CN101448522A - 包含蛋白质nmb0938的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别涉及包含蛋白质NMB0938的药物组合物的开发。本发明的组合物赋予针对由病原体或不由病原体引起的不同疾病的保护。蛋白质NMB0938被鉴定为脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)外膜囊泡(OMV)制备物的组分，它通过使用重组脱氧核糖核酸(DNA)技术而获得，并且在动物模型中评估其免疫原性和保护活性。由于编码蛋白质NMB0938的基因的高度保守性，因而包含这种蛋白质的组合物作为诱导广泛反应性的免疫应答的抗原具有极大的价值。本发明的组合物可应用于人类医药学领域。

Description

包含蛋白质NMB0938的药物组合物

技术领域

本发明涉及医药领域，特别地涉及用于预防性或治疗性应用的新型疫苗组合物的开发，所述新型疫苗组合物允许增加针对不同来源的疾病的疫苗抗原的免疫应答的质量。

现有技术

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是革兰氏阴性双球菌，其唯一的已知宿主是人，并且是脑膜炎球菌性脑膜炎(meningococcal meningitis)的致病因子。通常，在正常群体中的无症状携带者之中发现这种细菌，这种小生境是关于其微生物分离的最常见来源。

在世界上，小于2岁的儿童是最易于感染脑膜炎球菌性脑膜炎的群体，然而，青少年和正常成人群体也可能受到影响。

未治疗的脑膜炎球菌病(meningococcal disease)对于大多数患病个体是致命的，和疫苗接种可以通过甚至避免细菌移居来预防这种情形。

已开发了几种策略，目的是获得能够满足所需要求的疫苗，以便在一般群体中诱导针对这种疾病的保护。为了这个目的，已考虑了荚膜抗原，因为它们的免疫学特异性已允许将这种微生物分类成血清群。这些血清群中的5种已被定义为是造成全世界的脑膜炎球菌病的大多数临床病例的原因。A血清群是撒哈拉南部非洲中该病流行的主要原因。B和C血清群与发达国家中发生的大多数病例相关。Y和W-135血清群在美国一些地区中流行的该疾病和感染的其余病例的大多数之中存在，过去几年出现显著增加。因此，荚膜多糖成为作为疫苗候选物进行研究和评估的目标。赋予针对A、C、Y和W-135血清群的保护的基于荚膜多糖的四价疫苗已在美国得到许可。疫苗接种后所引发的抗体是血清群特异性的(Rosenstein N.等人，2001.Meningococcaldisease.N.Engl.J.Med，344，1378-1388)。

不同于其余血清群的血清群B继续为地方性和流行性脑膜炎球菌病的重要原因，并且这主要是由于完全缺乏针对其的有效疫苗。已注意到，B荚膜多糖是弱免疫原性的，加之关于基于这种化合物的疫苗存在诱导免疫耐受和自身免疫的理论风险，这是因为其与存在于人类胎儿结构中的寡糖链具有结构相似性。(Finne J.等人，1987.An IgGmonoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts withdevelopmentally regulated polysialic acid units ofglycoproteins in neural and extraneural tissues.J.Immunol，138：4402-4407)。因此，针对B血清群的疫苗的开发集中于使用亚荚膜抗原。

外膜蛋白质和囊泡疫苗

在70年代对于生产基于外膜蛋白质(outer membrane protein，OMP)的疫苗的最初尝试基于通过使用去污剂来从外膜蛋白质制备物中去除LPS(Frasch CE和Robbins JD.1978.Protection against groupB meningococcal disease.III.Immunogenicity of serotype 2vaccines and specificity of protection in a guinea pig model.J Exp Med 147(3)：629-44)。然后，使外膜蛋白质OMPs沉淀以产生悬浮于氯化钠中的聚集体。尽管在动物研究中获得有希望的结果，但这些疫苗无法在成人或儿童中诱导杀菌抗体(Zollinger WD等人，1978.Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidistype 2 protein vaccine in animals and humans.J.Infect.Dis.137(6)：728-39)。这些疫苗的差的性能在很大程度上归因于伴随着沉淀过程而出现的三级结构的丧失。因此，接下来的合理步骤是生产以其在外膜囊泡形式中的天然构象展示出所述蛋白质的疫苗(Zollinger WD等人，1979.complex of meningococcal group Bpolysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenicin man.J.Clin.Invest.63(5)：836-48；Wang LY和Frasch CE.1984.Development of a Neisseria meningitidis group B serotype2b protein vaccine and evaluation in a mouse model.Infect Immun.46(2)：408-14136)。

这些外膜囊泡疫苗比OMP聚集体显著更具有免疫原性，并且免疫原性显示出通过吸附至佐剂氢氧化铝而得到进一步增强(Wang LY和Frasch CE.1984.Neisseria meningitidis group B serotype 2bprotein vaccine and evaluation in a mouse model.Infect Immun.46(2)：408-14136)。

已使用不同配方的可溶性外膜囊泡疫苗进行了许多功效试验。在20世纪80年代，分别作为对于古巴(Sierra GV等人，1991.Vaccineagainst group B Neisseria meningitidis：protection trial andmass vaccination results in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)：195-210)和挪威(Bjune G等人，1991.Effect of outer membrane vesiclevaccine against group B meningococcal disease in Norway.Lancet.338(8775)：1093-6)中的疾病暴发的响应而开发出了2种最深入研究的疫苗。由古巴的Finlay Institute生产的OMV疫苗(商业上称为VA-MENGOC-BC)是从菌株B:4:P1.19，15开始生产的，并且其由所述菌株的OMPs的制备物和分离的C血清群荚膜多糖组成，并吸附至氢氧化铝(Sierra GV等人，1991.Vaccine against group B Neisseriameningitidis：protection trial and mass vaccination results inCuba.NIPH Ann Dis.14(2)：195-210)。这种疫苗对于古巴中该流行病的快速下降作出了贡献(Rodriguez AP等人，Theepidemiological impact of antimeningococcal B vaccination inCuba.1999.Mem Inst Oswaldo Cruz.94(4)：433-40)。

