KR19990045763A - 비공유결합성으로 착염화된 다가의 프로테오좀 서브-유니트 백신의 개선된 제조 방법 - Google Patents
비공유결합성으로 착염화된 다가의 프로테오좀 서브-유니트 백신의 개선된 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
투석 또는 한외여과 기법을 이용하여 비경구성 투여 또는 점막 투여에 적합한 다가 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신 제조용 방법에 관한 것이다. 이 양쪽성 결정자에는 그램 음성 박테리아, 예컨대 플렉스너균, 플레시오모나스 시겔로이드스 및 손네균로부터의 리포다당류가 포함된다. 프로테오좀은 그룹 B 타입 2b 뇌막염균(meningococci)으로부터 얻어진다. 이 백신의 활성 프로테오좀-양쪽성 결정자 착염(비공유결합성 착염)은 정화제를 제거하는 데 투석이나 한외여과를 이용하여 형성된다. 이 투석이나 한외여과의 사용은 공정 시간을 단축시키고 오염의 확률을 감소시키며, 추가로 대기 온도의 사용 및 유용한 대량화를 가능하게 한다. 또한, 이 공정은 전체 공정의 효율성을 증진시키는 투석물의 확실하고 연속적인 관측이 가능하다. 다량의 백신 제조용 투석 시간은 > 7-10 일에서 72 시간 미만 및 대개 48 또는 24 시간 미만으로 단축된다. 이 공정의 용도는 다가 백신의 제조에서 각각의 항원 성분의 존재를 최적화하는 것이다.
Description
다가의 서브 유니트 백신이 각각의 성분에 대한 적절한 면역 반응을 자극하기 위해서는, 적절한 성분들이 적합하게 배합되어야만 하고 각각이 면역 시스템에 사용이 가능하여 이들이 면역 시스템의 세포들에 의해 효과적으로 인지되고 처리될 수 있어야만 한다. 이러한 비공유성으로 착염화된 백신의 일차 예에는 펩티드, 리포펩티드, 경막성(transmembrane) 또는 톡소이드화된 프로테인, 다당류 또는 리포다당류(LPS: lipopolysaccharides)를 포함한 매우 다양한 항원들에 비공유결합성으로 착염화된 나이세리아성(neisserial) 외막 단백질 프로테오좀으로 이루어질 수 있는 프로테오좀 백신이 포함된다(1987년 6월 23일자의 미국 특허 출원 제 07/065,440 호의 "Immunogenic peptide vaccines and methodes of preparation"; 1989년 4월 12일자 미국 특허 출원 제 07/336,952 호 "immunoprotentiaing system for large proteins and polypeptides"; 1992년 10월 8일자 미국 특허 출원 제 07/958,426 호 "Oral or Intranasal Vaccines Using Hydrophobic Complexes Having Proewosomers and Lipopolysaccharides"; 1993년 3월 1일자 미국 특허 출원 제 08/029,666 호 "Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic Materials"; 1993년 10월 29일자 미국 특허 출원 제 08/143,365 호 "Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic Materials"; 1993년 10월 29일자 미극 특허 출원 제 93/10,402 호 "Submicron Emulsion as Vaccine Adjuvants"; 1994년 5월 18일자 미국 특허 출원 제 08/063,613 호 "Solid Fat Nanoemulsions as Vehicles For Vaccine Adjuvants" and publications Orr, N., Robin, G., Gohen, D., Arnon, R. and Lomell, G.H.(1993), Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal Models. Infect. Immun. 61: 2390; Mallett, C.P., T.L. Hale, R. Kaminski, T.Larsen, N. Orr, D. Cohen, and G.H. Lowell. 1995. Intranasal or intragastric immunization with proteosome-Shigella lipopolysaccharide vaccines protect against lethal pneumonia in a murine model of shigellosis. Infect, Immun. 63:2382-2386; Lowell GH, Kaminski RW, Grate S et al.(1996) Intranasal and intramuscular proteosome-staphylococcal enterotoxin B (SEB) toxoid vaccines: immunogenicity and efficacy against lethal SEB intoxication in mice. Infec. Immun. 64: 1706-1713; Lowell, G.H.(1990) Proteosomes, Hydrophobic Anchors, Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide and protein Vaccines. in New Generation Vaccines: G. C. Woodrow and M.M. Levine, eds. (Marcel Dekkeer, NY). Chapter 12(pp. 141-160) and Lowell, G.H., W.R. Ballou, L.F. Smith, R.A. WirtA, W.D. Zollinger and W.T. Hockmeyer. 1988. Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides. Science 240:800).
본 명세서에서 인용된 모든 문헌의 내용은 따로 참고문헌으로서 첨부하였다.
질병을 예방하기 위한 백신 투여의 실재적인 적용에서, 개개인이 다양한 유기체에 의해 야기되는 질병에 감염될 수 있다는 사실 때문에 대개 몇몇의 이러한 항원들을 동시에 투여할 필요가 흔히 나타난다. 게다가, 몇몇 유기체들의 서로간의 연관성의 유무에 관계없이 대개 동일한 지역에서 풍토성이므로, 예방이 필요한 개인들은 몇가지 타입의 백신으로 접종할 필요가 있다.
과거에는, 성분들의 비공유결합성 착염화가 필요한 백신의 제조는 성분들을 투석 가능한 정화제의 존재 하에서 투석 튜빙(dialysis tubing)내에 넣고 이 혼합물을 7-10 일 동안 투석시켜 이 정화제를 제거할 수 있도록 하는 간단한 투석법을 이용하여 이루어졌다. 이같은 시스템의 실재적인 단점은 다음과 같은 이유들을 포함하는 몇 가지 이유 때문에 이같은 기술 방법의 진일보된 개발 및 상업화를 심각하게 저해하는 경향이 있다: 1) 시간: 이 제조 방법의 시간 길이: 백신을 투석하는 주간 동안에 GMP 자원을 사용할 필요성이, 장시간 동안에 신진대사적인 또는 생물학적인 성분들이 파괴되거나 오염될 확률이 높아지고 수반되는 비용이 증가되는 두 가지 이유 모두 때문에 비실재적이게 된다; 2) 오염성: 오염될 확률의 증가: 투석 튜빙은 살균하기가 곤란하고, 투석 튜빙은 수동 개폐 장치가 요구되기 때문에 장착 및 탈착 공정 모두 동안에 이 성분들이 오염에 노출된다. 이 튜빙의 장착과 탈착 사이에 많은 날들이 소요되기 때문에, 이 공정을 시작하는 날들에서 작은 오염의 위험성이 그 많은 날들 동안에 쉽게 증대되어, 이 방법이 실질적인 백신 제조용으로 사용될 수 없게 된다. 백(bag)에 구멍이 날 위험이 있어 생성물의 유실을 초래할 수 있다; 3) 온도: 장시간이 수반되기 때문에 이 투석은 4 ℃에서 수행되어야만 한다; 4) 투석용 유체의 부피: 이 공정의 대량화용 백신 제조를 위해서는, 투석 튜빙에 대한 외부 액체 대 튜빙 내부의 액체 비 200 : 1이 전형적으로 필요하기 때문에, 대량의 투석용 유체가 사용되어야만 할 것이다. 따라서, 예를 들면, 백신 2 리터의 공장 단위 제조는 1 일당 이 튜빙 외부 유체 400 리터 - 10 일당 4,000 리터 - 가 필요할 것이며, 20-200 리터의 생성물 단위의 제조에서는 40,000-4,000,000 리터가 필요하게 될 것이다. 이같은 양들은 본 발명에 사용된 방법에 비해 비경제적이며 비실재적이다; 대량의 생성물이 확실치 않기 때문에 투석 튜빙은 측량이 불가능하고, 5) 백신의 유효성을 극대화할 수 있도록 하는 정화제 제거의 완료를 용이하게 측정하는 것이 불가능하다. 이 투석 백이 200 부피(volumes)의 완충용액을 갖는 용기내에 놓이기 때문에, 정화제 제거 진행중에서의 측정 방법이 실재적이지 못하거나 불가능하며, 6) 추가로, 바람직한 일례에 사용된 정화제, 엠피겐(Empigen) BB의 존재 하에서의 측정 방법이 개시되어 있지 않다.
본 발명에서 해소된 이차 문제점으로는 다가 백신의 제조 및 그 투여 방법에 대한 증명이다. 성분들은 함께 제조되거나 각각 제조되어 투여되기 전에 함께 혼합될 수 있다. 본 발명은 이러한 다가 백신을 제조하는 적절한 방법을 개시한다.
본 발명은 점막 투여 및 비경구성 투여용의 비공유결합성으로 착염화된 다가 프로테오좀(multivalent proteosome) 백신용 조성물과 그의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1은 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신으로 비내 면역화: 감소된 투여량으로 몇몇 조제물에 의해 도출되는 혈청 IgG 반응을 나타내는 도면이다.
도 2는 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신으로 비내 면역화: 감소된 투여량으로 몇몇 조제물에 의해 도출되는 혈청 IgA 반응을 나타내는 도면이다.
도 3은 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신과 프로테오좀-플렉스너균 2a 백신을 동일한 날에 함께 투여하거나 각각 주간으로 투여하는 것 모두가 손네균 및 플렉스너균 2a LPS 성분들에 대한 면역원성이 우수한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 프로테오좀 부형제를 갖는 시겔라 LPS와의 관계를 나타내는 프로테오좀-시겔라 LPS 백신의 면역성 골드(immunogold) 표지된 전자 현미경 사진이다.
도 5는 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신의, 시겔라증의 동물 모델에서 치사성 손네균 폐렴에 대한 예방성을 나타낸 도면이다.
도 6은 프로테오좀-플렉스너균 2a LPS 백신으로 비내 또는 경구 면역화가 면역화 이후에 30-60 일 동안 지속될 수 있는 안티-시겔라 LPS 혈청내 IgA와 IgG 및, 장 및 폐 세척 유체내 IgA를 유도하는 도면이다.
도 7은 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신의 1 또는 2 회 투여에 의한 인체의 비내 또는 경구 면역화: 안티-시겔라 LPS IgA, IgG 및 IgM 말초 혈액 ASC 반응 및, 혈청, 타액 및 소변의 항체 반응의 유도를 나타내는 도면이다.
도 8은 비착염화된 플레시오모나스 시겔로이드스 LPS를 적용한 후에 HPLC 분획에서 LPS 및, 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신을 적용한 후에 HPLC 분획내 프로테인과 LPS의 공동-용리에 의해 LPS와 프로테오좀 프로테인의 비공유결합성 착염화를 증명하는 도면이다.
도 9a와 9b는 뇌막염균 외막 프로테인-해독된 리포다당류 백신에 대한 쥐의 살균성 항체 반응, 뇌막염균 균주 9162에 대한 기하학적인 평균 상호 적정(geometric mean reciprocal titers)을 나타내는 도면이다.
발명의 요약
본 발명의 주제는 광의적으로 전신(혈청) 및 점막(호흡 및 장을 포함)의 항체 반응들을 유도하기 위한, 호흡계 투여(예컨대, 비(鼻)내, 인두(咽頭)내 및 폐내 포함), 위장계 투여(예컨대, 경구 또는 직장 포함) 또는 국부 투여(예컨대, 결막 또는 귀)를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 비경구 투여용이나 특히 점막 투여용으로 고안된 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 및 그 생성물에 관한 것이다. 양쪽성 결정자는 프로테오좀과 적절하게 배합될 때 대상의 면역학적 반응을 도출시키는 착염용으로 프로테오좀과 정렬하는 소수성 및 친수성 부분을 갖는 분자이다. 전형적인 양쪽성 결정자에는 글리코리피드, 리포-당류(해독된 리포다당류 포함), 리포펩티드, 경막성, 외장성 또는 톡소이드화된 프로테인 또는 소수성 아미노산부를 갖는 프로테인이나 펩티드가 포함된다. 이같은 결정자 물질들은 에스케리히아(escherichia), 클레브시엘라(klebsiella), 슈도모나스(pseudomonas), 헤모필러스 브루셀라(hemophilus brucella), 시겔라(shigella) 및 나이세리아(neisseria)를 포함하는 그램 음성 박테리아로부터 얻어질 수 있다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 뇌막염균성(meningcoccal) 외막 프로테인 프로테오좀 조제물(수막염균(N. meningitidis) 또는 임균(N. gonorrhea)의 어떠한 균주 또는 그 외의 나이세리아 종으로부터 제조됨)이 음성이거나 해독된 시겔라 또는 나이세리아 리포다당류 또는 리포올리고당류에 비공유결합적으로 착염화되어, 뇌막염균이나 시겔라를 포함하는 착염의 그 어떤 성분부를 함유하는 그램 음성 유기체로부터 야기된 질병을 예방할 수 있도록 고안된 백신을 형성하는 프로테오좀에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 타입-특정적인 시겔라 리포다당류의 체강성 다당류 O-항원을 인식하여 시겔라증의 동족체성 예방을 부여하는 항체 반응을 야기시키는 LPS를 함유하는 프로테오좀 백신에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 프로테오좀과 착염화될 때, 이러한 안티-시겔라 예방성 면역 반응을 유도하는 리포다당류를, 손네균 질환에 대한 면역성을 갖도록 손네균 또는 플레시오모나스 시겔로이드스(Plesiomonas shigelloides)로부터, 플렉스너균 2a 질환에 대한 면역성을 갖도록 플렉스너균 2a로부터, 기타 등등으로부터 동족체 또는 항원성 교차 반응 유기체로부터 유도된 LPS를 이용하여 제조 및 정제하여, 플렉스너균 2a(또는 3a 등), 보이디균(S. boydii), 손네균 등에 의해 야기되는 동족체 면역성을 부여한다. 한층 구체적으로, 본 발명은 플렉스너균 2a(플렉스너균 2a 질환의 경우) 플레시오모나스 시겔로이드스(P. Shigelloides) 또는 손네균 (손네균 질환의 경우)로부터 유도된 시겔라 LPS를 이용하여 두 가지로 각각 제조된 프로테오좀 백신이 함께 투여되어 두 가지 유기체를 인식하는 항체를 유도하고 이 두 가지 타입의 질환에 대한 예방성을 부여하는 식의, 다가 프로테오좀-시겔라 백신의 성공적인 투여 방법을 기술한다. 최대한으로 구체화한다면, 본 발명은 할로 피버 투석 기법(hollow fiber diafiltration)을 이용하여 그룹 B 타입 2b 뇌막염균으로부터의 프로테오좀을 플레시오모나스 시겔로이드스 LPS에 착염화시켜 점막 호흡 작용 및/또는 위장 경로에 의해 투여되어 손네균의 체강성 O-항원 LPS를 인식하여 이 유기체에 의해 야기되는 시겔라증을 예방하는 백신을 제조하는 프로테오좀-시겔라 LPS 백신에 관한 것이다. 다른 통상 한외여과법/투석법, 예컨대 플랫폼막(platform membrane) 및 막 카트리지(membrane catridge)가 계획되어 있다.
본 발명은 1) 필요한 시간을 단축시키고, 2) 오염 확률을 감소시키고, 3) 이러한 백신이 제조될 수 있는 온도를 상온으로 상승시키고, 4) 필요한 반응물의 양이 최소화가 될 수 있도록 제조 공정의 유용한 대량화가 가능하고, 5) 작동의 효율성을 적정화하기 위해 정화제의 제거율을 반복적으로 산측할 수 있도록 확실하고 효과적인 투석물의 샘플링이 가능한 방식으로, 비공유 결합적으로 착염화된 백신을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 좀더 적은 투여량으로 다소 증가된 면역성을 갖는 백신을 제조할 수 있도록 백신의 착염화 유효성을 직접적으로 증가시킨다. 이러한 방식으로, 생성물의 전체적인 질이 현저히 향상된다. 6) 추가로, 바람직한 일례에서 사용되는 정화제, 엠피겐 BB의 존재 하에서 측정하는 방법을 기술한다. 다른 투석 가능한 정화제들을 엠피겐 BB 대신에 사용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법을 이용하여, 이 백신을 백신 면역원성에 의해 산측된 바와 같은 적절한 백신 효능을 갖도록 하는 바와 같은 방식으로 동결건조시키고 재-수화시킬 수 있다는 것이 증명되었다.
본 발명의 방법은 할로 피버 한외여과법/투석 카트리지를 사용하여 이 정화제의 제거에 의한 착염화에 유효화시키는 것을 필요로 한다. 이 카트리지의 하우징 크기를 다양화시킴으로써, 다량의 백신 제조용 투석 시간이 > 7-10 일로부터 72 시간 미만 및 대개 48 또는 24 시간 미만까지 단축될 수 있다. 이같은 단시간이 사용되기 때문에, 생성물의 흠결성이나 공정의 절충이 없이도 반응 온도를 4 ℃로부터 정상 실온까지 상승시킬 수 있다. 이 공정을 약 20 ℃에서 수행할 때, 0 내지 40 ℃ 사이에서 종결된다. 이 시스템은 밀봉되어 있기 때문에, 오염 확률이 매우 크게 감소된다. 추가로, 하우징 크기를 증가함으로써, 초대량의 물질을 비교적 짧은 시간내에 공정화시켜서, 상업적 개발용으로 효율적이며 재생성이 있는 대량화 방법이 가능하게 된다. 게다가, 바람직한 일례에서 사용되는 정화제, 엠피겐 BB의 존재 하에서 본 발명의 테스트를 이용하여 달성될 수 있는 바와 같이, 정화제의 제거율을 측정하기 위하여 이 삼투액을 반복적으로 샘플링할 수 있다. 정류 투석 백을 사용하여 7-10 일 서서히 투석함으로써 달성되었던 면역원성 물질로의 이 백신의 구조 및 착염화가, 정류 투석 튜브의 유속에 비해 매우 큰 유속으로 착염화될 부분들이 튜브를 통해 이동하는 할로 피버 기법을 사용하여 균일화되거나 향상될 수 있다는 것이 명확하지 않기 때문에, 이 방법의 독창성에는 실험상의 다양화가 요구되었다.
비공유결합적으로 착염화될 성분들의 크기에 따라 사용되는 막의 최소 분자량 차단치(nominal molecular weight cutoff: NMWC)이 1,000, 3,000, 5,000, 10,000, 30,000, 50,000 또는 그 이상 중에서 선택될 수 있기 때문에, 이같은 시스템은 음성이거나 해독된 리포다당류, 리피드, 펩티드, 리포펩티드, 리포-당류, 다당류, 강글리오시드 또는, 경막성, 외장성 또는 음성 또는 톡소이드화된 단백질을 서로에게 또는 프로테오좀의 뇌막염균 외막 프로테인 조제물에 착염화시키는 데 용이하게 개조할 수 있다.
얻어진 생성물은 비경구성 또는 점막성 경로로, 즉, 호흡기 또는 위장계를 통해, 예컨대 비내로, 경구로, 구강 인두 흡입으로, 국부적으로 또는 직장으로 투여되는 백신으로서 사용할 수 있다. 다음 실시예에서, 프로테오좀이 플레시오모나스 시겔로이드스 LPS에 비공유결합적으로 착염화되어 손네균 시겔라증를 예방하는 데 필요한 안티-손네균 LPS 반응을 유도하는 백신을 형성한다는 것을 알 수 있다.
이 방법은 다음의 세 가지 단계: 예비 작업; 프로테오좀을 양쪽성 결정자, 예컨대 플레시오모나스 시겔로이드스 LPS와 착염화하기; 그 후에 멸균 여과하기로 이루어진다.
다가 백신들을 적절하게 전달하기 위해서는, 본 발명은 개별적으로 특정적인 백신을 제조한 후에 같은 날 동시에 각각 적절한 농도로 각각 제조된 두 가지 백신으로 면역화하는 것이 가장 좋은 방법임을 나타내고 있다. 비공유결합성 착염을 형성하는 동안에 다른 혼성 백신을 제조하는 것과 같은 가능성 또한 달성되었거나 제시되어 있다.
실시예 1
본 실시예에는 단백질 약 2-3 g을 함유하는 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 백신의 제조 방법이 상세히 기술되어 있다. 이 제조 방법은 막 카트리지의 하우징 크기의 적절한 대량화로 10-1000 배 이상의 물질을 사용하여 대량화에도 동일하게 적용할 수 있고, 부피를 적절하게 증가시킬 수 있다. 착염화될 항원을 갖도록 적절한 크기의 분자량 차단치를 갖는 적절한 크기의 막을 이용하여, 이 방법은 프로테오좀을 다른 음성 또는 해독된 리포다당류, 리피드, 펩티드, 리포펩티드, 리포-당류, 다당류, 강글리오시드 또는, 경막성, 외장성 또는 음성 또는 톡소이드화된 프로테인 서로에 또는 프로테오좀의 뇌막염균 외막 프로테인 조제물에 프로테오좀을 착염화시키는 데 동일하게 적용할 수 있다. 엠피겐 BB는 이 방법에 예로서 사용된다: 이 방법은 성분들을 가용시키는 그 어떤 투석 가능한 정화제에 동일하게 적용한다. 이 방법은 A/G Technology 카트리지를 사용하지만, 그 어떤 상표의 카트리지 타입의 한외여과/투석 시스템에 적용할 수 있다.
0.0. 예비 작업
0.0.1. 이 공정에 사용되는 정화제인 30% 엠피겐 BB를 멸균 여과하였다.
0.0.2. 2X TEEN/2% 엠피겐(0.1 M 트리스(Tris), 0.02 M 디나트륨 EDTA, 0.3 M 염화나트륨, WFI 및 2% 엠피겐, pH 8.0)를 제조하였다.
0.0.3. 정화제를 투석해낼 목적으로 pH 8.0, 0.05 M 트리스, 0.15 M 염화나트륨을 함유하는 TNS(트리스 정상 식염수: Tris Nomal Saline) 용액 150 L를 제조하였다.
0.0.4. UF 카트리지 세정용 수산화나트륨 10 L를 제조하였다.
0.0.5. 플렉스너균 2a 리포다당류(LPS) 필요량을 녹였다.
0.1. 플렉스너균 2a LPS과 프로테오좀의 착염화
0.1.6. 2X TEEN 완충액을 동부피의 LPS에 첨가하고 균일하게 혼합하였다.
0.1.7. 상기 단계 5에서 녹인 LPS 양과 동일하게 양, mg으로 거대(bulk) 프로테오좀의 양을 산측하여 녹였다.
0.1.8. 프로테오좀에 L 당 멸균 여과된 엠피겐 30 mL를 첨가하였다. 균일하게 혼합하고 상기 단계 5의 LPS와 배합하였다.
0.1.9. 두 성분을 균일하게 혼합하였다. 교반기(stir plate) 상에서 교반 막대(stir bar)로 대개 15 분 동안 배합시키는 것이 알맞다.
0.1.10. 프로테오좀 착염을 형성시킬 수 있도록 정화제를 투척시켜내기 위하여, 멸균된 실리콘 튜빙과 연동 운동성 펌프가 장착된 A/G Technology, Inc.에서 제작된 최소 분자량 차단치(NMWC) 공극 크기가 10,000인 할로 피버 카트리지를 이용하여 한외여과 시스템(접선 플로우(tangential flow) 기법을 기초로 함)을 설정하였다. 가동 전반에 걸쳐 압력을 관찰할 수 있도록, 위생 처리한 압력 게이지를 이 카트리지의 입출구 면에 장착하였다. 후미 압력(back pressure)을 조정하기 위해서 카트리지의 출구면에 후미 압력 밸브를 장착하였다.
0.1.11. 이 한외여과 시스템을 WFI와 0.5 N NaOH로 50 ℃의 온도에서 60 분이 넘는 시간 동안 세정하고 살균하였다. 이같은 시스템은 사용하기 전에 WFI로 씻어내고 TNS 완충 용액으로 평형화시켰다.
0.1.12. 주입 액체를 용기로부터 채울 수 있도록 멸균 저장 용기를 연결시켰다. 액체를 카트리지 막(삼투 또는 여과)을 경유하여 통과함에 따라, TNS 완충 용액을 직접 첨가하거나 연속 주입 시스템을 이용하여 재충전시켰다. 샘플 저장소까지 TNS 완충 용액을 함유한 용기에 연결시킨 후에 기밀화시킴으로써 연속 주입 시스템을 설정하였다. 액체가 샘플 저장소로부터 여과에 의해 제거됨에 따라, 이 용기로부터 샘플 저장소로 "TNS" 완충 용액이 흡인되는 진공 상태가 발생하여, 이 시스템이 기밀화되어 있다면, 이 저장소내의 샘플 레벨은 일정하게 유지되었다.
0.1.13. 투석을 시작하기 위해서 재순환 펌프를 가동시켰다. 이 펌프 속도를 조정하고 후미 압력 밸브를 15±4 psi의 후미 압력이 얻어지도록 조정하였다.
0.1.14. 엠피겐 침전(Empigen Precipitin) 테스트를 사용하여 매번 10-15 L를 취하여 삼투 샘플을 테스트함으로써 엠피겐 BB의 점진적인 제거를 변화시켰다. 이같은 테스트는 삼투액과 기지량의 엠피겐 BB를 함유하는 표준 용액의 연속 희석액을 제조하고, HCl을 첨가하여 용액을 산성화시킨 후에 SDS (나트륨 도데실 설페이트)의 연속 희석액을 첨가하여 바둑판-타입 분석을 형성하였다. 최대 침전이 엠피겐과 SDS가 평형 양이 존재할 때 형성되었다. 이같은 방식으로, 존재하는 엠피겐의 양은 최대 침전이 형성될 때 SDS, 삼투액의 희석액을 측정함으로써 정량할 수 있었다. 투석 공정으로서, 엠피겐의 양은 줄게 되고 좀더 적은 SDS를 함유하는 튜브가 최대 침전을 갖는 튜브가 될 것이다. 침전의 존재는 스펙트로미터를 이용하여 600 nm에서 OD를 측정함으로써 정량화되었다.
0.1.15. 본 실시예에서 사용되는 성분들의 양에 대해, 삼투액 120 L 이상이 진행되고 엠피겐 침전 테스트에서 현저하게 침전물이 감소될 때까지 투석을 계속하였다(최대 OD 600 nm가 0.05 미만임).
0.1.16. 투석을 종결한 후에 OD280지수를 6.0에 근사하게 얻을 수 있는 최종 부피로 생성물을 농축시킨다. 이 시스템을 배출시키고 "TNS" 완충 용액 300-400 mL로 씻어주었다. 이 시스템을 재차 배출시키고 모두 풀에 배합시켰다. 다량의 WFI를 재순환시키고, 이후에 0.5 N NaOH로써 50 ℃에서 >60 분 동안 카트리지를 세정하였다.
0.2. 멸균 여과
0.2.17. 경우에 따라, 이 착염을 멸균 여과 처리할 수도 있다. 프로테오좀 농도는 0.22 μ 여과 전 또는 후에 조절될 수 있다. 멸균 여과는 정상적으로 Millipore Corp.제의 여과 유니트(unit)로 수행되었다. 이같은 유니트는 소위 Millipaks라 하며 다양한 크기가 가능하다. 여과된 용량을 작업을 이행하고 멸균성에 대해 테스트될 때까지 4 ℃에서 보관되었다.
0.3.0. 특정적인 목적: 뇌막염균 외막 프로테인 프로테오좀의 거대 GMP 조제물과 플렉스너균 2a 리포다당류를 비공유 결합성 착염에 정화제를 제거함으로써 배합하였다.
0.3.1. 적용: 이같은 GMP 방법은 플렉스너균 2a 감염에 대한 백신으로서의 용도의 플렉스너균 2a 리포다당류와 프로테오좀의 비공유 결합성 착염의 거대 조제 형성물을 생성시켰다.
실시예 2
거대 수막염균 균주 9162 정제된 외막 프로테인(프로테오좀)과 균주 8532로부터 정제된 알카리 해독된 수막염균 L8 리포다당류의 비공유결합성 착염화.
1.0. 거대 962 외막 프로테인(프로테오좀), lot 0136 및 거대 해독된 뇌막염균 L8 리포-올리고당(LOS: Lipooligosaccharide) lot 0203을 보관소에서 꺼내 실온에서 녹였다. 멸균 증류수로 LOS 500 mg을 함유하는 거대 LOS의 부피량(182 mL)을 0.05 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.01 M EDTA 및 0.1% 엠피겐 BB를 함유하는 완충 용액에 단백질 400 mg을 함유하는 거대 프로테오좀의 부피량(306 mL)과 배합하였다.
1.2. 엠피겐 BB (30% 용액)을 0.22 ㎛ 공극 크기의 여과기를 통해 멸균 여과하고. 1/60 부피량을 배합 프로테오좀, LOS 용액에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 교반시켰다.
1.3. 정화제 완충 용액을 프로테오좀, LOS 용액과 분리시키고, 3000 분자량 절단 공극 크기를 갖는 A/G Technology 한외여과 카트리지 UFP-3-C-6을 이용한 한외여과에 의해 멸균 증류수로 대체시켰다.
1.4. 셋업, 살균, 씻어주기 및 장치 세정 방법은 상기 실시예 1에서 전술한 바와 같이 동일하게 실시하였다. 주입 압력은 15 ± 4 PSI이였으며 삼투 유속은 분당 175 mL이였다.
1.5. 삼투액은 각각 엠피겐 BB 정화제의 존재에 대하여 상기 실시예 1에 전술한 바와 같은 침전 방법에 의해 3 내지 4 리터를 처리한 후에 테스트되었다. 한외여과는 침전물이 추가 5 리터에 더하여 테스트에서 얻어지지 않을 때까지 계속하였다. 삼투액 총 37 리터를 모았다.
1.6. 여과액(retentate)는 투명하였으며 단백질과 LOS용으로 분석되는 0.22 ㎛ 공극 크기 필터를 통해 멸균 여과되고 거대 생성물로서 4 ℃에서 보관되었다.
1.7. 거대 생성물은 mL 당 프로테인 0.2 mg 농도 및 0.15 M로 조정된 NaCl 농도로 희석되었다. 0.01%의 티메라졸(Thimerasol)을 방부제로서 첨가하고, 생성된 거대 용량체를 멸균 조건 하에서 최종 보관 용기에 현탁액화하고, 라벨링하여 -70 ℃에서 보관하였다.
1.8. 이 생성물은 식염수 용액으로서 투여되고 부형제로서 수산화알루미늄겔에 흡착될 경우의 면역원성(immunogencity)에 대해 마우스에게 테스트되었다. 그 결과는 다음 표 1에 나타내었으며, 이를 통해 이 백신 착염이 마우스에 복강내로(i.p.) 투여될 경우에 면역원성이 있음을 알 수 있다.
| 백신 | 투여량 | 부형제 | 0 일 | 28 일 | 42 일 |
| 프로테오좀-dLOSLot 0271 | 1 μg | 없음 | <8 | <8 | 16 |
| 3 μg | 없음 | <8 | <8 | 128 | |
| 10 μg | 없음 | <8 | <8 | 512 | |
| 프로테오좀-dLOSLot 0271 | 1 μg | Al(OH)3 | <8 | <8 | 512 |
| 3 μg | Al(OH)3 | <8 | <8 | 512 | |
| 10 μg | Al(OH)3 | <8 | 64 | 2048 | |
| 주: 백신을 성장한 CD-1 마우스 10 마리 군에게 0 및 28 일에 복강내 투여함. |
1.9. 프로테오좀과 LOS의 착염화는 착염화 전후에 프로테오좀과 LOS 성분의 컬럼 크로마토그래피에 의해 확인되었다. 거대 뇌막염균 L8 LOS와 최종 프로테오좀/LOS의 크로마토그래피 분석은 Sephacryl S300 저압 컬럼상에서 착염화된다. 이 컬럼은 0.05 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA, 0.15 M NaCl 완충용액으로 실시되었다. 프로테인에 대한 분석은 280 nm에서의 흡수에 의해 이루어졌으며, LOS에 대한 분석은 플라스틱판에 흡착된 정제 L8 LOS와 결합하는 L8 모노클로날 항체가 분획 제거 Sephacryl 컬럼의 연속적인 희석에 의해 억제되는 ELISA(enzyme linked immunosorbant assay)의 억제도에 의해 이루어졌다. 착염화 이전에, LOS는 컬럼에서 분획(fraction) 39에 중심을 둔 넓은 피크로 나타났다. 착염화 이후에 프로테오좀과 함께 용리되는 LOS는 대략 분획 33에 중심을 둔 피크로 나타났다.
1.10. 특정적인 목적: 뇌막염균 외막 프로테인 프로테오좀과 해독된 뇌막염균 리포다당류의 거대 GMP 조제물을 정화제의 제거에 의해 비공유 결합성 착염에 배합한다.
1.11. 적용: 이같은 GMP 제조 방법은 수막염균(뇌막염균성: meningococcal) 감염에 대한 백신으로서의 용도로, 프로테오좀과 해독된 뇌막염 리포다당류 비공유 결합성 착염의 거대 조제 형성물의 제조로 종결된다.
실시예 3
본 실시예는 또한 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 백신의 제조에 관한 것이다. 이 제조 방법은 막 카트리지의 하우징 크기의 적절한 대량화와 함께 10-1000 배 이상의 물질을 이용한 대량화에 동일하게 적용할 수 있으며, 부피상으로 적절하게 증가시킨다.
8.1. 멸균 여과된 엠피겐 BB(30% 용액) 25 mL의 제조
8.1.1. 0.2 μ 공극 크기 막 필터를 갖는 100 mL Nalgene 분산 가능한 필터를 엠피겐 BB(30% 용액) 약 25 mL를 멸균 여과하는 데 사용하였다.
8.2. 2% 엠피겐 BB를 갖는 TEEN 2x(0.1 M 트리스, 0.02 M 디나트륨 EDTA, 0.3 M 염화나트륨, WFI 및 엠피겐 BB의 2% 용액) 4 L를 제조하였다.
8.3. "TNS" 용액 10 L을 15 배하여 총 150 리터로 제조하였다: TNS는 0.15 M 염화나트륨, 0.05 M 트리스 완충 용액 pH 8.0 ± 0.2로 이루어졌다.
8.4. 0.5 N 수산화나트륨 10 L를 제조하였다.
8.6. 경우에 따라, 거대 플레시오모나스 시겔로이드스 리포다당류(LPS)를 녹여 프로테오좀과 착염화용으로 제조하고 lot 수와 LPS의 농도, mg으로 필요한 LPS의 양 및 제거될 LPS의 산측 부피를 기록하였다.
9.0. 프로테오좀과 플레시오모나스 시겔로이드스 LPS의 착염화
9.1. 착염화용 LPS의 제조
9.1.2. 거대 LPS 부를 깨끗하고 멸균된 5 L 용량의 병에 채웠다. 전체 부피를 측정하고 LPS의 총량을 측정하였다.
9.1.3. 상기 단계 9.1.2에서 사용된 LPS와 동일한 부피의 2x TEEN 완충 용액을 첨가하고, 배합 전체 부피를 측정한 후에 교반 막대를 넣고 교반기에서 교반 막대로 배합물을 15 ± 2 분 동안 혼합하였다.
9.2. 착염화용 프로테오좀의 제조
9.2.1. 전체 시간을 기록하고, 만약 있다면, 프로테오좀을 녹였다.
9.2.2. 거대 프로테오좀부를 깨끗하고, 멸균된 1 L 용량의 실린더에 채웠다. 전체 부피를 측정하고 프로테오좀의 총량을 측정하였다.
9.2.3. 상기 단계 9.2.2에서의 실린더로부터, 다른 깨끗한 멸균 1 L 용량의 실린더에 옮겨 담고, 상기 단계 9.1.2에 사용된 LPS의 mg 양과 동일한 mg 양을 함유한 프로테오좀 부피를 첨가하였다.
9.2.4. 이 프로테오좀을 함유하는 실린더에, 프로테오좀 L 당 엠피겐 30 mL를 사용하여 0.22 μ 여과된 30% 엠피겐 BB를 첨가하였다. 교반 막대로 15 ± 2 분 동안 혼합하였다.
9.3. 플레시오모나스 시겔로이드스 LPS와 프로테오좀의 배합
9.3.1. 교반 막대로 부드럽게 교반시켜주면서, 단계 9.3.2의 프로테오좀을 LPS를 갖는 5 L 용량의 병에 첨가하고 15 ± 2 분 동안 교반시켰다.
9.3.3. 4 개의 1 mL 샘플을 덜어내어 KDO 분석에 의해서 및 Lowry 방법에 의한 단백질의 후속 측정용으로 -75 ℃에서 보관하였다.
9.4. 한외여과/투석에 의한 정화제의 제거
9.4.1. 한외여과 시스템 상세부 시스템: A/G Technology, Inc. 할로 피버 카트리지, 10,000 NMWC 공극 크기, 하우징 크기 6, 한외여과 카트리지
주: 글리세롤을 분출시키기 위한 새로운 카트리지 조건이 필요하다. 이는 후미 압력 없이 6 sq/ft 카트리지 이하를 통해 WFI 6 리터를 분출시킴으로써 수행될 수 있다. 이 삼투 용액은 주입 저장소로 재순환될 수 없다.
9.4.2. A/G 한외 여과 시스템을 설치하고 살균하기. 0.5 N 수산화나트륨 2-3 리터로 50 ± 5 ℃의 개시 온도에서 최소한 60 분 동안 재순환시킴으로써 이 시스템을 세정하고 살균한다. WFI 4-5 리터로 이 시스템을 분출시킨 다음에 "TNS"(0.05 M Tris/정상 식염수 완충용액 pH 8.0 ± 0.2) 2-3 리터를 적어도 20 ± 5 분 동안 재순환시켰다.
9.4.3. 1 리터 용량의 실린더로 및 저장소에서부터 액체로 충진된 주입 및 배출 라인을 옮김으로써 UF 시스템(튜빙 포함)내의 보유 부피(the hold up volume)를 측정한 후에, UF 시스템이 비워질 때까지 펌프질하였다.
9.4.4. 2 리터 용량의 가지 달린 용기를 팬에 배치하고 투석 공정 동안 젖은 얼음으로 용기를 감쌌다.
9.4.5. 2 L 용량의 가지 달린 용기에 상기 단계 9.3.3의 거대 프로테오좀-LPS 혼합물 1.7-1.9 L를 옮겨 담았다. 이 용기에 10 mL 용량의 피펫이 장착된 2-홀 마개를 장치하고 주입 및 배출 튜빙을 투석 시스템에서부터 용기 피펫까지 연결시켰다.
9.4.6. 재순환 펌프를 가동시키고, 펌프 세팅을 4-6으로 조정하였다. 후미 압력 클램프를 15 ± 4 psi의 주입 압력을 얻을 수 있도록 조정하였다. 보유 부피를 포함하여 전체 부피를 1.0 ± 0.1 L로 농축시켰다.
9.4.7. 상기 단계 9.3.3의 혼합물 1 ± 0.1 L를 2 L 용량의 가지 달린 용기에 옮겨 담고 상기 단계 9.4.6을 반복하였다.
9.4.8. 상기 단계 9.3.3의 프로테오좀-LPS 혼합물 전부를 2 L 용량의 가지 달린 용기에 옮겨 담고 보유 부피를 포함하여 여과액 부피가 1.4 ± 0.2 L가 될 때까지 상기 단계 9.4.7에서와 같이 옮겨 담기와 단계 9.4.9에서와 같이 농축하기를 계속하였다.
9.4.10. 막을 통해 액체를 제거하는 것과 같이 2 L 용량의 가지 달린 용기에 TNS(0.05 M Tris, 정상 식염수)의 연속 주입용 한외여과 장치를 설치하였다. TNS를 함유하고 이 용기의 바닥까지 연장된 튜브가 장착된 10 리터 용기를 이용하여 저장고를 장착하였다. 주입과 배출 라인을 한외여과 시스템으로부터 연결시켰다. 재순환 펌프를 가동시키고 펌프 세팅을 4-6으로 조정하였다. 15 ± 4 psi의 주입 압력을 얻을 수 있도록 후미 압력을 조정하였다.
9.4.11. UF 유니트로 삼투 유속을 측정하고 측성 수행시의 주입 압력을 기록하였다.
9.4.12. 진행된 각각의 12 ± 0.5 L 삼투액 샘플 15 내지 20 mL를 모아서, 인-하우스 라벨(in-house label)을 적용하고 샘플의 최대 O.D.600, 진행된 부피 및 시간을 기록하였다. 엠피겐 침전 테스트를 이용하여 엠피겐 BB 존재에 대해 샘플을 테스트함으로써 엠피겐의 진행성 제거를 확인하였다. 이같은 테스트는 삼투액과, 각각, 기지량의 엠피겐 BB를 함유하는 용액의 연속 희석액을 제조하고, HCl을 첨가하여 용액을 산성화시킨 후에 SDS(나트륨 도데실 설페이트)의 연속 희석액을 첨가하여 바둑판-타입 분석을 형성시키는 것으로 이루어진다. 최대 침전물은 동량의 엠피겐과 SDS가 존재할 경우에 형성될 것이다. 이같은 방식으로, 존재하는 엠피겐의 양은 침전물이 형성되는 삼투액과 SDS의 희석액을 기록하고 표준 상태에서 이들의 희석액과 비교함으로써 정량화할 수 있다. 투석을 진행시키는 것과 같이, 엠피겐의 양은 좀더 적어질 것이며 좀더 적은 SDS를 함유하는 튜브가 최대 침전물을 갖는 튜브가 될 것이다. 침전물의 존재는 분광학기를 이용하여 600 nm에서 OD를 측정함으로써 정량화된다.
본 실시예에 사용된 성분들의 양에 대하여, 적어도 삼투액 120 리터가 진행되고 엠피겐 침전 테스트(최대 OD 600 nm이 0.05 미만)에서 현저한 침전물의 경감이 있을 때까지 투석을 계속하였다.
9.4.13. 생성물을 보유 부피(단계 9.4.3)을 포함한 최종 여과액 부피 500 ± 50 mL까지 농축시켰다. 샘플 0.5 mL를 덜어내서, 샘플을 1 : 10으로 희석시키고, O.D.280을 반복하였다.
9.4.14. 농축된 여과액의 바람직한 최대 O.D.는 5.7이다. O.D.가 5.7 미만이면, 보유 부피(단계 9.4.3)를 포함한 400 ± 50 mL로 계속 농축시키고 O.D.280을 반복하였다.
9.4.15. 여과액 용액으로부터 여과액 라인으로 및 여과액 배출 라인을 폐쇄하면서, 카트리지와 라인이 비워질 때까지 역방향으로 서서히 펌프하였다. 이 주입 라인과 여과액 라인을 여과액 용기로부터 350 ± 50 mL TNS를 갖는 새로운 깨끗한 용기로 옮겼다. 펌프를 역으로 하고 2-3 분 동안 서서히 이 TNS를 재순환시켰다.
9.4.16. TNS를 재순환시킨 후에, 펌프질을 멈추고, 이 시스템을 재출시키고, 여과액 세정 용액을 깨끗한 멸균의 1 L 용량 실린더에 모으고, 부피 및 O.D.280을 측정하였다.
9.4.17. 원래의 여과액 용액(단계 9.4.12 또는 9.4.13)을 세정 여과액 용액(단계 9.4.15)와 배합하고 여과액의 최종 부피를 측정하였다. 이 여과액 용량체를 멸균 여과할 때까지 4 ± 2 ℃에 보관하였다.
9.4.18. WFI를 사용한 후에, 0.5 N 수산화나트륨으로 초기 50 ± 5 ℃에서 최대 60 분 동안 여과 유니트를 씻어주었다. 이 세정제를 WFI로 헹궈준 후에 보관제로서 0.1 N NaOH 3-4 리터로 분출시켰다.
9.5. 멸균 여과
경우에 따라, 이 착염을 멸균 여과할 수도 있다. 거대 착염화된 플테오좀과 LPS가 얻어지고 그 어떤 침전물이나 클라우딩 현상이 존재하는지 검측하였다. 거대 착염화된 생성물이 투명하다면, Millpak 40, 0.22 μ 여과 유니트를 사용하여 멸균된, 파이로겐 제거된(depyrogen) 용기로 멸균 여과하였다. 이같은 단계는 멸균실에서 수행되어야만 한다.
9.6. 특정 목적: 뇌막염균 외막 프로테인 프로테오좀과 플레시오모나스 시겔로이드스 리포다당류(손네균)의 거대 GMP 조제물을 정화제를 제거함으로써 비공유결합성 착염에 배합하였다.
9.7. 적용: 이같은 GMP 제조 방법은 손네균 감염에 대한 백신으로서 사용하기 위하여 프로테오좀과 플레시오모나스 시겔로이드스 2a 리포다당류의 비공유결합성 착염의 거대 조제 형성물의 제조로 종결된다.
10. 면역원성 연구:
10.1. 할로 피버 한외여과/투석을 이용한 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신의 면역원성
도 1과 2를 통해서는, 정화제를 제거하고 착염화에 유리한 할로 피버(HF: hollow fiber) 투석 기법을 이용하여 제조된 세 가지 다양한 프로테오좀-시겔라 LPS 백신 조제물이 간단한 투석 튜빙(DT: dialysis tubing)을 이용하여 제조된 조제물보다 테스트되는 최소한의, 가장 미량의 투여량으로 더욱 유효하다는 것을 알 수 있다. 즉, 좀더 강한 IgG(도 1) 및 IgA(도 2) 면역 반응은 종래의 유효성이 덜한 기술 방법에 의해서보다는 본 발명을 이용하여 제조된 백신에 의해서 도출되었다. 좀더 강한 면역 반응들이 좀더 나은 수준의 예방을 초래하기 때문에, 이같은 데이타들은 본 발명이 제조가 용이할 뿐만 아니라 좀더 강력한 백신을 생성시킨다는 것을 나타내고 있다. 게다가, 가장 적은 투여량(투여당 0.1 μg)으로 투여될 경우에 좀더 강한 반응이 도출됨으로써, 종래 기술 방법을 이용하는 것보다는 좀더 적은 백신이 본 발명을 이용하는 데 필요할 것이라는 것을 나타낸다. 다가 백신의 생성에서 다수의 다양한 항원이 요구되기 때문에, 투여되는 백신의 총량을 최소화하기 위해서, 좀더 적은 투여량으로 유효한 백신 성분들을 사용할 수 있다는 것이 매우 유리하다. 따라서, 할로 피버 기술 방법을 이용한 본 발명의 기술 방법은 광범위한 특성을 갖는 다가 백신을 배합할 수 있는 능력에 직접적으로 영향을 미침으로써 유용하다. 백신을 동결건조시킬 수 있도록 백신을 상업적으로 개발하는 데 유리하기 때문에, 수용액으로부터 HF 백신 착염의 동결건조가 놀랍게도 테스트된 모든 투여량으로 가장 큰 것에 속하는 반응을 시종일관 도출시키는 것을 알게 되었다. 따라서, 안티-LPS IgG(도 1) 및 IgA(도 2)에 대한 좀더 큰 면역원성을 HF 기법(동결건조와 함께 또는 없이)에 의해 제조된 백신 0.1 μg을 투여할 때 나타났다. 이같은 데이타들은 본 발명의 대량화 및 GMP 기술 방법이 GMP/HF-3을 나타내는 빗금친 막대에 의해 도 1과 2에 나타낸 바와 같은 HF 기법을 사용하였기 때문에 현저해진다.
10.2. 다가 백신을 이용한 면역원성 연구
도 3에 나타낸 바와 같이, 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS(손네균 시겔라증의 경우)과 프로테오좀-플렉스너균 2a 백신을 동일한 날이나 주 간격으로 좀 떨어져서 투여하는 것이 LPS 성분들에 대한 우수한 면역원성을 초래한다: 손네균 LPS 및 플렉스너균 2a LPS.
11. 프로테오좀-시겔라 백신의 전자 현미경
프로테오좀과 시겔라 LPS의 배합은 다음 도 4에 나타낸 바와 같이 명백하고 경이적으로 전자 현미경으로 묘사된다. 이 도면에서, 프로테오좀 소포들이 주파수-불투명성 검정색 점으로 산재되어 있다. 이 점들은 특정적인 안티-시겔라 LPS 항체를 인식하는 이차 항체와 결합되는 갓 비즈(god beads)이다. 따라서, 골드 도트(gold dots)가 존재하는 것은 시겔라 LPS의 존재를 나타낸다. 나타난 바와 같이, 골드 도트가 프로테오좀 수포를 둘러싸고 점점으로 찍혔 있기 때문에, 프로테오좀에 비공유결합적으로 결합된 LPS를 갖는 프로테오좀 백신이 이로써 확인되고 가시화된다. 놀랍게도, 본 발명의 HF 기법으로 제조된 백신의 일정한 수포적 특성이 종래 기술 방법을 사용하는 DT 조제물을 전자 현미경으로 검측할 경우에 발견되지는 않았다(비공개 결과).
12. 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신으로 시겔라증의 동물 모델에서 치사성 손네균 폐렴에 대한 예방
도 5에 나타낸 바와 같이, 동물을 치사성 폐렴을 유발시키는 생체로 하여 시도되는 시겔라증의 동물 모델에서 측정된 것과 같이, 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신은 플레시오모나스 시겔로이드스로의 치사성 감염에 대해 매우 현저한 예방을 제공한다. 이같은 데이타들은 또한 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신에 의해 제조되는 정확하고 예방적인 항체일 뿐만 아니라 이 비내 서브-유니트 백신이 치사성 폐렴을 예방할 수 있다는 것을 증명한다.
13. 프로테오좀-플렉스너균 2a LPS 백신의 비내 면역화 또는 경구 면역화에 의한, 면역화 이후 30-60 일이 지속되는 혈청내 안티-시겔라 LPS IgG 및 IgA, 및 장과 폐내 세척 유체내 IgA의 유도
도 6에 나타낸 바와 같이, 프로테오좀-플렉스너균 2a LPS 백신으로의 2 회 면역화가 면역화 이후 30 내지 60 일이 지속되는 혈청내 및 폐와 장내 분비물내에서 항체를 유발시킨다. 이러한 데이타들은 프로테오좀 백신이 통상적인 점막 면역 시스템을 자극하여 면역화 부위로부터 거리가 있는 부분에서도 특정 항체를 분비할 수 있다는 것을 나타낸다. 특히, 비내 면역화는 장내 분비물에서 항체를 유발시키고 그 역도 가능하다. 이같은 능력은 점막 문맥을 통해 숙주에 침입한 병원균을 예방할 수 있는 프로테오좀 백신의 잠재적인 이용 가능성을 확대시킨다.
14. 도 7은 다양한 백신의 양을 이용하여 손네균에 대한 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신으로 인체 지원자의 비내 또는 경구 면역화 후에, 혈청, 타액 및 소변의 IgA 및 IgG 항체 반응 및 안티-시겔라 LPS IgA, IgG 및 IgM 말초 혈액 ASC 반응의 유도를 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 6 명의 지원자 모두에게서 반응을 유발시키는 가장 큰 투여량에 의해 투여량 종속 방식으로 비내 면역화가 반응을 도출시킨다.
IgA, IgG 및 IgM 혈청 반응들이 비내 군들 중 각각에서 도출되었다. 추가로, 세포 ASC반응을 분비하는 강한 항체는 점막 면역화가 항체 분비 세포 - 가장 두드러지게는, IgA-분비 세포 - 의 교류를 자극하는 것을 나타내는 것으로 유도되었다. 가장 중요하게는, IgA 반응이 타액 및 특히, 소변 샘플에서 발견되었는데, 분비성 IgA가 점막 표면에서 생성되는 것을 나타내는 것이었다(IgA는 신장을 통해 배출되지 않으며, 오줌의 IgA는 항체의 국부 분비를 반영하는 것이며 이러한 비내 백신이 또한 국부적인 장내 IgA 또한 생성시킨다는 것과 비내 백신이 그램 음성 유기체에 의해 야기되는 비뇨기 계통의 감염증을 예방하는 데 사용될 수 있다는 것을 제시하는 것임). 이러한 ASC와 항체 반응의 대부분이 이차 접종 면역화가 필요하지 않다는 것을 제시하는 것으로 단지 일차 면역화 후에 발견되었다는 것이 주목할 만하다. IgA와 IgC ASC 및 비뇨기성 IgA는 또한 경구 투여후에도 발견되었다. 경구 투여의 가장 유효한 용도는 코를 통한 일차 접종 후에, 경우에 따라, 이차 접종으로서가 될 것이다.
15. 다가 분자성 프로테오좀 프로테인과 LPS의 비공유결합성 착염화의 증명을 다음 도 8에 나타내었다. 이 그래프는 프로테오좀-LPS 백신을 적용할 경우에 비해 컬럼 용리액 프로필이 다른 부분에서 발생하는, 비착염화된 플레시오모나스 시겔로이드스 LPS를 적용한 후의 HPLC 분획내 LPS를 나타낸다. 프로테오좀-플레시오모나스 시겔로이드스 LPS 백신을 적용한 후의 HPLC 분획내 프로테인과 LPS의 공동 용리는 프로테오좀의 가장 큰 프로테인 응집체에 해당되는 피크로 나타난다. 이 데이타는 LPS를 정량화할 수 있도록 억제성 ELISA를 이용하고 프로테오좀 단백질을 정량화할 수 있도록 A280에서 OD를 이용하여 측정하였다. 이 HPLC 컬럼은 Tosohaas G50000Pwxl이였으며 분자량 표준치는 화살표를 통해 표시하였다.
Claims (28)
- a) 프로테오좀, 투석 가능한 정화제 및 양쪽성 결정자의 혼합물을 형성하고,b) 상기 혼합물을 투석 또는 한외여과시켜 정화제를 제거하여 양쪽성 결정자-프로테오좀 착염을 생성시키고,c) 양쪽성 결정자-프로테오좀 착염 형성물의 양을 관측하고,d) 상기 양쪽성 결정자-프로테오좀 착염을 회수하는 것으로 이루어지는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 한외여과가 접선 플로우를 포함하는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 한외여과가 할로 피버 카트리지, 플랫폼막 및 막 카트리지로 이루어진 군 중에서 선택된 시스템에서 수행되는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 한외여과 시스템이 NMWC 공극 크기가 10,000인 할로 피버 카트리지인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 한외여과 시스템이 NMWC 공극 크기가 3,000인 할로 피버 카트리지인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 투석 가능한 정화제의 관측이 삼투액 샘플의 연속 측정을 포함하는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 관측이 삼투액 또는 여과액 샘플의 광학 밀도를 측정하는 것을 포함하는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 관측이 삼투액 샘플을 기지량의 SDS(나트륨 도데실 설페이트)와 혼합하여, 정화제가 존재한다면 침전물을 생성시키고, 침전물의 양을 측정함으로써 정화제 제거량을 측정하는 것을 포함하는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 삼투액내 정화제가 본질적으로 제거된 경우에, 상기 LPS-프로테오좀 착염을 회수하는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 정화제가 엠피겐 BB인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 양쪽성 결정자가 리포다당류인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 리포다당류를 그램 음성 박테리아로부터 얻는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 그램 음성 박테리아가 플레시오모나스(plesiomonas)인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 플레시오모나스가 플레시오모나스 시겔로이드스인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 그램 음성 박테리아가 시겔라인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 시겔라가 플렉스너균, 손네균 또는 보이디균인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 그램 음성 박테리아가 나이세리아인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 나이세리아가 수막염균인, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 프로테오좀을 수막염균 또는 임균으로부터 유도하는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 LPS-프로테오좀 착염의 회수가 정화제 제거의 관측 속도가 감소되거나 일정할 때 유효한, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, 추가로e) 상기 회수된 프로테오좀-양쪽성 결정자 착염을 생리학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 백신을 생성시키는 것으로 이루어지는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 21 항에 있어서, 추가로 상기 LPS-프로테오좀 착염을 회수하기 전에 이 착염을 농축시키는 것으로 이루어지는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 22 항에 있어서, 상기 농축을 바람직한 최종 농도까지 지속하는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 제조 방법이 다양한 양쪽성 결정자 타입으로 수행되어 상기 단계 e)에서 모아져서 다가 백신을 생성시키는 일련의 프로테오좀-양쪽성 결정자 착염을 생성시키는, 프로테오좀-양쪽성 결정자 백신의 제조 방법.
- 제 24 항에 의한 방법으로 제조된 다가 백신.
- 제 25 항에 의한 백신을 수체(recipient)에게 유효한 양으로 투여하는 것으로 이루어지는, 질병 예방법.
- 제 21 항에 의한 방법으로 제조된 백신을 수체에게 투여하는 것으로 이루어지는, 질병 예방법.
- 제 21 항의 방법에 의해 제조된 다가 백신.
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