wiązania RF1 z utrwalonym antygenem (HEP286).
Płyn puchlinowy w rozcieńczeniu 1/50000 w buforze nasyceniowym (PBS zawierająca 1% BSA, 0,1% Tween 20) zmieszano w stosunku 1:1 z badanych próbek szczepionek w różnych rozcieńczeniach w PBS (stężenia od 20 pg do 0,05 p/ml).
Mieszaniny inkubowano na płytkach Nunc Immunoplates (96U) przez 2 godziny w 37°C z wytrząsaniem przed przeniesieniem na płytki powleczone HBsAg. Preparatem HBsAg użytym do powleczenia była partia antygenu (Hep 286) oczyszczona sposobem z tiomersalem. Płytki te następnie inkubowano przez 2 godziny w 37°C w trakcie mieszania. Po etapie przemycia PBS z dodatkiem 0,1% Tween 20, dodano sprzężone z biotyną owcze przeciw-mysie IgG rozcieńczone 1/1000 w buforze nasyceniowym i inkubowano 1 godzinę w 37°C. Po etapie przemycia do tych samych studzienek dodano kompleks streptawidyna-biotynylowana peroksydaza rozcieńczony 1/1000 w buforze nasycania i inkubowano 30 minut w 37°C. Płytki przemyto i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej w roztworze OPDA 0,04%, H2O2 0,03% w 0,1 M buforze cytrynianowym pH 4,5. Reakcję zatrzymano dodawszy 2N H2SO4 oraz zmierzono wartości gęstości optycznej (O.D.) przy 490/630 nm i przedstawiono je graficznie.
PL 204 736 B1
Wartość IC50, zdefiniowaną jako stężenie antygenu (stężenie inhibitora) które hamuje w 50% wiązanie przeciwciała z powlekającym HbsAg, obliczono stosując równanie czteroparametrowe i wyrażono w ng/ml.
Szczepionkę wytworzoną z użyciem antygenu wytworzonego zmodyfikowanym sposobem porównano ze szczepionką Engerix B™ sformułowaną ze zwykłego antygenu HEP i bez tiomersalu jako środka konserwującego.
Testy wykonano w trzech powtórzeniach.
Wyniki przedstawiono w tabeli 7 i wykazują one, że około połowa ilości szczepionki DENS jest wymagana do osiągnięcia 50% hamowania wiązania RF1 w porównaniu z wolną od środka konserwującego szczepionką Engerix B™. Odzwierciedla to zwiększoną prezentację epitopu RF1 na antygenie HEF/DENS i zgadza się z testami wykonanymi z przeciwciałem RF1 i oczyszczonym antygenem.
T a b e l a 7. Hamowanie wiązania RF1 przez sformułowaną szczepionkę
| Partia szczepionki | IC50 (ng/ml)(1) | |||
| Doświadczenie | Średnia | |||
| 1 | 2 | 3 | ||
| DENS001A4 | 913 | 662 | 603 | 726 |
| DENS002A4 | 888 | 715 | 521 | 708 |
| DENS003A4 | 817 | 685 | 582 | 695 |
| ENG5100A2 | 1606 | 1514 | 1481 | 1534 |
| ENG3199B9 | 1329 | 1170 | 1286 | 1262 |
| ENG3328A9 | 1417 | 1194 | 1334 | 1315 |
(1) stężenie szczepionki hamujące w 50% wiązanie przeciwciała RF1 z utrwalonym antygenem
2.2.2 Immunogenność szczepionki DENS u myszy
Wykonano badanie na myszach Balb/C aby porównać immunogenność trzech partii DENS z Engerix B™ wytworzoną zgodnie z obecnym sposobem wytwarzania antygenu i sformułowaną z tiomersalem.
Zbadano następujące partie:
#DENS001A4 #DENS002A4 #DENS003A4 #ENG2953A4/Q jako partię odniesienia
W skrócie, 12 myszy szczepiono domięśniowo dwukrotnie z dwutygodniową przerwą dawkami szczepionek odpowiadającymi 1/10 (2 μg) lub 1/50 (0,4 μg) dawki dla dorosłego człowieka. Odpowiedź przeciwciał na HBsAg oraz profil izotypowy wywołany przez szczepienie monitorowano w surowicy pobranej dnia 28.
Projekt doświadczenia
Grupy po 12 myszy Balb/C szczepiono domięśniowo w obie nogi (2 x 50 μθ dnia 0 i 15 dawkami szczepionki podanymi w tabeli 8.
