BRPI0710064A2 - composição farmacêutica contendo a proteìna nmb0938 - Google Patents

Abstract

<B>COMPOSIçãO FARMACêUTICA CONTENDO A PROTEìNA NMB0938<D>A presente invenção refere-se ao campo de medicina, particularmente ao desenvolvimento de formulação farmacêutica contendo proteína NMB0938. A Formulação descrita na presente invenção é capaz de conferir proteção contra doenças diferentes causadas ou não por agentes patogênicos. A proteína NMB0938 foi identificada como componente de vesícula da membrana externa (OMV) de Neisseria meningitidis, e ela foi obtida através de tecnologia de DNA recombinante sendo sua imunogenicidade e atividade protetora avaliadas em modelos animais. Devido ao alto nível de conservação que o gene codificando NMB0938 mostrou, composições farmacêuticas contendo esta proteína têm um alto valor como indutores de uma resposta imune reativa-cruzada. Formulação apresentada na presente invenção é aplicável ao campo de medicina humana.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO A PROTEÍNA NMB0938".

Campo da Técnica

A presente invenção refere-se ao campo de Medicina, particu-larmente ao desenvolvimento de nova formulação de vacina de aplicaçãopreventiva ou terapêutica, que permite um aumento na qualidade de respos-ta imune contra antígenos de vacina de doenças de fontes diferentes.

Estado Anterior da Técnica

Neisseria meningitidis, um diplococo Gram-negativo cujo únicohospedeiro conhecido é o homem, o agente causai de meningite meningo-cócica. Geralmente esta bactéria é encontrada em carreadores assintomáti-cos dentre a população normal, sendo este nicho a fonte mais comum paraseu isolamento microbiano.

Em uma base mundial, crianças pequenas menores de dois a-nos de idade são a população mais suscetível a contrair meningite meningo-cócica, no entanto, adultos jovens e população adulta normal podem sertambém afetados.

Doença meningocócica não-tratada tem um curso fatal para amaioria dos indivíduos afetados, e vacinação poderia prevenir esta situação,ao parar os eventos no início na fase de colonização bacteriana.

Várias estratégias foram desenvolvidas com o objetivo de obten-ção de uma vacina capaz de satisfazer às necessidades a fim de induzir pro-teção contra esta doença em população geral. Para este propósito antígenoscapsulares foram levados em consideração, uma vez que sua especificidadeimunológica permitiu a classificação em sorogrupos deste microorganismo.Cinco desses sorogrupos foram definidos como responsáveis pela maioriados casos clínicos de doença meningocócica em todo o mundo. O sorogrupoA é a principal causa de epidemias na África sub-Saariana. Os sorogrupos Be C estão associados, na maioria dos casos, com as ocorrências em naçõesdesenvolvidas. Os sorogrupos Y e W135 são comuns na maioria dos casosrecorrentes da doença, e eles são prevalentes em algumas áreas dos Esta-dos Unidos, com um aumento acentuado nos últimos anos. A partir destesdados é óbvia a razão do uso, estudo e avaliação de polissacarídeos capsu-Iares como candidatos à vacina. Uma vacina tetravalente, com base em po-lissacarídeos capsulares, conferindo proteção contra sorogrupos A, C, Y eW-135 foi licenciada nos Estados Unidos. Anticorpos elicitados após vacina-ção são específicos de sorogrupo (Rosenstein, N. e outros, 2001, Menningo-coccal disease, N. Engl. J. Med., 344, 1378-1388).

O sorogrupo B, que é diferente do resto, continua a ser umacausa significante de doença meningocócica endêmica e epidêmica, e isto éprincipalmente devido à completa falta de vacinas eficientes contra ele. Foinotado que polissacarídeo capsular B é pobremente imunogênico, mais aexistência do risco teórico para uma vacina baseada neste composto de in-duzir imunotolerância e autoimunidade por causa de sua similaridade estru-tural com cadeias de oligossacarídeo que estão presentes em estruturasfetais neurais humanas. (Finne, J. e outros, 1987, An IgG monoclonal anti-body to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulatedpolysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisues. J. Im-munol. 138:4402-4407). Deste modo, o desenvolvimento de vacinas contrasorogrupos B é concentrado no uso de antígenos subcapsulares.Proteínas de membrana externa e vacinas de vesícula

Tentativas iniciais, nos anos 70, em produzir vacinas baseadasem proteínas de membrana externa foram baseadas em depleção de LPSde preparações de proteína de membrana externa por detergente (Frasch,C.E. e Robins, J.D., 1978, Protection against group B meningococcal disea-se. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection ina guinea pig modei. J. Exp. Med., 147(3):629-44). As proteínas de membra-na externa, OMPs, foram então precipitadas para produzir agregados sus-pensos em cloreto de sódio. Apesar de resultados promissores em estudosanimais, essas vacinas falharam em induzir anticorpo bactericida em adultosou crianças (Zollinger, W.D. e outros, 1978, Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animais and humans, J. In-fect. Dis. 137{6):728-39). O desempenho pobre dessas vacinas pode seramplamente atribuído à perda de estrutura terciária que acompanhou preci-pitação. A próxima etapa lógica foi, então, produzir uma vacina com proteí-nas mostradas em sua conformação nativa na forma de vesículas de mem-brana externa (Zollinger, W.D. e outros, 1979, Complex of meningococcalgroup B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic inman. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Wang, L.Y. e Frasch, C.E. 1984. Deve-lopment of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine andevaluation in a mouse model. Infect. Immun. 46(2):408-14136).

Essas vacinas de vesícula de membrana externa eram signifi-cantemente mais imunogênicas do que os agregados de OMP e imunogeni-cidade foi mostrada ser aumentada mais através de adsorção ao hidróxidode alumínio adjuvante (Wang, L.Y. e Frasch, C.E., 1984. Neisseria meningi-tidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model.Infect. Immun. 46(2):408-14136).

Vários testes de eficácia foram realizados usando vacinas devesícula de membrana externa solúveis de formulações diferentes. As duasvacinas mais extensivamente estudadas foram desenvolvidas nos anos 80em respostas a surtos de doença em Cuba (Sierra, G.V. e outros, 1991.Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and massvaccination results in Cuba. NIPH Ann. Dis. 14(2): 195-210) e Norway (Bju-ne, G. e outros, Effect of outer membrane vesicle against group B meningo-coccal disease in Nonvay. Lancet. 338(8775): 1093-6), respectivamente. Avacina de OMV produzida pelo Finlay Institute em Cuba (comercialmentecomercializada como VA-MENGOC-BC) é produzida da linhagemB:4:P1.19,15 com polissacarídeo de sorogrupo C e uma preparação deOMPs de alto peso molecular e é adsorvida em hidróxido de alumínio (Sier-ra, G.V. e outros, 1991, Vaccine against group B Neisseria meningitidis: pro-tection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann. Dis. 14(2): 195-210). Esta vacina contribuiu para o declínio rápido da epidemia em Cuba(Rodriguez, A.P. e outros, The epidemiological impact of antimeningococcalB vaccination in Cuba. 1999. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 94(4):433-40).

A vacina produzida pelo Norwegian National Institute for PubiicHealth (NIPH) era similarmente pretendida inicialmente para uso durante umperíodo de doença hiperendêmica causada por outro organismo do cloneET-5 (B:15:P1.7,16). Ela era também uma vacina monovalente produzida devesículas de membrana externa purificadas adsorvidas em hidróxido de a-lumínio (Bjune, G. e outros, 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccineagainst group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6).

Vacinas de vesícula de membrana externa parecem apresentareficazmente proteínas de membrana externa em uma conformação suficien-temente natural para permitir a geração de anticorpos bactericidas funcio-nais, pelo menos em adolescentes e adultos. As respostas de anticorpo ge-radas foram também mostradas para aumentar a opsonofagocitose de me-ningoeocei. A formulação precisa das vacinas (isto é, teor de OMP, teor deLPS e a presença ou ausência de adjuvante) tem um impacto significantesobre imunogenicidade (Lehmann, A.K. e outros, 1991. Immunization againstserogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured bychemiluminescence. APMIS. 99(8):769-72, Gomez, J.A. e outros, 1998. Ef-fect of adjuvants in the isotypes and bactericidai activity of antibodies againstthe transferring-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccine.16(17):1633-9, Steeghs, L. e outros, 1999. Immunogenicity of Outer Mem-brane Proteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria menin-gitides: Influenee of Adjuvants on the Immune Response. Infect Immun.67(10):4988-93).

O perfil antigênico de isolatos de doença também muda rapida-mente e uma vacina com cobertura de apenas um número limitado de Iinha-gens selecionadas é provável de se tornar ineficaz dentro de alguns anos amenos que a composição da vacina seja mudada para espelhar epidemiolo-gia local.

No momento vacinas de OMV têm sido usadas mais amplamen-te do que qualquer outra vacina do sorogrupo B e são potencialmente úteisno contexto de surtos de doença causados por um único tipo de PorA.

Os imunógenos que geram reatividade cruzada entre linhagensainda têm que ser completamente definidos. Estudos de soros pós-vacinação de testes de vacina de ambos Finlay Institute e NIPH sugeriramque anticorpos contra ambas PorA (P1, a proteína de subtipo de soro classe1) e OpcA (outra OMP principal, antes conhecida como Opc) (Wedege, E. eoutros, 1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigensof Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Menin-gococcal Disease During the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infec.Immun. 66(7):3223-31) foram ambos importantes na mediação de atividadebactericida de soro (com PorA mais imunogênica) ambos antígenos mostramvariabilidade de linhagem para linhagem acentuada.

A proeminência de proteína PorA e o nível significante de varia-bilidade nesta proteína, que parece sofrer variação contínua ambos entre edurante surtos (Jelfs, J. e outros, 2000. Sequenee Variation in the porA Geneof a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemie Spread. Clin. Diagn.Lab. Immunl. 7(3):390-5) em epítopos aos quais a maioria da atividade bac-tericida em pós-vacinação (e pós-doença) é direcionada, aumentaram aspreocupações que proteção oferecida por vacinas baseadas em OMV delinhagem única (monovalente) pudesse ser de subtipo de soro restrito (isto é,dependente do tipo PorA).

Em uma tentativa de superar este problema potencial, uma vaci-na de OMV foi desenvolvida nos Países Baixos na RIVM que continha prote-ínas PorA de seis isolatos patogênicos prevalentes diferentes (Van Der Ley,P. e Poolman, J.T., 1992. Construetion of a multivaient meningoeoceal vaeei-ne strain based on the elass 1 outer membrane protein. Infect. Immun.60(8):3156-61, Claassen, I. e outros, 1996. Produetion, Charaeterization andControl of a Neisseria meningitides hexavalent elass 1 outer membrane pro-tein eontaining vesiele vaeeine. Vaccine. 14(10):1001-8). Neste caso as ve-sículas de vacina foram extraídas de duas variantes da linhagem H44/76bem caracterizada que tinha sido geneticamente engenheirada para expres-sar três proteínas PorA separadas.

A pesquisa por um antigeno universal

Está claro que as proteínas de membrana externa (OMP) podeminduzir uma resposta imune funcional contra doença do sorogrupo B1 masque nenhuma das vacinas até agora desenvolvidas é universalmente prote-tora devido à grande heterogeneidade das regiões expostas de superfíciedas proteínas de membrana externa. A imunidade reativa-cruzada modestainduzida pelas vacinas de vesículas de membrana externa (OMV) alimentoua pesquisa por um antígeno de membrana externa (ou grupo de antígenos)que induzisse anticorpos funcionais e que estivesse presente em todas aslinhagens meningocócicas. Tais antígenos, se eles estivessem presentes emtodas as linhagens sem importar o sorogrupo, poderiam formar a base deuma vacina meningocócica verdadeiramente universal, o que eliminaria oproblema potencial de troca capsular em linhagens patogênicas seguindovacinação com polissacarídeo.

Uma vez que se tornou aparente que a variabilidade da proteínaPorA imunodominante limitaria seu uso como uma vacina universal, váriasdas outras proteínas de membrana externa principais foram consideradaspelo seu potencial de vacina e várias dessas estão sob desenvolvimentoadicional. Aquelas que foram consideradas incluem proteínas classe 5 (Op-cA), NspA e proteínas reguladas por ferro (TbpA e B, FbpA, FetA). TbpB fazparte do complexo de ligação de transferrina com TbpA. Trabalho recentesugere que TbpA tem ambos um papel funcional maior em ligação de ferro(Pintor, M. e outros, 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defec-tive mutants of Neisseria meningitidis, J. Med. Microbiol. 47(9): 757-60) e éum imunógeno mais eficaz do que TbpB.

Uma proteína de membrana externa menor altamente conserva-da foi encontrada através de uma nova técnica usando combinações de pre-parações de proteína de membrana externa de linhagens meningocócicasdiferentes para imunizar camundongos (Martin, D. e outros, 1997. HighlyConserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection AgainstExperimental Infection. J. Exp. Med. 185 (7): 1173-83). As células B doscamundongos foram usadas para produzir hibridomas que foram então ava-liados quanto à reatividade cruzada contra linhagens múltiplas de meningo-cocci. Um anticorpo monoclonal altamente reativo-cruzado foi verificado seligar a uma proteína de membrana externa de 22 kDa que foi chamada Ns-pA. Imunização com proteína NspA recombinante foi mostrada induzir umaresposta bactericida reativa-cruzada em camundongos contra linhagens dossorogrupos Α-C. Vacinação também protege camundongos contra infecçãomeningocócica letal (Martin, D. e outros, 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infecti-on. J. Exp. Med. 185(7):1173-83). Comparação de seqüências de NspA en-tre linhagens meningocócicas geneticamente divergentes demonstra que aproteína é altamente conservada (97% de homologia) (Cadieux, N. e outros,1999. Bactericidal and Cross-Protective Aetivities of a Monoclonal Antibody Direeted against Neisseria meningitides NspA Outer Membrane Protein. In-fect. Immun. 67(9):4955-9).

A presença de NspA foi detectada através de ELISA em 99,2%de linhagens testadas dos sorogrupos A-C usando anticorpos monoclonaisanti-NspA (Martin, D. e outros, 1997. Highly Conserved Neisseria meningiti- dis Surfaee Protein Confers Proteetion against Experimental Infeetion. J.Exp. Med. 185(7):1173-83). Esses anticorpos monoclonais foram mostradosser bactericidas contra várias linhagens de meningoeocei e são capazes dereduzir bacteremia meningocócica em um modelo de camundongo (Cadieux,N. e outros, 1999. Baeterieidal and Cross-Protective Aetivities of a Monoclo- nal Antibody Direeted against Neisseria meningitides NspA Outer MembraneProtein. Infect. Immun. 67(9):4955-9). Embora esses dados pareçam suge-rir que NspA é uma candidata promissora à vacina que é capaz de protegeralém dos limites do sorogrupo, soro de NspA anti-recombinante policlonalnão se liga à superfície de em torno de 35% das linhagens meningocócicas do sorogrupo B patogênicas apesar da presença do gene de NspA nessesorganismos (Moe, G.R. e outros, 1999. Differenees in Surfaee Expression ofNspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infect. Immun.67(11):5664-75).

Apresentação de antígeno e formulação de vacina

Trabalho anterior sugeriu que a forma na qual os antígenos sãoapresentados é provável de ser crítica. Os epítopos em proteínas ligadas àmembrana são freqüentemente dependentes da manutenção da estruturaterciária correta e isto por sua vez é freqüentemente dependente dos domí-nios ligados à membrana hidrofóbica. Foi mostrado que as preparações deproteínas de membrana externa elicitam imunidade em humanos apenasquando apresentadas em forma de vesícula (Zollinger, W.D. e outros, 1979.

Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer mem-brane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48. Zollinger,W.D. e outros, 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidestype 2 protein vaccine in animais and humans. J. Infect. Dis. 137(6):728-39).

