WO2005042571A1 - Método para la incorporación de antígenos en vesiculas de membrana externa de bacterias y formulaciones resultantes - Google Patents

Método para la incorporación de antígenos en vesiculas de membrana externa de bacterias y formulaciones resultantes Download PDF

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antigen
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Olivia NIEBLA PÉREZ
Rolando PAJÓN FEYT
Sonia González Blanco
Alejandro Miguel MARTÍN DUNN
Maité DELGADO ESPINA
Hilda Elisa GARAY PÉREZ
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
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Centro De Ingeniería Genética Y Biotecnología
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • the present invention is related to the field of medicine, particularly with the development of vaccine compositions, of preventive or therapeutic application, which allow an increase in the quality of the immune response against vaccine antigens in diseases of diverse origin.
  • the inclusion bodies can be easily separated, solubilized with denaturing agents, such as guanidium chloride or urea, and then renatured through a process such as dilution or dialysis.
  • denaturing agents such as guanidium chloride or urea
  • renaturation processes include inhibition of aggregation by applying low molecular weight additives and renaturation in matrices (Misawa S. and Kumagai I. (1999) Refolding of therapeutic proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies. Biopolymers 51: 297-307).
  • the P2 protein of Haemophilus influenzae which is one of the majority immunogenic proteins of the outer membrane, was renaturated in a solution that included high concentrations of salt and calcium ions (Pullen JK, et al. (1995) Production of Haemophilus influenzae type-b porin in Escherichia coli and its folding into the trimeric form. Gene 152: 85-8).
  • Rhodabacter capsulatus porin protein was chemically modified with methoxypolyethylene glycol-succinimidyl carbonate to yield a water soluble conjugate thereof.
  • the renaturation of the conjugate was studied by sequence addition! of trifluoroethanol to lower the dielectric constant, which was not achieved.
  • the protein was finally renatured by addition of hexafluoro-2-propanol between 5 and 10% (Wei J., Fasman GD (1995) A poly (ethylene glycol) water-soluble conjugate of porin: refolding to the native state. Biochemistry 34: 6408-15).
  • PorA Two types of PorA, P1.6 and P1.7,16 of meningococcus, folded in vitro after overexpression and isolation from E. coli. Said porins were folded efficiently by rapid dilution in an appropriate buffered solution containing the detergent n-dodecyl-N, N-dimethyl-1-ammonium-3-propanesulfonate (Jansen O, et al. (2000) Biochemical and biophysical characterization of in vitro folded outer membrane porin PorA of Neisseria meningitidis. Biochim Biophys 1464: 284-98).
  • the inclusion in membranes formed by lipid bilayers is a strategy used in the renaturation of porin proteins and other integral proteins of membrane, obtained through genetic engineering.
  • the main outer membrane protein of Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae was solubilized from inclusion bodies using 2% OG and 1mM dithiothreitol, before incorporating it into a lipid bilayer (Wyllie S., et al. (1999) Single channel analysis of recombinant major outer membrane protein porins from Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae. FEBS Lett 445: 192-96).
  • the outer membrane proteins of Escherichia coli OmpF and OmpA were renaturated by dilution in a dispersion of lipid vesicles or detergent / lipid vesicles (Surrey T., et al. (1996). Folding and membrane insertion of the trimeric beta-barrel protein OmpF. Biochemistry 35: 2283-88).
  • the meningococcal Opc gene was cloned and expressed at high levels in E coli.
  • the protein was purified by affinity chromatography, incorporated into liposomes and micelles of the Zwittergent detergent.
  • MFLA Mono Phosphoryl Lipid A
  • the affinity purified protein was either adjuvant with AI (OH) 3 adjuvant, or presented in liposomes.
  • Immunization of the recombinant protein in liposomes induced antibodies with great avidity for the native protein, which reacted with the intact meningococcus and inhibited the binding of protective antibodies (Christodoulides M., et al. (1998) Immunization with recombinant class 1 outer-membrane protein from Neisseria meningltidis: influence of liposomes and adjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the induction of a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology 144: 3027-37).
  • the porB gene from a N.
  • meningitidis strain expressing the PorB3 protein was cloned and inserted into the pRSETB vector and the protein was expressed at high levels in the E. coli host.
  • the recombinant protein was purified to homogeneity by affinity chromatography and used for immunization after incorporation into liposomes and micelles of Zwittergent detergent or sulfobetaine.
  • the serum produced by the liposomes and the micelles showed greater reactivity with the native protein (Wright JC, et al (2002). Immunization with the Recombinant PorB Outer Membrane Protein Induces a Bactericidal Immune Response against Neisseria meningitidis. Infec ⁇ Immun. 70: 4028- 3. 4).
  • Neisseria meningitidis a Gram negative diplococcus whose only host is man, is the causative agent of meningococcal meningitis. This bacterium is usually found in an asymptomatic carrier state in the population, this being the most common route for its microbiological isolation.
  • Various strategies have been developed with the aim of obtaining a vaccine preparation that satisfies the necessary requirements to protect the population against this disease. For this, the capsular antigens whose immunological specificity has allowed the classification of this microorganism in serogroups have been taken into account.
  • Serogroup B unlike the rest, continues to be an important cause of endemic and epidemic meningococcal disease, largely due to the lack of effective vaccines against it.
  • Product of the low immunogenicity of serogroup B polysaccharide (Finne J., et al. (1987) An monoclonal IgG antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tissues. J. Immunol. 138: 4402-07), the development of vaccines against this serogroup has concentrated on the use of subcapsular antigens.
  • Vaccines composed of VME were significantly more immunogenic parenterally than PME aggregates and this immunogenicity was initially explained by increased adsorption to the adjuvant aluminum hydroxide (Wang LY and Frasch CE. (1984) Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model, Infec ⁇ Immun. 46 (2): 408-14). Subsequently, the effectiveness of EMV vaccines has been attributed to the presentation of PMEs, arranged in their natural conformation, to allow the generation of bactericidal antibodies, at least in adolescents and adults. Antibody responses generated increased meningococcal opsonophagocytosis.
  • the precise formulation of the vaccines has a significant impact on immunogenicity, with large differences from one producer to another depending on the strain and / or the methodology used ( Lehmann AK, et al. (1991) Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS 99 (8): 769-72; Gómez JA, et al. (1998) Effect of adjuvants in the sotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrin-binding proteins of Neisseria meningitidis.
  • PorA porin approximately 42 kDa, has been shown by sequence analysis that its variability is exclusively concentrated in two of the 8 exposed protein loops (VR1 and VR2). Variation of these regions has been used in subtyping of meningococcal strains (Abdillahi H.
  • the present invention solves the aforementioned problem by providing a method for incorporating antigens into proteoliposomes, where said antigens form a complex with a preparation of Gram negative bacteria outer membrane proteins, this complex being generated by co-renaturation and keeping the structure intact. vesicular proteoliposome.
  • the method includes a preparation of Gram negative bacteria outer membrane proteins, obtained from species of the Neisseriaceae family or Bramhamella catarrhalis, with those including Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica being especially preferred.
  • the protein antigen that forms part of the complex is of natural, recombinant or synthetic origin.
  • the invention also relates to the vaccine combination derived from the method described above and comprising a complex formed by a preparation of Gram negative bacteria outer membrane proteins, made from species of the Neisseriaceae family or from Bramhamella catarrhalis, and a protein antigen of natural, recombinant or synthetic origin, where this complex is generated by co-renaturation and keeps the vesicular structure of the proteoliposome intact.
  • the vaccine compositions can be administered parenterally or mucosally.
  • a particularly important aspect of the invention relates to the addition to the above-mentioned vaccine compositions of bacterial polysaccharides, conjugated bacterial polysaccharides and nucleic acids as antigens.
  • the prophylactic or therapeutic use of the combinations described above in humans is also part of the present invention.
  • compositions protein antigens are renatured by insertion into proteoiiposomal vesicles, in order to achieve their correct folding.
  • Said compositions have new properties that result from the generation of the complex, which originates in such a way that the vesicular structure remains intact.
  • the mucosal administration of said compositions can generate a systemic immune response of similar intensity and superior quality to that obtained with conventional vaccine formulations that use alumina as an adjuvant. Furthermore, immunization by this route is capable of generating a powerful response at the mucosa level, characterized by high levels of IgA-type antibodies.
  • the present invention in contrast to the state of the prior art, is useful for achieving adequate renaturation of protein antigens without them having to be included in artificial, chemically modified lipid bilayers. or mixed with chemical compounds of inorganic origin.