T a b e l a 8. Grupy i dawka szczepionki
| Grupa | Szczepionka | Objętość | Dawka antygenu |
| 1 | DENS001A4 | 100 pl | 2 pg |
| 2 | ^Rozcieńczona 5 x PO4/NaCl | 100 pl | 0,4 pg |
| 3 | DENS002A4 | 100 p | 2 pg |
| 4 | ^Rozcieńczona 5 x PO4/NaCl | 100 pl | 0,4 pg |
| 5 | DENS003A4 | 100 pl | 2 pg |
| 6 | ^Rozcieńczona 5 x PO4/NaCl | 100 pl | 0,4 pg |
| 7 | ENG2953A4/Q | 100 pl | 2 pg |
| 8 | ^Rozcieńczona 5 x PO4/NaCl | 100 pl | 0,4 pg |
PL 204 736 B1
Dnia 15 (dwa tygodnie po I) i 28 (dwa tygodnie po II) pobrano krew z zatoki pozaoczodołowej.
Do zaprogramowania tego doświadczenia (4 preparaty x 2 dawki z 12 myszami na grupę) moc testu wstępnie określono za pomocą programu statystycznego PASS. Program statystyczny PASS (Power and Sample Size) otrzymano z NCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037. Dla dwustronnej analizy wariancji 2,5 krotną różnicę GMT (średniego geometrycznego miana) pomiędzy preparatami z błędem alfa 5% powinno się wykryć z mocą > 90%.
Wyniki 1
Serologia
Odpowiedzi humoralne (Całkowite Ig i izotypy) zmierzono za pomocą testu ELISA stosując HBsAg (Hep286) jako antygen powlekający i sprzężone z biotyną przeciwciała przeciw-mysie aby ujawnić wiązanie przeciwciała przeciw-HBs. Analizowano tylko surowice po II.
W tabeli 9 podano średnie i GMT odpowiedzi przeciwciał Ig przeciw-HBs zmierzone w poszczególnych surowicach po dwóch tygodniach po II.
Porównywalne odpowiedzi przeciwciał były wywołane przez DENS i zwykłe preparaty przeciw zapaleniu wątroby typu B: GMT wynosiły pomiędzy 2304 a 3976 EU/ml dla partii DENS w porównaniu z 2882 EU/ml dla jednoważnej szczepionki przeciw zapaleniu wątroby typu B SB Biologicals (Engerix B™) w dawce 2 μg; oraz GMT w zakresie 696 - 1182 EU/ml dla partii DENS w porównaniu z 627 EU/ml dla jednoważnej szczepionki przeciw zapaleniu wątroby typu B SB Biologicals (Engerix B™) w dawce 0,4 pg.
- Zgodnie z oczekiwaniem wyraźny wpływ zakresu dawki obserwowano dla wszystkich preparatów w dawkach 2 i 0,4 pg z 3 - 6 krotnymi różnicami GMT.
- Zaobserwowano cztery nie odpowiadające myszy (miana < 50 EU/ml) bez wyraźnego związku z dawkami lub partiami stosowanymi do zastrzyków (grupy 1, 2, 3 i 8; po jednej myszy na grupę). W oparciu o analizę statystyczną (test Grubbsa) myszy te wykluczono z dalszej analizy.
T a b e l a 9. Odpowiedź przeciwciał u myszy dnia 28 (dwa tygodnie po II)
| Grupa | Szczepionka | Dawka | Numer | Miana ELISA (Ig) | |
| Średnia | GMT | ||||
| 1 | DENS001A4 | 2 pg | 11 | 3466 | 2971 |
| 2 | 0,4 pg | 11 | 1283 | 1182 | |
| 3 | DENS002A4 | 2 pg | 11 | 2436 | 2304 |
| 4 | 0,4 pg | 12 | 984 | 786 | |
| 5 | DENS003A4 | 2 pg | 12 | 4583 | 3976 |
| 6 | 0,4 pg | 12 | 997 | 696 | |
| 7 | ENG2953A4/Q | 2 pg | 12 | 3999 | 2882 |
| 0,4 pg | 11 | 737 | 627 |
Analiza statystyczna
Na mianach przeciwciał przeciw-HBs po transformacji logarytmicznej danych po II przeprowadzono dwukierunkową analizę wariancji, stosując szczepionki (4 partie) i dawki antygenu (2 pg i 0,4 pg) jako czynniki. Analiza ta potwierdziła, że statystycznie istotną różnicę obserwowano pomiędzy dwiema dawkami antygenu (wartość p = 0,001) i nie wykazała jakiejkolwiek istotnej różnicy pomiędzy partiami szczepionki (wartość p = 0,2674). Jak wcześniej wspomniano, moc testu określono z góry i projekt testu był taki, że 2,5 krotną różnicę GMT pomiędzy preparatami z błędem alfa 5% powinno się wykryć z mocą > 90%.
Profil izotypowy
W tabeli 10 przedstawiono rozkład izotypowy (IgG1, IgG2a i IgG2b) obliczony z analizy połączonych surowic po II.
