CN103357010A - 疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供作为感染症的预防或治疗剂有用的、能够有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答且能够舌下给药的疫苗组合物。一种疫苗组合物，其特征在于，其为向人或动物的口腔内给药的疫苗组合物，包含至少一种的源自感染症的抗原、以及选自由Toll样受体4(TLR4)激动剂、Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂、和环二核苷酸或其衍生物或者盐组成的组中的至少一种。

Description

疫苗组合物
技术领域
本发明涉及作为感染症的预防或治疗剂而有用的且能够舌下给药的疫苗组合物。尤其是，本发明涉及以选自由Toll样受体4(TLR4)激动剂、Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂、和环二核苷酸或其衍生物或者盐组成的组中的至少1种作为佐剂，与源自感染症的抗原一起舌下给药，从而能够有效地诱导全身性免疫应答以及粘膜免疫应答的疫苗组合物。
背景技术
作为疫苗制剂的剂型，当前产品化的基本上均是注射剂。注射型疫苗诱导血液(全身性)的免疫应答(产生IgG抗体)，但存在以下问题点：不会诱导粘膜免疫应答(产生IgA抗体)，虽然能够预防感染后的病原体的增殖，但难以防御经由粘膜的病原体的感染本身。
因而，近年来，从粘膜接种疫苗受到瞩目，其中，使用流感病毒作为抗原的粘膜给药(经鼻给药)型疫苗的开发备受瞩目。
粘膜给药型疫苗不仅能够诱导全身性免疫(产生IgG抗体)，还能够诱导粘膜免疫(产生IgA抗体)。可以认为该IgA抗体的特征在于，对对象疾病的病原体的类别没有严格区分，即使逐年变化的病原体的流行类别(epidemic form)发生变化，也能够进行应对，对于防止流感爆发是有效的。
另外，对于经鼻给药型疫苗而言，作为其备受瞩目的原因之一，可列举出：对消化管粘膜给予抗原时，容易受到胃酸的影响、蛋白水解酶的影响，难以防止这些影响，而与此相对，对鼻粘膜给予抗原时，不受这些因素的影响。进而，鼻腔粘膜上存在被称为NALT的抗原识别组织，对免疫应答是有效的，这也是理由之一。
然而，对鼻腔粘膜给予抗原的效果虽高，但产生急性脑病等严重副作用的可能性也高，此外，老人、婴儿等进行经鼻给药本身复杂且困难，进而存在因鼻水等身体因素而无法获得稳定效果的问题点。
另一方面，还大量地进行了经口给予抗原、在咽下后使其在消化管粘膜(小肠)等处诱导全身性免疫以及粘膜免疫的尝试。此时的担心是如何防止因胃酸导致的抗原分解、因蛋白水解酶导致的抗原分解。为了解决这些问题而开发出了通过含有大量中和胃酸的抗酸剂、或微球等的被膜技术来保护抗原的技术。
但是，实际上开发成功的是原本在胃酸中的稳定性就高的生物弱毒性脊髓灰质炎病毒疫苗、生物弱毒性轮状病毒疫苗。
另外，作为经口给药但无需咽下的、经由口腔内粘膜(尤其是舌下粘膜)来进行免疫应答的制剂，可列举出变态反应疫苗。该疫苗被称为舌下特异性免疫治疗(Sublingual Imunotherapy，SLIT)，其利用如下现象：通过对舌下持续地给予包含变态反应的抗原即蛋白质(过敏原)的、源自植物的提取物，引起对该变应原的免疫耐受性，从而不会发生变态反应的现象。近年来，欧洲对该治疗方法有所认知，现在已有多种产品上市。
与皮下注射变应原的现有治疗方法(皮下免疫治疗，Subcutaneous Immunotherapy)相比，使用了该经由口腔粘膜、尤其是经由舌下粘膜来进行免疫应答的制剂的治疗方法从患者的生活质量(QOL)以及不会产生严重副作用即过敏性休克的观点出发，备受关注。
但是，该治疗方法说到底也仅是利用了诱发特异性免疫耐受性的制剂的方法，并非免疫活化的疗法。可以认为，口腔粘膜通常而言难以产生免疫，即使能够引起这些免疫耐受性，也难以进行免疫活化。
作为经由口腔粘膜、尤其是经由舌下粘膜来诱导粘膜免疫以及全身性免疫的例子，有以下报告。
已经提出了：通过使用OVA作为抗原、使用霍乱毒素作为免疫刺激剂(佐剂)，并进行舌下给药，确认了OVA特异性全身性免疫应答(产生IgG)以及OVA特异性粘膜免疫应答(产生IgA)(例如，参照专利文献1)。但是，该提案中，使用神经毒性高的霍乱毒素作为免疫刺激剂，安全性方面存在问题。
另外，已经提出了：通过使用OVA作为抗原、使用TLR4激动剂即3-邻位脱酰基单磷酰基脂质A作为免疫刺激剂，并进行舌下给药，确认了OVA特异性全身性免疫应答(产生IgG)以及OVA特异性粘膜免疫应答(产生IgA)(例如，参照专利文献2)。该提案中，舌下给药时使用TLR4激动剂作为免疫刺激剂，但没有源自感染症的抗原的相关实施例，效果方面是否对抗原种类具有通用性尚不明确。进而，OVA的给药量为80～160μg、3-邻位脱酰基单磷酰基脂质A的给药量为高达20～40μg的给药量，在考虑安全性的情况下，实用性方面仍有欠缺。
另外，在合成佐剂即吡喃葡萄糖基脂(Glucopyranosyl Lipid)的合成方法的相关提案(例如，参照专利文献3)中记载了：通过合并使用抗原和该佐剂并进行粘膜给药来诱导粘膜免疫应答。另外，提出了：使用TLR2/6配体即MALP-2，使用β-半乳糖苷酶作为抗原，对小鼠进行经鼻给药来诱导血清中的IgG以及鼻腔清洗液中的IgA(例如，参照专利文献4)。然而，关于源自感染症的抗原以及向口腔粘膜给药，既无实施例、且效果方面是否具有通用性也不明确。进而，提出了：通过使用环二核苷酸即c-di-GMP或c-di-AMP作为免疫刺激剂、使用β-半乳糖苷酶作为抗原，对小鼠经鼻给药来诱导血清中的IgG(例如，参照专利文献5)，但并未提及经鼻给药来诱导IgA，另外，关于源自感染症的抗原以及向口腔粘膜给药，既无实施例、且效果方面是否具有通用性也不明确。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2008/0112974号说明书
专利文献2：日本特表2003-519669号公报
专利文献3：美国专利申请公开第2010/0310602号说明书
专利文献4：美国专利申请公开第2005/0276813号说明书
专利文献5：美国专利申请公开第2008/0286296号说明书
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，鉴于上述现状，提供作为感染症的预防或治疗剂是有用的、能够有效地诱导全身性免疫应答以及粘膜免疫应答且能够舌下给药的疫苗组合物。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入地研究，结果发现，在口腔内给药、尤其是舌下给药时，通过以选自由Toll样受体4(TLR4)激动剂、Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂、和环二核苷酸或其衍生物或者盐组成的组中的至少1种作为佐剂，与源自感染症的抗原一起舌下给药，可以有效地诱导全身性免疫应答以及粘膜免疫应答，从而完成了本发明。
即，本发明为一种疫苗组合物，其特征在于，其为向人或动物的口腔内给药的疫苗组合物，包含至少一种的源自感染症的抗原、以及选自由Toll样受体4(TLR4)激动剂、Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂、和环二核苷酸或其衍生物或者盐组成的组中的至少1种。
本发明的疫苗组合物中，上述源自感染症的抗原优选为源自流感病毒的抗原。
另外，上述源自流感病毒的抗原优选为血凝素蛋白。
另外，源自流感病毒的抗原优选为完整病毒颗粒。
另外，上述Toll样受体4(TLR4)激动剂优选包含选自由脂多糖或其盐、以及单磷酰脂或其盐组成的组中的至少1种。
另外，上述脂多糖或其盐为源自大肠杆菌、源自沙门氏菌、源自泛菌、源自醋酸杆菌、源自发酵单胞菌、源自黄单胞菌或源自肠细菌的脂多糖或其盐，上述单磷酰脂或其盐优选为源自沙门氏菌的单磷酰脂或合成吡喃葡萄糖基脂。
另外，上述Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂优选包含二酰基脂肽或其衍生物或者盐。
另外，上述二酰基脂肽优选包含Pam2CSK4、MALP-2、FSL-1或它们的衍生物或者盐。
另外，上述环二核苷酸优选包含c-di-GMP、c-di-AMP或它们的衍生物或者盐。
另外，本发明的疫苗组合物中，向口腔内给药优选为向舌下粘膜给药。
另外，优选的是，本发明的疫苗组合物为诱导粘膜免疫应答和全身性免疫应答的疫苗组合物，上述粘膜免疫应答为产生抗原特异性IgA抗体，上述全身性免疫应答为产生抗原特异性IgG抗体和产生抗原特异性细胞性免疫。
以下，对本发明进行详细说明。
本发明的疫苗组合物含有至少一种的源自感染症的抗原。
上述源自感染症的抗原是指能够作为受试生物体产生的免疫应答的靶的所有物质。另外，上述源自感染症的抗原也可以是在接触免疫活性细胞时为免疫应答(例如，免疫活性细胞成熟、产生细胞因子、产生抗体等)的靶。
作为本发明中使用的源自感染症的抗原，只要是感染性病原体和源自感染性病原体的抗原就没有特别限定。
作为因上述感染性病原体而患的疾病，没有特别限定，可列举出例如因腺病毒、疱疹病毒(例如，HSV-I、HSV-II、CMV或VZV)、痘病毒(例如，天花或牛痘、或者传染性软疣等的正痘病毒)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒或肠病毒)、正粘病毒(例如，流感病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV))、冠状病毒(例如，SARS)、乳多空病毒(例如，引起生殖器疣、寻常疣或足底疣等的乳头状瘤病毒)、嗜肝DNA病毒(例如，乙肝病毒)、黄病毒(例如，丙肝病毒或登革热病毒)或逆转录病毒(例如，HIV等慢病毒)等的病毒感染而患的疾病等病毒疾病；因埃希氏菌属、肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、痢疾杆菌、李斯特菌、气杆菌属、螺杆菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌、假单胞菌、链球菌、衣原体、支原体、肺炎球菌、奈瑟菌属、梭状芽孢杆菌、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、分枝杆菌属、弯曲菌属、弧菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、色杆菌属、布鲁氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属或博德特氏菌属等细菌感染而患的疾病等细菌疾病；以衣原体病、念珠菌症、曲霉病、组织胞浆菌病、隐球菌脑膜炎为代表、但不限定于此的真菌疾病；疟疾、卡氏肺囊虫性肺炎、利什曼病、隐孢子虫病、弓形体病以及锥虫感染等。
本发明中，上述源自感染症的抗原优选为源自流感病毒的抗原。
此处，上述流感病毒是指隶属正粘病毒科的、具有直径约100nm的颗粒大小的RNA包膜病毒，根据内部蛋白质的抗原性而分为A、B以及C型。上述流感病毒由核糖核酸(RNA)的核和外部糖蛋白形成，所述核糖核酸(RNA)与包裹在具有脂质双层结构的病毒包膜内的内部核衣壳或核蛋白质缔合。上述病毒包膜的内层主要由基质蛋白构成，外层的大部分由源自宿主的脂质物质构成。另外，上述流感病毒的RNA呈分节结构。需要说明的是，世界中大范围流行的流感是由A型流感病毒引起的，该A型流感病毒具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种包膜糖蛋白，根据其抗原性的差异，HA分为16种亚型、NA分为9种亚型。
本发明中，作为上述源自感染症的抗原，适合使用源自A型和B型的流感病毒的抗原。需要说明的是，作为上述A型和B型流感病毒的亚型，没有特别限定，可以是至今为止已分离出的亚型，也可以是将来分离的亚型。
本发明中，作为源自流感病毒的抗原，只要是构成上述流感病毒的各种成分的至少一部分就没有特别限定，例如可列举出：提纯病毒颗粒用有机溶剂/表面活性剂或其它试剂灭活而成的完整病毒颗粒、或者从该完整病毒颗粒中去除杂质并提纯HA和/或NA而制作的病毒亚单位等。从免疫原性的观点出发，优选为HA亚单位或完整病毒颗粒。上述完整病毒颗粒优选通过福尔马林等进行过灭活。另外，杂质少且需要免疫刺激剂等佐剂的HA亚单位(split)是特别有效的。
对上述流感病毒抗原的制备方法没有特别限定，可以无限制地使用公知方法。例如可列举出：使鸡蛋感染从流感感染动物或流感患者中分离出的病毒株，通过常规方法进行培养，并由已提纯的病毒原液制备抗原的方法。另外，还可以使用源自通过基因工程学在培养细胞中制备的病毒的抗原。
本发明的疫苗组合物中，上述源自感染症的抗原含有有效量即可，例如，为了对1个体给药1次，相对于本发明的疫苗组合物的总量，优选含有0.001～1000μg的范围。更优选处于0.01～100μg的范围内，进一步优选处于0.1μg～50μg的范围内。抗原含量低于0.001μg时，有时感染症的预防或治疗剂的功能变得不充分，而超过1000μg时，有时安全性方面存在问题。需要说明的是，本说明书中所称的“1个体”可以为任意的哺乳动物，优选为人。
本发明的疫苗组合物含有选自由Toll样受体4(TLR4)激动剂、Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂、和环二核苷酸或其衍生物或者盐组成的组中的至少1种。
这些化合物在本发明的疫苗组合物中发挥免疫刺激剂的功能。
作为上述Toll样受体4(TLR4)激动剂，可适合地列举出脂多糖或其盐。需要说明的是，本说明书中所称的脂多糖除了脂多糖其自身之外，只要具有其性质，则还可以为脂多糖的衍生物。本说明书中的盐可以为任意的有机酸或无机酸，优选为药学上可接受的盐。
另外，上述脂多糖可以是从革兰氏阴性菌细胞壁中提取的提取物或其改性物，也可以是合成品。
作为上述革兰氏阴性菌，例如可列举出：大肠埃希菌属、志贺氏杆菌属、沙门氏菌属、克雷伯杆菌属、变形杆菌属、耶尔森氏菌属、霍乱弧菌属、副溶血弧菌属、嗜血杆菌属、假单胞菌属、军团杆菌属、博德特氏菌属、布鲁氏菌属、土拉弗朗西斯菌属、类杆菌属、奈瑟菌属、衣原体属、邻单胞菌属、卟啉菌属、泛菌属、农杆菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、醋酸杆菌属、黄单胞菌属、发酵单胞菌属等。
其中，优选源自大肠埃希菌属、源自沙门氏菌属、源自泛菌属、源自醋酸杆菌属、源自发酵单胞菌属、源自黄单胞菌属或源自肠杆菌属的革兰氏阴性菌。这些革兰氏阴性菌存在于自古以来的多种食品、中药中，可以担保其对生物体的安全性，尤其是源自泛菌属的革兰氏阴性菌在现有保健食品中使用，可以说是更有效的。还可以直接使用源自这些菌的提取物或其改性物。
另外，使用从上述革兰氏阴性菌细胞壁中提取的提取物或经提纯的脂多糖时，通常需要考虑其对生物体的安全性，还可以使用对它们进行了解毒的改性物。另一方面，醋酸杆菌属(Acetobacter aceti、Acetobacter xylinum、Acetobacter orientalis等)、发酵单胞菌属(Zymomonas mobilis等)、黄单胞菌属(Xanthomonas campestris等)、肠杆菌属(Enterobacter cloacae等)、泛菌属(Pantoea agglomerans等)存在于自古以来的多种食品、中药中，可以担保其对生物体的安全性，还可以直接使用源自这些菌的提取物或经提纯的脂多糖。
另外，作为上述Toll样受体4(TLR4)激动剂，可列举出上述脂多糖的衍生物、例如去除了多糖部分的脂质A或单磷酰脂A、3-脱酰基MPL等，或者也可以是盐。
作为上述去除了脂多糖的多糖部分的脂质A，只要是源自上述革兰氏阴性菌的分离物即可，或者也可以使用与源自这些革兰氏阴性菌的分离物具有相同结构的合成物。
另外，作为上述脂质A的改性物，也可适合地使用经脱磷酸化的单磷酰脂(MPL)或其盐。需要说明的是，本说明书中所称的单磷酰脂除了单磷酰脂其自身之外，只要具有其性质，则还可以为单磷酰脂的衍生物。尤其是，从对生物体的安全性的观点出发，已具有在医疗用途中作为免疫刺激剂的经历的3-脱酰化物单磷酰脂(3D-MPL)或美国专利申请公开第2010/0310602号说明书中提出的未经脱酰化的合成吡喃葡萄糖基脂(Glucopyranosyl lipid)是优选的。
另外，作为上述单磷酰脂，也可适合地使用具有安全性和使用先例的源自沙门氏菌的单磷酰脂。
作为上述Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂，例如优选包含二酰基脂肽或其衍生物或者盐。
作为上述二酰基脂肽，优选包含选自由具有安全性和使用先例的Pam2CSK4、MALP-2、FSL-1或它们的衍生物或者盐组成的组中的至少1种。
另外，作为上述Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂，可以是从支原体细胞膜中提取的提取物或其改性物，也可以是合成品。
作为上述支原体，例如可列举出：肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、尿素原体(Ureaplasma)、唾液支原体(Mycoplasma salivarium)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、实验室支原体(Mycoplasma laboratorium)、蕈状支原体(Mycoplasmamycoides)、羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)等。
使用从上述支原体细胞膜中提取的提取物或经提纯的二酰基脂肽时，通常需要考虑其对生物体的安全性，还可以使用对它们进行了解毒的改性物。
作为上述环二核苷酸，只要是环二嘌呤核苷酸或其衍生物或者盐即可，例如从安全性方面出发，优选c-di-GMP、c-di-AMP或其衍生物或者盐。
上述TLR4激动剂、TLR2/6激动剂以及c-di-GMP均是作为舌下免疫刺激剂而具有充分功能的物质，尤其是TLR4激动剂能够以低廉的价格而得到，另外也有对人使用的实际经历。例如，作为上述TLR4激动剂之一的源自泛菌的LPS广泛用于保健食品，具有人容易适应这一优点。
本发明的疫苗组合物中，作为上述3种免疫刺激剂(TLR4、TLR2/6、环二核苷酸)的各自的含量，例如，为了对1个体进行1次给药，相对于本发明的疫苗组合物的总量，优选含有0.1μg～100mg的范围。免疫刺激剂的含量低于0.1μg时，有时无法获得充分的作为感染症的预防或治疗剂的功能，而超过100mg时，安全性方面存在问题。上述免疫刺激剂含量的更优选的下限为0.3μg，更优选的上限为50mg。
另外，本发明的疫苗组合物如果包含选自由上述3种组成的组中的至少1种免疫刺激剂，则它们可以与其它现有公知的免疫刺激剂组合使用。
本发明的疫苗组合物可以通过向上述的源自感染症的抗原和免疫刺激剂中根据需要添加其它成分(例如，磷酸盐缓冲溶液等)，用公知方法进行搅拌混合，从而制备。
另外，可以使用本发明的疫苗组合物制备液体制剂、固体制剂、喷雾剂，除了上述材料以外，还可以根据期望适当使用赋形剂、结合剂、香料、矫味剂、甜味剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定化剂、表面活性剂等。
对这些材料没有特别限定，可以使用现有公知的材料。
此处，上述固体制剂中包含片剂、包衣片、散剂、颗粒剂、细粒剂、口腔内崩解片、口腔内贴剂、胶状剂、薄膜剂，只要是向口腔粘膜、舌下粘膜给药的固体状制剂就没有特别限定。
本发明的疫苗组合物是向人或动物(哺乳类、鸟类等)的口腔内给药的组合物，该向口腔内给药优选为向舌下粘膜给药。如上所述，可以认为，口腔粘膜通常难以产生免疫，即使能够引起这些免疫耐受性，也难以进行免疫活化，但本发明的疫苗组合物由于将至少一种的源自感染症的抗原与上述的特定免疫刺激剂一起使用，即使向口腔粘膜给药，也可以有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答。
另外，由于为向舌下粘膜给药，因此不会像对消化管粘膜给予抗原时那样地受到胃酸的影响、蛋白水解酶的影响，另外，不可能出现像对鼻腔粘膜给予抗原时那样的急性脑病等严重副作用，老人、婴儿等也可以容易地给药，进而也不会因鼻水等身体因素而妨碍稳定的效果。
另外，本发明的疫苗组合物的给药方法如上所述。另外，作为其给药量，可考虑动物种类、对象的年龄、性别、体重等后决定，例如，使用HA作为源自感染症的抗原时，通常能够以0.1μg～50μg的量给予1次或2次以上。优选多次给药，此时，优选以1～4周的间隔进行给药。使用完整病毒颗粒作为上述源自感染症的抗原时，以HA换算来设定给药量即可。需要说明的是，上述HA的重量是通过SRD效价或者Lowry法而测定的值。
发明的效果
本发明的疫苗组合物由于将至少一种的源自感染症的抗原和上述的特定免疫刺激剂一起使用，通过向口腔粘膜、尤其是向舌下粘膜给药，可以有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答。
附图说明
图1是示出实施例1～6、比较例1～9的小鼠血清中流感HA特异性IgG效价的结果的图。
图2是示出实施例1～6、比较例1～9的小鼠鼻腔清洗液中流感HA特异性IgA效价的结果的图。
图3是示出实施例7～9、比较例10～12的小鼠血清中流感HA特异性IgG效价的结果的图。
图4是示出实施例7～9、比较例10～12的小鼠鼻腔清洗液中流感HA特异性IgA效价的结果的图。
图5是表示实施例10、比较例13、比较例14的感染流感病毒时的小鼠生存率的图。
图6是示出实施例11、比较例1、比较例14的小鼠血清中流感HA特异性IgG效价的结果的图。
图7是示出实施例11、比较例1、比较例14的小鼠鼻腔清洗液中流感HA特异性IgA效价的结果的图。
图8是示出实施例12、实施例13、比较例15、比较例16、比较例1的小鼠血清中流感HA特异性IgG效价的结果的图。
图9是示出实施例12、实施例13、比较例15、比较例16、比较例1的小鼠鼻腔清洗液中流感HA特异性IgA效价的结果的图。
图10是示出实施例12、实施例14、实施例15、比较例16、比较例1的小鼠血清中流感HA特异性IgG效价的结果的图。
图11是示出实施例12、实施例14、实施例15、比较例16、比较例1的小鼠鼻腔清洗液中流感HA特异性IgA效价的结果的图。
图12是示出实施例16、实施例17、比较例17、比较例18的小鼠血清中流感HA特异性IgG效价的结果的图。
图13是示出实施例16、实施例17、比较例17、比较例18的小鼠鼻腔清洗液中流感HA特异性IgA效价的结果的图。
具体实施方式
通过以下实施例来具体说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
实施例1
向含流感HA抗原的溶液(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)76.3μL(236μg/mL)和源自大肠杆菌的脂多糖(NACALAI TESQUE,INC.制)溶液30μL(1mg/mL)中，添加磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。
将预先准备的5只小鼠(雌性7周龄C57BL/6小鼠，JapanSLC,Inc.制)麻醉(somnopentyl；共立制药株式会社制)后，分别向小鼠的舌下给予20μL所制备的疫苗组合物。
该给药1周后，再次将小鼠麻醉，分别向小鼠的舌下给予20μL所制备的疫苗组合物。
在第2次给药后的1周后，采集小鼠的血清和鼻腔清洗液，通过ELISA法测定血清中流感HA特异性IgG效价以及鼻腔清洗液中流感HA特异性IgA效价。需要说明的是，详细的测定方法见后述。
实施例2～6
作为源自大肠杆菌的脂多糖的代替物，实施例2中使用源自泛菌的脂多糖(自然免疫应用技研株式会社制)，实施例3中使用吡喃葡萄糖基脂(MPLAs，InvivoGen Corporation制)、实施例4中使用FSL-1(InvivoGen Corporation制)、实施例5中使用Pam2CSK4(InvivoGen Corporation制)、实施例6中使用c-di-GMP(环鸟苷二磷酸(Cyclic diguanosine monophosphate)，BIOLOG INC.制)，除此以外，与实施例1同样操作，制备疫苗组合物，以表1所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例1
将预先准备的5只小鼠(雌性7周龄C57BL/6小鼠，JapanSLC,Inc.制)麻醉后，准备120μL磷酸盐缓冲液(NACALAITESQUE,INC.制)，分别向小鼠的舌下给予20μL。之后的操作与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例2
作为磷酸盐缓冲液的代替物，向含流感HA抗原的溶液(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)76.3μL(236μg/mL)中添加磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。之后的操作以表1所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例3～9
在流感HA抗原(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)的基础上，比较例3中使用肽聚糖(源自沙门氏菌的PGN，InvivoGen Corporation制)、比较例4中使用酵母聚糖(NACALAITESQUE,INC.制)、比较例5中使用Pam3CSK4(InvivoGenCorporation制)、比较例6中使用Poly(I：C)(InvivoGenCorporation制)、比较例7中使用鞭毛蛋白(InvivoGenCorporation制)、比较例8中使用咪喹莫特(InvivoGenCorporation制)、比较例9中使用CpG(InvivoGen Corporation制)，除此以外，与比较例2同样操作，制备疫苗组合物，以表1所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
[表1]
Figure BDA00003017215300161
实施例7～9
在含流感HA抗原的溶液(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)19μL(236μg/mL)的基础上，实施例7中向吡喃葡萄糖基脂(MPLAs，InvivoGen Corporation制)溶液30μL(1mg/mL)中添加磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物，在麻醉下向小鼠(雌性7周龄BALB/c小鼠，JapanSLC,Inc.)舌下给予20μL。作为实施例7中的吡喃葡萄糖基脂的代替物，实施例8中使用FSL-1(InvivoGen Corporation制)、实施例9中使用c-di-GMP(Cyclic diguanosine m onophosphate，BIOLOG INC.制)，制备疫苗组合物。给药量如表2所示，制备后的操作除了小鼠的种类不同以外，与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例10
向含流感HA抗原的溶液(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)19μL(236μg/mL)中添加磷酸盐缓冲液(NACALAITESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。给药量如表2所示，制备后的操作除了使用BALB/c小鼠以外，与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例11、12
在流感HA抗原(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)76.3μL(236μg/mL)的基础上，比较例11中向肽聚糖(源自沙门氏菌的PGN，InvivoGen Corporation制)30μL(20mg/mL)中添加磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。作为比较例11中的肽聚糖的代替物，比较例12中使用Pam3CSK4(InvivoGen Corporation制)，制备疫苗组合物。给药量如表2所示，制备后的操作除了使用BALB/c小鼠以外，与实施例1用相同步骤进行试验。
[表2]
Figure BDA00003017215300171
实施例10
向含流感HA抗原的溶液(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)152.6μL(236μg/mL)中添加源自泛菌的脂多糖(自然免疫应用技研株式会社制)60μL(1mg/mL)、磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备240μL的疫苗组合物。
将预先准备的10只小鼠(雌性7周龄BALB/c小鼠，JapanSLC,Inc.制)麻醉后，分别向小鼠的舌下给予20μL所制备的疫苗组合物。
该给药1周后，再次将小鼠麻醉，分别向小鼠的舌下给予20μL所制备的疫苗组合物。
在第2次给药后的1周后，使其感染致死量的流感病毒(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)，其后追踪观察(follow up)2周，测定生存率。需要说明的是，详细的测定方法见后述。
比较例13、14
比较例13中制备了仅包含含流感HA抗原的溶液(A/IvPR8/34(H1N1)，阪大微生物病研究会制)的溶液、比较例14中制备了磷酸盐缓冲液。以表3所示的给药量、与实施例10用相同步骤进行试验。
[表3]
Figure BDA00003017215300181
实施例11
向含流感HA抗原的完整颗粒溶液(A/California/7/2009(H1N1)，阪大微生物病研究会制)10.1μL(1776μg/mL)中添加源自泛菌的脂多糖(自然免疫应用技研株式会社制)30μL(1mg/mL)、磷酸盐缓冲液(NACALAITESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。
以表4所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例14
比较例14中制备了仅包含含流感HA抗原的完整颗粒溶液(A/California/7/2009(H1N1))的溶液。以表4所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
[表4]
Figure BDA00003017215300191
实施例12
向含流感HA抗原的溶液(A/California/7/2009(H1N1)，阪大微生物病研究会制)36μL(500μg/mL)中添加源自泛菌的脂多糖(自然免疫应用技研株式会社制)30μL(1mg/mL)、磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。
以表5所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
实施例13
作为实施例12中的源自泛菌的脂多糖的代替物，实施例13中使用c-di-GMP(Cyclic diguanosine monophosphate，BIOLOGINC.制)，与实施例12同样操作，制备疫苗组合物，以表5所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例15
作为实施例12中的源自泛菌的脂多糖的代替物，比较例15中使用咪喹莫特(InvivoGen Corporation制)，以表5所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例16
作为实施例12中的源自泛菌的脂多糖的代替物，比较例16中未添加任何其它物质，制备了仅包含含流感HA抗原的溶液(A/California/7/2009(H1N1)，阪大微生物病研究会制)的溶液。以表5所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
[表5]
Figure BDA00003017215300201
实施例14
向含流感HA抗原的溶液(A/Victria/361/2009(H3N2)，阪大微生物病研究会制)33.7μL(534μg/mL)中添加源自泛菌的脂多糖(自然免疫应用技研株式会社制)30μL(1mg/mL)、磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。以表6所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
实施例15
向含流感HA抗原的溶液(B/Brisbane/60/2008，阪大微生物病研究会制)47.4μL(380μg/mL)中添加源自泛菌的脂多糖(自然免疫应用技研株式会社制)30μL(1mg/mL)、磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。以表6所示的给药量、与实施例1用相同步骤进行试验。
[表6]
Figure BDA00003017215300202
实施例16
疫苗组合物的制备与实施例12相同。即，向含流感HA抗原的溶液(A/California/7/2009(H1N1)，阪大微生物病研究会制)36μL(500μg/mL)中添加源自泛菌的脂多糖(自然免疫应用技研株式会社制)30μL(1mg/mL)、磷酸盐缓冲液(NACALAITESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。
除了以表7所示的给药量使用BALB/c小鼠以外，与实施例1用相同步骤进行试验。
实施例17
向OVA(卵白蛋白，Sigma-Aldrich Co.制)18μL(1mg/mL)中添加源自泛菌的脂多糖(自然免疫应用技研株式会社制)30μL(1mg/mL)、磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)，制备120μL的疫苗组合物。
除了以表7所示的给药量使用BALB/c小鼠以外，与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例17
作为实施例16中的源自泛菌的脂多糖的代替物，比较例17中未添加任何其它物质，制备了仅包含含流感HA抗原的溶液(A/California/7/2009(H1N1)，阪大微生物病研究会制)的溶液。除了以表7所示的给药量使用BALB/c小鼠以外，与实施例1用相同步骤进行试验。
比较例18
作为实施例17中的源自泛菌的脂多糖的代替物，比较例18中未添加任何其它物质，制备了仅包含OVA(卵白蛋白，Sigma-Aldrich Co.制)的溶液。除了以表7所示的给药量使用BALB/c小鼠以外，与实施例1用相同步骤进行试验。
[表7]
Figure BDA00003017215300211
试验方法
通过测定小鼠血清中的流感HA或者OVA特异性IgG效价，评价全身性免疫应答。另外，通过测定小鼠鼻腔清洗液中的流感HA或者OVA特异性IgA效价，评价粘膜免疫应答。各自的评价方法如下所示。另外，各自的评价结果示于图1～13(不包括图5)。
另一方面，进行了通过使小鼠感染流感病毒来确认疫苗效果的病毒感染实验。评价结果示于图5。
小鼠血清中流感HA特异性IgG效价的测定方法(ELISA法)
在ELISA用96孔板中，分别添加100μL用碳酸缓冲液稀释的各流感HA(例如测定A/IvPR8/34(H1N1)特异性IgG抗体效价时为A/IvPR8/34(H1N1)流感HA抗原溶液)或者含OVA的溶液(5μg/mL)，放置一晚。
用预先准备的清洗液(含吐温20的PBS)清洗3次孔，分别添加将封闭剂(Block Ace，DS Pharma Biomedical Co.,Ltd制)用纯化水稀释至4g/100mL而成的封闭溶液200μL，在室温下放置2小时。其后，用清洗液(含吐温20的PBS)清洗3次孔。
将预先从小鼠采集的血清在4℃下以3000G离心10分钟，向20μL上清中添加磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)300μL，制备了稀释血清溶液。
使用将封闭剂(Block Ace，DS Pharma Biomedical Co.,Ltd制)用磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)稀释至0.4g/100mL而成的溶液，使用前述稀释血清溶液，以2倍的倍率连续稀释16次，分别添加50μL该溶液，在室温下放置2小时。
其后，用清洗液(含吐温20的PBS)清洗3次孔，将封闭剂(Block Ace，DS Pharma Biomedical Co.,Ltd制)用磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)稀释至0.4g/100mL，用所得溶液将HRP标记抗小鼠IgG抗体(山羊抗鼠(Goat-anti-mouse)IgG FcHRP，BETHYL LABORATORIES制)稀释至10000倍，各添加100μL，在室温下放置1小时。
其后，用清洗液(含吐温20的PBS)清洗3次孔，分别添加100μL TMB溶液(ELISA POD TMB KIT，NACALAITESQUE,INC.制)。向其中分别添加1M硫酸溶液100μL，将该96孔板用酶标仪(168-11135CAM，Bio-Rad Laboratories,Inc.制)测定450nm的吸光度。基于连续稀释时的吸光度，以Log2求出小鼠血清中的IgG效价。
小鼠鼻腔清洗液中流感HA特异性IgA效价的测定方法(ELISA法)
在ELISA用96孔板中，分别添加100μL用碳酸缓冲液稀释的各流感HA(例如测定A/IvPR8/34(H1N1)特异性IgA抗体效价时为A/IvPR8/34(H1N1)流感HA)或者含OVA的溶液(5μg/mL)，放置一晚。
用预先准备的清洗液(含吐温20的PBS)清洗3次孔，分别添加将封闭剂(Block Ace，DS Pharma Biomedical Co.,Ltd制)用纯化水稀释至4g/100mL而成的封闭溶液200μL，在室温下放置2小时。
其后，用清洗液(含吐温20的PBS)清洗3次孔，将封闭剂(Block Ace，DS Pharma Biomedical Co.,Ltd制)用磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)稀释至0.4g/100mL，用所得溶液将从小鼠采集的鼻腔清洗液以2倍的倍率连续稀释12次，分别添加50μL该溶液，在室温下放置2小时。
其后，用清洗液(含吐温20的PBS)清洗3次孔，将封闭剂(Block Ace，DS Pharma Biomedical Co.,Ltd制)用磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)稀释至0.4g/100mL，用所得溶液将HRP标记抗小鼠IgA抗体(Goat-anti-mouse IgA α HRP，BETHYLLABORATORIES制)稀释至10000倍，各添加100μL，在室温下放置1小时。其后，用清洗液(含吐温20的PBS)清洗3次孔，分别添加100μL TMB溶液(ELISA POD TMB KIT，NACALAITESQUE,INC.制)。向其中分别添加1M硫酸溶液100μL，将该96孔板用酶标仪(168-11135CAM，Bio-Rad Laboratories,Inc.制)测定450nm的吸光度。基于连续稀释时的吸光度，以Log2求出小鼠鼻腔清洗液中的IgA效价。
使小鼠感染A/IvPR8/34(H1N1)流感病毒的实验(生存率测定)
对给予了疫苗的小鼠，在最终给药的一周后，在麻醉下投与15μL已稀释的A/IvPR8/34(H1N1)流感病毒(10×LD50：50%致死量)。以该日为第0日，追踪观察小鼠至第14日为止，测定生存率。
如图1、2所示那样，实施例1～6中，高水平地生成了流感HA特异性IgG和IgA，与此相对，比较例1～9中，虽然生成了流感HA特异性IgG，但流感特异性IgA的生成量低。由这些结果可以看出：TLR4激动剂、TLR2/6激动剂和环二核苷酸作为免疫刺激剂来诱导舌下的粘膜免疫是有效的。
如图3、4所示那样，通过实施例7～9与比较例10～12的比较可以看出：即使在流感HA抗原的给药量下降到0.75μg的体系中，也能够利用舌下给药来充分地诱导全身性免疫和粘膜免疫。
如图5所示那样，通过实施例10与比较例13、比较例14的比较可以看出：通过进行舌下免疫，对致死量的流感病毒实现了完全的感染防御。
如图6、7所示那样，通过实施例11与比较例14、比较例1的比较可以看出：即使对于完整颗粒类型的疫苗，通过使用佐剂，也可以充分地诱导全身性免疫和粘膜免疫。
如图8、9所示那样，通过实施例12、实施例13与比较例15、比较例16、比较例1的比较可以看出：即使针对A/California/7/2009(H1N1)、即人感染的季节性流感，也能够诱导全身性免疫和粘膜免疫。
如图10、11所示那样，通过实施例12、实施例14、实施例15与比较例16、比较例1的比较可以看出：通过舌下免疫能够对各种类型的流感病毒诱导全身性免疫和粘膜免疫。
如图12、13所示那样，通过实施例16、实施例17与比较例17、比较例18的比较可以看出：能够高度诱导流感HA特异性和OVA特异性全身性免疫以及粘膜免疫。
产业上的可利用性
本发明的疫苗组合物由于将至少一种的源自感染症的抗原与上述的特定免疫刺激剂一起使用，即使向口腔粘膜给药，也可以有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答。

Claims (11)

1.一种疫苗组合物，其特征在于，其为向人或动物的口腔内给药的疫苗组合物，
包含至少一种的源自感染症的抗原，以及
选自由Toll样受体4(TLR4)激动剂、Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂、和环二核苷酸或其衍生物或者盐组成的组中的至少1种。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，源自感染症的抗原为源自流感病毒的抗原。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，源自流感病毒的抗原为血凝素蛋白。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，源自流感病毒的抗原为完整病毒颗粒。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，Toll样受体4(TLR4)激动剂包含选自由脂多糖或其盐、以及单磷酰脂或其盐组成的组中的至少1种。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，脂多糖或其盐为源自大肠杆菌、源自沙门氏菌、源自泛菌、源自醋酸杆菌、源自发酵单胞菌、源自黄单胞菌或源自肠细菌的脂多糖或其盐，
单磷酰脂或其盐为源自沙门氏菌的单磷酰脂或合成吡喃葡萄糖基脂。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，Toll样受体2/6(TLR2/6)激动剂包含二酰基脂肽或其衍生物或者盐。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，二酰基脂肽包含Pam2CSK4、MALP-2、FSL-1或它们的衍生物或者盐。
9.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，环二核苷酸包含c-di-GMP、c-di-AMP或它们的衍生物或者盐。
10.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，脂多糖或其盐为源自泛菌的脂多糖或其盐。
11.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其为诱导粘膜免疫应答和全身性免疫应答的疫苗组合物，
所述粘膜免疫应答为产生抗原特异性IgA抗体，
所述全身性免疫应答为产生抗原特异性IgG抗体和产生抗原特异性细胞性免疫。
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