  • a more effective functional immune response is obtained, in terms of the quality of the antibodies that are generated against the antigen of interest, due to its optimal presentation to the immune system.
  • Figure 1 Passive protection against meningococcal infection, determined in the infant rat model. Rats received the antisera obtained by immunizing mice with: 1. proteoliposome with vesicular structure, 2. proteoliposome with non-vesicular structure.
  • C- negative control
  • C + positive control
  • Figure 2 Purification of recombinant PorA.
  • A 10% polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Line 1 protein molecular weight standard.
  • Line 2 Initial sample of purification, fraction after rupture by ultrasound.
  • Line 3 Final sample, fraction eluted from ion exchange.
  • B Chromatogram of the densitometry of the ion exchange chromatographic fraction.
  • Figure 3 Electrophoretic analysis of the incorporation variants.
  • A 10% Polyacrylamide Gel Electrophoresis.
  • Line 1 Molecular weight standard.
  • Line 2 Recombinant protein.
  • Line 3,4,5,6,7 incorporation variants.
  • Line 8 VME.
  • B Western blot immunoidentification of the incorporated protein, carried out with the anti-P1.16 monoclonal antibody.
  • Line 1 Molecular weight standard.
  • Line 2 VME.
  • Line 3,4,5,6,7 incorporation variants.
  • Line 8 recombinant protein.
  • FIG. 4 Electron microscopy photos showing the insertion of the recombinant protein PorA 7,16,9.
  • A External membrane vesicles evidenced by negative staining and electron microscopy, Strain CU385.
  • B Immunologically labeled outer membrane vesicles using an anti PorA monoclonal antibody (Subtype 15).
  • C Immunologically labeled outer membrane vesicles using a monoclonal anti PorA subtype 16.
  • Figure 5. Western blot to verify incorporation of the recombinant protein under different conditions.
  • A recombinant protein P1. 7.16.9 detected with Mab 1-33, anti-P1.9.
  • B natural P1 present in the gallbladder.
  • Line 1 Natural proteoliposome.
  • Line 2 Recombinant purified protein.
  • Line 3,4,5,6 incorporation variants.
  • FIG. 6 Graphical representation of the IgG antibody titers against the recombinant protein P1.7,16,9, reached by the different groups of immunized animals.
  • the titer was determined as the reciprocal of the maximum dilution that triples the D.O. value of the preimmune serum.
  • FIG. 7 Graphical representation of individual IgG antibody titers against Neisseria porins induced when immunized with the recombinant protein P1.7,16,9. The titer was determined as the reciprocal of the maximum dilution that triples the D.O. value of the preimmune serum.
  • FIG. 8 Graphical representation of bactericidal antibody titers when evaluating the serum obtained by immunizing with the recombinant protein P1.7,16,9, against Neisseria strains of subtypes 7, 16, and 9. The titer was determined as the reciprocal. of the maximum dilution of the serum where more than 50% of death is obtained.
  • Figure 9 Graphical representation of the antibody titers against the recombinant TbpB protein in the different renaturation variants studied.
  • Figure 10 Results of the transferrin binding inhibition assay in the presence of serum antibodies for the variants studied. The titer was determined as the reciprocal of the maximum serum dilution where more than 40% inhibition is reached.
  • Figure 11 Graphical representation of the antibody titers when evaluating the serum obtained by immunizing with the different variants, against the Neisseria strains of subtype P1.16. The titer was determined as the reciprocal of the maximum dilution that doubles the DO value of the preimmune serum.
  • FIG. 12 Levels of anti-VR2 peptide antibodies induced by MAP immunization of VR2 of the PorA protein of meningococcus.
  • a coating antigen a chemical conjugate of the peptide covering this region and bovine serum albumin were used.
  • FIG. 13 Graphic representation of the antibody titers against VME of a Neisseria strain of subtype P1.16, obtained by evaluating the antisera produced by immunizing with recombinant P1.16, with the same protein incorporated in VME of Neisseria lactamica or Bramhamella catarrhalis, or with the corresponding VME.
  • the titer was determined as the reciprocal of the maximum dilution that doubles the optical density value of the preimmune serum.
  • FIG. 14 Graphic representation of the antibody titers against recombinant TbpB (A) and recombinant P6 (B), obtained by evaluating the antisera produced by immunizing with: TbpB, TbpB-VME of the CU385 strain (TbpB-V), VME of the strain CU385 (V), TbpB-VME of strain CU385 formulated together with pELIP ⁇ (TbpB-V, pELIP6) and TbpB-VME of strain CU385 formulated together with pELl (TbpB-V, pELI).
  • the titer was determined as the reciprocal of the maximum dilution that doubles the optical density value of the preimmune serum.
  • Example 1 Influence of the vesicular structure of the Neisser ⁇ a meningitidis proteoliposome, administered by the intranasal route, on its immunogenicity and protective capacity.
  • Example 2 Obtaining the recombinant protein PorA and inserting it into the Neisser ⁇ a meningitidis proteoliposome keeping the vesicular structure intact.
  • a recombinant PorA protein was obtained that contains epitopes belonging to the subtypes Pl.7,16 and P1.9, in the same polypeptide.
  • the E. coli clone expressing the gene coding for said recombinant protein was grown in LBA liquid medium for 8 hours at 37 ° C, in the presence of kanamycin. After centrifugation, the cell pellet was subjected to ultrasonic disruption, and the insoluble fraction containing the recombinant protein was subjected to the following manipulations:
  • the protein was purified by chromatographic methods. After extraction of the recombinant protein at 10 mg / ml, it is diluted in TE buffer to bring the Urea to 4M and it is subjected to an ion exchange gel filtration process in Q-Sepharose. The purity of the resulting protein is shown in Figure 2.
  • variants V and VI the recombinant protein was renatured by dilution in solution B, then mixed with PME and centrifuged at 125 OOOg.
  • the incorporation of the recombinant protein in the vesicles was initially evidenced by electrophoretic analysis of the studied variants.
  • the presence of a protein band with the same size as the recombinant protein in some of the variants was evidence of the incorporation obtained. This was corroborated in the immunoidentification of the band with the anti-P1.16 monoclonal antibody, a signal that is indicated by the upper arrow in Figure 3B.
  • Table 3 shows the incorporation percentage determined by a capture ELISA using the anti-P1.9 monoclonal antibody and the peroxidase-conjugated anti-P64k anti-terminal antibody. This segment of the N. meningitidis P64k protein appears expressed at the N-terminus of the recombinant protein P1.7,16,9, as a stabilizer segment, which in turn allows it to be used for immunodetection. Table No. 3 Percentage of incorporation obtained for the studied variants
  • Example 3 Evaluation of the immune response obtained against the recombinant protein PorA inserted in the proteoliposome of Neisser ⁇ a meningitidis.
  • the recombinant proteins P1.9, P1.16 and P1.7.16 were inserted into the proteoliposome. Said preparations were used as a control in an immunization scheme with the objective of evaluating the immune response generated against the P1.7,16,9 protein.
  • These antigens were cloned and expressed in E. coli, from the genome of N. meningitidis strains, which express epitopes corresponding to said subtypes, given the variability presented by the PorA or P1 protein, as it is known interchangeably.
  • Proteins were renatured by dilution in 1M Tris-HCI with 2mM EDTA, 1.2% Sodium Deoxycholate and 20% sucrose, and incubated with the outer membrane protein preparation 1.5 h at room temperature before centrifugation. This was the method selected hereafter for the incorporation of protein antigens in the outer membrane of gram negative bacteria.
  • immunoidentification experiments were performed by Western blotting, with monoclonal antibodies specific for those subtypes.
  • Figure 5 shows the result of immunoidentification performed with monoclonal antibody 1-33. that recognizes P1.9, which evidenced the incorporation of the recombinant proteins P1.9 and P1.7,16,9.
  • the antibody titer (IgG) against the recombinant protein P1.7,16,9 was determined by ELISA in the sera.
  • the recognition of the corresponding antigens present in PME preparations of N. meningitidis strains expressing the aforementioned P1 subtypes was evaluated by the antisera resulting from the described immunization scheme.
  • FIG. 6 graphically represents the results of the immunization scheme, in terms of antibody levels against the recombinant protein P1.7,16,9. This test was performed using a mixture of the individual sera per group. As observed, immunization with each of the four recombinant proteins incorporated into the proteoliposomes induced antibodies against the protein. chimeric, which includes all the subtypes of P1 under study. The highest levels of antibodies against this protein were induced after immunization with the antigen itself.
  • the bactericidal antibody titers obtained against strains expressing P1.9, P1.16, P1.7, and P1.7,16, respectively, are shown in Figure 8. As can be seen, the antibodies obtained by immunizing with P1.7,16,9 renatured in the proteoliposome of the CU385 strain, had bactericidal activity against all the heterologous strains that contained the subtypes included therein.
  • Example 4 Insertion of the TbpB protein in the proteoliposome. Obtaining and evaluating a PorA-TbpB-VME complex by co-renaturation, and evaluating the immune response against it.
  • the TbpB protein is a human transferrin receptor protein that is expressed by N. meningitidis and constitutes an antigen of vaccine interest.
  • the antigenic features of the TbpB protein cause the N. meningitidis strains to be classified into two main families: isotype I and isotype II, which differ according to the molecular mass of said protein.
  • the TbpB protein corresponding to strain B16B6 was cloned and expressed in E. coli. From the biomass obtained, the recombinant protein was purified to homogeneity using widely described chromatographic procedures. In order to achieve the renaturation of this recombinant TbpB, belonging to isotype I, a proteoliposome obtained from strain CU385 was used, which expresses a TbpB that belongs to the other isotype, so that both TbpB are antigenically differentiated.
  • TbpB protein For the renaturation of the recombinant TbpB protein, it was incubated with the proteoliposome for 4h at 37 ° C, or incubated for 4h with recombinant PorA (P1.16) and the proteoliposome at 37 ° C and in a third variant it was incubated by 1h at 4 ° C with the P1.16 and proteoliposome mixture, previously incubated for 4h at 37 ° C. In all the variants the preparations were finally centrifuged at 125 OOOg. For the evaluation of the immune response, 50 female Balb / C mice from 8 to 10 weeks old, divided into 5 groups (of 10 animals each), were immunized with the immunogens described in Table 5. Table No. 5 Composition of the immunogen by group
  • Figure 9 represents the results of the evaluation of the generated antibody titers.
  • the determination of said titers was carried out by ELISA, using the recombinant protein and the VME of the B16B6 strain, from which the TbpB cloning was performed, as the covering antigen.
  • TbpB renatured with the Neisser ⁇ a outer membrane preparation, is not exposed to incubation at 37 ° C, the antibodies obtained recognize the protein presented in the VME of the bacterium ( Figure 9B).
  • Antibodies against the TbpB protein have the ability to block the binding between transferrin and TbpB present in meningococcal membranes.
  • Example 5 Evaluation of the immune response obtained against a synthetic peptide inserted into the Neisser ⁇ a meningitidis proteoliposome.
  • Example 6 Evaluation of the immune response obtained against the recombinant protein PorA inserted in proteoliposomes of Neisser ⁇ a lactamica and Bramhamella catarrhalis
  • VME preparations were obtained that were used to renaturate the recombinant PorA protein of subtype P1.16, following the procedures described above.
  • the antibody titer (IgG) against the recombinant protein P1.16 and against the parental porin present in PME of meningococci was determined by ELISA.
  • a simple classification analysis of variance was used.
  • the Newman-Keuls multiple comparison test was performed in comparing the means of the treatments in the necessary combinations.
  • Figure 13 graphically represents the results of the immunization scheme, in terms of levels of antibodies against the P1.16 protein present in meningococcal VME.
  • the alumina-adjuvant recombinant protein was unable to induce antibodies that recognized native 16-subtype porin.
  • Example 7 Evaluation of the immune response induced by a formulation composed of recombinant TbpB, incorporated into the CU385 proteoliposome, and a vector for immunization with DNA.
  • a plasmid was constructed that carries the gene that encodes the P6 protein of
  • Haemophilus influenzae which was named pELIP6 and was used in DNA immunization experiments.
  • the material necessary to include said plasmid was purified in formulations containing the recombinant TbpB protein (B16B6) inserted into the proteoliposome of the N. meningitidis CU385 strain.
  • the vector pELl was obtained, similar to the plasmid pELIP ⁇ but lacking the coding segment for P6.
  • 40 female Balb / C mice, 8-10 weeks old were used, which were divided into five groups (of 8 animals each), as shown in Table 8.
  • Sera extracted at the end of the scheme the antibody titer against the recombinant TbpB protein was determined. Sera were also titrated to quantify the levels of antibodies against the P6 protein. Said recombinant antigen was previously purified from a genetically modified E coli strain.
  • Figure 14 graphically represents the results of the immunization scheme, in terms of levels of antibodies against the recombinant TbpB protein and recombinant P6, respectively.
  • the highest antibody titers against the recombinant TbpB protein were induced in the variants in which the protein was incorporated into the proteoliposome of a heterologous strain.
  • the presence of plasmid pELIP ⁇ in the formulation did not affect the immunogenicity of the recombinant TbpB protein.
  • the plasmid coding for P6 produced an antibody response at the expected level, after immunization with it in the presence of the TbpB-VME complex. This response was higher (with statistical significance) than that achieved by the group that had a similar formulation, but that contained the vector pELl.

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Abstract

Método para la incorporación de antígenos proteicos naturales, recombinantes o sintéticos en un preparado de vesículas de membrana externa de bacterias Gram negativas, sin producir ruptura de la estructura vesicular, manteniendo la inmunogenicidad y la capacidad inmunoestimuladora de las mismas, con la ventaja de que se genera contra el antígeno incorporado una respuesta inmune superior a la generada contra el antígeno administrado solo. Las composiciones vacunales resultantes son útiles para elevar el espectro protector de vacunas ya existentes y permiten extenderlo contra diferentes patógenos en enfermedades bacterianas, virales, cancerosas, o de otro origen. Las composiciones referidas son aplicables en la industria farmacéutica como vacunas para uso profiláctico y terapéutico en humano.

Description

MEMORIA DESCRIPTIVA
MÉTODO PARA LA INCORPORACIÓN DE ANTÍGENOS EN VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA DE BACTERIAS Y FORMULACIONES RESULTANTES.
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con el campo de la medicina, particularmente con el desarrollo de composiciones vacunales, de aplicación preventiva o terapéutica, que permiten un aumento en la calidad de la respuesta inmune contra antígenos vacunales en enfermedades de origen diverso.
Estado de la técnica anterior
La tecnología del ADN recombinante ha traído grandes avances al campo de la investigación y el desarrollo de vacunas, al hacer posible la obtención de suficientes cantidades de un gran grupo de antígenos de interés vacunal, lo que facilita la evaluación de su inmunogenicidad y su carácter protector. Sin embargo, en muchos casos estas proteínas se obtienen formando partes de cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión bacterianos son agregados de proteínas, mal renaturalizadas, que a menudo se forman en las bacterias recombinantes tras la sobrexpresión de los genes clonados. En biotecnología, la formación de los cuerpos de inclusión representa un obstáculo importante para la producción de proteínas, ya que aún cuando favorecen los altos rendimientos, el recobrado in vitro de la proteína funcional de los depósitos insolubles depende de procedimientos de renaturalización técnicamente diversos y frecuentemente complejos (Garrió M.M., Villaverde A. (2002) Construction and deconstruction of bacterial inclusión bodies. J Biotechnol. 96:3-12).
Renaturalización de proteínas
Dentro de la última década se han desarrollado métodos y estrategias específicas para preparar proteínas recombinantes activas a partir de estos cuerpos de inclusión. Generalmente, los cuerpos de inclusión pueden separarse fácilmente, solubilizarse con agentes desnaturalizantes, tales como cloruro de guanidio o urea, y entonces renaturalizarse a través de un proceso tal como la dilución o la diálisis. Avances recientes en los procesos de renaturalización incluyen la inhibición de la agregación mediante la aplicación de aditivos de bajo peso molecular y renaturalización en matrices (Misawa S. and Kumagai I. (1999) Refolding of therapeutic proteins produced in Escherichia coli as inclusión bodies. Biopolymers 51:297-307). Para purificar y renaturalizar la porina de membrana externa mitocondrial, canal aniónico dependiente de voltaje, en un solo paso se empleó la cromatografía de afinidad por iones metálicos, mediante un procedimiento en el que se extrae la proteína y la fracción soluble se aplica a la columna, en la cual se lavan los contaminantes en presencia de n-octilo-beta-D-glucopiranósido (OG) y glicerol y se eluye la fracción que contiene la proteína de interés en presencia de OG e imidazol (Shi Y., et al. (2003) One-step on-column affinity refolding purification and functional analysis of recombinant human VDAC1. Biochem Biophys Res Común. 303:475-82). En otro caso, se logró renaturalizar la proteína P2 de Haemophilus influenzae, que es una de las proteínas inmunogénicas mayoritarias de la membrana externa, en una solución que incluía altas concentraciones salinas e iones de calcio (Pullen J.K., et al. (1995) Production of Haemophilus influenzae type-b porin in Escherichia coli and its folding into the trimeric form. Gene 152:85-8).
La proteína porina de Rhodabacter capsulatus, obtenida de forma natural, se modificó químicamente con metoxipolietilenglicol-succinimidil carbonato, para rendir un conjugado soluble en agua de la misma. La renaturalización del conjugado se estudió mediante la adición secuencia! de trifluoroetanol para bajar la constante dieléctrica, lo que no se logró. Se renaturalizó la proteína finalmente por adición de hexafluoro-2-propanol entre 5 y 10% (Wei J., Fasman G.D. (1995) A poly(ethylene glycol) water-soluble conjúgate of porin: refolding to the native state. Biochemistry 34:6408-15).
Dos tipos de PorA, P1.6 y P1.7,16 del meningococo, se plegaron in vitro tras la sobrexpresión y el aislamiento partiendo de E. coli. Dichas porinas se plegaron eficientemente mediante dilución rápida en una solución tamponeada apropiada conteniendo el detergente n-dodecilo-N,N-dimetilo-1-amonio-3-propanosulfonato (Jansen O, et al. (2000) Biochemical and biophysical characterization of in vitro folded outer membrane porin PorA of Neisseria meningitidis. Biochim Biophys 1464:284-98).
La inclusión en membranas formadas por bicapas lipídicas es una estrategia empleada en la renaturalización de proteínas porinas y otras proteínas integrales de membrana, obtenidas por medio de la ingeniería genética. La principal proteína de membrana externa de Chlamydia psittaci y Chlamydia pneumoniae, se solubilizó a partir de cuerpos de inclusión usando 2% de OG y 1 mM de ditiotreitol, antes de incorporarla a una bicapa lipídica (Wyllie S., et al. (1999) Single channel analysis of recombinant major outer membrane protein porins from Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae. FEBS Lett 445: 192-96).
Las proteínas de la membrana externa de Escherichia coli OmpF y OmpA se renaturalizaron por dilución en una dispersión de vesículas lipídicas o vesículas detergente/lípido (Surrey T., et al. (1996). Folding and membrane insertion of the trimeric beta-barrel protein OmpF. Biochemistry 35: 2283-88).
El gen Opc del meningococo se clonó y expresó a altos niveles en E coli. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad, se incorporó a liposomas y micelas del detergente Zwittergent. Para aumentar la respuesta inmune contra dicha proteína, se adicionó Mono Fosforil Lípido A (MFLA) a los liposomas y a las micelas, aumentando la magnitud de la respuesta y el rango de subclases de anticuerpos generados. La respuesta funcional más efectiva contra este antígeno se obtuvo en el caso de que la proteína se incorporó a liposomas con MFLA (Kolley K.A., et al. (2001) Immunization with Recombinant Opc Outer Membrane Protein from Neissería meningitidis: Influence of Sequence Variation and Levéis of Expression on the Bactericidal Immune Response against Meningococci. Infecí Immun. 69:3809-16). Las proteínas porinas PorA y PorB de N. meningitidis, obtenidas en dos hospederos recombinantes, se han renaturalizado empleando este mismo enfoque, consistente en la incorporación a liposomas formados por fosfolípidos y colesterol, en presencia o no de detergentes. El gen porA de N. meningitidis se clonó y expresó en E. coli. La proteína purificada por afinidad se adyuvó con el adyuvante AI(OH)3, o se presentó en liposomas. La inmunización de la proteína recombinante en liposomas indujo anticuerpos con gran avidez por la proteína nativa, que reaccionaron con el meningococo intacto e inhibieron la unión de anticuerpos protectores (Christodoulides M., et al. (1998) Immunization with recombinant class 1 outer-membrane protein from Neisseria meningltidis: influence of liposomes and adjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the ¡nduction of a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology 144:3027-37). El gen porB de una cepa de N. meningitidis que expresa la proteína PorB3 se clonó e insertó en el vector pRSETB y la proteína se expresó a altos niveles en el hospedero E. coli. La proteína recombinante se purificó hasta homogeneidad mediante cromatografía de afinidad y se usó para la inmunización después de la incorporación a liposomas y a micelas del detergente Zwittergent o la sulfobetaina. El suero producido por los liposomas y las micelas mostró mayor reactividad con la proteína nativa (Wright J.C., et al (2002). Immunization with the Recombinant PorB Outer Membrane Protein Induces a Bactericidal Immune Response against Neisseria meningitidis. Infecí Immun. 70:4028-34).
Neisseria meningitidis, vesículas y proteínas de membrana externa Neisseria meningitidis, un diplococo Gram negativo cuyo único hospedero es el hombre, es el agente causal de la meningitis meningocóccica. Usualmente esta bacteria se encuentra en estado de portador asintomático en la población, siendo esta la vía más común para su aislamiento microbiológico. Diversas estrategias se han desarrollado con el objetivo de obtener un preparado vacunal que satisfaga los requisitos necesarios para proteger a la población contra esta enfermedad. Para ello se han tenido en cuenta los antígenos capsulares cuya especificidad inmunológica ha permitido la clasificación de este microorganismo en serogrupos. El serogrupo B, a diferencia del resto, continúa siendo una importante causa de enfermedad meningocóccica endémica y epidémica, en gran parte debido a la no existencia de vacunas efectivas contra el mismo. Producto de la baja inmunogenicidad del polisacárido del serogrupo B (Finne J., et al. (1987) An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tissues. J. Immunol. 138:4402-07), el desarrollo de vacunas contra este serogrupo se ha concentrado en el uso de antígenos subcapsulares.
En la década de los años 70 la producción de vacunas de proteínas de membrana externa (PME), estuvo basada en la eliminación del lipopolisacárido (LPS) de las preparaciones proteicas mediante la utilización de detergentes (Frasch C.E., Robbins J.D. (1978) Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J. Exp. Med. 147(3):629-44). Después, las PME fueron precipitadas para producir agregados resuspendidos en cloruro de sodio. A pesar de los buenos resultados obtenidos en estudios realizados en animales, estas vacunas no indujeron anticuerpos bactericidas ni en adultos ni en niños (Zollinger W.D., et al. (1978) Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animáis and humans. J. Infecí Dis. 137(6):728-39), resultado que fue atribuido a la desnaturalización de las proteínas presentes en la preparación como resultado de la precipitación. Los siguientes pasos en la búsqueda de un nuevo candidato, se encaminaron al diseño de una vacuna que presentara las proteínas en su conformación nativa, formando vesículas de membrana externa (VME) (Zollinger W.D., et al. (1979) Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48; Wang L.Y. and Frasch CE. (1984) Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infecí Immun. 46(2):408-14).
Las vacunas compuestas por VME fueron significativamente más inmunogénicas por vía parenteral que los agregados de PME y esta inmunogenicidad fue explicada inicialmente por una mayor adsorción al adyuvante hidróxido de aluminio (Wang L.Y. and Frasch CE. (1984) Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infecí Immun. 46(2):408-14). Posteriormente, la efectividad de las vacunas de VME se ha atribuido a la presentación de las PME, dispuestas en su conformación natural, para permitir la generación de anticuerpos bactericidas, al menos en adolescentes y adultos. Las respuestas de anticuerpos generadas, incrementaron la opsonofagocitosis del meningococo. La formulación precisa de las vacunas (por ejemplo: contenido de PME, contenido de LPS y la presencia o ausencia del adyuvante) tiene un significativo impacto en la inmunogenicidad existiendo grandes diferencias de un productor a otro según la cepa y/o la metodología empleada (Lehmann A.K., et al. (1991) Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS 99(8):769-72; Gómez J.A., et al. (1998) Effect of adjuvants in the ¡sotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrin-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccine 16(17):1633-39; Steeghs L, et al. (1999) Immunogenicity of outer membrane proteins in a lipopolysaccharide-deficient mutant of Neisseria meningitidis: influence of adjuvants on the immune response. Infecí Immun. 67(10):4988-93). Dentro de las proteínas más estudiadas del meningococo están las porinas. La porina PorA, de aproximadamente 42 kDa, ha mostrado por análisis de secuencia que su variabilidad está concentrada exclusivamente en dos de los 8 lazos expuestos de la proteína (VR1 y VR2). La variación de estas regiones ha sido usada en el subtipaje de las cepas del meningococo (Abdillahi H. and Poolman J.T. (1988) Neisseria meningitidis group B serosubtyping using monoclonal antibodies in whole- cell ELISA. Microb. Pathog. 4:27-32). Con la construcción de péptidos sintéticos y el uso de anticuerpos monoclonales se ha logrado comprobar que los epítopos inmunodominantes están siempre localizados en estas regiones (McGuinness B., Lambden P.R. and Heckels J.E. (1993) Class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitidis: epitope analysis of the antigenic diversity between strains, implications for subtype definition and molecular epidemiology. Mol. Microbiol. 7:505-514).
Aunque estos epítopos son lineales, cuando estas proteínas son clonadas y expresadas en E. coli (Niebla O. (2001) Immunogenicity of recombinant class 1 protein from Neisseria meningitidis refolded into phospholipid vesicles and detergent. Vaccine 19:3568-74) u otra cepa heteróloga, como Bacillus subtilis (Nurminen M., et al. (1992) The class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitidis produced in Bacillus subtilis can give rise to protective immunity. Mol. Microbiol. 6:2499-2506), el proceso de renaturalización de las mismas juega un papel definitorio en la respuesta, ya que la capacidad de inducir anticuerpos con actividad bactericida y protectora contra los epítopos inmunodominantes puede ser anulada si el antígeno no es presentado satisfactoriamente al sistema inmune. Por lo tanto, esto último explica en parte la necesidad de que se alcance una adecuada renaturalización de determinados antígenos, lo cual constituye un importante problema al cual se le busca solución.
Explicación de la Invención
La presente invención resuelve el problema antes mencionado, proporcionando un método para incorporar antígenos en proteoliposomas, donde dichos antígenos forman un complejo con una preparación de proteínas de membrana externa de bacterias Gram negativas, siendo este complejo generado por co-renaturalización y mantiene intacta la estructura vesicular del proteoliposoma.
En una realización preferida, el método incluye una preparación de proteínas de membrana externa de bacterias Gram negativas, obtenida a partir de especies de la familia Neisseriaceae o de Bramhamella catarrhalis, siendo especialmente preferidas las que incluyen Neissería meningitidis y Neisseria lactamica. En otra materialización de la invención, el antígeno proteico que forma parte del complejo es de origen natural, recombinante o sintético.
Igualmente la invención se refiere a la combinación vacunal derivada a partir del método descrito anteriormente y que comprende un complejo formado por una preparación de proteínas de membrana externa de bacterias Gram negativas, elaborada a partir de especies de la familia Neisseriaceae o de Bramhamella catarrhalis, y un antígeno proteico de origen natural, recombinante o sintético, donde este complejo es generado por co-renaturalización y mantiene intacta la estructura vesicular del proteoliposoma. Dependiendo de las circunstancias, las composiciones vacunales pueden administrarse por vía parenteral o mucosal.
Un aspecto particularmente importante de la invención relaciona la adición a las composiciones vacunales antes mencionadas de polisacáridos bacterianos, de polisacáridos bacterianos conjugados y de ácidos nucleicos como antígenos. También es parte de la presente invención el uso profiláctico o terapéutico de las combinaciones anteriormente descritas en humanos.
En estas composiciones, los antígenos proteicos se renaturalizan mediante la inserción en vesículas proteoiiposomales, para lograr el correcto plegamiento de los mismos. Dichas composiciones tienen nuevas propiedades que resultan de la generación del complejo, que se origina de forma tal que se mantiene intacta la estructura vesicular.
La administración mucosal de dichas composiciones puede generar una respuesta inmune sistémica de similar intensidad y superior calidad a la que se obtiene con formulaciones vacunales convencionales que usan alúmina como adyuvante. Además, la inmunización por esta ruta es capaz de generar una potente respuesta a nivel de mucosas, caracterizada por altos niveles de anticuerpos de tipo IgA.
La incorporación de PorA recombinante al proteoliposoma del meningococo, aumenta el espectro protector de las preparaciones de vesículas de membrana externa, a la vez que facilita el proceso de renaturalización de dicho antígeno recombinante, permitiendo la generación de anticuerpos subtipo específicos capaces de producir la lisis mediada por complemento, lo que conlleva a la destrucción de la bacteria.
La presente invención, en contraste al estado de la técnica anterior, es útil para alcanzar la adecuada renaturalización de antígenos de carácter proteico sin que tengan que ser incluidos en bicapas lipídicas artificiales, modificados químicamente o mezclados con compuestos químicos de origen inorgánico. Mediante dicha invención se obtiene una respuesta inmune funcional más efectiva, en términos de calidad de los anticuerpos que se generan contra el antígeno de interés, debido a la óptima presentación del mismo al sistema inmune.
Breve descripción de los dibujos
En parte, los resultados se muestran gráficamente en las siguientes figuras: Figura 1: Protección pasiva contra la infección meningocóccica, determinada en el modelo de ratas infantes. Las ratas recibieron los antisueros obtenidos al inmunizar ratones con: 1. proteoliposoma con estructura vesicular, 2. proteoliposoma con estructura no vesicular. Como Control negativo (C-) se empleó suero de ratones no inmunizados y como Control positivo (C+) un suero hiperinmune de ratón inmunizado con PME por ruta intraperitoneal.
Figura 2: Purificación de PorA recombinante. A: Electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%. Línea 1: patrón de peso molecular de proteína. Línea 2: Muestra inicial de la purificación, fracción después de ruptura por ultrasonido. Línea 3: Muestra final, fracción eluída de intercambio iónico. B: Cromatograma de la densitometría de la fracción cromatográfica de intercambio iónico.
Figura 3: Análisis electroforético de las variantes de incorporación. A. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%. Línea 1 : Patrón de peso molecular. Línea 2: Proteína recombinante. Línea 3,4,5,6,7: variantes de incorporación. Línea 8: VME. B: Inmunoidentificación por Western blot de la proteína incorporada, realizada con el anticuerpo monoclonal anti P1.16. Línea 1: Patrón de peso molecular. Línea 2: VME. Línea 3,4,5,6,7: variantes de incorporación. Línea 8: proteína recombinante.
Figura 4. Fotos de Microscopía electrónica evidenciando la inserción de la proteína recombinante PorA 7,16,9. A: Vesículas de membrana externa evidenciadas por tinción negativa y microscopía electrónica, Cepa CU385. B: Vesículas de membrana externa marcadas inmunológicamente utilizando un anticuerpo monoclonal anti PorA (Subtipo 15). C: Vesículas de membrana externa marcadas inmunológicamente utilizando un monoclonal anti PorA subtipo 16. Figura 5. Western blot para verificar incorporación de la proteína recombinante bajo diferentes condiciones. A: proteína recombinante P1. 7,16,9 detectada con Mab 1- 33, anti-P1.9. B: P1 natural presente en la vesícula. Línea 1: Proteoliposoma natural. Línea 2: Proteína recombinante purificada. Línea 3,4,5,6: variantes de incorporación.
Figura 6. Representación gráfica de los títulos de anticuerpos IgG contra la proteína recombinante P1.7,16,9, alcanzados por los diferentes grupos de animales inmunizados. 1: Con P1.9 recombinante, 2: P1.16 recombinante, 3: Pl.7,16 recombinante, 4: P1.7,16,9 recombinante. El título fue determinado como el recíproco de la máxima dilución que triplica el valor de D.O del suero preinmune.
Figura 7. Representación gráfica de los títulos individuales de anticuerpos IgG contra las porinas de Neisseria inducidos cuando se inmunizó con la proteína recombinante P1.7,16,9. El título fue determinado como el recíproco de la máxima dilución que triplica el valor de D.O del suero preinmune.
Figura 8. Representación gráfica de los títulos de anticuerpos bactericida al evaluar el suero obtenido inmunizando con la proteína recombinante P1.7,16,9, contra cepas de Neisseria de los subtipos 7, 16, y 9. El título fue determinado como el recíproco de la máxima dilución del suero donde se obtiene más del 50% de muerte.
Figura 9. Representación gráfica de los títulos de anticuerpos contra la proteína TbpB recombinante en las diferentes variantes de renaturalización estudiadas. A- Evaluación contra la proteína recombinante. B- Evaluación contra la proteína natural en las membranas de la cepa B16B6. El título fue determinado como el recíproco de la máxima dilución que duplica el valor de D.O del suero preinmune.
Figura 10. Resultados del ensayo de inhibición de la unión a transferrina en presencia de los anticuerpos séricos para las variantes estudiadas. El título fue determinado como el recíproco de la máxima dilución del suero donde se alcanza más del 40% de inhibición. Figura 11. Representación gráfica de los títulos de anticuerpos al evaluar el suero obtenido inmunizando con las diferentes variantes, contra las cepas de Neisseria de subtipo P1.16. El título fue determinado como el recíproco de la máxima dilución que duplica el valor de D.O del suero preinmune.
Figura 12. Niveles de anticuerpos anti-péptido VR2 inducidos mediante la inmunización con MAP de la VR2 de la proteína PorA del meningococo. Como antígeno de recubrimiento se empleó un conjugado químico del péptido que cubre dicha región y seroalbúmina bovina.
Figura 13. Representación gráfica de los títulos de anticuerpos contra VME de una cepa de Neissería de subtipo P1.16, obtenidos al evaluar los antisueros producidos inmunizando con P1.16 recombinante, con la misma proteína incorporada en VME de Neisseria lactamica o Bramhamella catarrhalis, o con las VME correspondientes. El título fue determinado como el recíproco de la máxima dilución que duplica el valor de densidad óptica del suero preinmune.
Figura 14. Representación gráfica de los títulos de anticuerpos contra TbpB recombinante (A) y P6 recombinante (B), obtenidos al evaluar los antisueros producidos inmunizando con: TbpB, TbpB-VME de la cepa CU385 (TbpB-V), VME de la cepa CU385 (V), TbpB-VME de la cepa CU385 formulado junto a pELIPδ (TbpB-V,pELIP6) y TbpB-VME de la cepa CU385 formulado junto a pELl (TbpB- V,pELI). El título fue determinado como el recíproco de la máxima dilución que duplica el valor de densidad óptica del suero preinmune.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos La presente invención será descrita más completamente mediante los ejemplos siguientes, los cuales son ilustrativos y no limitan el alcance de la invención. Ejemplo 1: Influencia de la estructura vesicular del proteoliposoma de Neissería meningitidis, administrado por ruta intranasal, en su inmunogenicidad y capacidad protectora.
Se realizó un estudio comparativo de la inmunogenicidad del proteoliposoma con estructura vesicular (PV) y no vesicular (PNV), mediante el siguiente experimento. Se analizaron 2 grupos, de 10 ratones cada uno, inmunizados por vía intranasal. Los animales recibieron 3 dosis separadas por 7 días, con 50μg de proteoliposoma en la estructura que se indica, según el grupo. El volumen fue de 50μl por animal. La composición de los grupos se muestra en la Tabla 1. Tabla 1. Composición del inmunógeno empleado por grupo
Figure imgf000013_0001
Los niveles de IgG específicos contra las PME de la cepa CU385 de N. meningitidis, después de segunda y tercera dosis, se determinaron por ELISA. Los resultados obtenidos se exponen en la Tabla 2. Los títulos de anticuerpos se determinaron como el recíproco de la dilución del suero que triplica el valor del suero preinmune. El análisis estadístico de los resultados se realizó a través de una prueba t de Student.
Tabla 2. Resultados obtenidos al evaluar los sueros policlonales por ELISA y ensayo bactericida.
Figure imgf000013_0002
Después de la tercera dosis existe una diferencia significativa entre los niveles de anticuerpos del grupo inmunizado con proteoliposoma que presenta estructura vesicular, respecto al grupo que no la presenta, por lo que se evidencia la ventaja del mantenimiento de la estructura vesicular en la respuesta de anticuerpos generada después de la inmunización por vía intranasal. Además los resultados se reafirman a través de la determinación del título de anticuerpos bactericidas, también presentados en la Tabla 2 y el experimento de protección pasiva en el modelo de infección meningocóccica en ratas infantes (Figura 1). El título bactericida se determinó como el recíproco de la máxima dilución del suero donde se obtiene más del 50% de muerte del inoculo bacteriano. En ambos ensayos se demuestra que la actividad funcional de los antisueros obtenidos contra el proteoliposoma presentado en su estructura vesicular es superior a la actividad funcional de los antisueros contra el proteoliposoma no vesicular.
Ejemplo 2: Obtención de la proteína recombinante PorA e inserción de la misma en el proteoliposoma de Neissería meningitidis manteniendo intacta la estructura vesicular.
Obtención de la proteína recombinante PorA 7, 16,9
Mediante ingeniería genética se obtuvo una proteína PorA recombinante que contiene epitopos pertenecientes a los subtipos Pl.7,16 y P1.9, en un mismo polipéptido. El clon de E. coli que expresa el gen codificante para dicha proteína recombinante se creció en medio líquido LBA durante 8 horas a 37°C, en presencia de kanamicina. Después de la centrifugación, el precipitado celular fue sujeto a disrupción ultrasónica, y la fracción insoluble conteniendo la proteína recombinante se sometió a las siguientes manipulaciones:
-Lavados del sedimento con el tampón Tris-EDTA, pH 8,0 (TE), y después al mismo tampón se le adiciona: NaCI 0.1M, MgCI 0.8M, 0.5% NP40.
-Solubilización de la proteína recombinante con una solución que contiene Urea 8M disuelta en el tampón carbonato-bicarbonato pH 10,0 a una concentración final de 10 mg/ml.
Finalmente se procedió a la purificación de la proteína por métodos cromatográficos. Después de la extracción de la proteína recombinante a 10 mg/ml, esta se diluye en tampón TE para llevar la Urea a 4M y se somete a un proceso de filtración en gel de intercambio iónico en Q-Sepharosa. La pureza de la proteína resultante se muestra en la Figura 2.
Inserción de la proteína recombinante PorA 7, 16,9 en el proteoliposoma Con el objetivo de encontrar las condiciones de inserción/renaturalización de la proteína en el proteoliposoma se ensayaron 6 variantes diferentes. En la variante II la incorporación de la proteína se realizó mediante la mezcla con el preparado de proteínas de membrana externa 1:1 en Tris-HCI 1M con 2mM de EDTA, 1.2% de Desoxicolato de sodio y 20% de sacarosa (solución B), y posteriormente la mezcla es centrifugada. La variante III mantuvo las mismas condiciones que la variante II, pero con una relación proteína recombinante-PME 2:1. En la variante IV la proteína fue incubada después de la mezcla 1,5 h a temperatura ambiente antes de centrifugar. En las variantes V y VI la proteína recombinante fue renaturalizada por dilución en la solución B, luego se mezcla con las PME y se centrifuga a 125 OOOg. La incorporación de la proteína recombinante en las vesículas fue evidenciada inicialmente por análisis electroforético de las variantes estudiadas. La presencia de una banda de proteína con la misma talla que la proteína recombinante en algunas de las variantes constituyó una evidencia de la incorporación obtenida. Esto se corroboró en la inmunoidentificación de la banda con el anticuerpo monoclonal anti- P1.16, señal que aparece indicada con la flecha superior en la Figura 3B. En la Tabla 3 se muestra el porciento de incorporación determinado por un ELISA de captura empleando el anticuerpo monoclonal anti-P1.9 y el anticuerpo anti N- terminal de la P64k conjugado a peroxidasa. Este segmento de la proteína P64k de N. meningitidis aparece expresado en el extremo N-terminal de la proteína recombinante P1.7,16,9, como segmento estabilizador, lo que permite emplearlo a su vez en la inmunodetección. Tabla No. 3 Porciento de incorporación obtenido para las variantes estudiadas
Figure imgf000015_0001
Al emplear distintos métodos para medir la incorporación de la proteína recombinante en el proteoliposoma se detectan algunas diferencias entre los procedimientos de incorporación. Estas diferencias pueden atribuirse más a la naturaleza del método de detección que a divergencias entre los procedimientos, ya que los resultados de la evaluación inmunológica así lo indican. A pesar de las diferencias observadas por electroforesis y Western blot entre los diferentes métodos de incorporación, cuando los sueros de los animales inmunizados con estas variantes fueron evaluados por ELISA esas diferencias no fueron significativas. Todas las variantes de renaturalización fueron analizadas mediante ¡nmunomicroscopía electrónica. Los resultados obtenidos con las diferentes variantes estuvieron en correspondencia con el ELISA de cuantificación. La Figura 4 A, B y C muestra los resultados para la variante IV.
Como se aprecia la presencia de la proteína recombinante se evidencia por la unión de las partículas de oro coloidal conjugado con el correspondiente anticuerpo monoclonal. En todos los casos se evidencia también el mantenimiento de la estructura vesicular a pesar de las manipulaciones realizadas.
Ejemplo 3: Evaluación de la respuesta inmune obtenida contra la proteína recombinante PorA insertada en el proteoliposoma de Neissería meningitidis.