- Zgodnie z oczekiwaniem, wywoływana jest wyraźna odpowiedź TH2 przez te oparte na ałunie szczepionki, gdyż stwierdzono głównie przeciwciała IgG1.
Nie zaobserwowano różnicy pomiędzy partiami DENS lub jednoważną szczepionką przeciw zapalaniu wątroby typu B SB Biologicals pod względem profilu izotypowego.
PL 204 736 B1
T a b e l a 10. Rozkład izotypów IgG w połączonych surowicach z dnia 28
| Grupa | Szczepionka | Dawka | Izotyp (%) | ||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | |||
| 1 | DENS001A4 | 2 pg | 91 | 4 | 5 |
| 2 | 0,4 pg | 87 | 8 | 5 | |
| 3 | DENS002A4 | 2 pg | 97 | 2 | 1 |
| 4 | 0,4 pg | 87 | 6 | 7 | |
| 5 | DENS003A4 | 2 pg | 98 | 1 | 1 |
| 6 | 0,4 pg | 93 | 4 | 3 | |
| 7 | ENG2953A4/Q | 2 pg | 88 | 8 | 4 |
| 0,4 pg | 88 | 9 | 3 |
P r z y k ł a d 3
Formułowanie złożonych szczepionek
Antygen według wynalazku jest szczególnie odpowiedni do formułowania złożonej szczepionki zawierającej IPV.
Badania trwałości przeprowadzone na początkowych partiach złożonej szczepionki DTPa-HBV-IPV wykazały obniżenie skuteczności składnika IPV, w szczególności antygenu choroby Heinego i Medina typu 1 przy zastosowaniu testu immunologicznego in vitro (oznaczenie zawartości antygenu D za pomocą ELISA) oraz w szczurzym teście działania in vivo. Nie stwierdzono utraty skuteczności dla typu 3. Dla typu 2, utrata skuteczności była w oczekiwanym zakresie (nie więcej niż 10% spadku na rok przechowywania).
Rozpoczęto badania w celu ustalenia przyczyny tego spadku skuteczności w przypadku złożonej szczepionki DTPa-HBV-IPV. Z obserwacji, że trwałość IPV w szczepionce DTPa-IPV SB Biologicals jest wystarczająca (nie więcej niż 10% utraty zawartości antygenu na rok przechowywania) wywnioskowano, że składnik HBV prawdopodobnie odpowiada za nietrwałość IPV w szczepionce DTPaHBV-IPV.
Składnikiem HBV stosowanym w początkowym preparacie DTPa-HBV-IPV był oczyszczony r-DNA, pochodzący z drożdży HBsAg stosowanym także do wytwarzania jednoważnej szczepionki przeciw zapaleniu wątroby typu B SB Biologicals i wytworzony w sposób opisany w przykładzie 1.
W pierwszej próbie ustalenia, który element składnika HBV był szkodliwy dla IPV, HBsAg zanalizowano pod względem obecności tiomersalu. Wcześniej stwierdzono (Davisson i inni, 1956, J. Lab. Clin. Med 47:8-19), że tiomersal stosowany jako środek konserwujący w szczepionkach DTP „był szkodliwy dla wirusa polio w połączeniu DTP-IPV. Obserwację tę wzięli pod uwagę producenci szczepionki, którzy zastąpili tiomersal innymi środkami do formułowania szczepionek zawierających IPV. Niedawno ponownie zbadano wpływ tiomersalu na skuteczność IPV w warunkach długotrwałego przechowywania w + 4°C. Doniesiono o utracie antygenu wirusa polio typu 1 do niewykrywalnych poziomów po 4-6 miesiącach (Sawyer, L.A. i inni, 1994, Vaccine 12:851-856).
Metodą atomowej spektroskopii adsorpcyjnej wykryto około 0,5 μg rtęci (Hg) na 20 μg HbsAg w antygenie oczyszczonym według przykładu 1.
Ta ilość rtęci (w postaci tiomersalu i chlorku etylortęci, produktu rozkładu tiomersalu) może obniżyć do niewykrywalnych poziomów odpowiedź ELISA dla zawartości antygenu D typu 1 w koncentracie IPV inkubowanym w 37°C przez 7 dni.
Opracowano sposób usuwania rtęci obecnej w HbsAg. Postulowano, że rtęć może wiązać grupy tiolowe na cząstce HbsAg, a zatem może być uwalniana w obecności środków redukujących. Po doświadczeniach z innymi środkami redukującymi, wybrano L-cysteinę jako środek do uwalniania rtęci z cząstki HbsAg. Po dializie HBsAg względem roztworu soli zawierającym 5,7 mM L-cysteinę, nie wykryto rtęci w pozostałości (granica wykrywalności metody badawczej: 25 ng Hg/20 μg HBsAg). Dializowany antygen zmieszano z koncentratem IPV i trwałość wirusa typu 1 zbadano przez zmierzenie zawartości antygenu D po inkubacji w 37°C przez 7 dni. Koncentrat IPV nie zmieszany i zmieszany z HBsAg nietraktowanym cysteiną zastosowano jako kontrole. Wzorcowe miano ELISA uzyskano na próbkach przechowywanych w +2°C do +8°C przez 7 dni. Wyniki podano w tabeli 11.
