CZ303217B6 - Zpusob výroby vakcíny proti hepatitide typu B - Google Patents

Zpusob výroby vakcíny proti hepatitide typu B Download PDF

Info

Publication number
CZ303217B6
CZ303217B6 CZ20030385A CZ2003385A CZ303217B6 CZ 303217 B6 CZ303217 B6 CZ 303217B6 CZ 20030385 A CZ20030385 A CZ 20030385A CZ 2003385 A CZ2003385 A CZ 2003385A CZ 303217 B6 CZ303217 B6 CZ 303217B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antigen
vaccine
hepatitis
thiomersal
antigens
Prior art date
Application number
CZ20030385A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2003385A3 (cs
Inventor
Heyder@Koen De
Schu@Peter
Serantoni@Michelle
Opstal@Omer Van
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0019728.5A external-priority patent/GB0019728D0/en
Priority claimed from GB0101334A external-priority patent/GB0101334D0/en
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals S.A. filed Critical Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Publication of CZ2003385A3 publication Critical patent/CZ2003385A3/cs
Publication of CZ303217B6 publication Critical patent/CZ303217B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
    • A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Zpusob výroby vakcíny proti hepatitide B, která obsahuje vycištený povrchový antigen hepatitidy B, který obsahuje méne než 0,025 .mi.g rtuti na 20 .mi.g bílkoviny a pri jehož cištení nebyl použit thiomersal, a farmaceuticky prijatelnou pomocnou látku, pri kterém se antigen cistí tak, že se surový prípravek antigenu hepatitidy B (a) podrobí gelové permeacní chromatografii, (b) podrobí iontove výmenné chromatografii a (c) smísí se s redukcním cinidlem, majícím volnou skupinu -SH, v jehož prítomnosti se dále cistí, a antigen se po vycištení formuluje s farmaceuticky prijatelnou pomocnou látkou do vakcíny, pricemž vakcína je prostá thiomersalu.

Description

Způsob výroby vakcíny proti hepatitidě typu B
Oblast techniky
Tento vynález se týká nového způsobu výroby vakcíny vůči hepatitidě typu B pro použití při léčbě nebo profylaxi infekcí virem hepatitidy B (HBV). Dále se pak týká vakcíny vůči HBV, kterou lze získat novým způsobem podle vynálezu.
Dosavadní stav techniky
Infekce virem chronické hepatitidy B (HBV), pro kterou v současnosti existuje jen omezená léčba, představuje globální problém veřejného zdravotnictví a to problém ohromných rozměrů.
Chroničtí přenašeči HBV, jejichž počet se celosvětově odhaduje na více než 300 milionů, jsou rizikem vývoje chronicky aktivní hepatitidy (zánětu jater), cirhózy a primárního hepatocelulámího karcinomu.
Mnohé vakcíny, které jsou běžně dostupné, vyžadují k prevenci zhoršení kvality konzervační látky. Často používanou konzervační látkou je thiomersal, což je sloučenina obsahující rtuť. Objevily se určitě pochybnosti, které se týkaly použití rtuti ve vakcínách, ačkoli komentátoři zdůraznili, že možná rizika vakcín s obsahem thiomersalu by neměla být zveličována (P. A. Offit, JAMA 283 (16)). Přesto by bylo výhodné nalézt nové a případně bezpečnější způsoby výroby vakcín k nahražení používání thiomersalu ve výrobním postupu. Existuje tedy potřeba vyvinutí vakcíny bez přítomnosti thiomersalu a zejména vakcíny vůči hepatitidě B.
Podstata vynálezu
Podstata vynálezu tvoří způsob výroby vakcíny proti hepatitidě B, která obsahuje vyčištěný povrchový antigen hepatitidy B, který obsahuje méně než 0,025 gg rtuti na 20 pg bílkoviny a při jehož čištění nebyl použit thíomorsal a farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, vyznačující se tím, že se antigen čistí tak, že se surový přípravek antigenů hepatitidy B (a) podrobí gelové permeační chromatografii, (b) podrobí iontově výměnné chromatografii a (c) smísí se s redukčním činidlem, majícím volnou skupinu -SCH, v jehož přítomnosti se dále čistí, a antigen se po vyčištění formuluje s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou do vakcíny, přičemž vakcína je prostá thiomersalu.
Čištění se s výhodou provádí v nepřítomnosti thiomersalu a vyčištěný antigen neobsahuje vůbec žádný thiomersal.
Antigen je s výhodou stálá a vhodně v podstatě tak stálý, jako antigeny hepatitidy, vyčištěný v přítomnosti thiomersalu, jak je například ukázáno zde v Příkladu 1.
Antigen hepatitidy je s výhodou imunogenní.
Redukční činidlo se s výhodou přidává během postupu čištění antigenů, s výhodou po nárůstu buněk, exprimujících antigen.
-TCZ 303217 B6
Redukčním činidlem je s výhodou cystein, dithiothreitol, β-merkaptoethanol nebo glutathion, přičemž nejvíce se upřednostňuje cystein.
Předkládaný vynález tedy v souladu s tím poskytuje způsob výroby stálého imunogenního antige5 nu hepatitidy B, beze stop thiomersalu, který zahrnuje čištění antigenů v přítomnosti cysteinu. Čištění se s výhodou provádí v přítomnosti roztoku cysteinu.
Cystein, ať už ve formě roztoku nebo v práškové formě, se během takového způsobu přidává do konečné koncentrace do 1 do 10 mmol. Γ* a lépe od 1 do 5 mmol. Γ1, Ještě lépe se cystein přidává až k dosažení konečné koncentrace přibližně 2 mmol. I1.
Cystein je s výhodou L-cystein.
Vynález dále poskytuje způsob výroby stálého antigenů hepatitidy B beze stop thiomersalu, při němž se surový antigen podrobí gelové permeační chromatografii, iontově výměnné chromatografii a smíchá se s redukčním činidlem, které má volnou skupinu -SH.
Iontově výměnnou chromatografii je s výhodou aniontově výměnná chromatografie.
Vynález dále poskytuje antigen hepatitidy B, neobsahující thiomersal, který lze získat způsobem výroby podle předkládaného vynálezu, přičemž antigen je alespoň tak imunogenní a antigenní jako antigen, který byl vyrobený v přítomnosti thiomersalu.
Tento vynález dále poskytuje imunogenní antigen hepatitidy B, mající střední poměr bílkoviny, měřený postupem ELISA (enzymovým imunologickým stanovením), větší než 1,5 a obsahem RF1 s alespoň třikrát nižší hodnotou IC5o, než je tomu u povrchového antigenů hepatitidy B, vyrobeného v přítomnosti thiomersalu.
V dalším aspektu se tento vynález týká způsobu výroby antigenů hepatitidy, vhodného pro použití ve vakcíně, přičemž tento způsob zahrnuje čištění antigenů v přítomnosti thiomersalu a následnou úpravu antigenů v přítomnosti redukčního činidla, obsahujícího volnou skupinu -SH.
Po úpravě s výhodou následuje krok čištění, jako je dialyzační krok, k odstranění thiomersalu.
Redukčním činidlem je s výhodou cystein, dithiothreitol, glutathion nebo 2-merkaptoethanol.
Antigen hepatitidy B podle vynálezu může být použit buď pro léčbu nebo profylaxi infekcí hepatitidy B, zvláště pak pro léčbu nebo profylaxi například chronických infekcí hepatitidy B.
Předkládaný vynález dále poskytuje vakcinační prostředek obsahující antigen hepatitidy B podle tohoto vynálezu ve spojení s adjuvantní látkou. Adjuvantní látkou je s výhodou hlinitá sůl nebo preferenční, přednostní stimulátor odpovědi buněk TH1.
Antigenem je s výhodou povrchový antigen hepatitidy B.
Příprava povrchového antigenů hepatitidy B je dobře doložená. Viz například Harford se spoluautory, Develop. Biol. Standard 54, 125, 1983; Gregg se spoluautory, Biotechnology 5, 479, 1987, EP-A-0 226 846, EP-A-0 229 108 a odkazy v uvedených publikacích.
Tak, jak je zde používán, zahrnuje výraz povrchový antigen hepatitidy B jakýkoli antigen HBsAg (povrchový antigen hepatitidy B) nebo jeho fragment, vykazující antigennost povrchového antigenů HBV (viru hepatitidy B). Bude zřejmé, že kromě sekvence 226 aminokyselin antigenu HBsAg (viz Tiollais se spoluautory, Nátuře 317, 489, 1985 a zde uvedené odkazy) může
HBsAg, jak je zde uveden, pokud je to žádoucí, obsahovat část sekvence pre-S či celou sekvenci
-2CZ 303217 B6 pre-S, jak je popsána ve výše uvedených odkazech a v EP-A-0 278 940. HBsAg, jak je zde uveden, může také odpovídat variantám, například únikovému mutantu (escape mutant), popsanému ve WO 91/14703.
HBsAg může také odpovídat polypeptidům, popsaným v EP 0 198 474 nebo v EP 0 304 578.
HBsAg bude normálně v částicové formě. Ve zvláště upřednostňovaném ztělesnění bude HBsAg sestávat zejména z S-antigenu HBsAg, uvedeného výše.
io Vakcína může s výhodou zahrnovat farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, jako je vhodná adjuvantní látka. Vhodné adjuvantní látky jsou obchodně dostupné, jako například Freudovo nekompletní adjuvans a Freundovo kompletní adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Mi); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); hlinité sole jako gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý; sole vápní15 ku, železa ěi zinku; nerozpustná suspenze akrylovaného tyrodinu; acylované cukry; kationtově nebo aniontově derivatizované polysacharidy; polyfosfazeny; biologicky odbouratelné (degradovatelné) mikrokuliěky; monofosforyllipid A a quil A. Jako adjuvantní látky mohou být také použity cytokiny, jako GM-CSF nebo interleukin-2, interIeukin-7 či interleukin-12.
V prostředcích podle tohoto vynálezu se upřednostňuje to, aby adjuvantní sloučenina indukovala imunitní odpověď převážně typu THI. Vysoké hladiny cytokinů typu Thi (například interferonu gama, faktoru nekrózy tumorů alfa, interleukinu 2 a interleukinu 12, tj. IFN-γ, TNFa, IL-2 a IL—12), mají sklon upřednostňovat, indukci buněčně zprostředkovaných imunitních odpovědí na podávaný antigen. V upřednostňovaném ztělesnění, při němž je imunitní odpověď převážně typu THI, se bude hladina cytokinů typu Thi zvyšovat ve větším rozsahu než hladina cytokinů typu TH2. Hladiny těchto cytokinů mohou být snadno určeny za použití standardních stanovení. Pro přehled typů cytokinů viz práci Mosmanna a Cofřmana a Ann. Rev. Immunol. 7, 145—173, 1989.
Vhodné adjuvantní látky pro vyvolání především odpovědi typu THI zahrnují například kombinaci monofosforyllipidu A, s výhodou 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (3D-MPL) spolu s hlinitou solí. Jiné známé adjuvantní látky, které indukují především imunitní odpověď typu THI, zahrnují oligonukleotidy s obsahem cPG. Tyto oligonukleotidy jsou charakterizovány tím, že dinukleotid CpG je nemethylovaný. Takové oligonukleotidy jsou dobře známé a jsou popsány například ve WO 96/02555. Imunostimulaění sekvence DNA jsou také popsány, například Šatem se spoluautory v práci, zveřejněné ve Science 273,352, 1996.
Jinou upřednostňovanou adjuvantní látkou je saponin, s výhodou saponinový produkt QS21 (dostupný od firmy Aquilla Biopharmaceuticals lne., Framingham, MA), který může být použit buď samotný, nebo v kombinaci s jinými adjuvantními látkami. Posílený systém například zahrnuje kombinaci monofosforyllipdu A a saponinového derivátu, jako kombinaci QS21 a 3D-MPL, popsanou ve WO 94/00153, nebo méně reagující prostředek, v němž je QS21 zhášen cholesterolem, jak je popsáno ve WO 96/33739. Jiné upřednostňované prostředky obsahují emulzi typu oleje ve vodě a tokoferol. Zvláště silný adjuvantní prostředek zahrnující QS21, 3D-MPL a toko45 ferol v emulzi typu oleje ve vodě, je popsán ve WO 05/17210.
Zvláště silný adjuvantní prostředek zahrnující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu ve vodě, je popsán ve WO 05/17210 aje upřednostňovaným prostředkem.
Podle jednoho ztělesnění předkládaného vynálezu je zde poskytnuta vakcína, obsahující povrchový antigen hepatitidy B podle tohoto vynálezu, která nadto obsahuje adjuvantní látku, indukující THI. Upřednostňovaným ztělesněním je vakcína, v níž je adjuvantní látka, indukující THI, zvolena ze skupiny adjuvantních látek, obsahující 3D-MPL, QS21, směs QS21 a cholesterolu a oligonukleotid CpG. Jiným upřednostňovaným ztělesněním je vakcína, obsahující povrchový anti gen hepatitidy B, jehož účinek je zesílen monofosforyllipidem A nebo derivátem, QS21 a tokoferolem v emulzi typu oleje ve vodě.
Vakcína s výhodou navíc obsahuje saponin a lépe saponinový produkt QS21. Jiný zvláště vhodný 5 adjuvantní prostředek, obsahující CPG a saponin, je popsán ve WO 00/09159 a je upřednostňovaným prostředkem. Saponinem je v tomto konkrétním prostředku QS21. Prostředek s výhodou navíc obsahuje emulzi typu oleje ve vodě a tokoferok
Předkládaný vynález dále poskytuje vakcinaění prostředek, obsahující povrchový antigen hepatiio tidy B podle tohoto vynálezu v kombinaci s adjuvantní látkou a navíc obsahuje jeden nebo více antigenů, zvolených ze skupiny, sestávající ze záškrtového toxoidu (D), tetanového toxoidu (T), buněčných antigenů černého kašle (Pa), inaktivovaného viru dětské obrny (IPV), antigenů hemophilus influenzae (Hib), antigenů hepatitidy A, viru herpes simplex (HSV), antigenů chlamydií, streptokoka typu B (GSB), lidského papilomaviru (HPV), streptokoka pneumonia a neisserií. is Ve vakcinačním prostředku podle předkládaného vynálezu mohou být rovněž kombinovány antigeny, poskytující ochranu vůči dalším chorobám.
V jednom konkrétním ztělesnění vakcinační prostředek zahrnuje povrchový antigen hepatitidy B, který lze získat způsobem výroby podle tohoto vynálezu, společné s adjuvantní látkou a inaktivo20 váným virem dětské obrny.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob léčby a/nebo profylaxe infekcí viru hepatitidy B, který zahrnuje podávání bezpečného a účinného množství vakcíny podle tohoto vynálezu v profylaxi anebo léčbě infekce hepatitidy B lidskému nebo živočišnému subjektu, trpícímu infekcí virem hepatitidy B, nebo náchylného k takové infekci.
Tento vynález dále poskytuje použití povrchového antigenů podle předkládaného vynálezu k výrobě léku pro léčbu pacientů trpících infekcí způsobenou virem hepatitidy B, jako je chronická infekce virem hepatitidy B.
Vakcína podle předkládaného vynálezu bude obsahovat imunoprotektivní množství antigenů (množství, dostačující k vyvolání imunitní ochrany) a může být vyráběna běžnými postupy.
Vakcinační prostředek je obecně popsán v: Pharmaceutical Biotechnology, dílu 61, ''Vaccine 35 Design - the subunit and adjuvant approach, vydavatelů Powella a Newmana, Plenům Press,
1995. New Trends and Development in Vaccines, vydavatelé Voliér a spol., University Parke
Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Opouzdření (enkapsulace) do liposomu je popsána například Fullertonem v patentu US 4 235 877. Spojení (konjugace) bílkovin do makromolekul je uvedeno například Likhitem v patentu US 4 372 945 a Armorem se spoluautory v patentu
SU 4 474 757. Použití látky Quill A je popsáno Daisguaardem s spoluautory v Acta Vet. Scand.
18, 349, 1977. 3D-MPL je dostupný od firmy Ribi Immunochem, USA a je popsán v britské patentové přihlášce 2220211 a v patentu US 4 912 094. QS21 je popsán v patentu US 5 057 540.
Předkládaný vynález je ozřejměn, ne však omezen, následujícími příklady,
-4CZ 303217 Β6
Přehled obrázků na výkresech
V následujících příkladech provedení vynálezu:
Obr. 1 znázorňuje výrobní postup pro vakcínu Engerix BrM bez thiomersalu.
Obr, 2 znázorňuje analýzu šarží objemových antigenů prostřednictvím SDS-PAGE (elektroforézy v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsuifátu sodného); barvení bylo provedeno stříbrem; 1 pg bílkoviny na vzorek;
polohy označovaěů, markérů molekulové hmotnosti jsou vyznačeny černými skvrnami: 92 500, 66 200, 45 000, 31 000, 21 500, 14 400.
Obr. 3 znázorňuje zbytkové kvasinkové bílkoviny v šaržích objemových antigenů, vyráběných postupem bez thiomersalu. Jedná se o metodu Western blottiing s králičím sérem proti kvasinkovým bílkovinám.
Polohy označovaěů, markérů molekulové hmotnosti jsou vyznačeny černými skvrnami: 92 500, 66 200,45 000,31 000,21 500, 14 400.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Způsob výroby povrchového antigenů hepatitidy B v přítomnosti thiomersalu
Povrchový antigen hepatitidy b (HBsAg) z monovalentní vakcíny vůči hepatitidě B, poskytovaný firmou SB Biologicals (Engerix B™) se exprimuje jako rekombinantní bílkovina v Saccharomyces cerevisiae (viz Harford se spoluautory, zde již uvedeno jako citace). Bílkovina o velikosti 24 000 se vyrábí nitrobuněčně a hromadí se v rekombinantních buňkách kvasinek. Na konci kvašení se buňky kvasinek shromáždí (sklidí) a rozruší se v přítomnosti jemné povrchově aktivní látky, jako je Tween 20 (monolaurát polyoxyethylensorbitanu), k uvolnění požadované bílkoviny. Následně se buněčný homogenát, obsahující rozpustné částice povrchového antigenů, přečistí v sérii srážecích kroků a poté se zahustí ultrafiltrací.
Další čištění rekombinantního antogenu se provádí následnými chromatografickými separacemi. V prvním kroku se koncentrát surového antigenů podrobí gelové permeační ehromatografií na sloupci Sepharose 4B medium. Thiomersal je přítomný v elučním pufru pro krok permeační chromatografie na 4B gelu. Eluční pufr má následující složení: lOmmol.l'1 Tris, 5% ethylenglykol., pH 7,0; 50 mg/l thiomersalu. Thiomersal je do tohoto pufru začleněn pro kontrolu biologického zatížení.
Většina uvedeného množství thiomersalu je odstraněna v následujících krocích čištění, které zahrnují iontově výměnnou ehromatografií, ultracentrifugaci a odsolení (gelovou permeační ehromatografií), takže vyčištěné objemové antigenní prostředky, připravené působením, originálním způsobem výroby, obsahují přibližně 1,2 pg a méně než 2 pg thiomersalu na 20 pg bílkoviny.
Krok iontově výměnné chromatografie se provádí za použití DEAE-martixu a spojené podíly (pool) se potom podrobí ultracentrifugaci na cesiovém gradientu za použití čtyř předem připravených vrstev o různých koncentracích chloridu cesia. Antigenní částice jsou v gradientu odděleny od znečišťujících buněčných částic v závislosti na své hustotě a na konci postupu odstřeďování
-5CZ 303217 B6 jsou eíuovány. Chlorid cesia je z tohoto podílu následně odstraněn druhým krokem gelové permeační chromatografie za použití gelu Sepharose.
Pokud se HBsAg připravuje způsobem, obsahujícím thiomersaí ve 4B gelovém permeačním pufru, jsou ve spojených podílech zCSCl gradientu, obsahujících HBsAg, nalezeny koncentrace bílkovin vyšší než 30 mg/ml, odpovídající příslušným koncentracím HBsAg, stanoveným za použití sady AUSZYME od Abbott Laboratories.
Krok ultracentrifugace v gradientu CsCl obvykle z prostředku HBsAg eliminuje zbytkové tuky, io DNA a menší bílkovinná znečištění. Provádí se zonálním odstřeďováním v rotoru Ti 15 od firmy
Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornie při rychlosti 30 000 otáček za minutu po dobu přibližně 40 až 60 hodin. Vzorek, ktetý má být vyčištěn, se nanese na vrstvy roztoku CsCl o konečných koncentracích 0,75; 1,5; 2,5 a 3,25 mokl'1 CSCL Na konci odstřeďování je gradient eluován do podílů. Podíly, obsahující BHsAg, mohou být určeny absorbancí UV světla při 280 nm nebo testováním naředění podílů pomocí sady AUSZYME. Pruh HBsAg se nachází v hustotě 1,17 až
1,23 g/cm’.
Roztok, obsahující vyčištěný HBsAg, je před použitím k výrobě vakcinačního prostředku sterilně filtrován.
Čištění z buněčného lyzátu kvasinek je komplexní děj, neboť antigen je vytvářen nitrobuněčně a k získání čistého objemového antigenů je nezbytná celá série separačních (oddělovacích) technik, sestavená k odstranění různých typů (kvasinkového) znečištění. Kroky čištění jsou důležité, neboť produkt, jež má být vyčištěn, je lipoproteinová částice, obsahující mnohočetné kopie poly25 peptidu povrchového antigenů a tato struktura musí být během procesu čištění zachována. Je zvláštností tohoto procesu, že poskytuje částice povrchového antigenů, které jsou plně imunogenní bez nutnosti dalšího chemického ovlivnění ke zvýšení jejich imunogenity (srovnej EPO 135 435).
Podrobnosti o způsobu výroby jsou dále popsány v EP 0199698.
Příklad 2
Výroba a charakterizace HBsAg získaného z kvasinek postupem bez thiomersalu.
1. Výroba a čištění HBsAg, získaného z kvasinek
1.1. Přehled výrobního způsobu
Povrchový antigen hepatitidy B může být vyráběn kvašením vhodného kmene Saccaromyces cerevisiae, například takového, jaký popsal Harford se spoluautory (citováno výše).
Na konci kvašení rekombínantního kmene kvasinek ve velkém měřítku se buňky sklidí (shromáž45 dí se) a otevřou se rozštěpením v přítomnosti jemné povrchově aktivní látky, jako je Tween 20.
Povrchový antigen je pak isolován vícekrokovým exktraktním a purifikačním postupem přesně tak, jak bylo popsáno výše, v Příkladu 1, až do kroku první gelové permeace na Sepharose 4B.
1.2 Postup čištění bez thiomersalu
Do postupu bez přítomnosti thomersalu byly oproti postupu, popsanému v Příkladu 1, začleněny následující dvě změny.
1. Eluční pufr, používaný v kroku permeační chromatografie v gelu 4B, již neobsahuje thio55 mersal.
-6CZ 303217 Β6
2. Do eluovaných spojených podílů (poolu) z kroku an iontově výměnné chromatografie se přidá cystein (o konečné koncentraci 2 mmol.l·1).
Bylo zjištěno, že výsledkem odstranění thíomersalu z pufru pro permeační chromatografii v gelu 4B může být vysrážení částic BHsAg. během kroku odstřeďování v hustotním gradientu CsCl s úbytkem produktu a agregací či shlukováním získaného antigenu.
Přidání cysteinu v konečné koncentraci 2 mmol.l·1 k eluovaným spojeným podílům z předchozího kroku aniontově výměnné chromatografie zabraňuje srážení a úbytku antigenu během odstřeďování v hustotním gradientu CsCl.
Pro takové ovlivnění je cystein upřednostňovanou látkou, neboť se jedná o přirozeně se vyskytující aminokyselinu, která může být odstraněna v následujícím kroku odsotení na sloupci pro gelovou permeační chromatografii za použití Sepharose 4BCLFF jako matrixu sloupce.
Ve srovnání s postupem, popsaným v Příkladu 1, už nedošlo k žádným jiným změnám výrobního postupu.
Postup, při němž se nepoužívá thiomersal, poskytuje objemový antigen, mající čistotu a vlastnosti srovnatelné s antigenem, získaným postupem podle Příkladu 1,
I. 2a
Předpokládá se, že thiomersal, přidaný do pufru pro 4B gelovou chromatografii v koncentraci 50 pg/ml, se rozkládá a výsledná ethylrtuť se může kovalentně vázat na volné sulfhydrylové skupiny na cysteinových zbytcích bílkoviny. Bílkovina obsahuje 14 cysteinových zbytků, z nichž 7 se nachází mezi polohami 101 a 150.
Tato oblast bílkoviny se pokládá za ležící na povrchu částice a obsahující hlavní antigenní oblast HBsAg, zahrnující imunodominantní a oblast a rozpoznávací místo pro monoklonální protilátku RF1 (J. Waters se spoluautory, Postgrad, Med. 63(2), 51-56, 1987 a Ashton-Rickardt a Murray,
J. Med. Virology 29, 196, 1989). Antigen, čištěný s thiomersalem, přítomným v pufru pro 4B gelovou permeační chromatografii, obsahuje na konci postupu čištění přibližně 0,5 až 0,6 pg rtuti. Tato rtuť není jednoduchou dialýzou plně odstraněna.
V jednom pokusu bylo v objemovém antigenním prostředku naměřeno 0,56 pg rtuti na 20 pg bílkoviny. Tento prostředek byl dialyzován 16 hodin při teplotě místnosti proti pufru o pH 6,9. Obsahujícímu 150 mmol.l·1 roztok NaCI a 10 mmol.l·1 roztok NaPO4. Na konci dialýzy byla naměřena koncentrace 0,33 pg rtuti na 20 pg bílkoviny.
Naproti tomu dialýza v přítomnosti redukčního činidla, jako je L-cystein v koncentraci od 0,1 do 5,0 mg/ml, dithiothreitol v koncentraci 50 mmol.l'1 nebo 2-merkaptoethanol v koncentraci 0,5 mmol.l1, po níž následuje další dialýza k odstranění redukčního činidla, poskytuje snížení obsahu rtuti v antigenním prostředku na méně než 0,025 pg rtuti na 20 pg bílkoviny. To je nejnižší detekční hranice této metody.
Obsah rtuti byl stanoven za pomoci absorpční spektrofotometrie. Antogen byl nareděn v roztoku, obsahujícím 0,01 % (hmotnost/objem) dichromanu draselného, K2Cr2O? a 5 % (objem/objem) kyseliny dusičné. S thiomersalem jako zdrojem rtuti byly připraveny standardní roztoky atomová absorpce vzorku a standardních roztoků se měří po odpaření v generátoru páry, s katodou specifickou pro rtuť, při vlnové délce 253,7 nm. Atomová absorpce zředěného roztoku se měří jako slepý pokus (blank). Obsah rtuti ve vzorku se počítá pomocí kalibrační křivky, získané z hodnot, naměřených ve standardních roztocích. Výsledky jsou vyjádřeny jako pg titru na pg bílkoviny.
—-7CZ 303217 B6
1.3 Výroba objemového antigenu bez thiomersalu
Výrobní kroky, týkající se čištění objemu antigenu, jsou znázorněny na obr. 1.
1.4. Složení vakcíny, formulované bez thiomersalu
Typické kvantitativní složení vakcíny proti hepatitidě B bez konzervační látky a formulované z antigenu, připraveného postupem bez thiomersalu, je uvedeno v Tabulce 1.
io
Tabulka 1
ll složka množství v ml
aktivní složka - bílkovina, tvořená z alespoň 95 % HBsAg 20 gg
hydroxid hlinitý (adsorbent), vyjádřený jako AI2O3 0,95 mg
chlorid sodný 9,0 mg (max)
I dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného 0,98 mg
dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného 0,71 mg
i voda pro injekce dle potřeby do i . . 1,0 ml
Složení se může měnit přidáním 3D-MPL a/nebo jiných adjuvantních látek.
2, Charakterizace objemového antigenu a vakcíny, vyráběné postupem bez thiomersalu
2.1 Testy a stanovením prováděné u vyčištěného objemového antigenu
2.1.1. Základní srovnání
Postupem bez thiomersalu podle tohoto Příkladu (Příklad 1.2) byly připraveny tři šarže objemového antigenu a byly označeny jako HEF001, HEF002 a HEF003. Ty byly srovnávány s šarží objemového antigenu (HEP2055), připravenou předchozím postupem (popsaným v Příkladu 1) v přítomnosti thiomersalu.
2.1.2 Testy a stanovení, prováděné u objemového antigenu
Testovány byly tři šarže objemového antigenu, vyrobené postupem bez thiomersalu a výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2.
Obsah bílkoviny byl měřen postupem podle Lowiyho a spoluautorů (J. Biol. Chem. 193, 265, 1951).
Obsah endotoxinu byl měřen Limulusovým postupem hrudkovatění gelu (Limulus gel clotting technique) za použití obchodně dostupné sady od Firmy Cápe Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA. Reakční činidlo je standardizováno vzhledem ke standardu US Pharm. Endotoxin Reference Standard.
-8CZ 303217 B6
Tween 20 (monolaurát polyoxyethylensorbitanu) byl měřen postupem podle Huddlestona a Allreda (J. Amer. Oil Chemist Soc. 42 983, 1965).
Obsah HBsAg byl měřen obchodně dostupnou sadou AUSZYME od firmy Abbott Laboratories,
Dne Abbott Park Rad, Abbott Park, IL 60064, USA. Použit byl postup B, uváděný výrobcem. Ke stanovení křivky závislosti na dávce byla jako standard použita šarže objemového antigenů, čištěného postupem, využívajícím thiomersal.
Polysacharidy byly měřeny postupem podle Dubiose a spoluautorů (Anal. Chem. 28, 350, 1956). io
Lipidy byly měřeny za použité obchodně dostupné sady (Merkotest Total Lipids 3321) od firmy E. Merck, Β. P. 4199, Darmstad D-6100, Německo.
Obsah DNA byl měřen prahovou metodou (Treshold method) za použití zařízení a reagencií, t5 dostupných od firmy Molecular Devices Corp., Gutenbergstrasse 10, Ismanning, Mnichov,
Německo.
Hodnoty, získané v testech a stanoveních, jsou v rozmezí, které se uplatňuje pro šarže objemových antigenů, vyrobené za použití thiomersalu v elučním pufru pro krok gelové permeační chromatografie na Sepharose 4B, s výjimkou antigenní aktivity, měřené testem ELISA. Hodnoty naměřené v tomto testu pro tři prostředky HEF jsou vyšší (1,63-2,25) než hodnoty, zjištěné pro šarži objemového antigenů HEP2055, kde byl poměr ELISA/bílkovina 1,13. Poměry ELISA/bílkovina, měřené pomocí sady AUSZYME u šarží objemového antigenů obsahujících thiomersal, jsou obecně přibližně 1,0 a v rozmezí od 0,8 do 1,2; velmi zřídka pak překračují hodnotu 1,4.
2.1.3 SDS-PAGE analýza
Prostředky objemového antigenů byly zkoumány za použití analýzy SDS-PAGE v redukčních podmínkách a barvení prostřednictvím modři Coodmassie blue. Veškeré vzorky vykazovaly hlavní proužek o velikosti 24 000 se stopami dimemí bílkoviny. Vzorky byly posouzeny jako mající vysokou čistotu (> 99 % Čistotu), jak bylo prokázáno nepřítomností viditelných proužků znečišťujících bílkovin.
Vzorky (1 μg) prostředků objemového antigenů byly testovány prostřednictvím SDS-PAGE v re35 dukujících a neredukujících podmínkách a za barvení stříbrem (Obr. 2). V redukujících podmínkách vzorky vykázaly intenzivní proužek, pohybující se v oblasti hodnoty 24 000 se stopami dimemích a multimemích forem. Vzorky gelů byly nerozlišitelné od vzorku HEP2055, použitého ke srovnání. Vzorky byly podrobeny také zkoumání v neredukujících podmínkách. Za takových podmínek se méně materiálu pohybovalo s oblastí 24 000 a množství polypeptidů, pohybujícího se v dimemích a multimemích polohách, vzrostlo. Šarže objemového antigenů bez thiomersalu se zdají mít poněkud vyšší stupeň polymerizace, než srovnávací šarže HEP2055.
Identita polypeptidů 24 000, prokázaného barvivém Coomassie blue nebo stříbrným barvením, byla potvrzena metodou Western blotting s králičími polyklonálními protilátkami vůči plas45 matickému HBsAg. Prostředky objemového antigenů vykazují hlavní proužek v oblasti 24 000 spolu s dimemími a trimemími formami. Technika prokázala menší stopy rozpadových produktů bílkoviny povrchového antigenů. Nebyly nalezeny žádné rozdíly mezi objemovým antigenem, připraveným postupem bez použití thiomersalu a šarží HEP2055.
Přítomnost zbytkových kvasinkových bílkovin byla stanovována analýzou prostřednictvím SDSPAGE v redukujících podmínkách a metodou Western blotting s králičím polyklonálním antisérem vůči kvasinkovým bílkovinám (Obr. 3). Tato technika je kvalitativní a neumožňuje kvantifikaci nečistot.
- 9--CZ 303217 B6
Pro tri šarže objemového antigenů, připravené postupem bez použití thiomersalu, i pro šarži HEP2055 je prokázán stálý profil proužků jen s jednou výjimkou.
Silně zbarvený proužek, přítomný v oblasti ± 23 000 u objemového antigenů HEP2055, je prak5 ticky nepřítomný u tří prostředků HEF. Metoda Western blotting prokázala, že výsledkem čisticího postupu bez thiomersalu je čistší antigenní produkt.
Tabulka 2: Výsledky testů a stanovení provedených na vyčištěném, objemovém antigenů bez io thiomersalu
TEST VÝSLEDEK --Ί
HEF001 HEF002 HEF003 HEP2055
pH 6.8 6,8 l 6,8 6,8
obsah bílkoviny dle Lowryho metody 1312 pg/ml í t 888 ug/ml 913 pg/ml 995 pg/ml
obsah endotoxinu < 0,25 EU < 0,25 EU < 0,25 EU < 0,25 EU
obsah Tween 20 7,1 pg 6,6 pg 7,4 pg 5,8 pg
antigenní aktivita (v testu ELISA) 2957 pg/ml 1505 pg/ml 1486 pg/ml 1128pg/ml
poměr ELISA/bílkovina 2,25 r 1,69 1,63 1,13
obsah polysacharidů 0,33 pg 0,35 pg 0,33 pg 0,34 pg
obsah tuků 13,7 ng 12,8 pg 12,9 pg 11,8 pg
obsah DNA dle Tresholda <1 pg <1 pg <1 pg <1 pg
2.1.4. Další biochemické testy a stanovení
2.1.4.1. Obsah DNA
Obsah DNA byl u tří šarží objemového antigenů měřen prahovou metodou (Treshol method, Molecular Davices Corp.). Měřená množství byla menší než 10 pg DNA na 20 pg bílkoviny (Tabulka 2); Stejná hodnota obsahu DNA byla pozorována u objemového antigenů, vyráběného běžně schváleným způsobem.
-10CZ 303217 B6
2.1.4.2. Aminokyselinové složení
Aminokyselinové složení tří šarží objemových antigenů HEF bylo určováno po kyselé hydro lýze s 6 mol.l'1 roztokem HCI, chromatografii aminokyselin na iontově výměnném sloupci s detekcí ninhydrinem po opouštění sloupce. Prolin a tryptofan nebyly stanovovány. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3.
Nalezená složení souhlasí se složením, určených pro HEPT2055 a s předkládaným složením, odvozeným ze sekvence DNA. 1 když počet glycinových zbytků, naměřený pro HEP 2055, je blízký očekávanému složení, hodnota 16 až 17 je obvykleji naměřena pro objemné antigenní prostředky. Průměrný počet nalezených cysteinových zbytků se rovnal předkládaným čtrnácti, což ukazuje, že v důsledku ovlivněn při kroku na gradientu CsCI se na částici nenavazují žádné další cysteiny.
2.1.4.3.
Množství volného cysteinu, přítomného v objemových antigenních prostředcích, získaných podle zde popsaného způsobu, bylo měřeno po oxidaci částic kyselinou permravenčí bez předchozí ky20 sele hydrolýzy. Oxidované volné cystěinové zbytky byly odděleny na iontově výměnném sloupci s detekcí ninhydrinem po opuštění sloupce. Detekční mez cysteinu při použití tohoto postupu je 1 pg na 1 ml.
U tří antigenních prostředků HEF nebylo možné během jejich testování při počátečních koncent25 racích bílkovin, uvedených v Tabulce 2, naměřit žádný volný cystein.
Tento postup měří jak volné cystě inové zbytky, přítomné v pufru, tak i cystě inové zbytky, které jsou připojeny na bílkovinu HBsAg dísulfidickou vazbou, ale nevytvářejí část polypeptidové sekvence.
2.1.4.4. Sekvenční analýza N-konce
Přítomnost možných bílkovinných znečištění a degradačních produktů ve třech šaržích objemového antigenu, vyráběných modifikovaným způsobem, byla určována sekvenční analýzou N35 konce na základě Edmanova odbourávání. N-koncová sekvence MENITS... bílkoviny HBsAg byla detegována bez interference s ostatními sekvencemi. Bylo také potvrzeno, že N-koncový methionin je z 60 až 75 % blokován acety lácí, jak již bylo pozorováno drive u polypeptidu HBsAg, vyráběného rutinním postupem.
-rrCZ 303217 B6
Tabulka 3: Aminokyselinová složení HBsAg.
aminoky- selina HEF001 HEF002 HEF003 prúm. složen; HEP2055 předpokf složení
Asp 11,3 11,3 11,3 11,3 11,5 10
Thr 17,5 17,4 17,2 17,4 17,8 17
Ser 21,4 21,6 21,4 21,5 20,9 23
Glu 11 11 11 11 10,5 9
Pro nestán. nestán. nestán. nestán. 24
Gly 17,1 16,8 16,7 16,9 14,6 14
Ala 7,5 7,4 7,4 7,4 7,2 6
Cys 12,3 14,95 14,9 14,1 13,2 14
Val I 10,9 I 11, 0 t 10,9 10,9 10,7 11
Met 6,8 6,7 4,1 ί 6·9 7,1 6
Ile 12,3 12,4 12,5 12,4 12,2 16
Leu 26,3 26,6 26,2 26,4 26,7 33
Tyr 6,8 6,8 6,8 6,8 7 6
Phe 13,8 13,9 13,8 I 13,8 13,9 15
His 3 2,8 3,3 3,0 3.3 1
Lys 4 4 3,9 4,0 4,2 3
Arg : 5-7 5,8 5,7 5,7 6,1 5
Trp nestán. nestán. nestán. nestán. 13
2.1.4.5. Analýza rozptylem laserového světla
U částic HBsAg, vyrobených za použití modifikovaného způsobu a u referenční šarže HEP2055 bylo provedeno srovnání velikosti částic za použití rozptylu laserového světla (Tabulka 4). Stanovené střední molekulové hmotnosti prokázaly dobrou shodu mezi prostředky.
- 12 CZ 303217 B6
Tabulka 4: Molekulové hmotnosti částic HBsAg, stanovené rozptylem laserového světla
šarže antigenů molekulová hmotnost
HEF001 3,07.106
HEF002 2,76.10®
HEF003 2,76.10®
HEP2055 3,34.10®
2.1,4.6 Elektronová mikroskopie
Prostředky objemového antigenů byly testovány za použití elektronové mikroskopie pro fixaci, znehybnění, a barvení uranylacetátem.
Pozorované částice byly ve všech vzorcích podobné a odpovídaly ±20 nm téměř kulovitým (ve formě kočičích hlav) Částicím, které jsou typické pro HBsAg. Částice, pozorované ve třech io šaržích HEF, byly nerozlišitelné do částic HEP2055.
2.1.5. Imunologické analýzy
2.1.5.1. Reaktivita (schopnost reakce) s monoklonální protilátkou RF1
Tři prostředky objemového antigenů byly testovány vzhledem ke své schopnosti reagovat s monoklonální protilátkou prostřednictvím inhibice stanovené ELISA. Bylo prokázáno, že monoklonální protilátka RF1 chrání šimpanze vůči napadení HBV a předpokládá se, že rozpoznává ochranný konformační epitop na částici HBsAg (S. Iwarson se spoluautory, J. Med. Virol. 16,
89-96, 1985).
Hybridom (produkt tuze lymfocytů) RF1 může být množen v břišní dutině myší kmene Balb/c, nebo ve tkáňové kultuře.
Ascitická tekutina, naředěná v poměru 1:50 000 v saturačním pufru (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, PBS, s obsahem 1% hovězího sérového albuminu, BSA a 0,1% Tween 20), byla smíchána v poměru 11: s různými naředěními testovaných vzorků HBsAg v PBS (konečné koncentrace se pohybovaly v rozmezí od 100 pg do 0,05 pg/ml).
Směsi byly inkubovány v destičkách Nunc Immunoplates (o 96 jamkách) po dobu 1 hodiny a při teplotě 37 °c. Poté byly převedeny do destiček, potažených standardním prostředkem HBsAg, na 1 hodinu při 37 °C. Standardním prostředkem HBsAg byla šarže objemového antigenů (Hep 286), vyčištěná způsobem, využívajícím thiomersal. Po kroku promytí prostřednictvím PBS s obsahem 0,1 % Tween 20 byl přidán biotinem konjugovaný ovčí anti-myší IgG, naředěný v po35 měru 1:1 000 v saturačním pufru a inkubován 1 hodinu při teplotě 37 °C.
Po kroku promytí byl do stejných jamek přidán streptavidin-biootinýtovaný peroxidázový komplex, naředěný v poměru 1:1 000 v saturačním pufru a inkubován 30 minut při 37 °C. Destičky byly promyty a inkubovány s roztokem 0,04 % OPDA a 0,03 % H2O2 v 0,1 mol.l1 citrátovém pufru o pH 4,5 po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Reakce byla stanovena přídavkem 1 mol.f1 H2SO4. Poté byly při vlnových délkách 490/630 nm měřeny optické hustoty O.D. a vyneseny do grafu.
·. ts
Hodnota IC50, definovaná jako koncentrace antigenů (koncentrace inhibitoru), která inhibuje z 50 % vazbu protilátky na povlečený HBsAg,. byla vypočítána za použití rovnice o 4 proměnných a byla vyjádřena v ng/ml.
Testovány byly rovněž série šarží HEP antigenů včetně HEP2055, spolu s antigenem Herpes simplex gD jako negativní kontrolou. Stanovení určuje schopnost každého testovaného antigenů inhibovat vazbu RF1 ke standardnímu antigennímu přípravku (HEP286), navázanému na mikrotitrační destičku.
ío Tabulka 5 udává koncentrace každého antigenů, u nichž bylo prokázáno, že z 50 % inhibují vazbu RF1 na znehybněný antigen.
Tabulka 5: Inhibice vazby monoklonální protilátky RF1 na HBsAg
objemový antigen IC50 (ng/ml)*
HEP286 3834
HEP673 3437
HEP720 3150
HEP2055 ... 2384
i
HEF001 468
HEF002 574
HEF003 540
*1C5O = koncentrace antigenů (ng/ml), inhibující z 50 % vazbu RF na znehybněný antigen
Výsledky ukazují, že k inhibování vazby RF1 je potřeba čtyřnásobně až sedminásobně menší množství antigenů HEF (viz Tabulka 5). To ukazuje, že antigen, připravený modifikovaným, po20 změněným způsobem, vykazuje ve srovnání s objemovým antigenem HEP zvýšenou presentaci epitopu RF1.
Stejný typ inhibičního stanoveni byl proveden za použití lidského séra lidí, očkovaných místo fragmentem mAb RF1 prostředkem Engerix B™, a v takovém případě nebyly zjištěny rozdíly mezi šaržemi angenu HEP a antigenů HEF.
2.1.5.2. Afinita k vazbě monoklonální RF1
Kinetické parametry vazba monoklonální protilátky RF1 ke třem šaržím antigenů HEF ak 30 HEP2055 byly měřeny povrchovou plasmovou rezonancí za použití zařízení Biacore 2000 od firmy Amersham Pharmacia Biotech, Amershym Plače, Little Chalfont, Bucks, Velká Británie.
měřenými kinetickými parametry byly:
ka: asociační konstanta (níÝ1) kd: disociační konstanta (s*1)
Ka: rovnovážná nebo afínitní konstanta (m'1)
- 14CZ 303217 B6 ka přičemž Ka - kd
Nalezené hodnoty jsou uvedeny v Tabulce 6.
Tabulka 6: Afinitní konstanty vazby RF1 k HBsAg
objemový antigen ka (x 10'3) kd (x 105) Ka (x 10 7)
HEF001 6,81 3,21 21,97
HEF002 6,89 3.73 18,83
HEF003 7,39 4,67 15.80
HEP2055 3,31 6,30 5,31
io Tři šarže antigenů HEF poskytují podobné asociační/disociační konstanty a hodnoty vazebné afinity. Na rozdíl od nich má HEP2055 slabší afinitu pro vazbu k RF1.
Zjištěné skutečnosti jsou v souladu s výsledky z inhibičního stanovení ELISA, které prokázalo, že antigen, připravený způsobem bez použití thiomersalu, vykazuje zvýšenou presentaci epito15 puRFl.
2.2. Test a stanovení za použití vakcíny, formulované s antigenem, vyrobeným pozměněným způsobem
Tři šarže antigenů HEF byly adsorbovány na hydroxid hlinitý a formulovány jako vakcína o složení, uvedeném v Tabulce 1. Balením je dávka pro dospělé v lahvičkách (20 pg antigenní bílkoviny v 1 ml). Šarže byly označeny jako DENS001A4, DENS002A4 a DENS003A4.
Síla (účinnost) vakcíny byla měřena stanovením obsahu antigenů in vitro za použití sady od
Abbott Laboratories AUSZYME ELISA kit a klasické šarže vakcíny, formulované s 50 pg thiomersalu v 1 ml, jako standardu. Účinnost vakcíny byla měřena za použití metody B, popsané v PharmaEuropa Speciál Issue Bio97-2 (prosinec 1997). Tři šarže HEF poskytly vyšší hodnoty obsahu antigenů, které byly ve srovnání s určeným obsahem 20 pg antigenní bílkoviny téměř dvojnásobné.
2.2.1 Reaktivita vakcíny DENS s monoklonální protilátkou RF1
Antigennost adsorbované vakcíny byly dále testována v inhibiěním stanovení s monoklonální protilátkou RF1. Stanovení měří schopnost vzorku vakcíny inhibovat vazbu RF1 na znehybněný objemový antigen (HEP286).
Ascitická tekutina, naředěná v poměru 1 : 50 000 v saturaěním pufru (PBS, obsahující 1% BSA a 0,1% Tween 20), byla v pomru 1 : 1 smíchána s různými zředěnými vzorků vakcín, které měly být testovány, v PBS (koncentrace se pohybovaly od 20 pg/ml do 0,05 pg/ml.
Směsi byly za protřepávání inkubovány v destičkách Nunc Immunoplates (o 96 jamkách) po dobu 2 hodin a při teplotě 37 °C. Poté byly převedeny do destiček, potažených prostředkem HBsAg. Prostředkem HBsAg, použitým pro potažení, byla šarže objemového antigenů (Hep
X3CZ 303217 B6
286), vyčištěná způsobem, využívajícím thiomersal. tyto destičky pak byly za protřepávání inkubovány 2 hodiny při 37 °C. Po kroku promytí prostřednictvím PBS s obsahem 0,1 % Tween 20 byl přidán biotinem konjugovaný ovčí anti-myší IgG, naředěny v poměru 1:1 000 v saturačním pufru a inkubován 1 hodinu při teplotě 37 °C. Po kroku promytí byl do stejných jamek přidán streptavidin-biotinylovaný peroxidázový komplex, naředěný v poměru kl 000 v saturačním pufru a inkubován 30 minut pri 37 °C. Destičky byly promyty a inkubovány s roztokem 0,04 % OPDA a 0,03 % H2O2 v 0,1 mol.l'1 citrátovém pufru o pH 4,5 po dobu 20 minut pri teplotě místnosti. Reakce byla zastavena přídavkem 1 molT1 H2SO4. Poté byly při vlnových délkách 490/630 nm měřeny optické hustoty O.D. a vyneseny do grafu.
io
Hodnota ID50, definovaná jako koncentrace antigenu (koncentrace inhibitoru), která inhibuje z 20 % vazbu protilátky na povlečený HBsAg, byla vypočítána za použití rovnice o 4 proměnných a byla vyjádřena v ng/ml.
is Vakcína, vyrobená z objemového antigenu, získaného pozměněným způsobem, byla srovnána s vakcínou Engerix B™, formulovanou za použití klasického objemového antigenu HEP a bez thiomersalu jako konzervačního činidla.
Stanovení bylo prováděno trojmo.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7 a ukazují, že k dosažení 50% inhibice vazby RFI je ve srovnání s vakcínou Engerix B™ bez konzervační látky vyžadována přibližně polovina množství vakcíny DENS. To odráží zvýšenou prezentaci epitopu RFI na antigenu HEF/DENS a je v souladu s testy, prováděnými s protilátkou RF 1 na vyčištěném objemovém antigenu.
Tabulka 7: Inhibice vazby RFI formulovanou vakcínou
šarže vakcíny IC50 (ng/ml)(1>
1 pokus průměr
2 3
DENS001A4 913 662 603 726
DENS002A4 888 715 521 708
DENS003A4 817 685 582 695
ENG5100A2 1606 1514 1481 1534
ENG3199B9 1329 1170 1286 1262
ENG3328A9 1417 1194 1334 1315
(1) koncentrace vakcíny, inhibující z 50 % vazby protilátky Rl na znehybněný antigen
2.2.2. ímunogennost vakcíny DENS u myší
Studie byla provedena na myších kmene Balb/C pro srovnání imunogennosti tří šarží DENS a prostředku Engerix B™, vyráběného podle běžného způsobu výroby antigenu a formulovaného s thiomersalem.
- 16CZ 303217 B6
Testovány by ly nás 1 eduj íc í Šarže:
DENS001A4
DENS002A4 5 DENS003A4 a ENG2953A4/Q pro srovnání.
Stručně uvedeno, skupiny 12 myší byly dvakrát v intervalu 2 týdnů intramuskulárně imunizovány dávkami vakcíny, které odpovídaly 1/10 (2 pg) nebo 1/50 (0,4 pg) dávky pro dospělého člověka, io Ze séra, odebraného v den 28, byly určeny protilátková odpověď vůči HBsAg a isotypový profil, indukovaný očkováním.
Uspořádání pokusu
Skupiny 12 myší kmene Balb/C byly v den 0 a v den 15 intramuskulárně imunizovány do obou zadních tlapek (2 x 50 pg) následujícími dávkami vakcíny:
Tabulka 8: Skupiny a dávka vakcíny
skupina vakcína objem dávka
i antigenů
1 DENS001A4 100 μΙ 2 ng
2 - zředěná 5x v PO4/NaCI 100 μί 0,4 μ9
3 DENS002A4 100 μΙ 2 μδ
4 - zředěná 5x v PO4/NaCI 100 μΙ 0,4 μς
5 DENS003A4 100 μΙ 2 μ3
6 - zředěná 5x v PO4/NaCI 100 μΙ 0,4 μ9
I 1 ENG2953A4/Q 100 μΙ 2 μ9
8 - zředěná 5x v PO4/NaCl 100 μΙ 0,4 μς
V den 15 (2 týdny po imunizaci I) a v den 28 (2 týdny po imunizaci I) a v den 28 (2 týdny po imunizaci II) byla odebrána krev z retroorbitální dutiny.
Pro uspořádání tohoto pokusu (4 prostředky x 2 dávky a 12 myší na skupinu) byla kapacita a priori odhadnuta statistickým programem PASS. Statistický program PASS (Power and Sample Size, Účinnost a velikost vzorku) byl získán zNCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037. Pro dvoucestnou variační analýzu by měl být 2,5 násobný rozdíl v titru protilátek, GMT, mezi prostředky s chybou alfa ve výši 5 % detegován s účinností vyšší než 90 %.
Výsledky
Sérologie
Humorální odpovědi (celkové Ig a isotypy) byly měřeny stanovením ELISA za použití HBsAg (Hep286) jako povlékacího antigenů a biotinem konjugovaných anti-myších protilátek k prokázání vazby anti-HBs protilátky.A nalyzována byla pouze séra po imunizaci II (post II).
Tabulka 9 znázorňuje průměr a GMT protilátkové odpovědi anti-HBs Ig, měřených v jednotliio vých sérech 2 týdny po imunizaci II.
Prostředkem DENS a klasickými prostředky vůči hepatitídě B jsou indukovány srovnatelné protilátkové odpovědi, a to: GMT mezi 2304 a 3976 EU/ml pro šarže DENS ve srovnání s 2882 EU/ml pro monovaíentní vakcínu vůči hepatitidě B od SB Biologícals (Engerix B™) v dávce 2 gg a GMT mezi 696 a 182 EU/ml pro šarže DENS ve srovnání s 627 EU/ml pro monovalentní vakcínu vůči hepatitidě B od SB Biological (Engerix B™) v dávce 0,4 gg.
• Podle předpokladu je jasný účinek antigenní dávky zjištěn u všech prostředků v dávkách 2 gg a 0,4 gg s tří- až šestinásobným rozdílem v hodnotách GMT.
• Pozorovány byly čtyři odpověď neposkytující myši (s titry menšími než 50 EU/ml) bez přímé vazby na dávky antigenů nebo šarže použité k injikaci (ve skupinách 1, 2, 3 a 8 jedna myš na skupinu). Na základě statistické analýzy (Grubbsův test) byly tyto myši z další analýzy vyloučeny.
Tabulka 9: Protilátková odpověď u myší v den 28 (2 týdny po imunizaci II)
skupina vakcína dávka počet titry ELISA (Ig)
průměr GMT
1 DENS001A4 2gg 11 3466 2971
2 0,2 μς 11 1283 1182
3 DENS001A4 2gg 11 2436 2304
4 0,2 μg 12 984 1 786 ί
5 DENS001A4 2gg 12 4583 3976
6 0,2 μρ 12 997 696
7 ENG2953A4/Q * I 2μ9 12 3999 2882
... 0,2 μρ 11 737 627
Statistická analýza
Dvoj směrní variační analýza byla provedena u titrů anti-HBs po logaritmické transformaci údajů po druhé imunizaci, za použití vakcín (4 šarže) a dávek antigenů (2 gg a 0,4 gg) jako faktorů. Tato analýza potvrdila, že statisticky významný rozdíl bylo možné pozorovat mezi oběma dávkami antigenů (hodnota p<0,001) a žádný významný rozdíl se neobjevil mezi jednotlivými šaržemi (hodnota p = 0,2674). Jak bylo uvedeno výše, účinnost (síla) byla odhadnuta a priori a uspořádá- 18CZ 303217 B6 ní pokusu bylo takové, že mezi prostředky s účinností vyšší než 90 % lze detegovat 2,5 násobný rozdíl v GMT s 0,5% chybou alfa.
Isotypový profil
Tabulka 10 znázorňuje isotypové rozdělení (IgGl, lgG2a a IlG2b), vypočtené z analýzy spojených vzorků séra po imunizaci II.
• Podle očekávání je jasná odpověď TH2 indukována vakcínami na bázi hydroxidu hlinitého, i o neboť byly pozorovány zejména protilátky IgG 1.
• Žádný rozdíl, týkající se isotypového profilu, nebyl pozorován mezi šaržemi DENS nebo mono valen tni vakcínou proti hepatitidě B od SB Biologicals.
Tabulka 10: Rozdělení isotypů IgG ve spojených sérech, odebraných v den 28
skupina vakcína dávka isotyp (%) lgG2b
IgGl lgG2a
1 DENS001A4 2μρ 91 4 5
2 0,2 μθ 87 8 5
3 DENS001A4 2μ9 97 2 1
4 0,2 μθ 87 6 7
5 DENS001A4 2μ9 98 1 1
6 θ,2 μς 93 4 3
7 ENG2953A4/Q 2μ0 0,2 μθ 88 88 8 9 4 3
Příklad 3
Prostředky kombinovaných vakcín
Objemový antigen podle tohoto vynálezu se zvláště hodí pro formulování do kombinované vakcíny, obsahující IPV (inaktivovaný virus dětské obrny).
Studie zabývající se stálostí, prováděné na výchozích šaržích kombinované vakcíny vůči DTPaHBV-IPV prokázaly pokles účinnosti IPV složky, zvláště antigenů poliomyelitidy typu 1, za použití imunitního stanovení in vitro (určený obsahu D-antigenu pomocí ELISA) a testu in vivo účinnosti u krys. Žádný úbytek účinnosti nebyl pozorován u typu 3. U typu 2 byl úbytek účin30 nosti v očekávaném rozmezí (ne více než 10% úbytek za rok skladování).
Byly zahájeny studie, mající určit příčiny této ztráty účinnosti, pozorované u kombinované vakcíny vůči DTPa-HBV-IPV. Ze zjištění, že stálost IPV ve vakcíně DTPa-IPV od firmy SB Biological je vyhovující (úbytek obsahu antigenů nepřevyšuje 10 % za rok skladování) bylo vyvozeA9-CZ 303217 B6 no, že za nestálost IPV ve vakcíně vůči DTPa-HBV-IPV pravděpodobně zodpovídá složka HBV.
Složka HBV, použitou v původním vakcinačním prostředku vůči DTpa-HBV-IPV, je čištěná rDNA, tedy z kvasinek získaný HBsAg, používaný také pro výrobu monovalentní vakcíny proti hepatitidě B firmou SB Biologicals a připravený tak, jak je popsáno v Příkladu 1.
V prvním pokusu zjistit, který prvek složky BHV byl škodlivý vůči IPV, byl HBsAg analyzován vzhledem k přítomnosti thiomersalu. Již dříve bylo zjištěno (Davisson se spoluautory, J. Lab. io Clin. Med. 47 8-19, 1956), že thiomersal, používaný jako konzervační látka ve vakcínách vůči
DTP, byl na újmu viru poliomyelitidy v kombinaci DTPIPV. Toto pozorování bylo uváženo výrobci vakcín, kteří pri vytváření svých vakcín s obsahem IPV nahradili thiomersal jinými konzervačními látkami. V nedávné době byl znovu zkoumán vliv thiomersalu na účinnost IPV za podmínek dlouhodobého skladování pri teplotě +4 °C. Po 4 až 6 měsících skladování byl popsán úbytek účinnosti polyovirového antigenu typu l až k nedelegovaným hodnotám (L.A. Sawyer se spoluautory, Vaccine 12, 851-856, 1994).
Za použití adsorpční atomové spektroskopie bylo v antigenu, čištěném podle Příkladu , nalezeno přibližně 0,5 pg rtuti (Hg) na 20 pg HBsAg.
Toto množství rtuti (v podobě thiomersalu a chloridu ethyl rtuti, degradačního produktu thiomersalu), může redukovat odpověď ELISA vůči obsahu D-antigenu typu 1 v objemovém koncentrátu IPV, inkubovaném 7 dní při teplotě 37 °C, až na nedetegovatelnou úroveň.
Pro uvolnění rtuti, přítomné v objemu HBsAg, byla vyvinuta metoda. Předpokládalo se, že rtuť může být vázána na thiolové skupiny částice HBsAg a může tedy být uvolněna v přítomnosti redukčních činidel. Po pokusech, prováděných i s jinými redukčními činidly, byl jako činidlo pro uvolňování rtuti z částice HBsAg vybrán L-cystein. Po dialýze objemu HBsAg proti solnému roztoku s obsahem 5,7 mmolT1 cysteinu nebyla v zadrženém podílu detegována žádná rtuť (detekční limit testovací metody je 25 ng Hg/20 pg HBsAg). Dialyzovaný antigen byl smíchán s objemovým koncentrátem IPV a stálost viru typu 1 byla hodnocena měřením obsahu D-antigenu po inkubaci v trvání 7 dnů při teplotě 37 °C. Jako kontroly byly použity objemový koncentrát IPV, nesmíšený s HBsAg a objemový koncentrát IPV, smísený s HBsAg, neovlivněným cysteinem. Srovnávací titr ELISA byl získán u vzorků, skladovaných 7 dní pri teplotě +2 °C až +8 °C.
Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 11.
Tabulka 11
vzorek obsah D-antigenu (typu 1)(1) úbytek
7 dní/4 °C 7 dní/37 °C
IPV (nesmíchaný) 31,6 ! 24,2 1 23 %
IPV + HBsAg (neupravený) 31,1 18,1 42 %
IPV HBsAg upravený cysteinem 31,4 27,6 12 %
IPV + thiomersal (1 pg/ml) 30,5 11,0 74 %
(1) vyjádřeno v jednotkách D-antigenu (DU)
-20CZ 303217 B6
Údaje, získané za použití těchto laboratorních prostředků, jasně ukazují, že stálost polioviru typu l je významně zlepšena, pokud je HBsAg ovlivněn cysteinem k odstranění zbytkové rtuti ještě před smícháním s IPV.
Výše uvedené údaje také ukazují úbytek obsahu D-antigenu v rozsahu 23 % po sedmidenní inkubaci při 37 °C u srovnávacího prostředku IPV. To potvrzuje přirozenou nestálost Mahoneyho polioviru typu 1, která byla popsána dříve L. A. Sawyerem a spoluautory ve Vaccine 12, 851— 856, 1994.
io Ačkoli komerční šarže vakcín vůči DTpa-HBV-lPV a DTPa-HBV-lPV/Hib byly již vyrobeny za použití dialyzačního postupu s 5,7 mmokl'1 cysteinem k odstranění zbytkové rtuti a k ochraně stálosti IPV, pro výrobu ve velkém měřítku není díalyzační postup vhodný a k přípravě HBsAg bez přítomnosti thiomersalu nebo bez přítomnosti rtuti zahrnuje série doplňkových kroků. Naproti tomu HBsAg podle tohoto vynálezu, připravený bez thiomersalu, lze přímo použít v prostřed15 cích kombinovaných vakcín a zvláště těch s obsahem IPV.
4. Souhrn
Dříve používaný postup pro vyčištění kvasinkového povrchového antigenů obsahuje krok gelové permeace (zachycení v gelu), při němž je v elučním pufru zahrnuta protimikrobiální sloučenina thiomersal s obsahem rtitu, ke kontrole biologického zatížení.
Thiomersal se během následujících kroků postupu úplně neodstraní, takže ve vyčištěném objemovém antigenů je nadále přítomno přibližně 1,2 pg thiomersalu na 20 pg bílkoviny.
Pro výrobu objemového antigenů zcela bez obsahu thiomersalu (rtuti) byl způsob jeho Čištění ve dvou krocích pozměněn.
• Thiomersal je z elučního pufru v permeačním kroku na 4B gelu vypuštěn.
• K eluátu, shromážděnému z kroku aníontově výměnné chromatografie, se přidá cystein (v konečné koncentraci 2 mmokl1). To zabraňuje srážení antigenů během odstřeďování v hustotním gradientu CsCl.
Ve výrobním způsobu nejsou učiněny žádné další změny.
Objemový antigen, vyrobený modifikovaným způsobem, byl již charakterizován. Fyzikálně chemické testy a stanovení ukazují, že antigen bez přítomnosti thiomersalu je nerozlišitelný, pokus se týká jeho vlastností, od antigenů, vyrobeného dříve používaným způsobem výroby. Antigenní částice mají stejné složky.
Identita a celistvost (integrita) polypeptidu HBsAg je pozměněním způsobu výroby neovlivněna, což bylo prokázáno analýzou pomocí SDS-PAGE, postupem Western blotting za použití polyklonálních protilátek vůči HBsAg, analýzou N-koncové sekvence a složení aminokyselin.
Elektronová mikroskopie a rozptylová analýza laserového světla prokázaly, že částice mají svou typickou formu a velikost, očekávanou u HBsAg z kvasinek. Analýza postupem Western blotting s protikvasinkovým bílkovinným sérem prokázala, že antigen, vyrobený způsobem bez přítomnosti thiomersalu, má podobný vzorek znečišťujících kvasinkových bílkovin. Ovšem množství znečišťujícího proužku, pohybujícího se v oblasti 23 000, je ve třech šaržích HBsAg, vyrobe50 ných pozměněnným způsobem výroby, silně omezeno.
Imunologické analýzy ukazují, že částice bez thiomersalu vykazují zvýšenou antigennost. Tyto částice jsou reaktivnější při použití sady AUSZYME (obsahující směs monoklonálních protilátek), přičemž poskytují poměry bílkoviny/ELISA od 1,6 do 2,25. Tato zvýšená antigennost se rovněž projevuje s chránící monoklonální protilátkou RF1. Pro inhibici vazby RF1 ke standard nímu znehybněnému antigenu je potřeba přibližně čtyřikrát až sedmkrát méně antigenu bez thiomersalu. Křivky inhibice vazby pomocí antigenu bez thiomersalu a klasického antigenu patří do dvou odlišných podskupin. Tento rozdíl je rovněž prokázán měřením vazebné afinitní konstanty pro RF1 za použit povrchové plazmové rezonance. Vazebné afinity prostředků bez thiomersalu jsou trojnásobně až čtyřnásobně vyšší než u šarže klasického objemového antigenu.
Prostředky objemového antigenu byly formulovány jako vakcíny adsorpci na hydroxid hlinitý a bez konzervační látky.
io Testování účinnosti in vitro za použití sady AUSZYME ELISA od firmy Abbtt a monovalentní vakcíny vůči hepatitidě b s obsahem thiomersalu od firmy SB Biologicals jako standardu prokázalo získání vysokých hodnot účinnosti in vitro. Obsah antigenu, měřený tímto testem, byl téměř dvojnásobkem uvedené hodnoty 20 pg bílkoviny na ml.
Zvýšená reaktivita vakcíny, připravené z antigenu neobsahujícího thiomersal, byla pozorována také v inhibičním stanovení s monoklonální protilátkou RF1 pro vazbu na znehybněný antigen. k 50% inhibici vazby RF1 na znehybněný antigen bylo potřeba přibližně polovičního množství vakcíny bez thiomersalu ve srovnání s antigenem, vyčištěným drive používaným způsobem a formulovaným bez konzervační látky.
Tato zvýšená antigennost vakcíny neobsahující thiomersal, vztahující se kRFl, je v souladu s výsledky testu účinnosti in vitro (obsahu antigenu) a testů protilátky RF1, prováděných na prostředcích objemového antigenu.
Test imunogen ity u myší byl prováděn za použití základního očkování (priming) a zesilovacího očkování (booster) o dva týdny později v dávkách 2,0 a 0,4 pg antigenu. Myším byla odebrána krev v den 28, 14 dní po zesilovacím očkování. Séra byla analyzována vzhledem k titru protilátek a isotypovému složení. U obou podávaných látek byla pozorována jasná nezávislost účinku na dávce antigenu, ale nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl v odpovědi pokud se týká titru pro30 ti látek (GMT) u vakcín bez obsahu thiomersalu a u vakcín bez konzervační látky.
Žádné podstatné rozdíly nebyly pozorovány v isotypových profilech.

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    40 1. Způsob výroby vakcíny proti hepatitidě B, která obsahuje vyčištěný povrchový antigen hepatitidy B, který obsahuje méně než 0,025 pg rtuti na 20 pg bílkoviny a při jehož čištění nebyl použit thiormesal, a farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, vyznačující se tím, že se antigen čistí tak, že se surový přípravek antigenu hepatitidy B
    45 (a) podrobí gelové permeační chromatografii, (b) podrobí iontově výměnné chromatografii a (c) smísí se s redukčním činidlem, majícím volnou skupinu -SH, v jehož přítomnosti se dále
    50 čistí, a antigen se po vyčištění formuluje s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou do vakcíny, přičemž vakcína je prostá thiomersalu.
    -22CZ 303217 B6
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se antigen hepatitidy adsorbuje na hydroxid hlinitý.
  3. 3. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se jako re5 dukční činidlo použije cystein, glutathion, dithiothreitol nebo β-merkaptoethanol.
  4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se jako redukční činidlo použije cystein.
    io
  5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se cystein přidává do konečné koncentrace 1 až lOmM.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že cystein přidává do konečné koncentrace 2mM.
  7. 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž 6, vyznačující se tím, že se přidá adjuvantní látka pro vytvoření vakcíny.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se tím, že adjuvantní látkou je hlinitá sůl.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že hlinitou sloučeninou je hydroxid hlinitý.
  10. 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7až9, vyznačující se tím, že adjuvantní
    25 látkou, j e látka indukuj íc ί ΤΗ-1.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se adjuvantní látka, indukující TH-1 volí ze skupiny zahrnující 3-de-O-acylovaný monofosforyl lipid A, saponin QS21, 3-deO-acylovaný monofosforyllipid A a QS21 a oligonukleotid CpG.
  12. 12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11, vyznačující se tím, že pro výrobku vakcíny se kromě povrchového antigenu hepatitidy B použije jeden nebo větší počet antigenů ze skupiny, zahrnující záškrtový toxoid (D), tetanový toxoid (T), nebuněčné antigeny černého kašle (Pa), inaktivovaný poliovirus (IPV), antigen Haemophilus influenzae (Hib), antigen hepatitidy A,
    35 viru herpes simplex (HSV), antigeny chlamydíí, HPV, Streptococcus pneumoniae a Neisseria.
CZ20030385A 2000-08-10 2001-08-07 Zpusob výroby vakcíny proti hepatitide typu B CZ303217B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0019728.5A GB0019728D0 (en) 2000-08-10 2000-08-10 Novel treatment
GB0101334A GB0101334D0 (en) 2001-01-18 2001-01-18 Novel compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2003385A3 CZ2003385A3 (cs) 2003-06-18
CZ303217B6 true CZ303217B6 (cs) 2012-05-30

Family

ID=26244821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20030385A CZ303217B6 (cs) 2000-08-10 2001-08-07 Zpusob výroby vakcíny proti hepatitide typu B

Country Status (36)

Country Link
US (3) US20030235590A1 (cs)
EP (2) EP1307473B1 (cs)
JP (2) JP2004505992A (cs)
KR (1) KR100804922B1 (cs)
CN (1) CN1468256B (cs)
AP (1) AP2003002734A0 (cs)
AR (1) AR030325A1 (cs)
AT (2) ATE313558T1 (cs)
AU (2) AU2001282073B2 (cs)
BG (1) BG66038B1 (cs)
BR (1) BRPI0113155C1 (cs)
CA (2) CA2740282A1 (cs)
CY (2) CY1106310T1 (cs)
CZ (1) CZ303217B6 (cs)
DE (2) DE60136400D1 (cs)
DK (2) DK1666487T3 (cs)
DZ (1) DZ3470A1 (cs)
EA (1) EA006433B1 (cs)
EG (1) EG25829A (cs)
ES (2) ES2254464T3 (cs)
HK (1) HK1056884A1 (cs)
HU (1) HU228932B1 (cs)
IL (2) IL154301A0 (cs)
MX (1) MXPA03001235A (cs)
MY (1) MY128999A (cs)
NO (1) NO20030635L (cs)
NZ (1) NZ524012A (cs)
OA (1) OA12361A (cs)
PE (1) PE20020287A1 (cs)
PL (1) PL204736B1 (cs)
PT (1) PT1666487E (cs)
SI (2) SI1666487T1 (cs)
SK (2) SK288079B6 (cs)
UA (1) UA79735C2 (cs)
UY (1) UY26882A1 (cs)
WO (1) WO2002012287A1 (cs)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA79735C2 (uk) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
GB0202901D0 (en) * 2002-02-07 2002-03-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
EP2371381A3 (en) * 2005-07-11 2012-07-18 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies
EA014314B1 (ru) * 2005-08-02 2010-10-29 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Срл Пониженная интерференция между маслосодержащими адъювантами и антигенами, содержащими поверхностно-активные вещества
GB0522765D0 (en) * 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB0612142D0 (en) 2006-06-20 2006-08-02 Secr Defence Spreading modulation spectrum control
NZ575273A (en) 2006-09-07 2012-02-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Method for making combination vaccine comprising inactivated poliovirus type 1, diptheria toxoid and tetanus toxoid
TW200914042A (en) 2007-05-02 2009-04-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2009057699A1 (ja) * 2007-10-30 2009-05-07 Kyocera Corporation 弾性波装置
US8250102B2 (en) * 2008-03-14 2012-08-21 Microsoft Corporation Remote storage and management of binary object data
KR100959145B1 (ko) 2008-03-21 2010-05-25 중앙대학교 산학협력단 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법
WO2009143524A2 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
CA2763486A1 (en) * 2009-05-27 2010-12-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Casb7439 constructs
PT2705365T (pt) * 2011-01-14 2016-09-19 Hal Allergy Holding B V Imunoensaio para determinação direta do teor de antigénio de produtos compreendendo partículas de antigénio acoplado a adjuvante
GB201105981D0 (en) 2011-04-08 2011-05-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
CN106222129A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
PE20201443A1 (es) 2017-07-18 2020-12-10 Serum Inst Of India Pvt Ltd Una composicion inmunogenica que tiene estabilidad mejorada, inmunogeneicidad potenciada y reactogenicidad reducida y proceso para la preparacion de la misma
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
JP2022524007A (ja) 2019-03-05 2022-04-27 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｂ型肝炎免疫化レジメンおよび組成物
JP2023506440A (ja) * 2019-12-13 2023-02-16 遠大賽威信生命科学（南京）有限公司 免疫刺激性組成物及びその用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
US4683294A (en) * 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
WO1999045957A2 (en) * 1998-03-09 1999-09-16 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Combined vaccine compositions
EP1307473A1 (en) * 2000-08-10 2003-05-07 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Purification of hbv antigens for use in vaccines

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1030777A (en) * 1963-12-06 1966-05-25 Ciba Ltd Method of preparing a vaccine against trypanosoma cruzi infections
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4720385A (en) * 1983-03-29 1988-01-19 Miles Laboratories, Inc. Protein compositions substantially free from infectious agents
JPS6013718A (ja) 1983-07-05 1985-01-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｂ型肝炎ワクチン
EP0135435A3 (en) 1983-08-22 1987-03-25 Merck & Co. Inc. Immunogenic hbsag derived from transformed yeast
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4895800A (en) 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
AP56A (en) 1987-01-30 1989-09-26 Smithkline Biologicals S A Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them.
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
ES2056799T3 (es) 1987-07-17 1994-10-16 Rhein Biotech Ges Fur Biotechn Moleculas de adn codante para las regiones de control fmdh y gen estructural para una proteina que tiene una actividad de fmdh y su uso.
EP0314240A3 (en) 1987-10-26 1990-03-28 Merck & Co. Inc. Process for purifying recombinant hepatitis antigens
JPH085804B2 (ja) 1988-04-28 1996-01-24 財団法人化学及血清療法研究所 Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5242812A (en) * 1989-02-07 1993-09-07 Bio-Technology General Corp. Method for production and purification of hepatitis B vaccine
US5274081A (en) * 1989-09-20 1993-12-28 Immuno A.G. Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen
GB9007024D0 (en) 1990-03-29 1990-05-30 Imperial College Novel vaccine
AU9052091A (en) 1990-12-20 1992-07-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
JP3026029B2 (ja) 1991-04-26 2000-03-27 財団法人阪大微生物病研究会 組換え水痘ウイルスとその作製法
JPH06503231A (ja) 1991-09-18 1994-04-14 アムジエン・インコーポレーテツド 胆汁酸塩を含有するｂ型肝炎ワクチン製剤
US6620414B2 (en) * 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
CZ282235B6 (cs) 1992-06-25 1997-06-11 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Očkovací prostředek, jeho použití k výrobě vakcíny, způsob léčby patogenních infekcí tímto prostředkem a způsob jeho výroby
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
CA2560114A1 (en) 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
NZ337543A (en) * 1994-10-24 2002-06-28 Allergan Inc Composition comprising avian antitoxin against clostridial neurotoxin protein and method for producing recombinant antitoxin proteins are provided for
KR960023066A (ko) * 1994-12-10 1996-07-18 성재갑 전에스 (s) 2 펩티드 함유 비 (b) 형 간염 표면항원의 정제 방법
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
DE69929444T2 (de) 1998-08-10 2006-09-28 Antigenics Inc., Woburn Cpg-zusammensetzungen, saponin-adjuvantien und verfahren zu deren verwendung
WO2000037104A1 (en) * 1998-12-23 2000-06-29 Merck & Co., Inc. Improved recombinant hepatitis b surface antigen

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683294A (en) * 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
US4649192A (en) * 1985-05-30 1987-03-10 Smith Kline-Rit Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate
WO1999045957A2 (en) * 1998-03-09 1999-09-16 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Combined vaccine compositions
EP1307473A1 (en) * 2000-08-10 2003-05-07 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Purification of hbv antigens for use in vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
CA2740282A1 (en) 2002-02-11
IL154301A0 (en) 2003-09-17
HK1056884A1 (en) 2004-03-05
PL204736B1 (pl) 2010-02-26
AU2001282073B2 (en) 2005-01-20
BR0113155A (pt) 2003-07-08
ES2254464T3 (es) 2006-06-16
US20090123496A1 (en) 2009-05-14
PE20020287A1 (es) 2002-06-20
SI1307473T1 (sl) 2006-04-30
AU8207301A (en) 2002-02-18
IL154301A (en) 2009-11-18
JP2004505992A (ja) 2004-02-26
US20030235590A1 (en) 2003-12-25
HUP0302951A3 (en) 2004-10-28
ATE412665T1 (de) 2008-11-15
BRPI0113155B8 (pt) 2019-08-13
KR100804922B1 (ko) 2008-02-20
JP5559847B2 (ja) 2014-07-23
CN1468256A (zh) 2004-01-14
BRPI0113155C1 (pt) 2021-05-25
DE60116107T2 (de) 2006-08-03
AP2003002734A0 (en) 2003-03-31
UA79735C2 (uk) 2007-07-25
EP1666487B1 (en) 2008-10-29
CN1468256B (zh) 2010-10-27
WO2002012287A1 (en) 2002-02-14
NO20030635D0 (no) 2003-02-07
MY128999A (en) 2007-03-30
EA006433B1 (ru) 2005-12-29
DE60136400D1 (de) 2008-12-11
UY26882A1 (es) 2002-03-22
JP2012255015A (ja) 2012-12-27
CZ2003385A3 (cs) 2003-06-18
CY1106310T1 (el) 2011-10-12
PT1666487E (pt) 2008-12-26
EP1666487A1 (en) 2006-06-07
ES2314555T3 (es) 2009-03-16
EP1307473A1 (en) 2003-05-07
US8624004B2 (en) 2014-01-07
DZ3470A1 (fr) 2002-02-14
NZ524012A (en) 2004-02-27
KR20030029127A (ko) 2003-04-11
HU228932B1 (en) 2013-06-28
ATE313558T1 (de) 2006-01-15
SI1666487T1 (sl) 2009-02-28
BRPI0113155B1 (pt) 2018-11-21
DK1666487T3 (da) 2009-01-12
OA12361A (en) 2004-04-13
US20060159705A1 (en) 2006-07-20
EA200300129A1 (ru) 2003-10-30
SK288079B6 (sk) 2013-06-03
PL362322A1 (en) 2004-10-18
BG107545A (bg) 2004-01-30
HUP0302951A2 (hu) 2003-12-29
SK288069B6 (sk) 2013-05-03
BG66038B1 (bg) 2010-11-30
SK1692003A3 (en) 2003-08-05
CA2427475C (en) 2011-07-05
MXPA03001235A (es) 2004-07-16
DE60116107D1 (de) 2006-01-26
DK1307473T3 (da) 2006-05-01
AR030325A1 (es) 2003-08-20
EP1307473B1 (en) 2005-12-21
NO20030635L (no) 2003-04-01
CY1108789T1 (el) 2014-04-09
CA2427475A1 (en) 2002-02-11
EG25829A (en) 2012-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5559847B2 (ja) ワクチンに使用するためのｈｂｖ抗原の精製
KR100365373B1 (ko) B형간염백신
AU2001282073A1 (en) Purification of HBV antigens for use in vaccines
WO2003066094A2 (en) Hepatitis b vaccines
EP0597838B1 (en) Vaccine compositions
NO20130773L (no) Metode for fremstilling av en vaksine

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20210807