KR20130112790A - 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 감염증의 예방 또는 치료제로서 유용하고, 효과적으로 전신성 면역 응답 및 점막 면역 응답을 유도시킬 수 있는 설하 투여 가능한 백신 조성물을 제공한다.
인간 또는 동물의 구강 내에 투여되는 백신 조성물이며, 적어도 1종류의 감염증 유래 항원과, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트, 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트 및 환상 비스디뉴클레오티드 또는 그의 유도체 혹은 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물이다.
인간 또는 동물의 구강 내에 투여되는 백신 조성물이며, 적어도 1종류의 감염증 유래 항원과, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트, 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트 및 환상 비스디뉴클레오티드 또는 그의 유도체 혹은 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물이다.
Description
본 발명은 감염증의 예방 또는 치료제로서 유용하고 설하 투여 가능한 백신 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트, 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트 및 환상 비스디뉴클레오티드 또는 그의 유도체 혹은 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 아쥬반트로 하여, 감염증 유래 항원과 함께 설하 투여함으로써, 효과적으로 전신성 면역 응답 및 점막 면역 응답을 유도하게 하는 것이 가능한 백신 조성물에 관한 것이다.
백신 제제의 제형으로는, 현재 제품화되어 있는 것 대부분이 주사제이다. 주사형 백신은 혈중(전신성)의 면역 응답(IgG 항체의 생성)을 유도하지만, 점막에서의 면역 응답(IgA 항체의 생성)은 유도하지 않고, 감염 후에 의한 병원체의 증식을 방지할 수는 있지만, 점막 경로에 의한 병원체의 감염 자체를 방어하는 것은 곤란하다는 문제점이 있었다.
따라서, 최근에 점막으로부터의 백신 접종이 주목을 받고 있으며, 그 중에서도 인플루엔자 바이러스를 항원으로 사용한 점막 투여(경비 투여)형 백신의 개발이 각광을 받고 있다.
점막 투여형 백신은 전신성 면역(IgG 항체의 생성)을 유도할 뿐만 아니라, 점막 면역(IgA 항체의 생성)을 유도하는 것이 가능하다. 이 IgA 항체는 대상이 되는 질환의 병원체의 타입을 그다지 엄격히 구별하지 않는 것이 특징이며, 해마다 바뀌는 병원체의 유행형이 변화해도 대응할 수 있어, 범유행 방지에 효과적이라고 여겨지고 있다.
또한, 경비 투여형 백신이 각광을 받고 있는 것은, 소화관 점막에의 항원의 투여에서는 위산의 영향이나 단백 분해 효소의 영향을 받기 쉬워, 이들을 방지하는 것이 곤란한 것에 반해, 경비 점막에의 항원의 투여에서는 이들의 영향이 없는 것을 그 이유 중 하나로 들 수 있다. 또한, 비강 점막 상에는 NALT라고 불리는 항원인식 조직이 있어, 면역 응답에 효과적인 것도 이유 중 하나다.
그러나, 비강 점막에의 항원의 투여는 효과는 높지만 급성 뇌증 등의 위독한 부작용의 가능성도 높고, 또한 노인이나 유아 등에서는 경비 투여 자체가 번잡하고 어려우며, 또한 콧물 등의 신체적 요인에 의해 안정된 효과를 얻지 못하는 문제점이 있었다.
한편, 항원을 경구 투여하고, 연하 후, 소화관 점막(소장) 등으로 전신성 면역 및 점막 면역을 유도시키려는 시도도 다수 행해지고 있다. 이때 우려되는 점은, 위산에 의한 항원의 분해, 단백 분해 효소에 의한 항원의 분해를 어떻게 방지할 것인가라는 것이다. 이것을 해결하기 위해서, 위산을 중화하는 제산제를 다량으로 포함시키거나, 마이크로스피어 등의 피막 기술에 의해 항원을 지키는 기술이 개발되어 왔다.
그러나, 실제로 개발이 성공한 것은, 원래 위산에서의 안정성이 높은 생약독화 폴리오바이러스 백신이나 생약독화 로타바이러스 백신이었다.
또한, 경구 투여에서, 연화하지 않고 구강내 점막(특히 설하 점막) 경로로 면역 응답시키는 제제로서, 알레르기 백신을 들 수 있다. 이 백신은 설하 면역요법(Sublingual Imunotherapy, SLIT)이라고 불리고, 설하에 알레르기의 항원이 되는 단백(알레르겐)을 포함하는 식물 유래의 추출물을 계속해서 투여함으로써, 당해 알레르겐에 대하여 면역 관용을 일으키게 되고, 알레르기 반응이 일어나지 않게 되는 현상을 이용한 것이다. 최근 유럽에서 당해 치료법이 인지되어, 현재는 다수의 제품이 출시되어 있다.
이 구강 점막 경로, 특히 설하 점막 경로로 면역 응답시키는 제제를 사용한 치료법은 알레르겐을 피하에 주사를 놓던 종래의 치료법(피하 면역요법(Subcutaneous Immunotherapy))과 비교하여, 환자의 QOL 및 위독한 부작용인 과민성 쇼크가 일어나기 어렵다는 관점에서, 대단히 각광을 받고 있다.
그러나, 당해 치료법은 어디까지나 특이적인 면역 관용을 일으키게 하는 제제를 이용하는 것이며, 면역을 활성화시키는 요법은 아니었다. 구강 점막은, 일반적으로는 면역이 일어나기 어렵고, 이들 면역 관용을 일으킬 수 있어도 면역을 활성화하는 것은 어렵다고 생각되어 왔다.
구강 점막 경로, 특히 설하 점막 경로로 점막 면역 및 전신성 면역을 유도하는 예로는 이하의 보고가 이루어져 있다.
항원으로서 OVA를 사용하고, 면역 부활제(아쥬반트)로서 콜레라톡신을 사용하여, 설하에 투여함으로써, OVA 특이적인 전신성 면역 응답(IgG 생성) 및, OVA 특이적인 점막 면역 응답(IgA 생성)이 확인되는 것이 제안되어 있다(예를 들어, 특허문헌 1 참조). 그러나, 당해 제안에 있어서는 신경 독성이 높은 콜레라톡신을 면역 부활제로 사용하고 있어, 안전성에 대하여 문제가 있었다.
또한, 항원으로 OVA를 사용하고, 면역 부활제로 TLR 4 아고니스트인 3탈-O-아실화 모노포스포릴 지질 A를 사용하여, 설하에 투여함으로써, OVA 특이적인 전신성 면역 응답(IgG 생성) 및 OVA 특이적인 점막 면역 응답(IgA 생성)이 확인되는 것도 제안되어 있다(예를 들어, 특허문헌 2 참조). 당해 제안에 있어서는 설하 투여에 있어서 TLR4 아고니스트를 면역 부활제로 사용하고 있지만, 감염증 유래 항원에 관한 실시예가 없고, 효과에 항원의 종류에 대한 범용성이 있는지 여부는 명확하지 않다. 또한, OVA의 투여량이 80 내지 160㎍이며, 3탈-O-아실화 모노포스포릴 지질A의 투여량의 20 내지 40㎍으로 상당히 투여량이 많고, 안전성을 고려한 경우에는 실용성이 부족한 부분이 있었다.
또한, 합성 아쥬반트인 글루코피라노실리피드(Glucopyranosyl Lipid)의 합성법에 관한 제안(예를 들어, 특허문헌 3 참조) 중에도, 항원과 당해 아쥬반트를 병용해서 점막 투여함으로써 점막 면역 응답이 유도되는 취지가 기재되어 있다. 또한, TLR2/6 리간드인 MALP-2를 사용하고, 항원으로서 β-갈락토시다아제를 사용하여, 마우스에 경비 투여함으로써, 혈청 중의 IgG 및 비강 세정액 중의 IgA가 유도되는 것을 제안(예를 들어, 특허문헌 4 참조)하고 있다. 그러나, 감염증 유래의 항원 및 구강 점막에의 투여에 대해서는 실시예가 없고, 효과에 범용성이 있는지 여부는 불분명하였다. 또한, 환상 비스디뉴클레오티드인 c-di-GMP 또는 c-di-AMP를 면역 부활제로서 사용하고, 항원으로 β-갈락토시다아제를 사용하여, 마우스에 경비 투여함으로써, 혈청 중의 IgG가 유도되는 것을 제안(예를 들어, 특허문헌 5 참조)하고 있지만, 경비 투여에서의 IgA 유도에 대해서는 언급하고 있지 않고, 또한 감염증 유래의 항원 및 구강 점막에의 투여에 대해서는 실시예가 없어, 효과에 범용성이 있는지 여부는 불분명하였다.
본 발명은 상기 현 상황을 감안하여, 감염증의 예방 또는 치료제로서 유용하고, 효과적으로 전신성 면역 응답 및 점막 면역 응답을 유도시킬 수 있는 설하 투여 가능한 백신 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 구강내 투여, 특히 설하 투여에 있어서, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트, 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트 및 환상 비스디뉴클레오티드 또는 그의 유도체 혹은 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 아쥬반트로 하여, 감염증 유래 항원과 함께 설하 투여함으로써, 효과적으로 전신성 면역 응답 및 점막 면역 응답을 유도시킬 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 인간 또는 동물의 구강 내에 투여되는 백신 조성물이며, 적어도 1종류의 감염증 유래 항원과, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트, 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트 및 환상 비스디뉴클레오티드 또는 그의 유도체 혹은 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물이다.
본 발명의 백신 조성물에 있어서, 상기 감염증 유래 항원은 인플루엔자 바이러스 유래 항원인 것이 바람직하다.
또한, 상기 인플루엔자 바이러스 유래 항원은 헤마글루티닌 단백인 것이 바람직하다.
또한, 인플루엔자 바이러스 유래 항원은 바이러스 전체 입자인 것이 바람직하다.
또한, 상기 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트는, 리포폴리사카라이드 또는 그의 염 및 모노포스포릴리피드 또는 그의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 리포폴리사카라이드 또는 그의 염은 대장균 유래, 살모넬라균 유래, 판토에아균 유래, 아세토박테리아균 유래, 자이모모나스균 유래, 크산토모나스균 유래, 또는 엔테로박테리아균 유래이며, 상기 모노포스포릴리피드 또는 그의 염은 살모넬라균 유래의 모노포스포릴리피드 또는 합성 글루코피라노실리피드인 것이 바람직하다.
또한, 상기 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트는 디아실화 리포펩티드 또는 그의 유도체 혹은 염을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 디아실화 리포펩티드는 Pam2CSK4, MALP-2, FSL-1, 또는 이들의 유도체 혹은 염을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 환상 비스디뉴클레오티드는 c-di-GMP, c-di-AMP, 또는 이들의 유도체 혹은 염을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 백신 조성물에 있어서, 구강내에의 투여는 설하 점막에의 투여인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 백신 조성은 점막 면역 및 전신성 면역 응답을 유도하게 하는 것이며, 상기 점막 면역 응답은 항원 특이적 IgA 항체 생성이고, 상기 전신성 면역 응답은 항원 특이적 IgG 항체 생성 및 항원 특이적 세포성 면역 생성인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 백신 조성물은 적어도 1종류의 감염증 유래 항원을 함유한다.
상기 감염증 유래 항원이란, 피검생물체에 의해 발생하는 면역 응답의 표적일 수 있는 모든 물질을 가리킨다. 또한, 상기 감염증 유래 항원은 면역 담당 세포에 접촉했을 때에, 면역 응답(예를 들어, 면역 담당 세포의 성숙, 사이토카인 생성, 항체 생성 등)의 표적이어도 좋다.
본 발명에서 사용하는 감염증 유래 항원으로는 감염성 병원체 및 감염성 병원체 유래의 항원이면 특별히 한정되지 않는다.
상기 감염성 병원체로부터 걸리는 질환으로는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSV-I, HSV-II, CMV 또는 VZV), 폭스 바이러스(예를 들어, 두창 혹은 우두, 또는 전염성 연속종 등의 오소폭스 바이러스), 피코르나 바이러스(예를 들어, 라이노 바이러스 또는 엔테로 바이러스), 오르토믹소 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 파라믹소 바이러스(예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV)), 코로나 바이러스(예를 들어, SARS), 파포 바이러스(예를 들어, 생식기 사마귀, 심상성 방광혹, 또는 족저 사마귀를 일으키는 것 등의 유두종 바이러스), 헤파드나 바이러스(예를 들어, 간염B 바이러스), 플라비 바이러스(예를 들어, 간염C 바이러스 또는 뎅기 바이러스), 또는 레트로 바이러스(예를 들어, HIV 등의 렌티 바이러스) 등의 바이러스 감염으로부터 걸리는 질환 등의 바이러스 질환, 에스케리키아 속, 엔테로박터, 살모넬라균, 포도상구균, 적리균, 리스테리아, 아에로박터, 헬리코박터, 클렙시엘라, 프로테우스, 슈도모나스, 연쇄 구균, 클라미디아, 미코플라스마, 폐렴구균, 네이세리아, 클로스트리듐, 바실루스, 코리네박테리움, 미코박테리움, 칸피로박터, 비브리오, 세라티아, 프로비덴시아, 크로모박테리움, 브루셀라, 예르시니아, 해모필루스, 또는 보르데텔라 등의 세균 감염으로부터 걸리는 질환 등의 세균 질환, 클라미디아, 칸디다증, 아스페르길루스증, 히스토플라스마증, 크립토코쿠스 수막염을 비롯하지만, 이것에 한정되는 것은 아닌 진균 질환, 말라리아, 뉴모시스티스카리니 폐렴, 레슈마니아증, 크립토스포리디움증, 톡소플라스마증 및 트리파노소마 감염 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 감염증 유래 항원은 인플루엔자 바이러스 유래 항원인 것이 바람직하다.
여기서, 상기 인플루엔자 바이러스란, 오르토믹소 바이러스과에 속하는 직경 약 100㎚의 입자 크기를 갖는 RNA 엔벨로프 바이러스이며, 내부 단백의 항원성에 기초하여, A, B 및 C형으로 나뉘어진다. 상기 인플루엔자 바이러스는 지질 이중층 구조를 갖는 바이러스 엔벨로프로 둘러싸인 내부 뉴클레오캡시드 또는 핵 단백질과 회합한 리보핵산(RNA)의 코어와, 외부 당단백질을 포함하여 이루어진다. 상기 바이러스 포락선의 내층은 주로 매트릭스 단백질로 구성되고, 외층은 대부분이 숙주 유래 지질 물질로 구성된다. 또한, 상기 인플루엔자 바이러스의 RNA는 분절 구조를 취한다. 또한, 전세계에서 대유행하는 인플루엔자는 A형 인플루엔자 바이러스에 의한 것이며, 이 A형 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌(HA) 및 노이라미니다제(NA)의 2종류의 엔벨로프 당단백질을 갖고, 항원성의 차이에 의해 HA에서는 16종, NA에서는 9종의 아형으로 구별되어 있다.
본 발명에 있어서 상기 감염증 유래 항원으로는 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 유래 항원이 적절하게 사용된다. 또한, 상술한 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스의 아형으로는 특별히 한정되지 않고, 지금까지 단리된 아형이어도 장래 단리될 아형이어도 좋다.
본 발명에 있어서, 인플루엔자 바이러스 유래 항원으로는, 상기 인플루엔자 바이러스를 구성하는 다양한 성분의 적어도 일부이면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 정제 바이러스 입자가 유기 용매/계면 활성제 혹은 다른 시약으로 불활화된 바이러스 전체 입자, 또는 상기 바이러스 전체 입자 중에서 불순물을 제거하고, HA 및/혹은 NA를 정제해서 만들어진 바이러스 서브유닛 등을 들 수 있다. 면역원성의 관점에서, HA 서브유닛 또는 바이러스 전체 입자가 바람직하다. 상기 바이러스 전체 입자는 포르말린 등에 의해 불활화된 것이 보다 바람직하다. 또한, 불순물이 적고, 면역 부활제 등의 아쥬반트가 필수가 되는 HA 서브유닛(스플릿)에 대해서 특히 유효하다.
상기 인플루엔자 바이러스 항원의 제조 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지된 방법을 한정 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 감염 동물 또는 인플루엔자의 환자로부터 단리된 바이러스주를 달걀 등에 감염시켜서 통상법에 의해 배양하고, 정제한 바이러스 원액으로부터 항원을 제조하는 방법을 들 수 있다. 또한, 유전자 공학적으로 배양 세포 중에서 제조한 바이러스 유래의 항원을 사용해도 좋다.
본 발명의 백신 조성물에 있어서, 상기 감염증 유래 항원은 유효량 함유되어 있으면 좋지만, 예를 들어 1개체에 1회 투여를 위하여 본 발명의 백신 조성물의 전량에 대하여 0.001 내지 1000㎍의 범위로 함유되어 있는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 0.01 내지 100㎍의 범위이고, 더욱 바람직하게는 0.1㎍ 내지 50㎍의 범위이다. 0.001㎍ 미만이면 감염증의 예방 또는 치료제로서의 기능이 불충분해지는 경우가 있고, 1000㎍을 초과하면 안전성에 대해서 문제가 되는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에서 말하는 「1개체」란, 임의의 포유동물이어도 좋고, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 백신 조성물은 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트, 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트 및 환상 비스디뉴클레오티드 또는 그의 유도체 혹은 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 함유한다.
이들 화합물은 본 발명의 백신 조성물에 있어서 면역 부활제로서 기능하는 것이다.
상기 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트로는 리포폴리사카라이드 또는 그의 염을 적절하게 들 수 있다. 또한, 본 명세서에서 말하는 리포폴리사카라이드란, 리포폴리사카라이드 그 자체이어도, 그의 성질을 갖는 한 그의 유도체이어도 좋다. 본 명세서에서 말하는 염이란, 임의의 유기산 또는 무기산이어도 좋지만, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 염이다.
또한, 상기 리포폴리사카라이드는, 그램 음성균 세포벽으로부터의 추출물 또는 그의 개변체이어도 좋고, 합성품이어도 좋다.
상기 그램 음성균으로는, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Eschericha Coli)속, 시겔라(Shigella)속, 살모넬라(Salmonella)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 프로테우스(Proteus)속, 예르시니아(Yersinia)속, 브이. 콜레라에(V. cholerae)속, 브이. 파라해몰리티쿠스(V. parahaemolyticus)속, 해모필루스(Haemophilus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 레지오넬라(Legionella)속, 보르데텔라(Bordetella)속, 브루셀라(Brucella)속, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)속, 박테로이데스(Bacteroides)속, 네이세리아(Neisseria)속, 클라미디아(Chlamydia)속, 플레시오모나스(Plesiomonas)속, 프로피로모나스(Prophyromonas)속, 판토에아(Pantoea)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 스테노르토포모나스(Stenortophomonas)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 아세토박터(Acetobacter)속, 크산토모나스(Xanthomonas)속, 자이모모나스(Zymomonas)속 등을 들 수 있다.