PL 204 736 B1
T a b e l a 11
| Próbka | Zawartość antygenu D (typ 1)(1) | Ubytek | |
| 7 dni/4°C | 7 dni/37°C | ||
| IPV (nie zmieszany) | 31,6 | 24,2 | 23% |
| IPV+HBsAg nie traktowany | 31,1 | 18,1 | 42% |
| IPV + HBsAg-traktowany cysteiną | 31,4 | 27,6 | 12% |
| IPV + tiomersal (1 pg /ml) | 30,5 | 11,0 | 74% |
(1) wyrażona w jednostkach antygenu D (DU)
Dane uzyskane dla tych preparatów laboratoryjnych wyraźnie wykazują, że trwałość wirusa polio typu 1 została istotnie poprawiona gdy HbsAg poddano działaniu cysteiny w celu usunięcia pozostałej rtęci po zmieszaniu z IPV.
Dane przedstawione powyżej także pokazują utratę 23% zawartości antygenu D dla preparatu odnośnego IPV po inkubacji przez 7 dni w 37°C. Potwierdza to wcześniej opisaną naturalną nietrwałość wirusa polio typu Mahoney (Sawyer, L.A. i inni, (1994), Vaccine 12: 851-856).
Jakkolwiek handlowe partie szczepionek DTPa-HBV-IPV i DTPa-HBV-IPV/Hib wytworzono z zastosowaniem procesu dializy z 5,7 mM L-cysteiną w celu usunięcia pozostałej rtęci i zwiększenia trwałości IPV, proces dializy nie jest odpowiedni do produkcji w dużej skali i wymaga szeregu etapów uzupełniających w celu wytworzenia HbsAg wolnego od tiomersalu lub rtęci. W odróżnieniu od tego HBsAg według wynalazku, wytwarzany bez tiomersalu, może być bezpośrednio stosowany w preparatach złożonych szczepionek, zwłaszcza zawierających IPV.
4. Streszczenie
Poprzednio stosowany sposób oczyszczania pochodzącego z drożdży antygenu powierzchniowego obejmuje etap przesączenia przez żel, w którym zawierający rtęć środek przeciwbakteryjny tiomersal dodaje się do buforu do wymywania aby kontrolować biozanieczyszczenia.
Tiomersal nie jest całkowicie usuwany podczas kolejnych etapów procesu, tak że około 1,2 pg tiomersalu na 20 pg białka jest obecne w oczyszczonym antygenie.
Aby wytworzyć antygen całkowicie wolny od tiomersalu (rtęci), sposób oczyszczania zmieniono w dwóch etapach.
- Tiomersal pomija się w buforze do wymywania w etapie przesączenia przez żel 4B.
- Cysteinę (2 mM stężenie końcowe) dodaje się do połączonego eluatu w etapie chromatografii anionowymiennej. Przeciwdziała to wytrącaniu podczas wirowania w gradiencie gęstości CsCl.
Nie ma innych zmian w procesie produkcyjnym.
Zbadano antygen wytworzony w zmodyfikowanym procesie.
Testy i oznaczenia fizykochemiczne wykazały, ze antygen wolny od tiomersalu nie różni się właściwościami od antygenu wytworzonego zgodnie z poprzednio stosowanym sposobem. Cząstki antygenu mają te same składniki.
Tożsamość i integralność polipeptydu HBsAg nie uległy zmianie w zmodyfikowanym sposobie, co stwierdzono metodą analizy SDS-PAGE, analizy Western blot z poliklonalnymi przeciwciałami przeciw-HBsAg, analizy sekwencji N-końca i składu aminokwasowego. Mikroskopia elektronowa i analiza rozpraszania światła laserowego wykazały, że cząstki mają typową postać i wielkość oczekiwaną dla HbsAg pochodzącego z drożdży. Analiza Western blot z surowicą przeciw białkom drożdżowym pokazała, że antygen wytwarzany sposobem bez udziału tiomersalu ma podobny skład zanieczyszczeń białkami drożdżowymi. Jednakże ilość zanieczyszczającego prążka migrującego przy 23K była znacznie obniżona w trzech partiach HBsAg wyprodukowanych zmodyfikowanym sposobem.
