ES2217325T3 - Procedimientos mejorados de produccion de vacunas polivalentes en subunidades de proteosomas complejadas de forma no covalente. - Google Patents
Procedimientos mejorados de produccion de vacunas polivalentes en subunidades de proteosomas complejadas de forma no covalente.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR VACUNAS DE DETERMINANTES ANFIFILICOS Y PROTEOSOMAS MULTIVALENTES, ADECUADAS PARA LA ADMINISTRACION PARENTERAL O MUCOSICA UTILIZANDO LA TECNOLOGIA DE LA DIAFILTRACION O LA ULTRAFILTRACION. LOS DETERMINANTES ANFIFILICOS INCLUYEN LIPOPOLISACARIDOS PROCEDENTES DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS, POR EJEMPLO S. FLEXNERI, P. SHIGELLOIDES Y S. SONNEI. LOS PROTEOSOMAS SE OBTIENEN A PARTIR DE MENINGOCOCOS DEL GRUPO B DEL TIPO 2B. LOS COMPLEJOS ACTIVOS DE PROTEOSOMAS - DETERMINANTE ANFIFILICO (COMPLEJOS UNIDOS DE FORMA NO COVALENTE) DE LA VACUNA SE FORMAN UTILIZANDO DIAFILTRACION O ULTRAFILTRACION PARA ELIMINAR EL DETERGENTE. EL USO DE LA DIAFILTRACION O LA ULTRAFILTRACION DISMINUYE EL TIEMPO DE PROCESAMIENTO Y LA OPORTUNIDAD DE CONTAMINACION, Y ADEMAS PERMITE EL USO DE LA TEMPERATURA AMBIENTE Y UN EFICAZ AUMENTO DE LA ESCALA. ADEMAS, EL PROCEDIMIENTO PERMITE EL CONTROL CONTINUO Y FIABLE DEL DIALIZADO, LO CUAL AUMENTA LA EFICACIA DEL PROCEDIMIENTO COMPLETO. EL TIEMPO DE DIALISIS PARA LA PRODUCCION DE UN LOTE DE VACUNAS SE REDUCE DESDE > 7 - 10 DIAS A MENOS DE 72 HORAS Y HABITUALMENTE A MENOS DE 48 O 24 HOTAS. EL USO DEL PROCEDIMIENTO OPTIMIZA LA PRESENCIA DE CADA COMPONENTE ANTIGENICO EN LA PREPARACION DE VACUNAS MULTIVALENTES.
Description
Procedimientos mejorados de producción de vacunas
polivalentes en subunidades de proteosomas complejadas de forma no
covalente.
Esta invención está relacionada con métodos de
producción y composiciones de vacunas multivalentes de proteosomas
acomplejados no covalentemente para administración mucosal y
parenteral.
Con el fin de que las vacunas de subunidades
multivalentes estimulen respuestas inmunes óptimas hacia cada uno
de los componentes, los componentes adecuados deben estar asociados
apropiadamente y cada uno de ellos debe estar disponible para el
sistema inmune a fin de que puedan ser reconocidos y procesados
eficazmente por las células del sistema inmune. Ejemplos principales
de tales vacunas acomplejadas no covalentemente incluyen vacunas de
proteosomas que pueden constar de proteosomas de proteínas de la
membrana externa de Neisseria acomplejados no covalentemente
con una amplia variedad de antígenos, incluyendo péptidos,
lipopéptidos, proteínas transmembranales o proteínas convertidas en
toxoides, polisacáridos o lipopolisacáridos (LPS) (solicitudes de
patente n^{os} 07/065.440 registrada el 23 de Junio de 1987
"Immunogenic peptide vaccines and methods of preparation";
07/336.952 registrada el 12 de Abril de 1989 "Immunopotentiating
system for large proteins and polypeptides"; 07/958.426
registrada el 8 de Octubre de 1992 "Oral or Intranasal Vaccines
Using Hydrophobic Complexes Having Proteosomes and
Lipopolysaccharides"; 08/029.666 registrada el 11 de Marzo de
1993 "Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic
Materials"; 08/143.365 registrada el 29 de Octubre de 1993
"Immunopotentiating Systems for Preparation of Immunogenic
Materials"; 93/10.402 registrada el 29 de Octubre de 1993
"Submicron Emulsions as Vaccine Adjuvants"; 08/063.613
registrada el 18 de Mayo de 1994 "Solid Fat Nanoemulsions as
Vehicles for Vaccine Delivery" y las publicaciones Orr, N.,
Robin, G., Cohen, D., Arnon, R. Lowell, G.H. (1993).
"Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigella
flexneri 2a and Shigella sonnei
Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal
Models". Infect. Immun. 61:2390; Mallett, C.P., T.L. Hale, R.
Kaminski, T. Larsen, N. Orr, D. Cohen y G.H. Lowell. 1995.
"Intranasal or intragastric immunization with
proteosome-Shigella lipopolysaccharide vaccines protect
against lethal pneumonia in a murine model of shigellosis".
Infect. Immun. 63:2382-2386; Lowell, G.H.,
Kaminski, R.W., Grate, S. y col. (1996) "Intranasal and
intramuscular proteosome-staphylococcal enterotoxin
B (SEB) toxoid vaccines: immunogenicity and efficacy against lethal
SEB intoxication in mice". Infect. Immun.
64:1706-1713; Lowell, G.H. (1990) "Proteosomes,
Hydrophobic Anchors, Iscoms and Liposomes for Improved Presentation
of Peptide and Protein Vaccines, en New Generation Vaccines:
G.C. Woodrow and M.M. Levine, eds., (Marcel Dekker, NY). Capítulo
12 (pp. 141-160) y Lowell, G.H., W.R. Ballou, L.F.
Smith, R.A. Wirtz, W.D. Zollinger y W.T. Hockmeyer. 1988.
"Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of
immunogenicity for malaria CS peptides. Science 240:800.
Ruegg, C.L. y col., 1990 (Journal of
Immunological Methods, Vol. 135: 101-109) describen
la preparación de vacunas basadas en proteosomas. Lowell, G.H. y
col., 1988 (Science 240: 800-802) describen vacunas
de proteosoma-lipopéptido y el incremento de la
inmunogenicidad de péptidos CS de la malaria. Lowell, G.H. y col.,
1988 (Journal of Experimental Medicine, Vol. 167:
658-663) describen que péptidos unidos a proteosomas
a través de pies hidrofóbicos resultan altamente inmunogénicos sin
adyuvantes.
Para la aplicación práctica de la administración
de vacunas con el fin de proteger frente a una enfermedad, es
necesario frecuentemente administrar varios de tales antígenos al
mismo tiempo debido normalmente al hecho de que los individuos son
susceptibles a contraer enfermedades causadas por una variedad de
organismos. Además, varios organismos, estén o no relacionados entre
sí, son a menudo endémicos en el mismo lugar y por tanto los
individuos que requieren protección pueden necesitar una vacunación
con varios tipos de vacunas.
En el pasado, la producción de vacunas que
requerían la formación de complejos no covalentes de sus
componentes se ha realizado utilizando una diálisis simple en la
que los componentes son colocados en el tubo de diálisis en
presencia de un detergente dializable y la mezcla es dializada
durante 7-10 días para intentar extraer el
detergente. Las desventajas prácticas de este sistema tienden a
impedir gravemente el desarrollo avanzado y la comercialización de
esta tecnología por varias razones, incluyendo 1) Tiempo: Duración
del procedimiento: La necesidad de utilizar recursos de GMP durante
semanas mientras la vacuna se está dializando es poco práctica
debido al exceso de los costes implicados y a la probabilidad
incrementada de degradación o contaminación de los componentes
mecánicos o biológicos durante este extenso periodo de tiempo; 2)
Contaminación: Probabilidad de contaminación incrementada: El tubo
de diálisis es difícil de esterilizar, el tubo de diálisis requiere
la apertura y el cierre manual del sistema, exponiendo de este modo
los componentes a contaminación durante el proceso de carga y
descarga. Como transcurren muchos días entre la carga y la descarga
del tubo, el riesgo de una pequeña contaminación en los días
iniciales del proceso puede ser fácilmente aumentado durante los
muchos días de diálisis, haciendo que este método no sea útil para
la fabricación práctica de una vacuna. El riesgo de perforar la
bolsa puede tener como resultado una pérdida de producto; 3)
Temperatura: Necesidad de realizar la diálisis a 4ºC debido al
largo tiempo implicado; 4) Volumen de los fluidos de diálisis: Con
el fin de fabricar la vacuna para la ampliación a escala del
proceso, sería necesaria la utilización de cantidades masivas de
fluido de diálisis, ya que se requiere típicamente una proporción de
200:1 de líquido en el exterior del tubo de diálisis con respecto
al líquido en el interior del tubo de diálisis. Por tanto, por
ejemplo, la producción de un lote piloto de dos litros de vacuna
requeriría 400 litros de fluido fuera del tubo por día -4.000 litros
en 10 días- y la producción de un lote de producción de
20-200 litros requeriría
40.000-4.000.000 de litros. Estas cantidades son
antieconómicas y poco prácticas en comparación con el método
utilizado en la presente invención. El tubo de diálisis no es
escalable ya que grandes cantidades de producto son problemáticas y
5) Incapacidad para medir fácilmente la finalización de la
extracción del detergente a fin de maximizar la eficacia de la
vacuna. Como la bolsa de diálisis está colocada en un recipiente
con 200 volúmenes de tampón, la medida de la eliminación de
detergente en curso no es ni práctica ni factible y 6) Además, no
se ha descrito ningún método para medir la presencia del detergente
utilizado en la realización preferida, Empigen BB.
El segundo problema resuelto en esta invención es
la demostración del método para producir y administrar vacunas
multivalentes. Los componentes pueden ser producidos juntos o
producidos separadamente y mezclados antes de la administración. La
presente invención demuestra la manera óptima de preparar tales
vacunas multivalentes.
El tema de la presente invención se refiere en
líneas generales a la producción y fabricación de vacunas de
proteosoma-determinante anfifílico diseñadas para
administración parenteral o especialmente para administración
mucosal incluyendo, pero sin limitarse a, administración
respiratoria (por ejemplo incluyendo administración intranasal,
intrafaríngea e intrapulmonar), gastrointestinal (incluyendo por
ejemplo administración oral o rectal) o tópica (por ejemplo
administración conjuntival u ótica) para inducir respuestas de
anticuerpos sistémicas (suero) y mucosales (incluyendo respiratorias
e intestinales). Un determinante anfifílico es una molécula que
tiene regiones hidrofóbicas e hidrofílicas que, cuando es formulada
apropiadamente con proteosomas, se alinea con los proteosomas para
formar un complejo que produce una respuesta inmunológica en un
sujeto. Determinantes anfifílicos típicos incluyen glucolípidos,
liposacáridos (incluyendo lipopolisacáridos destoxificados),
lipopéptidos, proteínas transmembranales, de la envoltura o
proteínas convertidas en toxoides, o proteínas o péptidos con
anclajes de aminoácidos hidrofóbicos intrínsecos. Estos materiales
determinantes pueden ser obtenidos de bacterias gram negativas
incluyendo escherichia, klebsiella, pseudomonas, hemophilus,
brucella, shigella y neisseria. Más específicamente, la
invención se refiere a vacunas de proteosomas en las que
preparaciones de proteosomas de proteínas de la membrana externa
meningocócica (preparadas a partir de cualquier cepa de N.
meningitidis o N. gonorrhea o de otra especie de
Neisseria) son acomplejadas no covalentemente con
lipopolisacáridos o lipooligosacáridos nativos o destoxificados de
Shigella o Neisseria con el fin de formar vacunas
diseñadas para proteger frente a enfermedades causadas por
organismos gram negativos que contengan cualquiera de las partes
componentes del complejo, incluyendo meningococos o shigellas. Más
específicamente, la invención se refiere a vacunas de proteosomas
que contienen LPS y que inducen respuestas de anticuerpos que
reconocen antígenos O polisacarídicos somáticos específicos de un
tipo de lipopolisacáridos de shigella y confieren de este
modo una protección homóloga frente a la shigellosis. Todavía más
específicamente, los lipopolisacáridos que cuando forman complejos
con proteosomas inducen tales respuestas inmunes protectoras
anti-shigella, son preparados y purificados a partir
de Shigella sonnei o Plesiomonas shigelloides para
obtener inmunidad frente a la enfermedad causada por Shigella
sonnei, a partir de Shigella flexneri 2a para obtener
inmunidad frente a la enfermedad causada por Shigella flexneri
2a, y así sucesivamente, utilizando LPS derivado de organismos
homólogos o de organismos que reaccionan de manera cruzada
antigénicamente con el fin de conferir una inmunidad homóloga
frente a la shigellosis causada por S. flexneri 2a (o
3a, etc.), S. boydii, S. sonnei, etc. Todavía
más específicamente, la presente invención describe la
administración con éxito de vacunas de proteosoma-shigella
que son multivalentes en cuanto a que dos vacunas de proteosomas
producidas independientemente que utilizan LPSs de shigella
derivados de S. flexneri 2a (para la enfermedad causada por
S. flexneri 2a) y de P. shigelloides o S.
sonnei (para la enfermedad causada por S. sonnei) son
administradas juntas, induciendo de este modo anticuerpos que
reconocen los dos organismos y confieren por ello protección frente
a los dos tipos de enfermedad. Más específicamente, la presente
invención se refiere a una vacuna de proteosoma-LPS
de Shigella en la que proteosomas de meningococos de tipo 2b
del grupo B son acomplejados con LPS de P. shigelloides
utilizando la tecnología de diafiltración en fibra hueca para
producir una vacuna administrada por vía mucosal respiratoria y/o
gastrointestinal con el fin de inducir anticuerpos que reconozcan el
antígeno O somático LPS de S. sonnei y protejan de este modo
frente a la shigellosis causada por este organismo. Se
prevee otra ultrafiltración/diafiltración convencional, por ejemplo
una membrana de plataforma y un cartucho de membrana.
La presente invención proporciona metodología
para producir vacunas acomplejadas no covalentemente de una manera
que 1) Disminuye el tiempo requerido, 2) Disminuye la oportunidad
de contaminación, 3) Incrementa la temperatura a la que tales
vacunas pueden ser producidas hasta temperatura ambiente, 4) Permite
una ampliación a escala eficaz del proceso de producción a fin de
requerir un uso mínimo de reactivos, 5) Permite una toma de muestras
del dializado fiable y eficaz con el fin de poder medir
repetidamente la tasa de eliminación del detergente para optimizar
la eficacia de la operación. Esto conduce directamente a un
incremento de la eficacia de la formación de complejos de la vacuna
para producir una vacuna con una inmunogenicidad sensiblemente mayor
a dosis más bajas. De esta forma, se incrementa significativamente
la calidad global del producto. 6) Además, se describe un método
para medir la presencia del detergente utilizado en la realización
preferida, Empigen BB. Pueden utilizarse otros detergentes
dializables en lugar de Empigen BB. Además, se ha demostrado,
utilizando el método de la presente invención, que la vacuna puede
ser liofilizada y rehidratada de tal manera que conserve su potencia
óptima como vacuna medida como inmunogenicidad de la vacuna.