Una vez seleccionada una variante de incorporación de la proteína recombinante P1.7,16,9, se procedió a la inserción de las proteínas recombinantes P1.9, P1.16 y P1.7.16 en el proteoliposoma. Dichas preparaciones se utilizaron como control en un esquema de inmunización con el objetivo de evaluar la respuesta inmune generada contra la proteína P1.7,16,9. Estos antígenos se clonaron y expresaron en E. coli, a partir del genoma de cepas de N. meningitidis, que expresan epitopos correspondientes a dichos subtipos, dada la variabilidad que presenta la proteína PorA o P1, como se le conoce indistintamente. Las proteínas fueron renaturalizadas mediante dilución en Tris-HCI 1M con 2mM de EDTA, 1.2% de Desoxicolato de sodio y 20% de sacarosa, e incubadas con el preparado de proteínas de membrana externa 1.5 h a temperatura ambiente antes de la centrifugación. Este fue el método seleccionado en lo adelante para la incorporación de antígenos proteicos en la membrana externa de bacterias gram negativas. Para verificar la incorporación de las proteínas recombinantes en el proteoliposoma, se realizaron experimentos de inmunoidentificación por Western blotting, con anticuerpos monoclonales específicos para esos subtipos. La Figura 5 muestra el resultado de la inmunoidentificación realizada con el anticuerpo monoclonal 1-33 que reconoce P1.9, la cual evidenció la incorporación de las proteínas recombinantes P1.9 y P1.7,16,9.
Para evaluar la inmunogenicidad de la proteína incorporada, se emplearon 40 ratones Balb/C hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en cuatro grupos de 10 animales cada uno. Se realizaron tres inmunizaciones por vía subcutánea, separadas por intervalos de una semana y las extracciones de sangre se efectuaron el mismo día y una semana después de la tercera inoculación. Las proteínas se adyuvaron con hidróxido de aluminio a una concentración de 40 μg/μg de proteína.
Tabla No. 4 Composición del inmunógeno empleado por grupo.
Figure imgf000017_0001
Después de la tercera inoculación, se determinó por ELISA el título de anticuerpos (IgG) contra la proteína recombinante P1.7,16,9, en los sueros. Así mismo, se evaluó el reconocimiento de los antígenos correspondientes presentes en preparaciones de PME de cepas de N. meningitidis que expresan los subtipos de P1 antes mencionados, por los antisueros resultantes del esquema de inmunización descrito.
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó el método no paramétrico de análisis de varianza, de clasificación simple por rangos, de Kruskal-Wallis, debido a que las varianzas entre los grupos no eran homogéneas, según la prueba de Bartlett. En la comparación de las medias de los tratamientos en las combinaciones necesarias se realizó la prueba de comparación múltiple de Dunn. La Figura 6 representa gráficamente los resultados del esquema de inmunización, en cuanto a niveles de anticuerpos contra la proteína recombinante P1.7,16,9. Este ensayo se realizó utilizando una mezcla de los sueros individuales por grupo. Como se observa, la inmunización con cada una de las cuatro proteínas recombinantes incorporadas en los proteoliposomas indujo anticuerpos contra la proteína quimérica, que incluye todos los subtipos de P1 en estudio. Los mayores niveles de anticuerpos contra dicha proteína se indujeron tras la inmunización con el propio antígeno.
Al evaluar el reconocimiento de los antígenos naturales presentes en las distintas cepas de N. meningitidis, se observó que los sueros reaccionaron con las proteínas P1 de los subtipos correspondientes. Muestra de ello son los resultados que se representan en la Figura 7. Los sueros individuales de los ratones inmunizados con proteína recombinante P1.7,16,9 (insertada en el proteoliposoma) reconocieron las VME de cepas de meningococos que expresan P1.7, P1.9, P1.16 y P1.7,16. Para determinar si estos antisueros poseían actividad funcional contra N. meningitidis se realizó un experimento de lisis mediada por complemento, conocido como ensayo bactericida. En la Figura 8 se muestran los títulos de anticuerpos bactericidas obtenidos contra cepas que expresan P1.9, P1.16, P1.7, y P1.7,16, respectivamente. Como se aprecia, los anticuerpos obtenidos inmunizando con P1.7,16,9 renaturalizada en el proteoliposoma de la cepa CU385, tuvieron actividad bactericida contra todas las cepas heterólogas que contenían los subtipos en ella incluidos.
Ejemplo 4: Inserción de la proteína TbpB en el proteoliposoma. Obtención y evaluación de un complejo PorA-TbpB-VME por co-renaturalización, y evaluación de la respuesta inmune contra el mismo.
La proteína TbpB es una proteína receptora de transferrina humana que es expresada por N. meningitidis y constituye un antígeno de interés vacunal. Los rasgos antigénicos de la proteína TbpB hacen que las cepas de N. meningitidis se clasifiquen en dos familias principales: isotipo I e isotipo II, los que se diferencian de acuerdo a la masa molecular de dicha proteína.
La proteína TbpB correspondiente a la cepa B16B6 se clonó y expresó en E. coli. A partir de la biomasa obtenida, se purificó la proteína recombinante hasta homogeneidad empleando procedimientos cromatográficos ampliamente descritos. Con el objetivo de lograr la renaturalización de esta TbpB recombinante, perteneciente al isotipo I, se empleó proteoliposoma obtenido a partir de la cepa CU385, que expresa una TbpB que pertenece al otro isotipo, por lo que ambas TbpB se diferencian antigénicamente. Para la renaturalización de la proteína TbpB recombinante, ésta se incubó con el proteoliposoma durante 4h a 37°C, o se incubó durante 4h con PorA recombinante (P1.16) y el proteoliposoma a 37°C y en una tercera variante se incubó por 1h a 4°C con la mezcla P1.16 y proteoliposoma, previamente incubados por 4h a 37°C. En todas las variantes las preparaciones fueron finalmente centrifugadas a 125 OOOg. Para la evaluación de la respuesta inmune, se inmunizaron 50 ratones Balb/C hembras de 8 a 10 semanas, divididos en 5 grupos (de 10 animales cada uno), que se inmunizaron con los inmunógenos que describe la Tabla 5. Tabla No. 5 Composición del inmunógeno por grupo
Figure imgf000019_0001
Se realizaron tres inmunizaciones por vía subcutánea, separadas por intervalos de una semana y las extracciones de sangre se efectuaron el mismo día y por último una semana después de la tercera inoculación. Las proteínas se adyuvaron con hidróxido de aluminio a una concentración de 40 μg/μg de proteína.
En la Figura 9 se representan los resultados de la evaluación de los títulos de anticuerpos generados. La determinación de dichos títulos se realizó por ELISA, utilizando como antígeno de recubrimiento la proteína recombinante y las VME de la cepa B16B6, a partir de la cual se realizó el clonaje de TbpB.
El ELISA contra la proteína recombinante evidenció la especificidad de la respuesta de anticuerpos para todas las variantes estudiadas (Figura 9A). Cuando la proteína
TbpB, renaturalizada con el preparado de membrana externa de Neissería, no es expuesta a la incubación a 37°C, los anticuerpos obtenidos reconocen a la proteína presentada en las VME de la bacteria (Figura 9B).
Los anticuerpos contra la proteína TbpB tienen la capacidad de bloquear la unión entre la transferrina y la TbpB presente en las membranas de meningococo. Los sueros obtenidos contra la proteína TbpB recombinante, insertada en el proteoliposoma de otra cepa, se estudiaron en el ensayo de inhibición de la unión a transferrina. Los resultados de dicho estudio se muestran en la Figura 10. Las diferencias significativas observadas para los títulos de anticuerpos contra la proteína TbpB natural no se reflejaron en los títulos de inhibición de la unión a transferrina, cuando la proteína era incubada con los sueros hiperinmunes de ratón. En todas las variantes en que la proteína se renaturalizó con el proteoliposoma se observó inhibición de la unión de la transferrina a la proteína receptora presente en las PME del meningococo.
La combinación de TbpB con PorA recombinante (subtipo P1.16), insertadas ambas en el proteoliposoma de una cepa heteróloga, no afectó la inmunogenicidad de PorA en el complejo PorA-TbpB-VME cuando son incubadas a 4°C (Figura 11).
Ejemplo 5: Evaluación de la respuesta inmune obtenida contra un péptido sintético insertado en el proteoliposoma de Neissería meningitidis.
Con vistas a lograr una mayor inmunogenicidad, por vía mucosal, de un péptido multiepitópico (del inglés Múltiple Antigen Peptide, MAP) que contenía la región variable 2 (VR2) (Garay, H.E et al. (2000) Disulfide bond polymerization of a cyclic peptide derived from the surface loop 4 of class 1 OMP of Neisseria meningitidis. Letí Pept. Sci. 7:97-105) de la porina PorA de N. meningitidis presente en la cepa CU385 (subtipo 15) éste se incorporó a VME de una cepa heretóloga de N. meningitidis (233) de clasificación C:2a:P1.5 (subtipo 5). Esta combinación antigénica fue administrada a cada ratón (n=8), por vía intranasal, en un esquema de tres dosis, separadas entre sí por intervalos de 14 días. Los grupos inmunizados se reflejan en la Tabla 6.
Tabla 6. Composición del inmunógeno por grupo
Figure imgf000020_0001
Quince días después de dos y tres dosis se muestrearon los animales para obtener el suero. El título de anticuerpos contra la VR2 de la porina en estudio se determinó mediante un ensayo tipo ELISA contra el péptido sintético que cubría la región VR2, conjugado a la seroalbúmina bovina. Los resultados obtenidos por ELISA, medidos en el suero colectado dos semanas después de dos dosis, se muestran en la Figura 12. Como se observa existió un mayor título de anticuerpos contra el péptido (con significación estadística) cuando el péptido se coadministró con VME. Dichas VME, por ser de una cepa heteróloga, son incapaces de inducir anticuerpos contra este péptido (grupo 3). Además, se realizaron experimentos de Inmunoblot en el que se separaron electroforéticamente 10μg de VME de la cepa CU385 por línea, que una vez transferidas a membranas de nitrocelulosa se incubaron con la mezcla de los sueros de cada grupo. En el suero obtenido dos semanas después de la tercera dosis se apreció un mayor reconocimiento de la proteína PorA (subtipo 15), por el suero del grupo 2 comparado con el grupo 1, lo cual indica que el reconocimiento de la proteína parental se favoreció al incorporar el MAP a las VME de una cepa de diferente subtipo.
Ejemplo 6: Evaluación de la respuesta inmune obtenida contra la proteína recombinante PorA insertada en proteoliposomas de Neissería lactamica y Bramhamella catarrhalis
A partir de otros microorganismos Gram negativos, Neisseria lactamlca y Bramhamella catarrhalis, se obtuvieron preparaciones de VME que se emplearon para renaturalizar la proteína PorA recombinante del subtipo P1.16, siguiendo los procedimientos antes descritos.
Para verificar la inmunogenicidad de la proteína recombinante incorporada a ambos proteoliposomas, se emplearon 50 ratones Balb/C hembra, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en cinco grupos (de 10 animales cada uno), según se muestra en la Tabla 7. Se realizaron tres inmunizaciones por vía subcutánea, separadas por intervalos de 15 días y las extracciones de sangre se efectuaron el mismo día y una semana después de la tercera inoculación. Las proteínas se adyuvaron con hidróxido de aluminio a una concentración de 40 μg/μg de proteína. Tabla 7. Composición del inmunógeno empleado por grupo.
Figure imgf000022_0001
Después de la tercera inoculación, se determinó en los sueros el título de anticuerpos (IgG) contra la proteína P1.16 recombinante y contra la porina parental presente en PME de meningococos, por ELISA. Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó un análisis de varianza de clasificación simple. En la comparación de las medias de los tratamientos en las combinaciones necesarias se realizó la prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls. La Figura 13 representa gráficamente los resultados del esquema de inmunización, en cuanto a niveles de anticuerpos contra la proteína P1.16 presente en VME de meningococos. La proteína recombinante adyuvada con alúmina no fue capaz de inducir anticuerpos que reconocieran la porina de subtipo 16 nativa. Los mayores títulos de anticuerpos contra dicha porina nativa se indujeron tras la inmunización con el antígeno incorporado en las VME de N. lactamica, seguido por el antígeno incorporado en VME de B. catarrhalis. Existieron diferencias significativas entre los títulos de anticuerpos generados tras la inmunización con la proteína recombinante incorporada y los títulos de anticuerpos inducidos por la inmunización con VME de estos dos microorganismos Gram negativos, por sí solas.
Ejemplo 7: Evaluación de la respuesta inmune inducida por una formulación compuesta por TbpB recombinante, incorporada en el proteoliposoma de CU385, y un vector para inmunización con ADN.
Se construyó un plasmidio que porta el gen que codifica para la proteína P6 de
Haemophilus influenzae, el que se denominó pELIP6 y se empleó en experimentos de inmunización con ADN. Se purificó el material necesario para incluir dicho plasmidio en formulaciones que contenían la proteína TbpB recombinante (B16B6) insertada en el proteoliposoma de la cepa de N. meningitidis CU385. Como control se obtuvo el vector pELl, similar al plasmidio pELIPδ pero que carece del segmento codificante para la P6. Para verificar la inmunogenicidad de las formulaciones se emplearon 40 ratones Balb/C hembra, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales se dividieron en cinco grupos (de 8 animales cada uno), según se muestra en la Tabla 8. Se realizaron cuatro inmunizaciones por vía subcutánea, separadas por intervalos de 21 días y las extracciones de sangre se efectuaron el día de inicio del esquema y tres semanas después de la cuarta inoculación. Las proteínas se adyuvaron con hidróxido de aluminio a una concentración de 40 μg/μg de proteína.
Tabla 8. Composición del inmunógeno empleado por grupo.
Figure imgf000023_0001
A los sueros extraídos al final del esquema, se les determinó el título de anticuerpos contra la proteína TbpB recombinante. Además se titularon los sueros para cuantificar los niveles de anticuerpos contra la proteína P6. Dicho antígeno recombinante fue purificado previamente a partir de una cepa de E coli modificada genéticamente.
Para el análisis estadístico de los resultados se utilizó un análisis de varianza de clasificación simple. En la comparación de las medias de los tratamientos en las combinaciones necesarias se realizó la prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls.
La Figura 14 representa gráficamente los resultados del esquema de inmunización, en cuanto a niveles de anticuerpos contra la proteína TbpB recombinante y P6 recombinante, respectivamente. Los mayores títulos de anticuerpos contra la proteína TbpB recombinante se indujeron en las variantes en que la proteína se incorporó al proteoliposoma de una cepa heteróloga. La presencia del plasmidio pELIPδ en la formulación no afectó la inmunogenicidad de la proteína TbpB recombinante.
Por otra parte, el plasmidio que codifica para P6 produjo una respuesta de anticuerpos al nivel esperado, tras la inmunización con el mismo en presencia del complejo TbpB-VME. Dicha respuesta fue superior (con significación estadística) a la alcanzada por el grupo que poseía una formulación similar, pero que contenía el vector pELl.

Claims

REIVINDICACIONES
MÉTODO PARA LA INCORPORACIÓN DE ANTÍGENOS EN VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA DE BACTERIAS Y FORMULACIONES RESULTANTES. 1. Método para incorporar antígenos en vesículas de membrana externa de bacterias, caracterizado porque dichos antígenos forman un complejo con una preparación de proteínas de membrana externa de bacterias Gram negativas, siendo este complejo generado por co-renaturalización y manteniendo intacta la estructura vesicular del proteoliposoma.
2. El método según la reivindicación 1, donde la preparación de proteínas de membrana externa de bacterias Gram negativas se obtiene a partir de especies de la familia Neisseriaceae o de Bramhamella catarrhalis.
3. El método según la reivindicación 2, donde la preparación de proteínas de membrana externa de bacterias es de Neisseria meningitidis y de Neisseria lactamica.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el antígeno proteico es de origen natural, recombinante o sintético.
5. Composición vacunal obtenida según el método de la reivindicación 1, para administración por vía parenteral o mucosal, caracterizada porque comprende un complejo formado por un antígeno proteico y una preparación de proteínas de membrana externa de bacterias Gram negativas, donde este complejo es generado por co-renaturalización y mantiene intacta la estructura vesicular del proteoliposoma, en combinación con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
6. Composición vacunal según la reivindicación 5, donde la preparación de proteínas de membrana externa de bacterias Gram negativas se obtiene a partir de especies de la familia Neisseriaceae o de Bramhamella catarrhalis.
7. Composición vacunal según la reivindicación 6, donde la preparación de proteínas de membrana externa de bacterias es de Neisseria meningitidis y de Neisseria lactamica.
8. Composición vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde el antígeno proteico es de origen natural, recombinante o sintético.
9. Composición vacunal de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 7, caracterizada porque comprende además polisacáridos bacterianos.
10. Composición vacunal de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 7, caracterizada porque comprende además polisacáridos bacterianos conjugados.
11. Composición vacunal de acuerdo con las reivindicaciones de la 5 a la 7, caracterizada porque comprende además ácido nucleico como antígeno.
12. Composición vacunal de acuerdo a las reivindicaciones de la 5 a la 11, para uso profiláctico o terapéutico en humano.
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