Analiza immunologiczna wykazała, że cząstki wolne od tiomersalu mają podwyższoną antygenowość. Cząstki te były bardziej reaktywne z zestawem Abbott AUSZYME (zawierającym mieszaninę przeciwciał monoklonalnych) i dawały stosunek ELISA/białko wynoszący 1,6 - 2,25. Tą podwyższoną antygenowość wykazano także dla ochronnego przeciwciała monoklonalnego RF1. Około 4-7 razy mniej antygenu wolnego od tiomersalu jest wymagane do zahamowania wiązania RF1 z wzorcowym utrwalonym antygenem. Krzywe wiązania wolnego od tiomersalu i zwykłego antygenu należą do dwóch różnych rodzin. Różnicę tą pokazano także przez pomiary stałych powinowactwa wiązania RF1
PL 204 736 B1 metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Powinowactwa wiązania preparatów wolnych od tiomersalu są 3 - 4 razy wyższe w porównaniu z partią klasycznego antygenu.
Preparaty antygenu sformułowano jako szczepionki przez zaadsorbowanie na wodorotlenku glinu oraz bez środka konserwującego.
Badanie skuteczności działania in vitro z zestawem Abbott AUSZYME ELISA i zawierającej tiomersal jednoważnej szczepionki przeciw zapaleniu wątroby typu B SB Biologicals jako wzorcem wykazały, że uzyskano duże wartości skuteczności działania in vitro. Zawartość antygenu zmierzona w tym teście była prawie dwukrotna w porównaniu z podaną wartością 20 μg białka na ml.
Zwiększoną reaktywność szczepionki wytworzonej sposobem wolnym od tiomersalu stwierdzono także w teście hamowania wiązania przeciwciała monoklonalnego RF1 z utrwalonym antygenem. Około połowa ilości wolnej od tiomersalu szczepionki była potrzebna do wywołania w 50% hamowania wiązania RF1 z utrwalonym antygenem, w porównaniu z antygenem oczyszczonym wcześniej stosowanym sposobem i formułowania bez środka konserwującego.
Ta zwiększona antygenowość wolnej od tiomersalu szczepionki w odniesieniu do RF1 zgadza się z wynikami in vitro testu skuteczności działania (zawartość antygenu) i testami przeciwciał RF1 przeprowadzonymi na preparatach antygenu.
Test immunogenności u myszy przeprowadzono stosując szczepienie pierwsze i po dwóch tygodniach szczepienie przypominające oraz dawki 2 i 0,4 μg antygenu. Od myszy pobrano krew dnia 28, 14 dni po szczepieniu przypominającym. Surowice analizowano pod względem miana przeciwciał i składu izotypowego. Stwierdzono wyraźny wpływ dawki antygenu dla dwóch podanych dawek, ale nie było różnic istotnych statystycznie w odpowiedzi w odniesieniu do mian przeciwciał (GMT) pomiędzy wolną od tiomersalu i wolną od środka konserwującego szczepionką.
Nie stwierdzono istotnych różnic w profilach izotypowych.
Claims (10)
1. Sposób wytwarzania stabilnej immunogennej szczepionki, bez śladów tiomersalu, przeciw zapaleniu wątroby typu B, znamienny tym, że (a) eksprymuje się antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) jako białko rekombinowane w szczepie Saccharomyces cerevisiae;
(b) przetwarza się komórki drożdży, z wytworzeniem surowego preparatu antygenu;
(c) surowy preparat antygenu poddaje się chromatografii żelowej, przy czym bufor do wymywania w etapie chromatografii żelowej nie zawiera tiomersalu;
(d) zawierający antygen eluent z etapu (c) poddaje się chromatografii jonowymiennej;
(e) do zawierającego antygen zebranego eluentu z etapu (d) dodaje się cysteiny;
(f) poddaje się preparat z etapu (e) ultrawirowaniu z chlorkiem cezu;
(g) łączy się oczyszczony HBsAg z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, z wytworzeniem stabilnej immunogennej szczepionki przeciw zapaleniu wątroby typu B;
przy czym do powstałej szczepionki nie dodaje się tiomersalu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cysteinę dodaje się do stężenia końcowego 1-10 mM.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że cysteinę dodaje się do stężenia końcowego około 2 mM.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że chromatografią jonowymienną jest chromatografia anionowymienna.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że szczepionkę łączy się ponadto z adiuwantem.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że adiuwantem jest sól glinu.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że adiuwantem jest żel wodorotlenku glinu lub fosforan glinu.
8. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że adiuwantem jest adiuwant indukujący Th1.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że adiuwant indukujący Th1 jest wybrany z grupy obejmującej 3D-MPL; QS21; 3D-MPL i QS21; oraz oligonukleotyd CpG.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że adiuwantem jest 3D-MPL i sól glinu.
