MX2013012207A - Procedimiento para preparar una composicion de vacuna. - Google Patents

Abstract

Se describe un método para preparar una composición que comprende uno o más antígenos adsorbidos a un aminoácido, en donde dicho método comprende: (i) mezclar una solución de uno o más antígenos con una solución del aminoácido en un ácido acuoso mientras se neutraliza la mezcla de soluciones, formando así un adsorbato que comprende uno o más de los antígenos y el aminoácido; (ii) separar el adsorbato en un regulador de pH deseado a través de filtración de flujo cruzado formando así dicha composición; y (iii) recuperar dicha composición; en donde los pasos (i) a (iii) se realizan en un ambiente estéril y dentro de un sistema cerrado.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UNA COMPOSICIÓN DE VACUNA Campo de la Invención La presente invención se relaciona con un método para la fabricación de una composición estéril que comprende un antígeno modificado unido a un aminoácido.

Antecedentes de la Invención La vacunación es la aplicación más conocida y exitosa de los principios i nmunológicos a la salud humana. Para su introducción y autorización, toda vacuna debe ser eficaz, y la eficacia de todas las vacunas se reevalúa periódicamente. Una vacuna eficaz debe inducir la respuesta inmune deseada, tener estabilidad para su conservación y producir inmunogenicidad suficiente. Con las vacunas inactivadas, en particular, a menudo es necesario controlar la liberación de antígeno tras la administración.

Se ha demostrado que la unión de un antígeno a un aminoácido suspendido permite una liberación lenta del antígeno tras la administración, lo que aumenta la seguridad a la vez de optimizar la eficacia mediante una exposición más prolongada. Sin embargo, la fabricación de formulaciones que comprenden estos antígenos es problemática, ya que la adsorción del antígeno en el aminoácido produce derivados químicos no deseados que deben eliminarse. Además, el proceso debe realizarse bajo condiciones estériles. Dado que el producto final es una suspensión, este no puede esterilizarse mediante filtración, y como el principio activo es biológico, no puede esterilizarse por calor. En consecuencia, las suspensiones estériles a menudo se fabrican por centrifugación en una sala estéril.

La patente de los EE.UU. 4.070.455 describe m icropartículas de tirosina finamente divididas, en las que se ha dispersado un alérgeno tratado con glutaraldehído. Las micropartículas se preparan mediante la mezcla de una solución de tirosina en un ácido fuerte acuoso con una solución de polen de estafiate tratado con glutaraldehído, más la posterior neutralización de la solución resultante. Las partículas microfinas de tirosina que contienen el alérgeno modificado se extraen mediante centrifugación.

EP 0988862 describe la formulación de un antígeno, un adyuvante inductor de TH-1 y un aminoácido moderadamente soluble en agua para usarse en inmunización. La formulación se prepara mezclando una solución de un antígeno y el adyuvante inductor de TH1 con una solución del aminoácido moderadamente soluble o un derivado en un ácido fuerte acuoso, y neutralizando la mezcla de las soluciones: esto co-precipita el aminoácido moderadamente soluble y el antígeno. El precipitado resultante se extrae de la solución mediante centrifugación, se reconstituye con una solución de regulador de pH fresca, y se le añade el adyuvante.

El uso de centrifugación para extraer el precipitado de aminoácido/antígeno requiere un grado considerable de exposición aséptica y alta dependencia de la interacción del operador. La presente invención aborda este problema.

Breve Descripción de la Invención La presente invención resuelve los problemas del estado de la técnica mediante la creación de un sistema que separa el adsorbato de antígeno/aminoácldo utilizando filtración tangencial. El sistema adapta los filtros de acero inoxidable sinterizado esterilizable utilizados de rutina en la filtración en línea mediante la inclusión de un sistema circulación cerrada específicamente diseñado. Esto permite la extracción del adsorbato de antígeno/aminoácido y los derivados químicos a través del filtro, a medida que se añade nueva solución de regulador de pH para mantener el volumen y las especificaciones.

La necesidad tecnológica surgió debido a la imposibilidad de esterilización o filtración final del producto de adsorbato de tirosina y alérgeno modificado (MATA, por sus siglas en inglés), que es insoluble y debe fabricarse en una planta estéril. A fin de asegurar la esterilidad fue necesario desarrollar un sistema cerrado de limpieza ¡n situ (CIP, por sus siglas en inglés) y vapor in situ (SIP, por sus siglas en inglés). La naturaleza cerrada del sistema significaba que el componente MATA insoluble debía mantenerse suspendido en una solución durante los pasos de formulación e intercambio de solución de regulador de pH. Para lograrlo, se desarrolló un sistema de filtración tangencial continua como el que aquí se describe.

Dada su carácter cerrado y la capacidad de esterilizar por vapor es posible ubicar los equipos fuera de la sala aséptica (si bien siempre dentro de las áreas de producción controladas). Por lo tanto, la presente invención cuenta con ventajas notables frente a los métodos de producción existentes. El método de la invención reduce substancialmente la exposición del producto antígeno al ambiente al contar con un sistema aséptico cerrado. El método también reduce la necesidad de intervención física, eliminando así la posibilidad de error y contaminación microbiana.

Según un primer aspecto de la presente invención, se provee un método para preparar una composición que comprende uno o más antígenos adsorbidos en un aminoácido, en el que dicho método comprende: (i) mezclar una solución de uno o más antígenos con una solución del aminoácido en un ácido acuoso a la vez de neutralizar la mezcla de las soluciones, para así formar un adsorbato que comprende el uno o más antígenos y el aminoácido; (ii) separar el adsorbato en una solución de regulador de pH mediante filtración tangencial para así formar la composición mencionada; y (iii) recuperar dicha composición; en el que los pasos (i) a (iii) se realizan en un ambiente estéril y dentro de un sistema cerrado.

Preferentemente el aminoácido es un aminoácido moderadamente soluble.

Preferentemente el aminoácido es tirosina, triptófano o un derivado de tal. Más preferentemente, el aminoácido es tirosina.

Preferentemente, el uno o más antígenos están modificados con glutaraldehído.

En un modo de realización especialmente preferido, el uno o más antígenos derivan de polen, ácaros, mohos, bacterias o virus.

En un modo de realización, el método comprende la preparación de una composición incluyendo uno o más antigenos de polen modificados con glutaraldehído y adsorbidos en tirosina, que comprende: (i) la modificación de uno o más antígenos de polen con glutaraldehído; (ii) la eliminación del excedente de glutaraldehído utilizando filtración tangencial para formar una solución de polen modificado; (iii) la mezcla de la solución de polen modificado con una solución de la tirosina en un ácido acuoso a la vez de neutralizar la mezcla de las soluciones, para así formar un adsorbato que comprende el polen modificado y la tirosina; (iv) la separación del adsorbato en una solución de regulado de pH mediante filtración tangencial para así formar la composición mencionada; y (v) la recuperación de dicha composición; en el que los pasos (iii) a (v) se realizan en un ambiente estéril y dentro de un sistema cerrado. Preferentemente los pasos (iii) a (v) se realizan en un ambiente BPF UE Grado 'C7ISO Clase 7.

Preferentemente los pasos (i) y (ii) se realizan dentro de un ambiente BPF UE Grado 'B7ISO Clase 5.

En otro modo de realización, el método comprende la preparación de una composición incluyendo uno o más antígenos de polen modificados con glutaraldehído y adsorbidos en tirosina, en el que el método comprende: (i) la extracción de uno o más antígenos de polen en una solución para formar una solución de extracto de polen; (ii) la filtración de la solución de extracto de polen para eliminar los sólidos; (¡ii) la filtración tangencial y el aislamiento del retenido que comprende el antígeno de polen; (iv) la modificación del uno o más antígenos de polen con glutaraldehído; (v) la eliminación del excedente de glutaraldehído utilizando filtración tangencial para formar una solución de polen modificado; (vi) la filtración estéril de la solución de polen modificado; (vii) la mezcla de la solución de polen modificado con una solución de tirosina en un ácido acuoso a la vez de neutralizar la mezcla de las soluciones, para así formar un adsorbato que comprende el polen modificado y la tirosina; (viii) la separación del adsorbato en una solución de regulador de pH mediante filtración tangencial para asi formar la composición mencionada; y (ix) la recuperación de dicha composición en el que los pasos (vii) a (ix) se realizan en un ambiente estéril y dentro de un sistema cerrado. Preferentemente los pasos (vii) a (ix) se realizan en un ambiente BPF UE Grado 'C7ISO Clase 7.

Preferentemente los pasos (i) a (vi) se realizan dentro de un ambiente BPF UE Grado 'B7ISO Clase 5.

El antígeno de polen puede ser, sin estar limitado a ello, polen de Agrostis, polen de Alopecurus, polen de Anthoxanthum odoratum, polen de Arrhenatherum elatius, polen de Bromus, polen de Cynosurus cristatus, polen de Dactylis, polen de Festuca, polen de Holcus lanatus, polen de Lolium, polen de heno de Fleo, polen de Poa y polen de centeno cultivado.

Preferentemente, el uno o más antígenos consisten en polen de Agrostis, polen de Alopecurus, polen de Anthoxanthum odoratum, polen de Arrhenatherum elatius, polen de Bromus, polen de Cynosurus cristatus, polen de Dactylis, polen de Festuca, polen de Holcus lanatus, polen de Lolium, polen de heno de Fleo, polen de Poa y polen de centeno cultivado.

Preferentemente la solución de extracto de polen se filtra mediante un filtro de tamaño de poro de 0,2 µ??; Puesto de otro modo, la composición preferentemente comprende todos los pólenes del grupo compuesto por polen de Agrostis, polen de Alopecurus, polen de Anthoxanthum odoratum, polen de Arrhenatherum elatius, polen de Bromus, polen de Cynosurus cristatus, polen de Dactylis, polen de Festuca, polen de Holcus lanatus, polen de Lolium, polen de heno de Fleo, polen de Poa y polen de centeno cultivado.

Preferentemente el polen se extrae en una solución salina con regulador de pH fenólico, preferentemente a pH 6,5 (preferentemente con contenido de cloruro de sodio, fosfato ácido de potasio, dodecahidrato de fosfato disódico, 80% p/p fenol licuado y agua para inyección (WFI)) de aproximadamente 2 a aproximadamente 8°C, más preferentemente aproximadamente 5°C.

Preferentemente la extracción se realiza durante alrededor de 12-30 horas, más preferentemente desde alrededor de 14 a alrededor de 24 horas, y aún más preferentemente durante alrededor de 18 horas.

Preferentemente la filtración tangencial empleada para aislar el retenido y/o para eliminar el excedente de glutaraldehído que se describe aquí se realiza mediante una membrana con un umbral de peso molecular de 5-10kDa. Más preferentemente la membrana tiene un umbral de peso molecular de 10kDa.

Preferentemente la filtración tangencial empleada para separar el adsorbato se realiza mediante un filtro de acero inoxidable polisinterizado, más preferentemente un filtro de acero inoxidable polisinterizado de 5 µ??, preferentemente con una presión entre 1,1-1,3 bares.

El adsorbato que comprende el antígeno y el aminoácido se forma mezclando el antígeno con el aminoácido en un ácido fuerte, preferentemente un ácido inorgánico, de preferencia ácido clorhídrico (HCI), a la vez de neutralizar la mezcla preferentemente con NaOH. Neutralización significa un ajuste del pH a un valor que esté dentro de la gama de 6,5 a 7,5, preferentemente de 6,8 a 7,2. Es conveniente que en ningún momento durante la neutralización, o al menos no durante un período prolongado, el pH pierda su equilibrio, o sea que quede fuera de la gama de pH de 6,5 a 7,5 o más preferentemente, fuera de la gama de pH de 6,8 a 7,2.

Preferentemente el ácido fuerte es HCI con una molaridad de aproximadamente 3,5M a aproximadamente 4,5M, preferentemente aproximadamente 3,8M. Preferentemente el NaOH tiene una molaridad de aproximadamente 3 a aproximadamente 3,5, preferentemente aproximadamente 3,2M.

Preferentemente la composición es una composición de vacuna.

En un modo de realización preferido, la composición se usa como una vacuna y el antigeno es uno de utilidad en dicha vacuna.

En diversos modos de realización puede añadirse a la composición un adyuvante, tal como MPL, 3-DMPL o un derivado o una sal de ellos.

Conforme a otro aspecto de la presente invención, se provee una composición preparada según el método de la invención.

Descripción Detallada A continuación se describirán diversos rasgos y modos de realización de la presente invención utilizando ejemplos, pero sin limitación a ellos.

La práctica de la presente invención hará uso, a menos que se indique lo contrario, de técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de una persona de habilidad ordinaria en el arte. Estas técnicas se explican en la literatura. Consúltese, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Coid Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. 1995 y suplementos ocasionales; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principies and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach , Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; and E. M. Shevach and W. Strober, 1992 y suplementos ocasionales, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY. Cada uno de estos textos generales queda incorporado al presente por su referencia.

Antígeno El término "antígeno" se usa para señalar cualquier molécula que puede ser específicamente reconocida por los elementos adaptativos de la respuesta inmune, o sea, por los linfocitos B o T, o ambos.

El antígeno empleado en la presente invención es preferentemente un inmunógeno, o sea, un antígeno que activa células inmunes para generar una respuesta inmune contra sí mismo.

El antígeno puede obtenerse mediante una recombinación o mediante la síntesis de péptidos, o a partir de fuentes o extractos naturales, y puede derivar de organismos vivos o no vivos.

El antígeno puede derivarse de una bacteria, como por ejemplo, ántrax, Campylobacter, cólera, difteria, E. coli enterotoxigénico, Giardia, Gonococo, Helicobacter pylori, Hemophilus influenza B, Hemophilus influenza no tipable, Meningococo, pertussis, Neumococo, Salmonella , Shigella, Estreptococo B, Estreptococo A, tétano, Vibrio cholerae, Yersinia, Estafilococo, especies de Pseudomonas y especies de Clostridium.

Alternativamente, el antígeno puede derivarse de un virus, como por ejemplo, adenovirus, serotipos 1 a 4 de dengue, ebola (Jahrling et al., Arch Virol Suppl, 11:135-140, 1996), enterovirus, serotipos A a E de la hepatitis (Blum, Digestión 56:85-95, 1995; Katkov, Med Clin North Am 80:189-200, 1996; Lieberman and Greenberg, Adv Pediatr Infect Dis 11:333-3631996; Mast et al., Annu Rev Med 47:257-266, 1996), virus herpes simplex 1 o 2, virus de inmunodeficiencia humana (Deprez et al., Vaccine 14:375-382, 1996), influenza, encefalitis equina japonesa, sarampión, norovirus, papilomavirus, parvovirus B19, polio, rabia, rotavirus, rubéola, vaccinia, constructos de vaccinia que contengan genes que codifiquen otros antígenos, tales como los antígenos de la malaria, varicela y la fiebre amarilla. Los parásitos incluyen, por ejemplo: Entamoeba histolytica (Zhang et al., Infect Immun 63.1349-1355); Plasmodium (Bathurst et al., Vaccine 11:449-456, 1993), toxoplasmosis y los helmintos.

En un modo de realización preferido, el antígeno es un alérgeno. El término "alérgeno" se usa para describir un antígeno que provoca una hipersensibilidad inmune indeseada o una reacción alérgica. Una alergia es una respuesta de hipersensibilidad a un antígeno ambiental (alérgeno).

El alérgeno utilizado en la presente invención puede derivarse de una sustancia que provoque alergia, tal como, sin limitación, un polen (por ej., polen de Agrostis, polen de Alopecurus, polen de Anthoxanthum odoratum , polen de Arrhenatherum elatius, polen de Bromus, polen de Cynosurus cristatus, polen de Dactylis, polen de Festuca, polen de Holcus lanatus, polen de Lolium, polen de heno de Fleo, polen de Poa, polen de centeno cultivado, polen de Ambrosia, polen de Artemisia, polen de abedul, polen de aliso, polen de avellano, polen de olivo, polen de Parietaria, polen de maple (Acer negundo), polen de ciprés, polen de cedro japonés (Cryptomeria japónica), alimentos, veneno de insectos, moho y materiales derivados de animales tales como los pelos, y ácaros tales como los ácaros del polvo (por ej., D. farinae o D. pteronyssinus o Blomia tropicalis).

Preferentemente el antígeno empleado en la presente invención es un antígeno de polen. Preferentemente los antígenos de polen son polen de Agrostis, polen de Alopecurus, polen de Anthoxanthum odoratum, polen de Arrhenatherum elatius, polen de Bromus, polen de Cynosurus cristatus, polen de Dactylis, polen de Festuca, polen de Holcus lanatus, polen de Lolium, polen de heno de Fleo, polen de Poa y polen de centeno cultivado.

El antígeno puede modificarse químicamente mediante una reacción con sustancias conocidas, por ejemplo, pero sin limitación, formaldehído o glutaraldehído, preferentemente glutaraldehído, que retiene o incrementa las propiedades inmunogénicas deseadas en el antígeno a la vez de ayudar a evitar efectos adversos indeseados. Estas modificaciones se conocen bien dentro de este campo.

Aminoácido Preferentemente el aminoácido utilizado en la invención tiene una solubilidad en agua de alrededor de 1,1 o menos g/100ml H20 a 25°C. Los aminoácidos de preferencia en particular son la tirosina o el triptófano, prefiriéndose la tirosina por ser menos insoluble. También se incluye en el alcance de esta invención los derivados farmacéuticamente aceptables de estos aminoácidos, tal como la bencil-O-octadecanoil-L-tirosina.

Preparación La composición de la presente invención se prepara mezclando una solución acuosa del antígeno con una solución del aminoácido en un ácido fuerte acuoso y neutralizando la mezcla de soluciones para co-precipitar el aminoácido y el antígeno.

Típicamente se mezcla una solución acuosa del antígeno, preferentemente a pH de 6,3 a 7,2, con una solución del aminoácido en un ácido fuerte acuoso. El ácido fuerte generalmente es un ácido inorgánico, de preferencia, ácido clorhídrico. La solución de antígeno usada en este paso típicamente contiene hasta 0,15 g/ml de proteína de antígeno. En un modo de realización la solución de aminoácido utilizada es de aproximadamente 24% p/v.

La mezcla resultante de soluciones de antígeno y aminoácido se neutraliza. Es conveniente que en ningún momento durante la neutralización, o al menos no durante un período prolongado, el pH pierda su equilibrio. Esto puede lograrse mediante la agitación vigorosa de la solución y mediante el uso de la cantidad de base requerida solamente, si así se desea. La adición de diversos agentes reguladores de pH, tales como una solución salina regulada en su pH, puede ser de utilidad para ayudar a controlar el pH durante los pasos de mezcla y neutralización.

Un método especialmente útil para lograr la neutralización es añadir por separado la solución de aminoácido y la base neutralizadora a la solución de antígeno. Las tasas de flujo de las soluciones añadidas se controlan mediante el estado del pH, o sea, mediante equipo que regula el flujo de una o ambas soluciones de modo tal que el pH de la mezcla reactiva se mantenga sustancialmente constante a un nivel predeterminado. Se ha hallado que se obtienen resultados óptimos controlando el pH dentro de la gama de 6,5 a 7.5, preferentemente 6,8 a 7,2, si bien el pH preciso puede variar según la naturaleza del antígeno.

El resultado de la neutralización es la precipitación inmediata del aminoácido, con la consecuente oclusión y/o adsorción de la solución de antigeno.

Filtración tangencial Un método que ha sido útil para el fraccionamiento de diversas partículas es la filtración de flujo cruzado o filtración tangencial (TFF, según siglas en inglés). La filtración tangencial es un proceso de separación que utiliza membranas para separar componentes dentro de una solución líquida o suspensión en base a sus diferencias de tamaño o peso molecular. En la filtración tangencial, la solución o suspensión a filtrar pasa a través de la superficie de la membrana de forma transversal. Lo que impulsa la filtración es la presión transmembránica. La velocidad con la que el filtrado atraviesa la superficie de la membrana también controla el índice de filtración y ayuda a evitar obstrucciones en la membrana. Dado que con la filtración tangencial se recircula el retenido a través de la superficie de la membrana, esto minimiza la acumulación de depósitos en la membrana, y a la vez mantiene un elevado índice de filtración y de recuperación de producto.

Los dispositivos de filtración tangencial generalmente constan de una bomba, un depósito de solución de alimentación, un módulo de filtración y conductos para conectar todos estos elementos.

Durante el uso, la solución de alimentación se desplaza del depósito de solución de alimentación al módulo de filtración, mientras que el retenido del módulo de filtración se recircula del módulo de filtración al depósito de solución de alimentación hasta obtenerse el volumen de retenido deseado.

La filtración tangencial empleada en la presente invención para separar el adsorbato que comprende el antígeno modificado y el aminoácido preferentemente se realiza utilizando un filtro de acero inoxidable polisinterizado de 5 µ?? de tamaño de poro, en el que se mantiene una presión de entre 1,1 y 1,3 barias.

Sistema cerrado Un sistema cerrado es un sistema aislado que evita la exposición de la composición al ambiente externo al sistema. La composición sólo se expone al ambiente inmediato de la tubería y los componentes de la máquina que conforman el sistema cerrado. El sistema cerrado de la presente invención evita la contaminación de la composición, y lo logra al asegurar que la composición quede aislada del ambiente exterior al sistema, impidiendo así la entrada de contaminantes al sistema.

Adyuvante Una composición producida por el método de la presente invención puede añadirse un adyuvante. Preferentemente el adyuvante es un adyuvante inductor de TH1. Un adyuvante inductor de TH1 es un adyuvante que incrementa la respuesta de TH1 a un antígeno.

La eficacia de un adyuvante tal como el adyuvante inductor de TH1 puede establecerse determinando el perfil de los anticuerpos dirigidos contra un antígeno como resultado de la administración de dicho antígeno en vacunas que también incluyen diversos adyuvantes.

Preferentemente, el adyuvante es un lipopolisacárido modificado. Tal como se describe en la Patente de los EE.UU. Na 4.912.094, el lipopolisacárido enterobacteriano (LPS, por sus siglas en inglés) es un potente inmunoestimulante. Sin embargo, también puede provocar respuestas nocivas, e incluso a veces, fatales. Ahora se sabe que las actividades endotóxicas asociadas con el LPS se deben a su componente lípido A. Consecuentemente, la presente invención más preferentemente usa un derivado destoxificado del lípido A. Ribi ImmunoChem produjo un derivado del lípido A originariamente conocido como endotoxina destoxificada refinada (RDE, por sus siglas en inglés) que luego llegó a conocerse como monofosforil lípido A (MPL, por sus siglas en inglés). Como se describe en la Patente de los EE.UU. Na 4.912.094, MPL se produce mediante el reflujo de LPS o lípido A obtenido de mutantes sin heptosas de bacterias gram negativas (por ej., Salmonella sp.) en soluciones de ácidos minerales de potencia moderada (por ej., 0,1N HCI) durante un periodo de alrededor de 30 minutos. Este tratamiento provoca la pérdida de la fracción de fosfato en la posición 1 del extremo reductor de la glucosamina. Durante este tratamiento también se elimina el carbohidrato núcleo de la posición 6' de la glucosamina no reductora.

Sin embargo, preferentemente se emplea un LPS modificado o un lípido A en el cual el lípido A destoxif icado retenga la fracción núcleo ligada a la posición 6' de la glucosamina no reductora. Estos derivados de LPS y lípido A también se describen en la Patente de los EE.UU. N24.912.094. En mayor detalle, la Patente de los EE.UU. Ns. 4.912.094 describe un lipopolisacárido modificado que se obtiene mediante el método de remoción selectiva de solamente el resto acílico ß-hidroximirístico del lipopolisacárido con una unión éster al extremo reductor de la glucosamina en la posición 3' de dicho lipopolisacárido, lo cual comprende someter el lipopolisacárido a hidrólisis alcalina. En la presente invención puede usarse un monofosforil lípido A (MPL) de-O-acilado, difosforil lípido A (DPL) y LPS de este tipo. En consecuencia, en un modo de realización preferido, la presente invención emplea MPL, DPL o LPS en los que la posición 3' del extremo reductor de la glucosamina está de-O-acilada. Estos compuestos se conocen como 3-DMPL, 3-DDPL y 3-DLPS respectivamente.

En la Patente de los EE.UU. Ns 4.987.237 se describen derivados con la fórmula: OP03H2 en los que R1 y R2 son H, R3 es un hidrocarburo de cadena lineal o ramificado compuesto de C, H y como opción O, N y S, en el cual si bien uno o más átomos pueden ser iguales o diferentes, el número total de átomos de tipo C no supera 60, y el círculo representa un núcleo de MPL.

Como alternativa, el derivado de MPL tiene la fórmula en el que el segmento del derivado representado por contiene de 2 a 60 átomos C y R3 es un hidrocarburo de cadena lineal o ramificado compuesto de C, H y como opción O, N y S, en el cual uno o más átomos pueden ser iguales o diferentes, y x es 1 como mínimo y puede ser cualquier número entero de modo tal que la cantidad total de átomos C en todos los segmentos x no supere 60, y en el que la estructura química de cada R3 puede ser igual o diferente en cada uno de estos segmentos, y en el que el círculo representa un núcleo de MPL.

Todos estos derivados o sales de LPS o lípido A disponibles ahora o en el futuro pueden usarse en la presente Invención. Preferentemente los derivados y sales son los de aceptación farmacéutica.

Dosis y administración de las composiciones Las composiciones producidas por la presente invención pueden administrarse a un paciente de un modo compatible con la formulación de la dosis, y en cantidades que sean profiláctica y/o terapéuticamente eficaces. La cantidad a administrar, generalmente dentro de la gama de 5 a 250 pg de antígeno por dosis, depende del paciente a tratar, de la capacidad de su sistema inmune de sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseada. Una gama preferida es de aproximadamente 20 pg a aproximadamente 40 pg por dosis.

Un tamaño de dosis adecuado es de aproximadamente 0,5 mi.

En consecuencia, una dosis para inyección subcutánea, por ejemplo, sería de 0,5 mi y comprendería 20 pg de inmunogeno mezclado con 0,5% de adyuvante.

Las cantidades precisas de principio activo que se necesite administrar pueden depender del criterio del profesional sanitario y pueden ser específicas para cada paciente.

La composición puede administrarse en una sola dosis, o preferentemente, con un programa de dosis múltiples, que es un programa en el que el tratamiento primario de vacunación puede administrarse en 1 a 20 dosis separadas, seguidas de otras dosis administradas con posterioridad a intervalos temporales que son necesarias para mantener o reforzar la respuesta inmune, por ejemplo, 1 a 4 meses para una segunda dosis, y de ser necesario, una o más dosis posteriores al cabo de varios meses. El régimen de dosis también estará determinado, al menos en parte, por la necesidad de la persona, y dependerá del criterio del profesional sanitario.

Asimismo, la composición con contenido de antígeno(s) puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores, como, por ejemplo, ¡nmunoglobulinas.

Descripción de las Figuras Figura 1. Representación esquemática del sistema de filtración tangencial usado para separar el adsorbato de aminoácido.

Figura 2. Representación esquemática del filtro de acero inoxidable polisinterizado empleado en la filtración tangencial; la Figura muestra el alojamiento del filtro (A) y la unidad in-situ (B).

Figura 3. Representación esquemática de la extracción de antígenos de polen para obtener una solución del extracto. La Solución Evans en el recipiente VL001 se enfría a 5"C +/- 3"C, y se extraen 2000 mi que se utilizan para suspender el polen prepesado. Esta suspensión luego se añade al recipiente VL001, donde se produce la extracción durante 18 horas, con tiempo y temperatura controlados y registrados por el PLC y un registrador de datos asociado. La solución del extracto luego se filtra a través de un sistema de filtro de 0,2 pm antes de pasar a la etapa siguiente.

Figura 4. Representación esquemática de la filtración tangencial para aislar el retenido que comprende el antígeno de polen. La solución del extracto se recircula a través del cartucho de filtro de filtración tangencial, en el cual la diafiltración extrae la materia de bajo peso molecular y la desecha, y retiene la materia de alto peso molecular en la solución circulante. El volumen recibido en el depósito de desechos se reemplaza por Solución Evans bombeada al depósito TNK01. Esto se repite hasta completar 5 cambios de volumen.

Figura 5. Representación esquemática de la modificación de los antígenos de polen con glutaraldehído. Se añade glutaraldehído prepesado a la solución diafiltrada. Tras esta adición, la solución se agita durante 1-2 horas para lograr la modificación.

Figura 6. Representación esquemática de la eliminación del excedente de glutaraldehído. Una vez completada la modificación, la diafiltración vuelve a repetirse hasta completarse 5 cambios de volumen. Esto elimina todo el glutaraldehído no utilizado durante el proceso de modificación.

Figura 7. Representación esquemática que muestra como la solución modificada pasa del sistema de filtración tangencial al recipiente de adición de fosfato CGV020. Luego se añade un regulador de pH de fosfato previamente preparado y la solución se mezcla. Ahora la solución está lista para pasar a la etapa de co-precipitación.

Figura 8. Representación esquemática que muestra como el PLC controla los índices de adición correspondientes de NaOH y HCI / Tirosina para asegurar el correcto índice de neutralización. Durante la etapa de lavado salino también asegura que se añade solución salina para reemplazar el volumen perdido como desecho. Todos los datos críticos se registran tanto de forma impresa como electrónica.

Figura 9. Representación esquemática que muestra como la concentración de sal de la solución en VL003 se reduce mediante la recirculación a través de un filtro de flujo tangencial de 5µm. El volumen perdido en el desecho se reemplaza por un regulador de pH salino de baja concentración, reduciéndose así el contenido total de sal.

Figura 10. Representación esquemática que muestra que una vez completados los lavados salinos se aplica al recipiente VL003 aire comprimido filtrado estéril para forzar la transferencia de la suspensión a través de una tubería hacia un recipiente colector dedicado VL005, situado en la sala aséptica.

