NO320074B1 - Fremgangsmater for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine, samt multivalent vaksine fremstilt i folge fremgangsmaten. - Google Patents
Fremgangsmater for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine, samt multivalent vaksine fremstilt i folge fremgangsmaten. Download PDFInfo
- Publication number
- NO320074B1 NO320074B1 NO19981189A NO981189A NO320074B1 NO 320074 B1 NO320074 B1 NO 320074B1 NO 19981189 A NO19981189 A NO 19981189A NO 981189 A NO981189 A NO 981189A NO 320074 B1 NO320074 B1 NO 320074B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- proteosome
- determinant
- amphiphile
- vaccine according
- vaccine
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 11
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 112
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 111
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 23
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 claims abstract description 20
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000606999 Plesiomonas shigelloides Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 claims abstract 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 32
- DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N n-dodecyl-n,n-dimethylglycinate Chemical group CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC([O-])=O DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 19
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 14
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims description 14
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 claims description 8
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 241000607766 Shigella boydii Species 0.000 claims description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 claims description 2
- 241000607000 Plesiomonas Species 0.000 claims 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 30
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 abstract description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 16
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 22
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 241000147000 Shigella flexneri 2a Species 0.000 description 15
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 206010040550 Shigella infections Diseases 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 208000004429 Bacillary Dysentery Diseases 0.000 description 10
- 201000005113 shigellosis Diseases 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 5
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 5
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 101710099705 Anti-lipopolysaccharide factor Proteins 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000776 antibody secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000012500 good manufacturing practice method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- -1 liposaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000008949 local secretion Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000011232 storage material Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940031572 toxoid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/008—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1275—Lipoproteins; Chylomicrons; Artificial HDL, LDL, VLDL, protein-free species thereof; Precursors thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/25—Shigella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0043—Nose
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Denne oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine, samt multivalent vaksine fremstilt ifølge fremgangsmåten.
For at multivalente sub-enhetvaksiner skal kunne stimulere optimale immunresponser på hver av komponentene bør de riktige komponenter være hensiktsmessig assosiert og hver enkelt være tilgjengelig for immunsystemet slik at de effektivt kan gjenkjennes og bearbeides av cellene i immunsystemet. Viktige eksempler på slike ikke-kovalent komplekserte vaksiner inkluderer proteosom-vaksiner som kan bestå av yttermembran-proteosomer fra neisseria ikke-kovalent kompleksert med en rekke forskjellige antigener innbefattet peptider, lipopeptider, transmembrane eller toksoide proteiner, polysakkarider eller lipopolysakkarider (LPS)
(patentsøknad nr. 07/065.440 innlevert 23. juni 1987 "Immunogenic peptide vaccines and methods of preparation"; 07/336.952 innlevert 12. april 1989 "Immunopotentiating system for large proteins and polypeptides"; 07-958.426 innlevert 8. oktober 1992 "Oral or Intranasal Vaccines Using Hydrophobic Complexes Håving Proteosomes and Lipopolysaccharides"; 08/029.666 innlevert 11. mars 1993 "Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic Materials"; 08/143.365 innlevert 29. oktober 1993 "Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic Materials; 93/10.402 innlevert 29. oktober 1993 "Submicron Emulsjons as Vaccine Adjuvants"; 08/063.613 innlevert 18. mai 1994 "Solid Fat Nanoemulsions as Vehicles for Vaccine Delivery" og publikasjonene Orr, N., Robin, G., Cohen, D., Arnon, R. og Lowell, G.H. (1993). Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal Models. Infect. Immun. 61:2390; Mallett, C.P., T.L Hale, R. Kaminski, T. Larsen, N. Orr, D. Cohen og G.H. Lowell. 1995. Intranasal or intragastric immunization with proteosome-S/7/ge//a lipopolysaccharide vaccines protect against lethal pneumonia in a murine model of shigellosis. Infect. Immun. 63:2382-2386; Lowell GH, Kaminski RW, Grate S et al. (1996) Intranasal and intramuscular proteosome-staphytococcal enterotoxin B (SEB) toxoid vaccines: immunogenicity and efficacy against lethal SEB intoxication in mice. Infec. Immun. 64:1706-1713; Lowell, G.H. (1990) Proteosomes, Hydrophobic Anchors, Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide and Protein Vaccines in New Generation Vaccines: G.C. Woodrow og M.M. Levine, redaktører (Marcel Dekker,
NY), kapittel 12 (sidene 141-160) og Lowell G.H., W.R. Ballou, LF. Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger og W.T. Hockmeyer. 1988. Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides. Science 240:800). Ruegg CL et al., 1990 (Journal of Immunological Methods, vol. 135:101-109) beskriver fremstilling av proteosom-baserte vaksiner. Lowell G.H. et al., 1988 (Journal of Experimental Medicine, vol. 167: 658-663) beskriver at peptider bundet til proteosomer via hydrofobe kontaktpunkt blir svært immunogene uten adjuvanser.
Innholdet av alle dokumentene gjengitt heri er uttrykkelig inkorporert ved referanse.
For praktisk anvendelse ved administrering av vaksiner for å beskytte mot sykdom er det ofte nødvendig å avgi flere slike antigener på samme tid vanligvis på grunn av det faktum at individer er mottagelige for å pådra seg sykdommer forårsaket av flere forskjellige organismer. Dessuten vil flere organismer, enten de er beslektet med hverandre eller ikke, ofte være endemiske på samme lokasjon, og derfor kan individer som krever beskyttelse trenge vaksinasjon med flere typer vaksiner.
Tidligere er fremstillingen av vaksiner som krever ikke-kovalent kompeksering av komponenter blitt gjennomført ved anvendelse av enkel dialyse hvor komponentene blir plassert i dialyseslanger i nærvær av dialyserbart tensid, og blandingen dialyseres i 7-10 dager for å forsøke å fjerne tensidet. De praktiske ulemper med dette system har tendens til alvorlig å utelukke den avanserte utvikling og kommersialisering av denne teknologi av flere grunner, innbefattet 1) Tid: Tidslengde for fremgangsmåten: Behovet for å anvende GMP-resursser i uker mens vaksinen er under dialyse er upraktisk, både på grunn av de høye involverte kostnader og den økte anledning for nedbrytning eller forurensning av mekaniske eller biologiske komponenter i løpet av den lange tidsperiode: 2) Forurensning: Øket anledning for forurensning: Dialyseslangene er vanskelige å sterilisere, dialyseslangene krever manuell åpning og lukking av systemet hvilket eksponerer komponentene for forurensning både under fylle- og tappefremgangsmåten. Siden det går mange dager mellom fylling og tapping av slangene kan risikoen for en liten forurensning i de første dager av fremgangsmåten lett bli forstørret under de mange dialysedager og således gjøre denne fremgangsmåte ubrukelig for praktisk vaksine-fremstilling. Risikoen for punktering av posen kan resultere i tap av produkt. 3) Tempratur: Nødvendigheten av å gjennomføre dialysen ved 4°C på grunn av den utstrakte tid som involveres; 4) Volum av dialyseringsftuider: For å fremstille vaksine for oppskalering av fremgangsmåten ville det være nødvendig å anvende massive mengder av dialysevæske siden et 200:1 forhold av væske på utsiden av dialyseslangene til innsiden av slangene typisk er nødvendig. Derfor ville f.eks. fremstilling av en pilot-sats på 2 liter vaksine kunne kreve 400 liter væske på utsiden av slangen pr. dag - 4000 liter pr. 10 dager - og fremstilling av en produksjonssats på 20-200 liter ville kreve 40 000 - 4 000 000 liter. Disse mengder er sløseri og upraktiske sammenlignet med fremgangsmåten som anvendes i den foreliggende oppfinnelse; dialyseslangene lar seg ikke oppskalere siden store mengder av produkt er problematisk og 5) Manglende evne til lett å måle fullstendigheten av fjerning av tensidet for således å maksimere vaksine-effektiviteten. Siden dialyseposen er plassert i en beholder med 200 volumer av buffer, vil den pågående måling av tensidfjerning være hverken praktisk eller gjennomførbar og 6) I tillegg er det ikke beskrevet noen fremgangsmåte for måling av tilstedeværelsen av tensidet som anvendes i den foretrukne utførelse, Empigen BB.
Det andre problem som løses i denne oppfinnelse er å demonstrere fremgangsmåten for fremstilling og avgivelse av multivalente vaksiner. Komponenter kan enten lages sammen eller fremstilles separat og blandes sammen før administrering. Den foreliggende oppfinnelse demonstrerer den optimale måte for fremstilling av slike multivalente vaksiner.
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine, kjennetegnet ved den omfatter: a) å danne en blanding av proteosom, et dialyserbart tensid og en amfrfil determinant, b) å underkaste blandingen en diafiltrering eller ultrafiltrering for å fjerne vaskemidlet og derved danne et amfifil-determinant-proteosom-kompleks, c) å overvåke mengden av amfifil-determinant-proteosom-kompleksdannelse, og d) å gjenvinne amfifil-determinant-proteosom-komplekset hvor den nominelle molekylvektssperren (NMWC) til systemet er 3000 eller større.
Emne for den foreliggende oppfinnelse relaterer bredt til produksjon og fremstilling av proteosom-amfifile determinante vaksiner utformet for enten parenteral eller spesielt for slimhinneadministrering innbefattet, men ikke begrenset til luftveis-administrering (f.eks. innbefattet intranasal, intrastrupehode og intralunge), mage-tarmadministrering (f.eks. innbefattet oral eller rektal) eller lokal administrering (f.eks. i øyets slimhinne eller i øret) for å indusere både systemisk (serum) og mukosal (innbefattet luftveiene og tarmene) antistoffresponser. En amfifil determinant er et molekyl som har hydrofobe og hydrofile regioner som, når hensiktsmessig formulert med proteosomer, innretter seg med proteosomene under dannelse av et kompleks som fremkaller en immunologisk respons i et individ. Typiske amfifile determinater inkluder glykolipider, liposakkarider (innbefattet detoksifiserte lipopolysakkarider), lipopeptider, transmembrane, omhyllings- eller toksoiderte proteiner, eller proteiner eller peptider med intrinsiske hydrofobe aminosyreankere. Disse determinant-materialer kan fremstilles fra gram-negative bakterier innbefattet escherichia, klebsieila, pseudomonas, hemophilus brucelta, shigella og neisseria.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også multivalent vaksine fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten i et hvilket som helst av kravene 21 til 24. Nærmere bestemt vedrører denne oppfinnelse proteosom-vaksiner hvori meningokokk yttermembran-proteinproteosom-preparater (fremstilt fra hvilken som helst stamme av N. meningiditis eller N. gonorrhea eller andre neisseria-arter) er ikke kovalent komplekser! til naturlige eller detoksifiserte shigella eller neisseria lipopolysakkarider eller lipooligosakkarider under dannelse av vaksiner utformet til å beskytte mot sykdommer forårsaket av gram-negative mekanismer som inneholder hvilke som helst av komponentdelene av komplekset innbefattet meningokokker eller shigellaer. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen fremstilling av proteosom-vaksiner som inneholder LPS som induserer antistoffresponser som gjenkjenner typespesifikke somatiske polysakkarid O-antigener av shigella lipopolysakkarider, og derved gir homolog beskyttelse mot shigellose. Enda nærmere bestemt blir lipopoly-sakkaridene som, når de komplekseres til proteosomer induserer slike anti-shigella-beskyttende immunresponser, fremstilt og renset fra enten Shigella sonnei eller Plesiomonas shigelloides for immunitet mot Shigella sonnei sykdom, fra Shigella flexneri 2a for immunitet mot Shigella flexneri 2a sykdom, og videre, ved anvendelse av LPS avledet fra homologe eller antigent kryssreagerende organismer for å gi homolog immunitet mot shigellose forårsaket av S. flexneri 2a (eller 3a osv.), S. boydii, S. sonnei osv. Enda nærmere bestemt beskrives den vellykkede administrering av proteosom-shigella-vaksiner fremstilt i henhold til oppfinnelsen som er multivalente ved at to uavhengig fremstilte proteosomvaksiner som anvender shigella LPS'er avledet fra S. flexneri 2a (for S. flexneri 2a sykdom) og fra P. shigelloides eller S. sonnei (for S. sonnei sykdom) blir administrert sammen for derved å indusere antistoffer som gjenkjenner de to organismer og derved gir beskyttelse mot de to typer av sykdommer. Mest spesifikt vedrører den foreliggende oppfinnelse fremstilling av en proteosom-shigella LPS-vaksine hvori proteosomene fra gruppe B type 2b meningokokker blir kompleksert til P. shigelloides LPS ved anvendelse av hulfiber- diafiltreringsteknologi for å frembringe en vaksine som administreres via slimhinnene i luftveiene og/eller mage-tarmkanalen til å indusere antistoffer som gjenkjenner det somatiske O-antigen LPS av S. sonnei og derved beskytter mot shigellose forårsaket av denne organisme. Annen konvensjonell ultrafiltrering/diafiltrering blir forutsett, f.eks. plattform-membran og membran-patron.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer metodologi for fremstilling av ikke-kovalent komplekserte vaksiner på en måte som: 1) Nedsetter den tid som kreves. 2) Nedsetter muligheten for forurensning. 3) Øker temperaturen til omgivende temperatur for at slike vaksiner kan fremstilles. 4) Tillater effektiv oppskalering av fremstitlingsfremgangsmåten slik at det kreves minimum anvendelse av reagenser. 5) Tillater pålitelig og effektiv prøvetaking av dialysat slik at det blir mulig gjentatt å måle fjerningshastigheten av tensidet for således å optimalisere effektiviteten av operasjonen. Dette fører direkte til en økning i komplekseringseffektiviteten av vaksine slik at det kan fremstilles vaksine med målbart høyere immunogenisitet ved lavere doser. På denne måte økes den totale kvalitet av produktet signifikant. 6) I tillegg beskrives en fremgangsmåte til å måle tilstedeværelsen av det anvendte tensid i den foretrukne utførelse, Empigen BB. Andre dialyserbare tensider kan
anvendes istedenfor Empigen BB. Ved å anvende fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er det dessuten blitt demonstrert at vaksinen kan lyofiliseres og rehydreres på en slik måte at man kan beholde optimal vaksinepotens som målt ved vaksineimmunogenisitet.
Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse innebærer anvendelse av en hulfiberultrafiltrerings/diafiltreringspatron for å gjennomføre kompleksering ved fjerning av tensidet. Ved å variere størrelsen av patronhylsen kan man redusere dialysetiden for fremstilling av en sats av vaksine fra >7-10 dager til mindre enn 72 timer og vanligvis mindre enn 48 eller 24 timer. Siden denne korte tid anvendes kan reaksjonstemperaturen økes fra 4° til normal romtemperatur uten å kompromittere fremgangsmåten eller integriteten av produktene. Selv om fremgangsmåten ble gjennomført ved ca. 20°C, blir det overveiet temperaturer mellom 0° og 40C. Siden systemet er lukket er det et svært redusert potensiale for forurensning. Ved å øke størrelsen på hylsen kan det dessuten bearbeides en stadig større mengde materiale i løpet av et relativt kort tidsrom for derved å tillate effektiv og reproduserbar oppskalering av fremgangsmåten for kommersiell utvikling. Videre kan permeatet prøvetas flere ganger for å måle fjerningen av tensidet hvilket kan gjennomføres ved anvendelse av testen ifølge den foreliggende oppfinnelse for å måle tilstedeværelsen av tensidet Empigen BB, det tensid som anvendes i den foretrukne utførelse. Denne unike metodologi krevet eksperimentell verifisering siden det ikke var åpenbart at komplekseringen og strukturen av vaksinen til immunogene materialer som ble oppnådd ved langsom dialyse i løpet av 7-10 dager ved anvendelse av en stasjonær dialysepose, kunne bli oppnådd eller forbedret ved anvendelse av hulfiber-teknologien, hvori gruppene som skal komplekseres blir beveget gjennom slanger ved svært høye strømningshastigheter sammenlignet med den for den stasjonære dialyseslange.
Siden den nominelle molekylvektsperre for den anvendte membran kan velges til å være fra 1000, 3000, 5000,10 000, 30 000, 50 000 eller høyere, avhengig av størrelsen av komponentene som skal komplekseres ikke-kovalent, vil dette system være lett å tilpasse til komplekseringen av naturlige eller detoksifiserte lipopolysakkarider, lipider, peptider, lipopeptider, liposakkarider, polysakkarider, gangliosider eller transmembrane, omhyllings- eller naturlige eller toksoiderte proteiner til hverandre eller til meningokokk yttermembran-proteinpreparater av proteosomer.
Det resulterende produkt kan anvendes som en vaksine administrert enten parenteralt eller mukosalt, dvs. luftveiene eller mage-tarmkanalen, f.eks. intranasalt, oralt, ved orofaryngealt inhalasjonsmiddel, lokalt eller rektalt. I det gitte eksempel blir det vist at proteosomer blir ikke-kovalent komplekser! til P. shigelloides LPS under dannelse av en vaksine som induserer de anti-S. sonnei LPS-responser som er nødvendige for beskyttelse mot S. sonnei shigellose.
Metodologien har tre trinn: en preliminær operasjon; kompleksering av proteosomet med en amfifil determinant, f.eks. P. shigelloides LPS; etterfulgt av en steril filtrering.
For å avgi multivalente vaksiner optimalt, viser den foreliggende oppfinnelse at den beste fremgangsmåte er å lage de spesifikke vaksiner individuelt og deretter immunisere med de to individuelt fremstilte vaksiner, hver ved den optimale konsentrasjon, på samme dag. Andre muligheter slik som fremstilling av hybride vaksiner under dannelsen av de ikke-kovalente komplekser er også blitt gjennomført eller er forutsett.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1: Intranasal immunisering med proteosom-P. shigelloides LPS-vaksine:
serum IgG responser fremkalt av flere preparater ved nedsatte doser. Figur 2: Intranasal immunisering med proteosom-P. shigelloides LPS-vaksine: serum IgA responser fremkalt av flere preparater med nedsatt dose.
Figur 3: Administrering av proteosom-P. shigelloides LPS (for S. sonnei shigellose) og proteosom-S. flexneri 2a vaksinene sammen på samme dag eller uker fra hverandre resulterer i god immunogenisitet mot både
S. sonnei og S. flexneri 2a LPS-komponentene.
Program 1 besto av fem mus intranasalt immunisert på dagene 0 og 21 med proteosom-S. sonnei LPS-vaksinen (10 ug hver av proteosomer og
LPS). Musene ble avblødd 4 uker etter den siste immunisering. Program 2 besto av fem mus intranasalt immunisert på dagene 0 og 21 med proteosom-S. flexneri 2a LPS-vaksinen (10 ug hver av proteosomer og
LPS). Musene ble avblødd 4 uker etter den siste immunisering. Program 3 besto av fem mus intranasalt immunisert på dagene 0 og 21 med proteosom-S. sonnei LPS-vaksinen (10 ug hver av proteosomer og LPS) og proteosom-S. flexneri 2a vaksinen (10 u.g hver av proteosomer
og LPS). Musene ble avblødd 4 uker etter den siste immunisering. Program 4 besto av fire mus intranasalt immunisert på dagene 0 og 21 med proteosom-S. sonnei LPS-vaksinen (10 p.g hver av proteosomer og LPS) og deretter på dagene 49 og 70 med S. flexneri 2a LPS-vaksinen (10 u.g hver av proteosomer og LPS). Musene ble avblødd 4 uker etter den siste S. flexneri 2a immunisering. Figur 4: Immuno-gullmerket elektronmikrografi av proteosom-shigella LPS-vaksine som viser assosiering av shigella LPS med proteosomvesikler. Figur 5: Proteosom-P. shigelloides LPS-vaksine beskytter mot dødlig Shigella sonnei pneumonia i en dyremodell av shigellose.
Grupper av utavlede mus (14 til 15 pr. gruppe) ble immunisert intranasalt på ukene 0 og 3 med proteosom-P.sW<g>e/fo/cfes LPS-vaksine (10 \ ig hver av proteosomer og LPS pr. 20 fil). Kontrollgrupper ble gitt saltløsning etter det samme program. Alle mus ble utfordret intranasalt med 5 til 10 millioner kolonidannende enheter av S. sonnei på uke 7. Musene ble observert daglig i to uker etter utfordring, og dødelighet som resulterte fra den påfølgende lungebetennelsessykdom ble registrert. Som vi tidligere har vist, dør 86 til 100% av kontrollmusene i løpet av fire dager etter utfordring. I begge eksperimenter var 93% av musene immunisert med vaksinen som overlevde utfordringen (P
<0,001, Fisher"s Exact Test).
Figur 6: Intranasal eller oral immunisering med proteosom-S/7/ge//a flexneri 2a LPS-vaksiner induserer anti-shigella LPS IgG og IgA i serum og IgA i tarmvæske og lungeskyllevæske som kan vare 30-60 dager post-immunisering. Figur 7: Intranasal eller oral immunisering av mennesker med en eller to doser proteosom-P. shigelloides LPS-vaksiner for Shigella sonnei ved anvendelse av forskjellige vaksinemengder: Indusering av anti-shigella LPS IgA, IgG og IgM perifert blod ASC-responser, og serum, spytt og urin
antistoffresponser.
Figur 8: LPS i HPLC-fraksjoner etter anvendelse av ikke-kompleksert
P. shigelloides LPS og demonstrering av ikke-kovalent kompleksering av LPS og proteosom-proteiner ved ko-eluering av LPS og proteiner i HPLC-fraksjonene etter anvendelse av proteosom-P. shigelloides LPS-vaksine.
Figur 9: Bakterisid antistoffrespons hos mus på meningokokk yttermembran-protein-detoksifisert lipooligosakkeridvaksine, geometrisk gjennomsnitt av inverse titere mot meningokokkstamme 9162.
EKSEMPEL 1
Dette eksempel er vist i detalj for fremstilling av proteosom-P. shigelloides vaksine inneholdende ca. 2-3 g protein. Fremgangsmåten er like anvendelig for oppskalering ved anvendelse av 10-1000 ganger mer materiale med tilnærmet oppskalering av hylsestørrelse på membranpatronen og hensiktsmessig økning i volumene. Ved å anvende membraner med hensiktsmessig størrelse og med hensiktsmessig molekylvektssperrer til å holde tilbake antigenene som skal komplekseres, vil denne fremgangsmåte være like anvendelig for kompleksering av proteosomer til andre naturlige eller detoksifiserte lipopolysakkarider, lipider, peptider, lipopeptider, liposakkarider polysakkarider, gangliosider eller transmembrane, omhyllings- eller naturlige eller toksoiderte proteiner til hverandre eller til meningokokk yttermembran-proteinpreparater av peoteosomer. Empigen BB er det tensid som anvendes som eksempel i denne fremgangsmåte; fremgangsmåten gjelder like gjerne hvilket som helst dialyserbart tensid som solubiliserer komponentene. Denne fremgangsmåte anvender A/G teknologi-patroner, men er like anvendelig til hvilket som helst ultrafiltrerings/diafiltrerings-system av patrontypen.
5.0.0.1 PRELIMINÆR OPERASJON
5.0.0.1. Sterilfiltrering av en oppløsning av 30% Empigen BB, som er tensider
som anvendes i denne fremgangsmåte.
5.0.0.2. Fremstilling av 2X TEEN / 2% empigen (0,1 M tris, 0.02M dinatirum
EDTA, 0,3M natriumklorid, WFI og 2% empigen, pH 8,0).
5.0.0.3. Fremstilling av 150 I av en TNS-(tris normal saltløsning)-løsning inneholdende 0.05M tris, 0,15M natriumklorid pH 8,0 med det formål å
dialysere ut tensidet.
5.0.0.4. Fremstilling av 101 natriumhydroksyd for UF patronrensing.
5.0.0.5 Tining av den nødvendige mengde av Shigella flexneri 2a lipopolysakkarid (LPS).
5.0.1. KOMPLEKSERING AV PROTEOSOMER MED S. FLEXNERI 2a LPS
5.0.1.6. Tilsetning av et like stort volum av 2X TEEN-buffer til volumet av LPS
og inngående blanding.
5.0.1.7. Tining og utmåling av en mengde av bulkproteosomer, i mg, lik
mengden av LPS tint i trinn 5.
5.0.1.8. Tilsetning til proteosomene av 30 ml av sterilfiltrert empigen pr. liter.
Inngående blanding og sammenslåing med LPS fra trinn 5.
5.0.1.9. Inngående blanding av begge komponenter. Vanligvis vil 15 minutter
på en røreplate og rørstavkombinasjon være tilstrekkelig.
5.0.1.10. For å dialysere ut tensidet slik at det kan danne seg proteosom-komplekser, oppsetting av et ultrafiltreringssystem (basert på tangensiell flyt-teknologi) ved anvendelse av en hulfiberpatron med en nominell molekylvektssperre (NMWC) porestørrelse på 10 000 fremstilt av A/G Technology, Inc. koblet til sterilisert silikonslange og en peristaltisk pumpe. Sanitære trykkmålere er plassert på innløps- og utløpssiden av patronen for overvåking av trykket gjennom hele kjøringen. En tilbaketrykksventil er plassert på utløpssiden av patronen
for å justere tilbaketrykket.
5.0.1.11. Ultrafiltreringssystemet blir rengjort og renset med WFI og 0,5N NaOH
ved en temperatur på 50°C for et tidsrom lenger enn 60 minutter. Dette system gjennomspyles med WFI og ekvilibreres med TNS-buffer før
anvendelse.
5.0.1.12. En beholder med sterilt reservoar plasseres i linjen slik at innløps-væsken blir trukket fra beholder og overskytende væske sendt tilbake til samme reservoar. Ettersom væske passerer gjennom patron-membranen (permeat eller filtrat) blir det etterfylt med TNS-buffer enten ved direkte tilsetning eller ved et kontinuerlig matesystem. Det settes opp et kontinuerlig matesystem ved å forbinde silikonslangen med en beholder inneholdende TNS-buffer til prøvetakingsreservoaret som da er lufttett. Ettersom væsken blir fjernet ved filtrering fra prøve-reservoaret dannes det et vakuum som forårsaker avtrekking av "TNS"-buffer fra beholderen til prøvetakingsreservoaret. Dersom systemet
holder seg lufttett vil prøvenivået i prøvereservoaret holde seg konstant. 5.0.1.13. Oppstarting av resirkulasjonspumpen for å begynne diafiltrering.
Pumpehastighet og tilbaketrykksventil justeres for å oppnå et tilbaketrykk på 15 ±4 psi.
5.0.1.14. Verifisering av progressiv fjerning av Empigen BB ved testing av permeatprøver tatt for hver 10-15 liter ved anvendelse av Empigen Precipitin-testen. Denne test består av å lage seriefotrynninger av permeatet og av en standardløsning inneholdende en kjent mengde Empigen BB, tilsetning av HCI for å surgjøre løsningene og deretter tilsetning av seriefortynninger av SDS (natriumdodecylsulfat) for å lage en analyse av sjakkbrett-typen. Maksimum utfelling vil danne seg når ekvivalente mengder av empigen og SDS er tilstede. På denne måte kan mengden av tilstedeværende empigen kvantifiseres ved å bemerke fortynningen av SDS, permeatet og av de standarder hvorved maksimum utfelling blir dannet. Ettersom diafiltreringen går videre blir empigen-mengden mindre, og slangen som inneholder mindre SDS vil være slangen med den maksimale utfelling. Tilstedeværelsen av utfellingen blir kvantifisert ved å måle OD ved 600 nm ved anvendelse
av et spektrofotometer.
5.0.1.15. For den mengde komponenter som anvendes i dette eksempel fortsettes diafiltreringen inntil minst 120 I permeat er blitt bearbeidet, og det er en mangel på signifikant utfelling i Empigen Precipitin-testen
(maksimum OD 600 nm er mindre enn 0,05).
5.0.1.16. Etter fullstendig dialyse konsentreres produktet til et sluttvolum for å få
en OD28o-verdi nær opp til 6,0. Systemet dreneres og vaskes med 300-400 ml av "TNS"-buffer. Systemet dreneres igjen og begge volumer slås sammen. Patronen renses ved resirkulering av store mengder av WFI etterfulgt av 0,5N NaOH ved 50°C i >60 minutter. NaOH skylles ut med WFI og systemet lagres i 0,01 N NaOH.
5.0.2. STERILFILTRERING
5.0.2.17. Kompleksene kan om ønsket sterilfiltreres. Proteosom-konsentrasjonen kan justeres før eller etter 0,22 um filtrering. Sterilfiltreirng gjennom-føres normalt med filterenheter fra Millipore Corp. Disse enheter kalles Millipaks og kommer i forskjellige størrelser. Det filtrerte volum lagres ved 4°C inntil fyilingsoperasjonen og blir testet for sterilitet.
5.0.3.0 SPESIFIKKE FORMÅL
Bulk GMB-preparatene av meningokokk yttermembranprotein-
x proteosomer og S. flexneri 2a lipopolysakkarid kombineres til ikke-kovalente komplekser ved fjerning av tensid.
5.0.3.1 ANVENDELSER:
Denne GMP fremgangsmåte resulterer i fremstilling av en bulkpreparat-dannelse av ikke-kovalente komplekser av proteosomer med S. flexneri 2a lipopolysakkarid for anvendelse som vaksine mot S. flexneri 2a infeksjon.
EKSEMPEL 2
Ikke-kovalent kompleksering av bulk Neisseria meningiditis stamme 9162 rensede yttermembran-proteiner (proteosomer) og alkalisk detoksifisert N. meningiditis L8 lipooligosakkarid renset fra stamme 8532.
5.1.0 Bulk 9162 yttermembran-protein (proteosomer), sats 0136 og bulk-detoksifisert meningokokk L8 lipooligosakkarid (LOS) sats 0203 ble tatt fra lagring og tinet ved romtemperatur. Et volum (182 ml) av bulk LOS inneholdende 500 ml LOS i sterilt destillert vann ble slått sammen med et volum (306 ml) av bulk-proteosomer inneholdende 400 mg protein i buffer inneholdende 0.05M tris-HCI, 0,15M NaCI, 0,01 M EDTA og 0,1%
Empigen BB.
5.1.2. Empigen BB (30% løsning) ble sterilfiltrert gjennom et filter med
0,22 (im porestørrelse og 1/60 del av volumet tilsatt til de samlede
roteosomer, LOS-løsning og omrørt ved romtemperatur i 1 time. 5.1.3. Tensidbufferløsningen ble fjernet fra proteosomene, LOS-løsningen og erstattet med sterilt destillert vann ved ultrafiltrering ved anvendelse av en A/G Technology ultrafiltreringspatron UFP-3-C-6 med en molekylvektssperre porestørrelse på 3000.
5.1.4. Fremgangsmåten for oppsett, rengjøring, vasking, vasking og rensing av apparatet var den samme som beskrevet i eksempel 1. Innløps-trykket var 15 ± 4 psi og permeatstrømningshastigheten var 175 ml pr. minutt.
5.1.5. Permeatet ble testet etter hver 3 til 4 liter for tilstedeværelse av Empigen BB tensid ved utfellingsfremgangsmåten beskrevet i eksempel 1. Ultrafiltreringen ble fortsatt inntil ingen utfelling ble oppnådd i testen pluss ytterligere 5 liter. Tilsammen 37 liter permeat
ble oppsamlet.
5.1.6. Retentatet var klart og ble sterilfiltrert gjennom et filter med en pore-størrelse på 0,22 um, analysert for protein og LOS og lagret som et
bulkprodukt ved 4°C.
5.1.7. Bulkproduktet ble fortynnet til en konsentrasjon på 0,2 mg protein pr. ml og konsentrasjonen av NaCI justet rtil 0,15M. Thimerasol ved 0,01% ble tilsatt som konserveringsmiddel, og det resulterende volum ble dispensert under sterile betingelser i endelige beholderglass, merket og
lagret ved -70°C.
5.1.8. Dette produkt ble testet på mus for immunogenisitet når det ble gitt som saltløsning og adsorbert til aluminiumhydroksydgel som adjuvans. Resultatene er gitt i tabell 1 nedenfor og viser at vaksinekompleksene var immunogene når de ble gitt i.p. til mus.
Tabell 1. Baktericid antistoff respons hos mus på meningokokk yttermembranprotein-detoksifisert lipooligosakkaridvaksine, geometrisk gjennomsnitt av inverse titere mot meningokokkstamme9162
Bemerkning: Vaksine ble gitt intraperitonealt på 0 og 28 dager til grupper av 10 utavlede CD-1 mus.
5.1.9. Komplekseringen av proteosomene og LOS ble verifisert ved kolonne-kromatografi av proteosomene og LOS-komponentene før og etter kompleksering (figur 9). Kromatografisk analyse av bulk-meningokokk L8 LOS og de endelige proteosomer/LOS-komplekser på Sephacryl S300 lavtrykkskolonne. Kolonnen ble kjørt i 0.05M tris-HCI, 0,01 M EDTA, 0,15M NaCI buffer. Analysen for protein var ved absorbans ved 280 nm, og analysen for LOS var ved inhibering av en ELtSA ("enzyme linked immunosorbant assay") hvori en L8 monoklonalt antistoffbinding til renset L8 LOS adsorbert til plastplaten ble inhibert ved seriefortynninger av fraksjonene fra Sephacryl-kolonnen. Før kompleksering kom LOS fra kolonnen i en bred topp sentrert omkring fraksjon 39. Etter kompleksering ko-eluerte LOS sammen med proteosomene i en topp sentrert omkring fraksjon 33.
5.1.10. SPESIFIKT FORMÅL
Bulk GMP-preparatene av meningokokk yttermembranprotein-proteosomer og detoksifisert meningokokk lipopolysakkarid kombineres til ikke-kovalente komplekser ved fjerning av tensid.
5.1.11. ANVENDELSE:
Denne GMP-fremgangsmåte resulterer i fremstilling av en bulkpreparat-dannelse av ikke-kovalente komplekser av proteosomer med detoksifisert meningokokk lipopolysakkarid for anvendelse som vaksine mot N. meningitides (meningokokk)-infeksjon.
EKSEMPEL 3
Dette eksempel vedrører også fremstilling av proteosom - P. shigelloides vaksine. Fremgangsmåten er likeså anvendelig for oppskaleringer ved anvendelse av 10-1000 ganger mer materiale med hensiktsmessig oppskalering av hylsestørrelsen av membranpatronen og hensiktsmessig volumøkning.
5.8.1. Fremstilling av 25 ml sterilfiltrert Empigen BB (30% løsning)
5.8.1.1 Det anvendes en 100 ml Nalgene engangsfilterenhet med membran-filter med en porestørrelse på 0,2 um for å sterilfiltrere ca. 25 ml
Empigen BB (30% løsning).
5.8.2 Det fremstilles 4 liter av TEEN 2X med 2% Empigen BB (bestående av 0,1 M tris, 0.02M dinatrium EDTA, 0,3M natriumklorid, WFI og 2%
løsning av Empigen BB.
5.8.3. Det fremstilles en 10 liter løsning av TNS" femten ganger tilsammen 150 liter: TNS består av 0,15M natriumklorid, 0,05M tris buffer
pH 8,0 ± 0,2.
5.8.4. Det fremstilles 10 liter av 0,5N natriumhydroksyd.
5.8.6. Om nødvendig tines bulk P. shigelloides lipopolysakkarid (UPS) for å
forberede kompleksering med proteosomer og registrere sats-nummeret, og konsentrering av LPS, den nødvendige mengde av LPS i mg og det beregnede volum av LPS som skal fjernes.
5.9.0. KOMPLEKSERING AV PROTEOSOMER med P. shigelloides LPS
5.9.1. FREMSTILLING AV LPS FOR KOMPLEKSERING
5.9.1.2 Alikvotene av bulk LPS slås sammen i en ren steril kalibrert 5 liter kolbe. Det samlede volum måles og den samlede mengde av LPS
bestemmes.
5.9.1.3 Det tilsettes et volum av 2X TEEN buffer lik volumet av LPS anvendt i trinn 5.9.1.2, det samlede totalvolum måles og deretter tilsettes en rørestav og blandes med rørestaven og røreplatekombinasjonen i 15 ± 2 minutter.
5.9.2 FREMSTILLING AV PROTEOSOMER FOR KOMPLEKSERING
5.9.2.1 Registrering av den samlede tid, om noen, som proteosomene fikk tine. 5.9.2.2 Alikvotene av bulk-proteosomer slås sammen i en ren, steril, 1 liter gradert sylinder. Det samlede volum måles og den totale mengde av proteosomer bestemmes.
5.9.2.3 Fra sylinderen i trinn 5.9.2.2 overføres til en annen ren, steril, 1 liter gradert sylinder, et volum av proteosomer inneholdende den mengde i
mg som er lik mg-mengden av LPS anvendt i trinn 5.9.1.2.
5.9.2.4 Til sylinderen inneholdende proteosomene tilsettes 0,22 nm filtrert 30%
Empigen BB ved anvendelse av 30 ml empigen pr. liter proteosomer. Det blandes med en rørestav i 15 ± 2 minutter.
5.9.3 PROTEOSOMENE KOMBINERES MED P. shigelloides LPS
5.9.3.1 Under forsiktig omrøring med en rørestav tilsettes peoteosomene fra
trinn.
5.9.3.2 til den graderte 5 liter kolbe med LPS og omrøres i 15 ± 2 minutter. 5.9.3.3 Det tas ut fire 1 ml prøver og lagres ved -75°C for senere måling av konsentrasjonen av protein ved Lowry-fremgangsmåten og LPS ved KDO-analyse.
5.9.4. FJERNING AV TENSID VED ULTRAFILTRERING & DIAFILTRERING
5.9.4.1 Ultrafittreringssystemdetaljer: A/G Technology Inc. hulfiberpatron,
10 000 NMWC-porestørrelse, hylsestørrelse 6, ultrafiltreringspatron.
Bemerk: Det er nødvendig å kondisjonere nye patroner for å vaske ut glycerol. Dette kan gjøres ved å vaske ut 6 liter av WFI gjennom patronene på 6 sq/ft eller mindre uten noe tilbaketrykk. Permeat-løsningen bør ikke resirkuleres til fødereservoaret.
Bemerk: Alle ultrafiltreringstrinn vil bli etterfulgt av rensing, rengjøring
og lagringstrinn. Nye patroner må renses og rengjøres før anvendelse. 5.9.4.2 A/G ultrafiltreringssystemet settes opp og rengjøres. Rengjøring og rensing av systemet ved resirkulering i minst 60 minutter med 2-3 liter av 0,5N natriumhydroksyd ved en begynnelsestemperatur på 50 ± 5°C. Systemet gjennomspyles med 4-5 liter av WFI etterfulgt av resirkulering av 2-3 liter av "TNS" (0.05M tris/normal saltløsningsbuffer pH 8,0 ± 0,2 i
minst 20 ± 5 minutter.
5.9.4.3 Måling av holdevolumet i UF-systemet (innbefattet slangen) ved over-føring av innløps- og utløpsledningene fylt med væske ut av reservoaret
og inn i en 1 liters målesylinder, deretter pumping inntil UF-systemet er
tomt.
5.9.4.4 Plassering av en 2 liter sidearmet beholder i en kjele og pakking av
beholderen med fuktig is så lenge diafiltreringsfremgangsmåten varer. 5.9.4.5 Overføring av 1,7 -1,9 liter av bulk-proteosom-LPS-blandingen fra trinn 5.9.3.3 til den 2 liter sidearmede beholder. Plassering av en to-hullet kork utstyrt med to 10 ml pipetter på beholderen og sammenkobling av innløps- og utløpsslangene fra diafiltreringssystemet til beholder-pipettene.
5.9.4.6 Innkobling av resirkulasjonspumpen og justering av pumpesettingen til 4-6. Justering av tilbaketrykksklemmen for å oppnå et innløpstrykk på 15 ± 4 psi. Konsentrering til et totalvolum på 1,0 ± 0,1 liter innbefattet
holdevolumet.
5.9.4.7 Overføring av 1 ± 0,1 liter av blandingen fra trinn 5.9.3.3 til den 2 liter
sidearmede beholder og repetisjon av trinn 5.9.4.6.
5.9.4.8 Overføringen som i trinn 5.9.4.7 og konsentreringen som i trinn 5.9.4.9 fortsettes inntil hele proteosom-LPS-blandingen fra trinn 5.9.3.3 er blitt overført til den 2 liter sidearmede beholder og retentatvolumet er 1,4 ±
0,2 liter som innkluderer holdevolumet.
5.9.4.10 Oppsetting av ultrafiltreringsapparatet for kontinuerlig føding av TNS
(0.05M tris normal saltløsning) til den 2 liter sidearmede beholder ettersom væske blir fjernet gjennom membranen. Oppsetting av et reservoar ved anvendelse av en 10 liter flaske inneholdende TNS
og utstyrt med en slange som strekker seg til bunnen av flasken. Innløps- og utløpsledningene fra ultrafiltreringssystemet kobles til. Resirkulasjonspumpen kobles inn og pumpesettingen justeres til 4-6. Tilbaketrykksklemmen justeres for å oppnå et innløpstrykk på 15 ± 4
psi.
5.9.4.11 Måling av permeatstrømningshastigheten på UF-enheten og
registrering av innløpstrykket når målingen tas.
5.9.4.12 Oppsamling av en 15 til 20 ml prøve av permeatet for hver 12 + 0,5 liter bearbeidet, påføring av husets merkelapp ("Permeat nr. P1, P2, P3 osv.") og registrering av tiden, volum bearbeidet og maksimum ODeoo
for prøven. Verifisering av progressiv fjerning av empigen ved testing av prøvene for tilstedeværelse av Empigen BB ved anvendelse av Empigen Precipitin-testen. Denne test består i å lage seriefortynninger av permeatet og separat av en løsning inneholdende en kjent mengde Empigen BB, tilsetning av HCI for å surgjøre løsningene og deretter tilsetning av seriefortynninger av SDS (natriumdodecylsulfat) for å danne en analyse av sjakkbrett-typen. Maksimum utfelling vil dannes når ekvivalente mengder av empigen og SDS er tilstede. På denne måte kan mengden av tilstedeværende empigen kvatifiseres ved å notere fortynningene av permeatene og SDS hvori utfellingen er dannet, og sammenligning av disse fortynninger med standard-fortynningene. Ettersom diafiltreringen går videre blir empigen-mengden mindre og den slange som inneholder mindre SDS vil være slangen med maksimum utfelling. Tilstedeværelsen av bunnfall kvatifiseres ved måling av OD ved 600 nm ved anvendelse av et spektrofotometer.
For mengdene av komponenter som anvendes i dette eksempel fortsettes diafiltreringen inntil minst 120 liter permeat er bearbeidet og det er en mangel på signifikant utfelling i Empigen Precipitin-testen
(maksimum OD 600 nm mindre enn 0,05).
5.9.4.13 Konsentrering av produktet til et endelig retentatvolum 500 ± 50 ml innbefattet holdevolumet (trinn 9.4.3). Uttak av en 0,5 ml prøve,
fortynning av prøven 1:10 og måling av OD28o-
5.9.4.14 Det ønskede minimum OD av det konsentrerte retentat er 5,7. Dersom OD er mindre enn 5,7 fortsettes konsentreringen til 400 ± 50 ml
innbefattet holdevolumet (trinn 5.9.4.3) og repetisjon av OD2bo-5.9.4.15 Med retentatledningene ut av retentatløsningen og filtratutløps-ledningene lukket, pumpes det langsomt i den motsatte retning inntil patronene og ledningene er tomme. Overføring av fødeledningen og retentatledningene fra retentatflasken til en ny ren beholder med 350 50 ml TNS. Pumpen reverseres og TNS resirkuleres langsomt i 2-3 minutter.
5.9.4.16 Etter resirkulering av TNS stanses pumpen, systemet dreneres,
retentatvaskeløsningen oppsamles i en ren, steril, 1 liter gradert
sylinder og volumet og OD2eo måles.
5.9.4.17 Den originale retentatløsning (trinn 5.9.4.12 eller 5.9.4.13) slås sammen med vaskeretentatløsningen (trinn 5.9.4.15) og sluttvolumet av retentat måles. Mesteparten av retentatet lagres ved 4°C ± 2°C inntil
aseptisk filtrering.
5.9.4.18 Filtreringsenheten renses ved anvendelse av WFI etterfulgt av 0,5N
natriumhydroksyd ved 50 ± 5°C til å begynne med i minimum 60 minutter. Rensemidlet skylles ut med WFI, deretter skylles ut med 3-4 liter av 0,1 N NaOH som lagringsmiddel.
5.9.5 STERILFILTRERING
Kompleksene kan om ønsket sterilfiltreres. De bulk-komplekserte proteosomer og LPS fremstilles og inspiseres for tilstedeværelse av eventuell utfelling eller blakking. Dersom det bulk-komplekserte produkt er klart, filtreres det aseptisk ved anvendelse av en Millipak 40, 0,22 fim filtreringsenhet over i en steril depyrogenert beholder. Dette trinn må utføres i et sterilt kabinett.
5.9.6 SPESIFIKT FORMÅL:
Bulk-GMP-preparater av meningokokk yttermembranprotein-proteosomer og P. shigelloides lipopolysakkarid (for S. sonnei) kombineres til ikke-kovalente komplekser ved fjerning av tensid.
5.9.7. ANVENDELSER:
Denne GMP-fremgangsmåte resulterer i fremstilling av en bulk-preparatdannelse av ikke-kovalente komplekser av proteosomer med P. shigelloides 2a lipopolysakkarid for anvendelse som vaksine mot Shigella sonnei infeksjon.
5.10 IMMUNOGENISITETSSTUDIER:
5.10.1 IMMUNOGENISITET AV PROTEOSOM-P. shigelloides LPS-VAKSINE VED ANVENDELSE AV HULFIBER-ULTRAFILTRERING/ DIAFILTRERING
Figurene 1 og 2 demonstrerer at tre forskjellige proteosom-shigella LPS-vaksine-preparater laget ved anvendelse av hulfiber (HF) diafiltreringsteknikk (HF-1, HF-2 og GMP/HF-3) for å fjerne tensid og lette kompleksering er mer effektive ved den laveste, mest stringente testede dose, enn preparater laget ved anvendelse av enkel dialyseslange (DT). Med andre ord ble det fremkalt sterkere IgG (figur 1) og IgA (figur 2) immunresponser av vaksiner fremstilt ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelse enn ved den eldre, mindre effektive teknologi. Siden sterkere immunresponser resulterer i bedre nivå av beskyttelse, viser disse data klart at den foreliggende oppfinnelse resulterer i vaksiner som ikke bare er mer effektive å lage, men også mer kraftfulle. Videre fremkalles de sterkere responser av vaksinen når den administreres ved den laveste dose (0,1 ug pr. dose) hvilket derved indikerer at mindre vaksine ville være nødvendig ved anvendelse av den foreliggende oppfinnelse enn det som ville kreves ved anvendelse av den eldre teknologi. Siden formuleringen av multivalente vaksiner krever mange forskjellige antigener for å minimalisere den totale mengde vaksine som administreres, er det svært fordelaktig å være i stand til å anvende vaksinekomponenter som er effektive ved lavere doser. Teknologien ifølge den foreliggende oppfinnelse for fremstilling av vaksiner ved anvendelse av hulfiberteknologi vil således ha direkte innvirkning på og lette evnen til å formulere multivalente vaksiner som har et bredt område av spesifisiteter. Siden det er fordelaktig for kommersiell utvikling av vaksiner å være i stand til å lyofilisere vaksiner var vi takknemlige for å oppdage at lyofilisering av HF-vaksinekompleksene fra vandig løsning overraskende resulterte i vaksine som konsistent fremkalte responser som var blant de høyeste ved alle testede doser. Høyere immunogenisitet for anti-LPS IgG (figur 1) og IgA (figur 2) ble således funnet når 0,1 ug vaksine laget ved HF-teknikken (med eller uten lyofilisering) ble administrert. Disse data er signifikante siden oppskaleringen og GMP-fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendte HF-teknologien som angitt i figurene 1 og 2 ved den kryss-skraverte søyle som representerer GMP/HF-3.
5.10.2 IMMUNOGENISITETSSTUDIER SOM ANVENDER MULTIVALENT
VAKSINE
Som vist i figur 3 vil administrering av proteosom-P. shigelloides LPS (for S. sonnei shigellose) og proteosom-S. flexneri 2a vaksinene på samme dag eller uker fra hverandre resultere i god immunogenisitet for begge LPS-komponenter: S. sonnei LPS og S. flexneri 2a LPS.
5.11 ELEKTRONMIKROGRAFI AV PROTEOSOM-SHIGELLA-VAKSINE
Assosiasjonen av shigella LPS med proteosomer er klart og dramatisk gjengitt i elektronmikrografiet vist i figur 4. I denne figur er proteosom-vesiklene overstrødd med radio-opake svarte prikker. Disse prikker er gullperler bundet til sekundære antistoffer som gjenkjenner spesifikke anti-shigella LPS-antistoffer. Tilstedeværelsen av gullprikker indikerer således tilstedeværelse av shigella LPS. Siden gullkprikkene omgir og bestrør proteosomvesiklene som det kan sees, blir bildet av proteosom-vaksiner med LPS ikke-kovalent bundet til proteosomene derved beskreftet og visualisert. Overraskende ble den konsistente vesikkel-karakter av vaksinene laget med HF-teknologien ifølge den foreliggende oppfinnelse ikke funnet når DT-preparatene som anvender den eldre teknologi ble undersøkt ved elektronmikroskopi (ikke publiserte resultater).
5.12 PROTEOSOM-P. shigelloides LPS-VAKSINE BESKYTTER MOT DØDELIG
Shigella sonnei pneumonia I EN DYREMODELL AV SHIGELLOSE
Som det kan sees i figur 5, vil proteosom-P. shigelloides LPS-vaksine konsistent gi høyst signifikant beskyttelse mot dødelig infeksjon med P. shigelloides som målt i en dyremodell av shigellose hvori dyrene blir utfordret med levende organismer for å indusere dødelig lungebetennelse. Disse data demonstrerer også at ikke bare blir de korrekte og beskyttende antistoffer fremstilt av proteosom-P. shigelloides LPS-vaksine, men også at denne intranasale subenhet-vaksine kan beskytte mot dødelig lungebetennelse.
5.13 INTRANASAL ELLER ORAL IMMUNISERING MED PROTEOSOM-Sh/ge//a
flexneri 2a LPS-VAKSINER VIL INDUSERE ANTI-SHIGELLA LPS IgG OG
IgA I SERUM OG IgA I TARM- OG LUNGESKYLLEVÆSKER SOM KAN VARE 30-60 DAGER ETTER IMMUNISERING
Som vist i figur 6 vil to immuniseringer med proteosom-S/7/ge//a flexneri 2a LPS-vaksiner indusere antistoffer i sera og i lunge- og tarmsekreter som kan vare 30-60 dager etter immunisering. Disse data viser at proteosomvaksiner kan stimulere det vanlige slimhinneimmunsystem til å sekretere spesifikke antistoffer endog i lokasjoner langt borte fra immuniseringsstedet. Spesielt intranasal immunisering kan indusere antistoffer i tarmsekresjoner og vice versa. Denne evne ekspanderer den potensielle anvendelighet av proteosomvaksiner til å beskytte mot patogener som invaderer verten gjennom slimhinneadgangsåpningene i heie kroppen.
5.14 Figur 7 viser indusering av anti-shigella LPS IgA, IgG og IgM perifert blod ASC
responser, og serum, spytt og urin IgA og IgG antistoffresponser etter intranasal eller oral immunisering av humane frivillige med en eller to doser proteosom-P. shigelloides LPS-vaksiner for Shigella sonnei ved anvendelse av forskjellige vaksinemengder. Som vist ville intranasal immunisering frem-kalle responser på en doseavhengig måte slik at den høyeste dose induserer responser i alle seks frivillige.
IgA, IgG og IgM serumresponser ble fremkalt i hver av de intranasale grupper. I tillegg ble det indusert kraftige antistoffsekreterende celle ASC responser hvilket indikerer at slimhinneimmunisering stimulerte ferdsel av antistoffsekreterende celler - mest bemerkelsesverdig, IgA-sekreterende celler. Mest viktig er det at IgA responser også ble funnet i spyttprøver og spesielt i urin-prøver, hvilket indikerer at sekretorisk IgA ble produsert i slimhinneoverflater (siden IgA ikke passerer gjennom nyrene, må urin IgA reflektere lokal sekresjon av antistoff og antyder at slike intranasale vaksiner også frem-bringer lokal tarm IgA og at intranasale vaksiner kunne anvendes til å beskytte mot urinveisinfeksjoner forårsaket av gram-negative organismer). Det er bemerkelsesverdig at mesteparten av disse ASC og antistoffresponser ble funnet etter bare en immunisering, hvilket antyder at forsterket immunisering kanskje ikke er nødvendig. IgA og IgG ASCer og urin-lgA ble også funnet etter oral immunisering. Den mest effektive anvendelse av oral administrering kan være som en forsterkende immunisering etter nasal priming, om
nødvendig.
5.15 Demonstrasjon av ikke-kovalent kompleksering av de multimolekylære protesomproteiner og LPS er vist i figur 8. Diagrammet viser LPS i HPLC-f raksjoner etter påsetting av ikke-kompleksert P. shigelloides LPS som forekommer i en annen del av kolonnens elueringsprofil enn ved påsetting av proteosom-LPS-vaksinen. Ko-elueringen av LPS og proteiner i HPLC-fraksjoner etter påsetting av proteosom-P. shigelloides LPS-vaksine er vist med topper som tilsvarer de største proteinaggregater av proteosomer. Disse data ble målt ved anvendelse av en inhiberings-ELISA til å kvantifisere LPS og anvendelse av OD ved A280 nm til å kvantifisere proteosomproteinene. HPLC-kolonnen var en Tosohaas G50000Pwxl og molekylvektstandardene er angitt ved pilene.
Claims (25)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine, karakterisert ved at den omfatter: a) å danne en blanding av proteosom, et dialyserbart tensid og en amfifil determinant, b) å underkaste blandingen en diafiltrering eller ultrafiltrering for å fjerne vaskemidlet og derved danne et amfifil-determinant-proteosom-kompleks, c) å overvåke mengden av amfifil-determinant-proteosom-kompleksdannelse, og d) å gjenvinne amfifil-determinant-proteosom-komplekset hvor den nominelle molekyfvektssperren (NMWC) til systemet er 3000 eller større.
2. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at ultrafiltreringen involverer tangensiell strømning.
3. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at ultrafiltreringen gjennomføres i et system valgt fra hulfiberpatron, plattformmembran og membranpatron.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amifil-determinant vaksine ifølge krav 3, karakterisert ved at ultrafiltreringssystemet er en hulfiberpatron med en NMWC porestørrelse på 10 000.
5. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 3, karakterisert ved at ultrafiltreringssystemet er en hulfiberpatron med en NMWC porestørrelse på 3000.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at overvåkingen av dialyserbart tensid involverer kontinuerlig måling av permeatprøver.
7. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at overvåkingen inkluderer måling av den optiske tetthet av permeat- eller retentatprøve.
8. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at overvåkingen involverer måling av mengden av tensidfjerning ved å blande en permeatprøve med en kjent mengde av SDS (natriumdodecylsulfat) under dannelse av et bunnfall dersom tensid er tilstede, og bestemmelse av mengden av bunnfall.
9. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 8, karakterisert ved at LPS-protesomkomplekset blir gjenvunnet når tensidet i permeatet i alt vesentlig er blitt fjernet.
10. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at tensidet er Empigen BB.
11. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at den amfifile determinant er et lipopolysakkarid.
12. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-lipopolysakkarid vaksine ifølge krav 11, karakterisert ved at lipopolysakkaridet blir oppnådd fra en gram-negativ bakterie.
13. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-lipopolysakkarid vaksine ifølge krav 12, karakterisert ved at den gram-negative bakterie er en plesiomonas.
14. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-lipopolysakkarid vaksine ifølge krav 13, karakterisert ved at plesiomonas er Plesiomonas shigelloides.
15. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-lipopolysakkarid vaksine ifølge krav 12, karakterisert ved at at den gram-negative bakterie er en shigella.
16. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-lipopolysakkarid vaksine ifølge krav 15, karakterisert ved at shigella er Shigella flexneri, Shigella sonnei eller Shigella boydii.
17. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-lipopolysakkarid vaksine ifølge krav 12, karakterisert ved at den gram-negative bakterie er en neisseria.
18. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-lipopolysakkarid vaksine ifølge krav 17, karakterisert ved at neisseria er Neisseria meningiditis.
19. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at proteosomet er avledet fra N. meningiditis eller N. gonorriiea.
20. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at gjenvinningen av proteosom-amfifil-determinanten blir gjennomført når den overvåkte hastighet av tensidfjeming er avtagende eller konstant.
21. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 1, ytterligere karakterisert vede) å blande det gjenvundne proteosom-amfifil-determinante kompleks med en fysiologisk akseptabel bærer under dannelse av en vaksine.
22. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 21, ytterligere karakterisert ved å konsentrere proteosom-amfifil-determinant-komplekset før gjenvinning av komplekset.
23. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 22, karakterisert ved at konsentreringen fortsettes til en ønsket slutt-konsentrasjon.
24. Fremgangsmåte for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine ifølge krav 21, karakterisert ved at fremgangsmåten utføres med forskjellige amfifile determinant-typer under dannelse av en serie av proteosom-amfifil-determinant-komplekser som blir sammensatt i trinn e) under dannelse av en multivalent vaksine.
25. Multivalent vaksine fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten i et hvilket som helst av kravene 21 til 24.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US385995P | 1995-09-18 | 1995-09-18 | |
| PCT/US1996/015002 WO1997010844A1 (en) | 1995-09-18 | 1996-09-18 | Improved methods for the production of non-covalently complexed and multivalent proteosome sub-unit vaccines |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO981189D0 NO981189D0 (no) | 1998-03-17 |
| NO981189L NO981189L (no) | 1998-05-14 |
| NO320074B1 true NO320074B1 (no) | 2005-10-17 |
Family
ID=21707938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19981189A NO320074B1 (no) | 1995-09-18 | 1998-03-17 | Fremgangsmater for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine, samt multivalent vaksine fremstilt i folge fremgangsmaten. |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6476201B1 (no) |
| EP (1) | EP0854729B2 (no) |
| JP (2) | JP4033489B2 (no) |
| KR (1) | KR19990045763A (no) |
| CN (1) | CN1211192A (no) |
| AT (1) | ATE261313T1 (no) |
| BR (1) | BR9610484A (no) |
| CA (1) | CA2232410C (no) |
| CZ (1) | CZ298460B6 (no) |
| DE (1) | DE69631835T3 (no) |
| DK (1) | DK0854729T3 (no) |
| EA (1) | EA199800208A1 (no) |
| ES (1) | ES2217325T5 (no) |
| HU (1) | HUP9901577A3 (no) |
| IL (1) | IL123720A (no) |
| MX (1) | MX9802128A (no) |
| NO (1) | NO320074B1 (no) |
| PL (1) | PL325604A1 (no) |
| PT (1) | PT854729E (no) |
| WO (1) | WO1997010844A1 (no) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5961970A (en) | 1993-10-29 | 1999-10-05 | Pharmos Corporation | Submicron emulsions as vaccine adjuvants |
| BR9910749A (pt) * | 1998-05-29 | 2001-02-13 | Chiron Corp | Composições e vacinas imunogênicas combinadas para meningites b e c e método de induzir uma resposta imune por administração da mesma |
| RU2245366C2 (ru) | 1999-04-30 | 2005-01-27 | Чирон С.Р.Л. | Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование |
| EP2270174A1 (en) | 1999-05-19 | 2011-01-05 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Combination neisserial compositions |
| EP1721618A3 (en) * | 2000-02-15 | 2007-01-10 | ID Biomedical Corporation of Quebec | Proteosome influenza vaccine composition |
| DE60121136T2 (de) | 2000-02-15 | 2007-06-06 | Id Biomedical Corporation Of Quebec, Ville St. Laurent | Proteasom-influenzavirus-impfstoffzusammensetzung |
| PT2270030E (pt) | 2000-02-28 | 2012-07-24 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Expressão heteróloga de proteínas de neisseria |
| EP1372706B1 (en) * | 2001-03-09 | 2010-12-01 | ID Biomedical Corporation of Quebec | Proteosome-liposaccharide vaccine adjuvant |
| KR101239242B1 (ko) * | 2002-08-02 | 2013-03-11 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 항원 조합물을 포함하는 나이세리아 백신 조성물 |
| WO2004032958A1 (en) | 2002-10-11 | 2004-04-22 | Chiron Srl | Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages |
| US7255867B2 (en) * | 2002-11-15 | 2007-08-14 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Vaccine |
| GB0316560D0 (en) * | 2003-07-15 | 2003-08-20 | Chiron Srl | Vesicle filtration |
| US7368537B2 (en) * | 2003-07-15 | 2008-05-06 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection |
| JP2007505836A (ja) * | 2003-09-15 | 2007-03-15 | アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック | 麻疹サブユニットワクチン |
| JP4966661B2 (ja) | 2003-10-22 | 2012-07-04 | アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック | 生得的免疫およびアレルギー性免疫を活性化させるための組成物および方法 |
| CA2571035A1 (en) * | 2004-06-25 | 2006-01-12 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Compositions and methods for treating neurological disorders |
| AU2005319716A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-06-29 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Vaccine compositions for treating coronavirus infection |
| US7552948B2 (en) | 2006-03-29 | 2009-06-30 | Tokai Rubber Industries, Ltd. | Quick connector |
| CN101553246B (zh) * | 2006-08-07 | 2019-05-21 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法 |
| EP2056871B1 (en) * | 2006-08-07 | 2017-11-15 | President and Fellows of Harvard College | Protein matrix vaccines and methods of making and administering such vaccines |
| WO2008027861A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | System and method for characterizing membranes and membrane filtration devices |
| BRPI0913268A2 (pt) * | 2008-05-30 | 2016-03-15 | U S A As Represented By The Secretary Of The Army On Behalf Of Walter Reed Army | vacina de vesícula de membrana externa nativa multivalente meningocócica, métodos de fabricação e uso da mesma |
| EP2473188A4 (en) * | 2009-09-09 | 2014-01-01 | Matrivax Res & Dev Corp | PROTEIN MATRIX VACCINES WITH IMPROVED IMMUNOGENICITY |
| JP6590916B2 (ja) * | 2014-09-24 | 2019-10-16 | ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ レプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ ネイビーＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ａｓ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｖｙ | 毒素原性大腸菌およびジェジュニ菌の組合せの組換えコンストラクト |
| CA3208643A1 (en) | 2021-01-18 | 2022-07-21 | Conserv Bioscience Limited | Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707543A (en) * | 1985-09-17 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Process for the preparation of detoxified polysaccharide-outer membrane protein complexes, and their use as antibacterial vaccines |
| RU1522494C (ru) * | 1987-06-16 | 1994-11-15 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Способ получения инактивированной вакцины гриппа |
| RU2023448C1 (ru) * | 1987-07-30 | 1994-11-30 | Сентро Насьональ Де Биопрепарадос | Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в |
| US5145702A (en) * | 1988-09-19 | 1992-09-08 | Opta Food Ingredients, Inc. | Hydrophobic protein microparticles and preparation thereof |
| EP0449958B9 (en) * | 1988-12-19 | 2003-05-28 | American Cyanamid Company | Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine |
| US5102989A (en) * | 1991-03-15 | 1992-04-07 | Merck & Co., Inc. | Method of stabilizing recombinant hepatitis B virus surface proteins from recombinant host cells |
| CA2139517A1 (en) * | 1992-07-20 | 1994-02-03 | Paul M. Keller | Immunological conjugates of ompc and hiv-specific selected principal neutralization epitopes |
| US5576016A (en) * | 1993-05-18 | 1996-11-19 | Pharmos Corporation | Solid fat nanoemulsions as drug delivery vehicles |
| AU5543294A (en) * | 1993-10-29 | 1995-05-22 | Pharmos Corp. | Submicron emulsions as vaccine adjuvants |
| DE60121136T2 (de) * | 2000-02-15 | 2007-06-06 | Id Biomedical Corporation Of Quebec, Ville St. Laurent | Proteasom-influenzavirus-impfstoffzusammensetzung |
-
1996
- 1996-09-18 EA EA199800208A patent/EA199800208A1/ru unknown
- 1996-09-18 HU HU9901577A patent/HUP9901577A3/hu unknown
- 1996-09-18 ES ES96932269T patent/ES2217325T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-18 EP EP96932269A patent/EP0854729B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-18 KR KR1019980702007A patent/KR19990045763A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-09-18 US US09/043,529 patent/US6476201B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-18 CA CA002232410A patent/CA2232410C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-18 PL PL96325604A patent/PL325604A1/xx unknown
- 1996-09-18 JP JP51287597A patent/JP4033489B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-18 WO PCT/US1996/015002 patent/WO1997010844A1/en active IP Right Grant
- 1996-09-18 IL IL12372096A patent/IL123720A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-09-18 CZ CZ0081998A patent/CZ298460B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-09-18 CN CN96197616A patent/CN1211192A/zh active Pending
- 1996-09-18 DE DE69631835T patent/DE69631835T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-18 BR BR9610484-8A patent/BR9610484A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-09-18 PT PT96932269T patent/PT854729E/pt unknown
- 1996-09-18 AT AT96932269T patent/ATE261313T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-09-18 DK DK96932269T patent/DK0854729T3/da active
-
1998
- 1998-03-17 NO NO19981189A patent/NO320074B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-03-18 MX MX9802128A patent/MX9802128A/es unknown
-
2003
- 2003-10-24 JP JP2003365270A patent/JP2004099619A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL123720A0 (en) | 1998-10-30 |
| PL325604A1 (en) | 1998-08-03 |
| MX9802128A (es) | 1998-11-29 |
| ATE261313T1 (de) | 2004-03-15 |
| HUP9901577A2 (hu) | 1999-08-30 |
| CZ81998A3 (cs) | 1998-10-14 |
| DE69631835D1 (de) | 2004-04-15 |
| ES2217325T3 (es) | 2004-11-01 |
| JP4033489B2 (ja) | 2008-01-16 |
| CA2232410C (en) | 2003-06-17 |
| EP0854729B2 (en) | 2008-10-22 |
| HUP9901577A3 (en) | 2000-03-28 |
| US20020164357A1 (en) | 2002-11-07 |
| DE69631835T2 (de) | 2005-02-10 |
| BR9610484A (pt) | 2001-09-11 |
| EP0854729A1 (en) | 1998-07-29 |
| EP0854729B1 (en) | 2004-03-10 |
| US6476201B1 (en) | 2002-11-05 |
| PT854729E (pt) | 2004-08-31 |
| CN1211192A (zh) | 1999-03-17 |
| EP0854729A4 (en) | 2000-02-02 |
| JP2004099619A (ja) | 2004-04-02 |
| DE69631835T3 (de) | 2009-03-05 |
| CA2232410A1 (en) | 1997-03-27 |
| DK0854729T3 (da) | 2004-07-12 |
| WO1997010844A1 (en) | 1997-03-27 |
| NO981189L (no) | 1998-05-14 |
| JP2000507913A (ja) | 2000-06-27 |
| EA199800208A1 (ru) | 1998-10-29 |
| KR19990045763A (ko) | 1999-06-25 |
| NO981189D0 (no) | 1998-03-17 |
| IL123720A (en) | 2002-02-10 |
| ES2217325T5 (es) | 2009-04-01 |
| CZ298460B6 (cs) | 2007-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO320074B1 (no) | Fremgangsmater for fremstilling av proteosom-amfifil-determinant vaksine, samt multivalent vaksine fremstilt i folge fremgangsmaten. | |
| CA2123355C (en) | Preparation and uses of los-depleted outer membrane proteins of gram-negative cocci | |
| US6558677B2 (en) | Vaccine against gram negative bacteria | |
| Collins | Gram-negative outer membrane vesicles in vaccine development | |
| US11339367B2 (en) | Hyperblebbing Shigella strains | |
| Levine et al. | Fimbrial vaccines | |
| Frasch et al. | Protection against group B Neisseria meningitidis disease: preparation of soluble protein and protein-polysaccharide immunogens | |
| Frasch et al. | Outer membrane protein vesicle vaccines for meningococcal disease | |
| US20040131642A1 (en) | Outer membrane vesicle vaccine against disease caused by neisseria meningitidis serogroup a and process for the production thereof | |
| BE1022875B1 (fr) | Compositions pour une immunisation contre staphylococcus aureus | |
| Muttilainen et al. | TheNeisseria meningitidisouter membrane protein P1 produced inBacillus subtilisand reconstituted into phospholipid vesicles elicits antibodies to native P1 epitopes | |
| Blanco et al. | Human cell mediated immunity to porins from Salmonella typhi | |
| AU751063B2 (en) | Improved methods for the production of non-covalently complexed and multivalent proteosome sub-unit vaccines | |
| Ito et al. | Homologous prime-boost strategy in neonate mice using Neisseria lactamica |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |