BR112013026759B1

BR112013026759B1 - Método de preparação de uma composição

Info

Publication number: BR112013026759B1
Application number: BR112013026759-3A
Authority: BR
Inventors: Murray Skinner; Simon Hewings; Duncan Packer; Richard Poland
Original assignee: Allergy Therapeutics (Uk) Limited
Priority date: 2011-04-21
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2021-12-21
Also published as: US9731004B2; CA2833319C; PT2699255T; DK2699255T3; MX2013012207A; HUE030623T2; GB201320508D0; GB2504444B; PE20140883A1; PL2699255T3; WO2012143732A1; CA2833319A1; CN103608034A; KR101945265B1; JP2014517824A; EP2699255A1; CN103608034B; ES2613089T3; AU2012246087B2; GB2504444A

Abstract

processo para preparação de composição de vacina. método para preparação de uma composição compreendendo um ou mais antígenos adsorvidos por um aminoácido, onde o dito método compreende: (i) mistura de uma solução de um ou mais antígenos com uma solução de aminoácidos em um ácido aquoso, enquanto neutralizando a mistura das soluções, pelo que formando um adsorvato compreendendo um ou mais antígenos e os aminoácidos; (ii) separação do adsorvato em um tampão por filtração em fluxo cruzado, formando assim a dita composição, e (iii) recuperação da dita composição; onde as etapas (i) a (iii) são realizadas em um ambiente estéril e dentro de um sistema fechado.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção se refere a um método para a fabricação de uma composição estéril que compreende um antígeno modificado ligado a um aminoácido.

Antecedentes da Invenção

[0002] A vacinação é a aplicação mais conhecida e bem- sucedida dos princípios imunológicos para a saúde humana.

[0003] De modo a ser introduzida e aprovada, a vacina deve ser eficaz e a eficácia de todas as vacinas foi avaliada ao longo do tempo. Uma vacina eficaz deve: induzir a resposta imune desejada; ser estável em armazenamento, e apresentar imunogenicidade suficiente. Com as vacinas não vivas, especificamente, é muitas vezes necessário controlar a liberação do antígeno seguindo-se a administração.

[0004] A ligação de um antígeno a um aminoácido suspenso demonstrou resultar na liberação lenta do antígeno após a administração, aumentando assim a segurança enquanto aperfeiçoando a eficácia através do prolongamento da exposição. No entanto, a fabricação de formulações contendo tais antígenos é problemática, uma vez que a adsorção do antígeno pelo aminoácido resulta em subprodutos químicos indesejados que precisam ser removidos. Além disso, o processo deve ser realizado em condições estéreis. À medida que o produto final é uma suspensão que não pode ser esterilizada por filtração e, como o componente ativo é biológico o mesmo não pode ser esterilizado por calor. Por conseguinte, suspensões estéreis são frequentemente fabricadas por centrifugação dentro de um conjunto asséptico.

[0005] A Patente USA 4.070.455 descreve micropartículas finamente divididas de tirosina que apresentam um alérgeno tratado com glutaraldeído disperso nas mesmas. As micropartículas são preparadas por mistura de uma solução de tirosina em um ácido aquoso forte com uma solução de pólen de tasneira tratado com glutaraldeído e, em seguida, neutralizando a solução resultante. As micro-partículas finas de tirosina contendo o alérgeno modificado são removidas por centrifugação.

[0006] O documento EP 0988862 descreve a formulação de um antígeno, um adjuvante indutor de TH-1 e um aminoácido moderadamente solúvel em água e para uso em imunização. A formulação é preparada por mistura de uma solução de um antígeno e o adjuvante indutor de TH1 com uma solução de aminoácido moderadamente solúvel ou um derivado em um ácido aquoso forte, enquanto neutralizando a mistura de soluções, pelo que, coprecipitando o aminoácido moderadamente solúvel e antígeno. O precipitado resultante é removido da solução por centrifugação, reconstituído com tampão fresco e o adjuvante adicionado.

[0007] O uso de centrifugação para remover o aminoácido/antígeno precipitado requer um grau substancial de exposição asséptica e uma alta dependência da interação do operador. A presente invenção resolve este problema.

Sumário da Invenção

[0008] A presente invenção supera os problemas da técnica precedente através da criação de um sistema que separa o adsorvato de antígeno/aminoácido usando filtração em contracorrente. O sistema adapta filtros de aço inoxidável sinterizados esterilizáveis por vapor, rotineiramente usados na filtração frontal por inclusão dos mesmos em um sistema de circuito fechado personalizado. Isto permite que o adsorvato de antígeno/aminoácido e os subprodutos químicos sejam removidos através do filtro, conforme um novo tampão é adicionado para manter o volume e especificação.

[0009] O requisito tecnológico surgiu com base na incapacidade de esterilizar terminalmente, ou filtrar o produto de adsorvato de tirosina modificado por alérgeno (MATA) que é insolúvel e deve ser fabricado em instalações estéreis. A fim de garantir a esterilidade era necessário o desenvolvimento de um sistema de limpeza no local (CIP) vapor no local (SIP). A natureza fechada do sistema significa que o componente MATA insolúvel precisou ser mantido suspenso na solução durante as etapas de troca de tampão e formulação. Para tal, um sistema de filtração em contracorrente contínuo foi desenvolvido como descrito no presente documento.

[0010] Devido à natureza fechada e capacidade de esterilização por vapor, é possível posicionar o hardware fora do local asséptico (embora ainda dentro das áreas de produção controladas). Por conseguinte, a presente invenção apresenta vantagens distintas em relação aos métodos de produção existentes. O método da invenção reduz substancialmente a exposição do produto de antígeno ao ambiente por apresentar um sistema asséptico fechado. O método também reduz a necessidade de intervenção física, o que faz com que o método não corra riscos de apresentar erro e contaminação microbiana.

[0011] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de preparação de uma composição compreendendo um ou mais antígenos adsorvidos por um aminoácido, onde o método compreende:(i) mistura de uma solução de um ou mais antígenos com uma solução de aminoácidos em um ácido aquoso, enquanto neutralizando a mistura das soluções, pelo que formando um adsorvato compreendendo um ou mais antígenos e os aminoácido;(ii) separação do adsorvato em um tampão por filtração em contracorrente, formando assim a dita composição, e(iii) recuperação da dita composição;onde as etapas (i) a (iii) são realizadas em um ambiente estéril e dentro de um sistema fechado.

[0012] De preferência, o aminoácido é um aminoácidomoderadamente solúvel.

[0013] De preferência, o aminoácido é tirosina,triptofano ou um derivado dos mesmos. Maispreferencialmente, o aminoácido é tirosina.

[0014] Preferencialmente, o um ou mais antígenos sãomodificados com glutaraldeído.

[0015] Em uma modalidade particularmente preferida, o umou mais antígenos são derivados de pólen, ácaros, fungos, bactérias ou vírus.

[0016] Em uma modalidade, o método compreende apreparação de uma composição compreendendo um ou mais antígenos de pólen modificados com glutaraldeído e adsorvidos pela tirosina, o dito método compreendendo:(i) modificação de um ou mais antígenos de pólen com glutaraldeído;(ii) remoção do excesso de glutaraldeído utilizando filtração em contracorrente para formar uma solução de pólen modificado;(iii) mistura da solução de pólen modificado com uma solução de tirosina em um ácido aquoso, enquanto neutralizando a mistura das soluções, pelo que formando um adsorvato modificado compreendendo o pólen e a tirosina,(iv) separação do adsorvato em um tampão por filtração em contracorrente, formando assim a dita composição, e(v) recuperação da dita composição;

[0017] onde as etapas (iii) a (v) são realizadas em umambiente estéril e dentro de um sistema fechado. Preferivelmente as etapas (iii) a (v) são realizadas em um ambiente de Classificação EU GMP ‘C’/ISO Classe 7. Preferivelmente as etapas (i) e (ii) são realizadas em um ambiente de Classificação EU GMP ‘B’/ISO Classe 5.

[0018] Em outra modalidade, o método compreende apreparação de uma composição consistindo em um ou mais antígenos de pólen modificados com glutaraldeído e adsorvidos pela tirosina, onde o dito método compreende: (I) extração de um ou mais antígenos de pólen na solução de modo a formar uma solução de extrato de pólen; (II) filtração da solução de extrato de pólen para remover os sólidos; (III) realização da filtração em contracorrente e isolamento do retentado contendo o antígeno de pólen; (iv) modificação de um ou mais antígenos de pólen com glutaraldeído; (v) remoção do excesso de glutaraldeído utilizando filtração em contracorrente para formar uma solução de pólen modificado; (vi) filtração estéril da solução de pólen modificado; (vii) mistura da solução de pólen modificado com uma solução de tirosina em um ácido aquoso, enquanto neutralizando a mistura das soluções, formando assim um adsorvato compreendendo o pólen modificado e a tirosina; (viii) separação do adsorvato em um tampão por filtração em contracorrente, pelo que formando assim a dita composição, e (ix) recuperação da dita composição

[0019] onde as etapas (vii) a (ix) são realizadas em um ambiente estéril e dentro de um sistema fechado. Preferivelmente as etapas (vii) a (ix) são realizadas em um ambiente de Classificação EU GMP ‘C’/ISO Classe 7. Preferivelmente as etapas (i) e (vi) são realizadas em um ambiente de Classificação EU GMP ‘B’/ISO Classe 5.

[0020] O antígeno de pólen pode ser, porém não está limitado ao pólen de agrostis, pólen de vulpino dos prados, pólen de capim santo, pólen de gramínea falsa aveia, pólen de gramínea bromus, pólen de cauda de cão de crista, pólen de panasco, pólen de gramínea festuca, pólen de grama veludo, azevém, pólen de um tipo de gramínea (Timothy), pólen de gramínea do prado e pólen de centeio cultivado.

[0021] De preferência, um ou mais antígenos consistem pólen de agrostis, pólen de vulpino dos prados, pólen de capim santo, pólen de gramínea falsa aveia, pólen de gramínea bromus, pólen de cauda de cão de crista, pólen de panasco, pólen de gramínea festuca, pólen de grama veludo, azevém, pólen de um tipo de gramínea (Timothy), pólen de gramínea do prado e pólen de centeio cultivado.

[0022] De preferência, a solução de extrato de pólen é filtrada através do uso de um filtro de 0,2 μm de tamanho de poro.

[0023] Dito de outra forma, a composição compreende de preferência todos os pólens no grupo constituído por pólen de agrostis, pólen de vulpino dos prados, pólen de capim santo, pólen de gramínea falsa aveia, pólen de gramínea bromus, pólen de cauda de cão de crista, pólen de panasco, pólen de gramínea festuca, pólen de grama veludo, azevém, pólen de um tipo de gramínea (Timothy), pólen de gramínea do prado e pólen de centeio cultivado.

[0024] De preferência, o pólen é extraído em uma solução de salmoura tamponada, fenólica, de preferência a um pH de 6,5 (de preferência contendo cloreto de sódio, fosfato de potássio diidrogenado, dodecaidrato fosfato dissódico, fenol líquido a 80% peso/peso e água para injetáveis (WFI)) a cerca de 2°C a cerca de 8°C, mais preferivelmente cerca de 5°C. De preferência, a extração é realizada durante cerca de 12-30 horas, mais preferivelmente cerca de 14 a cerca de 24 horas, mais preferencialmente ainda durante cerca de 18 horas.

[0025] De preferência, a filtração em contracorrenteutilizada para isolar o retentado e/ ou para remover o excesso de glutaraldeído como descrito no presente documento é realizada usando uma membrana de 5-10kDa de corte de peso molecular. Mais preferencialmente, a membrana apresenta um corte de peso molecular de 10kDa.

[0026] De preferência, a filtração em contracorrenteutilizada para separar o adsorvato é realizada utilizando um filtro de aço inoxidável polissinterizado, de preferência um filtro de aço inoxidável polissinterizado de 5 μm, preferivelmente com uma pressão entre 110-130 kPa.

[0027] O adsorvato compreendendo o antígeno e oaminoácido é formado por mistura do antígeno com o aminoácido em um ácido forte, preferencialmente um ácido inorgânico, de preferência ácido clorídrico (HCl), enquanto neutralizando a mistura, de preferência com NaOH. O termo neutralização significa um ajuste do pH a um valor dentro do intervalo de 6,5 a 7,5, de preferência 6,8 a 7,2. É desejável que, em nenhum momento, ou pelo menos não por um tempo prolongado, durante a etapa de neutralização, o pH se desloque do equilíbrio, isto é, se desloque para fora da faixa de pH de 6,5 a 7,5 ou mais preferivelmente para fora da faixa de pH de 6,8 a 7,2.

[0028] De preferência, o ácido forte é HCl apresentando uma molaridade de cerca de 3,5M a cerca de 4,5M, de preferência cerca de 3,8 M. De preferência, NaOH apresenta uma molaridade de cerca de 3 a cerca de 3,5, de preferência cerca de 3,2M.

[0029] De preferência, a composição é uma composição de vacina.

[0030] Em uma modalidade preferida, a composição se destina ao uso como uma vacina e o antígeno é um que seja útil em tal vacina.

[0031] Nas várias modalidades, um adjuvante pode ser adicionado à composição, tais como MPL, 3-DMPL ou um derivado ou sal do mesmo.

[0032] De acordo com outro aspecto da presente invenção é provida uma composição preparada pelo método da invenção.

Descrição detalhada

[0033] Várias características e modalidades preferenciais da presente invenção serão descritas agora por meio de exemplos não limitantes.

[0034] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado ao contrário, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia que estão dentro das capacidades de uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica. Tais técnicas são explicadas na literatura. Vide, por exemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. e outros (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York,N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing. Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O’D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A PracticalApproach, Iri Press; D. M. J. Litley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; and E. M. Shevach and W. Strober, 1992 and periodic supplements, Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons, New York, NY.

Antígeno

[0035] O termo "antígeno" é empregado para indicarqualquer molécula que pode ser reconhecida especificamente pelos elementos adaptativos da resposta imune, isto é, as células B ou células T, ou ambas.

[0036] O antígeno utilizado na presente invenção é de preferência um imunógeno, isto é, um antígeno que ativa células imunes para gerar uma resposta imune contra si mesmas.

[0037] O antígeno pode ser obtido por meios recombinantes ou por síntese de peptídeos, ou a partir de fontes naturais ou de extratos e pode ser derivado de qualquer organismo vivo ou não.

[0038] O antígeno pode ser derivado de bactérias, tais como, por exemplo, o antraz, Campylobacter, cólera, difteria, E. coli enterotoxigênico, giardia, gonococo, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza B, Hemophilus influenza não tipificável, meningococo, tosse convulsa, pneumococos, salmonela, Shigella, Streptococcus B, Streptococcus do grupo A, tétano, Vibrio cholerae, Yersinia, Staphylococcus, Pseudomonas e espécies de Clostridium.

[0039] Alternativamente, o antígeno pode ser derivado de vírus, tal como, por exemplo, adenovírus, sorotipos da dengue 1 a 4, Ebola (Jahrling e outros, Arch Virol Suppl, 11:135140, 1996), enterovírus, sorotipos A a E da hepatite (Blum, Digestion 56:85-95, 1995; Katkov, Med Clin North Am 80:189200, 1996; Lieberman e Greenberg, Adv Pediatr Infect Dis 11:333-3631996; Mast e outros, Annu Rev Med 47:257-266, 1996), vírus da herpes simplex 1 e 2, o vírus da imunodeficiência humana (Deprez e outros, Vaccine 14:375382, 1996), gripe, encefalite equina japonesa, sarampo, vírus de Norwalk, papiloma vírus B19, poliomielite, raiva, rotavírus, rubéola, vaccinia, construções de vaccinia contendo genes que codificam outros antígenos, tais como, antígenos de malária, varicela e febre amarela. Os parasitas incluem, por exemplo: Entamoeba histolytica (Zhang e outros, Infect Immun 63:1349-1355); Plasmodium (Bathurst e outros, Vaccine 11:449-456, 1993), Toxoplasmose e os helmintos.

[0040] Em uma modalidade preferida, o antígeno é um alérgeno. O termo "alérgeno" é utilizado para descrever um antígeno que induz uma hipersensibilidade imune indesejada ou reação alérgica. Uma alergia é uma reação de hipersensibilidade a um antígeno ambiental (alérgeno).

[0041] O alérgeno utilizado na presente invenção pode ser derivado de qualquer substância que provoque alergia, tal como, porém não limitado, ao pólen (por exemplo, pólen de agrostis, pólen de vulpino dos prados, pólen de capim santo, pólen de gramínea falsa aveia, pólen de gramínea bromus, pólen de cauda de cão de crista, pólen de panasco, pólen de gramínea festuca, pólen de grama veludo, azevém, pólen de um tipo de gramínea (Timothy), pólen de gramínea do prado e pólen de centeio cultivado, pólen de tasneira, pólen de artemísia, pólen de bétula, pólen de amieiro, pólen da aveleira, pólen da oliveira, pólen de priateria, pólen de bordo (Acer negundo), pólen de cipreste e cedro japonês (Cryptomeria japônica), alimentos, veneno para insetos e material derivado de animais, tais como, peles ou ácaros, tais como, ácaros de poeira doméstica (por exemplo, D. farinae e D. pteronyssinus ou Blomia tropicalis).

[0042] Preferivelmente, o antígeno usado na presenteinvenção é um antígeno de pólen. De preferência, os antígenos de pólen são do pólen de agrostis, pólen de vulpino dos prados, pólen de capim santo, pólen de gramínea falsa aveia, pólen de gramínea bromus, pólen de cauda de cão de crista, pólen de panasco, pólen de gramínea festuca, pólen de grama veludo, azevém, pólen de um tipo de gramínea (Timothy), pólen de gramínea do prado e pólen de centeio cultivado.

[0043] O antígeno pode ser modificado quimicamente porreação com substâncias conhecidas, por exemplo, porém não se limitando ao formaldeído ou glutaraldeído, de preferência o glutaraldeído, que mantém ou aumenta as propriedades imunogênicas desejadas do antígeno, enquanto ajuda a evitar efeitos adversos indesejados. Tais modificações são conhecidas na técnica.

Aminoácido

[0044] De preferência, o aminoácido utilizado na presente invenção apresenta uma solubilidade em água de cerca de 1,1 ou menos de g/100 mL de H2O a 25°C. Os aminoácidos particularmente preferidos são tirosina ou triptofano, a tirosina mais insolúvel sendo preferível. Derivados farmaceuticamente aceitáveis destes aminoácidos estão também incluídos no âmbito da presente invenção, tal como, benzil- O-octadecanoil-L-tirosina.

Preparação

[0045] A composição da presente invenção é preparada por mistura de uma solução aquosa do antígeno, com uma solução do aminoácido em um ácido aquoso forte e neutralizando a mistura da solução, pelo que coprecipitando assim o aminoácido e antígeno.

[0046] Tipicamente, uma solução aquosa do antígeno, de preferência a um pH de 6,3-7,2, é misturada com uma solução de aminoácido em um ácido aquoso forte. O ácido forte é normalmente um ácido inorgânico, preferivelmente ácido clorídrico. A solução de antígeno utilizada nessa etapa contém, tipicamente até 0,15 g/mL de antígeno protéico. Em uma modalidade, a solução de aminoácido empregada é de cerca de 24% p/v.

[0047] A mistura resultante de solução de antígeno e aminoácidos é neutralizada. É desejável que em nenhum momento, ou pelo menos não por um tempo prolongado durante a neutralização que o pH da solução se desvie do equilíbrio. Esta condição pode ser cumprida por uma agitação vigorosa da solução e com o uso apenas da quantidade necessária de base, se desejado. Vários agentes de tamponamento, tais como, solução salina tamponada podem ser adicionados, de forma útil, às soluções de antígeno para auxiliar no controle do pH durante as fases de mistura e de neutralização.

[0048] Um método especificamente útil de realizar a neutralização é separar as correntes da solução de aminoácidos e base de neutralização a serem empregadas na solução de antígeno. As vazões das soluções adicionadas são controladas por estado do pH, isso é, por equipamento que regula o fluxo de uma ou ambas as soluções, de modo que o pH da mistura de reação permanece substancialmente constante em um nível predeterminado. Verificou-se que os melhores resultados são normalmente obtidos pelo controle do pH na faixa de 6,5 a 7,5, de preferência 6,8 a 7,2, embora o pH preciso possa variar de acordo com a natureza do antígeno.

[0049] O resultado da neutralização é a precipitação imediata do aminoácido, dentro e/ou pelo que a solução de antígeno é ocluída e/ou adsorvida.

Filtração em contracorrente

[0050] Um método que tem sido útil para o fracionamento de várias partículas é de filtração em contracorrente ou filtração de fluxo tangencial (TFF). A filtração em contracorrente é um processo de separação que utiliza membranas para separar componentes em uma solução ou suspensão líquida com base no tamanho ou diferenças de peso da molécula. Na filtração em contracorrente, a solução ou suspensão a ser filtrada é passado através da superfície da membrana em um modo de contracorrente. A força motriz para a filtração é a pressão da transmembrana. A velocidade na qual o filtrado é passado através da superfície da membrana também controla a taxa de filtração e ajuda a evitar o entupimento da membrana. Uma vez que a filtração em contracorrente recircula o retentado através da superfície da membrana, a obstrução da membrana é minimizada, uma taxa elevada de filtração é mantida e a recuperação do produto é melhorada.

[0051] Dispositivos de filtração em contracorrente compreendem geralmente uma bomba, um reservatório de solução de alimentação, um módulo de filtração, e condutos de ligação desses elementos. Em utilização, a solução de alimentação é dirigida a partir do reservatório de solução de alimentação para o módulo de filtração, enquanto o retentado a partir do módulo de filtração é recirculado a partir do módulo de filtração para o reservatório de solução de alimentação até que o volume desejado de produto retido seja obtido.

[0052] A filtração em contracorrente usada na presente invenção para separar o adsorvato compreendendo o antígeno modificado e o aminoácido é de preferência realizada utilizando um filtro de aço inoxidável polissinterizado de 5 μm de tamanho de poro mantendo a pressão entre 110-130 kPa.

Sistema fechado

[0053] Um sistema fechado é um sistema isolado que evita a exposição da composição ao ambiente externo do sistema. A composição só é exposta ao ambiente imediato de componentes da tubulação e da máquina que constituem o sistema fechado. O sistema fechado da presente invenção evita a contaminação da composição. Isso é obtido assegurando-se que a composição seja vedada do ambiente externo ao sistema, impedindo a entrada de contaminantes no sistema.

Adjuvante

[0054] Um adjuvante pode ser adicionado à composição obtida pelo método da presente invenção. De preferência, o adjuvante é um adjuvante TH1. Um adjuvante TH1 é um adjuvante que aumenta a resposta de TH1 a um antígeno.

[0055] A eficácia de um adjuvante como um adjuvante indutor de TH1 pode ser determinada através da determinação do perfil de anticorpos dirigidos contra um antígeno resultando da administração desse antígeno às vacinas que são também constituídas dos vários adjuvantes.

[0056] De preferência, o adjuvante é um lipopolissacarídeo modificado. Conforme descrito na Patente US número 4.912.094, os lipopolissacarídeos enterobacterianos (LPS) são um poderoso imunoestimulante. No entanto, eles também podem promover respostas prejudiciais e, por vezes, fatais. Sabe-se agora que as atividades endotóxicas associadas aos LPS resultam do seu componente lipídeo A. Por conseguinte, a presente invenção utiliza de preferência mais de um derivado de lipídeo A destoxificado. Ribi ImmunoChem produziu um derivado de lipídeo A originalmente conhecido como endotoxina destoxificada refinada (RDE), porém que se tornou conhecido como monofosforil-lipídeo A (MPL). Conforme descrito na Patente US número 4.912.094, o MPL é produzido por refluxo de LPS ou lipídeo A obtidos de mutantes heptoseless de bactérias gram negativas (por exemplo, Salmonella sp.) em soluções ácidas minerais de força moderada (por exemplo, HCl 0,1 N) durante um período de cerca de 30 minutos. Este tratamento resulta na perda da porção fosfato na posição 1 da glucosamina redutora final.

[0057] Além disso, o carboidrato do núcleo é removido da posição 6' da glicosamina não redutora durante esse tratamento.

[0058] De preferência, contudo, um LPS modificado ou lipídeo A é empregado, no qual o lipídeo A destoxificado retém fração central ligada à posição 6’ da glicosamina não redutora. Esses derivados de LPS e o lipídeo A são também descritos na Patente USA Número 4.912.094. Em mais detalhes, a Patente US 4.912.094 descreve um lipopolissacarídeo modificado, que é obtido através do método de remoção seletiva apenas do resíduo acil β-hidroximiristico do lipopolissacarídeo que é ligado pelo éster à glicosamina redutora final na posição 3' do dito lipopolissacarídeo, que compreende sujeição do dito lipopolissacarídeo à hidrólise alcalina. O lipídeo A de monofosforila de-O-acilado (MPL), lipídeo A de difosforila (DPL) e LPS podem ser utilizados na presente invenção. Assim, em uma modalidade preferida, a presente invenção utiliza MPL, DPL ou LPS em que a posição 3' da extremidade redutora de glicosamina é des-O-acilada. Esses compostos são conhecidos como 3-DMPL, 3-DDPL e 3-DLPS respectivamente.

[0059] Na Patente US número 4.987.237 são descritos os derivados de MPL que apresentam a fórmula:

e em que R1 e R2 são H, R3 é um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada composto por C, H e opcionalmente O, N e S, em que, se mais de um átomo for o mesmo ou diferente, o número total de átomos de carbono não excederá a 60 e o círculo representará um núcleo de MPL.

[0060] Alternativamente, o derivado de MPL apresenta a fórmula:

[0061] em que o segmento do derivado representado por

[0062] contém 2 a 60 átomos de C e em que R3 é um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada composto por C, H e opcionalmente O, N e S, em que, se mais de um átomo for o mesmo ou diferente, e x for pelo menos 1 poderá ser qualquer número inteiro, de tal modo que o número total de átomos de carbono em todos os segmentos de x não exceda 60, e em que a estrutura química de cada R3 pode ser igual ou diferente em cada um desses segmentos e em que o círculo representa um núcleo de MPL.

[0063] Todos tais derivados ou sais de LPS ou lipídeo A que são ou se tornem disponíveis podem ser utilizados na presente invenção. De preferência, os derivados e sais são aqueles que são farmaceuticamente aceitáveis.

Dosagem e Administração das Composições

[0064] As composições produzidas pela presente invenção podem ser administradas a um indivíduo de uma forma compatível com a formulação de dosagem, e em uma quantidade que seja profilática e/ou terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada, que está geralmente na faixa de 5 μg a 250 μg de antígeno por dose, depende do indivíduo a ser tratado, capacidade do sistema imune do indivíduo de sintetizar anticorpos, e grau de proteção desejado. Uma faixa preferida é de cerca de 20 μg a cerca de 40 μg por dose.

[0065] Uma quantidade de dosagem adequada é de cerca de 0,5 mL. Desse modo, uma dose para injeção subcutânea, por exemplo, seria constituída por 0,5 mL contendo 20 μg de imunógeno em mistura com 0,5% de adjuvante.

[0066] As quantidades precisas de ingrediente ativo necessárias a serem administradas podem depender do julgamento do profissional e podem ser peculiares a cada indivíduo.

[0067] A composição pode ser administrada em um esquema de dose única ou, de preferência, em uma programação de dose múltipla. A programação de dose múltipla é uma em que um curso preliminar de vacinação pode ser de 1-20 doses separadas, seguido por outras doses fornecidas em intervalos de tempo subsequentes, os quais são necessários para manter e ou reforçar a resposta imune, por exemplo, em 1 a 4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma dose subsequente (s) após vários meses. O regime de dosagem será também, pelo menos em parte, determinado pela necessidade do indivíduo e dependerá da opinião do médico.

[0068] Além disso, a composição contendo o antígeno (s)pode ser administrada em conjunção com outros agentes imunorreguladores, por exemplo, imunoglobulinas.

Descrição das Figuras

[0069] Figura 1. Fluxograma do sistema de filtração em contracorrente empregado para separar o adsorvato dos aminoácidos.

[0070] Figura 2. Fluxograma do filtro de aço inoxidávelpolissinterizado empregado na filtração em contracorrente; a figura mostra o alojamento do filtro (A) e montagem in situ (B).

[0071] Figura 3. Fluxograma da extração de antígenos dopólen na solução de extrato. A solução de Evans em VL001 é resfriada para 5°C +/- 3°C, 2.000 mL são retirados eempregados para suspender o pólen pré-pesado. Essa suspensão é então adicionada a VL001 onde é realizada a extração por18 horas com tempo e temperatura controlados e registradospelo PLC e um dispositivo de registro de dados associado. A solução de extrato é então filtrada através de um filtro de 0,2 μm antes de passar para o próximo estágio.

[0072] Figura 4. Fluxograma do sistema de filtração emcontracorrente para isolar o retentado compreendendo o antígeno de pólen. A solução de extrato é recirculada através do cassete de filtro TFF, onde a diafiltração remove matéria de peso molecular baixo para descarte e mantém matéria de peso molecular alto na solução circulante. O volume de resíduos recebido é substituído por Solução de Evans bombeada para TNK01. Isso é realizado até 5 alterações de volume terem ocorrido.

[0073] Figura 5. Fluxograma da modificação dos antígenosde pólen com glutaraldeído. Glutaraldeído previamente pesado é adicionado à solução diafiltrada. Uma vez adicionada, a solução passa por agitação para modificação por 1 a 2 horas.

[0074] Figura 6. Fluxograma da remoção do excesso deglutaraldeído. Uma vez que a modificação tenha sido completada, a diafiltração é repetida novamente até cinco mudanças de volume terem ocorrido. Isso remove qualquer glutaraldeído não utilizado durante o processo de modificação.

[0075] Figura 7. Fluxograma mostrando que a solução modificada é distribuída a partir do sistema de TFF para dentro do recipiente CGV020 de adição de fosfato. Tampão de fosfato pré-fabricado é então adicionado e a solução misturada. Desse modo a mesma está pronta para passar para o estágio de co-precipitação.

[0076] Figura 8. Fluxograma mostrando como o controle de PLC atua para combinar as taxas de adição de NaOH e HCl/tirosina de modo a assegurar que a neutralização esteja na taxa correta. Desse modo, durante a fase de lavagem com salmoura é assegurado que a salmoura seja adicionada substituindo a perda de volume para descarte. Todos os dados críticos são registrados como cópias em papel e em formato eletrônico.

[0077] Figura 9. Fluxograma mostrando como a concentração de sal da solução dentro de VL003 é reduzida por recirculação através de um filtro de contracorrente de 5 μm. O volume perdido para descarte é substituído por tampão de salmoura em baixa concentração diminuindo assim o teor total de sal.

[0078] Figura 10. Fluxograma mostrando que uma vez que as lavagens com salmoura tenham sido completadas, ar comprimido filtrado e estéril é aplicado ao VL003 forçando a suspensão através de uma linha de transferência para um recipiente dedicado de espera VL005, localizado no conjunto asséptico.

[0079] Figura 11. Fluxograma mostrando que a reação de co-precipitação é repetida com a mistura de extrato modificado/tampão fosfato a partir do sistema de filtração em fluxo tangencial

[0080] Figura 12. Fluxograma do sistema de co- precipitação mostrando todas as conexões.

[0081] Figura 13. Fluxograma no estágio de projeto mostrando a ligação entre a bomba, filtro de contracorrente e filtro estéril de permeado de 0,2 μm, através do qual o licor de lavagem é arrastado durante a redução do sal dos sólidos de co-precipitação.

[0082] Outras características adicionais e preferidas além das modalidades da presente invenção serão descritas agora, por meio de exemplo não limitante e com referência aos desenhos anexos, nos quais:

Exemplo

[0083] Treze pólens de gramíneas (pólen de agrostis, pólen de vulpino dos prados, pólen de capim santo, pólen de gramínea falsa aveia, pólen de gramínea bromus, pólen de cauda de cão de crista, pólen de panasco, pólen de gramínea festuca, pólen de grama veludo, azevém, pólen de um tipo de gramínea (Timothy), pólen de gramínea do prado e pólen de centeio cultivado) são extraídos em um recipiente de aço inoxidável personalizado com solução de Evans (pH 6,5) (cloreto de sódio, fosfato de potássio dihidrogenado, dodecahidrato fosfato dissódico, Fenol Liquefeito e Água a 80% p/p para injetáveis) a 5°C por 18 horas com agitação. A mistura é em seguida filtrada até 0,2 μm para remover os sólidos através de um filtro Pall ou semelhante. O controlador do processo regula a temperatura e o fluxo refrigerante para o recipiente de extração. Ao final do período de extração no processo é realizado um teste do filtrado para determinar a eficácia do processo. O teste inclui pH, reatividade a IgE, potência IgG, perfil do alérgeno e polimérico.

[0084] O extrato de pólen agora sofre diafiltração passando através de um sistema de fluxo tangencial Cogent usando uma pressão de transmembrana entre 20 e 60 kPa por cinco mudanças de volume usando uma membrana de corte de peso molecular de 10kDa. O retentado é dispensado em um recipiente limpo e higienizado e uma solução de glutaraldeído a 10% em peso, é adicionada e a modificação é realizada agora por 2 horas para formar alergóides. As vantagens desse processo são capacidade de indução de IgG mantida e de IgE reduzida. O grau de modificação varia, porém, deve ser da ordem de 50 a 100%.

[0085] O extrato modificado sofre então um segunda etapa de diafiltração através do sistema de fluxo tangencial Cogent contra solução de Evans em pH 7,0 (cloreto de sódio, fosfato de potássio diidrogenado, dodecahidrato de fosfato dissódico, Fenol Liquefeito e Água 80% p/p para injetáveis) utilizando uma membrana com um corte de peso molecular de 5 a 10kDa para remover o excesso de glutaraldeído. O extrato final (medicamento) é submetido a uma bateria de testes de garantia de qualidade, incluindo a perda de amina primária; teor de proteína; reatividade IgE, potência de IgG e perfil polimérico.

[0086] A substância medicamentosa é estéril e filtradaatravés de um filtro de 0,2 μm de tamanho de poro, em um recipiente limpo e pré-higienizado ao qual é acrescentado, adicionalmente, tampão fosfato filtrado e estéril (diidrato fosfato sódico diidrogenado, dodecahidrato fosfatodissódico, água para injetáveis) na concentração necessária. L-tirosina estéril a 24% em 3,8M ácido clorídrico e 3,2M hidróxido de sódio são adicionados simultaneamente ao recipiente de reação equipado com um agitador de cisalhamento alto e a co-precipitação ocorre. Esse processo resulta em umalto teor de sal, que é reduzido por lavagem do precipitadode tirosina utilizando um filtro de aço inoxidável de 5 μm polissinterizado em contracorrente em um sistema fechado. Umfiltro de contracorrente de 5 μm é empregado para obter separação e o volume perdido é substituído por tampão de salmoura de baixa, o alergóide adsorvido da tirosina é então recuperado em um recipiente pré-esterilizado, limpo por aplicação de ar comprimido estéril ao recipiente de espera forçando a suspensão para fora. A tubulação para toda transferência de material é limpa no local (CIP)/com vapor no local (SIP).

[0087] Após a fabricação, o volume ativo é mantido no equipamento sob medida e transferido para um recipiente de diluição onde são realizadas adições de tirosina e MPL para mistura e envasamento asséptico em frascos de soro de 3 mL de butila com rolha.

[0088] O método exemplificado apresenta controle lógico sobre os aspectos críticos do processo e utiliza conexões estéreis Nova Septum para minimizar a possibilidade de resultados de contaminação falso-positivos. O método apresenta controles de processo e testes de linha para assegurar a conformidade. O equipamento foi projetado para minimizar a exposição dos operários aos materiais perigosos e utiliza limpeza no local, tecnologia de uso de vapor no local para prover processos de limpeza e esterilização plenamente válidos.

[0089] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas como referência. Inúmeras modificações e variações dos métodos descritos e sistema da presente invenção serão evidentes aos versados na técnica, sem com isso nos afastarmos do escopo e do espírito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferidas e especificas, deverá ser entendido que a invenção como reivindicada não deverá ser indevidamente limitada às modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para se realizar a invenção, as quais são óbvias aos versados na bioquímica e biotecnologia ou campos correlatos estão incluídas no âmbito das reivindicações que se segue.

Claims

1. Método de preparação de uma composição consistindo em um ou mais antígenos adsorvidos a um aminoácido caracterizado por compreender: (i) misturar uma solução de um ou mais antígenos com uma solução de aminoácido em um ácido aquoso, durante neutralização da mistura de soluções, formando, assim, um adsorvato compreendendo um ou mais dos antígenos e o aminoácido; (ii) separar o adsorvato em um tampão por filtração em contracorrente, formando, assim, a dita composição; e (iii) recuperar a dita composição; em que as etapas (i) a (iii) são realizadas em um ambiente estéril e dentro de um sistema fechado de limpeza no local (CIP) e de vapor no local (SIP), em que o aminoácido é tirosina; e em que um ou mais dos antígenos é(são) modificado(s) com glutaraldeído.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um ou mais dos antígenos ser(em) derivados de pólen.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a preparação de uma composição consistindo em um ou mais antígenos de pólen modificados com glutaraldeído e adsorvidos à tirosina, o dito método compreendendo: (i) modificar um ou mais antígenos de pólen com glutaraldeído; (ii) remover o excesso de glutaraldeído utilizando filtração em contracorrente para formar uma solução de pólen modificado; (iii) misturar a solução de pólen modificado com uma solução de tirosina em um ácido aquoso, durante neutralização da mistura de soluções, formando, assim, um adsorvato modificado compreendendo o pólen e a tirosina; (iv) separar o adsorvato em um tampão de filtração em contracorrente, formando, assim, a dita composição; e (v) recuperar a dita composição; em que as etapas (iii) a (v) são realizadas em um ambiente estéril e dentro de um sistema fechado de limpeza no local (CIP) e de vapor no local (SIP).

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a preparação de uma composição consistindo em um ou mais antígenos de pólen modificados com glutaraldeído e adsorvidos à tirosina, em que o dito método compreende: (i) extrair um ou mais antígenos de pólen na solução para formar uma solução de extrato de pólen; (ii) filtrar a solução de extrato de pólen para remover os sólidos; (iii) realizar a filtração em contracorrente e isolar o retentado contendo o antígeno de pólen; (iv) modificar um ou mais antígenos de pólen com glutaraldeído; (v) remover o excesso de glutaraldeído utilizando filtração em contracorrente para formar uma solução de pólen modificado; (vi) filtrar, de forma estéril, a solução de pólen modificado; (vii) misturar a solução de pólen modificado com uma solução de tirosina em um ácido aquoso, durante neutralização da mistura de soluções, formando, assim, um adsorvato compreendendo o pólen modificado e a tirosina; (viii) separar o adsorvato em um tampão por filtração em contracorrente, formando, assim, a dita composição; e (ix) recuperar a dita composição; em que as etapas (vii) a (ix) são realizadas em um ambiente estéril e dentro de um sistema fechado de limpeza no local (CIP) e de vapor no local (SIP).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 4, caracterizado por a composição conter os antígenos de pólen: pólen de agrostis, pólen de vulpino dos prados, pólen de capim santo, pólen de gramínea falsa aveia, pólen de gramínea bromus, pólen de cauda de cão de crista, pólen de panasco, pólen de gramínea festuca, pólen de grama veludo, pólen Timothy, pólen de gramínea do prado e pólen de centeio cultivado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por a etapa de extração (i) ser realizada utilizando uma solução fenólica tamponada de 2 a 8°C durante 18 horas.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado por a remoção do excesso de glutaraldeído utilizando filtração em contracorrente ser realizada usando uma membrana com um corte de peso de 5 a 10kDa.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a separação do adsorvato compreendendo o antígeno e o aminoácido usando filtração em contracorrente ser realizada utilizando um filtro de aço inoxidável polisinterizado.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o filtro de aço inoxidável polisinterizado ser um filtro de tamanho de poro de 5 μm.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o adsorvato compreendendo o antígeno e o aminoácido ser formado por mistura do antígeno com o aminoácido em HCl apresentando uma molaridade de 3,8M durante neutralização da mistura com NaOH apresentando uma molaridade de 3,2M.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por a dita composição ser diluída para a concentração desejada para uso parenteral.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por um adjuvante ser adicionado à dita composição.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o adjuvante ser MPL, 3-DMPL ou um derivado ou sal dos mesmos.