PL 204 736 B1
Rysunki
PL 204 736 B1
Fig. 2 Analiza SDS-PAGE partii antygenów: barwienie srebrem: 1pg białka na próbkę
Ścieżka 1: HEF 001, warunki redukujące
Ścieżka 2: HEF 002, warunki-redukujące
Ścieżka 3: HEF 003, warunki redukujące '
Ścieżka 4: HEF2005, warunki redukujące .
Ścieżka 5: wzorce masy cząsteczkowej Ścieżka 6: HEF 001, nie redukujące Ścieżka 7: HEF 002, nie redukujące Ścieżka 8: HEF 003, nie redukujące Ścieżka 9: HEF 2055, nie redukujące
Pozycje wzorców masy cząsteczkowej zaznaczono czarnymi kropkami: 92500,66200, 45000, 31000,21500,14400.
PL 204 736 B1
Fig. 3 Pozostałość białek drożdżowych w partiach antygenu wytworzonych w procesie bez udziału tiomersalu: analiza Western błot z króliczą surowicą przeciw-drożdżową
Ścieżka 1: wzorce masy cząsteczkowej (barwne)
Ścieżka 2: wzorce niskiej masy cząsteczkowej (biotynylowane)
Ścieżka 3: HEF 001, 20 pg białka
Ścieżka 4: HEF 002,20 pg białka
Ścieżka 5: HEF 003, 20 pg białka
Ścieżka 6; HEF 2055, 20 pg białka
Pozycje wzorców masy cząsteczkowej zaznaczono czarnymi kropkami: 92500,66200, 45000,31000,21500,14400.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0019728.5A GB0019728D0 (en) | 2000-08-10 | 2000-08-10 | Novel treatment |
| GB0101334A GB0101334D0 (en) | 2001-01-18 | 2001-01-18 | Novel compounds |
| PCT/EP2001/009100 WO2002012287A1 (en) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Purification of hbv antigens for use in vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL362322A1 PL362322A1 (pl) | 2004-10-18 |
| PL204736B1 true PL204736B1 (pl) | 2010-02-26 |
Family
ID=26244821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL362322A PL204736B1 (pl) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Sposób wytwarzania stabilnej immunogennej szczepionki, bez śladów tiomersalu, przeciw zapaleniu wątroby typu B |
Country Status (36)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20030235590A1 (pl) |
| EP (2) | EP1307473B1 (pl) |
| JP (2) | JP2004505992A (pl) |
| KR (1) | KR100804922B1 (pl) |
| CN (1) | CN1468256B (pl) |
| AP (1) | AP2003002734A0 (pl) |
| AR (1) | AR030325A1 (pl) |
| AT (2) | ATE313558T1 (pl) |
| AU (2) | AU8207301A (pl) |
| BG (1) | BG66038B1 (pl) |
| BR (1) | BRPI0113155C1 (pl) |
| CA (2) | CA2740282A1 (pl) |
| CY (2) | CY1106310T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ303217B6 (pl) |
| DE (2) | DE60136400D1 (pl) |
| DK (2) | DK1307473T3 (pl) |
| DZ (1) | DZ3470A1 (pl) |
| EA (1) | EA006433B1 (pl) |
| EG (1) | EG25829A (pl) |
| ES (2) | ES2314555T3 (pl) |
| HK (1) | HK1056884A1 (pl) |
| HU (1) | HU228932B1 (pl) |
| IL (2) | IL154301A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA03001235A (pl) |
| MY (1) | MY128999A (pl) |
| NO (1) | NO20030635L (pl) |
| NZ (1) | NZ524012A (pl) |
| OA (1) | OA12361A (pl) |
| PE (1) | PE20020287A1 (pl) |
| PL (1) | PL204736B1 (pl) |
| PT (1) | PT1666487E (pl) |
| SI (2) | SI1666487T1 (pl) |
| SK (2) | SK288079B6 (pl) |
| UA (1) | UA79735C2 (pl) |
| UY (1) | UY26882A1 (pl) |
| WO (1) | WO2002012287A1 (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
| GB0202901D0 (en) * | 2002-02-07 | 2002-03-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel vaccine |
| KR20080043775A (ko) * | 2005-07-11 | 2008-05-19 | 글로브이뮨 | 표적 치료용 회피 돌연변이체에 대한 면역 반응의 유발방법 및 조성물 |
| AP2745A (en) * | 2005-08-02 | 2013-09-30 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Reducing interference between oil-containing adjuvants and surfactant-containing antigens |
| GB0522765D0 (en) * | 2005-11-08 | 2005-12-14 | Chiron Srl | Combination vaccine manufacture |
| GB0612142D0 (en) | 2006-06-20 | 2006-08-02 | Secr Defence | Spreading modulation spectrum control |
| PT2097102E (pt) | 2006-09-07 | 2012-08-03 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacina de combinação tendo quantidades reduzidas de antigénio de poliovírus |
| US20100074918A1 (en) | 2007-05-02 | 2010-03-25 | Jan Poolman | Vaccine |
| JP5214627B2 (ja) * | 2007-10-30 | 2013-06-19 | 京セラ株式会社 | 弾性波装置 |
| US8250102B2 (en) * | 2008-03-14 | 2012-08-21 | Microsoft Corporation | Remote storage and management of binary object data |
| KR100959145B1 (ko) | 2008-03-21 | 2010-05-25 | 중앙대학교 산학협력단 | 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법 |
| US9415006B2 (en) * | 2008-05-23 | 2016-08-16 | The Regents Of The University Of Michigan | Immunogenic compositions comprising nanoemulsion and hepatitis B virus immunogen and methods of using the same |
| AU2010252012A1 (en) * | 2009-05-27 | 2011-12-22 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | CASB7439 constructs |
| DK2705365T3 (en) * | 2011-01-14 | 2016-10-24 | Hal Allergy Holding B V | Immunoassay for the direct determination of the antigen content in the products containing the adjuvant-linked antigen particles |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| CN106222129A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-12-14 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法 |
| EP3655024A1 (en) | 2017-07-18 | 2020-05-27 | Serum Institute of India Private Limited | An immunogenic composition having improved stability, enhanced immunogenicity and reduced reactogenicity and process for preparation thereof |
| GB201721069D0 (en) | 2017-12-15 | 2018-01-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hepatitis B Immunisation regimen and compositions |
| GB201721068D0 (en) | 2017-12-15 | 2018-01-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hepatitis B immunisation regimen and compositions |
| WO2020178359A1 (en) | 2019-03-05 | 2020-09-10 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hepatitis b immunisation regimen and compositions |
| CA3161638A1 (en) * | 2019-12-13 | 2021-06-17 | Jun Ge | Pharmaceutical composition and use thereof |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1030777A (en) * | 1963-12-06 | 1966-05-25 | Ciba Ltd | Method of preparing a vaccine against trypanosoma cruzi infections |
| US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
| US4372945A (en) | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
| IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
| US4720385A (en) * | 1983-03-29 | 1988-01-19 | Miles Laboratories, Inc. | Protein compositions substantially free from infectious agents |
| JPS6013718A (ja) | 1983-07-05 | 1985-01-24 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Ｂ型肝炎ワクチン |
| EP0135435A3 (en) | 1983-08-22 | 1987-03-25 | Merck & Co. Inc. | Immunogenic hbsag derived from transformed yeast |
| US4683294A (en) * | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
| FI861417A0 (fi) | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| US4895800A (en) | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| AP56A (en) | 1987-01-30 | 1989-09-26 | Smithkline Biologicals S A | Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them. |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| EP0304578B1 (en) | 1987-06-22 | 2001-10-24 | Medeva Holdings Bv | Peptide comprising hepatitis B surface antigen |
| EP0299108B1 (en) | 1987-07-17 | 1994-05-18 | Rhein Biotech Gesellschaft für biotechnologische Prozesse und Produkte mbH | DNA-molecules coding for FMDH control regions and structured gene for a protein having FMDH-activity and their uses |
| EP0314240A3 (en) | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| JPH085804B2 (ja) | 1988-04-28 | 1996-01-24 | 財団法人化学及血清療法研究所 | Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン |
| US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
| US5242812A (en) * | 1989-02-07 | 1993-09-07 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification of hepatitis B vaccine |
| US5274081A (en) * | 1989-09-20 | 1993-12-28 | Immuno A.G. | Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen |
| GB9007024D0 (en) | 1990-03-29 | 1990-05-30 | Imperial College | Novel vaccine |
| AU9052091A (en) | 1990-12-20 | 1992-07-22 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Vaccines based on hepatitis b surface antigen |
| JP3026029B2 (ja) | 1991-04-26 | 2000-03-27 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 組換え水痘ウイルスとその作製法 |
| JPH06503231A (ja) | 1991-09-18 | 1994-04-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | 胆汁酸塩を含有するｂ型肝炎ワクチン製剤 |
| US6620414B2 (en) * | 1992-03-27 | 2003-09-16 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A |
| JP3755890B2 (ja) | 1992-06-25 | 2006-03-15 | スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム） | アジュバント含有ワクチン組成物 |
| GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| EP1167379A3 (en) | 1994-07-15 | 2004-09-08 | University Of Iowa Research Foundation | Immunomodulatory oligonucleotides |
| HUT78048A (hu) * | 1994-10-24 | 1999-07-28 | Ophidian Pharmaceuticals, Inc. | A C. difficile által okozott betegség kezelésére és megelőzésére szolgáló vakcina és antitoxin |
| KR960023066A (ko) * | 1994-12-10 | 1996-07-18 | 성재갑 | 전에스 (s) 2 펩티드 함유 비 (b) 형 간염 표면항원의 정제 방법 |
| UA56132C2 (uk) | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
| HUP0101047A3 (en) * | 1998-03-09 | 2004-10-28 | Smithkline Beecham Biolog | Combined vaccine compositions |
