SK288079B6 - Method for preparing stable, immunogenic hepatitis B vaccine without trace of thiomersal - Google Patents
Method for preparing stable, immunogenic hepatitis B vaccine without trace of thiomersal Download PDFInfo
- Publication number
- SK288079B6 SK288079B6 SK50032-2012A SK500322012A SK288079B6 SK 288079 B6 SK288079 B6 SK 288079B6 SK 500322012 A SK500322012 A SK 500322012A SK 288079 B6 SK288079 B6 SK 288079B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- antigen
- vaccine
- hbsag
- hepatitis
- adjuvant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 67
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 9
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 title claims abstract description 6
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 6
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 title abstract description 17
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 title abstract description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 172
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 168
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 168
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 71
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 27
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 21
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical group [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 claims description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical group O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 28
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 27
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 26
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 10
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 8
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010084884 GDP-mannose transporter Proteins 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 6
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 5
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 5
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 5
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 4
- 150000007949 saponins Chemical group 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 102100037831 DNL-type zinc finger protein Human genes 0.000 description 3
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 3
- PMTMAFAPLCGXGK-JMTMCXQRSA-N (15Z)-12-oxophyto-10,15-dienoic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@H]1[C@@H](CCCCCCCC(O)=O)C=CC1=O PMTMAFAPLCGXGK-JMTMCXQRSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- PMTMAFAPLCGXGK-UHFFFAOYSA-N OPDA Natural products CCC=CCC1C(CCCCCCCC(O)=O)C=CC1=O PMTMAFAPLCGXGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100028078 Oryza sativa subsp. japonica OPR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 230000000656 anti-yeast Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 208000016350 chronic hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-fluorophenyl)methyl]piperazine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1CN1CCNCC1 OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLOKJRIVRGCVIM-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-methylsulfanylphenyl)methyl]piperazine Chemical compound C1=CC(SC)=CC=C1CN1CCNCC1 QLOKJRIVRGCVIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000408930 Astictopterus jama Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 229940032024 DPT vaccine Drugs 0.000 description 1
- -1 DTT Natural products 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101710112523 GDP-mannose transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012993 chemical processing Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- PJDVOLYULHZZAG-UHFFFAOYSA-N ethylmercury Chemical compound CC[Hg] PJDVOLYULHZZAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 229960004443 hemophilus influenzae b vaccines Drugs 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011551 log transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- NZMAJUHVSZBJHL-UHFFFAOYSA-N n,n-dibutylformamide Chemical compound CCCCN(C=O)CCCC NZMAJUHVSZBJHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 229940075562 sodium phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CRKADHVTAQCXRA-UHFFFAOYSA-K trisodium;phosphate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O CRKADHVTAQCXRA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 description 1
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
- A61K39/0018—Combination vaccines based on acellular diphtheria-tetanus-pertussis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
A method comprising expressing the hepatitis B surface antigen (HBsAg) as a recombinant protein in Saccharomyces cerevisiae, processing the yeast cells to provide a crude antigen preparation, subjecting the crude antigen preparation to gel permeation chromatography, wherein the used elution buffer does not contain thiomersal, subjecting the antigen-containing eluant from step (c) to ion exchange chromatography, adding cysteine to the antigen-containing eluant pool obtained after previous step, subjecting the preparation from previous step to caesium chloride ultracentrifugation and combining the purified HBsAg with a pharmaceutically acceptable excipient to produce a stable, immunogenic hepatitis B vaccine, wherein no thiomersal id added to the resulting vaccine.
Description
Oblasť techniky
Tento vynález sa týka nového spôsobu výroby vakcíny proti hepatitíde B na použitie na liečenie alebo profylaxiu infekcií vírusom hepatitídy B (HBV).
Doterajší stav techniky
Chronická infekcia vírusom hepatitídy B (HBV), pre ktorú je v súčasnosti dostupná obmedzená liečba, predstavuje globálny problém verejného zdravotníctva s enormným rozsahom. Počet chronických prenášačov HBV na celom svete sa odhaduje na 300 miliónov, a je u nich riziko vývoja chronickej aktívnej hepatitídy, cirhózy a primárneho hepatobunkového karcinómu.
Mnohé vakcíny, ktoré sú v súčasnosti dostupné, vyžadujú konzervačnú látku na zabránenie ich zničeniu. Často používanou konzervačnou látkou je tiomerzal, ktorý je zlúčeninou obsahujúcou ortuť. Boli vznesené určité obavy v súvislosti s používaním ortuti vo vakcínach, hoci komentátori zdôraznili, že potenciálne riziká vakcín obsahujúcich tiomerzal by nemali byť zveličované (Offit; P. A. JAMA zv. 283; č. 16). Bez ohľadu na to by bolo výhodné nájsť nové a potenciálne bezpečnejšie spôsoby prípravy vakcín na nahradenie používania tiomerzalu vo výrobnom procese. Preto existuje potreba vývoja vakcín, ktoré neobsahujú tiomerzal, najmä vakcín proti hepatitíde B.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je spôsob výroby stabilného antigénu hepatitídy B bez stôp tiomerzalu, pričom tento spôsob zahŕňa purifikáciu antigénu v prítomnosti redukčného činidla majúceho voľnú -SH skupinu.
Antigénový prípravok je vo všeobecnosti bez stôp tiomerzalu, keď tiomerzal nie je detekovateľný v purifikovanom antigénovom produkte použitím absorpčnej spektrofotometrie ortuti, ako je tu opísaná.
Hepatitídový antigénový prípravok výhodne obsahuje menej ako 0,025 pg ortuti na 20 pg proteínu, vhodne podľa merania prostredníctvom absorpčnej spektrofotometrie.
Výhodne sa purifikácia uskutočňuje bez tiomerzalu a purifikovaný antigén je úplne bez tiomerzalu.
Výhodne je antigén stabilný, vhodne v podstate rovnako stabilný ako hepatitídový antigén purifikovaný v prítomností tiomerzalu, ako je napríklad uvedené, v príklade 1.
Hepatitídový antigén je výhodne imunogénny.
Redukčné činidlo sa výhodne pridáva v priebehu procesu purifikácie antigénu, výhodne po raste buniek exprimujúcich antigén.
Redukčným činidlom je výhodne cysteín, ditiotreitol, β-merkaptoetanol alebo glutatión, pričom cysteín je najvýhodnejší.
Z toho vyplýva, že predložený vynález výhodne poskytuje spôsob produkcie stabilného imunogénneho antigénu hepatitídy B bez stopy tiomerzalu, pričom tento spôsob zahŕňa purifikáciu antigénu v prítomnosti cysteínu.
Purifikácia sa výhodne uskutočňuje v prítomnosti cysteínového roztoku.
Cysteín, v roztoku alebo práškovej forme, sa výhodne pridáva v priebehu procesu do konečnej koncentrácie 1 až 10 mM, výhodne 1 až 5 mM. Výhodnejšie sa cysteín pridáva do konečnej koncentrácie približne 2 mM.
Cysteínom je výhodne L-cysteín.
Vynález ďalej poskytuje spôsob výroby stabilného antigénu hepatitídy B bez stopy tiomerzalu, v ktorom sa surový antigén podrobuje gélovej permeačnej chromatografii, iónovo-výmennej chromatografii a zmieša sa s redukčným činidlom, ktoré má voľnú -SH skupinu.
Iónovo-výmennou chromatografiou je výhodne aniónovo-výmenná chromatografia.
Vynález ďalej poskytuje antigén hepatitídy B bez tiomerzalu, získateľný spôsobom výroby podľa predloženého vynálezu, pričom tento antigén je aspoň tak imunogénny a antigénny, ako antigén hepatitídy B vyrobený v prítomnosti tiomerzalu.
Vynález ďalej poskytuje imunogénny antigén hepatitídy B, ktorý má priemerný ELISA proteínový pomer vyšší ako 1,5 a RF1 obsah s IC50 hodnotou nižšou aspoň o 3 rády, ako sú hodnoty povrchového antigénu hepatitídy B vyrobeného v prítomnosti tiomerzalu.
Ďalej sa vynález týka spôsobu výroby hepatitídového antigénu vhodného na použitie vo vakcíne, ktorý zahŕňa purifikáciu antigénu v prítomnosti tiomerzalu a následne spracovanie antigénu v prítomnosti redukčného činidla obsahujúceho voľnú -SH skupinu.
Po spracovaní vhodne nasleduje purifikačný krok, ako napríklad dialyzačný krok, na odstránenie tiomerzalu.
SK 288079 Β6
Redukčným činidlom je výhodne cysteín, DTT, glutatión alebo 2-merkaptoetanol.
Antigén hepatitídy B podľa vynálezu sa môže používať buď na liečenie, alebo na profylaxiu infekcií hepatitídy B, najmä na liečenie alebo profylaxiu napríklad chronických infekcií vírusom hepatitídy B.
Predložený vynález ďalej poskytuje spôsob výroby vakcínového prostriedku, ktorý obsahuje antigén hepatitídy B podľa predloženého vynálezu spolu s adjuvans. Výhodným adjuvans je hliníková soľ alebo preferenčný stimulátor TH1 bunkovej odpovede.
Antigénom je výhodne povrchový antigén hepatitídy B.
Príprava povrchového antigénu hepatitídy B je dobre dokumentovaná. Pozri napríklad Harford a ďalší v Develop. Biol. Standard 54, strana 125 (1983), Gregg a ďalší v Biotechnology, 5 strana 479 (1987), EP-A-0 226 846, EP-A-0 299 108 a tam citované publikácie.
Tak ako sa používajú tu, zahŕňajú výrazy „povrchový antigén hepatitídy B“ alebo „HBsAg“ akýkoľvek HBsAg antigén alebo jeho fragment, ktorý má antigénnosť HBV povrchového antigénu. Bude zrejmé, že okrem 226-aminokyselinovej sekvencie HBsAg S antigénu (pozri Tiollais a ďalší, Náture, 317, 489 (1985) a tam uvedené publikácie) môže HBsAg, ako je tu opísaný, zahŕňať, ak je to želateľné, celú alebo časť pre-S sekvencie, ako je opísaná v uvedených citáciách a v EP-A-0 278 940. HBsAg, tak ako je tu opísaný, môže označovať aj varianty, napríklad „únikový mutant“ opísaný vo WO 91/14703.
HbsAb môže označovať aj polypeptidy opísané v EP 0 198 474 alebo EP 0 304 578.
Normálne bude HBsAg v časticovej forme. Vo výnimočne výhodnom uskutočnení bude HbsAg pozostávať v podstate z HBsAg S antigénu uvedeného skôr.
Vakcína vyrobená spôsobom podľa vynálezu môže výhodne zahŕňať farmaceutický prijateľný excipient, ako napríklad vhodný adjuvans. Vhodné adjuvans sú komerčne dostupné, ako napríklad Freundovo nekompletné adjuvans a kompletné adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merck adjuvans 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); hlinité soli, ako napríklad gél z hydroxidu hlinitého (kamenec) alebo fosforečnan hlinitý; soli vápnika, železa alebo zinku; a nerozpustná suspenzia acylovaného tyrozínu; acylované sacharidy; katiónovo alebo aniónovo derivatizované polysacharidy; polyfosfazény; biodegradovateľné mikrosféry; monofosforyl lipid A a quil A. Ako adjuvans môžu byť použité aj cytokíny, ako napríklad GM-CSF alebo interleukín-2, -7 alebo -12.
Vo formuláciách vyrobených podľa vynálezu je výhodné, aby adjuvantný prostriedok indukoval predominantne imunitnú odpoveď typu TH1. Vysoké hladiny cytokínov Thl-typu (napr. IFN-γ, TNFa, IL-2 a IL-12) majú tendenciu zvýhodňovať bunkami sprostredkované imunitné odpovede na podaný antigén. Vo výhodnom uskutočnení, pri ktorom je odpoveď predominantne Thl-typu, sa bude hladina cytokínov Thl-typu zvyšovať vo väčšom rozsahu ako hladina cytokínov Th2-typu. Hladiny týchto cytokínov je možné jednoducho stanoviť použitím štandardných testov. Zhrnutie rodín cytokínov je uvedené v Mosmann a Coffrnan, Ann. Rev. Immunol. 7: 145 - 173, 1989.
Z toho vyplýva, že vhodné adjuvans na použitie na predominantne vyvolanie odpovede Th-l-typu zahŕňajú napríklad kombináciu monofosforyl lipidu A, výhodne 3-de-O-acylovaného monofosforyl lipidu A (3D-MPL) spolu s hlinitou soľou. Iné známe adjuvans, ktoré preferenčne indukujú imunitnú odpoveď Thl-typu, zahŕňajú oligonukleotidy obsahujúce CpG. Oligonukleotidy sa vyznačujú tým, že v CpG dinukleotide nie sú metylované. Takéto oligonukleotidy sú dobre známe a sú opísané napríklad vo WO 96/02555. Imunostimulačné DNA sekvencie sú opísané napríklad aj v Sato a ďalší, Science 273: 352, 1996. Iným výhodným adjuvans je saponín, výhodne QS21 (Aquilla Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), ktorý sa môže používať samostatne alebo v kombinácii s iným adjuvans. Posilňovací systém zahŕňa napríklad kombináciu monoforforyl lipidu A a saponínového derivátu, ako napríklad kombináciu QS21 a 3D-MPL, ako je opísaná vo WO 94/00153, alebo menej reaktívny prostriedok, kde je QS21 oslabený cholesterolom, ako je opísané vo WO 96/33739. Iné výhodné formulácie obsahujú emulziu oleja vo vode a tokoferol. Výnimočne účinná adjuvantná formulácia zahŕňa QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzii oleja vo vode, ako je opísaná vo WO 95/17210.
Výnimočne účinná adjuvantná formulácia, zahŕňajúca QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzii oleja vo vode, je opísaná vo WO 95/17210 a je výhodnou formuláciou.
V súlade s jedným uskutočnením predloženého vynálezu je vyrobená vakcína obsahujúca povrchový antigén hepatitídy B podľa predloženého vynálezu a TH-1 indukujúci adjuvans. Výhodným uskutočnením je vakcína, v ktorej je TH-1 indukujúci adjuvans vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje: 3D-MPL, QS21, zmes QS21 a cholesterolu, a CpG oligonukleotid. Iným výhodným uskutočnením je vakcína, ktorá obsahuje povrchový antigén hepatitídy B spolu s nasledujúcimi adjuvans: monofosforyl lipidom A alebo jeho derivátom, QS21 a tokoferolom v emulzii oleja vo vode.
Vyrobená vakcína okrem toho výhodne obsahuje saponín, výhodnejšie QS21. Iná výnimočne vhodná adjuvans formulácia zahŕňa CpG a saponín opísané vo WO 00/09159 a je výhodnou formuláciou. Najvýhodnejšie je v tejto konkrétnej formulácii saponínom QS21. Výhodne formulácia ďalej obsahuje emulziu oleja vo vode a tokoferol.
Predložený vynález sa týka aj vakcínovej formulácie obsahujúcej povrchový antigén hepatitídy B vyro3
SK 288079 Β6 bený podľa predloženého vynálezu spolu s adjuvans a okrem toho obsahujúcej jeden alebo viacero antigénov vybraných zo skupiny zahŕňajúcej: diptheria toxoid (D), tetanus toxoid (T), mimobunkové pertussis antigény (Pa), inaktivovaný polio vírus (IPV), haemophilus influenzae antigén (Hib), antigén hepatitídy A, antigény vírusu herpes simplex (HSV), chlamydia antigén, GSB, HPV, streptococcus pneumoniae antigény a neisseria antigény. Vo vakcínovej formulácii podľa predloženého vynálezu môžu byť kombinované aj antigény poskytujúce ochranu voči iným ochoreniam.
V jednom konkrétnom uskutočnení pripravená vakcínová formulácia obsahuje povrchový antigén hepatitídy B, ktorý je možné získať spôsobom výroby podľa predloženého vynálezu, spolu s adjuvans a inaktivovaným polio vírusom.
Predložený vynález sa týka aj spôsobu liečenia a/alebo profylaxie infekcií vírusom hepatitídy B, ktorý zahŕňa podávanie bezpečného a účinného množstva vakcíny podľa predloženého vynálezu na profylaxiu a/alebo liečenie infekcie hepatitídou B človeku alebo zvieraťu, ktorý trpí alebo je náchylný na infekciu vírusom hepatitídy B.
Vynález sa týka aj použitia povrchového antigénu hepatitídy B podľa predloženého vynálezu na výrobu lieku na liečenie pacientov trpiacich infekciou vírusom hepatitídy B, ako napríklad chronickou infekciou vírusom hepatitídy B.
Vakcína vyrobená podľa predloženého vynálezu bude obsahovať imunoprotektívne množstvo antigénu a môže byť pripravená bežnými technikami.
Vakcínový prostriedok je vo všeobecnosti opísaný v Pharmaceutical Biotechnology, zv. Vaccine Design the subunit and adjuvant approach, vyd. Powell a Newman, Plénum Press, 1995; v New Trends and Developments in Vaccines, vyd. Voliér a ďalší, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978. Enkapsulácia vo vnútri lipozómov je opísaná napríklad Fullertom v US patente 4235877. Konjugácia proteínov s makromolekulami je opísaná napríklad Likhitom v US patente 4372945 a Armorom a ďalšími v US patente 4474757. Použitie Quil A je opísané v Dalsgaard a ďalší, Acta Vet Scand, 18: 349 (1977). 3D-MPL je dostupný od Ribi immunochem, USA a je opísaný v britskej prihláške vynálezu č. 2220211 a v US patente 4912094. QS21 je opísaný v US patente č. 5057540.
Predložený vynález je ilustrovaný, ale nie je obmedzený nasledujúcimi príkladmi.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje diagram spôsobu produkcie Engerix B™ bez tiomerzalu.
Obrázok 2 znázorňuje SDS-PAGE analýzu celkových antigénových sérií: farbenie striebrom: 1 pg proteínu na vzorku.
Obrázok 3 znázorňuje zvyškové kvasinkové proteíny v celkových antigénových sériách produkovaných spôsobom bez tiomerzalu: Western blot s králičím anti-kvasinkovým proteínovým sérom.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Spôsob výroby povrchového antigénu hepatitídy B v prítomnosti tiomerzalu
Povrchový antigén hepatitídy B (HBsAg) SB Biologicals monovalentnej vakcíny hepatitídy B (Engerix B™) sa exprimuje ako rekombinantný proteín v Saccharomyces cerevisiae (pozri Harford a ďalší, loc. cit.). 24kD proteín sa produkuje intraceluláme a akumuluje sa v rekombinantných kvasinkových bunkách. Na konci fermentácie sa kvasinkové bunky odoberú a rozrušia sa v prítomnosti mierneho povrchovo aktívneho činidla, ako napríklad Tween 20, aby sa uvoľnil požadovaný proteín. Následne sa bunkový homogenát, obsahujúci rozpustné povrchové antigénové častice, predčisťuje v sériách precipitácií a potom sa skoncentruje prostredníctvom ultrafiltrácie.
Ďalšia purifikácia rekombinantného antigénu sa uskutočňuje v následných chromatografických separáciách. V prvom kroku sa surový antigénový koncentrát podrobí gélovej permeačnej chromatografii na Sepharose 4B médiu. Tiomerzal je prítomný v elučnom tlmivom roztoku v 4B permeačnom chromatografickom kroku. Elučný tlmivý roztok má nasledujúce zloženie: lOmM Tris, 5 % etylénglykol, pH 7,0, 50mg/l tiomerzal. Tiomerzal je v tomto tlmivom roztoku prítomný na kontrolu množstva biologických škodlivých látok v tele. Väčšina tiomerzalu sa odstráni v priebehu nasledujúcich purifikačných krokov zahŕňajúcich výmennú chromatografiu, ultracentrifugáciu a odsoľovanie (gélová permeácia), takže purifikované celkové antigénové prostriedky pripravené originálnym spôsobom obsahujú približne 1,2 pg a menej ako 2 pg tiomerzalu na 20 pg proteínu.
Iónovo-výmenný chromatografický krok sa uskutočňuje použitím DEAE-matrice a táto zásoba sa potom podrobí ultracentrifugácii v céznom gradiente v 4 vopred stanovených vrstvách s rozličnými koncentráciami
SK 288079 Β6 chloridu cézneho. Antigénové častice sa v gradiente separujú z kontaminovaných bunkových zložiek podľa ich hustoty a na konci centrifugačného procesu sa eluujú. Potom sa z tejto zásoby odstráni chlorid cézny sekundárnou gélovou permeáciou na Sepharose géli.
Keď sa HBsAg antigén pripravuje spôsobom zahŕňajúcim tiomerzal v 4B gélovom permeačnom tlmivom roztoku, získajú sa proteínové koncentrácie vyššie ako 30 mg/ml v zásobnom HBsAg obsahujúcom frakcie z CsCI gradientu, čo zodpovedá ekvivalentnej koncentrácii HBsAg, ako je testovaná AUSZYME kitom od Abbott Laboratories.
CsCI ultracentrifugačný krok užitočne eliminuje reziduálne lipidy, DNA a minoritné proteínové kontaminanty z HBsAg prípravku. Táto sa uskutočňuje zonálnou centrifugáciou v Ti 15 rotore od Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornia pri rýchlosti 30n000 ot./min. počas približne 40 až 60 hodín. Vzorka, ktorá sa má purifikovať, sa nanesie na vrstvy CsCI roztoku s konečnými koncentráciami 0,75, 1,5,2,5 a 3,25 M CsCI. Na konci centrifugácie sa gradient eluuje do frakcií. Frakcie obsahujúce HBsAg môžu byť identifikované prostredníctvom UV absorpcie pri 280 nm alebo testovaním riedení frakcií s AUSZYME kitom. HBsAg pás je pri hustote 1,17 až 1,23 g/cm3.
Roztok obsahujúci purifikovaný HBsAg sa pred použitím na výrobu vakcínovej formulácie sterilné prefiltruje.
Purifikácia z kvasinkového bunkového lyzátu je zložitá, keďže antigén sa produkuje intracelulárne a je nevyhnutná séria separačných techník na elimináciu rôznych typov (kvasinkových) kontaminantov, aby sa získal čistý celkový antigén. Purifikačné kroky sú dôležité, keďže produktom, ktorý sa má purifikovať, je lipoproteínová častica obsahujúca viacero kópií povrchového antigénového polypeptidu a táto štruktúra musí ostať zachovaná v priebehu purifikačného procesu. Výhodou tohto spôsobu je, že jeho výsledkom sú povrchové antigénové častice, ktoré sú úplne imunogénne bez toho, aby bolo potrebné ďalšie chemické spracovanie na posilnenie imunogénnosti (porovnaj EPO 135435).
Detaily tohto produkčného procesu sú podrobnejšie opísané v európskom patente 0199698.
Príklad 2
Produkcia a charakterizácia od kvasiniek odvodeného HBsAg spôsobom bez tiomerzalu
1. Produkcia a purifikácia od kvasiniek odvodeného HBsAg
1.1 Prehľad produkčného spôsobu
Povrchový antigén hepatitídy B sa môže produkovať fermentáciou príslušného kmeňa Saccharomyces cerevisiae, napríklad kmeňa opísaného v Harford a ďalší {loc. cit.).
Na konci fermentácia rekombinantného kvasinkového kmeňa vo veľkom meradle sa bunky zozbierajú a rozrušia sa v prítomnosti mierneho povrchovo aktívneho činidla, ako napríklad Tween 20. Povrchový antigén sa potom izoluje multikrokovým extrakčným a purifikačným postupom, presne ako je opísané v príklade 1, až do kroku prvej gélovej permeácie na Sepharose 4B.
1.2 Purifikačný spôsob bez tiomerzalu
V spôsobe bez tiomerzalu boli zahrnuté nasledujúce dve zmeny v porovnaní so spôsobom opísaným v príklade L
1. Elučný tlmivý roztok pri 4B gélovom permeačnom chromatografíckom kroku už neobsahuje tiomerzal.
2. Do eluátovej zásoby z aniónovo-výmenného chromatografického kroku sa pridáva cysteín (2mM konečná koncentrácia).
Zistilo sa, že vynechanie tiomerzalu zo 4B gélového permeačného tlmivého roztoku môže viesť k precipitácii HBsAg častíc v priebehu CsCI hustotného gradientového centrifugačného kroku, pričom dochádza k strate produktu a agregovaniu alebo zhlukovaniu izolovaného antigénu.
Pridávanie cysteínu v 2mM konečnej koncentrácii do eluátovej zásoby z predchádzajúceho aniónovo-výmenného chromatografického kroku zabraňuje precipitácii a strate antigénu v priebehu CsCI hustotnej centrifugácie.
Cysteín je výhodnou látkou na toto spracovanie, pretože je prirodzene sa vyskytujúcou aminokyselinou a je možné ho odstrániť v následnom odsoľovacom kroku na gélovej permeačnej kolóne použitím Sepharose 4B CLFF ako kolónovej matrice.
V porovnaní so spôsobom opísaným v príklade 1 tento spôsob výroby nezahŕňa žiadne iné zmeny.
1.2a
Predpokladá sa, že tiomerzal, pridávaný do 4B tlmivého roztoku v koncentrácii 50 pg/ml, sa rozkladá a výsledný etyl ortuti sa môže kovalentne viazať na voľné sulfhydrylové skupiny cysteínových zvyškov proteínu. Protein obsahuje 14 cysteínových zvyškov, z ktorých 7 je umiestnených medzi polohami 101 a 150.
Verí sa, že táto oblasť proteínu je lokalizovaná na povrchu častice a obsahuje hlavný antigénny región HBsAg vrátane imunodominantného a regiónu a miesta rozoznávaného RF1 monoklonálnou protilátkou
SK 288079 Β6 (Waters J a ďalší, Postgrad. Med. J., 1987: 63 (dod. 2): 51 - 56; a Ashton-Rickardt a Murray, J. med. Virology, 1989: 29: 196). Antigén purifikovaný s tiomerzalom nachádzajúcim sa v 4B gélovom permeačnom tlmivom roztoku obsahuje približne 0,5 až 0,6 pg ortuti na konci purifikačného procesu. Táto ortuť sa úplne neodstráni jednoduchou dialýzou.
V jednom experimente sa v celkovom antigénovom prípravku nameralo 0,56 pg ortuti na 20 pg proteínu. Tento prípravok sa dialyzoval 16 hodín pri laboratórnej teplote oproti 150mM NaCI, lOmM NaPO4 tlmivému roztoku, pH 6,9. Na konci dialýzy sa namerala koncentrácia 0,33 pg ortuti na 20 pg proteínu.
Na rozdiel od toho dialýza v prítomnosti redukčného činidla, ako napríklad L-cysteínu, v koncentrácii 0,1 až 5,0 mg/ml, DTT v koncentrácii 50 mM alebo 2-merkaptoetanolu v koncentrácii 0,5 M, nasledovaná sekundárnou dialýzou na odstránenie redukčného činidla, viedla k redukcii obsahu ortuti v antigénovom prípravku na menej ako 0,025 pg ortuti na 20 pg proteínu. To je najnižší limit pre detekciu týmto spôsobom.
Obsah ortuti sa stanovoval absorpčnou spektrofotometriou. Antigén sa nariedil v roztoku obsahujúcom 0,01 % hmotnosť/objem chrómanu draselného (K2Cr2O7) a 5 % obj. kyseliny dusitej. Pripravili sa štandardné roztoky s tiomerzalom ako zdrojom ortuti. Atómová absorpcia vzorky a štandardných roztokov sa merala po vaporizácii v generátore pary s katódou špecifickou pre ortuť, pri 253,7 nm. Atómová absorpcia riediacej kvapaliny sa merala ako blank. Obsah ortuti vo vzorke sa vypočítal prostredníctvom kalibračných kriviek získaných zo štandardných roztokov. Výsledky sú uvedené ako pg ortuti na 20 pg proteínu.
1.3 Produkcia celkového antigénu bez tiomerzalu
Kroky spôsobu purifikácie celkového antigénu sú znázornené na obrázku 1.
1.4 Zloženie vakcíny formulovanej bez tiomerzalu
V tabuľke 1 je uvedené typické kvantitatívne zloženie vakcíny hepatitídy B bez konzervačnej látky a formulovanej z antigénu pripraveného spôsobom bez tiomerzalu.
Tabuľka 1
| Zložka | Množstvo zložky na ml |
| Aktívna zložka - proteín, z ktorého aspoň 95 % tvorí HBsAg | 20J1S |
| Hydroxid hlinitý (adsorbent) (ako A12O3) | 0,95 mg |
| Chlorid sodný | 9,0 mg (maximum) |
| Dihydrát fosforečnanu sodného | 0,98 mg |
| Dihydrát dihydrogénfosforečnanu sodného | 0,71 mg |
| Voda pre injekcie | do 1,0 ml |
Zloženie sa môže meniť pridaním 3D-MPL a/alebo iného adjuvans.
2. Charakterizácia celkového antigénu a vakcíny produkovanej spôsobom bez tiomerzalu
2.1 Testovanie purifikovaného celkového antigénu
2.1.1 Základné porovnanie
Pripravili sa tri série celkového antigénu spôsobom bez tiomerzalu podľa tohto príkladu (príklad 1.2) a označili sa ako HEF001, HEF002 a HEF003. Tieto sa porovnávali so sériou celkového antigénu (HEP2055) pripravenou predchádzajúcim spôsobom (ako je opísaný v príklade 1) v prítomnosti tiomerzalu.
2.1.2 Testy celkového antigénu
Testovali sa tri série celkového antigénu pripraveného spôsobom bez tiomerzalu a výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2.
Obsah proteínu sa meral spôsobom podľa Lowryho a ďalších (J. Biol. Chem. 1951: 193: 265).
Obsah endotoxínu sa meral Limulus gélovou zrážacou technikou použitím komerčne dostupného kitu od Cápe Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA. Reakčné činidlá sú štandardizované vzhľadom na US Pharm. Endotoxin Reference Standard.
Tween 20 sa meral spôsobom podľa Huddlestonona a Allreda (J. Amer. Oil Chemist Soc., 1965: 42: 983).
Obsah HBsAg sa meral prostredníctvom komerčne dostupného AusZYME kitu od Abbott Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, USA. Využil sa testovací postup B podľa výrobcu. Vzorka celkového antigénu purifikovaného spôsobom zahŕňajúcim tiomerzal sa použila ako štandard na stanovenie dávkovej odpoveďovej krivky.
Polysacharidy sa merali spôsobom podľa Duboisa a ďalších (Anál. Chem. 1956: 28: 350).
Lipidy sa merali použitím komerčne dostupného kitu (Merkotest Total Lipids 3321) od E. Merck, B. P. 4119, Darmstad D-6100, Germanny.
SK 288079 Β6
Obsah DNA sa meral prahovou metódou použitím zariadenia a reakčných činidiel dostupných od Molecular Devices Corp., Gutenbergstrasse 10, Ismaning, Munich, Nemecko.
Hodnoty zistené v testoch sú v rozsahu hodnôt zistených pre série celkového antigénu vyrobeného použitím tiomerzalu v elučnom tlmivom roztoku Sepharose 4B gélového permeačného kroku, s výnimkou výsledkov antigénnej aktivity získaných prostredníctvom ELISA. Hodnoty tohto merania pre tri HEF prípravky boli vyššie (1,63 až 2,25) ako hodnoty zistené pre HEP2055 sériu celkového antigénu, ktorá mala pomer ELISA/proteín 1,13. Pomery ELISA/proteín merané prostredníctvom AUSZYME kitu pre vzorky celkového antigénu obsahujúce tiomerzal boli vo všeobecnosti približne 1,0 a v rozsahu 0,8 až 1,2 a veľmi zriedka presiahli 1,4.
2.1.3 SDS-PAGE gélová analýza
Celkové antigénové prípravky sa testovali SDS-PAGE analýzou v redukčných podmienkach a s Coomassie blue farbením. Všetky vzorky mali hlavný pás v oblasti 24K so stopami dimémeho proteínu. Vzorky sa vyhodnotili ako veľmi čisté (> 99 %), čo sa stanovilo prostredníctvom neprítomnosti viditeľných pásov kontaminačných proteínov.
Vzorky (1 pg) celkových antigénových prípravkov sa testovali prostredníctvom SDS-PAGE v redukčných a neredukčných podmienkach a s farbením striebrom (obrázok 2). V redukčných podmienkach vzorky mali intenzívny pás migrujúci v oblasti 24 K so stopami dimémej a multimémej formy. Gélové vzory sú nerozlíšiteľné od vzoru HEP2055 ako porovnávacej vzorky. Vzorky sa nechali zbehnúť aj v neredukujúcich podmienkach. V týchto podmienkach menej materiálu migruje v oblasti 24K. a je zvýšené množstvo polypeptidu migrujúceho v dimémej a multimémej polohe. Zdá sa, že série celkového antigénu bez tiomerzalu majú o niečo vyšší stupeň polymerizácie ako porovnávacia séria HEP2055.
Identita 24K polypeptidu odhaleného Coomassie blue alebo strieborným farbením bola potvrdená Western blotom s králičími polyklonálnymi protilátkami vyvolanými proti plazmatickému HBsAg.
Celkové antigénové prípravky mali hlavný pás v oblasti 24K spolu s dimérnou a trimémou formou. Technika odhalila minoritné stopy zlámaných produktov povrchového antigénového proteínu. Nie sú žiadne rozdiely medzi celkovým antigénom pripraveným spôsobom bez tiomerzalu a HEP2055 sériou.
Prítomnosť zvyškových kvasinkových proteínov sa testovala SDS-PAGE analýzou v redukčných podmienkach a Western blotom s králičím polyklonálnym antisérom vyvolaným proti kvasinkovým proteínom (obrázok 3). Technika je kvalitatívna a neumožňuje kvantifikáciu nečistôt.
Dokázaný je konštantný vzor pásov pre tri celkové antigénové série pripravené spôsobom bez tiomerzalu a pre HEP2055 sériu s jednou výnimkou.
Ťažko farbiteľný pás, nachádzajúci sa v oblasti 23K pri HEP2055 celkovom antigéne, v skutočnosti chýba v 3 HEF prípravkoch. Western blot dokazuje, že purifikačný proces bez tiomerzalu vedie k čistejšiemu antigénovému produktu.
Tabuľka 2
Výsledky testov purifikovaného celkového antigénu bez tiomerzalu
| Výsledky testov | ||||
| HEF001 | HEF002 | HEF003 | HEP2055 | |
| __ | 6,8 | 6,8 | 6,8 | 6,8 |
| Obsah proteínu (Lowry) | 1312 g/ml | 888 g/ml | 913 g/ml | 995 g/ml |
| Obsah endotoxínu | < 0,25 EU | < 0,25 EU | < 0,25 EU | < 0,25 EU |
| Tween 20 obsah | 7.1 Pg | 6,6 pg | 7,4 pg | 5,8 pg |
| Antigénna aktivita prostredníctvom ELISA | 2957 pg/ml | 1505 pg/ml | 1486 pg/ml | 1128 pg/ml |
| ELISA/proteín pomer | 2,25 | 1,69 | 1,63 | 1,13 |
| Obsah polysacharidov | 0,33 pg | 0,35 pg | 0,33 pg | 0,34 pg |
| Obsah lipidov | 13,7 pg | 12,8 pg | 12,9 pg | 11,8 pg |
| Obsah DNA prostr. prahovej metódy | < 1 Pg | < 1 PS | < 1 Pg | < 1 Pg |
2.1.4 Iné biochemické testy
2.1.4.1 Obsah DNA
Obsah DNA v 3 celkových antigénových sériách sa meral prahovým spôsobom (Molecular Devices Corp). Namerané množstvá boli nižšie ako 10 pg DNA na 20 pg proteínu (tabuľka 2), pričom rovnaká úroveň DNA obsahu bola nameraná pri celkovom antigéne produkovanom v súčasnosti zavedeným spôsobom.
2.1.4.2 Aminokyselinové zloženie
Aminokyselinové zloženie troch HEF celkových antigénových dávok sa determinovalo po kyslej hydrolýze so 6N HCI prostredníctvom chromatografie aminokyselín na iónovo-výmennej kolóne s postkolónovou ninhydrín detekciou. Nedeterminoval sa prolín a tryptofán. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Zistené zloženia boli v dobrom súlade so zložením determinovaným pre HEP2055 a so zložením očakávaným na základe DNA sekvencie. Hoci počet glycínových zvyškov nameraný pre HEP2055 je blízky očakávanému zloženiu, hodnota 16 až 17 zvyškov sa zvyčajnej šie namerala pre celkové antigénové prípravky. Zistený priemerný počet cysteínových zvyškov je očakávaných 14, z čoho vyplýva, že na časticu nie sú naviazané žiadne extra cysteíny ako výsledok spracovania v CsCI gradientovom kroku.
2.1.4.3 Kvantifikácia voľného cysteínu
Meralo sa množstvo voľného cysteínu nachádzajúce sa v celkových antigénových prípravkoch získaných tu opísaným spôsobom po oxidácii častíc s kyselinou permravčou bez predchádzajúcej kyslej hydrolýzy. Oxidované voľné cysteínové zvyšky sa separovali na iónovo-výmennej kolóne s post kolónovou detekciou prostredníctvom ninhydrínu. Limit pre detekciu cysteínu týmto spôsobom je 1 pg na ml.
Nebolo možné namerať žiadny cysteín v 3 HEF antigénových prípravkoch, keď sa testovali v počiatočných proteínových koncentráciách uvedených v tabuľke 2. Táto technika meria tak voľné cysteínové zvyšky prítomné v tlmivom roztoku, ako aj cysteínové zvyšky, ktoré sú pripojené na HBsAg protein prostredníctvom disulfidovej väzby, ktoré ale netvoria časť polypeptidovej sekvencie.
2.1.4.4N-koncová sekvenčná analýza
Prítomnosť možných proteínových kontaminantov a degradačných produktov v troch celkových antigénových sériách vyrobených modifikovaným spôsobom sa hodnotili N-koncovou sekvenčnou analýzou založenou na Edmanovej degradácii. N-koncová sekvencia MENITS... HBsAg proteinu bola detegovaná bez interferencie s inými sekvenciami. Potvrdilo sa tiež, že N-koncový metionín je na 60 až 75 % blokovaný acetyláciou, ako sa pozorovalo predtým pre HBsAg polypeptid vyrobený rutinným spôsobom.
Tabuľka 3 - Aminokyselinové zloženie HBsAg
| Aminokyseliny | HEF001 | HEF002 | HEF003 | Priemer | HEP2055 | Očakávané |
| Asp | 11,3 | 11,3 | 11,3 | 11,3 | 11,5 | 10 |
| Thr | 17,5 | 17,4 | 17,2 | 17,4 | 17,8 | 17 |
| Ser | 21,4 | 21,6 | 21,4 | 21,5 | 20,9 | 23 |
| Glu | 11 | 11 | 11 | 11,0 | 10,5 | 9 |
| Pro | nd | nd | nd | nd | 24 | |
| Gly | 17,1 | 16,8 | 16,7 | 16,9 | 14,6 | 14 |
| Ala | 7,5 | 7,4 | 7,4 | 7,4 | 7,2 | 6 |
| Cys | 12,3 | 14,95 | 14,9 | 14,1 | 13,2 | 14 |
| Val | 10,9 | 11 | 10,9 | 10,9 | 10,7 | 11 |
| Met | 6,8 | 6,7 | 7,1 | 6,9 | 7,1 | 6 |
| Íle | 12,3 | 12,4 | 12,5 | 12,4 | 12,2 | 16 |
| Leu | 26,3 | 26,6 | 26,2 | 26,4 | 26,7 | 33 |
| Tyr | 6,8 | 6,8 | 6,8 | 6,8 | 7 | 6 |
| Phe | 13,8 | 13,9 | 13,8 | 13,8 | 13,9 | 15 |
| His | 3 | 2,8 | 3,3 | 3,0 | 3,3 | 1 |
| Lys | 4 | 4 | 3,9 | 4,0 | 4,2 | 3 |
| Arg | 5,7 | 5,8 | 5,7 | 5,7 | 6,1 | 5 |
| Trp | nd | nd | nd | nd | 13 |
2.1.4.5Laserová svetelná rozptylová analýza
Robili sa porovnávania veľkosti častíc medzi HBsAg časticami vyrobenými použitím modifikovaného spôsobu a HEP2055 referenčnou sériou prostredníctvom laserového svetelného rozptylu (tabuľka 4). Determinované molekulové hmotnosti majú dobrý súlad medzi prípravkami.
Tabuľka 4
| Antigénová séria | Molekulová hmotnosť (Daltony) |
| HEF001 HEF002 HEF003 HEP2055 | 3,07 x 106 2,76 x 106 2,76 x 106 3,34 x 106 |
SK 288079 Β6
2.1.4.6 Elektrónová mikroskopia
Celkové antigénové prípravky sa skúmali elektrónovou mikroskopiou po fixácii a farbení s uranyl acetátom.
Pozorované častice boli podobné vo všetkých vzorkách a súhlasili s ± 20 nm subsférickými alebo dlaždicovými časticiam v podobe mačacích hláv typických pre HBsAg. Častice pozorované v 3 HEF sériách boli rozlíšiteľné od HEP2055.
2.1.5 Imunologické analýzy
2.1.5.1 Reaktivita s RF 1 monoklonálnou protilátkou
Tri celkové antigénové prípravky sa testovali z hľadiska ich reaktivity s RF1 monoklonálnou protilátkou ELISA inhibičným testom. Bolo dokázané, že RF1 monoklonálna protilátka chráni šimpanzy pred infikovaním s HBV, a je považovaná za protilátku rozoznávajúcu ochranný konfomračný epitop HBsAg častice (Iwarson S a ďalší, 1985, J. Med, Virol., 16: 89 - 96).
RF1 hybridom sa môže rozmnožovať v peritoneálnej dutine BalbC myší alebo v tkanivovej kultúre.
Ascitická tekutina nariedená v pomere 1/50 000 v saturačnom tlmivom roztoku (PBS obsahujúcom 1 % BSA, 0,1 % Tween 20) sa zmiešala v pomere 1 : 1 s rôznymi riedeniami HBsAg vzoriek, ktoré sa mali testovať, v PBS (konečné koncentrácie v rozsahu od 100 pg do 0,05 pg/ml).
Zmesi sa inkubovali v Nunc Immunoplatniach (96U) 1 hodinu pri 37 °C predtým, ako sa preniesli na 1 hodinu (pri 37 °C) na platne pokryté štandardným prípravkom HBsAg. Štandardným HBsAg prípravkom bola séria celkového antigénu (Hep 286) purifikovaná spôsobom zahŕňajúcim tiomerzal. Po premývacom kroku s PBS obsahujúcim 0,1 % Tween 20 sa pridal ovčí anti-myšací IgG konjugovaný s biotínom a nariedený v pomere 1/1000 v saturačnom tlmivom roztoku a nasledovalo inkubovanie 1 hodinu pri 37 °C. Po premývacom kroku sa do rovnakej jamky pridal komplex streptavidínu a biotinylovanej peroxidázy nariedený v pomere 1/1000 v saturačnom tlmivom roztoku a nasledovalo inkubovanie 20 minút pri 37 °C. Platne sa premyli a inkubovali sa s roztokom OPDA 0,04 %, H2O2 0,03 % v 0,1 M citrátovom tlmivom roztoku, pH 4,5, 20 minút pri laboratórnej teplote. Reakcia sa zastavila 2N H2SO4 a zmerali sa optické hustoty (O. D.) pri 490/630 nm a zaznamenali sa do grafu.
Testovali sa aj série HEP antigénových dávok, vrátane HEP2055, spolu s Herpex simplex gD antigénom ako negatívnou kontrolou. Test meral schopnosť každého testovaného antigénu inhibovať viazanie RF1 na štandardný antigénový prípravok (HEP286) naviazaný na mikrotitračných platniach.
Tabuľka 5 poskytuje koncentrácie inhibujúce 50 % RF1 viazania na fixovaný antigén pre každý antigén.
Tabuľka 5
Inhibícia viazania RF1 monoklonálnej protilátky na HBsAg
| Celkový antigén | IC50 (ng/ml)* |
| HEP286 | 3834 |
| HEP673 | 3437 |
| HEP720 | 3150 |
| HEP2055 | 2384 |
| HEF001 | 468 |
| HEF002 | 574 |
| HEF003 | 540 |
*IC50 = koncentrácia antigénu (ng/ml) inhibujúca 50 % RF1 viazania na fixný antigén
Výsledky dokazujú, že na inhibíciu RF1 viazania (tabuľka 5) je potrebných 4 až 7-krát menej HEF antigénu. To dokazuje, že antigén pripravený modifikovaným spôsobom má zvýšenú prezentáciu RF1 epitopu v porovnaní s HEP celkovým antigénom.
2.1.5.2 Afinita viazania na monoklonálnu RF 1
Kinetické parametre viazania RF1 monoklonálnej protilátky na 3 HEF antigénové série a na HEP2055 sa merali povrchovou plazmónovou rezonanciou použitím Biacore 2000 zariadenia od Amersham Phamacia Biotech, Amersham Plavé, Little Chalfont, Bucks, UK. Meranými kinetickými parametrami boli: ka: asociačná rýchlostná konštanta (MA1), kd: disociačná rýchlostná konštanta (S'1),
Ka: rovnovážna alebo afinitná konštanta (M1), kde Ka = ka/kd.
Zistené hodnoty sú uvedené v tabuľke 6.
SK 288079 Β6
Tabuľka 6
Afinitné konštanty RF1 viazania na HBsAg
| Celkový antigén | ka (x 10'3) | kd (x 105) | Ka(x 10’7) |
| HEF001 | 6,81 | 3,21 | 21,97 |
| HEF002 | 6,89 | 3,73 | 18,83 |
| HEF003 | 7,39 | 4,67 | 15,80 |
| HEP2055 | 3,31 | 6,30 | 5,31 |
Tri HEF antigénové série mali podobné hodnoty asociačných/disociačných konštánt a väzobnej afinity. Na rozdiel od nich mal HEP2055 slabšiu afinitu pri viazaní RF1.
To je v súlade s výsledkami z ELISA inhibičného testu, ktorý ukazuje, že antigén pripravený spôsobom bez tiomerzalu má zlepšenú prezentáciu RF1 epitopu.
2.2 Testy vakcín formulovaných s antigénom produkovaný modifikovaným spôsobom
Tri HEF antigénové série sa adsorbovali na hydroxid hlinitý a formulovali sa ako vakcína v súlade so zložením uvedeným v tabuľke 1. Formulované boli v dávke pre dospelých v liekovkách (20 pg antigénového proteínu v 1 ml). Série sa označili ako DENS001A4, DENS002A4 a DENS003A4.
Účinok vakcíny sa meral prostredníctvom in vitro testu obsahu antigénu použitím Abbott Laboratories AUSZYME ELISA kitu a klasickej série vakcíny formulovanej s 50 pg/ml tiomerzalu ako štandardom. Účinok vakcíny sa meral použitím metódy B opísanej v Pharmal Európa Special Issue Bio97-2 (December 1997). Tri HEF série poskytujú vysoké hodnoty antigénového obsahu, takmer dvojnásobok 20 pg, stanoveného obsahu antigénového proteínu.
2.2.1 Reaktivita DENS vakcíny s RF1 monoklonálnou protilátkou
Antigénnosť adsorbovanej vakcíny sa ďalej testovala v inhibičnom teste s RF1 monoklonálnou protilátkou. Test meria schopnosť vakcínovej vzorky inhibovať RF1 viazanie na fixovaný celkový antigén (HEP286).
Ascitická tekutina nariedená v pomere 1/50 000 v saturačnom tlmivom roztoku (PBS obsahujúcom 1 % BSA, 0,1 % Tween 20) sa zmiešala v pomere 1 : 1 s rôznymi riedeniami vakcínových vzoriek, ktoré sa mali testovať, v PBS (koncentrácie v rozsahu od 20 pg do 0,05 pg/ml).
Zmesi sa inkubovali v Nunc Immunoplatniach (96U) 2 hodiny pri 37 °C s pretrepávaním, predtým ako sa preniesli na platne pokryté s HBsAg. HBsAg prípravkom použitým na pokrytie bola séria celkového antigénu (Hep 286) purifikovaného spôsobom zahŕňajúcim tiomerzal. Tieto platne sa potom inkubovali 2 hodiny pri 37 °C s pretrepávaním. Po premývacom kroku s PBS obsahujúcim 0,1 % Tween 20 sa pridal ovčí antimyšací IgG konjugovaný s biotínom a nariedený v pomere 1/1000 v saturačnom tlmivom roztoku a nasledovalo inkubovanie 1 hodinu pri 37 °C. Po premývacom kroku sa do rovnakej jamky pridal komplex streptavidínu a biotinylovanej peroxidázy nariedený v pomere 1/1000 v saturačnom tlmivom roztoku a nasledovalo inkubovanie 30 minút pri 37 °C. Platne sa premyli a inkubovali sa s roztokom obsahujúcim OPDA 0,04 %, H2O2 0,03 % v 0,1 M citrátovom tlmivom roztoku, pH 4,5, 20 minút pri laboratórnej teplote. Reakcia sa zastavila 2N H2SO4 a zmerali sa optické hustoty (O. D.) pri 490/630 nm a zaznamenali sa do grafu.
IC50, definovaná ako koncentrácia antigénu (koncentrácia inhibítora), ktorá inhibuje 50 % viazania protilátky na naviazaný HBsAg, sa vypočítala použitím 4-parametrovej rovnice a vyjadrila sa v ng/ml.
Vakcína pripravená z celkového antigénu vyrobeného modifikovaným spôsobom sa porovnávala s Engerix B™ vakcínou formulovanou z klasického HEP celkového antigénu a bez tiomerzalu ako konzervačnej látky. Testy bežali trojmo.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 7 a dokazujú, že na 50 % inhibíciu RF 1 viazania je potrebné približne polovičné množstvo DENS vakcíny v porovnaní s Engerix B™ vakcínou bez konzervačnej látky. To odráža zvýšenú prezentáciu RF1 epitopu na HEF/DENS antigéne a je v súlade s testami uskutočnenými s RF1 protilátkou na purifikovanom celkovom antigéne.
Tabuľka 7
Inhibícia RF1 viazania formulovanou vakcínou
| Vakcínová séria | IC-50 (ng/ml)1 | |||
| Experiment | Priemer | |||
| DENS001A4 | 1 913 | 2 662 | 3 603 | 726 |
| DENS002A4 | 888 | 715 | 521 | 708 |
| DENS003A4 | 817 | 685 | 582 | 695 |
| ENG5100A2 | 1606 | 1514 | 1481 | 1534 |
| ENG3199B9 | 1329 | 1170 | 1286 | 1262 |
| ENG3328A9 | 1417 | 1194 | 1334 | 1315 |
(1) Koncentrácia vakcíny inhibujúca 50 % viazania RF1 protilátky na fixovaný antigén
SK 288079 Β6
Imunogénnosť DENS vakcíny pri myšiach
Štúdia sa uskutočňovala na Balb/C myšiach, aby sa porovnala imunogénnosť troch DENS súhlasných dávok s Engerix B™ vyrobenou podľa v súčasnosti používaného spôsobu na výrobu antigénu a formulovanou s tiomerzalom.
Testované boli nasledujúce série:
- DENS001A4,
- DENS002A4,
- DENS003A4,
- ENG2953A4/Q ako štandard.
V stručnosti, skupiny po 12 myší sa imunizovali intramuskuláme dvakrát v dvojtýždňovom intervale s vakcínovými dávkami zodpovedajúcimi 1/10 (2 gg) alebo 1/50 (0,4 gg) dávky pre dospelého človeka. Protilátková odpoveď na HBsAg a izotypový profil indukovaný očkovaním sa monitorovali zo séra odobratého na 28. deň.
Návrh experimentu
Skupiny 12 Balb/C myší sa imunizovali intramuskuláme do oboch nôh (2 x 50 gl) v deň 0 a 15 s nasledujúcimi vakcínovými sériami:
Tabuľka 8
Skupiny a vakcínové série
| Skupina | Vakcína | Objem | Antigénová dávka |
| 1 | DENS001A4 | 100 gl | 2 gg |
| 2 | -♦ nariedená 5x v PO4/NaCI | 100 gl | 0,4 gg |
| 3 | DENS002A4 | 100 gl | 2 pg |
| 4 | —> nariedená 5x v PO4/NaCI | 100 gl | 0,4 pg |
| 5 | DENS003A4 | 100 gl | 2 pg |
| 6 | —> nariedená 5x v PO4/NaCI | 100 gl | 0,4 gg |
| 7 | ENG2953A4/Q | 100 gl | 2 Pg |
| 8 | —> nariedená 5x v PC^/NaCI | 100 gl | 0,4 gg |
Na 15. deň (2 týždne po I) a na 28. deň (2 týždne po II) sa z retroorbitálneho sínusu odobrala krv.
Pri návrhu tohto experimentu (4 formulácie x 2 dávky s 12 myšami na skupinu) bola sila odhadnutá a priori s PASS štatistickým programom. PASS (Power and Sample Size) štatistický program sa získal od NCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037. Pre dvojfaktorovú disperznú analýzu by sa mal detegovať 2,5-násobný rozdiel GMT medzi formuláciami s 5 % alfa chybou so silou viac ako 90 %.
Výsledky
Sérológia
Humorálne reakcie (celkové Ig a izotypy) sa merali ELISA testom použitím HBsAg (Hep286) ako pokrývacieho antigénu a anti-myšacích protilátok konjugovaných s biotínom na odhalenie anti-HBs protilátkového viazania. Analyzovali sa len post II séra.
Tabuľka 9 znázorňuje priemer a GMT anti-HBs Ig protilátkové reakcie merané v jednotlivých sérach 2 týždne post II.
DENS a klasickými hepatitídovými B formuláciami sa indukujú porovnateľné protilátkové reakcie: GMT v rozsahu od 2 304 do 3 976 EU/ml pre DENS série v porovnaní s 2 882 EU/ml pre SB Biologicals hepatitídovú B monovalentnú vakcínu (Engerix B™) v dávke 2 gg, a GMT v rozsahu 696 až 1 182 EU/ml pre DENS série v porovnaní s 627 EU/ml pre SB Biologicals hepatitídovú B monovalentnú vakcínu (Engerix B™) v dávke 0,4 gg.
Ako sa očakávalo, pozoruje sa jasný antigénový dávkový rozsahový efekt pre všetky formulácie v dávkach 2 gg a 0,4 gg s 3 až 6-násobným rozdielom v GMTs.
Pozorovali sa štyri nereagujúce myši (titre menej ako 50 EU/ml) bez jasných spojení s antigénovými dávkami alebo sériami použitými pre injekciu (skupiny 1, 2, 3 a 8; jedna myš na skupinu).
Na základe štatistickej analýzy (Grubbsov test) boli tieto myši vylúčené z ďalšej analýzy.
SK 288079 Β6
Tabuľka 9
Protilátková reakcia pri myšiach v deň 28 (2 týždne post II)
| Skupina | Vakcína | Dávka | Počet | ELISA titre (Ig) | |
| Priemer | GMT | ||||
| 1 | DENS001A4 | 2 pg | 11 | 3466 | 2971 |
| 2 | 0,4 pg | 11 | 1283 | 1182 | |
| 3 | DENS002A4 | 2 Pg | 11 | 2436 | 2304 |
| 4 | 0,4 pg | 12 | 984 | 786 | |
| 5 | DENS003A4 | 2 pg | 12 | 4583 | 3976 |
| 6 | 0,4 pg | 12 | 997 | 696 | |
| 7 | ENG2953 | 2 pg 0,4 pg | 12 11 | 3999 737 | 2882 627 |
Štatistická analýza
Uskutočnila sa dvojfaktorová disperzná analýza anti-HBs titrov po log transformácii post II údajov, použitím vakcín (4 typy) a antigénových dávok (2 pg, 0,4 pg) ako faktorov. Táto analýza potvrdila, že sa pozoroval štatisticky významný rozdiel medzi dvoma antigénovými dávkami (p hodnota < 0,001) a nedokázala žiadny významný rozdiel medzi vakcínovými sériami (p hodnota = 0,2674). Ako bolo uvedené, sila sa odhadla a priori a návrh experimentu bol taký, aby bolo možné detegovať 2,5-násobný rozdiel GMT s alfa chybou 5 % medzi formuláciami so silou > 90 %.
Izotypový profil
Tabuľka 10 uvádza izotypové rozdelenie (IgGl, lgG2 a lgG2b) vypočítané z analýzy spojených sér v post II.
Ako sa očakávalo, pozorovalo sa, že tieto vakcíny založené na kamenci indukujú jasnú TH2 odpoveď vo forme najmä IgGl protilátok.
Nepozoroval sa žiadny rozdiel medzi DENS sériami alebo SB Biologicals hepatitídovou B monovalentnou vakcínou, čo sa týka izotypového profilu.
Tabuľka 10
Rozdelenie IgG izotypov v spojených sérach z 28. dňa
| Skupina | Vakcína | Dávka | IgGl | Izotyp (%) lgG2a | lgG2b |
| 1 | DENS001A4 | 2 pg | 91 | 4 | 5 |
| 2 | 0,4 pg | 87 | 8 | 5 | |
| 3 | DENS002A4 | 2 pg | 97 | 2 | 1 |
| 4 | 0,4 pg | 87 | 6 | 7 | |
| 5 | DENS003A4 | 2 pg | 98 | 1 | 1 |
| 6 | 0,4 pg | 93 | 4 | 3 | |
| 7 | ENG2953A4/Q | 2 Pg | 88 | 8 | 4 |
| 0,4 pg | 88 | 9 | 3 |
Príklad 3
Formulovanie kombinovaných vakcín
Celkový antigén podľa vynálezu je výnimočne vhodný na formulovanie kombinovaných vakcín obsahujúcich IPV.
Štúdie stability uskutočňované na počiatočných sériách kombinovanej DTPa-HBV-IPV vakcíny indikovali pokles účinnosti IPV komponentu, najmä poliomyelitídového antigénu typu 1, keď sa použil in vitro imunotest (determinácia obsahu D-antigénu prostredníctvom ELISA) a in vivo test účinnosti na potkanoch. Pre typ 3 nebola pozorovaná žiadna strata účinnosti. Pre typ 2 bola strata účinnosti v očakávanom rozsahu (nie väčšia ako 10 % strata na rok skladovania).
Iniciovali sa štúdie na determináciu príčiny tejto straty účinnosti v kombinovanej DTPa-HBV-IPV vakcíne. Z pozorovania, že stabilita IPV v SB Biologicals DTPa-IPV vakcíne je uspokojivá (nie viac ako 10 % strata obsahu antigénu na rok skladovania), sa vyvodilo, že HBV komponent je pravdepodobne zodpovedný za nestabilitu IPV v DTPa-HBV-IPV vakcíne.
HBV komponent použitý v počiatočnej DTPa-HBV-IPV formulácii je purifikovaná rDNA, z kvasinky odvodený HBsAg používaný aj na výrobu SB Biologicals hepatitídovej B monovalentnej vakcíny, a je pripravený, ako je opísané v príklade 1.
Ako prvý pokus o určenie toho elementu v HBV komponente, ktorý je Škodlivý pre IPV, sa analyzoval celkový HBsAg z hľadiska prítomností tiomerzalu. Predtým sa zistilo (Davisson a ďalší, 1956, J. Lab. Clin. Med 47: 8 - 19), že tiomerzal používaný ako konzervačná látka v DTP vakcínach ,je škodlivý pre poliomye12
SK 288079 Β6 litídový vírus“ v kombinácii DTP-IPV. Toto pozorovanie bolo brané do úvahy výrobcami vakcín, ktorí nahradili tiomerzal inými konzervačnými látkami pri formulovaní ich vakcín obsahujúcich IPV. V bližšej minulosti sa znova skúmal vplyv tiomerzalu na IPV účinok v podmienkach dlhotrvajúceho skladovania pri +4 °C. Publikovaná bola strata účinku polio vírusového antigénu typu 1 na nedetekovateľnú úroveň po 4 až 6 mesiacoch (Sawyer, L. A. a ďalší, 1994, Vaccine 12: 851 - 856).
Použitím atómovej adsorpčnej spektroskopie sa detegovalo približne 0,5 gg ortuti (Hg) na 20 gg HBsAg v antigéne purifikovanom podľa príkladu 1.
Toto množstvo ortuti (vo forme tiomerzalu a chloridu etylortuťnatého, degradačného produktu tiomerzalu) môže znížiť ELISA reakciu na obsah D-antigénu typu 1 v IPV celkovom koncentráte, inkubovanom pri 37 °C 7 dní, na nedetekovateľnú úroveň.
Zaviedol sa spôsob na uvoľnenie ortuti nachádzajúcej sa v celkovom HBsAg. Určilo sa, že ortuť by sa mohla viazať na tiolové skupiny HBsAg častice, a preto by bolo možné ju uvoľniť v prítomnosti redukujúcich činidiel. Po experimentovaní s inými redukčnými činidlami sa L-cysteín vybral ako činidlo na uvoľnenie ortuti z HBsAg častice. Po dialýze celkového HBsAg oproti soľanke obsahujúcej 5,7mM L-cysteín nebola v retenáte detegovaná žiadna ortuť (detekčný limit testovacej metódy: 25 ng Hg/20 gg HBsAg). Dialyzovaný antigén sa zmiešal s IPV celkovým koncentrátom a stabilita vírusu typu 1 sa stanovovala meraním obsahu D-antigénu po inkubovaní pri 37 °C, 7 dní. IPV celkové koncentráty nezmiešané a zmiešané s HBsAg, na ktoré sa nepôsobilo cysteínom, sa použili ako kontroly. Referenčný ELISA titer sa získal zo vzoriek uskladnených pri +2 °C až 8 °C 7 dní. Výsledky sú sumarizované v tabuľke 11.
Tabuľka 11
| Vzorka | Obsah D-antigénu (typ l)1 | Strata | |
| 7 dní/4 °C | 7 dní/37 °C | ||
| IPV (nezmiešaný) | 31,6 | 24,2 | 23% |
| IPV + HBsAg neošetrený | 31,1 | 18,1 | 42% |
| IPV + HBsAg ošetrený s cysteínom | 31,4 | 27,6 | 12% |
| IPV + tiomerzal (1 gg/ml) | 30,5 | 11,0 | 74% |
(1) vyjadrené v jednotkách D-antigénu (DU)
Údaje získané pri týchto laboratórnych prípravkoch jasne demonštrujú, že stabilita polio vírusu typu 1 sa významne zlepší, ak sa na HBsAg pôsobí cysteínom, aby sa odstránila zvyšná ortuť, pred zmiešaním s IPV.
Prezentované údaje tiež dokazujú 23 % stratu obsahu D-antigénu v porovnaní s IPV prípravkom po 7 dňovom inkubovaní pri 37 °C. Toto potvrdzuje charakteristickú nestabilitu Mahoney polio vírusu typu 1, ako už bolo predtým publikované (Sawyer, L. A. a ďalší (1994), Vaccie 12: 851 - 856).
Hoci komerčné šarže DTPa-HBV-IPV a DTPa-HBV-IPV/Hib vakcín boli pripravené použitím dialyzačného procesu s 5,7mM L-cysteínom na odstránenie zvyškovej ortuti a na zachovanie stability IPV, dialyzačný proces nie je vhodný na produkciu vo veľkom meradle a zahŕňa série dodatočných krokov, aby sa pripravil HBsAg bez tiomerzalu alebo ortuti. Na rozdiel od toho HBsAg podľa predloženého vynálezu, pripravený bez tiomerzalu, sa môže priamo použiť vo formuláciách kombinovaných vakcín, najmä vakcín obsahujúcich IPV.
4. Zhrnutie
Predtým používaný spôsob purifikácie povrchového antigénu odvodeného z kvasinky zahŕňa gélový permeačný krok, pri ktorom sa v elučnom tlmivom roztoku nachádza anti-mikrobiálna zlúčenina tiomerzal, obsahujúca ortuť, na kontrolu biologických škodlivín v tele.
Tiomerzal v priebehu nasledujúcich krokov procesu nevymizne úplne, takže v purifikovanom celkovom proteíne sa nachádza približne 1,2 gg tiomerzalu na 20 gg proteínu.
Na produkciu celkového antigénu úplne bez tiomerzalu (ortuti) sa purifikačný proces menil v dvoch krokoch.
- Tiomerzal sa vynecháva z elučného tlmivého roztoku pri 4B gélovom permeačnom kroku.
- Do eluátovej zásoby z aniónovo-výmenného chromatografického kroku sa pridáva cysteín (2mM konečná koncentrácia). To zabraňuje precipitácii antigénu v priebehu centrifugácie v CsCI hustotovom gradiente.
Žiadne ďalšie zmeny sa do produkčného procesu nezavádzajú.
Bol charakterizovaný celkový antigén produkovaný modifikovaným spôsobom. Fyzikálno-chemické testy ukázali, že vlastnosti antigénu bez tiomerzalu sú nerozlíšiteľné od vlastností antigénu produkovaného predtým používaným spôsobom. Antigénové častice majú rovnaké súčasti.
Identita a integrita HBsAg polypeptidu nie je ovplyvnená modifikovaným procesom, čo sa dokázalo SDS-PAGE analýzou, Western blotom použitím polyklonálnych anti-HBsAg protilátok, N-koncovej sekvenčnej analýzy a aminokyselinovým zložením. Elektrónová mikroskopia a laserová svetelná rozptylová ana13
SK 288079 Β6 lýza dokazujú, že častice majú typickú formu a veľkosť očakávanú pre HBsAg odvodený z kvasiniek. Analýza prostredníctvom Westem blotu s anti-kvasinkovým proteínovým sérom dokazuje, že antigén produkovaný spôsobom bez tiomerzalu má podobný vzor kontaminujúcich kvasinkových proteínov. Ale množstvo kontaminujúceho pásu migrujúceho v oblasti 23K je značne redukované pri 3 HBsAg šaržách produkovaných použitím modifikovaného spôsobu.
Imunologické analýzy dokazujú, že častice bez tiomerzalu majú zvýšenú antigénnosť. Častice sú reaktívnejšie s Abbott AUSZYME kitom (obsahujúcim zmes monoklonálnych protilátok), pričom poskytujú ELISA/proteínový pomer 1,6 až 2,25. Toto zvýšenie antigénnosti je dokázané aj s ochrannou RF1 monoklonálnou protilátkou. Približne 4 až 7-krát menej antigénu bez tiomerzalu je potrebného na inhibovanie RF1 viazania na štandardný fixovaný antigén. Inhibície viazania antigénom bez tiomerzalu a klasickým antigénom spadajú do dvoch rozličných kategórií. Tento rozdiel je dokázaný aj meraniami väzobnej afinitnej konštanty pre RF1 použitím povrchovej plazmónovej rezonancie. Väzobné afinity prípravkov bez tiomerzalu sú 3 až 4-krát vyššie v porovnaní so šaržou klasického celkového antigénu.
Celkové antigénové prípravky boli formulované ako vakcína prostredníctvom adsorpcie na hydroxid hlinitý a bez konzervačnej látky.
Testovanie in vitro účinnosti použitím Abbott AUSZYME ELISA kitu a SB Biologicals hepatitídovej B monovalentnej vakcíny obsahujúcej tiomerzal ako štandardu, dokázalo, že sa získali vysoké hodnoty in vitro účinnosti. Obsah antigénu meraný týmto testom bol takmer dvakrát taký ako stanovená hodnota 20 pg proteínu na ml.
Zvýšená reaktivita vakcíny pripravenej z antigénu bez tiomerzalu sa pozorovala aj v inhibičnom teste s RF1 monoklonálnou protilátkou pri viazaní sa na fixovaný antigén. Približne polovičné množstvo vakcíny bez tiomerzalu bolo potrebné na poskytnutie 50 % inhibície RF 1 viazania na fixovaný antigén v porovnaní s antigénom purifikovaný predtým používaným spôsobom a formulovaným bez konzervačnej látky.
Zvýšená antigénnosť vakcíny bez tiomerzalu s ohľadom na RF1 je v súlade s výsledkami testu in vitro účinnosti (obsah antigénu) a s RF 1 protilátkovými testami uskutočňovaných na celkových antigénových prípravkoch.
Myšací test imunogénnosti sa uskutočňoval prostredníctvom primárneho a boosterového očkovania, s dvojtýždňovým odstupom a dávkami 2 a 0,4 pg antigénu. Myšiam sa odobrala krv na 28. a 14. deň po boosterovej injekcii. Séra sa analyzovali na protilátkový titer a izotypové zloženie. Pozoroval sa jasný od dávky závislý efekt pre dve podávané dávky, ale nebol žiadny štatisticky významný rozdiel v odpovedi, čo sa týka protilátkových titrov (GMT) medzi vakcínou bez tiomerzalom a vakcínou bez konzervačných látok.
Žiadne podstatné zmeny sa nepozorovali v izotypových profiloch.
Claims (5)
1. Spôsob výroby stabilnej, imunogénnej hepatitídovej B vakcíny bez stôp tiomerzalu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:
a) exprimovanie hepatitídového B povrchového antigénu (HBsAg) ako rekombinantného proteínu v Saccharomyces cerevisiae,
b) spracovanie kvasinkových buniek na poskytnutie surového antigénového prípravku,
c) podrobenie sa surového antigénového prípravku gélovej permeačnej chromatografii, pri ktorej sa používa elučný tlmivý roztok neobsahujúci tiomerzal,
d) podrobenie sa antigén obsahujúceho eluovaného roztoku z kroku (c) iónovej výmennej chromatografii,
e) pridanie cysteínu do antigén obsahujúcej zásoby eluovaného roztoku získanej v kroku (d),
f) podrobenie prípravku z kroku e) ultracentrifugácii v chloride céznom a
g) spojenie purifikovaného HBsAg s farmaceutický prijateľným excipientom na vytvorenie stabilnej, imunogénnej hepatitídovej B vakcíny, pričom do výslednej vakcíny sa nepridáva žiadny tiomerzal.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že cysteín sa pridáva do konečnej koncentrácie 1 až 10 mM.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že cysteín sa pridáva do konečnej koncentrácie približne 2 mM.
4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 3, vyznačujúci sa tým, že iónovou výmennou chromatografiou je aniónová výmenná chromatografia.
5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že vakcína obsahuje aj adjuvans.
6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že adjuvans je hlinitá soľ.
7. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že adjuvans je gél z hydroxidu hlinitého alebo fosforečnan hlinitý.
8. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že adjuvans je Thl-indukujúci adjuvans.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že Thl-indukujúci adjuvans je 3-deacetylovaný monofosforyl lipid A, QS21, 3-deacetylovaný monofosforyl lipid A a QS21 alebo CpG oligonukleotid.
5 10. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že adjuvans je 3-deacetylovaný monofosforyl lipid A a hlinitá soľ.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0019728.5A GB0019728D0 (en) | 2000-08-10 | 2000-08-10 | Novel treatment |
| GB0101334A GB0101334D0 (en) | 2001-01-18 | 2001-01-18 | Novel compounds |
| PCT/EP2001/009100 WO2002012287A1 (en) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Purification of hbv antigens for use in vaccines |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK288079B6 true SK288079B6 (sk) | 2013-06-03 |
Family
ID=26244821
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK50032-2012A SK288079B6 (sk) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Method for preparing stable, immunogenic hepatitis B vaccine without trace of thiomersal |
| SK169-2003A SK288069B6 (sk) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Process for preparing hepatitis B virus vaccine |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK169-2003A SK288069B6 (sk) | 2000-08-10 | 2001-08-07 | Process for preparing hepatitis B virus vaccine |
Country Status (36)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20030235590A1 (sk) |
| EP (2) | EP1307473B1 (sk) |
| JP (2) | JP2004505992A (sk) |
| KR (1) | KR100804922B1 (sk) |
| CN (1) | CN1468256B (sk) |
| AP (1) | AP2003002734A0 (sk) |
| AR (1) | AR030325A1 (sk) |
| AT (2) | ATE412665T1 (sk) |
| AU (2) | AU2001282073B2 (sk) |
| BG (1) | BG66038B1 (sk) |
| BR (1) | BRPI0113155C1 (sk) |
| CA (2) | CA2427475C (sk) |
| CY (2) | CY1106310T1 (sk) |
| CZ (1) | CZ303217B6 (sk) |
| DE (2) | DE60116107T2 (sk) |
| DK (2) | DK1666487T3 (sk) |
| DZ (1) | DZ3470A1 (sk) |
| EA (1) | EA006433B1 (sk) |
| EG (1) | EG25829A (sk) |
| ES (2) | ES2254464T3 (sk) |
| HK (1) | HK1056884A1 (sk) |
| HU (1) | HU228932B1 (sk) |
| IL (2) | IL154301A0 (sk) |
| MX (1) | MXPA03001235A (sk) |
| MY (1) | MY128999A (sk) |
| NO (1) | NO20030635L (sk) |
| NZ (1) | NZ524012A (sk) |
| OA (1) | OA12361A (sk) |
| PE (1) | PE20020287A1 (sk) |
| PL (1) | PL204736B1 (sk) |
| PT (1) | PT1666487E (sk) |
| SI (2) | SI1307473T1 (sk) |
| SK (2) | SK288079B6 (sk) |
| UA (1) | UA79735C2 (sk) |
| UY (1) | UY26882A1 (sk) |
| WO (1) | WO2002012287A1 (sk) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
| GB0202901D0 (en) * | 2002-02-07 | 2002-03-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel vaccine |
| SG163572A1 (en) * | 2005-07-11 | 2010-08-30 | Globeimmune Inc | Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies |
| ATE526036T1 (de) * | 2005-08-02 | 2011-10-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Reduzierung der interferenz zwischen ölhaltigen adjuvanzien und surfactanthaltigen antigenen |
| GB0522765D0 (en) * | 2005-11-08 | 2005-12-14 | Chiron Srl | Combination vaccine manufacture |
| GB0612142D0 (en) | 2006-06-20 | 2006-08-02 | Secr Defence | Spreading modulation spectrum control |
| EP2097102B1 (en) | 2006-09-07 | 2012-05-30 | GlaxoSmithKline Biologicals s.a. | Combination vaccine having reduced polio virus antigen quantities |
| EP2682127A1 (en) | 2007-05-02 | 2014-01-08 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Vaccine |
| WO2009057699A1 (ja) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | Kyocera Corporation | 弾性波装置 |
| US8250102B2 (en) * | 2008-03-14 | 2012-08-21 | Microsoft Corporation | Remote storage and management of binary object data |
| KR100959145B1 (ko) | 2008-03-21 | 2010-05-25 | 중앙대학교 산학협력단 | 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법 |
| EP2293813A4 (en) | 2008-05-23 | 2012-07-11 | Univ Michigan | NANOEMULSION VACCINES |
| NZ596501A (en) * | 2009-05-27 | 2013-11-29 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Casb7439 constructs |
| DK2705365T3 (en) * | 2011-01-14 | 2016-10-24 | Hal Allergy Holding B V | Immunoassay for the direct determination of the antigen content in the products containing the adjuvant-linked antigen particles |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| CN106222129A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-12-14 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法 |
| GEP20227386B (en) | 2017-07-18 | 2022-06-10 | Serum Institute Of India Pvt Ltd | Immunogenic composition having improved stability, enhanced immunogenicity and reduced reactogenicity and process for preparation thereof |
| GB201721069D0 (en) | 2017-12-15 | 2018-01-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hepatitis B Immunisation regimen and compositions |
| GB201721068D0 (en) | 2017-12-15 | 2018-01-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hepatitis B immunisation regimen and compositions |
| JP2022524007A (ja) | 2019-03-05 | 2022-04-27 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | Ｂ型肝炎免疫化レジメンおよび組成物 |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1030777A (en) * | 1963-12-06 | 1966-05-25 | Ciba Ltd | Method of preparing a vaccine against trypanosoma cruzi infections |
| US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
| US4372945A (en) | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
| IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
| US4720385A (en) * | 1983-03-29 | 1988-01-19 | Miles Laboratories, Inc. | Protein compositions substantially free from infectious agents |
| JPS6013718A (ja) | 1983-07-05 | 1985-01-24 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Ｂ型肝炎ワクチン |
| KR850001534A (ko) | 1983-08-22 | 1985-03-30 | 제임스 에프. 나우톤 | 형질전환된 효모로 부터 유도된 면역원성 HBsAg |
| US4683294A (en) | 1985-04-03 | 1987-07-28 | Smith Kline Rit, S.A. | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them |
| FI861417A0 (fi) | 1985-04-15 | 1986-04-01 | Endotronics Inc | Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav. |
| US4649192A (en) * | 1985-05-30 | 1987-03-10 | Smith Kline-Rit | Method for the isolation and purification of hepatitis B surface antigen using polysorbate |
| US4895800A (en) | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| EP0278940A3 (en) | 1987-01-30 | 1988-12-07 | Smithkline Biologicals S.A. | Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| EP0304578B1 (en) | 1987-06-22 | 2001-10-24 | Medeva Holdings Bv | Peptide comprising hepatitis B surface antigen |
| ES2056799T3 (es) | 1987-07-17 | 1994-10-16 | Rhein Biotech Ges Fur Biotechn | Moleculas de adn codante para las regiones de control fmdh y gen estructural para una proteina que tiene una actividad de fmdh y su uso. |
| EP0314240A3 (en) | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| JPH085804B2 (ja) | 1988-04-28 | 1996-01-24 | 財団法人化学及血清療法研究所 | Ａ型及びｂ型肝炎混合アジュバントワクチン |
| US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
| US5242812A (en) * | 1989-02-07 | 1993-09-07 | Bio-Technology General Corp. | Method for production and purification of hepatitis B vaccine |
| US5274081A (en) * | 1989-09-20 | 1993-12-28 | Immuno A.G. | Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen |
| GB9007024D0 (en) | 1990-03-29 | 1990-05-30 | Imperial College | Novel vaccine |
| AU9052091A (en) | 1990-12-20 | 1992-07-22 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Vaccines based on hepatitis b surface antigen |
| JP3026029B2 (ja) | 1991-04-26 | 2000-03-27 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 組換え水痘ウイルスとその作製法 |
| AU657168B2 (en) | 1991-09-18 | 1995-03-02 | Amgen, Inc. | Hepatitis B vaccine with bile salt adjuvant |
| US6620414B2 (en) * | 1992-03-27 | 2003-09-16 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A |
| ES2143716T3 (es) | 1992-06-25 | 2000-05-16 | Smithkline Beecham Biolog | Composicion de vacuna que contiene adyuvantes. |
| GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| DE69535905D1 (de) | 1994-07-15 | 2009-02-26 | Coley Pharm Group Inc | Immunomodulatorische Oligonukleotide |
| NZ295998A (en) * | 1994-10-24 | 1999-10-28 | Ophidian Pharm Inc | Neutralizing antitoxins against clostridium difficile and clostidium botulinum toxins |
| KR960023066A (ko) * | 1994-12-10 | 1996-07-18 | 성재갑 | 전에스 (s) 2 펩티드 함유 비 (b) 형 간염 표면항원의 정제 방법 |
| UA56132C2 (uk) | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
| HUP0101047A3 (en) * | 1998-03-09 | 2004-10-28 | Smithkline Beecham Biolog | Combined vaccine compositions |
| AU773204C (en) | 1998-08-10 | 2005-05-19 | Antigenics Llc | Compositions of CPG and saponin adjuvants and methods thereof |
| EP1140155A4 (en) * | 1998-12-23 | 2004-11-03 | Merck & Co Inc | IMPROVED RECOMBINATION HEPATITIS B ENVELOPE ANTIGEN |
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
-
2001
- 2001-07-08 UA UA2003021025A patent/UA79735C2/uk unknown
- 2001-08-07 DK DK05077471T patent/DK1666487T3/da active
- 2001-08-07 MX MXPA03001235A patent/MXPA03001235A/es active IP Right Grant
- 2001-08-07 AT AT05077471T patent/ATE412665T1/de active
- 2001-08-07 OA OA1200300038A patent/OA12361A/en unknown
- 2001-08-07 DZ DZ013470A patent/DZ3470A1/fr active
- 2001-08-07 SI SI200130489T patent/SI1307473T1/sl unknown
- 2001-08-07 AP APAP/P/2003/002734A patent/AP2003002734A0/en unknown
- 2001-08-07 HU HU0302951A patent/HU228932B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 EP EP01960630A patent/EP1307473B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 US US10/344,211 patent/US20030235590A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-07 NZ NZ524012A patent/NZ524012A/en unknown
- 2001-08-07 DE DE60116107T patent/DE60116107T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 SI SI200130884T patent/SI1666487T1/sl unknown
- 2001-08-07 PL PL362322A patent/PL204736B1/pl unknown
- 2001-08-07 CZ CZ20030385A patent/CZ303217B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 IL IL15430101A patent/IL154301A0/xx unknown
- 2001-08-07 CN CN018169988A patent/CN1468256B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 DE DE60136400T patent/DE60136400D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 EA EA200300129A patent/EA006433B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 CA CA2427475A patent/CA2427475C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 ES ES01960630T patent/ES2254464T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 KR KR1020037001933A patent/KR100804922B1/ko active IP Right Grant
- 2001-08-07 AU AU2001282073A patent/AU2001282073B2/en not_active Expired
- 2001-08-07 DK DK01960630T patent/DK1307473T3/da active
- 2001-08-07 ES ES05077471T patent/ES2314555T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 SK SK50032-2012A patent/SK288079B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 AU AU8207301A patent/AU8207301A/xx active Pending
- 2001-08-07 SK SK169-2003A patent/SK288069B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 CA CA2740282A patent/CA2740282A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-07 WO PCT/EP2001/009100 patent/WO2002012287A1/en active IP Right Grant
- 2001-08-07 EP EP05077471A patent/EP1666487B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-07 PT PT05077471T patent/PT1666487E/pt unknown
- 2001-08-07 BR BRPI0113155A patent/BRPI0113155C1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-08-07 JP JP2002518258A patent/JP2004505992A/ja active Pending
- 2001-08-07 AT AT01960630T patent/ATE313558T1/de active
- 2001-08-08 EG EG2001080869A patent/EG25829A/xx active
- 2001-08-08 AR ARP010103790A patent/AR030325A1/es active IP Right Grant
- 2001-08-08 PE PE2001000786A patent/PE20020287A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-08-10 MY MYPI20013779A patent/MY128999A/en unknown
- 2001-08-10 UY UY26882A patent/UY26882A1/es not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-02-05 IL IL154301A patent/IL154301A/en active IP Right Grant
- 2003-02-07 NO NO20030635A patent/NO20030635L/no unknown
- 2003-02-07 BG BG107545A patent/BG66038B1/bg active Active
- 2003-10-14 HK HK03107371A patent/HK1056884A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-11-03 US US11/266,565 patent/US20060159705A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-03-07 CY CY20061100311T patent/CY1106310T1/el unknown
-
2008
- 2008-12-10 CY CY20081101440T patent/CY1108789T1/el unknown
- 2008-12-23 US US12/342,220 patent/US8624004B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-08-16 JP JP2012180462A patent/JP5559847B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5559847B2 (ja) | ワクチンに使用するためのｈｂｖ抗原の精製 | |
| KR100365373B1 (ko) | B형간염백신 | |
| AU2001282073A1 (en) | Purification of HBV antigens for use in vaccines | |
| WO2003066094A2 (en) | Hepatitis b vaccines | |
| JP4974441B2 (ja) | 抗原性凝集物を得る方法と製剤におけるその使用 | |
| NO337659B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Expiry date: 20210807 |