그 중에서도, 에스케리키아 콜라이속 유래, 살모넬라속 유래, 판토에아속 유래, 아세토박터속 유래, 자이모모나스속 유래, 크산토모나스속 유래 또는 엔테로박터속 유래인 것인 것이 바람직하다. 이것들은 옛부터 많은 식품, 한방약에 포함되어, 생체에 대한 안전성이 담보되고 있으며, 특히 판토에아속 유래는 현재 건강식품으로 사용되고 있어, 보다 유효하다고 말할 수 있다. 이들 균 유래의 추출물 또는 그의 개변체를 그대로 사용하는 것도 가능하다.
또한, 상기 그램 음성균 세포벽으로부터의 추출물 또는 정제한 리포폴리사카라이드로 사용하는 경우에는, 일반적으로는 생체에 대한 안전성을 가미할 필요가 있고, 이것들을 해독화하기 위한 개변체로서 사용할 수도 있다. 한편, 아세토박터속(아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 크실리눔(Acetobacter xylinum), 아세토박터 오리엔탈리스(Acetobacter orientalis) 등), 자이모모나스속(자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 등), 크산토모나스속(크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) 등), 엔테로박터속(엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 등), 판토에아속(판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 등)은 옛부터 많은 식품, 한방약에 포함되어, 생체에 대한 안전성이 담보되고 있으며, 이들 균 유래의 추출물 또는 정제한 리포폴리사카라이드를 그대로 사용하는 것도 가능하다.
또한, 상기 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트로서는, 상기 리포폴리사카라이드의 유도체, 예를 들어 다당 부분을 제거한 리피드 A 또는 모노포스포릴리피드 A, 3-탈-아실화MPL 등을 들 수 있고, 혹은 염이어도 좋다.
상기 리포폴리사카라이드의 다당 부분을 제거한 리피드 A로는, 상기 그램 음성균 유래의 단리물이면 좋고, 혹은 이들 그램 음성균 유래의 단리물과 동일한 구조가 되도록 합성한 물을 사용해도 좋다.
또한, 상기 리피드 A의 개변체로는 탈인산화를 행한 모노포스포릴리피드(MPL) 또는 염도 적절하게 사용된다. 또한, 본 명세서에서 말하는 모노포스포릴리피드는, 모노포스포릴리피드 그 자체이어도, 그의 성질을 갖는 한 그의 유도체이어도 좋다. 특히 이미 의료 용도로 면역 부활제로서 실적이 있는 3-탈-아실화물 모노포스포릴리피드(3D-MPL), 또는 미국 특허 출원 공개 제2010/0310602호 명세서로 제안되어 있는 탈아실화되어 있지 않은 합성 글루코피라노실리피드가 생체에 대한 안전성의 관점에서 바람직하다.
또한, 상기 모노포스포릴리피드로는 안전성 및 사용 전례가 있는 살모넬라균 유래의 것도 적절하게 사용된다.
상기 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트로는, 예를 들어 디아실화 리포펩티드 또는 그의 유도체 혹은 염을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 디아실화 리포펩티드로는 안전성 및 사용 전례가 있는 Pam2CSK4, MALP-2, FSL-1 또는 이것의 유도체 혹은 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트로는 미코플라스마 세포막으로부터의 추출물 또는 그의 개변체이어도 좋고, 합성품이어도 좋다.
상기 미코플라스마로는, 예를 들어 미코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae), 미코플라스마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium), 미코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 우레아플라스마(Ureaplasma), 미코플라스마 살리바리움(Mycoplasma salivarium), 미코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans), 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 미코플라스마 히오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae), 미코플라스마 라보라토리움(Mycoplasma laboratorium), 미코플라스마 미코이데스(Mycoplasma mycoides), 미코플라스마 오비뉴모니애(Mycoplasma ovipneumoniae) 등을 들 수 있다.
상기 미코플라스마 세포막으로부터의 추출물 또는 정제한 디아실화 리포펩티드로 사용하는 경우에는, 일반적으로는 생체에 대한 안전성을 가미할 필요가 있고, 이들을 해독화하기 위한 개변체로서 사용할 수도 있다.
상기 환상 비스디뉴클레오티드로는, 환상 비스디프린 뉴클레오티드 또는 그의 유도체 혹은 염이면 좋고, 예를 들어 안전성의 면에서 c-di-GMP, c-di-AMP 또는 그의 유도체 혹은 염이 바람직하다.
상기 TLR4 아고니스트, TLR2/6 아고니스트 및 c-di-GMP는 모두 설하 면역 부활제로서 충분한 기능을 갖는 것이며, 특히 TLR4 아고니스트는 저렴하게 입수 가능하고, 또한 인간에게도 사용 실적이 있다. 예를 들어, 상기 TLR4 아고니스트의 하나인 판토에아균 유래 LPS는 건강식품으로서 널리 사용되고 있으며, 인간에게 있어 적응이 용이하다는 이점이 있다.
본 발명의 백신 조성물에 있어서, 상술한 3종류의 면역 부활제(TLR4, TLR2/6, 환상 비스디뉴클레오티드)의 각각의 함유량으로는, 예를 들어 1개체에 1회 투여를 위하여 본 발명의 백신 조성물의 전량에 대하여 0.1㎍ 내지 100㎎의 범위로 함유되어 있는 것이 바람직하다. 0.1㎍ 미만이면 충분한 감염증의 예방 또는 치료제로서의 기능을 얻지 못하는 경우가 있고, 100㎎을 초과하면 안전성에 대해서 문제가 되는 경우가 있다. 상기 면역 부활제 함유량의 보다 바람직한 하한은 0.3㎍, 보다 바람직한 상한은 50㎎이다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 상술한 3종류의 군에서 선택되는 면역 부활제를 적어도 1종류 포함하면, 이것들과 다른 종래 공지된 면역 부활제를 조합해서 사용해도 좋다.
본 발명의 백신 조성물은 상술한 감염증 유래 항원 및 면역 부활제에 필요에 따라 다른 성분(예를 들어, 인산 완충 용액 등)을 첨가하고, 공지된 방법으로 교반 혼합함으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물을 사용하여, 액제, 고형 제재, 분무제를 제조하는 것이 가능하고, 상술한 재료 이외에, 원한다면 부형제, 결합제, 향료, 교미제, 감미제, 착색제, 방부제, 항산화제, 안정화제, 계면 활성제 등을 적절히 사용해도 좋다.
이들의 재료로는 특별히 한정되지 않고 종래 공지된 것을 사용할 수 있다.
여기서, 상기 고형제재에는 정제, 코팅정, 산제, 과립제, 세립제, 구강내 붕괴정, 구강내 부착제, 젤리제, 필름제가 포함되고, 구강 점막, 설하 점막에 투여하는 고형 형상인 것이라면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 인간 또는 동물(포유류, 조류 등)의 구강 내로 투여되는 것인데, 당해 구강 내로의 투여는, 설하 점막에의 투여인 것이 바람직하다. 상술한 바와 같이 구강 점막은, 일반적으로는 면역이 일어나기 어렵고, 이들 면역 관용을 일으킬 수 있어도, 면역을 활성화하는 것이 어렵다고 생각되고 있었지만, 본 발명의 백신 조성물은 적어도 1종류의 감염증 유래 항원과 함께, 상술한 특정한 면역 부활제를 병용하기 때문에, 비강 점막에 투여해도 효과적으로 전신성 면역 응답 및 점막 면역 응답을 유도할 수 있다.
또한, 설하 점막에 투여하므로, 소화관 점막에 항원을 투여할 경우와 같이 위산의 영향이나 단백 분해 효소의 영향을 받는 경우가 없고, 또한 비강 점막에 항원을 투여하는 경우와 같이 급성 뇌증 등의 위독한 부작용의 가능성이 없으며, 노인이나 유아 등에게도 투여가 용이하고, 또한 콧물 등의 신체적 요인에 의한 안정된 효과를 방해하는 경우도 없다.
또한, 본 발명의 백신 조성물의 투여 방법으로는 상술한 바와 같다. 또한, 그 투여량으로는 동물종, 대상의 연령, 성별, 체중 등을 고려해서 결정되지만, 예를 들어 감염증 유래 항원으로서 HA를 사용한 경우, 통상 0.1㎍ 내지 50㎍을 1회 또는 2회 이상 투여할 수 있다. 바람직하게는 복수회의 투여이며, 이 경우, 1 내지 4주일의 간격을 두어서 투여하는 것이 바람직하다. 상기 감염증 유래 항원으로서 바이러스 전체 입자를 사용한 경우, HA 환산으로 투여량을 설정하면 좋다. 또한, 상기 HA의 중량은 SRD 역가 혹은 Lowry법에 의해 측정한 값이다.
본 발명의 백신 조성물은, 적어도 1종류의 감염증 유래 항원과 함께, 상술한 특정한 면역 부활제를 병용하기 때문에, 구강 점막, 특히 설하 점막에의 투여에 의해, 효과적으로 전신성 면역 응답 및 점막 면역 응답을 유도시킬 수 있다.
도 1은 실시예 1 내지 실시예 6, 비교예 1 내지 비교예 9의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 2는 실시예 1 내지 실시예 6, 비교예 1 내지 비교예 9의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 3은 실시예 7 내지 실시예 9, 비교예 10 내지 비교예 12의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 4는 실시예 7 내지 실시예 9, 비교예 10 내지 12의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 5는 실시예 10, 비교예 13, 비교예 14의 인플루엔자 바이러스 감염시의 마우스 생존율을 도시하는 그래프.
도 6은 실시예 11, 비교예 1, 비교예 14의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 7은 실시예 11, 비교예 1, 비교예 14의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 8은 실시예 12, 실시예 13, 비교예 15, 비교예 16, 비교예 1의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 9는 실시예 12, 실시예 13, 비교예 15, 비교예 16, 비교예 1의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 10은 실시예 12, 실시예 14, 실시예 15, 비교예 16, 비교예 1의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 11은 실시예 12, 실시예 14, 실시예 15, 비교예 16, 비교예 1의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 12는 실시예 16, 실시예 17, 비교예 17, 비교예 18의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 13은 실시예 16, 실시예 17, 비교예 17, 비교예 18의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 2는 실시예 1 내지 실시예 6, 비교예 1 내지 비교예 9의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 3은 실시예 7 내지 실시예 9, 비교예 10 내지 비교예 12의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 4는 실시예 7 내지 실시예 9, 비교예 10 내지 12의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 5는 실시예 10, 비교예 13, 비교예 14의 인플루엔자 바이러스 감염시의 마우스 생존율을 도시하는 그래프.
도 6은 실시예 11, 비교예 1, 비교예 14의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 7은 실시예 11, 비교예 1, 비교예 14의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 8은 실시예 12, 실시예 13, 비교예 15, 비교예 16, 비교예 1의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 9는 실시예 12, 실시예 13, 비교예 15, 비교예 16, 비교예 1의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 10은 실시예 12, 실시예 14, 실시예 15, 비교예 16, 비교예 1의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 11은 실시예 12, 실시예 14, 실시예 15, 비교예 16, 비교예 1의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 12는 실시예 16, 실시예 17, 비교예 17, 비교예 18의 마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가의 결과를 도시하는 그래프.
도 13은 실시예 16, 실시예 17, 비교예 17, 비교예 18의 마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 결과를 도시하는 그래프.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 76.3μL(236㎍/mL)와, 대장균 유래 리포폴리사카라이드(나카라이테스크사제) 용액 30μL(1㎎/mL)에, 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해서 120μL의 백신 조성물을 제조하였다.
미리 준비한 마우스(암컷 7주령 C57BL/6마우스, 니혼에스엘씨사제) 5마리에 마취(소무노펜틸; 쿄리츠세이야쿠사제)를 한 후, 각각의 마우스의 설하에 제조한 백신 조성물을 20μL 투여하였다.
당해 투여로부터 1주일 후, 다시 마우스에 마취를 하고, 각각의 마우스의 설하에 제조한 백신 조성물을 20μL 투여하였다.
2번째의 투여로부터 다시 1주일 후에, 마우스의 혈청 및 비강 세정액을 채취하여, 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가 및 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가의 측정을 ELISA법에 의해 측정을 행하였다. 또한, 상세한 측정 방법은 후술한다.
(실시예 2 내지 6)
대장균 유래 리포폴리사카라이드 대신에, 실시예 2에서는 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드(자연 면역 응용 기술연구소사제)를 사용하고, 실시예 3에서는 글루코피라노실리피드(MPLAs, InvivoGen사제)를 사용하며, 실시예 4에서는 FSL-1(InvivoGen사제)을 사용하고, 실시예 5에서는 Pam2CSK4(InvivoGen사제)를 사용하며, 실시예 6에서는 c-di-GMP(Cyclic diguanosine monophosphate, BIOLOG사제)를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 해서 백신 조성물을 제조하여, 표 1에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 1)
미리 준비한 마우스(암컷 7주령 C57BL/6 마우스, 니혼에스엘씨사제) 5마리에 마취를 한 후, 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 120μL 준비하여, 각각의 마우스의 설하에 20μL 투여하였다. 이후의 조작은 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 2)
인산 완충액 대신에, 인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 76.3μL(236㎍/mL)에, 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 120μL의 백신 조성물을 제조하였다. 이후의 조작은 표 1에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 3 내지 9)
인플루엔자 HA 항원(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 외에, 비교예 3에서는 펩티도글리칸(살모넬라균 유래 PGN, InvivoGen사제)을 사용하고, 비교예 4에서는 자이모산(zymosan)(나카라이테스크사제)을 사용하며, 비교예 5에서는 Pam3CSK4(InvivoGen사제)를 사용하고, 비교예 6에서는 Poly(I:C)(InvivoGen사제)를 사용하며, 비교예 7에서는 플라겔린(flagellin)(InvivoGen사제)을 사용하고, 비교예 8에서는 이미퀴모드(imiquimod)(InvivoGen사제)를 사용하며, 비교예 9에서는 CpG(InvivoGen사제)를 사용한 것 이외에는, 비교예 2와 마찬가지로 해서 백신 조성물을 제조하여, 표 1에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 7 내지 9)
인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 19μL(236㎍/mL) 외에, 실시예 7에서는 글루코피라노실리피드(MPLAs, InvivoGen사제) 용액 30μL(1㎎/mL)에, 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해서 120μL의 백신 조성물을 제조하고, 마취 하에서 마우스(암컷 7주령 BALB/c 마우스, 니혼에스엘씨사)에 20μL 설하 투여하였다. 실시예 7에 있어서의 글루코피라노실리피드 대신에, 실시예 8에서는 FSL-1(InvivoGen사제)을 사용하고, 실시예 9에서는 c-di-GMP(Cyclic diguanosine monophosphate, BIOLOG사제)를 사용해서 백신 조성물을 제조하였다. 투여량은 표 2와 같으며, 제조 후의 조작은 마우스의 종류가 상이한 것 이외에는 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 10)
인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 19μL(236㎍/mL)에 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 120μL의 백신 조성물을 제조하였다. 투여량은 표 2와 같으며, 제조 후의 조작은 BALB/c 마우스를 사용하고 있는 것 이외에는 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 11, 12)
인플루엔자 HA 항원(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 76.3μL(236㎍/mL) 외에, 비교예 11에서는 펩티도글리칸(살모넬라균 유래 PGN, InvivoGen사제) 30μL(20㎎/mL)에, 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해서 120μL의 백신 조성물을 제조하였다. 비교예 11에 있어서의 펩티도글리칸 대신에, 비교예 12에서는 Pam3CSK4(InvivoGen사제)를 사용해서 백신 조성물을 제조하였다. 투여량은 표 2와 같으며, 제조 후의 조작은 BALB/c 마우스를 사용하고 있는 것 이외에는 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 10)
인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 152.6μL(236㎍/mL)에 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드(자연 면역 응용 기술연구소사제) 60μL(1㎎/mL), 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 240μL의 백신 조성물을 제조하였다.
미리 준비한 마우스(암컷 7주령 BALB/c 마우스, 니혼에스엘씨사제) 10마리에 마취를 한 후, 각각의 마우스의 설하에 제조한 백신 조성물을 20μL 투여하였다.
당해 투여로부터 1주일 후, 다시 마우스에 마취를 하고, 각각의 마우스의 설하에 제조한 백신 조성물을 20μL 투여했다.
2번째의 투여로부터 또한 1주일 후에, 치사량의 인플루엔자 바이러스(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제)를 감염시키고, 그 후 2주일 경과 관찰을 행하여, 생존율 측정을 행하였다. 또한, 상세한 측정 방법은 후술한다.
(비교예 13, 14)
비교예 13에서는 인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/IvPR8/34(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제)만을 포함한 용액, 비교예 14에서는 인산 완충액을 제조하였다. 표 3과 같은 투여량으로 실시예 10과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 11)
인플루엔자 HA 항원 함유 전체 입자 용액(A/California/7/2009(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 10.1μL(1776㎍/mL)에 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드(자연 면역 응용 기술연구소사제) 30μL(1㎎/mL), 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 120μL의 백신 조성물을 제조하였다.
표 4에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 14)
비교예 14에서는 인플루엔자 HA 항원 함유 전체 입자 용액(A/California/7/2009(H1N1))만을 포함한 용액을 제조하였다. 표 4에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 12)
인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/California/7/2009(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 36μL(500㎍/mL)에 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드(자연 면역 응용 기술연구소사제) 30μL(1㎎/mL), 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 120μL의 백신 조성물을 제조하였다.
표 5에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 13)
실시예 12에 있어서의 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드 대신에, 실시예 13에서는 c-di-GMP(Cyclic diguanosine monophosphate, BIOLOG사제)를 사용하고, 실시예 12와 마찬가지로 해서 백신 조성물을 제조하여, 표 5에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 15)
실시예 12에 있어서의 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드 대신에, 비교예 15에서는 이미퀴모드(InvivoGen사제)를 사용하여, 표 5에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 16)
실시예 12에 있어서의 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드 대신에, 비교예 16에서는 다른 아무것도 첨가하지 않고, 인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/California/7/2009(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제)만을 포함한 용액을 제작하였다. 표 5에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 14)
인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/Victria/361/2009(H3N2), 오사카대학 미생물병 연구회제) 33.7μL(534㎍/mL)에 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드(자연 면역 응용 기술연구소사제) 30μL(1㎎/mL), 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 120μL의 백신 조성물을 제조하였다. 표 6에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 15)
인플루엔자 HA 항원 함유 용액(B/Brisbane/60/2008, 오사카대학 미생물병 연구회제) 47.4μL(380㎍/mL)에 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드(자연 면역 응용 기술연구소사제) 30μL(1㎎/mL), 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 120μL의 백신 조성물을 제조하였다. 표 6에 나타낸 투여량으로 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 16)
백신 조성물의 제조는 실시예 12와 같다. 즉, 인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/California/7/2009(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제) 36μL(500㎍/mL)에판토에아균 유래 리포폴리사카라이드(자연 면역 응용 기술연구소사제) 30μL(1㎎/mL), 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 120μL의 백신 조성물을 제조하였다.
표 7에 나타낸 투여량으로 BALB/c 마우스를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(실시예 17)
OVA(Ovalbumin, 시그마사제) 18μL(1㎎/mL)에 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드(자연 면역 응용 기술연구소사제) 30μL(1㎎/mL), 인산 완충액(나카라이테스크사제)을 첨가해 120μL의 백신 조성물을 제조하였다.
표 7에 나타낸 투여량으로 BALB/c 마우스를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 17)
실시예 16에 있어서의 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드 대신에, 비교예 17에서는 다른 아무것도 첨가하지 않고, 인플루엔자 HA 항원 함유 용액(A/California/7/2009(H1N1), 오사카대학 미생물병 연구회제)만을 포함한 용액을 제조하였다. 표 7에 나타낸 투여량으로 BALB/c 마우스를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(비교예 18)
실시예 17에 있어서의 판토에아균 유래 리포폴리사카라이드 대신에, 비교예 18에서는 다른 아무것도 첨가하지 않고, OVA(Ovalbumin, 시그마사제)만을 포함한 용액을 제조하였다. 표 7에 나타낸 투여량으로 BALB/c 마우스를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 같은 순서로 시험을 행하였다.
(시험 방법)
마우스 혈청 중의 인플루엔자 HA 혹은 OVA 특이적 IgG 역가를 측정함으로써, 전신성 면역 응답을 평가하였다. 또한, 마우스 비강 세정액 중의 인플루엔자 HA 혹은 OVA 특이적 IgA 역가를 측정함으로써, 점막 면역 응답을 평가하였다. 각각의 평가법에 대해서는 다음에 나타내었다. 또한, 각각의 평가 결과를 도 1 내지 도 13(도 5 제외)에 도시하였다.
한편 마우스에 인플루엔자 바이러스를 감염시킴으로써 백신 효과를 확인하는 바이러스 감염 실험을 행하였다. 평가 결과를 도 5에 도시하였다.
(마우스 혈청 중 인플루엔자 HA 특이적 IgG 역가 측정 방법(ELISA법))
ELISA용 96웰플레이트에 탄산 완충액으로 희석한 각 인플루엔자 HA(예를 들어 A/IvPR8/34(H1N1) 특이적 IgG 항체값을 측정할 시에는 A/IvPR8/34(H1N1) 인플루엔자 HA 항원 용액) 혹은 OVA 함유 용액(5㎍/mL)을 100mL씩 첨가하여, 하룻 밤 방치하였다.
미리 준비한 세정액(Tween20 함유 PBS)으로 3회 웰을 세정하고, 블로킹제(Block Ace, DS 파마바이오메디칼사제)를 정제수로 4g/100mL로 희석한 블로킹 용액을 200μL씩 첨가하여, 2시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 세정액(Tween20 함유 PBS)로 3회 웰을 세정하였다.
미리 마우스로부터 채취한 혈청을 4℃ 하 3000G에서 10분간 원심하고, 상청 20μL에 인산 완충액(나카라이테스크사제) 300μL를 첨가해서 희석 혈청 용액을 제조하였다.
블로킹제(Block Ace, DS 파마바이오메디칼사제)를 인산 완충액(나카라이테스크사제)으로 0.4g/100mL로 희석한 용액을 사용하여, 상술한 희석 혈청 용액을 사용해서 2배씩 16회 단계 희석하고, 그 용액을 각각 50μL씩 첨가하여, 2시간 실온에서 방치하였다.
그 후, 세정액(Tween20 함유 PBS)으로 3회 웰을 세정하고, 블로킹제(Block Ace, DS 파마바이오메디칼사제)를 인산 완충액(나카라이테스크사제)으로0.4g/100mL로 희석한 용액으로 HRP 표식 항 마우스 IgG 항체(Goat-anti-mouse IgG Fc HRP, BETHYL사제)를 10000배로 희석하고, 100μL씩 첨가하여, 1시간 실온에서 방치하였다.
그 후, 세정액(Tween20 함유 PBS)으로 3회 웰을 세정하고, TMB 용액(ELISA POD TMB키트, 나카라이테스크사제)을 100μL씩 첨가하였다. 여기에 1M 황산 용액을 100μL씩 첨가하고, 당해 96웰 플레이트를 마이크로플레이트리더(168-11135CAM, 바이오래드사제)로 450㎚의 흡광도를 측정하였다. 단계 희석시의 흡광도를 기초로, 마우스 혈청중 IgG 역가를 Log2로 구하였다.
(마우스 비강 세정액 중 인플루엔자 HA 특이적 IgA 역가 측정 방법(ELISA법))
ELISA용 96웰 플레이트에 탄산 완충액으로 희석한 각 인플루엔자 HA(예를 들어 A/IvPR8/34(H1N1) 특이적 IgG 항체값을 측정할 시에는 A/IvPR8/34(H1N1) 인플루엔자HA) 혹은 OVA 함유 용액(5㎍/mL)을 100μL씩 첨가하여, 하룻 밤 방치하였다.
미리 준비한 세정액(Tween20 함유 PBS)으로 3회 웰을 세정하고, 블로킹제(Block Ace, DS 파마바이오메디칼사제)를 정제수로 4g/100mL으로 희석한 블로킹 용액을 200μL씩 첨가하여, 2시간 실온에서 방치하였다.
그 후, 세정액(Tween20 함유 PBS)으로 3회 웰을 세정하고, 블로킹제(Block Ace, DS 파마바이오메디칼사제)를 인산 완충액(나카라이테스크사제)으로0.4g/100mL로 희석한 용액을 사용하여, 마우스로부터 채취한 비강 세정액을 2배씩 12회 단계 희석하고, 그 용액을 각각 50μL씩 첨가하여, 2시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 세정액(Tween20 함유 PBS)으로 3회 웰을 세정하고, 블로킹제(Block Ace, DS 파마바이오메디칼사제)를 인산 완충액(나카라이테스크사제)으로0.4g/100mL으로 희석한 용액으로 HRP 표식 항 마우스 IgA 항체(Goat-anti-mouse IgA α HRP, BETHYL사제)를 10000배로 희석하고, 100μL씩 첨가하여, 1시간 실온에서 방치하였다. 그 후, 세정액(Tween20 함유 PBS)으로 3회 웰을 세정하고, TMB 용액(ELISA POD TMB키트, 나카라이테스크사제)을 100μL씩 첨가하였다. 여기에 1M 황산 용액을 100μL씩 첨가하여, 당해 96웰 플레이트를 마이크로플레이트리더(168-11135CAM, 바이오래드사제)로 450㎚의 흡광도를 측정하였다. 단계 희석시의 흡광도를 기초로, 마우스 비강 세정액 중 IgA 역가를 Log2로 구하였다.
(마우스에의 A/IvPR8/34(H1N1) 인플루엔자 바이러스 감염 실험(생존율 측정))
백신 투여를 행한 마우스에 대해서, 최종 투여보다 일주일 후, 마취 하에서 희석한 A/IvPR8/34(H1N1) 인플루엔자 바이러스를 15μL 투여했다(10×LD50: 50％ Lethal Dose). 그 날을 0일째로 하고, 14일째까지 마우스의 경과 관찰을 행하여, 생존율을 측정하였다.
도 1, 도 2에 도시한 바와 같이, 실시예 1 내지 실시예 6에서는, 인플루엔자 HA 특이적 IgG 및 IgA가 고레벨로 생성되고 있는 데 반해, 비교예 1 내지 비교예 9에서는, 인플루엔자 HA 특이적 IgG에 대해서는 생성되고 있는 것도 있지만, 인플루엔자 특이적 IgA에 대해서는 생성량이 낮았다. 이들 결과로부터 면역 부활제로서 TLR4 아고니스트 및 TLR2/6 아고니스트, 환상 비스디뉴클레오티드가 설하에서의 점막 면역 유도에 유효한 것을 알아내었다.
도 3, 도 4에 도시한 바와 같이, 실시예 7 내지 실시예 9와 비교예 10 내지 비교예 12와의 비교에 의해, 인플루엔자 HA 항원의 투여량을 0.75㎍으로 저감시킨 계에 있어서도, 충분히 설하 투여로 전신성 면역 및 점막 면역을 유도하는 것이 가능한 것을 알아내었다.
도 5에 도시한 바와 같이, 실시예 10과 비교예 13, 비교예 14와의 비교에 의해, 설하 면역을 행함으로써, 치사량의 인플루엔자 바이러스에 대하여 완전한 감염 방어를 달성하고 있는 것을 알아내었다.
도 6, 도 7에 도시한 바와 같이, 실시예 11과 비교예 14, 비교예 1과의 비교에 의해, 전체 입자 타입의 백신에 있어서도 아쥬반트를 사용함으로써 충분히 전신성 면역 및 점막 면역을 유도하는 것이 가능한 것을 알아내었다.
도 8, 도 9에 도시한 바와 같이, 실시예 12, 실시예 13과 비교예 15, 비교예 16, 비교예 1과의 비교에 의해, A/California/7/2009(H1N1), 즉 인간에 감염되는 계절성 인플루엔자에 대해서도 전신성 면역 및 점막 면역을 유도하는 것이 가능한 것을 알아내었다.
도 10, 도 11에 도시한 바와 같이, 실시예 12, 실시예 14, 실시예 15와 비교예 16, 비교예 1과의 비교에 의해, 설하 면역에 의해 여러 가지 타입의 인플루엔자 바이러스에 대하여 전신성 면역 및 점막 면역을 유도하는 것이 가능한 것을 알아내었다.
도 12, 도 13에 도시한 바와 같이, 실시예 16, 실시예 17과 비교예 17, 비교예 18과의 비교에 의해, 인플루엔자 HA 특이적 및 OVA 특이적 전신성 면역 및 점막 면역이 높이 유도되고 있는 것을 알아내었다.
본 발명의 백신 조성물은, 적어도 1종류의 감염증 유래 항원과 함께, 상술한 특정한 면역 부활제를 병용하기 때문에, 구강 점막에의 투여라도 효과적으로 전신성 면역 응답 및 점막 면역 응답을 유도할 수 있다.
Claims (11)
- 인간 또는 동물의 구강 내에 투여되는 백신 조성물이며,
적어도 1종류의 감염증 유래 항원과,
톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트,
톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트, 및
환상 비스디뉴클레오티드 또는 그의 유도체 혹은 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물. - 제1항에 있어서, 감염증 유래 항원은 인플루엔자 바이러스 유래 항원인 백신 조성물.
- 제2항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 유래 항원은 헤마글루티닌 단백인 백신 조성물.
- 제2항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 유래 항원은 바이러스 전체 입자인 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 톨 유사 수용체 4(TLR4) 아고니스트는,
리포폴리사카라이드 또는 그의 염, 및
모노포스포릴리피드 또는 그의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류를 포함하는 백신 조성물. - 제5항에 있어서, 리포폴리사카라이드 또는 그의 염은 대장균 유래, 살모넬라균 유래, 판토에아균 유래, 아세토박테리아균 유래, 자이모모나스균 유래, 크산토모나스균 유래 또는 엔테로박테리아균 유래이며,
모노포스포릴리피드 또는 그의 염은 살모넬라균 유래의 모노포스포릴리피드 또는 합성 글루코피라노실리피드인 백신 조성물. - 제1항에 있어서, 톨 유사 수용체 2/6(TLR2/6) 아고니스트는 디아실화 리포펩티드 또는 그의 유도체 혹은 염을 포함하는 백신 조성물.
- 제7항에 있어서, 디아실화 리포펩티드는 Pam2CSK4, MALP-2, FSL-1, 또는 이들의 유도체 혹은 염을 포함하는 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 환상 비스디뉴클레오티드는 c-di-GMP, c-di-AMP, 또는 이들의 유도체 혹은 염을 포함하는 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 리포폴리사카라이드 또는 그의 염은 판토에아균 유래인 백신 조성물.
- 제1항에 있어서, 점막 면역 및 전신성 면역 응답을 유도하게 하는 것이며,
상기 점막 면역 응답은 항원 특이적 IgA 항체 생성이고,
상기 전신성 면역 응답은 항원 특이적 IgG 항체 생성 및 항원 특이적 세포성면역 생성인 백신 조성물.
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| Falkeborn et al. | Jacobs Journal of Vaccines and Vaccination |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |