JP6891125B2 - インフルエンザワクチン乾燥製剤、及び、インフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、インフルエンザワクチンを含有する乾燥製剤に関する。より詳細には、本発明は、厳密に温度管理することなく保存してもインフルエンザワクチンの活性を安定に維持することができ、安定に供給されうるインフルエンザワクチン乾燥製剤に関する。また、本発明は、該インフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法に関する。

インフルエンザは、インフルエンザウイルスによる急性感染症の一種である。インフルエンザウイルスが感染し、インフルエンザを発症するまでの潜伏期間は、通常１〜２日間である。発症した場合には、３８度以上の発熱が現れ、全身倦怠感、頭痛、関節痛、筋肉痛等の全身症状に加え、喉の痛み、咳、鼻汁等の症状が現れる。一般に、１週間以内に回復する。インフルエンザは、高齢者、乳幼児、妊婦、呼吸器系や循環器系に慢性疾患を有する患者、糖尿病患者、慢性腎不全患者等が発症した場合、肺炎や気管支炎等の合併症を引き起すことがあり、重篤化して死に至ることもある。また、インフルエンザは短期間に集中して流行するため、社会的な影響を及ぼし、経済的な損失を生じさせることがある。

インフルエンザの重篤化を防ぐには、インフルエンザワクチンの投与が最も有効な方法である。インフルエンザワクチン製剤は、注射剤や点鼻剤として使用される液剤が一般的である。
しかしながら、インフルエンザワクチン液剤を流通させる場合、インフルエンザワクチンの失活を防ぐため、流通及び保存の全工程で温度管理（いわゆるコールドチェーン）が必要となる。インフルエンザは地域により時期は異なるが、世界中で流行しており、温度管理が難しい国や地域に、インフルエンザワクチン抗原の活性を維持したまま、流通させることは困難である。

また、現在利用可能なインフルエンザワクチンは、生きた弱毒化インフルエンザワクチンと不活化させたインフルエンザワクチンとに大別される。更に、不活化インフルエンザワクチンは、（１）ホルマリン等で不活化された全粒子ウイルス、（２）有機溶媒や界面活性剤を用いてウイルス粒子を粉砕し、脂質エンベローブを可溶化させたスプリットワクチン、（３）ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミダーゼ（ＮＡ）を精製したサブユニットワクチンの３種類に分類される。これらのうち、現在市販されているインフルエンザワクチンは、スプリットワクチン及びサブユニットワクチンの２種類である。いずれのワクチンも、通常、有機溶媒や界面活性剤を用いてウイルス粒子を粉砕し、種類に応じてウイルスタンパク質を分離又は精製して調製される。
しかしながら、インフルエンザウイルス粒子はステロール含有量が高く、一般的に安定であるが、ウイルス粒子を粉砕し、ウイルス粒子の脂質物質を除去して、ウイルスタンパク質を分離又は精製した場合、保存期間中に経時的に力価が低下する等の問題が生じる。このようにスプリットワクチン及びサブユニットワクチンは必ずしも安定とはいえないことから、インフルエンザワクチン抗原の活性を維持するため、流通及び保存の全工程で温度管理が必要となっている。

このようなインフルエンザワクチン液剤の欠点を克服するための方法として、乾燥製剤の形態にする試みがなされている。
例えば、特許文献１には、インフルエンザウイルスを、増粘剤とともに噴霧乾燥し、粒子を製造することがすることが開示されている。例えば、特許文献２には、抗原を種々の添加剤とともに噴霧乾燥し、紛体を製造することが開示されている。例えば、特許文献３には、安定化剤としてスクロース、結合剤としてデキストラン、賦形剤としてキサンタンガムを含む溶液を凍結乾燥することにより、インフルエンザ生ワクチンである弱毒化インフルエンザウイルスを安定化した医薬組成物が提案されている。例えば、特許文献４には、安定化剤として、疎水性アミノ酸（フェニルアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン）及びアルギニン塩酸塩を含む溶液を凍結乾燥することにより、インフルエンザＨＡワクチンを安定化した医薬組成物が提案されている。

季節性インフルエンザＨＡワクチンは１年ごとに流行型が変更されるワクチンであり、３価（Ａ型２種類及びＢ型１種類）もしくは４価（Ａ型２種類及びＢ型２種類）の混合型が主流である。しかしながら、ウイルス型によってアミノ酸配列や立体構造が異なることから、従来のワクチン製剤化技術では、複数のインフルエンザＨＡワクチンを１つの医薬組成物として安定的に貯蔵することが困難であった。

国際公開第２００４／０５８１５６号 国際公開第２００２／１０１４１２号 国際公開第２００２／０１３８５８号 特許第５３８８８４２号公報

上記の状況を鑑みて、本発明は、厳密に温度管理することなく保存してもインフルエンザワクチンの活性を安定に維持することができ、安定に供給されうるインフルエンザワクチン乾燥製剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、インフルエンザワクチン乾燥製剤の製造工程においても、そこに含まれるインフルエンザワクチン抗原の活性低下を生じることなく、インフルエンザワクチン乾燥製剤を製造する方法を提供することを目的とする。

上記の解題を解決するため、鋭意検討した結果、本発明者らは、種々の添加剤のなかでも特に二糖と、アミノ酸を含有することにより、従来の液剤のように厳密に温度管理することなく保存しても、インフルエンザワクチンの活性を安定に維持できることを見出した。
また、このようなインフルエンザワクチン乾燥製剤は、安価に供給されうる二糖とアミノ酸によりインフルエンザワクチンが安定化されているため、このようなインフルエンザワクチン乾燥製剤もまた、安定に供給されうるものである。

すなわち、本発明は、インフルエンザワクチン抗原、二糖及びアミノ酸を含有し、上記二糖は、トレハロース、イソマルト、スクロース、マルトース、メリビオース、パラチノース及びラクチュロースからなる群より選択される１種以上であり、上記アミノ酸は、リジン、プロリン、トレオニン、オルニチン、システイン、ヒドロキシプロリン、及び、それらの塩、並びに、アルギニン塩酸塩からなる群より選択される１種以上であることを特徴とするインフルエンザワクチン乾燥製剤である。
上記インフルエンザウイルス抗原は、不活化抗原であることが好ましく、上記不活化抗原は、スプリットワクチン抗原又はサブユニットワクチン抗原であることが好ましく、なかでも、上記不活化抗原は、スプリットワクチン抗原であることが好ましい。
また、本発明は、インフルエンザワクチン抗原、二糖、及び、アミノ酸を含有するインフルエンザワクチン抗原含有水溶液を、乾燥するインフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法であって、上記二糖は、トレハロース、イソマルト、スクロース、マルトース、メリビオース、パラチノース及びラクチュロースからなる群より選択される１種以上であり、
上記アミノ酸は、リジン、プロリン、トレオニン、オルニチン、システイン、ヒドロキシプロリン、及び、それらの塩、並びに、アルギニン塩酸塩からなる群より選択される１種以上であるインフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法でもある。
以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、インフルエンザワクチン抗原を含有する。
ここにいう「乾燥製剤」とは、含水率が１５質量％以下である製剤を意味する。上記乾燥製剤のうち、含水率が、１０質量％以下であるものを、特に、低含水率乾燥製剤という。
なお、ここにいう「含水率」とは、第十六改正日本薬局方、一般試験法、乾燥減量法（以下、単に乾燥減量法ともいう）に従い求める。すなわち、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤の試験片を１０５℃、３時間の条件で加熱したときの質量の減少割合により求める。
本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、固形製剤であることが好ましい。ここにいう固形製剤とは、室温（２５℃）で固体である医薬品調製物、すなわち、流動性を有しない医薬品調製物を意味する。

上記インフルエンザワクチン抗原に使用されるインフルエンザウイルスは特に限定されず、例えば、Ａ型インフルエンザワクチン抗原、Ｂ型インフルエンザワクチン抗原等が挙げられる。上記インフルエンザワクチン抗原に使用されるインフルエンザウイルスは、１種類だけであってもよいが、Ａ型１種類以上及びＢ型１種類以上の２種類以上のインフルエンザワクチン抗原を含むことが好ましい。なかでも、Ａ型インフルエンザワクチン抗原では、Ｈ１Ｎ１型及びＨ３Ｎ２型が好ましく、Ｂ型インフルエンザワクチン抗原では、山形系統及びビクトリア系統のほか、ブリスベン系統が好ましい。

