KR101945265B1

KR101945265B1 - 백신 조성물을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR101945265B1
Application number: KR1020137030934A
Authority: KR
Inventors: 머레이 스키너; 시몬 휴잉스; 둔칸 패커; 리차드 폴란드
Original assignee: 알러지 쎄라퓨틱스 (유케이) 리미티드
Priority date: 2011-04-21
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2019-02-07
Also published as: AU2012246087B2; BR112013026759B1; BR112013026759A8; GB2504444B; HUE030623T2; EP2699255B1; CL2013003033A1; PL2699255T3; ES2613089T3; EP2699255A1; US9731004B2; CN103608034B; CA2833319C; NZ616268A; CN103608034A; PT2699255T; CO6910162A2; MX345947B; US20140106455A1; JP6175051B2

Abstract

아미노산에 흡착된 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서, (i) 하나 이상의 항원의 용액과 수성 산 중 아미노산의 용액을 혼합하면서 상기 용액의 혼합물을 중화시킴으로써, 하나 이상의 항원 및 아미노산을 포함하는 흡착물을 형성시키는 단계; (ii) 횡류 여과(cross-flow filtration)에 의해 요망되는 완충액으로 흡착물을 분리시킴으로써 상기 조성물을 형성시키는 단계; 및 (iii) 상기 조성물을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 단계 (i) 내지 (iii)가 살균 환경 내 및 폐쇄 시스템 내에서 수행되는, 방법이 본원에 제공된다.

Description

백신 조성물을 제조하는 방법{PROCESS FOR PREPARING VACCINE COMPOSITION}

발명의 분야

본 발명은 아미노산에 결합된 변형된 항원을 포함하는 살균 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

예방접종은 인간 건강에 대한 면역학적 원리의 가장 알려져 있고 가장 성공적인 적용이다. 수용되고 승인되기 위해서는, 백신은 효과적이어야 하며, 모든 백신의 효능은 때때로 재검토된다. 효과적인 백신은 요망되는 면역 반응을 유도하고, 저장시 안정적이고, 충분한 면역원성을 가져야 한다. 특히, 비생(non-living) 백신을 이용하는 경우, 투여 후의 항원의 방출을 조절하는 것이 종종 필요하다.

현탁된 아미노산으로의 항원의 결합은 투여 후의 항원의 방출을 늦춤으로써 안전성을 증가시키면서 노출을 연장시켜 효능을 최적화시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기 항원을 포함하는 제형의 제조는 문제가 되는데, 이는 아미노산으로의 항원의 흡착이 제거되는 것이 필요한 생성물에 의해 요망되지 않는 화학물질을 발생시키기 때문이다. 또한, 상기 공정은 살균 조건하에서 수행되어야 한다. 최종 생성물이 현탁액임에 따라, 이는 여과에 의해 살균될 수 없고, 활성 성분이 생물학적 성분임에 따라, 이는 열 살균될 수 없다. 따라서, 살균 현탁액은 종종 무균실(aseptic suite) 내에서의 원심분리에 의해 제조된다.

US 특허 제4,070,455호에는 티로신의 미세하게 나누어진 미세입자(micro-particle) 내에 분산된 글루타르알데하이드 처리된 알레르겐을 갖는 티로신의 미세하게 나누어진 미세입자가 기재되어 있다. 미세입자는 강한 수성 산 중 티로신의 용액과 글루타르알데하이드 처리된 래그위드 화분(ragweed pollen)의 용액을 혼합한 후, 생성된 용액을 중화시킴으로써 제조된다. 변형된 알레르겐을 함유하는 티로신의 초미세 입자(micro-fine particle)가 원심분리에 의해 제거된다.

EP 0988862호에는 면역화에 사용하기 위한 항원, TH-1 유도성 애쥬번트 및 거의 물에 용해되지 않는 아미노산의 제형이 기재되어 있다. 제형은 항원 및 TH1-유도성 애쥬번트의 용액과 강한 수성 산 중 가용성이 거의 없는 아미노산 또는 유도체의 용액을 혼합하면서 이러한 용액의 혼합물을 중화시킴으로써 가용성이 거의 없는 아미노산 및 항원을 공동 침전시킴으로써 제조된다. 생성된 침전물은 원심분리에 의해 용액으로부터 분리되고, 신선한 완충액으로 재구성되고, 애쥬번트가 첨가된다.

아미노산/항원 침전물을 분리시키기 위한 원심분리의 이용은 충분한 정도의 무균 노출 및 작업자 상호작용에 대한 높은 의존성을 필요로 한다. 본 발명은 상기 문제를 다룬다.

발명의 개요

본 발명은 횡류 여과(cross-flow filtration)를 이용하여 항원/아미노산 흡착물을 분리시키는 시스템의 생성에 의해 종래의 문제를 극복한다. 상기 시스템은 맞춤 설계의 폐쇄 순환 루프 시스템에 포함시킴으로써 막다른여과(dead end filtration)에서 통상적으로 사용되는 증기 살균가능한 소결 스테인레스 강철 필터를 적합화시킨다. 이는 부피 및 규격을 유지시키기 위해 새로운 완충액이 첨가됨에 따라 항원/아미노산 흡착물 및 화학적 부산물이 필터를 통해 분리되도록 한다.

최종적으로 살균하는 것에 대한 무능력, 또는 불용성이고 살균 시설에서 제조되어야 하는 필터 변형된 알레르겐 티로신 흡착물(MATA) 생성물을 기초로 하여 기술적 필요조건이 발생하였다. 무균을 보장하기 위해, 폐쇄된 정치 세척(clean in place, CIP) 정치 증기(steam in place, SIP) 시스템을 개발할 필요가 있었다. 상기 시스템의 폐쇄 특성은 불용성 MATA 성분이 제형화 및 완충액 교환 단계 동안 용액 중에 현탁된 채로 유지되어야 하는 것을 의미한다. 이를 달성하기 위해, 본원에 기재된 바와 같이 연속 횡류 여과 시스템이 개발되었다.

폐쇄된 특성 및 증기 살균에 대한 능력으로 인해, 무균실 외부에 기계설비를 위치(조절 생성 구역 내 증류기(still)를 통함)시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 현존하는 생성 방법에 비해 명확한 장점을 갖는다. 본 발명의 방법은 폐쇄된 무균 시스템을 가짐으로써 환경에 대한 항원 생성물의 노출을 실질적으로 감소시킨다. 상기 방법은 또한 물리적 개입에 대한 필요를 감소시키며, 실책 및 미생물 오염 둘 모두로부터 상기 방법의 위험을 완화시킨다.

본 발명의 첫번째 양태에 따르면, 아미노산에 흡착된 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은,

(i) 하나 이상의 항원의 용액과 수성 산 중 아미노산의 용액을 혼합하면서 상기 용액의 혼합물을 중화시킴으로써, 하나 이상의 항원 및 아미노산을 포함하는 흡착물을 형성시키는 단계;

(ii) 횡류 여과에 의해 완충액으로 흡착물을 분리시킴으로써 상기 조성물을 형성시키는 단계; 및

(iii) 상기 조성물을 회수하는 단계를 포함하며,

여기서, 상기 단계 (i) 내지 (iii)는 살균 환경 내 및 폐쇄 시스템 내에서 수행된다.

바람직하게는, 아미노산은 가용성이 거의 없는 아미노산이다.

바람직하게는, 아미노산은 티로신, 트립토판 또는 이들의 유도체이다. 더욱 바람직하게는, 아미노산은 티로신이다.

바람직하게는, 하나 이상의 항원은 글루타르알데하이드로 변형된다.

한 특히 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 항원은 화분, 진드기, 곰팡이, 박테리아 또는 바이러스로부터 유래된다.

한 구체예에서, 상기 방법은 글루타르알데하이드로 변형되고 티로신에 흡착된 하나 이상의 화분 항원을 포함하는 조성물을 제조하는 것을 포함하며, 이러한 방법은,

(i) 하나 이상의 화분 항원을 글루타르알데하이드로 변형시키는 단계;

(ii) 횡류 여과를 이용하여 과량의 글루타르알데하이드를 제거하여 변형된 화분 용액을 형성시키는 단계;

(iii) 변형된 화분 용액과 수성 산 중 티로신의 용액을 혼합하면서 이러한 용액의 혼합물을 중화시킴으로써, 변형된 화분 및 티로신을 포함하는 흡착물을 형성시키는 단계;

(iv) 횡류 여과에 의해 완충액으로 흡착물을 분리시킴으로써 상기 조성물을 형성시키는 단계; 및

(v) 상기 조성물을 회수하는 단계를 포함하며,

여기서, 상기 단계 (iii) 내지 (v)는 살균 환경 내 및 폐쇄된 시스템 내에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 단계 (iii) 내지 (v)는 EU GMP 등급 'C'/ISO 클래스 7 환경으로 수행된다. 바람직하게는, 상기 단계 (i) 및 (ii)는 EU GMP 등급 'B'/ISO 클래스 5 환경 내에서 수행된다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 글루타르알데하이드로 변형되고 티로신에 흡착된 하나 이상의 화분 항원을 포함하는 조성물을 제조하는 것을 포함하며, 이러한 방법은,

(i) 하나 이상의 화분 항원을 용액으로 추출하여 화분 추출 용액을 형성시키는 단계;

(ii) 화분 추출 용액을 여과시켜 고체를 제거하는 단계;

(iii) 횡류 여과를 수행하고, 화분 항원을 포함하는 보유액을 분리시키는 단계;

(iv) 글루타르알데하이드로 하나 이상의 화분 항원을 변형시키는 단계;

(v) 횡류 여과를 이용하여 과량의 글루타르알데하이드를 제거하여 변형된 화분 용액을 형성시키는 단계;

(vi) 변형된 화분 용액을 살균 여과시키는 단계;

(vii) 변형된 화분 용액과 수성 산 중 티로신의 용액을 혼합하면서 이러한 용액의 혼합물을 중화시킴으로써, 변형된 화분 및 티로신을 포함하는 흡착물을 형성시키는 단계;

(viii) 횡류 여과에 의해 완충액으로 흡착물을 분리시킴으로써 상기 조성물을 형성시키는 단계; 및

(ix) 상기 조성물을 회수하는 단계를 포함하며,

여기서, 상기 단계 (vii) 내지 (ix)는 살균 환경 내 및 폐쇄된 시스템 내에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 단계 (vii) 내지 (ix)는 EU GMP 등급 'C'/ISO 클래스 7 환경에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 단계 (i) 내지 (vi)는 EU GMP 등급 'B'/ISO 클래스 5 환경 내에서 수행된다.

화분 항원은 겨이삭속(Bent) 화분, 뚝새풀(Foxtail) 화분, 향기풀(Sweet vernal) 화분, 허위 귀리(False oat) 화분, 브롬(Brome) 화분, 크레스테드 도그스테일(Crested dogstail) 화분, 오리새(Cocksfoot) 화분, 김의털(Fescue) 화분, 요크셔 안개(Yorkshire fog) 화분, 라이 그래스(Rye grass) 화분, 큰조아재비(Timothy) 화분, 메도우(Meadow) 화분 및 재배 호밀(Cultivated rye) 화분일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

바람직하게는, 하나 이상의 항원은 겨이삭속 화분, 뚝새풀 화분, 향기풀 화분, 허위 귀리 화분, 브롬 화분, 크레스테드 도그스테일 화분, 오리새 화분, 김의털 화분, 요크셔 안개 화분, 라이 그래스 화분, 큰조아재비 화분, 메도우 화분 및 재배 호밀 화분으로 구성된다.

바람직하게는, 화분 추출 용액은 0.2㎛ 포어 크기 필터를 이용하여 여과된다.

달리 말해서, 조성물은 바람직하게는 겨이삭속 화분, 뚝새풀 화분, 향기풀 화분, 허위 귀리 화분, 브롬 화분, 크레스테드 도그스테일 화분, 오리새 화분, 김의털 화분, 요크셔 안개 화분, 라이 그래스 화분, 큰조아재비 화분, 메도우 화분 및 재배 호밀 화분으로 구성되는 그룹 내의 화분 모두를 포함한다.

바람직하게는, 화분은 약 2 내지 약 8℃, 더욱 바람직하게는 약 5℃에서 바람직하게는 pH 6.5의 페놀 완충 염수 용액(바람직하게는, 소듐 클로라이드, 포타슘 디-하이드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트 도데카하이드레이트, 80% w/w 액화 페놀 및 주사용수(WFI)를 함유함)으로 추출된다.

바람직하게는, 추출은 약 12-30시간, 더욱 바람직하게는 약 14 내지 약 24시간, 더욱 더 바람직하게는 약 18시간 동안 수행된다.

바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같은 보유액을 분리시키고/시키거나 과량의 글루타르알데하이드를 제거하는데 사용되는 횡류 여과는 5-10kDa의 분자량 컷 오프(cut off)의 막을 이용하여 수행된다. 더욱 바람직하게는, 막은 10kDa의 분자량 컷 오프를 갖는다.

바람직하게는, 흡착물을 분리시키는데 사용되는 횡류 여과는 바람직하게는 1.1-1.3 바(bar)의 압력을 이용한 다중-소결 스테인레스 강철 필터, 더욱 바람직하게는 5 ㎛ 다중-소결 스테인레스 강철 필터를 이용하여 수행된다.

항원 및 아미노산을 포함하는 흡착물은 항원과 강한 산, 바람직하게는 무기 산, 바람직하게는 염산(HCl) 중 아미노산을 혼합시키면서 이러한 혼합물을 바람직하게는 NaOH로 중화시킴으로써 형성된다. 중화는 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 6.8 내지 7.2 범위 내의 값으로의 pH의 조정을 의미한다. 중화 동안 한번도, 또는 최소한 연장된 시간 동안 pH가 평형으로부터 이동, 즉, 6.5 내지 7.5의 pH 범위 외부, 더욱 바람직하게는 6.8 내지 7.2의 pH 범위 외부로 이동하지 않는 것이 요망된다.

바람직하게는, 강한 산은 약 3.5M 내지 약 4.5M, 바람직하게는 약 3.8M의 몰농도를 갖는 HCl이다. 바람직하게는, NaOH는 약 3 내지 약 3.5, 바람직하게는 약 3.2M의 몰농도를 갖는다.

바람직하게는, 조성물은 백신 조성물이다.

한 바람직한 구체예에서, 조성물은 백신으로 사용하기 위한 것이며, 항원은 상기 백신에서 유용한 것이다.

다양한 구체예에서, MPL, 3-DMPL 또는 이들의 유도체 또는 염과 같은 애쥬번트가 조성물에 첨가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 조성물이 제공된다.

상세한 설명

본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구체예가 이제 비제한적인 실시예에 의해 기재될 것이다.

본 발명의 실시는 달리 표시하지 않는 한 당 분야의 당업자의 능력에 속하는 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 설명된다. 예를 들어, 문헌[J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization : Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology : DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; and E. M. Shevach and W. Strober, 1992 and periodic supplements, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY]을 참조하라. 상기 일반 문헌 각각은 본원에 참조로서 포함된다.

항원

용어 "항원"은 면역 반응의 적응 성분, 즉, B 세포 또는 T 세포, 또는 B 세포 및 T 세포 둘 모두에 의해 특별히 인지될 수 있는 임의의 분자를 나타내기 위해 사용된다.

본 발명에서 사용되는 항원은 바람직하게는 면역원, 즉, 그 자신에 대해 면역 반응을 발생시키는 면역 세포를 활성화시키는 항원이다.

항원은 재조합 수단 또는 펩티드 합성에 의해 수득되거나, 자연 공급원 또는 추출물로부터 수득될 수 있고, 임의의 생 또는 비생 유기체로부터 유래될 수 있다.

항원은 박테리아, 예를 들어, 탄저균, 캄필로박터(campylobacter), 콜레라, 디프테리아, 장독소생성 이. 콜리(enterotoxigenic E. coli), 편모충, 임균, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 헤모필루스 인플루엔자 B(Hemophilus influenza B), 비피막형(non-typable) 헤모필루스 인플루엔자, 수막구균, 백일해, 폐렴구균, 살모넬라, 시겔라, 연쇄구균 B(Streptococcus B), 그룹 A 연쇄구균, 파상풍, 비브리오 콜레라, 예르시니아, 포도구균, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 및 클로스트리듐(Clostridia) 종으로부터 유래될 수 있다.

대안적으로, 항원은 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 뎅기 혈청형 1 내지 4, 에볼라(Jahrling et al., Arch Virol Suppl, 11:135-140, 1996), 엔테로바이러스, 간염 혈청형 A 내지 E(Blum, Digestion 56:85-95, 1995; Katkov, Med Clin North Am 80:189-200, 1996; Lieberman and Greenberg, Adv Pediatr Infect Dis 11:333-3631996; Mast et al., Annu Rev Med 47:257-266, 1996) 단순 헤르페스 바이러스 1 또는 2, 인간 면역결핍 바이러스(Deprez et al., Vaccine 14:375-382, 1996), 인플루엔자, 일본 말 뇌염, 홍역, 노르워크(Norwalk), 유두종 바이러스, 파르보바이러스 B19, 폴리오, 광견병, 로타바이러스, 풍진, 홍역, 우두, 말라리아 항원과 같은 다른 항원을 코딩하는 유전자를 함유하는 우두 작제물, 수두, 및 황열로부터 유래될 수 있다. 기생충은, 예를 들어, 이질아메바(Entamoeba histolytica)(Zhang et al., Infect Immun 63:1349-1355); 열원충(Plasmodium)(Bathurst et al., Vaccine 11:449-456, 1993), 톡소포자충증(Toxoplasmosis), 및 연충(Helminth)을 포함한다.

한 바람직한 구체예에서, 항원은 알레르겐이다. 용어 "알레르겐"은 원치 않는 면역 과민성 또는 알레르기 반응을 유발하는 항원을 기재하는데 사용된다. 알레르기는 환경 항원(알레르겐)에 대한 과민성 반응이다.

본 발명에서 사용되는 알레르겐은 임의의 알레르기 유발 물질, 비제한적인 예로, 화분(예를 들어, 겨이삭속 화분, 뚝새풀 화분, 향기풀 화분, 허위 귀리 화분, 브롬 화분, 크레스테드 도그스테일 화분, 오리새 화분, 김의털 화분, 요크셔 안개 화분, 라이 그래스 화분, 큰조아재비 화분, 메도우 화분, 재배 호밀 화분, 래그위드 화분, 머그워트(Mugwort) 화분, 자작나무(Birch) 화분, 오리나무속(Alder) 화분, 개암나무 화분, 올리브 화분, 파리아테리아(Pariateria) 화분, 단풍나무(Maple)(아서 네군도(Acer negundo)) 화분, 사이프리스(Cypress) 화분 및 삼나무(Japanese Cedar)(크립토메리아 자포니카(Cryptomeria japonica)) 화분, 식품, 곤충 독, 곰팡이 및 동물 유래 물질, 예를 들어, 동물 모피 또는 진드기, 예를 들어, 집먼지진드기(예를 들어, 디. 파리내(D. farinae) 또는 디. 프테로니시누스(D. pteronyssinus) 또는 블로미아 트로피칼리스(Blomia tropicalis))으로부터 유래될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 항원은 화분 항원이다. 바람직하게는, 화분 항원은 겨이삭속 화분, 뚝새풀 화분, 향기풀 화분, 허위 귀리 화분, 브롬 화분, 크레스테드 도그스테일 화분, 오리새 화분, 김의털 화분, 요크셔 안개 화분, 라이 그래스 화분, 큰조아재비 화분, 메도우 화분 및 재배 호밀 화분이다.

항원은 항원의 요망되는 면역원성 특성을 보유하거나 향상시키면서 원치않는 유해 효과를 회피하는 것을 돕는 알려진 물질, 비제한적인 예로, 포름알데하이드 또는 글루타르알데하이드, 바람직하게는 글루타르알데하이드와의 반응에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 상기 변형은 당 분야에 공지되어 있다.

아미노산

바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 아미노산은 25℃에서 약 1.1 또는 그 미만의 g/100ml H₂O의 수 용해도를 갖는다. 특히 바람직한 아미노산은 티로신 또는 트립토판이고, 더욱 불용성인 티로신이 바람직하다. 상기 아미노산의 약학적으로 허용되는 유도체, 예를 들어, 벤질-O-옥타데카노일-L-티로신이 본 발명의 범위 내에 또한 포함된다.

제조물

본 발명의 조성물은 항원의 수용액과 강한 수성 산 중 아미노산의 용액을 혼합하고, 용액의 혼합물을 중화시킴으로써, 아미노산 및 항원을 공동 침전시킴으로써 제조된다.

통상적으로, 바람직하게는 pH 6.3 내지 7.2의 항원의 수용액이 강한 수성 산 중 아미노산의 용액과 혼합된다. 강한 산은 보통 무기산, 바람직하게는 염산이다. 본 단계에서 사용되는 항원의 용액은 통상적으로 0.15g/ml 이하의 항원 단백질을 함유한다. 한 구체예에서, 사용되는 아미노산의 용액은 약 24% w/v이다.

항원 및 아미노산의 용액의 생성된 혼합물은 중화된다. 중화 동안 한번도, 또는 최소한 연장된 시간 동안 용액의 pH가 평형으로부터 벗어나지 않는 것이 요망된다. 이러한 조건은 용액의 강한 교반 및 요망시 필요량의 염기의 단독 사용에 의해 충족될 수 있다. 다양한 완충액, 예를 들어, 완충 염수 용액이 혼합 및 중화 단계 동안 pH 조절을 돕기 위해 항원의 용액에 유용하게 첨가될 수 있다.

중화를 수행하는 특히 유용한 방법은 항원의 용액으로 이동되는 아미노산 및 중화 염기의 용액의 독립된 스트림이다. 첨가된 용액의 유량은 pH-상태, 즉, 반응 혼합물의 pH가 소정의 수준에서 실질적으로 일정하게 유지되도록 용액 중 하나 또는 둘 모두의 유동을 조절하는 장비에 의해 조절된다. 본 발명자는 최적 결과가 보통 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 6.8 내지 7.2의 범위 내에서의 pH 조절에 의해 수득되나, 정확한 pH는 항원의 특성에 따라 다양할 수 있는 것을 발견하였다.

중화의 결과는 항원의 용액이 흡장되고/되거나 흡착되는 중 및/또는 그 후의 아미노산의 즉각적인 침전이다.

횡류 여과

다양한 입자의 분할에서 유용한 방법은 횡류 여과 또는 접선-유동 여과(tangential-flow filtration, TFF)이다. 횡류 여과는 크기 또는 분자량 차이를 기초로 하여 액체 용액 또는 현탁액 내의 성분을 분리시키기 위해 막을 사용하는 분리 방법이다. 횡류 여과에서, 여과되는 용액 또는 현탁액은 횡류 방식으로 막의 표면을 가로질러 통과된다. 여과를 위한 추진력은 막간 차압이다. 여과액이 막 표면을 가로질러 통과되는 속도는 또한 여과율을 조절하며, 막의 클로깅(clogging)을 방지하는 것을 돕는다. 횡류 여과는 막 표면을 가로질러 보유액을 재순환시키므로, 막 오염이 최소화되고, 높은 여과율이 유지되고, 생성물 회수가 향상된다.

횡류 여과 장치는 일반적으로 펌프, 공급 용액 저장소, 여과 모듈 및 상기 구성요소를 연결하기 위한 도관을 포함한다. 사용시, 공급 용액은 공급 용액 저장소로부터 여과 모듈로 향하게 되면서, 요망되는 부피의 보유액이 수득될 때까지 여과 모듈로부터의 보유액이 여과 모듈로부터 공급 용액 저장소로 재순환된다.

변형된 항원 및 아미노산을 포함하는 흡착물을 분리시키기 위해 본 발명에서 사용되는 횡류 여과는 바람직하게는 1.1 내지 1.3 바의 압력을 유지시키는 5 ㎛ 포어 크기 다중-소결 스테인레스 강철 필터를 이용하여 수행된다.

폐쇄 시스템

폐쇄 시스템은 시스템의 외부 환경에 대한 조성물의 노출을 방지하는 분리된 시스템이다. 조성물은 폐쇄 시스템을 구성하는 관류(tubing) 및 기계 구성요소의 인접한 환경에만 노출된다. 본 발명의 폐쇄 시스템은 조성물의 오염을 방지한다. 이는 조성물이 시스템에 대한 외부 환경으로부터 밀봉되어, 오염물질이 시스템에 진입하는 것을 방지하는 것을 보장함으로써 달성된다.

애쥬번트

애쥬번트는 본 발명의 방법에 의해 생성되는 조성물에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 애쥬번트는 TH1-유도성 애쥬번트이다. TH1-유도성 애쥬번트는 항원에 대한 TH1 반응을 향상시키는 애쥬번트이다.

TH1-유도성 애쥬번트로서의 애쥬번트의 효과는 다양한 애쥬번트로 또한 구성되는 백신 중 항원의 투여로부터 발생하는 상기 항원에 대해 유도된 항체의 프로파일을 결정함으로써 결정될 수 있다.

바람직하게는, 애쥬번트는 변형된 지질다당류이다. US 특허 제4,912,094호에 기재된 바와 같이, 장내세균 지질다당류(LPS)는 강력한 면역자극제이다. 그러나, 이는 또한 유해하고 때때로 치명적인 반응을 유발시킬 수 있다. LPS와 관련된 내독소 활성이 이의 지질 A 성분으로부터 발생하는 것이 현재 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 더욱 바람직하게는 지질 A의 무독화된 유도체를 이용한다. Ribi ImmunoChem은 본래 정제된 무독화 내독소(refined detoxified endotoxin, RDE)로 알려졌으나, 모노포스포릴 지질 A(MPL)로 알려지게 된 지질 A의 유도체를 생성하였다. US 특허 제4,912,094호에 기재된 바와 같이, MPL은 약 30분의 기간 동안 적당한 강도의 광산 용액(예를 들어, 0.1N HCl) 중에서 그람 음성 박테리아(예를 들어, 살모넬라 종)의 무헵토스(heptoseless) 돌연변이로부터 수득된 LPS 또는 지질 A를 환류시킴으로써 생성된다. 이러한 처리는 환원-말단 글루코사민의 위치 1에서의 포스페이트 모이어티의 상실을 발생시킨다. 또한, 코어 탄수화물이 상기 처리 동안 비-환원 글루코사민의 6' 위치로부터 제거된다.

그러나, 바람직하게는 무독화된 지질 A가 비-환원 글루코사민의 6' 위치에 부착된 코어 모이어티를 보유하는 변형된 LPS 또는 지질 A가 사용된다. 이러한 LPS 및 지질 A의 유도체는 또한 US 특허 제4,912,094호에 기재되어 있다. 더욱 상세히는, US 특허 제4,912,094호에는 상기 지질다당류의 위치 3'에서 환원-말단 글루코사민에 에스테르-연결된 지질다당류의 β-하이드록시미리스틱 아실 잔기만 선택적으로 제거하는 방법에 의해 수득되는 변형된 지질다당류가 개시되어 있으며, 상기 방법은 상기 지질다당류를 알칼리성 가수분해에 적용시키는 것을 포함한다. 상기 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(MPL), 디포스포릴 지질 A(DPL) 및 LPS가 본 발명에서 사용될 수 있다. 따라서, 한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 환원 말단 글루코사민의 위치 3'이 데-O-아실화된 MPL, DPL 또는 LPS를 사용한다. 이들 화합물은 각각 3-DMPL, 3-DDPL 및 3-DLPS로 공지되어 있다.

US 특허 제4,987,237호에서, 화학식

을 갖는 MPL의 유도체가 기재되어 있으며, 여기서 R¹ 및 R²는 H이고, R³는 하나 이상의 원자가 동일하거나 상이할 수 있는 C, H 및 임의로 O, N 및 S로 구성되는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소이고, 여기서 C 원자의 전체 수는 60을 초과하지 않고, 고리는 MPL 핵을 나타낸다.

대안적으로, MPL 유도체는 화학식

을 가지며, 여기서

로 표시되는 유도체의 세그먼트는 2-60개의 C 원자를 함유하고, 여기서 R³는 하나 이상의 원자가 동일하거나 상이할 수 있는 C, H 및 임의로 O, N 및 S로 구성되는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소이고, x는 최소 1이고, 모든 x 세그먼트 내의 C 원자의 전체 수가 60을 초과하지 않도록 하는 임의의 전체 수일 수 있고, 여기서 각각의 R³의 화학 구조는 각각의 상기 세그먼트에서 동일하거나 상이할 수 있고, 여기서 고리는 MPL 핵을 나타낸다.

이용가능하거나 이용가능하게 된 LPS 또는 지질 A의 상기 모든 유도체 또는 염이 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 유도체 및 염은 약학적으로 허용되는 것이다.

투여량 및 조성물의 투여

본 발명에 의해 생성된 조성물은 투여 제형과 양립되는 방식, 및 예방적 및/또는 치료적으로 효과적일 양으로 피검체에 투여될 수 있다. 일반적으로 용량 당 5 ㎍ 내지 250 ㎍의 항원의 범위 내인 투여되는 양은 치료되는 피검체, 항체를 합성하는 피검체의 면역계의 능력, 및 요망되는 보호의 정도에 좌우된다. 바람직한 범위는 용량 당 약 20 ㎍ 내지 약 40 ㎍이다.

적합한 용량 크기는 약 0.5 ml이다. 따라서, 피하 주사용 용량은, 예를 들어, 0.5% 애쥬번트와 혼합된 20 ㎍의 면역원을 함유하는 0.5 ml를 포함한다.

투여되는 것이 필요한 활성 성분의 정확한 양은 진료의의 판단에 좌우될 수 있으며, 각각의 피검체에 대해 고유할 수 있다.

조성물은 단일 용량 스케줄, 또는 바람직하게는 다수 용량 스케줄로 제공될 수 있다. 다수 용량 스케줄은 예방접종의 일차 과정이 1-20개의 분리된 용량을 이용하여 이루어질 수 있고, 이후 면역 반응을 유지시키고/시키거나 강화시키는데 필요한 이후의 시간 간격, 예를 들어, 이차 용량에 대해 1 내지 4개월의 간격으로 다른 용량이 제공되고, 필요시, 수개월 후에 이후의 용량(들)이 제공되는 것이다. 투여 요법은 또한 적어도 부분적으로는 개체의 필요에 의해 결정될 것이며, 이는 진료의의 판단에 좌우될 것이다.

또한, 항원(들)을 함유하는 조성물은 다른 면역조절제, 예를 들어, 면역글로불린과 함께 투여될 수 있다.

도면의 설명

도 1. 아미노산 흡착물을 분리시키는데 사용되는 횡류 여과 시스템의 개략적 대표도.

도 2. 횡류 여과에서 사용되는 개략적 다중-소결 스테인레스 강철 필터; 도면은 필터 하우징(A) 및 정위 어셈블리(assembly in-situ)(B)를 도시한다.

도 3. 추출 용액으로의 화분 항원의 추출의 개략도. VL001 내의 에반스 용액(Evans Solution)이 5℃ +/- 3℃로 냉각되고, 2000ml가 빼내어지고, 미리 칭량된 화분을 현탁시키는데 사용된다. 이후, 이러한 현탁액은 VL001에 첨가되고, 여기서 이는 시간 및 온도 조절과 함께 18시간 동안 추출되고, PLC 및 관련 데이터 로거(logger)에 의해 로깅(logging)된다. 추출 용액은 이후 0.2 ㎛ 필터 트레인(filter train)을 통해 여과되고, 다음 단계로 이동한다.

도 4. 화분 항원을 포함하는 보유액을 분리시키기 위한 횡류 여과의 개략도. 추출 용액은 TFF 필터 카세트를 통해 재순환되고, 여기서 정용여과는 폐기를 위해 저분자량 물질을 분리시키고, 순환 용액 중에 고분자량 물질을 보유시킨다. 폐기물에서 수용된 부피는 TNK01으로 펌핑된 에반스 용액에 의해 대체된다. 이는 5 부피 변화가 발생할 때까지 수행된다.

도 5. 글루타르알데하이드를 이용한 화분 항원의 변형의 개략도. 미리 칭량된 글루타르알데하이드가 정용여과된 용액에 첨가된다. 첨가된 후, 용액은 진탕과 함께 방치되어 1-2시간 동안 변형된다.

도 6. 과량의 글루타르알데하이드의 제거의 개략도. 변형이 완료된 후, 5 부피의 변화가 발생할 때까지 정용여과가 반복된다. 이는 변형 과정 동안 사용되지 않은 임의의 글루타르알데하이드를 제거하는 작용을 한다.

도 7. 변형된 용액이 TFF 시스템으로부터 포스페이트 첨가 용기 CGV020로 분배되는 것을 도시하는 개략도. 미리 제조된 포스페이트 완충액이 이후 첨가되고, 용액이 혼합된다. 이는 이후 공동-침전 단계로 진행할 준비가 된다.

도 8. PLC 제어가 정확한 비율의 중화를 보장하기 위해 NaOH 및 HCl/티로신의 첨가율을 일치시키는 작용을 하는 방법을 도시하는 개략도. 염수 세척 단계 동안, 염수가 첨가되어 폐기되는 부피 손실을 대체하는 것이 보장된다. 모든 중요 데이터는 문서 및 전자 사본 둘 모두로 로깅된다.

도 9. VL003 내의 용액의 염 농도가 5㎛ 횡류 필터를 통한 재순환에 의해 감소되는 방법을 도시하는 개략도. 폐기되는 부피 손실은 낮은 농도의 염수 완충액에 의해 대체됨으로써, 전체 염 함량이 낮아진다.

도 10. 염수 세척이 완료된 후, 살균 여과된 압축 공기가 VL003에 적용되어, 현탁액이 전달 라인을 통해 무균실 내에 위치된 전용 보유 용기 VL005로 이동되어지는 것을 도시하는 개략도.

도 11. 공동-침전 반응이 이후 접선 유동 여과 시스템으로부터의 변형된 추출물/포스페이트 완충액 혼합물을 이용하여 반복되는 것을 도시하는 개략도.

도 12. 모든 연결을 도시하는 공동-침전 시스템의 개략도.

도 13. 공동-침전 고체의 염 감소 동안 세척 액체가 빼내어지는 펌프, 횡류 필터 및 투과 살균 필터 O.2 ㎛ 사이의 연관을 나타내는 설계 단계의 도표.

본 발명의 추가의 바람직한 특징 및 구체예는 이제 비제한적인 실시예에 의하고, 수반하는 도면을 참조로 하여 기재될 것이다:

실시예

13개의 생 풀 화분(겨이삭속 화분, 뚝새풀 화분, 향기풀 화분, 허위 귀리 화분, 브롬 화분, 크레스테드 도그스테일 화분, 오리새 화분, 김의털 화분, 요크셔 안개 화분, 라이 그래스 화분, 큰조아재비 화분, 메도우 화분 및 재배 호밀 화분)이 진탕과 함께 18시간 동안 5℃에서 에반스 용액(pH 6.5)(소듐 클로라이드, 포타슘 디-하이드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트 도데카하이드레이트, 80% w/w 액화 페놀 및 주사용수)을 갖는 맞춤 스테인레스 강철 용기에서 추출된다. 이후, 혼합물이 Pall 필터 또는 유사물을 통해 0.2㎛로 여과되어 고체가 제거된다. 상기 공정 제어기는 온도 및 추출 용기로의 유동 냉각제를 조절한다. 공정에서의 추출 기간의 말단에서 상기 공정의 효과를 결정하기 위해 여과액의 시험이 수행된다. 이들은 pH, IgE 반응성, IgG 효능, 알레르겐 및 중합체 프로파일을 포함한다.

화분 추출물은 이제 10kDa 분자량 컷-오프(cut-off) 막을 이용하여 5 부피 변화를 위해 0.2 내지 0.6 바의 막간 차압을 이용하여 Cogent 접선 유동 시스템을 통해 통과시킴으로써 정용여과를 경험한다. 보유액이 깨끗한 소독 용기에 분배되고, 10 중량%의 글루타르알데하이드 용액이 첨가되고, 변형이 이제 2시간 동안 발생하여 알레르고이드(allergoid)가 형성된다. 상기 공정의 이점은 IgE가 감소되고, IgG 유도 능력이 보유된다는 점이다. 변형의 정도는 다양하나, 약 50 내지 100%의 이내여야 한다.

변형된 추출물은 이후 과량의 글루타르알데하이드를 제거하기 위해 5 내지 10kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 막을 이용하여 에반스 용액 pH 7.0(소듐 클로라이드, 포타슘 디-하이드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트 도데카하이드레이트, 80% w/w 액화 페놀 및 주사용수)에 대한 Cogent 접선-유동 시스템을 통한 두번째 정용여과 단계를 겪는다. 최종 추출물(약물 물질)은 일차 아민 손실; 단백질 함량; IgE 반응성; IgG 효능 및 중합체 프로파일을 포함하는 일련의 품질 보증 시험에 제공된다.

약물 물질은 0.2 ㎛ 포어 크기 필터를 통해 깨끗한 미리-소독된 용기로 살균 여과되고, 여기에 추가의 살균 여과된 포스페이트 완충액(소듐 디하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트, 디소듐 포스페이트 도데카하이드레이트, 주사용수)이 필요한 농도로 첨가된다. 3.8M 염산 및 3.2M 소듐 하이드록사이드 중 24% 살균 L-티로신이 고 전단 교반기가 장비된 반응 용기에 동시에 첨가되고, 공동-침전이 발생한다. 이러한 공정은 높은 염 함량을 발생시키고, 이는 폐쇄된 시스템 내에서 5 ㎛ 횡류 다중-소결 스테인레스 강철 필터를 이용하여 티로신 침전물을 세척함으로써 감소된다. 분리를 달성하기 위해 5 ㎛ 횡류 필터가 사용되고, 부피 손실이 저농도 염수 완충액으로 대체되고, 티로신 흡착된 알레르고이드가 이후 살균 압축 공기를 보유 용기에 적용시켜 현탁액을 배출시킴으로써 새로운 깨끗한 미리-살균된 용기로 회수된다. 모든 물질 전달을 위한 파이프 기구(Pipework)는 폐쇄된 정치 세척(Clean in Place, CIP)/정치 증기(Steam in Place, SIP)이다.

제조 후, 활성 벌크는 맞춤 장비에서 유지되고, 혼합 및 3ml 부틸 혈청 마개 바이얼로의 무균 충전을 위한 MPL 및 티로신의 첨가를 위해 희석 용기로 옮겨진다.

예시된 방법은 상기 공정의 중요 양태에서 논리 제어를 가지며, 위(false) 양성 오염 결과의 가능성을 최소화시키기 위해 Nova Septum 살균 연결을 이용한다. 상기 방법은 순응성을 보장하기 위해 공정 제어(in process control) 및 직렬식 시험(in line testing)을 갖는다. 장비는 위험한 물질에 대한 작업자의 노출을 최소화시키고, 충분히 효과적인 깨끗하고 살균인 공정을 제공하기 위해 적절히 깨끗한 적절한 증기 기술을 이용하도록 설계되었다.

상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구체예와 관련하여 기재되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명은 상기 특정한 구체예로 과도하게 제한되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 또한, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형이 하기 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

Claims

아미노산에 흡착된 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서,
(i) 하나 이상의 항원의 용액과 수성 산 중 아미노산의 용액을 혼합하면서 상기 용액의 혼합물을 중화시킴으로써, 하나 이상의 항원 및 아미노산을 포함하는 흡착물을 형성시키는 단계;
(ii) 횡류 여과(cross-flow filtration)에 의해 완충액으로 흡착물을 분리시킴으로써 상기 조성물을 형성시키는 단계; 및
(iii) 상기 조성물을 회수하는 단계를 포함하며,
상기 단계 (i) 내지 (iii)가 살균 환경 내 및 정치 세척 (clean in place, CIP) 및 정치 증기(steam in place, SIP) 폐쇄 시스템 내에서 수행되는, 방법.
제 1항에 있어서, 아미노산이 티로신인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 하나 이상의 항원이 글루타르알데하이드로 변형되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 하나 이상의 항원이 화분으로부터 유래되는 방법.
제 1항에 있어서, 글루타르알데하이드로 변형되고 티로신에 흡착된 하나 이상의 화분 항원을 포함하는 조성물을 제조하는 것을 포함하는 방법으로서, 이러한 방법이,
(i) 하나 이상의 화분 항원을 글루타르알데하이드로 변형시키는 단계;
(ii) 횡류 여과를 이용하여 과량의 글루타르알데하이드를 제거하여 변형된 화분 용액을 형성시키는 단계;
(iii) 변형된 화분 용액과 수성 산 중 티로신의 용액을 혼합하면서 이러한 용액의 혼합물을 중화시킴으로써, 변형된 화분 및 티로신을 포함하는 흡착물을 형성시키는 단계;
(iv) 횡류 여과에 의해 완충액으로 흡착물을 분리시킴으로써 상기 조성물을 형성시키는 단계; 및
(v) 상기 조성물을 회수하는 단계를 포함하고,
상기 단계 (iii) 내지 (v)가 살균 환경 내 및 정치 세척 (clean in place, CIP) 및 정치 증기(steam in place, SIP) 폐쇄 시스템 내에서 수행되는, 방법.
제 1항에 있어서, 글루타르알데하이드로 변형되고 티로신에 흡착된 하나 이상의 화분 항원을 포함하는 조성물을 제조하는 것을 포함하는 방법으로서, 이러한 방법이,
(i) 하나 이상의 화분 항원을 용액으로 추출하여 화분 추출 용액을 형성시키는 단계;
(ii) 화분 추출 용액을 여과시켜 고체를 제거하는 단계;
(iii) 횡류 여과를 수행하고, 화분 항원을 포함하는 보유액을 분리시키는 단계;
(iv) 글루타르알데하이드로 하나 이상의 화분 항원을 변형시키는 단계;
(v) 횡류 여과를 이용하여 과량의 글루타르알데하이드를 제거하여 변형된 화분 용액을 형성시키는 단계;
(vi) 변형된 화분 용액을 살균 여과시키는 단계;
(vii) 변형된 화분 용액과 수성 산 중 티로신의 용액을 혼합하면서 이러한 용액의 혼합물을 중화시킴으로써, 변형된 화분 및 티로신을 포함하는 흡착물을 형성시키는 단계;
(viii) 횡류 여과에 의해 완충액으로 흡착물을 분리시킴으로써 상기 조성물을 형성시키는 단계; 및
(ix) 상기 조성물을 회수하는 단계를 포함하고,
상기 단계 (vii) 내지 (ix)가 살균 환경 내 및 정치 세척 (clean in place, CIP) 및 정치 증기(steam in place, SIP) 폐쇄 시스템 내에서 수행되는, 방법.
제 1항, 제 2항, 제 5항 및 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 겨이삭속(Bent) 화분, 뚝새풀(Foxtail) 화분, 향기풀(Sweet vernal) 화분, 허위 귀리(False oat) 화분, 브롬(Brome) 화분, 크레스테드 도그스테일(Crested dogstail) 화분, 오리새(Cocksfoot) 화분, 김의털(Fescue) 화분, 요크셔 안개(Yorkshire fog) 화분, 라이 그래스(Rye grass) 화분, 큰조아재비(Timothy) 화분, 메도우(Meadow) 화분 및 재배 호밀(Cultivated rye) 화분의 화분 항원을 포함하는 방법.
제 6항에 있어서, 추출 단계 (i)이 18시간 동안 2 내지 8℃에서 페놀성 완충 용액을 이용하여 수행되는 방법.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 횡류 여과를 이용하여 과량의 글루타르알데하이드를 제거하는 것이 5 내지 10kDa의 분자량 컷-오프(cut-off)를 갖는 막을 이용하여 수행되는 방법.
제 1항, 제 2항, 제 5항 및 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 횡류 여과를 이용하여 항원 및 아미노산을 포함하는 흡착물을 분리시키는 것이 다중-소결 스테인레스 강철 필터를 이용하여 수행되는 방법.
제 10항에 있어서, 다중-소결 스테인레스 강철 필터가 5㎛ 포어 크기 필터인 방법.
제 1항, 제 2항, 제 5항 및 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 및 아미노산을 포함하는 흡착물이 3.8M의 몰농도를 갖는 HCl 중에서 항원과 아미노산을 혼합하면서 이러한 혼합물을 3.2M의 몰농도를 갖는 NaOH를 이용하여 중화시킴으로써 형성되는 방법.
제 1항, 제 2항, 제 5항 및 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 비경구 사용을 위해 요망되는 농도로 희석되는 방법.
제 1항, 제 2항, 제 5항 및 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트가 상기 조성물에 첨가되는 방법.
제 14항에 있어서, 애쥬번트가 MPL, 3-DMPL 또는 이의 유도체 또는 염인 방법.
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