Figura 11. Representación esquemática que muestra la repetición de la reacción de co-precipitación con la mezcla de extracto modificado / regulador de pH de fosfato del sistema de filtración tangencial .

Figura 12. Representación esquemática del sistema de co-precipitación con todas sus conexiones.

Figura 13. Diagrama correspondiente a la etapa de diseño, que muestra la conexión entre la bomba, el filtro tangencial y el filtro estéril de 0,2 pm del permeado a través del cual se pasa el licor de lavado durante el paso de reducción de sal de los sólidos de co-precipitación.

Ahora se describirán otros rasgos y modos de realización preferidos de la presente invención a través de ejemplos no limitadores y con referencia a los planos adjuntos, en los cuales: Ejemplo Se extraen 13 pólenes de gramíneas en bruto (polen de Agrostis, polen de Alopecurus, polen de Anthoxanthum odoratum, polen de Arrhenatherum elatius, polen de Bromus, polen de Cynosurus cristatus, polen de Dactylis, polen de Festuca, polen de Holcus lanatus, polen de Lolium, polen de heno de Fleo, polen de Poa y polen de centeno cultivado) en un recipiente de acero inoxidable específicamente diseñado, con solución Evans (pH 6,5) (cloruro de sodio, fosfato ácido de potasio, dodecahidrato de fosfato disódico, 80% p/p fenol licuado y agua para inyección) a 5°C durante 18 horas con agitación. Luego se filtra la mezcla a 0,2 µ?t? para eliminar los sólidos utilizando un filtro Pall o similar. El controlador del proceso regula la temperatura y el flujo de refrigerante al recipiente de extracción. Al finalizar el período de extracción del proceso se efectúa el análisis del filtrado para determinar la eficacia del proceso, incluyendo pH, IgE reactividad, IgG potencia, alérgeno y perfil polimérico.

Ahora se realiza la diafiltración del extracto de polen mediante su paso por un sistema de flujo tangencial Cogent con una presión transmembránica de entre 0,2 y 0,6 barias durante 5 cambios de volumen, utilizando una membrana con umbral de peso molecular de 10kDa. El retenido se dirige a un recipiente limpio saneado, al que se añade una solución de glutaraldehído al 10% por peso, y ahora se produce la modificación durante 2 horas para formar los alergoides. Las ventajas de este proceso son la reducción de IgE y la retención de la capacidad de inducción de IgG. El grado de modificación varía, pero debe estar en el orden del 50 al 100%.

El extracto modificado a continuación se somete a un segundo paso de diafiltración a través del sistema de flujo tangencial Cogent utilizando solución Evans de pH 7,0 (cloruro de sodio, fosfato ácido de potasio, dodecahidrato de fosfato disódico, 80% p/p fenol licuado y agua para inyección) y una membrana con umbral de peso molecular de 5 a 10kDa para eliminar el excedente de glutaraldehído. El extracto final (Sustancia Farmacológica) se somete a un conjunto de pruebas de aseguración de calidad, incluyendo la pérdida de aminas primarias, el contenido de proteínas, IgE reactividad, IgG, potencia y perfil polimérico.

La sustancia farmacológica se somete a filtración estéril a través de un filtro de tamaño de poro 0,2 µ?t? para pasar a un recipiente limpio presaneado al que se añade el regulador de pH de fosfato adicional (dihidrato fosfato diácido de sodio, dodecahidrato de fosfato disódico, agua para inyección) filtrado estéril, hasta alcanzar la concentración requerida. Se añade simultáneamente L- tirosina estéril al 24% en 3,8M ácido clorhídrico y 3,2M hidróxido sódico al recipiente de reacción equipado con un agitador de alta velocidad, donde se produce la co-precipitación. Este proceso produce un alto contenido de sales, que se reduce mediante el lavado del precipitado de tirosina utilizando un filtro de acero inoxidable polisinterizado tangencial de 5 pm en un sistema cerrado. Se utiliza un filtro tangencial de 5 µ?? para lograr la separación, y el volumen perdido se reemplaza con un regulador de pH salino de baja concentración; el alergoide adsorbido en la tirosina se recupera en un recipiente limpio pre-esterilizado mediante la aplicación de aire comprimido estéril al recipiente colector para forzar la salida de la suspensión. Las tuberías para la transferencia de todos los materiales son de limpieza in situ (CIP) / vapor in Situ (SIP).

Tras la fabricación, el principio activo a granel se conserva en un equipo especial y se transfiere a un recipiente de dilución para el añadido de tirosina y PL, su mezcla, y el llenado aséptico de viales séricos de 3 mi con tapones butílicos.

El método ejemplificado cuenta con control lógico para los aspectos críticos del proceso, y hace uso de conexiones estériles Nova Septum para minimizar la posibilidad de resultados falsos positivos de contaminación. El método cuenta con controles durante el proceso y pruebas en línea para asegurar el cumplimiento de las especificaciones. El equipo ha sido diseñado para minimizar la exposición a materiales peligrosos, y utiliza tecnología de limpieza in situ / vapor in situ para dar lugar a procesos limpios y estériles totalmente validados.

Todas las publicaciones mencionadas en las especificaciones previas por el presente quedan incorporadas por su referencia. Diversas modificaciones y variaciones de los métodos descritos y del sistema de la presente invención serán aparentes para los expertos del tema sin apartarse del alcance y del espíritu de la presente invención. Si bien la presente invención se ha descrito con referencia a los modos de realización preferidos específicos, debe entenderse que la invención reivindicada no debe quedar indebidamente limitada a dichos modos de realización específicos. De hecho, la intención es que diversas modificaciones de los modos descritos para desarrollar la invención que son obvios para los expertos en bioquímica y biotecnología o campos relacionados estén abarcados dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una composición que comprende uno o más antígenos adsorbidos en un aminoácido, en el cual el método comprende: (i) mezclar una solución de uno o más antígenos con una solución del aminoácido en un ácido acuoso a la vez de neutralizar la mezcla de las soluciones, para así formar un adsorbato que comprende el uno o más antígenos y el aminoácido; (ii) separar el adsorbato en un regulador de pH mediante filtración tangencial para así formar la composición mencionada; y (iii) la recuperación de dicha composición; en el que los pasos (i) a (iii) se realizan en un ambiente estéril y dentro de un sistema cerrado.

2. Un método conforme a la reivindicación 1 en el que el aminoácido es tirosina.

3. Un método conforme a la reivindicación 1 o 2 en el que el uno o más antígenos están modificados con glutaraldehído.

4. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el uno o más antígenos se derivan de polen.

5. Un método conforme a la reivindicación 1 que comprende la preparación de una composición incluyendo uno o más antígenos de polen modificados con glutaraldehído y adsorbidos en tirosina en el que el método comprende: (i) modificar uno o más antígenos de polen con glutaraldehído; (¡i) eliminar el excedente de glutaraldehído utilizando filtración tangencial para formar una solución de polen modificado; (ii¡) mezclar la solución de polen modificado con una solución de la tirosina en un ácido acuoso a la vez de neutralizar la mezcla de las soluciones, para así formar un adsorbato que comprende el polen modificado y la tirosina; (iv) separar el adsorbato en un regulador de pH mediante filtración tangencial para así formar la composición mencionada; y (v) recuperar dicha composición; en el que los pasos (iii) a (v) se realizan en un ambiente estéril y dentro de un sistema cerrado.

6. Un método conforme a la reivindicación 1 que comprende la preparación de una composición incluyendo uno o más antígenos de polen modificados con glutaraldehído y adsorbidos en tirosina en el que método comprende: (i) la extracción del uno o más antígenos de polen en una solución para formar una solución de extracto de polen; (ii) la filtración de la solución de extracto de polen para eliminar los sólidos; (iii) la aplicación de filtración tangencial y el aislamiento del retenido que comprende el antígeno de polen; (iv) la modificación del uno o más antígenos de polen con glutaraldehído; (v) la eliminación del excedente de glutaraldehído utilizando filtración tangencial para formar una solución de polen modificado; (vi) la filtración estéril de la solución de polen modificado; (vii) la mezcla de la solución de polen modificado con una solución de tirosina en un ácido acuoso a la vez de neutralizar la mezcla de las soluciones, para así formar un adsorbato que comprende el polen modificado y la tirosina; (viii) la separación del adsorbato en un regulador de pH mediante filtración tangencial para así formar la composición mencionada; y (ix) la recuperación de dicha composición, en el que los pasos (vii) a (ix) se realizan en un ambiente estéril y dentro de un sistema cerrado.

7. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la composición comprende los antígenos de polen: polen de Agrostis, polen de Alopecurus, polen de Anthoxanthum odoratum, polen de Arrhenatherum elatius, polen de Bromus, polen de Cynosurus cristatus, polen de Dactylis, polen de Festuca, polen de Holcus lanatus, polen de Lolium, polen de heno de Fleo, polen de Poa y polen de centeno cultivado.

8. Un método conforme a la reivindicación 6 o 7 en el que el paso de extracción (i) se realiza utilizando una solución regulada en su pH fenólica de aproximadamente 2 a aproximadamente 8°C durante alrededor de 18 horas.

9. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 en el que la eliminación del excedente de glutaraldehído mediante filtración tangencial se realiza utilizando una membrana con un umbral de peso molecular de 5 a 10kDa.

10. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la separación del adsorbato que comprende el antígeno y el aminoácido mediante filtración tangencial se realiza utilizando un filtro de acero inoxidable polisinterizado.

11. Un método conforme a la reivindicación 10 en el que el filtro de acero inoxidable polisinterizado tiene un tamaño de poro de 5 µ?t?.

12. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el adsorbato que comprende el antígeno y el aminoácido se forma mediante la mezcla del antígeno con el aminoácido en HCI con una molaridad de aproximadamente 3,8M a la vez de neutralizar la mezcla con NaOH con una molaridad de aproximadamente 3,2 M.

13. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicha composición se diluye hasta alcanzar la concentración deseada para su uso parental.

14. Un método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que se añade un adyuvante a dicha composición.

15. Un método conforme a la reivindicación 14 en el que el adyuvante es MPL, 3-DMPL o un derivado o una sal de los mismos.

16. Una composición preparada según el método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.