El método de la presente invención implica la
utilización de un cartucho de ultrafiltración/diafiltración de
fibra hueca para efectuar la formación de complejos mediante la
extracción del detergente. Variando el tamaño del bastidor del
cartucho, puede reducirse el tiempo de diálisis para la producción
de un lote de vacuna desde >7-10 días hasta menos
de 72 horas, y normalmente hasta menos de 48 ó 24 horas. Como se
utiliza este tiempo tan corto, puede incrementarse la temperatura
de reacción desde 4º hasta la temperatura ambiente normal sin
comprometer el proceso ni la integridad de los productos. Aunque el
proceso se realizó a 20ºC aproximadamente, se contemplan
temperaturas entre 0º y 40ºC. Como el sistema es cerrado, hay un
potencial de contaminación altamente reducido. Además,
incrementando el tamaño del bastidor, puede procesarse una cantidad
de material extremadamente grande en un periodo de tiempo
relativamente corto, permitiendo de este modo un aumento a escala
del procedimiento eficaz y reproducible para su desarrollo
comercial. Además, pueden tomarse muestras del permeado
repetidamente para medir la extracción del detergente según puede
ser realizado utilizando el análisis de la presente invención para
medir la presencia del detergente Empigen BB, el detergente
utilizado en la realización preferida. La singularidad de esta
metodología necesitaba verificación experimental, ya que no era
obvio que la formación de complejos y la estructura de la vacuna en
materiales inmunogénicos que se llevó a cabo dializando lentamente
a lo largo de 7-10 días utilizando una bolsa de
diálisis estacionaria pudiera ser igualada o mejorada después de
utilizar la tecnología de fibra hueca, en la cual los restos que
van a acomplejarse se están moviendo a través de los tubos a
velocidades de flujo extremadamente elevadas en comparación con las
del tubo de diálisis estacionario.
Como puede seleccionarse el corte de peso
molecular nominal de la membrana utilizada para que sea 1.000,
3.000, 5.000, 10.000, 30.000, 50.000 o mayor, dependiendo del
tamaño de los componentes que se vayan a acomplejar no
covalentemente, este sistema es fácilmente adaptable para la
formación de complejos de lipopolisacáridos nativos o
destoxificados, lípidos, péptidos, lipopéptidos, liposacáridos,
polisacáridos, gangliósidos o proteínas transmembranales, de la
envoltura o proteínas nativas o convertidas en toxoides, entre sí o
con preparaciones de proteínas de la membrana externa meningocócica
de proteosomas.
El producto resultante puede ser utilizado como
una vacuna administrada parenteralmente o mucosalmente, esto es a
través del tracto respiratorio o gastrointestinal, por ejemplo
intranasalmente, oralmente, mediante inhalación orofaríngea,
tópicamente o rectalmente. En el ejemplo dado, se muestra que los
proteosomas son acomplejados no covalentemente con LPS de P.
shigelloides para formar una vacuna que induce las respuestas
anti-LPS de S. sonnei necesarias para la
protección frente a shigellosis por S. sonnei.
La metodología tiene tres etapas: una operación
preliminar; la formación de complejos del proteosoma con un
determinante anfifílico, por ejemplo LPS de P. shigelloides;
seguido por una filtración estéril.
Para administrar óptimamente vacunas
multivalentes, la presente invención muestra que el mejor método es
producir las vacunas específicas individualmente e inmunizar
posteriormente con las dos vacunas producidas individualmente, cada
una a la concentración óptima, en el mismo día. Se han realizado o
se contemplan también otras posibilidades tales como la producción
de vacunas híbridas durante la formación de los complejos no
covalentes.
Figura 1: Inmunogenicidad de varias preparaciones
de la vacuna de proteosoma-LPS de Plesiomonas
shigelloides: títulos de IgG anti-LPS de
Shigella sonnei en suero murino después de dos inmunizaciones
intranasales con la vacuna conteniendo 10, 1,0 ó 0,1 \mug de
proteína. DT-1 y DT-2 - tubo de
diálisis. HF-1 y HF-2 – cartucho de
fibra hueca. HF-2L - cartucho de fibra hueca y
liofilizado. GMP - buenos procedimientos de fabricación.
Figura 2: Inmunogenicidad de varias preparaciones
de la vacuna de proteosoma-LPS de Plesiomonas
shigelloides: títulos de IgA anti-LPS de
Shigella sonnei en suero murino después de dos inmunizaciones
intranasales con la vacuna conteniendo 10, 1,0 ó 0,1 \mug de
proteína.
Figura 3: Títulos de IgG sérica en ratón después
de la inmunización intranasal con las vacunas de
proteosoma-LPS de Shigella: administración
simultánea y/o secuencial de vacunas para S. sonnei y S.
flexneri 2a. El Ensayo 1 constaba de cinco ratones inmunizados
intranasalmente los días 0 y 21 con la vacuna de
proteosoma-LPS de S. sonnei (10 microgramos
de cada, proteosomas y LPS). Se extrajo sangre a los ratones cuatro
semanas después de la última inmunización. El Ensayo 2 constaba de
cinco ratones inmunizados intranasalmente los días 0 y 21 con la
vacuna de proteosoma-LPS de S. flexneri 2a
(10 microgramos de cada, proteosomas y LPS). Se extrajo sangre a los
ratones cuatro semanas después de la última inmunización. El Ensayo
3 constaba de cinco ratones inmunizados intranasalmente los días 0
y 21 con la vacuna de proteosoma-LPS de S.
sonnei (10 microgramos de cada, proteosomas y LPS) y con la
vacuna de proteosoma-LPS de S. flexneri 2a
(10 microgramos de cada, proteosomas y LPS). Se extrajo sangre a
los ratones cuatro semanas después de la última inmunización. El
Ensayo 4 constaba de cuatro ratones inmunizados intranasalmente los
días 0 y 21 con la vacuna de proteosoma-LPS de
S. sonnei (10 microgramos de cada, proteosomas y LPS) y
posteriormente los días 49 y 70 con la vacuna de LPS de S.
flexneri 2a (10 microgramos de cada, proteosomas y LPS). Se
extrajo sangre a los ratones cuatro semanas después de la última
inmunización con S. flexneri 2a. La administración de las
vacunas de proteosoma-LPS de P. shigelloides
(para la shigellosis por S. sonnei) y de
proteosoma-LPS de S. flexneri 2a juntas el
mismo día o separadas varias semanas tiene como resultado una buena
inmunogenicidad hacia ambos componentes LPS de S. sonnei y
S. flexneri 2a.
Figura 4: Micrografía electrónica de la vacuna de
proteosoma-LPS de P. shigelloides que
muestra anti-LPS de Shigella sonnei marcado
con oro asociado con proteosomas. En esta micrografía, los
anticuerpos secundarios marcados con oro (visibles como puntos
negros opacos) identifican a los anticuerpos primarios dirigidos
contra el LPS de Shigella. Como puede observarse, el LPS
está claramente asociado con las vesículas proteosómicas.
Figura 5: La vacuna de
proteosoma-LPS de P. shigelloides protege
contra la neumonía letal causada por Shigella sonnei en un
modelo animal de shigellosis. Grupos de ratones no consanguíneos
(14 a 15 por grupo) fueron inmunizados intranasalmente las semanas
cero y tres con la vacuna de proteosoma-LPS de P.
shigelloides (10 microgramos de cada, proteosomas y LPS, por 20
microlitros). A los grupos control se les administró solución salina
con la misma pauta. Todos los ratones fueron desafiados
intranasalmente con cinco a diez millones de unidades formadoras de
colonias de S. sonnei la semana siete. Los ratones fueron
observados diariamente durante dos semanas después del desafío, y se
registró la mortalidad resultante de la enfermedad pulmonar
consiguiente. Según hemos mostrado previamente, del 86 al 100% de
los ratones control murieron dentro de los cuatro días posteriores
al desafío. En ambos experimentos, el 93% de los ratones
inmunizados con la vacuna sobrevivieron al desafío (P <
0,001, Test Exacto de Fisher).
Figura 6: La inmunización intranasal u oral con
vacunas de proteosoma-LPS de Shigella flexneri
2a induce IgG e IgA anti-LPS de Shigella
en suero e IgA en fluidos procedentes de lavado intestinal y
pulmonar, que pueden durar 30-60 días tras la
inmunización.
Figura 7: Inmunización intranasal u oral de
humanos con una o dos dosis de vacunas de
proteosoma-LPS de P. shigelloides para
Shigella sonnei utilizando diferentes cantidades de vacuna:
Inducción de respuestas CSA en sangre periférica de IgA, IgG e IgM
anti-LPS de Shigella.
Figura 8: LPS en fracciones de HPLC después de la
aplicación de LPS de P. shigelloides no acomplejado y
demostración de la formación de complejos no covalentes de LPS y
proteínas proteosómicas mediante la coelución de LPS y proteínas en
las fracciones de HPLC después de aplicar la vacuna de
proteosoma-LPS de P. shigelloides.
Figura 9: Respuesta de anticuerpos bactericidas
de ratones a una vacuna de proteína de la membrana externa
meningocócica-lipooligosacárido destoxificado, media
geométrica del recíproco de los títulos frente a la cepa
meningocócica 9162.
Este ejemplo detalla la producción de una vacuna
de proteosoma-P. shigelloides conteniendo
2-3 gramos de proteína aproximadamente. El
procedimiento es igualmente aplicable para la ampliación a escala
utilizando 10-1000 veces más material, con el
incremento a escala apropiado del tamaño del bastidor del cartucho
de membrana y los incrementos apropiados de los volúmenes.
Utilizando las membranas del tamaño apropiado con cortes de peso
molecular del nivel apropiado para retener los antígenos que van a
formar los complejos, este procedimiento es igualmente aplicable
para la formación de complejos de proteosomas con otros
lipopolisacáridos nativos o destoxificados, lípidos, péptidos,
lipopéptidos, liposacáridos, polisacáridos, gangliósidos o proteínas
transmembranales, de la envoltura o proteínas nativas o convertidas
en toxoides, entre sí o con preparaciones de proteínas de la
membrana externa meningocócica de proteosomas. Empigen BB es el
detergente utilizado como ejemplo en este procedimiento; el
procedimiento es igualmente aplicable a cualquier detergente
dializable que solubilice los componentes. Este procedimiento
utiliza cartuchos de A/G Technology, pero es igualmente aplicable a
cualquier sistema de ultrafiltración/ diafiltración de tipo
cartucho de cualquier marca.
5.0.0.1. Esterilizar por filtración una solución
madre de Empigen BB al 30%, que es el detergente utilizado en este
proceso.
5.0.0.2. Preparar TEEN 2x/Empigen 2% (Tris 0,1 M,
EDTA disódico 0,02 M, cloruro de sodio 0,3 M, WFI y Empigen 2%, pH
8,0).
5.0.0.3. Preparar 150 l de una solución de TNS
(Solución Salina Normal con Tris) conteniendo Tris 0,05 M, cloruro
de sodio 0,15 M, pH 8,0, para extraer el detergente mediante
diálisis.
5.0.0.4. Preparar 10 litros de hidróxido de sodio
para la limpieza del cartucho UF.
5.0.0.5. Descongelar la cantidad requerida de
lipopolisacárido (LPS) de Shigella flexneri 2a.
5.0.1.6. Añadir un volumen igual de tampón TEEN
2x al volumen de LPS y mezclar bien.
5.0.1.7. Descongelar y medir una cantidad del
volumen de proteosomas, en mg, igual a la cantidad de LPS
descongelado en la Etapa 5.
5.0.1.8. Añadir a los proteosomas 30 ml de
Empigen esterilizado por filtración por litro. Mezclar bien y
combinar con el LPS de la Etapa 5.
5.0.1.9. Mezclar bien ambos componentes.
Normalmente es adecuada una combinación de 15 minutos en una placa
agitadora y barra de agitación.
5.0.1.10. Para extraer el detergente mediante
diálisis de tal manera que puedan formarse los complejos de
proteosomas, montar un sistema de ultrafiltración (basado en la
tecnología de flujo tangencial) utilizando un cartucho de fibra
hueca con un tamaño de poro de corte de peso molecular nominal
(NMWC) de 10.000, fabricado por A/G Technology, Inc., conectado a
un tubo de silicona esterilizado y a una bomba peristáltica. Se
colocan medidores de presión sanitarios en el lado de entrada y de
salida del cartucho para monitorizar la presión a lo largo de todo
el proceso. Se coloca una válvula de contrapresión en el lado de
salida del cartucho para ajustar la contrapresión.
5.0.1.11. El sistema de ultrafiltración es
limpiado e higienizado con WFI y NaOH 0,5 N a una temperatura de
50ºC durante un tiempo mayor de 60 minutos. Este sistema es lavado
abundantemente con WFI y equilibrado con tampón TNS antes de su
utilización.
5.0.1.12. Se coloca en línea un recipiente
reservorio estéril de tal manera que el líquido de entrada sea
extraído del recipiente y el retentado de retorno vuelva al mismo
recipiente. A medida que el líquido pasa a través de la membrana del
cartucho (permeado o filtrado) es rellenado con tampón TNS ya sea
por adición directa o mediante un sistema de alimentación continua.
Montar un sistema de alimentación continua conectando un tubo de
silicona desde un recipiente que contenga tampón TNS hasta el
reservorio de muestra que es luego cerrado herméticamente. Cuando el
líquido es extraído por filtración del reservorio de muestra, se
crea un vacío que hace que el tampón "TNS" sea extraído de su
recipiente y llevado al reservorio de muestra. Si el sistema
permanece hermético, el nivel de muestra en el reservorio
permanecerá constante.
5.0.1.13. Poner en funcionamiento la bomba de
recirculación para comenzar la diafiltración. Ajustar la velocidad
de la bomba y la válvula de contrapresión para obtener una
contrapresión de 15 \pm 4 psi.
5.0.1.14. Verificar la extracción progresiva de
Empigen BB mediante el análisis de muestras de permeado tomadas
cada 10-15 litros, utilizando el Empigen Precipitin
Test. Este análisis consiste en realizar diluciones seriadas del
permeado y de una solución estándar que contiene una cantidad
conocida de Empigen BB, añadir HCl para acidificar las soluciones y
añadir posteriormente diluciones seriadas de SDS (dodecil sulfato
de sodio) para constituir un ensayo del tipo tablero de ajedrez. Se
formará un precipitado máximo cuando estén presentes cantidades
equivalentes de Empigen y SDS. De esta forma, puede cuantificarse
la cantidad de Empigen presente anotando la dilución del SDS, de
los permeados y de los estándares a la que se forma el máximo
precipitado. A medida que progresa la diafiltración, disminuye la
cantidad de Empigen y el tubo que contenga menos SDS será el tubo
con el precipitado máximo. La presencia de precipitado es
cuantificada midiendo la D.O. a 600 nm utilizando un
espectrofotómetro.
5.0.1.15. Para la cantidad de los componentes
utilizada en este ejemplo, continuar la diafiltración hasta que se
hayan procesado al menos 120 litros de permeado y haya una ausencia
de precipitado significativa en el Empigen Precipitin Test (cuando
la D.O. a 600 nm sea menor de 0,05).
5.0.1.16. Una vez que se haya completado la
diálisis, concentrar el producto hasta un volumen final para
conseguir un valor de la D.O._{280} próximo a 6,0. Drenar el
sistema y lavar con 300-400 ml de tampón "TNS".
Drenar de nuevo el sistema y combinar ambos lavados. Limpiar el
cartucho haciendo recircular grandes cantidades de WFI, seguido por
NaOH 0,5 N a 50ºC durante >60 minutos. Eliminar el NaOH mediante
lavado con WFI y almacenar el sistema en NaOH 0,01 N.
5.0.2.17. Los complejos pueden ser, si se desea,
esterilizados por filtración. La concentración de proteosomas puede
ser ajustada antes o después de la filtración por 0,22 \mu. La
esterilización por filtración se realiza normalmente con unidades
de filtros de Millipore Corp. Estas unidades son denominadas
Millipaks y vienen en varios tamaños. El volumen filtrado es
almacenado a 4ºC hasta la operación de llenado y se analiza para
determinar su esterilidad.
5.0.3.0. Finalidad específica: combinar
bajo gmp las preparaciones no envasadas de proteínas proteosómicas
de la membrana externa meningocócica y el lipopolisacárido de S.
flexneri 2a para dar complejos no covalentes mediante la
extracción del detergente.
5.0.3.1. Aplicaciones: este procedimiento
de gmp tiene como resultado la producción de una preparación no
envasada para la formación de complejos no covalentes de
proteosomas con lipopolisacárido de S. flexneri 2a para
utilización como vacuna contra la infección por S. flexneri
2a.
Formación de complejos no covalentes de proteínas
(proteosomas) de la membrana externa purificadas de Neisseria
meningitidis cepa 9162 en grandes cantidades con
lipooligosacárido L8 de N. meningitidis purificado de la
cepa 8532 y destoxificado con álcali.
5.1.0. Se tomaron del depósito la proteína de la
membrana externa de 9162 (proteosomas) no envasada, lote 0136, y el
lipooligosacárido (LOS) L8 meningocócico destoxificado no envasado,
lote 0203, y se descongelaron a temperatura ambiente. Se combinó un
volumen (182 ml) del LOS no envasado que contenía 500 mg de LOS en
agua destilada estéril con un volumen (306 ml) de proteosomas no
envasados conteniendo 400 mg de proteína en un tampón que contenía
Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M, EDTA 0,01 M y un 0,1%
de Empigen BB.
5.1.2. El Empigen BB (solución al 30%) fue
esterilizado por filtración a través de un filtro de 0,22 \mum de
tamaño de poro y se añadió un volumen de 1/60º a la solución
combinada de proteosomas y LOS y se agitó a temperatura ambiente
durante 1 hora.
5.1.3. La solución tampón con detergente fue
extraída de la solución de proteosomas y LOS y sustituida por agua
destilada estéril mediante ultrafiltración utilizando un cartucho
de ultrafiltración
UFP-3-C-6 de A/G
Technology con un tamaño de poro de corte de peso molecular
3000.
5.1.4. El procedimiento de montaje,
higienización, lavado y limpieza del aparato fue el mismo que el
descrito en el Ejemplo 1. La presión de entrada fue de 15 \pm 4
psi y la velocidad de flujo del permeado fue de 175 ml por
minuto.
5.1.5. El permeado fue analizado después de cada
3 a 4 litros para determinar la presencia del detergente Empigen BB
mediante el método de precipitación descrito en el Ejemplo 1. La
ultrafiltración continuó hasta que no se obtuvo precipitado en el
ensayo más 5 litros adicionales. Se recogieron un total de 37 litros
de permeado.
5.1.6. El retentado era claro y fue esterilizado
por filtración a través de un filtro de 0,22 \mum de tamaño de
poro, analizado para determinar proteína y LOS y almacenado como un
producto sin envasar a 4ºC.
5.1.7. El producto sin envasar fue diluido hasta
una concentración de 0,2 mg de proteína por ml y se ajustó la
concentración de NaCl a 0,15 M. Se añadió como conservante
timerosal al 0,01% y el volumen resultante fue repartido bajo
condiciones estériles en viales contenedores finales, marcado y
almacenado a -70ºC.
5.1.8. Este producto fue analizado en ratones
para determinar su inmunogenicidad cuando era administrado como una
solución salina y adsorbido a un gel de hidróxido de aluminio como
adyuvante. Los resultados están presentados en la Tabla 1 siguiente
y muestran que los complejos vacunales eran inmunogénicos cuando se
administraban i.p. a ratones.
| Vacuna | Dosis | Adyuvante | Día 0 | Día 28 | Día 42 |
| proteosomas-dLOS | 1 \mug | Ninguno | <8 | <8 | 16 |
| Lote 0271 | |||||
| 3 \mug | Ninguno | <8 | <8 | 128 | |
| 10 \mug | Ninguno | <8 | <8 | 512 | |
| proteosomas-dLOS | 1 \mug | Al(OH)_{3} | <8 | <8 | 512 |
| Lote 0271 | |||||
| 3 \mug | Al(OH)_{3} | <8 | <8 | 512 | |
| 10 \mug | Al(OH)_{3} | <8 | 64 | 2048 | |
| Nota: La vacuna fue administrada intraperitonealmente los días 0 y 28 a grupos de diez ratones | |||||
| no consanguíneos CD-1. |
5.1.9. La formación de complejos entre los
proteosomas y el LOS fue verificada mediante cromatografía en
columna de los componentes proteosomas y LOS antes y después de la
formación de los complejos (Figura 9). El análisis cromatográfico
del LOS L8 meningocócico no envasado y de los complejos finales
proteosomas/LOS se realizó en una columna de Sefacril S300 a baja
presión. La columna fue procesada con tampón
Tris-HCl 0,05 M, EDTA 0,01 M, NaCl 0,15 M. El ensayo
para determinar proteínas fue midiendo la absorbancia a 280 nm, y
el ensayo para determinar LOS fue por inhibición de un ELISA
(ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido) en el que un
anticuerpo monoclonal hacia L8 que se unía a LOS L8 purificado
adsorbido a la placa de plástico era inhibido por diluciones
seriadas de las fracciones que salían de la columna de Sefacril.
Antes de la formación de los complejos el LOS salía de la columna
en un pico ancho centrado en la fracción 39. Después de la
formación de los complejos, el LOS coeluía con los proteosomas en
un pico centrado aproximadamente en la fracción 33.
5.1.10. Finalidad específica: combinar
bajo gmp preparaciones no envasadas de proteínas de la membrana
externa meningocócica (proteosomas) y lipopolisacárido
meningocócico destoxificado para dar complejos no covalentes
mediante la extracción del detergente.
5.1.11. Aplicaciones: este procedimiento
de gmp tiene como resultado la producción de una preparación no
envasada para la formación de complejos no covalentes de
proteosomas con lipopolisacárido meningocócico destoxificado para
utilización como vacuna contra la infección por N.
meningitidis (meningocócica).
Este ejemplo está dirigido también a la
producción de una vacuna de proteosoma-P. shigelloides. El
procedimiento es igualmente aplicable para la ampliación a escala
utilizando 10-1000 veces más material con el aumento
a escala apropiado del tamaño del bastidor del cartucho de la
membrana y con los incrementos apropiados de los volúmenes.
5.8.1. Preparación de 25 ml de Empigen BB
Esterilizado por Filtración (Solución al 30%).
5.8.1.1. Utilización de una unidad de filtración
desechable Nalgene de 100 ml con un filtro de membrana de un tamaño
de poro de 0,2 \mu para esterilizar por filtración 25 ml
aproximadamente de Empigen BB (solución al 30%).
5.8.2. Preparar 4 l de TEEN 2x con un 2% de
Empigen BB (que consta de Tris 0,1 M, EDTA disódico 0,02 M, cloruro
de sodio 0,3 M, WFI y una solución al 2% de Empigen BB).
5.8.3. Preparar 10 l de una solución de
"TNS" quince veces para un total de 150 litros: El TNS consta
de cloruro de sodio 0,15 M, tampón Tris 0,05 M pH 8,0 \pm
0,2.
5.8.4. Preparar 10 litros de hidróxido de sodio
0,5 N.
5.8.6. Si es necesario, descongelar el
lipopolisacárido (LPS) de P. shigelloides no envasado con el
fin de prepararlo para la formación de complejos con los
proteosomas y registrar el número de lote y la concentración del
LPS, la cantidad requerida de LPS en mg y el volumen calculado de
LPS a extraer.
5.9.1.2. Agrupar las alícuotas del LPS no
envasado en una botella de 5 l limpia, estéril, calibrada. Medir el
volumen total y determinar la cantidad total de LPS.
5.9.1.3. Añadir un volumen de tampón TEEN 2x
igual al volumen de LPS utilizado en la etapa 5.9.1.2, medir el
volumen total combinado y añadir luego una barra de agitación y
mezclar con la combinación de barra de agitación y placa agitadora
durante 15 \pm 2 minutos.
5.9.2.1. Registrar el tiempo total, si es que lo
hay, en el que se dejó descongelar a los proteosomas.
5.9.2.2. Agrupar las alícuotas de los proteosomas
no envasados en una probeta graduada de 1 l limpia, estéril. Medir
el volumen total y determinar la cantidad total de proteosomas.
5.9.2.3. Transferir desde la probeta de la etapa
5.9.2.2 a otra probeta graduada de 1 l limpia, estéril, un volumen
de proteosomas conteniendo la cantidad en mg igual a la cantidad en
mg de LPS utilizada en la etapa 5.9.1.2.
5.9.2.4. Añadir a la probeta que contiene los
proteosomas Empigen BB al 30% filtrado por 0,22 \mu utilizando 30
ml de Empigen por l de proteosomas. Mezclar con una barra de
agitación durante 15 \pm 2 minutos.
5.9.3.1. Bajo agitación suave con una barra de
agitación, añadir los proteosomas de la etapa.
5.9.3.2. a la botella de 5 l graduada con el LPS
y agitar durante 15 \pm 2 minutos.
5.9.3.3. Retirar cuatro muestras de 1 ml y
almacenar a -75ºC para la medida posterior de la concentración de
proteínas mediante el método de Lowry y de LPS mediante el ensayo
KDO.
5.9.4.1. Detalles del Sistema de Ultrafiltración:
cartucho de fibra hueca de A/G Technology, Inc., cartucho de
ultrafiltración de 10.000 NMWC de tamaño de poro, tamaño de
bastidor 6.
Nota: Es necesario acondicionar nuevos cartuchos
para hacer pasar glicerol. Esto puede ser realizado lavando
abundantemente con 6 litros de WFI los cartuchos de 6 pies
cuadrados o menos sin contrapresión. La solución de permeado no debe
ser reciclada hacia el reservorio de alimentación.
Nota: Todas las etapas de ultrafiltración deben
ser seguidas por etapas de limpieza, higienización y
almacenamiento. Los cartuchos nuevos deben ser limpiados e
higienizados antes de su utilización.
5.9.4.2. Montar e higienizar el sistema de
ultración A/G. Limpiar e higienizar el sistema mediante la
recirculación durante un mínimo de 60 minutos de 2-3
litros de hidróxido de sodio 0,5 N a una temperatura inicial de 50
\pm 5ºC. Lavar el sistema con 4-5 litros de WFI
seguido por la recirculación de 2-3 litros de
"TNS" (tampón Tris 0,05 M/solución salina normal pH 8,0 \pm
0,2), durante al menos 20 \pm 5 minutos.
5.9.4.3. Medir el volumen de retención del
sistema de UF (incluyendo los tubos) transfiriendo los tubos de
entrada y salida llenos con líquido desde el reservorio a una
probeta graduada de 1 litro, bombeando posteriormente hasta que el
sistema de UF se vacíe.
5.9.4.4. Colocar un recipiente de 2 litros con
brazos laterales en una cubeta y cubrir el recipiente con una masa
compacta de hielo húmedo durante la duración del procedimiento de
diafiltración.
5.9.4.5. Transferir 1,7-1,9 l de
la mezcla proteosoma-LPS sin envasar de la etapa
5.9.3.3 al recipiente de 2 l con brazos laterales. Colocar un tapón
de dos orificios que lleve acopladas dos pipetas de 10 ml sobre el
recipiente y conectar los tubos de entrada y salida del sistema de
diafiltración a las pipetas del recipiente.
5.9.4.6. Conectar la bomba de recirculación y
ajustar la posición de la bomba a 4-6. Ajustar la
pinza de contrapresión para obtener una presión de entrada de 15
\pm 4 psi. Concentrar hasta un volumen total de 1,0 \pm 0,1 l
incluyendo el volumen de retención.
5.9.4.7. Transferir 1 \pm 0,1 l de la mezcla de
la etapa 5.9.3.3 al recipiente de 2 l con brazos laterales y
repetir la etapa 5.9.4.6.
5.9.4.8. Continuar transfiriendo como en la etapa
5.9.4.7 y concentrar como en la etapa 5.9.4.9 hasta que toda la
mezcla de proteosoma-LPS de la etapa 5.9.3.3 haya
sido transferida al recipiente de 2 l con un brazo lateral y el
volumen del retentado sea de 1,4 \pm 0,2 l, lo cual incluye el
volumen de retención.
5.9.4.10. Montar el aparato de ultrafiltración
para la alimentación continua de TNS (Tris 0,05 M, solución salina
normal) al recipiente de 2 litros de brazos laterales a medida que
el líquido es extraído a través de la membrana. Montar un
reservorio utilizando una botella de 10 litros conteniendo TNS y que
lleva ajustado un tubo que se extiende hasta el fondo de la
botella. Conectar las líneas de entrada y salida del sistema de
ultrafiltración. Conectar la bomba de recirculación y ajustar la
posición de la bomba a 4-6. Ajustar la pinza de
contrapresión para obtener una presión de entrada de 15 \pm 4
psi.
5.9.4.11. Medir la velocidad de flujo del
permeado en la unidad de UF y registrar la presión de entrada
cuando se tome la medida.
5.9.4.12. Recoger una muestra de 15 a 20 ml del
permeado cada 12 \pm 0,5 litros procesados, aplicar una marca
interna ("Permeado Nº P1, P2, P3, etc.") y registrar el
tiempo, el volumen procesado y la D.O._{600} máxima de la
muestra. Verificar la extracción progresiva del Empigen analizando
las muestras para determinar la presencia de Empigen BB utilizando
el Empigen Precipitin Test. Este ensayo consiste en la realización
de diluciones seriadas del permeado y, separadamente, de una
solución conteniendo una cantidad conocida de Empigen BB, añadiendo
HCl para acidificar las soluciones y añadiendo luego diluciones
seriadas de SDS (dodecil sulfato de sodio) para establecer un ensayo
de tipo tablero de ajedrez. Se formará un precipitado máximo cuando
estén presentes cantidades equivalentes de Empigen y SDS. De esta
forma, la cantidad de Empigen presente puede ser cuantificada
anotando las diluciones de los permeados y del SDS en las que se
forma precipitado, y comparando esas diluciones con las de los
estándares. A medida que progresa la diafiltración, la cantidad de
Empigen disminuye y el tubo que contenga menos SDS será el tubo con
el precipitado máximo. La presencia de precipitado es cuantificada
midiendo la D.O. a 600 nm utilizando un espectrofotómetro.
Para las cantidades de componentes utilizadas en
este ejemplo, continuar la diafiltración hasta que se hayan
procesado al menos 120 litros de permeado y haya una falta de
precipitado significativo en el Empigen Precipitin Test (D.O. 600
nm máxima menor de 0,05).
5.9.4.13. Concentrar el producto hasta un volumen
final de retentado de 500 \pm 50 ml, incluyendo el volumen de
retención (etapa 9.4.3). Extraer una muestra de 0,5 ml, diluir la
muestra 1:10 y medir la D.O._{280}.
5.9.4.14. La D.O. mínima deseada del retentado
concentrado es 5,7. Si la D.O. es menor de 5,7, continuar
concentrando hasta 400 \pm 50 ml incluyendo el volumen de
retención (etapa 5.9.4.3) y repetir la D.O._{280}.
5.9.4.15. Con los tubos de retentado fuera de la
solución de retentado y los tubos de salida del filtrado cerrados,
bombear lentamente en dirección inversa hasta que el cartucho y los
tubos se vacíen. Transferir el tubo de alimentación y los tubos de
retentado desde la botella de retentado a un nuevo recipiente
limpio con 350 \pm 50 ml de TNS. Invertir la bomba y recircular
lentamente el TNS durante 2-3 minutos.
5.9.4.16. Después de recircular el TNS, parar la
bomba, drenar el sistema, recoger la solución de lavado del
retentado en una probeta graduada de 1 l limpia, estéril, y medir
el volumen y la D.O._{280}.
5.9.4.17. Combinar la solución de retentado
original (etapa 5.9.4.12 ó 5.9.4.13) con la solución de lavado del
retentado (etapa 5.9.4.15) y medir el volumen final de retentado.
Almacenar el volumen de retentado a 4ºC \pm 2ºC hasta la
filtración aséptica.
5.9.4.18. Limpiar la unidad de filtración
utilizando WFI, seguido por hidróxido de sodio 0,5 N a una
temperatura inicial de 50 \pm 5ºC durante un mínimo de 60
minutos. Eliminar mediante lavado el agente de limpieza con WFI y
lavar luego abundantemente con 3-4 litros de NaOH
0,1 N como agente de almacenamiento.
Los complejos pueden ser, si se desea,
esterilizados por filtración. Obtener los complejos de proteosomas
y LPS sin envasar e inspeccionarlos para detectar la presencia de
cualquier precipitado o turbidez. Si el producto acomplejado sin
envasar está claro, filtrarlo asépticamente utilizando una unidad
de filtración de 0,22 \mu Millipak 40, en un recipiente estéril,
despirogenado. Esta etapa debe ser realizada en una campana
estéril.
5.9.6. Finalidad específica: combinar bajo
gmp las preparaciones no envasadas de proteínas proteosómicas de la
membrana externa meningocócica y lipopolisacárido de P.
shigelloides (para S. sonnei) para formar complejos no
covalentes por la extracción del detergente.
5.9.7. Aplicaciones: este procedimiento de
gmp tiene como resultado la producción de una preparación no
envasada para la formación de complejos no covalentes de
proteosomas con lipopolisacárido de P. shigelloides 2a para
utilización como vacuna contra la infección por Shigella
sonnei.
Las Figuras 1 y 2 demuestran que tres
preparaciones diferentes de vacunas de
proteosoma-LPS de shigella producidas
utilizando la técnica de diafiltración en fibra hueca (HF)
(HF-1, HF-2 y
GMP/HF-3) para extraer el detergente y facilitar la
formación de complejos, son más eficaces a la dosis ensayada más
baja, más rigurosa, que las preparaciones producidas utilizando un
simple tubo de diálisis (DT). En otras palabras, se produjeron
respuestas inmunes de IgG (Figura 1) e IgA (Figura 2) más potentes
con las vacunas producidas utilizando la tecnología de la presente
invención que con las producidas con la tecnología más antigua,
menos eficaz. Como las respuestas inmunes más potentes tienen como
resultado mejores niveles de protección, estos datos muestran
claramente que la presente invención tiene como resultado vacunas
que no sólo son más eficaces de producir sino también más potentes.
Además, las respuestas más potentes son producidas por la vacuna
cuando es administrada a la dosis más baja (0,1 \mug por dosis),
indicando de este modo que se necesitaría menos vacuna utilizando
la presente invención que la que se requeriría utilizando la
tecnología más antigua. Como la formulación de vacunas
multivalentes requiere muchos antígenos diferentes, con el fin de
minimizar la cantidad total de vacuna administrada, es muy
ventajoso el poder utilizar componentes de la vacuna que sean
eficaces a dosis más bajas. Así, la tecnología de la presente
invención para producir vacunas utilizando la tecnología de fibra
hueca impacta directamente y facilita la capacidad para formular
vacunas multivalentes que tengan un amplio rango de
especificidades. Como es ventajoso para el desarrollo comercial de
las vacunas el poder liofilizar las vacunas, nosotros estamos
satisfechos de haber descubierto que la liofilización de los
complejos vacunales de HF a partir de una solución acuosa, tenía
como resultado sorprendentemente una vacuna que producía
sistemáticamente respuestas que estaban entre las más elevadas a
todas las dosis analizadas. Por tanto, se encontró una
inmunogenicidad más elevada para IgG (Figura 1) e IgA (Figura 2)
anti-LPS cuando se administraron 0,1 \mug de
vacuna producida mediante la técnica de HF (con o sin
liofilización). Estos datos son significativos, ya que la
ampliación a escala y el procedimiento de GMP de la presente
invención utilizaron la tecnología de HF según está indicado en las
Figuras 1 y 2 por la barra de rayado cruzado que representa
GMP/HF-3.
Según se muestra en la Figura 3, la
administración de la vacuna de proteosoma-LPS de
P. shigelloides (para la shigellosis por S. sonnei) y
de la vacuna de proteosoma-S. flexneri 2a, el mismo día o
separadas varias semanas, tiene como resultado una buena
inmunogenicidad hacia ambos componentes LPS: LPS de S.
sonnei y LPS de S. flexneri 2a.
La asociación de LPS de Shigella con
proteosomas está representada claramente y espectacularmente en la
micrografía electrónica mostrada en la Figura 4. En esta figura,
las vesículas proteosómicas están cubiertas por manchas negras
radiopacas. Estas manchas son esferas de oro unidas a anticuerpos
secundarios que reconocen a anticuerpos específicos
anti-LPS de Shigella. Por tanto, la presencia
de manchas de oro indica la presencia de LPS de Shigella.
Como, según puede observarse, las manchas de oro rodean y puntean
las vesículas proteosómicas, se confirma y se visualiza de este modo
la imagen de las vacunas de proteosomas con LPS unido no
covalentemente a los proteosomas. Sorprendentemente, no se encontró
la naturaleza vesicular consistente de las vacunas producidas con
la tecnología de HF de la presente invención cuando se examinaron
mediante microscopía electrónica las preparaciones de DT que
utilizaron la tecnología más antigua (resultados no
publicados).
Como puede observarse en la Figura 5, la vacuna
de proteosoma-LPS de P. shigelloides
confiere consecuentemente una protección muy significativa frente a
la infección letal con P. shigelloides según se midió en un
modelo animal de shigellosis, en el cual los animales son
desafiados con organismos vivos para inducir neumonía letal. Estos
datos demuestran también que no solamente se producen los
anticuerpos correctos y protectores por la administración de vacuna
de proteosoma-LPS de P. shigelloides, sino
que también esta vacuna subunidad intranasal puede proteger frente
a la neumonía letal.
Según se muestra en la Figura 6, dos
inmunizaciones con las vacunas de proteosoma-LPS de
Shigella flexneri 2a inducen anticuerpos en suero y en las
secreciones pulmonares e intestinales que pueden durar de 30 a 60
días después de la inmunización. Estos datos demuestran que las
vacunas de proteosomas pueden estimular el sistema inmune mucosal
común para que secrete anticuerpos específicos incluso en lugares
distantes del sitio de inmunización. Específicamente, la
inmunización intranasal puede inducir anticuerpos en las secreciones
intestinales y viceversa. Esta capacidad amplía la utilidad
potencial de las vacunas de proteosomas para proteger frente a
patógenos que invaden al huésped a través de los portales mucosales
de entrada al organismo.
5.14. La Figura 7 muestra la inducción de
respuestas de IgA, IgG e IgM anti-LPS de
Shigella producidas por CSA de sangre periférica, y de
respuestas de anticuerpos IgA e IgG en suero, saliva y orina,
después de la inmunización intranasal u oral de voluntarios humanos
con una o dos dosis de las vacunas de
proteosoma-LPS de P. shigelloides para
Shigella sonnei utilizando diferentes cantidades de vacuna.
Según se muestra, la inmunización intranasal produjo respuestas de
manera dependiente de la dosis, induciendo la dosis más alta
respuestas en los seis voluntarios.
Se produjeron respuestas de IgA, IgG e IgM en
suero en cada uno de los grupos intranasales. Además, se indujeron
potentes respuestas de células secretoras de anticuerpos (CSA),
indicando que la inmunización mucosal estimulaba el tráfico de
células secretoras de anticuerpos – muy particularmente de células
secretoras de IgA. Y lo que es más importante, se encontraron
también respuestas de IgA en muestras de saliva y, especialmente,
de orina, indicando que la IgA secretada había sido producida en
superficies mucosales (como la IgA no pasa a través del riñón, la
IgA urinaria refleja la secreción local de anticuerpo y sugiere que
tales vacunas intranasales producen también IgA intestinal local, y
que las vacunas intranasales podrían ser utilizadas para proteger
frente a las infecciones del tracto urinario causadas por organismos
gram negativos). Es digno de mención el que la mayoría de estas
respuestas de CSA y anticuerpos fueron encontradas después de
solamente una inmunización, sugiriendo que pueda no ser necesaria
una inmunización de refuerzo. Se encontraron también CSAs de IgA e
IgG, así como IgA en orina, después de la inmunización oral. La
utilización más eficaz de la administración oral puede ser como
inmunización de refuerzo después de la estimulación nasal, si es
necesario.
5.15. En la Figura 8 se muestra la demostración
de la formación de complejos no covalentes entre las proteínas
proteosómicas multimoleculares y el LPS. La gráfica muestra el LPS
en fracciones de HPLC después de la aplicación de LPS de P.
shigelloides no acomplejado, el cual se encuentra en una parte
diferente del perfil de elución de la columna que cuando se aplica
la vacuna de proteosoma-LPS. Se muestra la
coelución de LPS y proteínas en las fracciones de HPLC después de
la aplicación de la vacuna de proteosoma-LPS de
P. shigelloides, con picos que corresponden a los agregados
de proteosomas de proteínas más grandes. Los datos fueron medidos
utilizando un ELISA de inhibición para cuantificar el LPS y
utilizando la D.O. a A280 para cuantificar las proteínas
proteosómicas. La columna de HPLC era una Tosohaas G50000Pwxl y los
estándares de peso molecular están indicados por las flechas.
Claims (25)
1. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma -determinante anfifílico que comprende:
(a) la formación de una mezcla de proteosoma, un
detergente dializable y un determinante anfifílico;
(b) el sometimiento de la mezcla a diafiltración
o ultrafiltración para extraer el detergente, formándose de este
modo un complejo determinante
anfifílico-proteosoma;
(c) la monitorización del nivel de formación de
complejos determinante anfifílico-proteosoma; y
(d) la recuperación del complejo determinante
anfifílico-proteosoma, donde el corte de peso
molecular nominal del sistema es 3.000 o mayor.
2. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que la ultrafiltración implica flujo
tangencial.
3. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que la ultrafiltración se realiza en un
sistema seleccionado de entre cartucho de fibra hueca, membrana de
plataforma y cartucho de membrana.
4. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 3, en el que el sistema de ultrafiltración es un
cartucho de fibra hueca con un tamaño de poro de corte de peso
molecular nominal de 10.000.
5. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma -determinante anfifílico de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que el sistema de ultrafiltración es un
cartucho de fibra hueca con un tamaño de poro de corte de peso
molecular nominal de 3.000.
6. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, que comprende además la monitorización del
detergente dializable mediante la medida continua de muestras de
permeado.
7. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que la monitorización incluye la medida
de la densidad óptica de muestras de permeado o reten-
tado.
tado.
8. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que la monitorización implica la medida
del nivel de extracción del detergente mezclando una muestra de
permeado con una cantidad conocida de SDS (dodecil sulfato de sodio)
para formar un precipitado si está presente el detergente y
determinando la cantidad de precipitación.
9. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 8, en el que el complejo
proteosoma-determinante anfifílico es recuperado
cuando el detergente del permeado ha sido esencialmente
extraído.
10. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que el detergente es Empigen BB.
11. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que el determinante anfifílico es un
lipopolisacárido.
12. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-lipopolisacárido de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que el lipopolisacárido es obtenido de una
bacteria gram negativa.
13. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-lipopolisacárido de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que la bacteria gram negativa es una
Plesiomonas.
14. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-lipopolisacárido de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que la Plesiomonas es
Plesiomonas shigelloides.
15. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-lipopolisacárido de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que la bacteria gram negativa es una
Shigella.
16. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-lipopolisacárido de acuerdo con la
reivindicación 15, en el que la Shigella es Shigella
flexneri, Shigella sonnei o Shigella boydii.
17. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-lipopolisacárido de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que la bacteria gram negativa es una
Neisseria.
18. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-lipopolisacárido de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que la Neisseria es Neisseria
meningitidis.
19. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que el proteosoma deriva de N.
meningitidis o N. gonorrhea.
20. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1, en el que la recuperación del
proteosoma-determinante anfifílico es efectuada
cuando la tasa monitorizada de extracción del detergente está
disminuyendo o es constante.
21. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 1 que comprende además e) el mezclado del
complejo proteosoma-determinante anfifílico
recuperado con un vehículo fisiológicamente aceptable para formar
una vacuna.
22. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 21, que comprende además la concentración del
complejo proteosoma-determinante anfifílico antes de
la recuperación del complejo.
23. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 22, en el que se continúa la concentración hasta
alcanzar una concentración final deseada.
24. Un proceso para la preparación de una vacuna
de proteosoma-determinante anfifílico de acuerdo con
la reivindicación 21, donde el proceso se realiza con diferentes
tipos de determinantes anfifílicos con el fin de formar una serie
de complejos proteosoma-determinante anfifílico que
son ensamblados en la etapa (e) para formar una vacuna
multivalente.
25. Una vacuna multivalente preparada mediante el
proceso de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, para ser
utilizada en un método de tratamiento del organismo humano o animal
para la prevención de enfermedades.
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