Vacinas de proteína única têm sido usadas no campo por déca-das e geralmente exibem boa estabilidade. Se apresentação na forma devesículas for requerida, para permitir que os antígenos permaneçam ligadosà membrana, estabilidade e reproducibilidade podem ser difíceis de garantir.A imunogenicidade e a reatogenicidade de vesículas de membrana externapodem variar com alterações na quantidade de proteína e LPS removidasnos processos de purificação. Um corpo substancial de experiência em pro-dução de vesícula acumulou em fabricação de vacina de OMV, no entanto, eas vacinas atualmente produzidas são sujeitas a controle de qualidade com-pleto. Construção de vesículas de Iipossoma totalmente sintéticas podepermitir otimização e padronização adicionais de tais vacinas (Christodouli-des, M. e outros, 1998. Immunization with recombinant class 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of Iiposomes andadjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the inductionof a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology144(Pt 11 ):3027-37). Em outras palavras, proteínas de membrana externatêm sido apresentadas ambos em vesículas e como proteínas expressaspuras, e o desenvolvimento de respostas de anticorpo tem sido modesto. Osprincipais esforços até agora se concentraram em injeção intramuscular devacina meningocócica, levando à produção de IgG sistêmica. No entanto,em doença meningocócica onde invasão do hospedeiro é através do epitélionasal, a produção de IgA secretora pode ser também importante.A seqüência de genoma de N. meningitidis

As seqüências de genoma de MC58 (um meningococcus do so-rogrupo Β) (Tettelin, Η. e outros, 2000. Complete Genome Sequence ofNeisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172) e de Z2491 (uma linhagem do sorogrupo A) (Parkhill, J. e outros,2000. Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningi-tidis Z2491. Nature 404 (6777):502-6173) foram elucidadas e publicadasdurante 2000. A disponibilidade das seqüências de gene detalhadas deve teruma influência drástica sobre a pesquisa de vacina meningocócica. Emborao sequenciamento do genoma MC58 estivesse em progresso, Pizza e outroscomeçaram a identificar as estruturas de leitura aberta que eram previstascodificar proteínas ou ligadas à membrana, expostas na superfície ou expor-tadas. Eles identificaram 570 tais ORFs, amplificaram-nas através de reaçãode cadeia de polimerase e as clonaram em Escherichia coli para permitirexpressão das proteínas codificadas ou como proteínas marcadas com Hisou de fusão de glutationa S-transferase (Pizza, M. e outros, 2000. Identifiea-tion of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningoeoeeus by Whole-Genome Sequeneing. Science 287 (5459):1816-20). Os 61% (350) dasORFs selecionadas foram expressos com sucesso, aquelas que falharamem expressar foram freqüentemente aquelas contendo mais de um domíniode transmembrana hidrofóbico (possivelmente excluindo várias proteínasligadas à membrana externa). As proteínas recombinantes foram purificadase usadas para vacinar camundongos. Os soros imunes foram então avalia-dos quanto à ligação de superfície a linhagens meningocócicas múltiplasatravés de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e citometria defluxo e quanto à atividade bactericida contra duas linhagens usando o ensaiobactericida de soro. Finalmente sete proteínas foram selecionadas para es-tudo adicional com base em uma resposta positiva em todos os três ensaios.Formulações de vacina de teste usando várias dessas proteínas em combi-nação com adjuvantes foram mostradas para induzir títulos bactericidas sig-nificantes contra a linhagem meningocócica homóloga (MC58) em camun-dongos, mas nenhuma das proteínas induziu títulos de SBA tão altos quantouma vacina de vesícula de membrana externa de MC58 (Giuliani, M.M. eoutros, 2000. Proeeedings 12- IPNC. p. 22). Por outro lado, há alguma evi-dência de que combinações dessas proteínas podem exibir imunogenicidademaior em camundongos do que proteínas únicas (Santini,L. e outros, 2000.Proceedings 12- IPNC, p. 25). As várias estruturas de leitura aberta que fo-ram excluídas durante este trabalho, talvez através de falha de expressão deproteína ou modificação de suas propriedades imunológicas, podem tambémter potencial de vacina e requererem investigação adicional.

Componentes de vacina podem ser selecionados mais eficaz-mente uma vez uma compreensão da contribuição dos antígenos individuaispara a patogênese de N. meningitidis tendo sido obtida. Os próprios antíge-nos podem ser candidatos à vacina eficazes ou, alternativamente, os mutan-tes atenuados poderiam ser considerados como constituintes de vacina. Umproblema importante de prevenção e/ou terapia de doença meningocócica éque nenhuma vacina disponível até agora confere uma proteção universaldevido à heterogeneidade de antígenos usados como vacinas até agora.

Descrição da Invenção

A presente invenção contribui para resolver o problema mencio-nado antes ao fornecer formulações farmacêuticas contendo uma proteínacuja seqüência é altamente conservada, mesmo em gêneros bacterianospatogênicos diferentes. O objetivo técnico que a presente invenção busca éo desenvolvimento de formulações com a habilidade em aumentar a respos-ta imune hospedeira sistêmica e mucosal contra diferentes patógenos novosou um espectro mais amplo dos existentes. No objeto de trabalho da presen-te invenção é descrito, pela primeira vez, o uso da proteína NMB0938 comoum componente de uma formulação de vacina com caráter terapêutico oupreventivo.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a composi-ções farmacêuticas, compreendendo esta proteína, que têm o objetivo deprevenir ou tratar qualquer infecção causada por uma bactéria pertencenteao gênero Neisseria. Em outra realização preferida, essas composições far-macêuticas mencionadas compreendendo o antígeno previamente dito sãoúteis para a prevenção e tratamento de doenças causadas por N. meningiti-dis e N. gonorrhoeae. É especificamente um objeto da presente invençãouma formulação farmacêutica onde a proteína NMB0938 está presente emuma faixa de 0,5-100 pg/dose, em uma formulação farmacêutica aceitável. Adita formulação compreende, opcionalmente, um adjuvante de vacina capazde potencializar a resposta imune contra o ingrediente farmaceuticamenteativo, a proteína NMB0938.

Em outra realização da presente invenção, composições farma-cêuticas poderiam conter um ou vários antígenos sendo de origem sintética,recombinante ou natural. Em outra realização da presente invenção, compo-sições farmacêuticas combinadas poderiam conter antígenos de polissacarí-deo, incluindo polissacarídeos bacterianos, e, mais especificamente, polis-sacarídeos de N. meningitidis. As formulações da presente invenção podemconter proteína-polissacarídeos conjugados, sendo o polissacarídeo de ori-gem bacteriana.

Em uma realização preferida da presente invenção, formulaçõesfarmacêuticas contendo NMB0938 também contêm antígenos de naturezade peptídeo, com o propósito de expansão do espectro de proteção induzidopor vacinas derivadas das ditas composições.

A presente invenção revela formulações farmacêuticas, caracte-rizadas por serem uma vacina com a habilidade em elicitar uma respostaimune protetora no organismo hospedeiro contra infecções causadas porbactérias do gênero Neisseria. Mais especificamente, a formulação farma-cêutica da presente invenção é uma vacina capaz de elicitar uma respostaprotetora contra infecções causadas por Neisseria meningitidis ou Neisseriagonorrhoeae. Formulações farmacêuticas descritas aqui são administradasatravés de via parenteral ou mucosal, incluindo via oral.

Em outra realização preferida da presente invenção, proteínaNMB0938 pode ser empregada como adjuvante, ou carreador de peptídeos,polissacarídeos ou qualquer outro antígeno com menos imunogenicidade,objetivando reforçar a imunogenicidade dos ditos elementos. O Exemplo 11mostra que a proteína NMB0938 é capaz de aumentar os níveis de anticorpocontra um peptídeo derivado viral quando o dito peptídeo é conjugado àNMB0938. Está também compreendido no escopo da presente invençãocobrir o uso de determinantes protetores para um antígeno de proteína dadoque eles são inseridos na seqüência de amino ácido de NMB0938, objeti-vando induzir uma resposta imune aumentada contra tais determinantes,então sendo parte de novas proteínas híbridas presentes em uma composi-ção farmacêutica.

Em outra realização preferida da presente invenção, composi-ções farmacêuticas compreendidas na presente invenção poderiam conterfragmentos de proteína NMB0938, capazes de induzir uma resposta proteto-ra contra a meningococcus ou qualquer outra bactéria do gênero Neisseria.Em uma realização particular da presente invenção, composições farmacêu-ticas contêm mimótopos de NMB0938 ou peptídeos miméticos de NMB0938gerados através de síntese de tecnologia de DNA recombinante. O termo"mimótopo" descreve aqui qualquer peptídeo sendo capaz de induzir anti-corpos, e que eles são combinados com proteína NMB0938 enquanto sendocapazes de induzir uma resposta imune protetora contra Neisseria.

É também uma parte da presente invenção a detecção de doen-ça meningocócica através do uso de componentes farmacêuticos contendoNMB0938, ou o gene codificando NMB0938, identificado como Seq. ID Ns 3,de uma maneira independente ou entre outros componentes dentro de umaamostra biológica obtida de um indivíduo.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. Vetor de clonagem pM238 empregado na clonagem eexpressão de proteína NMB0938.

Figura 2. Construção final de seqüência de nucleotídeo do genede NMB0938 em vetor pM238.

Figura 3. Análise SDS-PAGE de frações obtidas de rompimentocelular: faixa 1, células inteiras; faixa 2, pelete celular após ruptura; faixa 3:sobrenadante de ruptura, MWM: Marcador de peso molecular.

Figura 4. Análise SDS-PAGE das frações diferentes de processode solubilização processo de purificação de proteína NMB0938 recombinan-te começando do pelete de rompimento: Faixa 1, Células inteiras; Faixa 2:pelete de ruptura; Faixas 3 e 4: sobrenadante e pelete após solubilizaçãocom uréia a 2M em tampão de carbonato-bicarbonato; Faixa 5: proteína puri-ficada. MWM: Marcador de peso molecular.

Figura 5. Níveis de anticorpo (IgG) contra proteína recombinanteNMB0938, obtidos após imunização de camundongo com o mesmo antígenoadjuvado com adjuvante de Freund (Freund), hidróxido de alumínio (AIum)ou polissacarídeo C de N. meningitidis através de via intraperitoneal. Resul-tados de ELISA são representados, como o inverso da diluição mais alta queduplica o valor de soro pré-imune.

Figura 6. Reconhecimento de determinantes antigênicos presen-tes em N. meningitidis, linhagem CU385, OMVs usando soros de murino ob-tidos após imunização de camundongos com o mesmo antígeno adjuvadocom adjuvante de Freund (Freund), hidróxido de alumínio (AIum) ou polissa-carídeo C de N. meningitidis através de via subcutânea. Resultados são re-presentados, como o inverso da diluição mais alta que duplica o valor desoros pré-imunes.

Figura 7. Resultados de pesquisas de homologia entre proteínaNMB09380 ("query") e seqüências detalhadas em genomas de sorogruposdiferentes de N. meningitidis ("Sbjct") usando o programa BLAST.

Figura 8. Reconhecimento de proteína NMB0938 em cinco Ii-nhagens diferentes de N. meningitidis, por soros elicitados contra o antígenorecombinante adjuvado com hidróxido de alumínio através de via intraperito-neal. Soros elicitados com outros adjuvantes tinham um perfil similar. Resul-tados são expressos como o inverso da diluição mais alta que duplica o valorde soros pré-imunes.

Figura 9. Experimentos de proteção passiva de infecção menin-gocócica no modelo de rato bebê usando soros elicitados contra o antígenorecombinante adjuvado com adjuvante de Freund (Freund), hidróxido de a-lumínio (AIum) ou polissacarídeo C de N. meningitidis (PsC). Infecção foifeita com a linhagem CU385. C-: grupo de animais não-tratados, C+: sorosde camundongos hiperimunes contra vesículas de membrana externa deZ4181. O símbolo * representa uma diferença estatística significante comrelação ao controle negativo (C-). Com relação aos níveis de bacteremia,esses são expressos como unidades de formação de colônia por ml_(cfu/ml).

Figura 10. Reconhecimento de proteína NMB0938 e um painelde antígenos não-relacionados pelos mAbs gerados (mAbs G7/23, 5D8/24 e4C7/16). P1, proteína Classe 1 linhagem Neisseria meningitidis B:4:P1.15;P64k, subunidade E3 de piruvato desidrogenase de Neisseria meningitidis;T.T., toxóide do tétano; HBsAg1 Antígeno de superfície da Hepatite B. Essesresultados são mostrados como valores de absorbância (492 nm) em umensaio tipo ELISA.

Figura 11. Reconhecimento de proteína NMB0938 por sorosconvalescentes humanos de sobreviventes de doença meningocócica. Comoum controle negativo soros de doador saudável foram empregados. Os re-sultados são mostrados como a absorbância (492 nm) em um ensaio tipoELISA.

Figura 12. Títulos de antipeptídeo JY1 dos soros de animais i-munizados ou com peptídeo livre (JY1), proteína recombinante (NMB0938)ou o conjugado JY1-NMB0938.

Figura 13. Níveis de anticorpo (IgA) contra proteína NMB0938recombinante em amostras de lavagem pulmonar de camundongos imuniza-dos intranasal com uma NMB0938 recombinante polissacarídeo C de N.meningitidis (NMB0938+PsC) ou com a proteína incorporada aos Iipossomas(NMB0938_Lip).

Apresentação detalhada de exemplos de realização/Exemplos

Exemplo 1. Detecção de proteína NMB0938 em preparações de vesículasde membrana externa de Neisseria meningitidis sorogrupo B

Com o objetivo de estudar proteínas que estão presentes nasvesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis sorogrupo B (li-nhagem B:4:P1.19, 15), uma eletroforese bidimensional foi realizada de a-cordo com um método descrito em outro lugar (Górg A, e outros 1985, Eiec-trophoresis 6:599-604). Subseqüentemente uma digestão enzimática foi feitanas proteínas extraída em gel usando tripsina (Promega, Madison, Wl1 U.S.).Peptídeos gerados após digestão foram extraídos em solução usando mi-crocolunas (ZipTips1 Millipore, MA, U.S.)· Para análise de espectrometria demassa os peptídeos foram eluídos de microcolunas com acetonitrila 60%,ácido fórmico 1% seguido por uma aplicação imediata em nanopontas (Pro-tana, Dinamarca).

Medições foram realizadas em um espectrômetro de massa hí-brido com quatro pólos e tempo de vôo (QTof-2®, Manchester, Reino Unido),equipado com uma fonte de ionização (nanoESI). Dados de espectrometriade massa foram adquiridos em uma faixa w/z de 400-2000 em 0,98 segundoe usando 0,02 segundo entre varreduras. Aquisição de dados e processa-mento de dados foram realizados usando o programa MassLynx (versão 3.5,Micromass).

Identificação de proteína com base em dados de espectro demassa foi realizada usando o programa ProFound (Zhang, W. e Chait, B.T.2000. ProFound: an expert system for protein Identification using mass spec-trometric peptide mapping information. Anal. Chem. 72:2482-2489.http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). A pesquisa foi subscrita paraos genes e seqüências de proteína derivadas contidos no banco de dadosSwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) e NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando a oxidação de metioninas, desaminação e carboxia-midometilação de cisteínas como possíveis modificações a serem encontra-das.

Identificação de proteínas com base nos espectros de massa foirealizada com o programa MASCOT (Perkins, D.N. e outros, 1999. Probabi-lity-based protein Identification by searching sequence databases using massspectrometry data. Electrophoresis 20:3551-3567.

http://www.matrixscience.com/). Parâmetros de pesquisa incluem modifica-ções de cisteína bem como oxidações e desaminações.

Partindo da análise de resultados obtidos da identificação deproteínas presentes em preparações de vesículas de membrana externa, aproteína NMB0938 foi selecionada para ser avaliada como possível candida-to à vacina, da qual um peptídeo foi identificado através de espectrometriade massa.Exemplo 2. Análise baseada em homoloqia de proteína NMB0938 com pro-dutos de gene relatados em bancos de dados.

Para a identificação da proteína NMB0938, uma pesquisa dehomologia de seqüência foi feita no banco de dados NCBI empregando oprograma BLAST (Altschul S.F, e outros, 1990. Basic local alignment searchtool. J. Mol. Biol. 215:403-410, http://ncbi.nlm.nig.gov/BLAST/). Os resulta-dos deste procedimento indicaram homologia apenas com N. meningitidis eN. gonorrhoeae, então é suposto pela requerente que esta proteína repre-sente um atributo específico de gênero.Exemplo 3. Clonagem e expressão do gene de NMB0938 codificando a pro-teína NMB0938 de N. meningitidis em Escherichia coli.

A fim de clonar e expressar o gene de NMB0938, o vetor de clo-nagem pM-238 foi empregado. Este vetor permite que a clonagem seja reali-zada usando enzimas de restrição diferentes e a geração de níveis de ex-pressão altos de proteínas heterólogas na forma de corpos de inclusão emE. coli.

O vetor pM-238 (Figura 1) tem os elementos que seguem: pro-motor de triptofano, segmento de gene codificando a seqüência de estabili-zação de 47 aminoácidos de fragmento Nt de P64 kDa da linhagem de N.meningitidis B:4:P1.19,15, seqüência de terminador transcripcional T4 debacteriófago e a seqüência do gene que confere resistência à Ampicilinacomo marcador de seleção. Este vetor de clonagem também permite sele-ção recombinante por meio de um tingimento de cor azul/branca de colôniastransformadas, devido à presença de subunidade alfa IacZ de beta-galactosidase.

Da seqüência de nucleotídeo de gene codificando NMB0938 (E-xemplo 1) um par de primer de oligonucleotídeo (0938U e 0938L) foi projeta-do para amplificação do dito segmento de gene, evitando a região de codifi-cação de peptídeo de sinal, do DNA genômico da linhagem CU385(B:4:P1.19, 15)

Xbal

0938U: 5" GCTTCTAGATCTTTCTCCGAGCAAAGACG 3(Ne de identificação de seqüência: 1)

0938L: GCCCCCGGGATCCATTGAAGTAGATG

SamHI

(NQ de identificação de seqüência: 2)

Para a previsão de peptídeo de sinal o servidor SignaIP WorldWide Web (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0) foi empregado. Apósamplificação por PCR do gene codificando NMB0938 (Saiki, R.K. e outros(1988). S Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermosta-ble DNA polymerase. Science 239:487-491) empregando prímers 0938U e0938L, o produto de PCR foi digerido usando enzimas de restrição Xba-I eBam-HI, e clonado em vetor de clonagem pM238 previamente digerido. Aconstrução final é mostrada na Figura 2, e a proteína NMB0938 é expressacomo uma proteína de fusão para o segmento Nt de proteína P64 kDa. Se-quenciamento do gene clonado de NMB0938 foi realizado usando o sequen-ciador automático ALFexpress Il (Termo Sequenase® Cy® 5 Dye TerminatorKit, Amersham Biosciences) e oligonucleotídeos 1573 (Seq. ID. Nq 8) e 6795(Seq. ID. N9 9) que ligam a seqüência do estabilizador P64 e terminadortranscripcional T4, respectivamente. O plasmídeo gerado aqui foi chamadopM-NMB0938 para uso posterior.

Para a expressão do gene de NMB0938 a linhagem de E. coliGC366 foi transformada através de método químico com o plasmídeo pM-NMB0938 (figura 2). O experimento de expressão foi realizado em meio mí-nimo (M9) (Miller, J.H. 1972. Experimente in Molecular Genetics, Cold S-pring Harbor Laboratory Press, Nova York, USA) suplementado com glicosea 1%, extrato de levedura 0,5%, CaCI2 a 0,1 mM, MgSO4 a 1mM e ampicilina50 pg/ml. Culturas bacterianas foram incubadas 12 horas a 37e C e 250 rpm.Culturas cultivadas foram centrifugadas e rompimento ultrassônico do peletecelular foi realizado (IKA LABORTECHNIK). Frações de pelete e sobrena-dante foram analisadas através de SDS-PAGE (Laemmli, UK, 1970. Cleava-ge of structural proteins during the assembly of the head of bacteríophage74. Nature 277:680) mais tingimento com Coomassie Brilliant Blue R-250. Aporcentagem de expressão foi realizada através de densitometria de gel(LKB Bromma 2202 Ultrascan Laser densitometer; Amersham PharmaciaBiotech., Reino Unido). A proteína NMB0938 foi obtida da fração de pelete,sendo cerca de 15% do teor de proteína total desta fração (Figura 3). Amos-tras de pelete celular foram solubilizadas em tampão de carbonato-bicarbonato (carbonato de sódio a 0,1 M, hidrogenocarbonato de sódio a0,1 M) contendo uréia em concentrações molares diferentes (2M, 4M, 6M e8M). Quando o tampão anterior com uréia a 2M foi empregado, a proteínaNMB0938 foi solubilizada. O sobrenadante após solubilização passou poruma cromatografia de afinidade de metal a fim de atingir a purificação daproteína de interesse. Como resultado uma amostra com uma pureza de85% foi obtida como é mostrado na Figura 4. Uma última etapa de diálise foirealizada antes de sua avaliação em animais de laboratório.Exemplo 4. Avaliação da resposta imune induzida após imunização com pro-teína NMB0938 através de via intraperitoneal.

Para avaliar a imunogenicidade da proteína NMB0938, um expe-rimento de imunização foi planejado e conduzido em camundongos, onde aproteína NMB0938 foi administrada adjuvada com Hidróxido de Alumínio,Adjuvante de Freund ou polissacarídeo C de N. meningitidis.

Com essas preparações, camundongos fêmeas Balb/C (8-10semanas de vida) foram imunizados, uma vez divididos em 3 grupos de 8camundongos cada. Três imunizações foram aplicadas através de via intra-peritoneal, com 7 dias de intervalo entre elas. Um grupo controle foi empre-gado e consequentemente imunizado com PBS, no entanto, tal como os ou-tros grupos no experimento, uma dose de reforço com a proteína adjuvadaem Hidróxido de alumínio foi dada no dia 45. Na Tabela 1 é descrita a com-posição dos grupos:

Tabela 1: Grupos de camundongos Balb/C empregados no experimento deimunização

<table>table see original document page 19</column></row><table>Títulos de anticorpo (IgG) contra a proteína recombinante e aproteína homóloga presentes na bactéria foram determinados através de umELISA, em amostras de soro obtidas após a dose de reforço. Na Figura 5, ostítulos de anticorpo contra a proteína recombinante de animais individuaissão mostrados. Níveis de anticorpo específicos foram detectados logo apósa segunda inoculação (dados não mostrados), sendo ainda mais altos apósa última inoculação. Além disso, a imunoidentificação por Western blotting foifeita, onde a respectiva faixa de proteína foi reconhecida (dados não mostrados).

Os soros obtidos após a imunização com a proteína recombinan-te reconheceram a proteína natural presente em uma preparação de proteí-na de membrana externa (OMP) de linhagens CU385 e Z4181. Esses resul-tados são apresentados na Figura 6. Os resultados foram estatisticamenteanalisados através do teste Kruskal-Wallis não-paramétrico, devido à falta dehomogeneidade em variâncias entre grupos de acordo com o teste de Bart-tle. Comparação de tratamento média em combinações requeridas foi manu-seada com o teste de Dunnet para Comparação Múltipla.

Exemplo 5. Caracterização da seqüência do gene codificando a proteínaNMB0938 em linhagens diferentes de N. meninpitidis e Neisseria gonorrhoeae.

Para analisar a conservação da seqüência do gene codificandoa proteína NMB0938 na espécie patogênica do gênero Neisseria uma pes-quisa de similaridade com os genomas de Neisseria meningitidis (sorogru-pos A, B e C) e Neisseria gonorrhoeae, detalhados no banco de dados NC-BI, foi feita (NC 003116.1, NC 003112.1. NC 003221, NC002946) empre-gando o programa BLAST (Altschul S.F., e outros, 1990. Basic local align-ment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). A Figura 7 mostra os resultados dacomparação de seqüência para aquelas seqüências que produzem um ali-nhamento significante em cada um dos genomas analisados. Essas seqüên-cias têm 100% de identidade no sorogrupo B, 95,22% de identidade no so-rogrupo A e uma identidade de 94% com Neisseria gonorrhoeae, com a se-quência obtida para o gene que codifica a proteína NMB0938 (Seq. ID. No.3). Ainda, a seqüência do referido gene foi determinada para 3 isolatos Cu-banos (Seq. ID Nos. 5-7), que pertencem ao sorogrupo B (B:4:P1.19, 15) eum alinhamento de seqüência foi feito usando o programa CIustaIX(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Os resultados do alinhamento mostram quehá uma grande conservação na seqüência de nucleotídeo do gene deNMB0938 entre as linhagens analisadas e em geral o gênero Neisseria.

O uso da proteína NMB0938 como um candidato à vacina, le-vando em consideração o alto grau de similaridade existente entre as se-quências previamente mencionadas, permitiria a geração de uma respostaimune eficaz, com uma proteção de amplo espectro (devido à reatividadecruzada) contra a doença meningocócica.

Exemplo 6. Caracterização da resposta imune com ação de amplo espectroinduzida pela imunização de camundonqos Balb/C com a proteínaNMB0938.

Para avaliar se a imunização com a proteína NMB0938 induziuuma resposta amplamente reativa-cruzada com outras linhagens de Neisse-ria, um ELISA foi feito. As placas de poliestireno foram revestidas com célu-las integrais de 5 linhagens de Neisseria, que pertencem a sorotipos e subti-pos de soro diferentes. As placas foram incubadas com soros agrupadosobtidos contra a proteína NMB0938, através de duas vias de imunização,conforme descrito no Exemplo 4.

A Figura 8 mostra o reconhecimento de antígenos presentes emlinhagens de sorogrupos A, B e C de N. meningitidis pelos soros elicitadosapós a imunização com a proteína NMB0938 recombinante adjuvada comhidróxido de alumínio. Como é observado, os soros imunes reconheceram aproteína presente em diferentes linhagens, com níveis similares àqueles en-contrados na linhagem CU385. O resto dos soros tinham um comportamentocomparável neste ensaio.

Exemplo 7. Proteção induzida pelos soros de murino específicos para prote-ína NMB0938, contra linhagens homólogas e heteróloqas, no modelo de ratobebê.Para determinar a atividade funcional dos anti-soros obtidos, umensaio de proteção foi conduzido no modelo de rato bebê para infecção me-ningocócica. Vinte e quatro ratos (5-6 dias de vida) foram divididos em gru-pos de 6 ratos cada.

Foi determinado que os soros administrados através de via in-traperitoneal protegiam os ratos de infecção causada por bactérias (linha-gem CU385), inoculadas pela mesma via uma hora depois. Os soros de ca-da grupo foram agrupados e diluídos 1/10 (em PBS estéril) antes deles se-rem inoculados em ratos bebês. Quatro horas mais tarde, os animais foramamostrados e bactérias viáveis em seu sangue foram contadas.

Para interpretar os resultados, uma Análise de Variância (Anova)foi feita, seguido por um Teste de Comparação Múltipla de Dunnet, onde osgrupos de teste foram comparados com o controle negativo. Como pode serobservado na Figura 9 o grupo recebendo soros de camundongos imuniza-dos com NMB0938 adjuvado com solução de Freund não mostrou diferen-ças estatisticamente significantes em comparação com grupo controle nega-tivo, então os títulos de anticorpo eram protetores no modelo de rato bebê.

Um ensaio similar foi feito infectando ratos bebês com a linha-gem 233 (C:2a:P1.5) constatando que, tal como no experimento anterior,anticorpos elicitados com a proteína NMB0938 adjuvada com adjuvante deFreund eram capazes de proteger ratos contra infecção meningocócica (da-dos não mostrados).

Um ensaio similar foi feito infectando ratos bebês com linhagensH44/48 e 120/90, isoladas de pacientes Cubanos, cuja classificação soroló-gica é homóloga à linhagem B385. Além disso, experimentos de provocaçãoforam conduzidos com a linhagem H44/76 (B:15:P1.7,16) do sorogrupo B.Em todos os casos, o anti-soro contendo anticorpos elicitados com a proteí-na NMB0938 alvo adjuvada com adjuvante de Freund era capaz de protegerratos contra infecção meningocócica.

Exemplo 8. Geração de anticorpos monoclonais contra proteína NMB0938capaz de mediar a atividade bactericida contra Neisseria meningitidis

Para gerar anticorpos monoclonais (mAbs) específicos contraproteína NMB0938, e estudar a habilidade funcional de mediação de ativida-de bactericida contra linhagem homóloga e heteróloga de N. meningitidis,um programa de imunização foi conduzido com uma preparação de proteínaNMB0938 com 80% de pureza (Exemplo 3). A imunização foi feita emBalb/C (H2d, fêmeas, 5-6 semanas de vida) e 4 doses foram aplicadas comosegue: Nos dias 0, 15 e 30 da rotina de administração, 10 pg de antígenoNMB0938 por camundongo (volume total 100 pl) foram administrados atra-vés de via subcutânea, emulsificados com Adjuvante de Freund; no dia 50,10 pg de antígeno por camundongo em Solução Salina Tamponada comFosfato (NaCI a 140 mM, KCI a 270 mM, KH2PO4 a 1,5 mM, Na2HPO4 a 6,5mM χ 2H20, pH 7,2) foram administrados através de via intraperitoneal. Ex-trações de sangue foram feitas nos dias 0 e 45.

Esplenócitos do animal com o título mais alto, medido através deum ELISA indireto usando proteína NMB0938 com o antígeno de revesti-mento (Exemplo 3), foram fundidos com células de mieloma de camundongoX63 Ag8 653. Os hibridomas resultantes foram isolados e avaliados de acor-do com procedimentos padrão (Gavilondo, J.V. 1995, Anticuerpos Mono-clonales: Teoria y Práctica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba).

A reatividade dos anticorpos secretados pelos hibridomas dire-cionados à proteína NMB0938, bem como seus antígenos não-relacionadosde reatividade cruzada, foi testada por um ELISA indireto empregando 5pg/ml de cada antígeno, e a mesma concentração de cada mAbs a ser en-saiado. A Figura 10 mostra os resultados obtidos neste experimento, ao todo3 clones positivos foram obtidos (mAbs G7/23, 5D8/24 e 4C7/16) que espe-cificamente reconheceram proteína NMB0938, e não reagem nem com aseqüência de aminoácido correspondendo ao terminal N de P64k, nem como resto dos antígenos não-relacionados ensaiados.

Para determinar a habilidade dos mAbs gerados contra a proteí-na NMB0938 em mediar uma resposta bactericida contra linhagens homólo-gas e heterólogas de Neisseria meningitidis um teste bactericida foi realiza-do. O título de anticorpo bactericida foi expresso como a recíproca da dilui-ção mais alta dos anticorpos testados que era capaz de matar 50% ou maisbactérias; dois dos mAbs (5D8/24 e 4C7/16) atingiram títulos bactericidasmaiores do que 1:128 contra a linhagem homóloga B:4:P.1.19,15 e um(G7/23) um título maior do que 1:80. Eles também mostraram títulos maisaltos do que 1:64 contra as linhagens heterólogas B:15:P.1.7,16 e C:2a:P1.5respectivamente.

Exemplo 9

Caracterização das regiões alvo da resposta imune de murino contra a pro-teína NMB0938

A fim de identificar as regiões na proteína que são mais frequen-temente reconhecidas pelos anti-soros de murino gerados contra o antígenorecombinante um ensaio SPOTScan foi feito. Um conjunto de peptídeos desobreposição que atravessa a seqüência da proteína foi sintetizado em umamembrana de celulose, que foi incubada com soros agrupados diluídos1:100. A reação de antígeno-anticorpo foi detectada pela incubação com umconjugado imunoglobulina G anti-murino - fosfatase alcalina, seguido pelaadição de uma solução que continha o substrato Bromo-cloro-indolil-fosfato.

Várias regiões antigênicas comuns dentro da proteína foram ob-servadas, sem importar a preparação que era empregada para a imunização(dados não mostrados). No entanto, nos grupos imunizados com a proteínaadjuvada com Adjuvante de Freund, havia um padrão muito mais amplo dereconhecimento.

Exemplo 10. Reconhecimento da proteína NMB0938 por soros humanos.

Uma coleção de soros humanos, vindo de indivíduos convales-centes, foi empregada neste estudo, que foi realizado através de ELISA. Asplacas foram revestidas com proteína NMB0938, obtida através de eletrofo-rese preparativa (5 pg/ml). Após bloqueio das placas com leite em pó desna-tado a 3% em PBS contendo Tween-20, os soros foram diluídos (1:50) namesma solução e foram incubados nas placas. O imunoensaio continuoucomo foi amplamente relatado. Soros de doador saudável foram emprega-dos como controles negativos. Ainda, soros agrupados de indivíduos vacina-dos com uma vacina recombinante contra Hepatite B foram usados um con-trole não-relacionado (dados não mostrados).A Figura 11 mostra os resultados obtidos com 5 soros de conva-Iescentes neste ensaio. Pode ser visto que os soros humanos reconhecerama proteína, que indica que ela é expressa durante a infecção meningocócicae ela é imunogênica.

Exemplo 11. Proteína NMB0938 como um carreador para um peptídeo.

Para demonstrar a capacidade carreadora da proteína recombi-nante NMB0938, ela foi conjugada a um peptídeo sintético de 15 meros, de-rivado da região V3 de proteína gp120 de HIV-1, isolato JY1. A conjugaçãofoi feita através do método de glutaraldeído. Peptídeo JY1 livre, a proteínarecombinante NMB0938 e o conjugado JY1-NMB0938 foram administradosa camundongos adultos em um programa de 3 doses, onde os imunógenosforam emulsificados com Adjuvante de Freund. Duas semanas após a tercei-ra dose, amostras de soro foram obtidas dos animais imunizados, e as a-mostras foram analisadas através de ELISA para determinar os títulos deanticorpo antipeptídeo. Para fazer isso, as placas foram revestidas com pep-tídeo livre (20 pg/ml) e o imunoensaio continuou como foi previamente des-crito. Os resultados do experimento (Figura 12) mostram a capacidade car-readora de proteína NMB0938, capaz de significantemente potencializar aresposta de anticorpo contra peptídeo JY1, após sua conjugação.Exemplo 12. Avaliação da resposta imune induzida após imunização comproteína NMB0938 através de via mucosal.

Para avaliar a imunogenicidade da proteína NMB0938, um expe-rimento de imunização foi planejado e conduzido e camundongos, onde aproteína NMB0938 foi administrada encapsulada em Iipossomas ou adjuva-da com polissacarídeo C de N. meningitidis. Lipossomas foram obtidos atra-vés de desidratação-reidratação conforme previamente descrito (Carmenate,T. e outros (2001). Proteína Opc recombinante de Neisseria meningitidis re-constituída em Iipossomas elicita anticorpos opsônicos seguindo imunização.Biotechnol. Appl. Biochem. 34:63-69). Com essas duas preparações, ca-mundongos fêmeas Balb/C (8-10 semanas de vida) foram imunizados. Trêsdoses de 50 pg através de via intranasal foram aplicadas, com intervalos de15 dias entre elas. A fim de analisar a resposta imune em nível mucosal, ní-veis de anticorpo IgA foram medidos em lavagens pulmonares de animaisimunizados. Na Figura 13, os níveis de anticorpo IgA detectado são mostra-dos para os dois grupos avaliados.Listagem de Seqüências

<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnologia

<120> "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO A PROTEÍNA NMB0938" .

<130> PROTEÍNA NMB0938

<140>

<141>

<160> 9

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligo 0938U

<400> 1

gcttctagat ctttctccga gcaaagacg 29

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligo 0938L

<400> 2

gcccccggga tccattgaag tagatg 2 6

<210> 3

<211> 837

<212> DNA

<213> Neisseria meningitidis (grupo B)

<400> 3

atgaaaaaca aaacctcatc acttctctta tggcttaccg caatcatgct gaccgcgtgt 60

tctccgagca aagacgataa aaccaaagaa gtcggtgcat ccgctgcttc gtcctccgcg 120

tcatcagctc cttcccaaac cgatttgcaa ccgaccgcat ccgcccctga taacgtcaag 180caggcagaaa gcgcgccgcc gtcaaattgc accagcctgc accccgccac cggcattgac 240gatctcatgc agcaaatcgc cgaacacatt gactcggact gtctgtttgc cctttcccat 300cacgaactgg aaacccgttt cggcttaccc gacggtggct atgacaacat acagcggctg 360ctgtttcccg acatccgccc tgaagatccc gactaccatc agaaaatcat actggcaatt 420gaagacttgc gttacggaaa gcgcacgatc agccggcagg cacaaaatgc cttgatggaa 480caggaacgcc gcctccgaga agcgacgctg ttgctgatac agggcagtca agaaacccgc 540ggacaaggcg aggagccgaa acgcacgcgt tattttgaag tttcggcaac ccctgcctat 600tcgagccggc acaacaacgg acttggcggc aatttccaat acatcagcca attgcccggc 660tatctgaaaa tacacggaga aatgcttgaa aaccaatcac tcttccggct gtccaaccgt 720gaacgcaatc ccgacaaacc gtttttagac atccattttg acgaaaatgg caaaatcacg 7 80cgtattgtcg tttacgaaaa aaacatctac ttcaatccaa acacggggcg aatataa 837<210> 4<211> 278<212> PRT

<213> Neisseria meningitidis (grupo Β)<400> 4

Met Lys Asn Lys Thr Ser Ser Leu Leu Leu Trp Leu Thr Ala Ile Met

15 10 15

Leu Thr Ala Cys Ser Pro Ser Lys Asp Asp Lys Thr Lys Glu Val Gly

20 25 30

Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ala Pro Ser Gln Thr Asp

35 40 45

Leu Gln Pro Thr Ala Ser Ala Pro Asp Asn Val Lys Gln Ala Glu Ser

50 55 60

Ala Pro Pro Ser Asn Cys Thr Ser Leu His Pro Ala Thr Gly Ile Asp65 70 75 80

Asp Leu Met Gln Gln Ile Ala Glu His Ile Asp Ser Asp Cys Leu Phe

85 90 95

Ala Leu Ser His His Glu Leu Glu Thr Arg Phe Gly Leu Pro Asp Gly

100 105 110

Gly Tyr Asp Asn Ile Gln Arg Leu Leu Phe Pro Asp Ile Arg Pro Glu115 120 125Asp Pro Asp Tyr His Gln Lys Ile Ile Leu Ala Ile Glu Asp Leu Arg130 135 140

Tyr Gly Lys Arg Thr Ile Ser Arg Gln Ala Gln Asn Ala Leu Met Glu145 150 155 160

Gln Glu Arg Arg Leu Arg Glu Ala Thr Leu Leu Leu Ile Gln Gly Ser 165 170 175

Gln Glu Thr Arg Gly Gln Gly Glu Glu Pro Lys Arg Thr Arg Tyr Phe 180 185 190

Glu Val Ser Ala Thr Pro Ala Tyr Ser Ser Arg His Asn Asn Gly Leu 195 200 205

Gly Gly Asn Phe Gln Tyr Ile Ser Gln Leu Pro Gly Tyr Leu Lys Ile 210 215 220

His Gly Glu Met Leu Glu Asn Gln Ser Leu Phe Arg Leu Ser Asn Arg225 230 235 240

Glu Arg Asn Pro Asp Lys Pro Phe Leu Asp Ile His Phe Asp Glu Asn 245 250 255

Gly Lys Ile Thr Arg Ile Val Val Tyr Glu Lys Asn Ile Tyr Phe Asn 260 265 270

Pro Asn Thr Gly Arg Ile 275

<210> 5

<211> 837

<212> DNA

<213> Neisseria meningitidis (grupo B)

<400> 5

atgaaaaaca aaacctcatc acttctctta tggcttaccg caatcatgct gaccgcgtgt 60

tctccgagca aagacgataa aaccaaagaa gtcggtgcat ccgctgcttc gtcctccgcg 120

tcatcagctc cttcccaaac cgatttgcaa ccgaccgcat ccgcccctga taacgtcaag 180

caggcagaaa gcgcgccgcc gtcaaattgc accagcctgc accccgccac cggcattgac 240

gatctcatgc agcaaatcgc cgaacacatt gactcggact gtctgtttgc cctttcccat 300

cacgaactgg aaacccgttt cggcttaccc gacggtggct atgacaacat acagcggctg 360

ctgtttoccg acatccgccc tgaagatccc gactaccatc agaaaatcat actggcaatt 420gaagacttgc gttacggaaa gcgcacgatc agccggcagg cacaaaatgc cttgatggaa 480

caggaacgcc gcctccgaga agcgacgctg ttgctgatac agggcagtca agaaacccgc 540

ggacaaggcg aggagccgaa acgcacgcgt tattttgaag tttcggcaac ccctgcctat 600

tcgagccggc acaacaacgg acttggcggc aatttccaat acatcagcca attgcccggc 660

tatctgaaaa tacacggaga aatgcttgaa aaccaatcac tcttccggct gtccaaccgt 720

gaacgcaatc ccgacaaacc gtttttagac atccattttg acgaaaatgg caaaatcacg 780

cgtattgtcg tttacgaaaa aaacatctac ttcaatccaa acacggggcg aatataa 837

<210> 6<211> 837<212> DNA

<213> Neisseria meningitidis (grupo Β)<400> 6

atgaaaaaca aaacctcatc acttctctta tggcttaccg caatcatgct gaccgcgtgt 60

tctccgagca aagacgataa aaccaaagaa gtcggtgcat ccgctgcttc gtcctccgcg 120

tcatcagctc cttcccaaac cgatttgcaa ccgaccgcat ccgcccctga taacgtcaag 180

caggcagaaa gcgcgccgcc gtcaaattgc accagcctgc accccgccac cggcattgac 240

gatctcatgc agcaaatcgc cgaacacatt gactcggact gtctgtttgc cctttcccat 300

cacgaactgg aaacccgttt cggcttaccc gacggtggct atgacaacat acagcggctg 360

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gaagacttgc gttacggaaa gcgcacgatc agccggcagg cacaaaatgc cttgatggaa 480

caggaacgcc gcctccgaga agcgacgctg ttgctgatac agggcagtca agaaacccgc 540

ggacaaggcg aggagccgaa acgcacgcgt tattttgaag tttcggcaac ccctgcctat 600

tcgagccggc acaacaacgg acttggcggc aatttccaat acatcagcca attgcccggc 660

tatctgaaaa tacacggaga aatgcttgaa aaccaatcac tcttccggct gtccaaccgt 72 0

gaacgcaatc ccgacaaacc gtttttagac atccattttg acgaaaatgg caaaatcacg 7 80

cgtattgtcg tttacgaaaa aaacatctac ttcaatccaa acacggggcg aatataa 837

<210> 7<211> 837<212> DNA

<213> Neisseria meningitidis (grupo B)<400> 7

atgaaaaaca aaacctcatc acttctctta tggcttaccg caatcatgct gaccgcgtgt 60tctccgagca aagacgataa aaccaaagaa gtcggtgcat ccgctgcttc gtcctccgcg 120tcatcagctc cttcccaaac cgatttgcaa ccgaccgcat ccgcccctga taacgtcaag 180caggcagaaa gcgcgccgcc gtcaaattgc accagcctgc accccgccac cggcattgac 240gatctcatgc agcaaatcgc cgaacacatt gactcggact gtctgtttgc cctttcccat 300cacgaactgg aaacccgttt cggcttaccc gacggtggct atgacaacat acagcggctg 360ctgtttcccg acatccgccc tgaagatccc gactaccatc agaaaatcat actggcaatt 420gaagacttgc gttacggaaa gcgcacgatc agccggcagg cacaaaatgc cttgatggaa 480caggaacgcc gcctccgaga agcgacgctg ttgctgatac agggcagtca agaaacccgc 540ggacaaggcg aggagccgaa acgcacgcgt tattttgaag tttcggcaac ccctgcctat 600tcgagccggc acaacaacgg acttggcggc aatttccaat acatcagcca attgcccggc 660tatctgaaaa tacacggaga aatgcttgaa aaccaatcac tcttccggct gtccaaccgt 720gaacgcaatc ccgacaaacc gtttttagac atccattttg acgaaaatgg caaaatcacg 780cgtattgtcg tttacgaaaa aaacatctac ttcaatccaa acacggggcg aatataa 837

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligo 1573

<400> 8

ttccatggta gataaaagaa tggctttag 2 9

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligo 6795

<400> 9

aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg 27

Claims (17)

1. Formulação farmacêutica caracterizada por conter a proteínaNMB0938 identificada como SEQ ID N2 4.

2. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,para a prevenção ou tratamento de infecções causadas por bactérias do gê-nero Neisseria.

3. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,para a prevenção ou tratamento de infecções causadas por Neisseria me-ningitidis ou Neisseria gonorrhoeae.

4. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,onde a proteína NMB0938 está presente na faixa de dosagem de 0,5-100Mg/dose, em uma formulação farmaceuticamente aceita.

5. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada por conter um adjuvante de vacina opcional.

6. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por conter em adição um ou vários antígenos de natureza dife-rente obtidos através de meios recombinantes, sintéticos ou naturais.

7. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada por conter antígenos de polissacarídeo, incluindo polissacarí-deos bacterianos.

8. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 7,caracterizada por conter polissacarídeos capsulares de Neisseria meningiti-dis.

9. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada por conter conjugados de proteína-polissacarídeo onde ocomponente polissacarídeo é um polissacarídeo bacteriano.

10. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada por conter antígenos de peptídeo.

11. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por ser uma vacina capaz de gerar no organismo recipienteuma resposta protetora contra infecções causadas por bactérias do gêneroNeisseria.

12. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 11,caracterizada por ser uma vacina capaz de gerar no organismo recipienteuma resposta protetora contra infecções causadas por Neisseria meningitidisou Neisseria gonorrhoeae.

13. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 aser administrada por via parenteral ou mucosal.

14. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo uso de proteína NMB0938 sozinha, combinada ou fundi-da, como um adjuvante ou carreador para antígenos de natureza diferente.

15. Formulação farmacêutica caracterizada por conter fragmen-tos de peptídeo, ou peptídeos miméticos de antígeno de proteína NMB0938,em formulações farmaceuticamente aceitas.

16. Método para diagnóstico de uma infecção causada por bac-térias do gênero Neisseria e compreendendo a detecção de proteínaNMB0938 ou seus fragmentos, ou de uma maneira independente ou emcombinação com outros componentes, em uma amostra biológica de umindivíduo.

17. Método para diagnóstico de uma infecção causada pela bac-téria do gênero Neisseria, e compreendendo a detecção do gene codificandoNMB0938, identificado como SEQ ID N9 3, ou de uma maneira independenteou em combinação com outros componentes, em uma amostra biológica deum indivíduo.