上記インフルエンザワクチンは特に限定されないが、生ウイルス又は不活化抗原を用いることができる。なかでも、上記インフルエンザウイルス抗原は、不活化抗原であることが好ましく、上記不活化抗原としては、不活化全粒子ウイルス、スプリットワクチン抗原又はサブユニットワクチン抗原を用いることができ、好ましくは、スプリットワクチン抗原又はサブユニットワクチン抗原であり、より好ましくは、スプリットワクチン抗原である。
上記不活化抗原としては、例えば、発育鶏卵でウイルス粒子を増殖させた後、有機溶媒や界面活性剤を用いてウイルス粒子を粉砕し、種類に応じてウイルスタンパク質を分離又は精製して調製されたスプリットワクチン抗原又はサブユニットワクチン抗原であることが好ましく、スプリットワクチン抗原であることがより好ましい。

上記スプリットワクチン抗原の種類は特に限定されず、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原、ノイラミダーゼ（ＮＡ）抗原、マトリックス（Ｍ１）抗原、マトリックス（Ｍ２）抗原、核タンパク（ＮＰ）抗原等が挙げられる。なかでも、インフルエンザワクチン乾燥製剤の投与により感染予防に効果的な免疫を獲得させる観点から、ウイルス表面抗原であるヘマグルチニン（ＨＡ）抗原が好ましい。
上記インフルエンザワクチン抗原は２種類以上のワクチン抗原を含有してもよく、単一のワクチン抗原を含有してもよい。

上記インフルエンザワクチン抗原を製造する方法は特に限定されず、従来公知の方法を使用することができる。例えば、インフルエンザ患者又はインフルエンザ感染動物から単離されたウイルス型を定法によって鶏卵や細胞等に感染させて培養し、精製したウイルス原液からインフルエンザワクチン抗原を製造してもよい。また、遺伝子工学的に組換えウイルスや特定の抗原を種々の細胞で産生させたものを材料として、インフルエンザワクチン抗原を製造してもよい。

本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤において、上記インフルエンザワクチン抗原は有効量含有されていれば良いが、例えば、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤中、抗原の合計量として、１回投与量あたり０．０１μｇ〜１．０ｍｇの範囲で含有されていることが好ましい。０．０１μｇ未満であると、感染症の予防又は治療剤としての機能が不充分となることがあり、１．０ｍｇを超えると、安全性に関して問題となることがある。上記抗原含有量のより好ましい下限は０．１μｇ、より好ましい上限は５００μｇである。
本明細書にいう「抗原の質量」とは、特記する場合を除き、ワクチン組成物中の抗原に含まれる全抗原タンパク質の合計質量のことである。したがって、抗原が、ウイルス等生体由来物質である場合は、その抗原に含まれる全タンパク質の質量を意味する。また、複数種類の抗原を含む場合は、その合計質量を意味する。

本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、二糖及びアミノ酸を含有する。
本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、これらの成分を含有するので、厳密に温度管理することなく保存してもインフルエンザワクチン抗原の活性を高い活性で安定に維持することができる。

上記二糖は、トレハロース、イソマルト、スクロース、マルトース、メリビオース、パラチノース及びラクチュロースからなる群より選択される少なくとも１種以上であることが好ましい。これらの二糖は、上記インフルエンザワクチン抗原を安定化するものであり、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤に含有される。
上記二糖は、トレハロース、イソマルト及びスクロースからなる群より選択される１種以上であることがより好ましい。
更に、二糖は、トレハロース及び／又はイソマルトであることが更に好ましい。トレハロース及びイソマルトは、特に安定化効果が高く、また、アミノ酸とともに乾燥製剤にした場合、副反応としてメイラード反応があるが、それを防止することができることからも非還元糖であるトレハロース、イソマルトが好ましい。

上記二糖の含有量は、インフルエンザワクチン乾燥製剤の全質量に基づいて、好ましくは５〜７０質量％、より好ましくは２０〜７０質量％である。
上記二糖の含有量が、５質量％未満であると充分なワクチン安定性が得られない可能性がある。

上記アミノ酸は、アルギニン、リジン、プロリン、トレオニン、オルニチン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒドロキシプロリン、及び、それらの塩からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。これらのアミノ酸は、上記インフルエンザワクチンを安定化するものであり、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤に含有される。
上記アミノ酸は、Ｌ−型であることがより好ましい。
上記アミノ酸は、アルギニン塩酸塩、プロリン、トレオニン、及び、オルニチン塩酸塩からなる群より選択される１種以上であることが更に好ましい。これは、厳密に温度管理することなく保存してもインフルエンザワクチン抗原の活性を高い活性で安定に維持することができるためである。
更に、上記アミノ酸は、アルギニン塩酸塩であることが最も好ましい。アルギニン塩酸塩を二糖と併用することにより、Ａ型インフルエンザ抗原、特にＨ３Ｎ２抗原、及び、Ｂ型インフルエンザ抗原の活性をより効果的に安定に維持することができるので、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型、及び、Ｂ型インフルエンザ抗原の全ての活性を安定に維持することができる。
なお、本明細書にいう塩とは、任意の有機酸または無機酸の塩であってよいが、好ましくは薬学的に許容される塩である。なかでも塩酸塩がより好ましい。

上記アミノ酸の含有量は、インフルエンザワクチン乾燥製剤の全質量に基づいて、好ましくは０．１〜５０質量％、より好ましくは１〜４０質量％、最も好ましくは１〜１０質量％である。上記アミノ酸の含有量が、０．１質量％未満であると充分なワクチン安定性が得られない可能性がある。

本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、免疫賦活化剤（アジュバント）を含有することが好ましい。
上記アジュバントとしては、例えば、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニスト、及び、環状ジヌクレオチド又はその誘導体若しくは塩からなる群より選択される少なくとも１種類が挙げられる。なかでも、ＴＬＲ４アゴニストが好ましい。

上記ＴＬＲ４アゴニストとしては、リポポリサッカライド又はその塩が好適に挙げられる。なお、本明細書にいうリポポリサッカライドは、リポポリサッカライドそれ自体のほか、その性質を有する限りその誘導体若しくは改変体であってもよい。
また、上記リポポリサッカライドは、グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又はその改変体であってもよく、合成品であってもよい。
上記グラム陰性菌としては、例えば、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｉｄｉｃａｌｄｕｓ属、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ属、Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ属、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属、Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｓａｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｅｌｎａｐｉａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｏｚａｋｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｎｅｏａｓａｉａ属、Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓｔｅｎｏｒｔｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｔｅｌｌａ属、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｖｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ属、Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ属等が挙げられる。上記グラム陰性菌としては、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｖｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｅｎｏｒｔｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属等が挙げられる。
なかでも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属由来、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属由来、Ｐａｎｔｏｅａ属由来、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属由来、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属由来又はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属由来のものであることが好ましい。これらは、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、特にＰａｎｔｏｅａ属由来は、現在健康食品として用いられており、より有効であるといえる。これらの菌由来の抽出物又はその改変体をそのまま用いることも可能である。

リポポリサッカライドとして、上記グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又は精製したリポポリサッカライドを用いる場合には、一般的には生体への安全性を加味する必要があり、これらを解毒化した改変体を用いることもできる。一方、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ等）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ等）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ等）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ等）、Ｐａｎｔｏｅａ属（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ等）は、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、これらの菌由来の抽出物又は精製したリポポリサッカライドをそのまま用いることも可能である。

上記リポポリサッカライドの誘導体としては、例えば、その多糖部分を除去した誘導体、具体的には、リピドＡ、モノホスホリルリピッドＡ、３−脱−アシル化モノホスホリルリピッドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）等が挙げられる。
上記リポポリサッカライドの多糖部分を除去したリピドＡとしては、上記グラム陰性菌由来の単離物、或いは、これらグラム陰性菌由来の単離物と同じ構造になるように合成した物を用いてもよい。
また、上記リピドＡの改変体としては、脱リン酸化を行ったモノホスホリルリピッド又はその塩若しくは誘導体も好適に用いられる。なお、本明細書にいうモノホスホリルリピッドの誘導体は、モノホスホリルリピッドの性質を有する限り本発明に用いられることができる。特に既に医療用途で免疫賦活剤として実績がある３Ｄ−ＭＰＬ、又は、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号明細書で提案されている脱アシル化されていない合成Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄが生体への安全性の観点から好ましい。
また、上記モノホスホリルリピッドとしては、安全性及び使用前例のあるサルモネラ菌由来のものも好適に用いられる。
上記環状ジヌクレオチドとしては、環状ジプリンヌクレオチドが好ましく、その特性を有する限りその塩若しくは誘導体であってよい。環状ジプリンヌクレオチドとしては、例えば、安全性の面から、環状ジグアノシンモノフォスフェートであるｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、環状ジアデノシンモノフォスフェートであるｃ−ｄｉ−ＡＭＰが好ましく用いられる。

上記アジュバントの含有量は、例えば、１個体に１回投与のために、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤中、０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲で含有されていることが好ましい。０．１μｇ未満であると、充分な感染症の予防又は治療剤としての機能が得られないことがあり、１００ｍｇを超えると、安全性に関して問題となることがある。上記免疫賦活剤含有量のより好ましい下限は０．３μｇ、より好ましい上限は５０ｍｇである。

本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、厳密に温度管理することなく保存してもインフルエンザワクチン抗原の活性を高い活性で安定に維持することができるため、従来の液剤に比べて、流通及び保存を容易にできる。
本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、例えば、０〜５０℃の保存温度で保存しても、インフルエンザワクチン抗原の活性を高い活性で安定に維持することができる。上記保存温度のより好ましい下限は２℃、より好ましい上限は４０℃である。

本発明は、インフルエンザワクチン抗原と、二糖及びアミノ酸とを含有するインフルエンザワクチン抗原含有水溶液を、乾燥するインフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法であって、上記二糖はトレハロース及びスクロースからなる群より選択される１種以上であり、アミノ酸は、アルギニン、リジン、プロリン、トレオニン、オルニチン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒドロキシプロリン、及び、それらの塩からなる群より選択される１種以上であるインフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法でもある。本方法は、インフルエンザワクチン乾燥製剤の製造工程においても、そこに含まれるインフルエンザワクチン抗原の活性低下を生じることなく、活性を発揮することができるため、有用である。

上記インフルエンザワクチン抗原含有水溶液における上記インフルエンザワクチン抗原の合計含有量は、０．０１μｇＨＡ／ｍＬ以上であることが好ましい。上記合計含有量が０．０１μｇＨＡ／ｍＬ未満であると、インフルエンザワクチン乾燥製剤の有効性が低下することがある。上記合計含有量のより好ましい下限は０．１μｇＨＡ／ｍＬである。
上記インフルエンザワクチン抗原含有水溶液における上記インフルエンザワクチン抗原の含有量は、抗原の安定性の観点から２０ｍｇＨＡ／ｍＬ以下であることが好ましい。上記含有量のより好ましい上限は１０ｍｇＨＡ／ｍＬである。

上記インフルエンザワクチン抗原含有水溶液における上記二糖の含有量は、好ましくは０．１〜２０質量％、より好ましくは０．５〜１５質量％である。
上記二糖の含有量が、０．１質量％未満であると、インフルエンザワクチン乾燥製剤において、インフルエンザワクチン抗原の安定性が充分に得られない可能性がある。一方、上記二糖の含有量が、２０質量％を超えると、インフルエンザワクチン抗原含有水溶液の粘性が非常に高くなり、製造上問題となる恐れがある。また、インフルエンザワクチン乾燥製剤の吸湿性が高くなり、厳密に温度管理することなく保存するとインフルエンザ抗原の活性が低下することがある。

上記インフルエンザワクチン抗原含有水溶液における上記アミノ酸の含有量は、０．０１〜２５質量／体積％であることが好ましい。上記含有量が０．０１質量／体積％未満であると、上記アミノ酸による安定化の効果が充分に得られないことがある。上記含有量が２５質量／体積％を超えると、インフルエンザワクチン乾燥製剤の吸湿性が高くなり、厳密に温度管理することなく保存するとインフルエンザワクチン抗原の活性が低下することがある。また、上記アミノ酸の結晶化が促進され、インフルエンザワクチン抗原の活性を低下させる恐れもある。上記含有量のより好ましい上限は２０質量／体積％であり、より好ましい下限は０．０５質量／体積％、更に好ましい上限は１５質量／体積％である。

上記インフルエンザワクチン抗原は、熱に不安定であるため、非加熱下に乾燥することが好ましい。
上記非加熱下に乾燥する方法は特に限定されないが、減圧乾燥法又は凍結乾燥法が好ましく、凍結乾燥法が特に好ましい。上記凍結乾燥法は特に限定されず、従来公知の凍結乾燥装置を用いた方法を使用することができる。

本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、上記インフルエンザワクチン抗原含有水溶液を凍結乾燥法により乾燥させ、錠剤又は粒子状製剤として用いても良く、上記インフルエンザワクチン抗原含有水溶液を減圧乾燥して、フィルム状製剤として用いても良く、上記インフルエンザワクチン抗原含有水溶液を乾燥させた後、混合、打錠して錠剤として用いても良い。

本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、厳密に温度管理することなく保存してもインフルエンザワクチン抗原の活性を高い活性で安定に維持することができるため、従来の液剤に比べて、流通及び保存を容易にできる。
また、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、安価で安定に供給されうる二糖及びアミノ酸によりインフルエンザワクチン抗原が安定化されているため、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤もまた、安定に供給されうるものである。
更に、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、そのまま、或いは、用時に生理食塩水や注射水等の生体投与可能な溶媒に溶解又は分散させて使用することもできるため、様々な投与形態に適応しうる。具体的には、鼻粘膜、口腔内粘膜（例えば、頬側、舌下、舌上、舌の後ろ）、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜又は直腸粘膜に投与する粘膜投与製剤、或いは、注射剤として用いることができる。
更に、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤を口腔内粘膜に投与する剤形として用いる場合は、優れたコンプライアンス、例えば非侵襲的投与、無痛、注射の恐怖からの解放、投与が簡便なため患者が自ら投与可能であり、医療従事者の針刺し感染事故のリスクも回避でき、繰返し投与を行う場合の通院頻度の低減が可能となり患者の生活の質の向上に貢献でき、注射針のような特殊廃棄の必要な医療廃棄物が生じないという利点を有する。更に、本発明のインフルエンザワクチン乾燥製剤は、粘膜に投与する剤形として用いる場合は、注射投与と比較して強い免疫を誘導可能（ＩｇＡ抗体）であるという利点も有する。

以下に本発明の実施例を示し、更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１〜４０）
（凍結乾燥インフルエンザＨＡワクチン製剤）
インフルエンザＨＡ抗原（Ａ型Ｈ１Ｎ１：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、Ａ型Ｈ３Ｎ２：Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１、Ｂ型山形系統：Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０、及び、Ｂ型ビクトリア系統：Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、阪大微生物病研究会製）に表１〜４に示すように、二糖として、トレハロース（林原製）又はスクロース（和光純薬工業製）、アミノ酸として、Ｌ（＋）−アルギニン塩酸塩（和光純薬工業製）、Ｌ−リジン塩酸塩（和光純薬工業製）、Ｌ（−）−プロリン（和光純薬工業製）、Ｌ−トレオニン（和光純薬工業製）又はＬ（＋）−アルギニン（和光純薬工業製）を添加した後、下記組成の調製用ＰＢＳ（リン酸緩衝塩化ナトリウム液）を加え、上記二糖の含有量を１０質量／体積％、上記アミノ酸の含有量を５質量／体積％、上記インフルエンザＨＡ抗原の含有量を１００μｇＨＡ／ｍＬ（上記インフルエンザＨＡ抗原１質量部に対して、上記二糖が１０００質量部、上記アミノ酸が５００質量部）となるようインフルエンザワクチン抗原含有水溶液を調製した。得られたインフルエンザワクチン抗原含有水溶液３０μＬを、１．５ｍＬのセイフロックチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に分注し、凍結乾燥させ、インフルエンザワクチン乾燥製剤を得た。

調製用ＰＢＳ
塩化ナトリウム（和光純薬工業製） ４．２５ｇ
リン酸水素二ナトリウム１２水和物（和光純薬工業製） １．７６ｇ
リン酸二水素ナトリウム２水和物（和光純薬工業製） ０．３５ｇ
蒸留水 ５００ｍＬにメスアップ

（比較例１、１５、２９及び４３）
（糖及びアミノ酸無添加インフルエンザＨＡワクチン製剤）
表１〜４に示すように二糖及びアミノ酸を添加しなかったこと以外は実施例１等と同様にして、インフルエンザワクチン乾燥製剤を得た。

（比較例２〜４、１６〜１８、３０〜３２及び４４〜４６）
（糖添加インフルエンザＨＡワクチン製剤）
表１〜４に示すように、糖として、トレハロース（林原製）、スクロース（和光純薬工業製）又はグルコース（和光純薬工業製）を添加し、上記糖の含有量を２０質量／体積％、上記インフルエンザＨＡ抗原の含有量を１００μｇＨＡ／ｍＬ（上記インフルエンザＨＡ抗原１質量部に対して、上記糖が５０質量部）となるよう添加し、アミノ酸を添加しなかったこと以外は実施例１と同様にして、インフルエンザワクチン乾燥製剤を得た。

（比較例５〜９、１９〜２３、３３〜３７及び４７〜５１）
（アミノ酸添加インフルエンザＨＡワクチン製剤）
表１〜４に示すように、アミノ酸として、Ｌ（＋）−アルギニン塩酸塩（和光純薬工業製）、Ｌ−リジン塩酸塩（和光純薬工業製）、Ｌ（−）−プロリン（和光純薬工業製）、Ｌ−トレオニン（和光純薬工業製）又はＬ（＋）−アルギニン（和光純薬工業製）を添加し、上記アミノ酸の含有量を１０質量／体積％Ｌ、上記インフルエンザＨＡ抗原の含有量を１００μｇＨＡ／ｍＬ（上記インフルエンザＨＡ抗原１質量部に対して、上記アミノ酸が１００質量部）となるよう添加し、糖を添加しなかったこと以外は実施例１と同様にして、インフルエンザワクチン乾燥製剤を得た。

（比較例１０〜１４、２４〜２８、３８〜４２及び５２〜５６）
（グルコース添加インフルエンザＨＡワクチン製剤）
糖として、グルコース（和光純薬工業製）を添加したこと以外は実施例１と同様にして、インフルエンザワクチン乾燥製剤を得た。

＜測定例：インフルエンザＨＡワクチン抗原の活性測定：一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）＞
アガロース（ＡＭＲＥＳＣＯ社製）を１質量％となるように上記調製用ＰＢＳに加え、加熱して完全に溶解させた。その後、６０℃程度まで温度が低下してきてから、インフルエンザＨＡワクチンに対応する抗血清を適量加えて撹拌し、直径１０ｃｍの耐熱性の容器に流し入れ、室温で冷却して固形化させた。専用のパンチで直径４ｍｍの穴を４×４個空けてＳＲＩＤ解析用ゲルとした。
実施例及び比較例に係るインフルエンザワクチン乾燥製剤を上記調製用ＰＢＳで溶解した後に、所望の濃度に希釈し、更に界面活性剤を終濃度１％となるよう加え、完全に溶解させた。これを試料溶液とした。
標準溶液として、インフルエンザワクチン原液を用いて３０μｇ／ｍＬのインフルエンザＨＡ抗原溶液を作製した。その際、上述の試料溶液に含まれる添加剤（製剤に用いた配合剤および界面活性剤）の終濃度が同じになるようにワクチン原液に加え、上記調製用ＰＢＳで適宜希釈し、完全に溶解させた。同様に、２２．５、１５、７．５μｇ／ｍＬのインフルエンザＨＡ抗原溶液も作製した。
４段階の濃度の標準溶液及び試料溶液を１０μＬ／ｗｅｌｌずつアプライし２５℃の湿潤な条件下で１８時間〜２４時間程度反応させた。
容器から取り外したＳＲＩＤゲルを濾紙で挟み、さらに吸収性の良い紙で挟んで重石を乗せて脱水した。さらに風乾して完全に乾燥させた。クマシーブリリアントブルー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）染色液に入れて適当な時間染色し、脱色液に移して適当な染色像が得られるまで脱色した。その後、ＧｅｌＢｏｎｄ Ｆｉｌｍ（ＬＯＮＺＡ社製）の上にＳＲＩＤゲルを拡げ、完全に乾燥させた。得られた沈降輪の面積をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアで計測した。

標準溶液の濃度及び得られた沈降輪の面積値から検量線を作成し、試料溶液の沈降輪の面積を測定し、検量線からＨＡ力価を算出した。得られたＨＡ力価を、インフルエンザＨＡワクチン添加プラセボ溶液の力価を１００％とした場合の試験サンプルの相対値（％）を表１〜４に記す。

表１〜４に示したように、二糖及びアミノ酸を配合した実施例では、全てのインフルエンザＨＡワクチン抗原の活性を安定に維持することが可能となった。
特に、アミノ酸として、アルギニン塩酸塩、リジン塩酸塩、トレオニン又はプロリンを用いた実施例では、インフルエンザＨＡワクチン抗原の活性を高い活性で安定に維持することが可能となった。特に、実施例１、６、１１、１６、２１、２６、３１、及び、３６から、アルギニン塩酸塩と二糖の併用により、Ａ型Ｈ１Ｎ１、Ａ型Ｈ３Ｎ２、Ｂ型山形系統、及び、Ｂ型ビクトリア系統の全てのインフルエンザＨＡワクチン抗原の活性を極めて高い活性で安定に維持することが可能になった。
また、糖のみしか配合されていない比較例２〜４、１６〜１８、３０〜３２及び４４〜４６、アミノ酸のみしか配合されていない比較例５〜９、１９〜２３、３３〜３７及び４７〜５１、糖及びアミノ酸を配合していない比較例１、１５、２９及び４３では、実施例と比較して、インフルエンザＨＡワクチン抗原の活性が安定化されていなかった。
また、糖としてグルコースを含有する比較例１０〜１４、２４〜２８、３８〜４２及び５２〜５６では、トレハロース又はスクロースを含有する実施例と比較して、インフルエンザＨＡワクチン抗原の活性が安定化されていなかった。
また、実施例及び比較例に係るインフルエンザワクチン乾燥製剤の乾燥減量法により測定した含水率は、すべて１０質量％以下であった。

本発明によれば、厳密に温度管理することなく保存してもインフルエンザワクチン抗原の活性を高い活性で安定に維持することができ、安定に供給されうるインフルエンザワクチン乾燥製剤を提供することができる。また、本発明によれば、該インフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法を提供することができる。

Claims (5)

1. インフルエンザワクチン抗原、二糖及びアミノ酸を含有し、
   前記二糖は、トレハロース、イソマルト、スクロース、マルトース、メリビオース、パラチノース及びラクチュロースからなる群より選択される１種以上であり、
   前記アミノ酸は、リジン、プロリン、トレオニン、オルニチン、システイン、ヒドロキシプロリン、及び、それらの塩、並びに、アルギニン塩酸塩からなる群より選択される１種以上である
   ことを特徴とするインフルエンザワクチン乾燥製剤。
2. インフルエンザウイルス抗原は、不活化抗原である請求項１記載のインフルエンザワクチン乾燥製剤。
3. 不活化抗原は、スプリットワクチン抗原又はサブユニットワクチン抗原である請求項２記載のインフルエンザワクチン乾燥製剤。
4. 不活化抗原は、スプリットワクチン抗原である請求項２記載のインフルエンザワクチン乾燥製剤。
5. インフルエンザワクチン抗原、二糖、及び、アミノ酸を含有するインフルエンザワクチン抗原含有水溶液を、乾燥するインフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法であって、
   前記二糖は、トレハロース、イソマルト、スクロース、マルトース、メリビオース、パラチノース及びラクチュロースからなる群より選択される１種以上であり、
   前記アミノ酸は、リジン、プロリン、トレオニン、オルニチン、システイン、ヒドロキシプロリン、及び、それらの塩、並びに、アルギニン塩酸塩からなる群より選択される１種以上である
   ことを特徴とするインフルエンザワクチン乾燥製剤の製造方法。