由Norwegian National Institute for Public Health(NIPH)生产的疫苗最初在由属于克隆ET-5的菌株(B:15:P1.7，16)引起的疾病的高度地方性流行期间使用。这种单价疫苗也是从纯化的外膜囊泡生产的并吸附在氢氧化铝上(BjuneG等人，1991.Effect of outermembrane vesicle vaccine against group B meningococcal diseasein Norway.Lancet.338(8775)：1093-6)。

外膜囊泡疫苗似乎有效地呈递处于足够天然的构象的外膜蛋白质，从而允许至少在青少年和成人中产生功能性杀菌抗体。所产生的抗体应答也已显示增加脑膜炎球菌的调理吞噬。疫苗的精确配制(例如，OMP含量、LPS含量和佐剂的存在或不存在)对于免疫原性具有显著影响(Lehmann AK等人，1991.Immunization against serogroupB meningococci.Opsonin response in vaccinees as measured bychemiluminescence.APMIS.99(8)：769-72；Gomez JA等人，1998.Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activityof antibodies against the transferrin-binding proteins ofNeisseria meningitidis.Vaccine.16(17)：1633-9；Steeghs L等人，1999.Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in aLipopolysaccharide-Deficient Mutan t of Neisseriameningitidis：Influence of Adjuvants on the Immune Response.Infect Immun.67(10)：4988-93)。

但是，从患者中获得的分离物的抗原谱快速改变，并且仅覆盖有限数目的所选菌株的疫苗可能在数年内变得无效，除非改变疫苗组成以反映当地的流行病学。

目前，OMV疫苗已比任何其他B血清群疫苗更广泛地使用，并且在由单一PorA类型引起的疾病暴发的背景下可能是有用的。

在菌株之间产生交叉反应性的免疫原仍有待充分定义。来自Finlay Institute和NIPH疫苗试验的疫苗接种后血清的研究暗示，针对PorA(P1，1类血清亚型蛋白质)和OpcA(另一种主要OMP，以前称为Opc)的抗体(Wedege E等人，1998.Immune Responses againstMajor Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis inVaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Diseaseduring the Norwegian Serogroup B Protection Trial.Infect Immun.66(7)：3223-31)是重要的血清杀菌活性的介体(主要是PorA)，并且这2种蛋白质均显示出显著的菌株间的变异性。

PorA蛋白是具有显著水平的变异性的抗原，其在暴发之间和期间经历连续变异(Jelfs J等人，2000.Sequence Variation in the porAGene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread.Clin Diagn Lab Immunol.7(3)：390-5)。在疫苗接种后和疾病后的杀菌抗体主要针对这种抗原。但是，其变异性却使得具有这样的问题，即用单个菌株的OMV疫苗(单价的)进行免疫接种所产生的保护作用是否是广谱的。为了解决这个问题，在荷兰(RIVM)开发了一种OMV疫苗，其包含6种不同的致病性分离物的PorA蛋白(Van Der LeyP和Poolman JT.1992.Construction of a multivalentmeningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membraneprotein.Infect Immun.60(8)：3156-61；Claassen I等人，1996.Production，characterization and control of a Neisseriameningitidis hexavalent class 1 outer membrane proteincontaining vesicle vaccine.Vaccine.14(10)：1001-8)。在这种情况下，从经充分表征的H44/76菌株的2种变体中提取出疫苗囊泡，所述H44/76菌株已进行了遗传改造以表达3种独立的PorA蛋白。

寻找通用抗原

显然，外膜蛋白质(OMP)可以诱导针对B血清群疾病的功能性免疫应答，但由于在外膜蛋白质的表面上暴露的区域的极大异质性，迄今为止开发的疫苗中没有一种是具有普遍保护性的。由外膜囊泡(OMV)疫苗诱导的适度交叉反应免疫性已推动了对于诱导功能性抗体且存在于所有脑膜炎球菌菌株上的外膜抗原(或抗原群)的寻找。如果它们与血清群无关地存在于所有菌株上，那么它们可能构成真正通用的脑膜炎球菌疫苗的基础，这将消除在多糖疫苗接种后致病性菌株上的荚膜转变的潜在问题。

由于免疫显性的PorA蛋白的变异性，因而其作为通用疫苗的用途受到限制，因此考虑了许多其他主要外膜蛋白质用于疫苗候选物，并且这些中的几种在进一步的开发中。已考虑的那些包括5类蛋白质(0pcA)、NspA和铁调节的蛋白质(TbpA和B、FbpA、FetA)。TbpB与TbpA一起构成了转铁蛋白结合复合物的一部分。近期工作暗示，TbpA在铁结合中具有比TbpB更大的功能作用(Pintor M等人，1998.Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutantsof Neisseria meningitidis.J Med Microbiol 47(9)：757-60)，且是比TbpB更有效的免疫原。

已经通过新型技术发现了高度保守的次要外膜蛋白质，其中使用来自不同脑膜炎球菌菌株的外膜蛋白质制备物的组合来免疫小鼠(Martin D等人，1997.Highly Conserved Neisseria meningitidisSurface Protein Confers Protection against ExperimentalInfection.J Exp Med 185(7)：1173-83)。将来自小鼠的B细胞用于生产杂交瘤，随后就针对多种脑膜炎球菌菌株的交叉反应性对所述杂交瘤进行筛选。发现一种具有高度交叉反应性的单克隆抗体与称为NspA的22kDa外膜蛋白质结合。用重组NspA蛋白进行免疫接种显示出在小鼠中诱导针对A-C血清群的菌株的交叉反应性杀菌应答。疫苗接种还保护小鼠免于致命性脑膜炎球菌感染(Martin D等人，1997.Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface ProteinConfers Protection against Experimental Infection.J Exp Med185(7)：1173-83)。在遗传上趋异的脑膜炎球菌菌株中的NspA序列的比较证实，该蛋白质是高度保守的(97％的同源性)(Cadieux N等人，1999.Bactericidal and Cross-Protective Activities of aMonoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidisNspA Outer Membrane Protein.Infect Immun 67(9)：4955-9)。

使用抗NspA单克隆抗体，通过ELISA在99.2％的来自A-C血清群的受试菌株上检测出NspA的存在(Martin D等人，1997.HighlyConserved Neisseria meningitidis Surface Protein ConfersProtection against Experimental Infection.J Exp Med 185(7)：1173-83)。这些单克隆抗体已显示出针对众多脑膜炎球菌菌株具有杀菌作用，并且能够在小鼠模型中减少脑膜炎球菌菌血症(Cadieux N等人，1999.Bactericidal and Cross-Protective Activities of aMonoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidisNspA Outer Membrane Protein.Infect Immun 67(9)：4955-9)。尽管这个数据似乎暗示NspA是能够跨越血清群界线发挥保护作用的有希望的疫苗候选物，但来自小鼠的多克隆抗重组NspA血清不与约35％的致病性B血清群脑膜炎球菌菌株的表面结合，虽然在这些生物中存在nspA基因(Moe GR等人，1999.Differences in SurfaceExpression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains.Infect Immun 67(11)：5664-75)。

脑膜炎奈瑟氏球菌基因组序列及其对疫苗开发的影响

MC58(B血清群脑膜炎球菌)(Tettelin H等人，2000.completeGenome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B StrainMC58.Science 287(5459)：1809-15172)和Z2491(A血清群菌株)(ParkhillJ等人，2000.complete DNA sequence of a serogroupA strain of Neisseria meningitidis Z2491.Nature 404(6777)：502-6173)的基因组序列在2000年期间得到阐明和公开。经注释的基因序列的可得性应当对脑膜炎球菌疫苗研究具有显著影响。在MC58基因组测序正在进行的同时，Pizza等人开始鉴定被预测编码膜结合的、表面暴露的或输出的蛋白质的开放读码框。他们鉴定了570种此类ORFs，经由聚合酶链式反应扩增它们，并将它们克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)中，以允许作为具有His尾巴或谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白来表达所编码的蛋白质(Pizza M等人，2000.Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup BMeningococcus by Whole-Genome Sequencing.Science 287(5459)：1816-20)。61％(350种)的所选择的ORFs得到成功表达，无法表达的那些通常是包含超过一个疏水跨膜结构域的那些(可能排除了许多外膜结合蛋白质)。所述重组蛋白质进行纯化，并用于对小鼠进行疫苗接种。然后，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)和流式细胞术就与多种脑膜炎球菌菌株的表面结合来对免疫血清进行评估，并且使用血清杀菌测定法就针对2种菌株的杀菌活性来对免疫血清进行评估。最后，基于在所有3种测定法中的阳性应答选择出了7种蛋白质用于进一步的研究。使用与佐剂相组合的许多这些蛋白质的试验疫苗制剂已显示在小鼠中诱导显著的针对同源脑膜炎球菌菌株(MC58)的杀菌抗体滴度，但所述蛋白质中没有一种诱导与MC58外膜囊泡疫苗一样高的SBA滴度(GiulianiMM等人，2000.Proceedings 12th IPNC.第22页)。另一方面，存在某些证据表明，这些蛋白质的组合可以在小鼠中显示出比单种蛋白质更高的免疫原性(SantiniL.等人，2000.Proceedings 12th IPNC.第25页)。可能通过蛋白质表达的失败或其免疫学性质的修饰而在这个工作期间排除的众多开放读码框也可能具有疫苗潜力并需要进一步研究。

一旦了解独个抗原对于脑膜炎奈瑟氏球菌的发病机理的贡献，就可以更有效地选择疫苗组分。抗原自身可能成为有效的疫苗候选物，或者备选地，减毒的突变体可以被视为疫苗的组分。

脑膜炎球菌病的预防和/或治疗中的一个重要问题是，由于到目前为止用作疫苗的抗原的异质性，迄今为止可得的疫苗中没有一种能够赋予通用保护。

发明描述

本发明通过提供包含这样的蛋白质的药物组合物而促成解决了前面提及的问题，所述蛋白质的序列即使在不同血清学分类的奈瑟氏球菌属(Neisseria)的菌种之间也是高度保守的。本发明所追求的技术目标是开发能够增加宿主的全身和粘膜免疫应答的组合物，所述免疫应答针对不同的新型病原体或更广谱的现有病原体。在本发明的工作目标中，首次报道了蛋白质NMB0938作为具有治疗或预防特征的疫苗组合物的组分的用途。

更具体而言，本发明涉及旨在预防或治疗由属于奈瑟氏球菌属的细菌引起的任何感染的药物组合物，其包含这种蛋白质。在另一个优选的实施方案中，包含先前所述抗原的这些所提及的药物组合物可用于预防或治疗由脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)或淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)引起的疾病。本发明的目的特别是这样的药物组合物，其中蛋白质NMB0938在药学上可接受的赋形剂中以0.5-100μg/剂的范围存在。所述组合物任选地包含能够增强针对药学活性成分即蛋白质NMB0938的免疫应答的疫苗佐剂。

在本发明的另一个实施方案中，药物组合物可以包含具有重组、合成或天然起源的一种或多种抗原。在本发明的另一个实施方案中，所述组合的药物组合物可以包含多糖抗原，包括细菌多糖，和更具体而言，脑膜炎奈瑟氏球菌多糖。本发明的药物组合物可以包含缀合的蛋白质-多糖，其中多糖组分是细菌多糖。

在本发明的一个优选实施方案中，包含NMB0938的药物组合物还包含肽性质的抗原，目的是扩展由衍生自所述组合物的疫苗所诱导的保护谱。

本发明揭示了这样的药物组合物，其特征在于为疫苗，该疫苗能够在受体生物中产生针对由奈瑟氏球菌属的细菌引起的感染的保护性应答。更具体而言，本发明的药物组合物是这样的疫苗，该疫苗能够在受体生物中产生针对由脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌引起的感染的保护性应答。本文描述的药物组合物通过肠胃外或粘膜途径进行施用，包括通过口部途径的施用。

在本发明的另一个优选实施方案中，蛋白质NMB0938可以与其他抗原相组合地或相融合地使用。在这样的组合物中，蛋白质NMB0938作为免疫原性较弱的肽、多糖或其他抗原的免疫增强剂或载体，目的是增强针对所述肽、多糖或其他抗原的免疫应答。实施例11显示，当病毒衍生肽与NMB0938缀合时，蛋白质NMB0938能够增强针对所述肽的抗体水平。本发明的范围内还包括使用蛋白质抗原的保护性决定簇，其中将它们插入NMB0938氨基酸序列内，目的是诱导针对此类决定簇的增强的免疫应答，从而形成作为药物组合物的一部分的杂合蛋白质。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的药物组合物可以在药学上可接受的赋形剂存在下包含蛋白质NMB0938的片段，所述片段能够诱导针对脑膜炎球菌或奈瑟氏球菌属的任何其他细菌的保护性应答。在本发明的一个具体实施方案中，药物组合物包含通过合成或重组DNA技术产生的NMB0938模拟表位或NMB0938模拟肽。术语“模拟表位”在本文中指任何能够诱导抗体的肽，所述抗体与蛋白质NMB0938相结合，并由此能够产生针对奈瑟氏球菌属的保护性免疫应答。

也为本发明的一部分的是用于诊断由奈瑟氏球菌属的细菌引起的感染的方法，其包括在来自个体的生物样品中以独立的形式或与其他组分相结合地检测蛋白质NMB0938或其片段或者编码蛋白质NMB0938的基因(该基因被标识为Seq.ID.No3)。

附图简述

图1.在蛋白质NMB0938的克隆和表达中使用的载体pM238。

图2.通过将相应于基因nmb0938的核苷酸序列克隆在载体pM238中而获得的最终构建体。

图3.通过细胞破裂而获得的级分的SDS-PAGE分析。泳道1，全细胞；泳道2，破裂沉淀物；泳道3，破裂上清液；MWM：分子量标准参照物。

图4.从破裂沉淀物开始的重组蛋白质NMB0938的纯化过程的不同级分的纯度的SDS-PAGE分析。泳道1，全细胞；泳道2，破裂沉淀物；泳道3和4，在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中用2M尿素溶解后的上清液和沉淀物；泳道5，纯化的蛋白质。MWM：分子量标准参照物。

图5.在用相同抗原通过腹膜内途径免疫小鼠后获得的针对重组蛋白质NMB0938的抗体水平(IgG)，对所述抗原佐以弗氏佐剂(Freund)、氢氧化铝(Alum)或脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖(PsC)。显示了在ELISA类型的测定法中获得的结果，其表示为滴度的倒数，该滴度被计算为在光密度为免疫前血清样品的光密度的2倍时的血清样品的稀释度。

图6.使用用重组蛋白质NMB0938通过腹膜内途径进行免疫的小鼠的血清，识别存在于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CU385(B血清群)和Z4181(C血清群)的OMVs中的抗原决定簇，对所述重组蛋白质NMB0938佐以弗氏佐剂(Freund)、氢氧化铝(Alum)或C多糖(PsC)。结果表示滴度的倒数，该滴度被计算为在光密度为免疫前血清的光密度的2倍时的血清的稀释度。

图7.使用BLAST程序在编码蛋白质NMB0938的基因(“Query”)和不同脑膜炎奈瑟氏球菌血清群的经注释的基因组序列(“Sbjct”)之间进行同源性检索的结果。

图8.血清对于存在于5种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中的抗原的识别，所述血清是在通过腹膜内途径用佐以氢氧化铝的重组蛋白质NMB0938进行免疫接种后而产生的。在用该蛋白质和其他佐剂进行免疫接种后而产生的的血清具有类似的行为。结果表示滴度的倒数，该滴度被计算为在光密度为免疫前血清的光密度的2倍时的血清的稀释度。

图9.使用用重组蛋白质NMB0938进行免疫接种而获得的血清，在幼年大鼠模型中的针对脑膜炎球菌感染的被动保护实验，对所述重组蛋白质NMB0938佐以弗氏佐剂(Freund)、氢氧化铝(Alum)或脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖(PsC)。使用菌株CU385来进行感染。C-：未处理动物的血清的混合物；C+：用菌株CU385的脑膜炎奈瑟氏球菌外膜囊泡免疫的小鼠的血清。符号*表示相对于阴性对照组(C-)而言具有统计学上显著的差异，其中涉及表示为菌落形成单位/毫升(cfu/ml)的菌血症水平。

图10.所产生的mAbs(mAbs G7/23、5D8/24和4C7/16)对于重组蛋白质NMB0938和一组无关抗原的识别。抗原：P1，脑膜炎奈瑟氏球菌菌株B：4：P1.19，15的1类蛋白质；P64k，脑膜炎奈瑟氏球菌的丙酮酸脱氢酶的E3亚基；T.T，破伤风类毒素；HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原。结果显示为在ELISA类型的测定法中的吸光度(492nm)。

图11.脑膜炎球菌病的恢复期患者血清对于重组蛋白质NMB0938的识别。作为阴性对照，使用健康供体的血清。结果显示为在ELISA类型的测定法中的吸光度(492nm)。

图12.抗-肽JY1抗体的滴度，其相应于用游离肽(JY1)、重组蛋白质(NMB0938)或缀合物JY1-NMB0938免疫的动物的血清。

图13.在用与脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖相混合的重组蛋白质NMB0938(NMB0938+PsC)或用掺入脂质体中的重组蛋白质NMB0938(NMB0938_Lip)通过鼻内途径免疫的小鼠的肺灌洗样品中，针对重组蛋白质NMB0938的抗体水平(IgA)。

实施实例/实施例的详细描述

实施例1.在B血清群脑膜炎奈瑟氏球菌外膜囊泡制备物中蛋白质NMB0938的检测。

为了研究存在于B血清群脑膜炎奈瑟氏球菌(菌株B：4：P1.19，15)外膜囊泡中的蛋白质，根据在文献(Sabounchi-Schutt F等人，(2000).An immobiline DryStrip application method enab ling high-capacity two-dimensional gel electrophoresis.Electrophoresis21：3649-3656)中描述的方法来进行二维电泳。随后使用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，U.S.)对经凝胶提取的蛋白质进行酶促消化。在消化后产生的肽通过使用微型柱(ZipTips，Millipore，MA，U.S.)而提取到溶液中。在进行质谱法分析之前，用乙腈60％、甲酸1％从微型柱中洗脱下肽，随后立即施加到纳米尖端(nanotips)(Protana，Denmark)中。

测量在配备电离源(nanoESI)的、具有四级和飞行时间的混合型质谱仪(QTof-2^TM，Manchester，United Kingdom)中进行。在0.98秒中并在扫描之间使用0.02秒间隔，在400-2000的w/z范围中获取质谱法数据。数据获取和数据处理使用MassLynx程序(版本3.5，Micromass)来进行。

基于质谱数据的蛋白质鉴定使用ProFound程序(ZhangW和ChaitBT.2000.ProFound：an expert system for protein identificationusing mass spectrometric peptide mapping information.Ana l Chem72：2482-2489.http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)来进行。对于包含在数据库SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的细菌基因和蛋白质序列进行搜索，其中作为将遇到的可能修饰考虑了甲硫氨酸的氧化、半胱氨酸的脱酰胺和羧基酰氨基甲基化(carboxyamidomethylation)。

基于质谱的蛋白质鉴定用MASCOT程序(Perkins DN等人，1999.Probability-based protein identification by searching sequencedatabases using mass spectrometry data.Electrophoresis 20：3551-3567.http://www.matrixscience.com/)来进行。搜索参数包括半胱氨酸的修饰以及可能的氧化和脱酰胺。

从得自存在于外膜囊泡制备物中的蛋白质鉴定的结果分析开始，选择蛋白质NMB0938作为可能的疫苗候选物进行评估，从中通过质谱法鉴定出1种肽。

实施例2.蛋白质NMB0938与在数据库中报告的基因产物的同源性分析。

关于蛋白质NMB0938的鉴定，使用BLAST程序(Altschul SF等人，1990.Basic local alignment search tool.J Mol Biol 215：403-410，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在NCBI数据库中进行序列同源性搜索。这一过程的结果表明仅与脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌具有同源性，因此我们假定这种蛋白质代表了属特异性的属性。

实施例3.在大肠杆菌中克隆和表达编码脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白质NMB0938的nmb0938基因。

为了克隆和表达nmb0938基因，使用pM-238克隆载体。这种载体允许使用不同的限制酶来进行克隆，和在大肠杆菌中以内含体的形式产生高表达水平的异源蛋白质。

pM-238载体(图1)具有下述元件：色氨酸启动子，相应于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CU385的P64k抗原的N-末端稳定性区段的序列(编码47个氨基酸)，编码C-末端组氨酸尾巴的序列，相应于T4噬菌体的转录终止子的序列，和作为选择标记的相应于赋予氨苄青霉素抗性的基因的序列。由于β-半乳糖苷酶lacZ α亚基的存在，这种克隆载体还允许通过菌落的蓝色或白色着色来选择重组体。

根据编码蛋白质NMB0938的基因的核苷酸序列(实施例1)，设计了寡核苷酸引物对(0938U和0938L)以用于从菌株CU385(B：4：P1.19，15)基因组DNA中扩增无信号肽编码区的所述基因区段，

XbaI

0938U：5｀GCTTCTAGATCTTTCTCCGAGCAAAGACG3｀

(序列标识号：1)

0938L：5｀GCCCCCGGGATCCATTGAAGTAGATG3｀

BamHI

(序列标识号：2)

为了预测信号肽，使用SignalP World Wide Web服务器(http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0)。在使用引物0938U和0938L对编码NMB0938的基因进行PCR扩增(SaikiRK等人，(1988).S Primer-directed enzymatic amplification of DNA with athermostable DNA polymerase.Science 239：487-491)后，PCR产物用XbaI和BamHI限制酶进行消化，并克隆到事先经消化的pM238克隆载体中。最终的构建体显示于图2中，并且将重组蛋白质NMB0938表达为与P64k的N-末端区段的融合蛋白。经克隆的基因nmb0938的测序使用ALFexpress II自动测序仪(Termo Sequena se^TM Cy^TM 5 DyeTerminador Kit，Amersham Biosciences)以及寡核苷酸1573(Seq.ID.No.8)和6795(Seq.ID.No.9)来进行，所述寡核苷酸分别结合P64k的稳定性区段和T4噬菌体转录终止子的序列。此处产生的质粒命名为pM-NMB0938以用于随后使用。

为了表达nmb0938基因，通过化学方法用pM-NMB0938质粒转化大肠杆菌GC366菌株(图2)。表达实验在补充有1％葡萄糖、0.5％酵母提取物、0.1mM CaC l₂、1mM MgSO₄和50μg/mL氨苄青霉素的M9含盐基本培养基(Miller JH.1972.Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NEW York，USA)中进行。细菌培养物在37℃和250rpm下温育12小时。将生长培养物进行离心，并且通过超声瓦解来进行细胞沉淀物的破裂(IKALABORTECHNIK)。来自沉淀物和上清液的级分通过SDS-PAGE(LaemmliUK.1970.Cleavage of struc tural proteins during the a ssemblyof the head of bacteriophage T4.Nature 277：680)并加上用考马斯亮蓝R-250染色来进行分析。表达的百分比通过凝胶光密度测定法来进行分析(LKB Bromma 2202 Ultrascan laser densitometer；Amersham Pharmacia Biotech，United Kingdom)。在破裂沉淀物中获得蛋白质NMB0938，为该级分的总蛋白质含量的约20％(图3)。将细胞沉淀物的样品溶解于包含不同摩尔浓度(2M、4M、6M和8M)的尿素的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(0.1M碳酸钠，0.1M碳酸氢钠)中。当使用具有2M尿素的前述缓冲液时，蛋白质NMB0938被溶解。使溶解后的上清液通过金属亲和层析以便达到目的蛋白质的纯化。因此，获得具有85％纯度的样品，如图4中所示的。在其在实验动物中进行评估之前，进行最后的透析步骤。

实施例4.通过腹膜内途径用蛋白质NMB0938进行免疫接种后诱导的免疫应答的评估。

为了评估蛋白质NMB0938的免疫原性，设计并在小鼠中进行免疫接种实验，其中施用佐以氢氧化铝、弗氏佐剂或脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖的蛋白质NMB0938。

使用这些制剂免疫雌性Balb/C小鼠(8-10周龄)，这些小鼠分成4组，每组8只小鼠。通过腹膜内途径进行3次免疫接种，每2次之间间隔7天。使用对照组，其在前3次免疫接种时接受PBS，然而，如同该实验中的其他组一样，在实验开始后45天时接受佐以氢氧化铝的所述蛋白质的加强剂量。在表1中描述了给每个组使用的组合物：

表1：在免疫接种实验中所使用的Balb/C小鼠组

 

组	免疫原
		1	20μg NMB0938+弗氏佐剂
2	20μg NMB0938+氢氧化铝
		3	20μg NMB0938+C多糖
4	PBS

在所述加强剂量后获得的血清样品中，通过ELISA测定针对该重组蛋白质和细菌中存在的同源蛋白质的抗体(IgG)的滴度。在图5中，显示了个体动物的针对该重组蛋白质的抗体滴度。正好在第二次接种后检测到特异性抗体水平(数据未显示)，在最后1次接种后更加高。此外，进行经由Western印迹法的免疫鉴定，其中识别出相应于所述蛋白质的条带(数据未显示)。

在用该重组蛋白质进行免疫接种后获得的血清识别存在于菌株CU385和Z4181的外膜蛋白质(OMP)制备物中的天然蛋白质。这些结果显示在图6中。由于根据Barttle’s检验在组之间缺乏方差齐性，因而通过非参数Kruskal-Wallis检验来对结果进行统计分析。在处理的平均值的比较中，以所需的组合，使用Dunn’s多重比较检验。

实施例5.在脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的不同菌株中编码蛋白质NMB0938的基因序列的表征。

为了分析奈瑟氏球菌属的致病性物种中编码蛋白质NMB0938的基因序列的保守性，使用BLAST程序(Altschul SF等人，1990.Basiclocal alignment search tool.J Mol Biol 215：403-410.http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)来进行采用在NCBI数据库中注释的脑膜炎奈瑟氏球菌(A、B和C血清群)和淋病奈瑟氏球菌的基因组的相似性搜索(NC_003116.1，NC_003112.1，NC_003221，NC_002946)。图7显示了关于在每种所分析的基因组中产生显著比对的那些序列的序列比较的结果。与所获得的编码蛋白质NMB0938的基因序列(Seq.ID.No.3)相比较，那些序列在B血清群中具有100％的同一性，在A血清群中具有95.22％的同一性，和在淋病奈瑟氏球菌的情况下具有94％的同一性。此外，对于属于B血清群(B:4:P1.19，15)的3种古巴分离物，测定了所述基因的核苷酸序列(Seq.ID.No.5-7)，并且通过使用ClustalX程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行了序列比对。比对的结果显示，在所分析的菌株中和一般而言在奈瑟氏球菌属中在基因nmb0938的核苷酸序列中存在极大的保守性。

考虑到在前面提及的序列中存在高度的相似性，将蛋白质NMB0938用作疫苗候选物将允许产生有效的免疫应答，具有针对脑膜炎球菌病的广谱保护(由于交叉反应性)。

实施例6.通过用蛋白质NMB0938对Balb/C小鼠进行免疫接种而诱导的具有广谱作用的免疫应答的表征。

为了评估用蛋白质NMB0938进行免疫接种是否诱导了与其他奈瑟氏球菌属菌株具有广泛交叉反应性的应答，进行ELISA。用5种奈瑟氏球菌属菌株的完整细胞包被聚苯乙烯平板，所述菌株属于不同的血清型和血清亚型。将平板与血清混合物进行温育，所述血清是针对具有不同佐剂的蛋白质NMB0938而获得的，如实施例4中所描述的。

图8显示，存在于脑膜炎奈瑟氏球菌的A、B和C血清群菌株中的抗原被在用佐以氢氧化铝的重组蛋白质NMB0938进行免疫接种后获得的血清所识别。如所观察到的，免疫血清识别在不同菌株中存在的该蛋白质，其水平类似于在菌株CU385中所发现的水平。在用具有其他佐剂的该蛋白质进行接种后所产生的血清具有类似的行为。

实施例7.在幼年大鼠模型中由针对蛋白质NMB0938而产生的鼠类血清所诱导的保护作用。

为了测定所获得的抗血清的功能活性，在幼年大鼠中的脑膜炎球菌感染模型之中进行被动保护测定法。将24只大鼠(5-6天龄)分成组，每组6只大鼠。

确定通过腹膜内途径施用的血清是否保护了大鼠不受由细菌(菌株CU385)引起的感染，所述细菌在1小时后通过相同途径接种。混合每个组的血清，并在将它们接种在幼年大鼠中之前作1/10稀释(在无菌PBS中)。4小时后，对动物进行取样，并且计数其血液中的活细菌。

为了解释所述结果，进行方差分析(Anova)，随后为Dunnet’s多重比较检验，其中比较了所研究的各组与阴性对照(未处理的动物的血清混合物)。如在图9中所观察到的，与阴性对照组相比较，接受用佐以弗氏佐剂的蛋白质NMB0938进行免疫接种的小鼠的抗体的组显示出统计上显著的差异，因此所述抗体在幼年大鼠模型中是具有保护性的。

通过用菌株233(C:2a:P1.5)感染幼年大鼠进行了类似测定法，其中发现，如前面的实验中一样，用佐以弗氏佐剂的蛋白质NMB0938进行免疫接种的小鼠的抗体能够保护大鼠不受脑膜炎球菌感染(数据未显示)。

通过用从古巴患者中分离的菌株H44/48和120/90感染幼年大鼠进行了类似测定法，所述菌株的血清学分类与菌株CU385同源。此外，攻击实验用B血清群的菌株H44/76(B:15:P1.7，16)来进行。在所有情况下，用佐以弗氏佐剂的蛋白质NMB0938进行免疫接种的小鼠的抗体能够保护幼年大鼠不受脑膜炎球菌感染。

实施例8.产生针对蛋白质NMB0938的单克隆抗体，其能够介导针对脑膜炎奈瑟氏球菌的杀菌活性。

为了产生针对蛋白质NMB0938特异性单克隆抗体(mAbs)，和研究介导针对脑膜炎奈瑟氏球菌的同源和异源菌株的杀菌活性的功能活性，用纯度为80％的蛋白质NMB0938的制剂进行免疫接种程序。免疫接种在Balb/C小鼠(H-2^d，雌性，5-6周龄)中进行，并且如下施加4剂：在免疫接种程序的第0、15和30天时，通过皮下途径施用经弗氏佐剂乳化的10μg抗原NMB0938/只小鼠(总体积100μl)；在第50天时，通过腹膜内途径施用在磷酸盐缓冲盐水(140mM NaCl、270mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、6.5mM Na₂HPO₄ x 2H₂O，pH7.2)中的10μg抗原/只小鼠。抽血在第0和45天时进行。

将来自具有最高滴度(通过使用蛋白质NMB0938作为包被抗原的间接ELISA而测量的)的动物的脾细胞与X63 Ag8 653小鼠骨髓瘤细胞融合。所得到的杂交瘤根据标准操作程序进行分离和筛选(Gavilondo JV.1995.Anticuerpos Monoclonales：Teoría yPráctica，Elfos Scientiae，La Habana，Cuba)。

由所述杂交瘤分泌的针对蛋白质NMB0938的抗体的反应性，以及其与无关抗原的交叉反应性，通过使用5μg/ml的每种抗原和相同浓度的每种待测定mAbs的间接ELISA来进行测试。图10显示了在这个实验中获得的结果，获得了总共3个阳性克隆(mAbs G7/23、5D8/24和4C7/16)，其特异性地识别蛋白质NMB0938，并且与相应于P64k的N-末端区段的氨基酸序列和其余所测定的无关抗原都不反应。

为了测定针对蛋白质NMB0938而产生的mAbs介导针对脑膜炎奈瑟氏球菌的同源和异源菌株的杀菌应答的能力，进行杀菌测试。杀菌抗体滴度表示为能够杀死50％或更多细菌的受试抗体的最高稀释度的倒数；所述mAbs中的2种(5D8/24和4C7/16)具有高于1:128的针对同源菌株B:4:P1.19，15的杀菌滴度，以及1种(G7/23)具有高于1:80的滴度。它们还显示出高于1:64的分别针对异源菌株B:15:P1.7，16和C:2a:P1.5的滴度。

实施例9.针对蛋白质NMB0938的鼠类免疫应答的靶区域的表征。

为了鉴定该蛋白质中更通常被针对该重组抗原而产生的鼠类抗血清所识别的区域，进行SPOTScan测定法。在纤维素膜上合成跨越该蛋白质序列的一组重叠肽，将其与1:100稀释的血清混合物一起温育。抗原-抗体反应通过下述方式来检测：与缀合物抗鼠类IgG-碱性磷酸酶一起温育，随后添加包含底物溴-氯-吲哚基-磷酸酯的溶液。

观察到几个在该蛋白质内存在的共有的抗原性区域，与用于免疫接种的制剂无关(数据未显示)。然而，在用佐以弗氏佐剂的该蛋白质进行免疫接种的组中存在广泛得多的识别模式。

实施例10.人类血清对于蛋白质NMB0938的识别。

在这个研究中使用来自恢复期个体的人类血清的集合，所述研究通过ELISA来进行。平板用通过制备型电泳获得的蛋白质NMB0938(5μg/ml)进行包被。用在包含Tween-20的PBS中的3％脱脂奶粉封闭平板后，将血清在相同溶液中进行稀释(1:50)并在平板中进行温育。如已广泛报告的，进行免疫测定法。将健康供体血清用作阴性对照。此外，将来自用针对乙型肝炎的重组疫苗进行疫苗接种的个体的血清混合物用作无关对照(数据未显示)。

图11显示了在这个测定法中使用5种恢复期的血清而获得的结果。可以看出，人类血清识别该蛋白质，这表明它在脑膜炎球菌感染期间表达，并且它是免疫原性的。

实施例11.蛋白质NMB0938作为肽的载体。

为了证实重组蛋白质NMB0938的载体能力，使其与15聚体的合成肽缀合，所述合成肽来源于HIV-1(分离物JY1)的gp120蛋白的V3区域。缀合通过戊二醛法来进行。在3-剂程序表中，将游离的JY1肽、重组蛋白质NMB0938和缀合物JY1-NMB0938施用给成年小鼠，其中免疫原由弗氏佐剂进行乳化。在第3剂后2周，从经免疫的动物中获得血清样品，并且通过ELISA来分析样品以测定抗-肽抗体的滴度。为此，平板用游离肽(20μg/ml)进行包被，并且如先前已描述的来进行免疫测定法。该实验的结果(图12)显示了蛋白质NMB0938的载体能力，其在缀合后能够显著增强针对肽JY1的抗体应答。

实施例12.在通过粘膜途径用蛋白质NMB0938进行免疫接种后诱导的免疫应答的评估。

为了评估蛋白质NMB0938的免疫原性，设计并在小鼠中进行免疫接种实验，其中施用包囊到脂质体中或佐以脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖的蛋白质NMB0938。如先前所描述的(Carmenate T等人，(2001).Recombinant Opc protein from Neisseria meningitidisreconstituted into liposomes elicits opsonic antibodiesfollowing immunization.Biotechnol.Appl.Biochem.34：63-69)，通过脱水-再水化来获得脂质体。使用这2种制剂，对于雌性Balb/C小鼠(8-10周龄)进行免疫接种。经鼻内途径施用3剂(每剂50μg)，每2次之间间隔15天。为了分析在粘膜水平上的免疫应答，在经免疫的动物的肺灌洗液中测量IgA抗体水平。在图13中显示了在所分析的2个组中检测到的IgA抗体的水平。

序列表

<110>Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

<120>包含蛋白质NMB0938的药物组合物

<130>PROTEINA NMB0938

<140>

<141>

<160>9

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：Oligo 0938U

<400>1

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：Oligo 0938L

<400>2

<210>3

<211>837

<212>DNA

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(B群)

<400>3

<210>4

<211>278

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(B群)

<400>4

<210>5

<211>837

<212>DNA

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(B群)

<400>5

<210>6

<211>837

<212>DNA

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(B群)

<400>6

<210>7

<211>837

<212>DNA

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(B群)

<400>7

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：Oligo 1573

<400>8

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：Oligo 6795

<400>9

Claims (17)

1.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含标识为Seq.ID.No4的蛋白质NMB0938。

2.根据权利要求1的药物组合物，其用于预防或治疗由奈瑟氏球菌属的细菌引起的感染。

3.根据权利要求1的药物组合物，其用于预防或治疗由脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌引起的感染。

4.根据权利要求1的药物组合物，其中蛋白质NMB0938在药学上可接受的赋形剂中以0.5-100μg/剂的范围存在。

5.根据权利要求4的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物任选地包含疫苗佐剂。

6.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物另外还包含通过重组、合成或天然方式获得的一种或多种具有不同性质的抗原。

7.根据权利要求6的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含多糖抗原，包括细菌多糖。

8.根据权利要求7的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖。

9.根据权利要求6的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含蛋白质-多糖缀合物，其中多糖组分是细菌多糖。

10.根据权利要求6的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含肽抗原。

11.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是疫苗，其能够在受体生物中产生针对由奈瑟氏球菌属的细菌引起的感染的保护性应答。

12.根据权利要求11的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是疫苗，其能够在受体生物中产生针对由脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌引起的感染的保护性应答。

13.根据权利要求1的药物组合物，其用于通过肠胃外或粘膜途径施用。

14.根据权利要求1的药物组合物，其特征在于，单独地、与其他抗原相组合或融合地将蛋白质NMB0938用作免疫增强剂或载体。

15.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含抗原蛋白质NMB0938的片段或模拟肽，和药学上可接受的赋形剂。

16.用于诊断由奈瑟氏球菌属的细菌引起的感染的方法，其包括在来自个体的生物样品中以独立的形式或与其他组分相组合地检测蛋白质NMB0938或其片段。

17.用于诊断由奈瑟氏球菌属的细菌引起的感染的方法，其包括在来自个体的生物样品中以独立的形式或与其他组分相组合地检测编码蛋白质NMB0938的基因，该基因被标识为Seq.ID.No 3。

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