| DE69929444T2 (de) | 1998-08-10 | 2006-09-28 | Antigenics Inc., Woburn | Cpg-zusammensetzungen, saponin-adjuvantien und verfahren zu deren verwendung |
| AU2212100A (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-12 | Merck & Co., Inc. | Improved recombinant hepatitis b surface antigen |
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
-
2001
- 2001-07-08 UA UA2003021025A patent/UA79735C2/uk unknown
- 2001-08-07 BR BRPI0113155A patent/BRPI0113155C1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 CA CA2740282A patent/CA2740282A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-07 MX MXPA03001235A patent/MXPA03001235A/es active IP Right Grant
- 2001-08-07 AU AU8207301A patent/AU8207301A/xx active Pending
- 2001-08-07 SI SI200130884T patent/SI1666487T1/sl unknown
- 2001-08-07 SK SK50032-2012A patent/SK288079B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 DK DK01960630T patent/DK1307473T3/da active
- 2001-08-07 EP EP01960630A patent/EP1307473B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 PT PT05077471T patent/PT1666487E/pt unknown
- 2001-08-07 AU AU2001282073A patent/AU2001282073B2/en not_active Expired
- 2001-08-07 OA OA1200300038A patent/OA12361A/en unknown
- 2001-08-07 SK SK169-2003A patent/SK288069B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 AP APAP/P/2003/002734A patent/AP2003002734A0/en unknown
- 2001-08-07 CN CN018169988A patent/CN1468256B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 CZ CZ20030385A patent/CZ303217B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 HU HU0302951A patent/HU228932B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 WO PCT/EP2001/009100 patent/WO2002012287A1/en active IP Right Grant
- 2001-08-07 US US10/344,211 patent/US20030235590A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-07 SI SI200130489T patent/SI1307473T1/sl unknown
- 2001-08-07 DE DE60136400T patent/DE60136400D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 IL IL15430101A patent/IL154301A0/xx unknown
- 2001-08-07 CA CA2427475A patent/CA2427475C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 JP JP2002518258A patent/JP2004505992A/ja active Pending
- 2001-08-07 DE DE60116107T patent/DE60116107T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 PL PL362322A patent/PL204736B1/pl unknown
- 2001-08-07 ES ES05077471T patent/ES2314555T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 EA EA200300129A patent/EA006433B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 AT AT01960630T patent/ATE313558T1/de active
- 2001-08-07 DZ DZ013470A patent/DZ3470A1/fr active
- 2001-08-07 DK DK05077471T patent/DK1666487T3/da active
- 2001-08-07 ES ES01960630T patent/ES2254464T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 KR KR1020037001933A patent/KR100804922B1/ko active IP Right Grant
- 2001-08-07 NZ NZ524012A patent/NZ524012A/en unknown
- 2001-08-07 AT AT05077471T patent/ATE412665T1/de active
- 2001-08-07 EP EP05077471A patent/EP1666487B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-08 PE PE2001000786A patent/PE20020287A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-08-08 AR ARP010103790A patent/AR030325A1/es active IP Right Grant
- 2001-08-08 EG EG2001080869A patent/EG25829A/xx active
- 2001-08-10 MY MYPI20013779A patent/MY128999A/en unknown
- 2001-08-10 UY UY26882A patent/UY26882A1/es not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-02-05 IL IL154301A patent/IL154301A/en active IP Right Grant
- 2003-02-07 NO NO20030635A patent/NO20030635L/no unknown
- 2003-02-07 BG BG107545A patent/BG66038B1/bg active Active
- 2003-10-14 HK HK03107371A patent/HK1056884A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-11-03 US US11/266,565 patent/US20060159705A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-03-07 CY CY20061100311T patent/CY1106310T1/el unknown
-
2008
- 2008-12-10 CY CY20081101440T patent/CY1108789T1/el unknown
- 2008-12-23 US US12/342,220 patent/US8624004B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-08-16 JP JP2012180462A patent/JP5559847B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8624004B2 (en) | Purification of HBV antigens for use in vaccines | |
| AU2001282073A1 (en) | Purification of HBV antigens for use in vaccines | |
| WO2003066094A2 (en) | Hepatitis b vaccines | |
| KR19980702480A (ko) | Ｂ형 간염 백신 | |
| JPH09510740A (ja) | クイラヤ サポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤 | |
| JP4974441B2 (ja) | 抗原性凝集物を得る方法と製剤におけるその使用 | |
| NO337659B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |