WO2020189752A1 - 口腔内粘膜付着型ワクチン製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、口腔内粘膜付着型の製剤で、口腔内粘膜に高濃度の薬物溶液を一定時間付着させることにより、粘膜面にワクチン抗原を安定的に暴露させ、所定時間内で完全に溶解させることのできる口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を提供することを目的とする。 本発明は、ワクチン抗原を含む薬物層と、薬物カバー層とを有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤であって、上記薬物カバー層の厚みが、15μm以上であって、37℃の蒸留水に対する、上記薬物層の崩壊性(A)及び上記薬物カバー層の崩壊性(B)が、(A)>(B)の関係を有し、面積20cm2厚み50μmの上記薬物カバー層の試験片を、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)が、50%以上90%以下である口腔内粘膜付着型ワクチン製剤に関する。
Description
本発明は、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤に関する。
従来から、口腔内への薬物の投与方法として液剤、軟膏剤、ゼリー剤、スプレー剤、トローチ剤、バッカル錠、舌下錠等を用いる方法が知られている。また近年、唾液などの水分で濡れた口腔粘膜に対しても良好な接着性を示す製剤として、水溶性あるいは水膨潤性の高分子を基剤とする口腔内粘膜付着型製剤が数多く開発ないし提案されている。
口腔内粘膜付着型製剤は、いわゆる口内炎のような口腔粘膜疾患を保護・治療する目的で用いられることが多い。そのため、貼付後に水分や唾液を含んだ場合にも貼付部位を物理的に保護し、長時間残存する特性を有することが望まれている。そのため、近年の口腔内粘膜付着型製剤の開発においては、薬物の徐放性を有し物理的に口腔内に長時間残存する口腔内粘膜付着型製剤が開発ないし提案されている。
また、口腔粘膜が疾患部位である場合以外に、口腔粘膜部位が比較的高い薬物吸収性を有することから、例えば、経口では吸収されにくい薬物の投与経路として利用する試みがなされている。このような口腔内粘膜付着型製剤としては、例えば、特許文献1に、セルロースの低級アルキル又は低級ヒドロキシアルキルエーテル、及び、アクリル酸重合体と薬物とから成る薬物層を有することにより、薬物の徐放性及び速効性を満たすことが教示されている。
しかしながら、口腔内粘膜付着型製剤における薬物層及びカバー層の崩壊性を制御することにより、口腔内粘膜に高濃度の薬物溶液を一定時間付着させるものは開示、示唆されていない。さらに、そのような薬物層にワクチン抗原を含む、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤も開示、示唆されていない。
しかしながら、口腔内粘膜付着型製剤における薬物層及びカバー層の崩壊性を制御することにより、口腔内粘膜に高濃度の薬物溶液を一定時間付着させるものは開示、示唆されていない。さらに、そのような薬物層にワクチン抗原を含む、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤も開示、示唆されていない。
一方、口腔内粘膜付着型製剤による薬物投与は、注射による薬物投与と比較して、痛み、恐怖心、注射痕及びそれに続く瘢痕化等の患者の心身的負担がほとんどなく、医療従事者の針刺し感染事故のリスクもなく、注射針等の医療廃棄物が生じないため、注射に代わる投与方法としても注目されている。
特に、ワクチン投与による免疫の誘導には、皮下又は皮内注射、筋肉注射等の注射が一般的に利用されている。微生物やウイルスは、そのサイズの為に皮膚からの侵入が阻止されているため、ワクチンは、侵襲的に体内に投与される必要があるためである。
しかし、免疫効果の高い皮内注射は投与手技が難しく、筋肉注射は患者への痛みが強いことから、注射に代わるワクチン投与方法が望まれていた。
特に、ワクチン投与による免疫の誘導には、皮下又は皮内注射、筋肉注射等の注射が一般的に利用されている。微生物やウイルスは、そのサイズの為に皮膚からの侵入が阻止されているため、ワクチンは、侵襲的に体内に投与される必要があるためである。
しかし、免疫効果の高い皮内注射は投与手技が難しく、筋肉注射は患者への痛みが強いことから、注射に代わるワクチン投与方法が望まれていた。
ここで、口腔内粘膜は、無害の抗原、例えば、食品及び吸入粒子に対する特異的な免疫応答の誘導を阻止するよう進化してきた。その結果、口腔内粘膜表面に導入される多くの抗原が、生産的なT細胞及びB細胞の応答ではなく、「寛容」を誘導する。従って、有効なワクチンを作成するためには、これらの自然プロセスを克服する必要がある。従って、口腔内粘膜ワクチンの製剤化においては、ワクチン抗原を効果的に免疫細胞に送達させること、すなわち、口腔内粘膜面にワクチン抗原を安定的に暴露させることが必須である。このようなワクチンの製剤化技術として、例えば、特許文献2には、経口投与可能な低粘度液体剤形が開示されており、低粘性で活性物質の吸収促進を図ることが教示されている。また、特許文献3には、免疫原性応答を誘発するための経口ワクチンが開示されており、ワクチンの送達のために、免疫応答強化マトリックス形成剤としてデンプンを利用すること、及び速溶性剤形であることが教示されている。
しかし、口腔内粘膜付着型のワクチン製剤で、粘膜面にワクチン抗原を一定時間、安定的に暴露させるものは開示、示唆されていない。
しかし、口腔内粘膜付着型のワクチン製剤で、粘膜面にワクチン抗原を一定時間、安定的に暴露させるものは開示、示唆されていない。
口腔粘膜付着型の製剤を用いて薬物を投与する際の最大の障害は、唾液などの分泌液或いは会話等に伴う粘膜部位の伸縮等により、配置した薬物が吸収されるまでに洗い流されること、及び、薬物量に比して充分な薬理効果が得られないことである。また、口腔内粘膜付着型の製剤が口腔内に維持されていても、製剤が多量の唾液に晒されることにより、製剤中の薬物が溶け出て嚥下される場合もあり、確実に粘膜経路で投与されているか不明な場合もあった。そのため、疾患の種類又は症状によって、投与する薬物の種類や量を調節することが困難であるとの欠点もあった。
また、医療機関においては、薬剤性のアナフィラキシー反応への対応として、通常、薬剤投与後30分は、医師の観察が必要とされている。従って、医療機関では、薬剤投与後の患者に対しても時間管理及び体調管理を行っている。そのため、薬剤投与後の時間管理の負担を軽減する方法も望まれていた。
本発明は、上記現状に鑑み、口腔内粘膜にワクチン抗原を一定時間安定的に暴露させることのできる口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を提供することを課題とする。
本発明者らは鋭意検討した結果、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を構成する薬物層及び薬物カバー層について、各層の水に対する崩壊性を特定の関係にすることで、高濃度の薬物溶液を口腔粘膜上に保持させ、粘膜面に薬物を暴露できることを見出した。さらに、薬物カバー層の崩壊性を示す特定条件下での残存率(C)を、特定の範囲とすることにより、薬物カバー層が一定時間崩壊することなく、高濃度の薬物溶液を一定時間安定して粘膜面に暴露でき、一定時間経過後には薬物カバー層が崩壊し、口腔内に残存せず、薬剤投与後の時間管理が簡便化されることを見出した。
本発明は、ワクチン抗原を含む薬物層と、薬物カバー層とを有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤であって、上記薬物カバー層の厚みが、15μm以上であって、37℃の蒸留水に対する、上記薬物層の崩壊性(A)及び上記薬物カバー層の崩壊性(B)が、(A)>(B)の関係を有し、面積20cm2厚み50μmの上記薬物カバー層の試験片を、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)が、50%以上90%以下であることを特徴とする口腔内粘膜付着型ワクチン製剤である。
また、上記薬物層は、37℃の蒸留水1.0mLに1回投与分を溶解させたときの溶液粘度(D)が、20mPa・s以下であることが好ましい。
また、上記薬物層は、さらに高分子成分を含むことが好ましい。
上記高分子成分は、デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。
上記高分子成分は、デキストランであることが好ましい。
上記薬物層は、さらに少なくとも1種の免疫誘導促進剤を含むことが好ましい。
上記ワクチン抗原は、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。
以下に、本発明を詳細に説明する。
また、上記薬物層は、さらに高分子成分を含むことが好ましい。
上記高分子成分は、デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。
上記高分子成分は、デキストランであることが好ましい。
上記薬物層は、さらに少なくとも1種の免疫誘導促進剤を含むことが好ましい。
上記ワクチン抗原は、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、ワクチン抗原を含む薬物層と、薬物カバー層とを有し、上記薬物カバー層の厚みが、15μm以上であって、37℃の蒸留水に対する、上記薬物層の崩壊性(A)及び上記薬物カバー層の崩壊性(B)が、(A)>(B)の関係を有している。さらに、上記薬物カバー層は、面積20cm2厚み50μmの上記薬物カバー層の試験片を、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)が、50%以上90%以下である。
上記構成を有することで、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内に配置された後にすぐに粘膜上の唾液により薬物層が崩壊する。一方、薬物カバー層は、一定時間崩壊しないため、高濃度の薬物溶液が、一定時間、安定的に粘膜上に保持されることができる。
上記構成を有することで、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内に配置された後にすぐに粘膜上の唾液により薬物層が崩壊する。一方、薬物カバー層は、一定時間崩壊しないため、高濃度の薬物溶液が、一定時間、安定的に粘膜上に保持されることができる。
すなわち、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、上記薬物カバー層の崩壊性(B)が、上記薬物層の崩壊性(A)よりも小さいため、本発明のワクチン製剤が適用される粘膜上の唾液により上記薬物層が崩壊し、高濃度の薬物溶液が形成されると、上記薬物カバー層により必要量以上の口腔内唾液が上記薬物溶液に混入することが確実に防がれる。従って、一定時間にわたって上記薬物溶液が唾液により希釈化されることを防ぎ、高濃度の薬物溶液を粘膜上に保持できる。よって、口腔内経路であっても、唾液の影響を受けることなく確実に薬物を投与することができる。さらに、唾液の影響を受けないため、口腔内への投与であっても薬物投与量に応じた薬理効果を得ることができる。
なお、上記薬物層及び上記薬物カバー層の各崩壊性(A)及び(B)の関係が、上記特定の関係を外れると、製剤が添付される粘膜上の唾液により薬物層が崩壊されるよりも速く口腔内の唾液により上記薬物カバー層が崩壊されることとなり、高濃度の薬物溶液を粘膜上に付着させることができなくなってしまう。
なお、上記薬物層及び上記薬物カバー層の各崩壊性(A)及び(B)の関係が、上記特定の関係を外れると、製剤が添付される粘膜上の唾液により薬物層が崩壊されるよりも速く口腔内の唾液により上記薬物カバー層が崩壊されることとなり、高濃度の薬物溶液を粘膜上に付着させることができなくなってしまう。
また、特定の大きさにおける上記薬物カバー層の残存率(C)が50%以上であることにより、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが15μm以上である場合に、例えば、口腔内環境で2分以上薬物カバー層の形状が保持される。
ここで、ワクチン製剤として免疫誘導効果を効率的に得るためには、薬物層が崩壊して形成される薬物溶液(ワクチン抗原溶液ともいう。)が、高濃度で一定時間(2分以上)、粘膜上に暴露されることが必要である。そのため、一定時間(2分)未満に、口腔内に投与された口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の薬物層に、一定量(投与箇所となる粘膜上に存在する唾液)以上の唾液が混入すると、上記薬物溶液の濃度低下を招き、免疫誘導が効率的に行われない可能性が生じる。また、投与された薬物量に応じた薬理効果が確実に得られない可能性が生じる。
すなわち、上記薬物カバー層の残存率(C)が50%よりも低いと、口腔内の唾液により薬物カバー層が崩壊されるまでの時間が、一定時間(2分)よりも短くなり、高濃度の薬物溶液を一定時間粘膜上に保持できなくなり、免疫誘導効果を充分に得られない可能性が生じる。
なお上記残存率(C)は、上記薬物カバー層を構成する組成物を用いて面積20cm2厚み50μmの試験片を作製し、該試験片の重量(mg)を測定し、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存重量(mg)を浸漬前の上記試験片の重量に対して100分率で表したものである。
ここで、ワクチン製剤として免疫誘導効果を効率的に得るためには、薬物層が崩壊して形成される薬物溶液(ワクチン抗原溶液ともいう。)が、高濃度で一定時間(2分以上)、粘膜上に暴露されることが必要である。そのため、一定時間(2分)未満に、口腔内に投与された口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の薬物層に、一定量(投与箇所となる粘膜上に存在する唾液)以上の唾液が混入すると、上記薬物溶液の濃度低下を招き、免疫誘導が効率的に行われない可能性が生じる。また、投与された薬物量に応じた薬理効果が確実に得られない可能性が生じる。
すなわち、上記薬物カバー層の残存率(C)が50%よりも低いと、口腔内の唾液により薬物カバー層が崩壊されるまでの時間が、一定時間(2分)よりも短くなり、高濃度の薬物溶液を一定時間粘膜上に保持できなくなり、免疫誘導効果を充分に得られない可能性が生じる。
なお上記残存率(C)は、上記薬物カバー層を構成する組成物を用いて面積20cm2厚み50μmの試験片を作製し、該試験片の重量(mg)を測定し、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存重量(mg)を浸漬前の上記試験片の重量に対して100分率で表したものである。
また、医療機関においては、薬剤性のアナフィラキシー反応への対応として、薬剤の投与後に医師の観察が必要とされる観察時間が設定されている。該観察時間は、ワクチンの種類やワクチン投与対象者に応じて異なる場合もあるが、通常は30分である。
本発明の口腔内付着型ワクチン製剤において、上記薬物カバー層は、面積20cm2厚み50μmの上記薬物カバー層の試験片を、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)が、90%以下であることにより、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが15μm以上である場合に、薬物カバー層を、例えば口腔内環境において30分程度で崩壊する構成とすることができる。上述の通り、ワクチンの投与後には観察時間が必要とされるため、所望の時間で崩壊する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、医療機関関係者の時間管理の負担軽減に貢献する。また、投与対象者自身の時間管理負担の軽減にも合わせて貢献することができる。上記残存率(C)は、50%以上90%以下であればよい。
なお、上記残存率(C)は、50%以上90%以下であれば、製剤投与後に必要とされる観察時間に応じて決定されることが好ましい。
本発明の口腔内付着型ワクチン製剤において、上記薬物カバー層は、面積20cm2厚み50μmの上記薬物カバー層の試験片を、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)が、90%以下であることにより、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが15μm以上である場合に、薬物カバー層を、例えば口腔内環境において30分程度で崩壊する構成とすることができる。上述の通り、ワクチンの投与後には観察時間が必要とされるため、所望の時間で崩壊する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、医療機関関係者の時間管理の負担軽減に貢献する。また、投与対象者自身の時間管理負担の軽減にも合わせて貢献することができる。上記残存率(C)は、50%以上90%以下であればよい。
なお、上記残存率(C)は、50%以上90%以下であれば、製剤投与後に必要とされる観察時間に応じて決定されることが好ましい。
なお、上記薬物カバー層の、37℃の蒸留水500mLに対する残存率と、口腔内の唾液に対する残存率とは、その成分が異なるために厳密には異なるが、唾液の99.5%は水分であるため、37℃の蒸留水に対する残存率は、例えば、ヒトの口腔内における唾液に対する残存率と同様の特性を示すものと考えられる。
また、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みは、15μm以上であればよく、20μm以上であることが好ましい。
また、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みは、30μm以下であることが好ましく、25μm以下であることが好ましい。
口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが、15μm以上である場合、面積20cm2厚み50μmの前記薬物カバー層の試験片を、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)が、50%以上90%以下の薬物カバー層は、口腔内環境でその形状が2分以上保持されるためである。
また、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みは、30μm以下であることが好ましく、25μm以下であることが好ましい。
口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが、15μm以上である場合、面積20cm2厚み50μmの前記薬物カバー層の試験片を、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)が、50%以上90%以下の薬物カバー層は、口腔内環境でその形状が2分以上保持されるためである。
薬物カバー層の残存率(C)の測定方法は以下の通りである。
(薬物カバー層の残存率(C)の測定方法)
1.溶出試験器のベッセルに蒸留水500mLを入れて、37℃に温めた。
2.時計皿(6cmφ)の重量を測定した後、
3.面積20cm2、厚み50μmの薬物カバー層を時計皿に両面テープで固定した。
4.50rpmの速度でパドルを回転させている中に、時計皿に固定した薬物カバー層を入れ、7分後に取り出した。
5.取り出し薬物カバー層を100℃で1時間乾燥させた後、重量を測定し、試験前の薬物カバー層の重量に対する割合を算出し、その値を残存率(C)とした。
(薬物カバー層の残存率(C)の測定方法)
1.溶出試験器のベッセルに蒸留水500mLを入れて、37℃に温めた。
2.時計皿(6cmφ)の重量を測定した後、
3.面積20cm2、厚み50μmの薬物カバー層を時計皿に両面テープで固定した。
4.50rpmの速度でパドルを回転させている中に、時計皿に固定した薬物カバー層を入れ、7分後に取り出した。
5.取り出し薬物カバー層を100℃で1時間乾燥させた後、重量を測定し、試験前の薬物カバー層の重量に対する割合を算出し、その値を残存率(C)とした。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、該製剤が添付される粘膜上の唾液に対し、速崩壊性を有することが好ましい。本明細書においては、37℃の蒸留水1.0mLに1回投与分の薬物層を添加し、スターラーで攪拌して30秒後の、蒸留水中に溶出した薬物の濃度が、37℃の蒸留水1mLに1回投与分の薬物を全量溶解させた場合の、蒸留水中に溶解した薬物の濃度に対して、80%以上である場合、上記薬物層が粘膜上の唾液に対し速崩壊性を有するとする。具体的な測定方法は実施例にて詳述する。
なお、本発明における薬物層は、投与の簡便性、ハンドリング性及び免疫誘導の観点から、1回投与分の質量が5~500mgであることが好ましい。
なお、本発明における薬物層は、投与の簡便性、ハンドリング性及び免疫誘導の観点から、1回投与分の質量が5~500mgであることが好ましい。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、ワクチン抗原として、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸を含む群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。口腔粘膜は、一般的には、免疫が起こりにくく、これら抗原に対して免疫寛容を引き起こすことができても、免疫を活性化することは難しいと考えられていたが、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内粘膜上に薬物溶液を一定時間高濃度で保持することが可能であるため、口腔粘膜への投与であっても、唾液により希釈化されることなく安定的に粘膜上に高濃度薬物溶液を暴露させることができ、ワクチン抗原に対して、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。中でもアナフィラキシーショックの誘発要因となり得るワクチン抗原であって、ワクチン投与後の時間管理が必要なワクチン抗原に対し好適に用いることができる。
上記ワクチン抗原は、本発明の属する技術分野においてワクチン抗原として用いられているものであれば特に限定されないが、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸からなる群より選択される少なくとも1種であることが好ましい。また、疾患の予防を目的とする場合は、製剤投与により予め患者の体内に抗体を形成させる必要があるため、上記ワクチン抗原として、感染症病原体由来抗原を利用することが好ましく、例えば、感染性病原体及び感染性病原体由来タンパク又はヒト内因性由来タンパク等が挙げられる。
上記感染症病原体由来抗原の感染症病原体から罹る疾患としては特に限定されず、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、HSV-I、HSV-II、CMV、又は、VZV)、ポックスウイルス(例えば、痘瘡若しくはワクシニア、又は、伝染性軟属腫などのオルトポックスウイルス)、ピコルナウイルス(例えば、ライノウイルス又はエンテロウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV))、コロナウイルス(例えば、SARS)、パポバウイルス(例えば、生殖器疣、尋常性胱贅、又は、足底疣費を引き起こすものなどのヒト乳頭腫(パピローマ)ウイルス)、ヘパドナウイルス(例えば、肝炎Bウイルス)、フラビウイルス(例えば、肝炎Cウイルス又はデングウイルス)、又は、レトロウイルス(例えば、HIVなどのレンチウイルス)などのウイルス感染から罹る疾患などのウイルス疾患、エシェリキア属、エンテロバクター、サルモネラ、ブドウ球菌、赤痢菌、リステリア、アエロバクター、ヘリコバクター、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、連鎖球菌、クラミジア、マイコプラズマ、肺炎球菌、ナイセリア、クロストリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、カンピロバクター、ビブリオ、セラチア、プロビデンシア、クロモバクテリウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス、又は、ボルデテラなどの細菌感染から罹る疾患などの細菌疾患、クラミジア、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス髄膜炎をはじめとするがこれに限定されるものではない真菌疾患、マラリア、ニューモシスティスカリニ肺炎、レーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、及び、トリパノソーマ感染等が挙げられる。
また、上記感染症病原体由来抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原であってもよい。
ここで、上記インフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約100nmの粒子サイズを有するRNAエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、A、B及びC型に分けられる。
上記インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸(RNA)のコアと、外部糖タンパク質とからなる。上記ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。
また、上記インフルエンザウイルスのRNAは、分節構造をとる。なお、世界中で大流行するインフルエンザは、主にはA型インフルエンザウイルスによるものであり、このA型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)の2種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってHAでは16種、NAでは9種の亜型に区別されている。
本発明においては、上記感染症病原体由来抗原としては、A型及びB型インフルエンザウイルス由来抗原が好適に用いられる。なお、上述したA型及びB型インフルエンザウイルスの亜型としては特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。上記インフルエンザワクチン抗原に使用されるインフルエンザウイルスは、A型1種類以上及びB型1種類以上の2種類以上のインフルエンザワクチン抗原を含むことが好ましい。なかでも、A型インフルエンザワクチン抗原では、H1N1型及びH3N2型が好ましく、B型インフルエンザワクチン抗原では、山形系統及びビクトリア系統が好ましい。
ここで、上記インフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約100nmの粒子サイズを有するRNAエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、A、B及びC型に分けられる。
上記インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸(RNA)のコアと、外部糖タンパク質とからなる。上記ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。
また、上記インフルエンザウイルスのRNAは、分節構造をとる。なお、世界中で大流行するインフルエンザは、主にはA型インフルエンザウイルスによるものであり、このA型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)の2種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってHAでは16種、NAでは9種の亜型に区別されている。
本発明においては、上記感染症病原体由来抗原としては、A型及びB型インフルエンザウイルス由来抗原が好適に用いられる。なお、上述したA型及びB型インフルエンザウイルスの亜型としては特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。上記インフルエンザワクチン抗原に使用されるインフルエンザウイルスは、A型1種類以上及びB型1種類以上の2種類以上のインフルエンザワクチン抗原を含むことが好ましい。なかでも、A型インフルエンザワクチン抗原では、H1N1型及びH3N2型が好ましく、B型インフルエンザワクチン抗原では、山形系統及びビクトリア系統が好ましい。
本発明において、インフルエンザウイルス由来抗原としては、上記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、例えば、生ウイルスや、精製ウイルス粒子が有機溶媒/界面活性剤若しくは他の試薬で不活化されたウイルス全粒子、又は、該ウイルス全粒子の中から不純物を取り除き、HA及び/若しくはNAを精製して作られたウイルスサブユニット等が挙げられる。免疫原性の観点から、HAサブユニット又はウイルス全粒子が好ましい。上記ウイルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。また、不純物が少なく、免疫誘導促進剤などのアジュバントが必須となるHAサブユニット(スプリット)について特に有効である。
上記インフルエンザウイルス由来抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物又はインフルエンザの患者から単離されたインフルエンザウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製する方法が挙げられる。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。
上記インフルエンザウイルス由来抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物又はインフルエンザの患者から単離されたインフルエンザウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製する方法が挙げられる。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤において、上記薬物層には、上記ワクチン抗原が有効量含有されていれば良いが、例えば、ワクチン抗原の合計量として、上記薬物層中、0.001μg~1.0mgの範囲で含有されていることが好ましい。0.001μg未満であると、感染症の予防又は治療剤としての機能が不充分となることがあり、1.0mgを超えると、安全性に関して問題となることがある。上記抗原含有量のより好ましい下限は0.01μg、さらに好ましい下限は0.1μg、より好ましい上限は500μg、さらに好ましい上限は100μgである。
なお、上記ワクチン抗原がインフルエンザウイルス由来抗原を除く抗原である場合、種類によっては、インフルエンザウイルス由来抗原と比較して口腔内投与で免疫を誘導することが比較的困難であり、ワクチン抗原の量の検討を要する。
なお、本明細書にいう「ワクチン抗原の質量」は、特記する場合を除き、上記薬物層に含まれる全ワクチン抗原タンパク質の合計質量のことである。したがって、抗原が、ウイルス等生体由来物質である場合は、その抗原に含まれる全タンパク質の質量を意味する。また、複数種類の抗原を含む場合は、その合計量を意味する。
なお、上記ワクチン抗原がインフルエンザウイルス由来抗原を除く抗原である場合、種類によっては、インフルエンザウイルス由来抗原と比較して口腔内投与で免疫を誘導することが比較的困難であり、ワクチン抗原の量の検討を要する。
なお、本明細書にいう「ワクチン抗原の質量」は、特記する場合を除き、上記薬物層に含まれる全ワクチン抗原タンパク質の合計質量のことである。したがって、抗原が、ウイルス等生体由来物質である場合は、その抗原に含まれる全タンパク質の質量を意味する。また、複数種類の抗原を含む場合は、その合計量を意味する。
なお、上記全身性免疫応答及び粘膜性免疫応答の誘導効果は、免疫評価用モデル動物を用いた免疫誘導実験およびELISA法(抗原特異的IgG及びIgA抗体)により測定することができる。
上記免疫誘導効果を測定するためのサンプルは、免疫評価用モデル動物の血液及び鼻腔洗浄液等である。
上記免疫誘導効果を測定するためのサンプルは、免疫評価用モデル動物の血液及び鼻腔洗浄液等である。
また、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、37℃の蒸留水1.0mLに1回投与分溶解させたときの溶液粘度(D)が20mPa・s以下であることが好ましい。本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤が口腔内に適用された際に、粘膜上の唾液により薬物層が溶解され薬物溶液となるが、溶液粘度が20mPa・s以下と低いことで、薬物溶液中のワクチン抗原の拡散性が向上し、より効果的に免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。上記薬物溶液が低粘性溶液として口腔内粘膜に保持されることで、ワクチン抗原の粘膜への暴露が促進されると考えられる。
なお、本発明における薬物層は、投与の簡便性、ハンドリング性及び免疫誘導の観点から、1回投与分の質量が5~500mgであることが好ましい。
なお、本発明における薬物層は、投与の簡便性、ハンドリング性及び免疫誘導の観点から、1回投与分の質量が5~500mgであることが好ましい。
なお、ヒトの唾液は、1分間に0.8~1.2 mL程度分泌することから、本発明においては、精製水1.0mLに溶解させて得られる溶液を、口腔内の粘度測定モデルとした。
37℃の蒸留水に対する溶液粘度と、口腔内の唾液に対する溶液粘度とは、その成分が異なるために厳密には異なるが、唾液の99.5%は水分であるため、37℃の蒸留水に対する溶液粘度は、例えば、ヒトの口腔内における唾液に対する溶液粘度と同様の特性を示すものと考えられる。
なお、溶液粘度は一般的に用いられる方法及び装置により測定することができる。具体的には、例えば、粘度測定装置(RheoStress 600、THeromo HAAKE社製)を用いて37℃における溶液粘度を測定することができる。
37℃の蒸留水に対する溶液粘度と、口腔内の唾液に対する溶液粘度とは、その成分が異なるために厳密には異なるが、唾液の99.5%は水分であるため、37℃の蒸留水に対する溶液粘度は、例えば、ヒトの口腔内における唾液に対する溶液粘度と同様の特性を示すものと考えられる。
なお、溶液粘度は一般的に用いられる方法及び装置により測定することができる。具体的には、例えば、粘度測定装置(RheoStress 600、THeromo HAAKE社製)を用いて37℃における溶液粘度を測定することができる。
上記薬物層は、高分子成分を含むことが好ましく、上記高分子成分は、水溶性の可食性高分子であることが好ましい。薬物層を水溶性とすることで、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を口腔内に配置した際に、粘膜上の唾液により薬物層が溶解し、高濃度の薬物溶液を粘膜上に付着させることができるためである。
上記水溶性の可食性高分子としては、特に限定されないが、具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(以下“HPMC”と記す)、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム等の合成高分子、アルギン酸ソーダ、デキストラン、カゼイン、ゼラチン、プルラン、ペクチン、グァーガム、キサンタンガム、トラガンカントガム、アカシアガム、アラビアガム及び澱粉等の天然高分子類や多糖類とそれらの誘導体等が挙げられる。
上記水溶性の可食性高分子としては、特に限定されないが、具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(以下“HPMC”と記す)、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム等の合成高分子、アルギン酸ソーダ、デキストラン、カゼイン、ゼラチン、プルラン、ペクチン、グァーガム、キサンタンガム、トラガンカントガム、アカシアガム、アラビアガム及び澱粉等の天然高分子類や多糖類とそれらの誘導体等が挙げられる。
また、上記薬物層は、高分子成分として、デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも1種を含むことがより好ましい。このような成分を含むことで、37℃の蒸留水に対する薬物層の崩壊性を向上させることができるためである。なお、上記特定の高分子成分の含有量としては、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層が所望の崩壊性となるように適宜配合すればよく、当業者知識の範囲内である。
さらに、上記特定の高分子成分を含むことにより、唾液(37℃の蒸留水)に薬物層が溶解した場合の溶液粘度が低くなり、口腔内粘膜経路でのワクチン製剤の投与に好適である。
さらに、上記特定の高分子成分を含むことにより、唾液(37℃の蒸留水)に薬物層が溶解した場合の溶液粘度が低くなり、口腔内粘膜経路でのワクチン製剤の投与に好適である。
上記デキストランは、一般的にLeuconostoc mesenteroides Van Tieghem(Lactobacillaceae)によるショ糖の発酵によって生産された多糖類を部分分解したものであり、主にD-グルコースより構成される。上記デキストランは、質量平均分子量が1万以上、より具体的には1万~10万であれば特に問題なく使用できるが、本発明が製剤である観点から、医薬品添加物規格に収載されているデキストラン40(平均分子量4万)もしくはデキストラン70(質量平均分子量7万)が好適に用いられる。
また、上記薬物層として凍結乾燥製剤を用いる場合、上記デキストランの含有量は、その凍結乾燥製剤の製造過程で、乾燥を行なう直前のワクチン含有製剤溶液の全質量に基づいて、合計量として、好ましくは1.0~35.0質量部であり、より好ましくは2.5~22.5質量部である。1.0質量部未満であると、乾燥後に医薬品として充分な剤形が形成されない可能性があり、一方、35.0質量部を超えると、製造溶液中に均一に分散もしくは溶解せず、製造上問題となる恐れがある。
上記ペクチンは、一般的に柑橘類又はリンゴから水で抽出して得られた高分子多糖類であり、ガラクツロン酸及びそのメチルエステルより構成される。
上記ペクチンの質量平均分子量は3万~10万程度である。当該メチルエステル化の割合によりLMペクチン及びHMペクチンに分けられる。全ガラクツロン酸のうち、メチル化ガラクツロン酸の占める割合が50%より多いものをHMペクチン、50%以下のものをLMペクチンという。本発明においてはどちらのペクチンを用いても良いが、LMペクチンはカルシウムイオンの存在下で熱不可逆性のゲルを形成するため、カルシウムイオンを含む有機酸塩との併用は検討を要する。
上記ペクチンの質量平均分子量は3万~10万程度である。当該メチルエステル化の割合によりLMペクチン及びHMペクチンに分けられる。全ガラクツロン酸のうち、メチル化ガラクツロン酸の占める割合が50%より多いものをHMペクチン、50%以下のものをLMペクチンという。本発明においてはどちらのペクチンを用いても良いが、LMペクチンはカルシウムイオンの存在下で熱不可逆性のゲルを形成するため、カルシウムイオンを含む有機酸塩との併用は検討を要する。
また、上記薬物層として凍結乾燥製剤を用いる場合、上記LMペクチンの含有量は、その凍結乾燥製剤の製造過程で、乾燥を行なう直前のワクチン含有製剤溶液の全質量に基づいて、合計量として、好ましくは0.5~15.0質量部、より好ましくは1.0~10.0質量部である。0.5質量部未満であると、乾燥後に医薬品として充分な剤形が形成されない可能性があり、一方、15.0質量部を超えると、免疫が充分に誘導されない恐れがある。
また、上記薬物層として凍結乾燥製剤を用いる場合、上記HMペクチンの含有量は、その凍結乾燥製剤の製造過程で、乾燥を行なう直前のワクチン含有製剤溶液の全質量に基づいて、合計量として、好ましくは0.25~7.50質量部である。0.25質量部未満であると、乾燥後に医薬品として充分な剤形が形成されない可能性があり、一方、7.50質量部を超えると、免疫が充分に誘導されない恐れがある。
また、上記薬物層として凍結乾燥製剤を用いる場合、上記アルギン酸ナトリウムの含有量は、その凍結乾燥製剤の製造過程で、乾燥を行なう直前のワクチン含有製剤溶液の全質量に基づいて、合計量として、好ましくは0.1~15.0質量部、より好ましくは0.2~10.0質量部である。0.1質量部未満であると、乾燥後に医薬品として充分な剤形が形成されない可能性があり、一方、15.0質量部を超えると、免疫が充分に誘導されない恐れがある。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の薬物層における高分子成分は、デキストランを含むことが好ましい。粘膜上に付着する少量の唾液(例えば、1mL)に対しての崩壊性が高く、薬物層が溶解して形成される薬物溶液の溶液粘度が低い為である。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、上記特定の高分子成分(デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも1種である)に加えて、本発明の効果を阻害しない範囲であれば、水及び/又は有機溶媒に可溶である可食性高分子を適量組み合わせて用いることもできる。
上記その他の可食性高分子の配合量は、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層の全質量基準で、好ましくは0.1~10.0質量部である。
上記その他の可食性高分子の配合量は、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層の全質量基準で、好ましくは0.1~10.0質量部である。
上記薬物層は、ワクチン抗原に加え、少なくとも1種の免疫誘導促進剤(アジュバント)を含むことが好ましい。上記免疫誘導促進剤は、抗原と共に投与され、免疫全体を活性化することによりワクチンの効果を高める作用があるが、本発明においては免疫活性化作用があるものであれば特に限定はされない。一例として、TOLL様受容体(TLR)アゴニスト(例えば、TLR2/6アゴニスト、TLR4アゴニスト)、及び、環状ジヌクレオチド又はこれらの塩若しくは誘導体からなる群より選択される少なくとも1種類を含有する。
上記TLR2/6アゴニストとしては、マイコプラズマ細胞膜からの抽出物又はその改変体であってもよく、合成品であってもよい。
上記マイコプラズマとしては、例えば、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Ureaplasma、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma gallisepticum、Mycoplasma hyopneumoniae、Mycoplasma laboratorium、Mycoplasma mycoides、Mycoplasma ovipneumoniae等が挙げられる。
上記マイコプラズマとしては、例えば、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Ureaplasma、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma gallisepticum、Mycoplasma hyopneumoniae、Mycoplasma laboratorium、Mycoplasma mycoides、Mycoplasma ovipneumoniae等が挙げられる。
また、上記TLR4アゴニストとしては、リポポリサッカライド又はその塩が好適に挙げられる。なお、本明細書にいうリポポリサッカライドは、リポポリサッカライドそれ自体のほか、その性質を有する限りその誘導体若しくは改変体を含む概念である。本明細書にいう塩とは、任意の有機酸又は無機酸の塩であってよいが、好ましくは薬学的に許容される塩である。
また、上記リポポリサッカライドは、グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又はその改変体であってもよく、合成品であってもよい。
上記グラム陰性菌としては、例えば、Acetobacter属、Achromobacter属、Acidicaldus属、Acidiphilium属、Acidisphaera属、Acidocella属、Acidomonas属、Agrobacterium属、Asaia属、Bacillus属、Belnapia属、Brucella属、Bacteroides属、Bordetella属、Clostridium属、Craurococcus属、Chlamydia属、Enterobacter属、Escherichia属、Flavobacterium属、Francisella属、Gluconacetobacter属、Gluconobacter属、Haemophilus属、Kozakia属、Klebsiella属、Leahibacter属、Leclercia属、Legionella属、Methanoculleus属、Methanosarcina属、Micrococcus属、Muricoccus属、Neisseria属、Neoasaia属、Oleomonas属、Pantoea属、Plesiomonas属、Paracraurococcus属、Pseudomonas属、Prophyromonas属、Proteus属、Rahnella属、Rhodopila属、Roseococcus属、Rubritepida属、Salmonella属、Shigella属、Stenortophomonas属、Saccharibacter属、Serratia属、Stella属、Swaminathania属、Vibrio属、Vparahaemolyticus属、Teichococcus属、Xanthomonas属、Yersinia属、Zymomonas属、Zavarzinia属等が挙げられる。上記グラム陰性菌としては、好ましくはEscherichia属、Shigella属、Salmonella属、Klebsiella属、Proteus属、Yersinia属、Vibrio属、Vparahaemolyticus属、Haemophilus属、Pseudomonas属、Legionella属、Bordetella属、Brucella属、Francisella属、Bacteroides属、Neisseria属、Chlamydia属、Plesiomonas属、Prophyromonas属、Pantoea属、Agrobacterium属、Stenortophomonas属、Enterobacter属、Acetobacter属、Xanthomonas属、Zymomonas属等が挙げられる。
なかでも、Escherichia属由来、Salmonella属由来、Pantoea属由来、Acetobacter属由来、Zymomonas属由来、Xanthomonas属由来又はEnterobacter属由来のものであることが好ましい。これらは、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、特にPantoea属由来は、現在健康食品として用いられており、より有効であるといえる。これらの菌由来の抽出物又はその改変体をそのまま用いることも可能である。
また、上記リポポリサッカライドは、グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又はその改変体であってもよく、合成品であってもよい。
上記グラム陰性菌としては、例えば、Acetobacter属、Achromobacter属、Acidicaldus属、Acidiphilium属、Acidisphaera属、Acidocella属、Acidomonas属、Agrobacterium属、Asaia属、Bacillus属、Belnapia属、Brucella属、Bacteroides属、Bordetella属、Clostridium属、Craurococcus属、Chlamydia属、Enterobacter属、Escherichia属、Flavobacterium属、Francisella属、Gluconacetobacter属、Gluconobacter属、Haemophilus属、Kozakia属、Klebsiella属、Leahibacter属、Leclercia属、Legionella属、Methanoculleus属、Methanosarcina属、Micrococcus属、Muricoccus属、Neisseria属、Neoasaia属、Oleomonas属、Pantoea属、Plesiomonas属、Paracraurococcus属、Pseudomonas属、Prophyromonas属、Proteus属、Rahnella属、Rhodopila属、Roseococcus属、Rubritepida属、Salmonella属、Shigella属、Stenortophomonas属、Saccharibacter属、Serratia属、Stella属、Swaminathania属、Vibrio属、Vparahaemolyticus属、Teichococcus属、Xanthomonas属、Yersinia属、Zymomonas属、Zavarzinia属等が挙げられる。上記グラム陰性菌としては、好ましくはEscherichia属、Shigella属、Salmonella属、Klebsiella属、Proteus属、Yersinia属、Vibrio属、Vparahaemolyticus属、Haemophilus属、Pseudomonas属、Legionella属、Bordetella属、Brucella属、Francisella属、Bacteroides属、Neisseria属、Chlamydia属、Plesiomonas属、Prophyromonas属、Pantoea属、Agrobacterium属、Stenortophomonas属、Enterobacter属、Acetobacter属、Xanthomonas属、Zymomonas属等が挙げられる。
なかでも、Escherichia属由来、Salmonella属由来、Pantoea属由来、Acetobacter属由来、Zymomonas属由来、Xanthomonas属由来又はEnterobacter属由来のものであることが好ましい。これらは、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、特にPantoea属由来は、現在健康食品として用いられており、より有効であるといえる。これらの菌由来の抽出物又はその改変体をそのまま用いることも可能である。
上記リポポリサッカライドとして、上記グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又は精製したリポポリサッカライドを用いる場合には、一般的には生体への安全性を加味する必要があり、これらを解毒化した改変体として用いることもできる。一方、Acetobacter属(Acetobacter aceti、Acetobacter xylinum、Acetobacter orientalis等)、Zymomonas属(Zymomonas mobilis等)、Xanthomonas属(Xanthomonas campestris等)、Enterobacter属(Enterobacter cloacae等)、Pantoea属(Pantoea agglomerans等)は、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、これらの菌由来の抽出物又は精製したリポポリサッカライドをそのまま用いることも可能である。
上記リポポリサッカライドの誘導体としては、例えば、その多糖部分を除去した誘導体、具体的には、リピドA、モノホスホリルリピッドA、3-脱-アシル化モノホスホリルリピッドA(3D-MPL)、グルコピラノシルリピッド(Glucopyranosyl lipid、GLA)、アルキルグルコサミニドフォスフェート(AGP)等が挙げられる。
上記リポポリサッカライドの多糖部分を除去したリピドAとしては、上記グラム陰性菌由来の単離物、あるいはこれらグラム陰性菌由来の単離物と同じ構造になるように合成した物を用いてもよい。
また、上記リピドAの改変体としては、脱リン酸化を行ったモノホスホリルリピッド又はその塩も好適に用いられる。なお、本明細書にいうモノホスホリルリピッドの誘導体は、モノホスホリルリピッドの性質を有する限り本発明に用いられることができる。特に既に医療用途で免疫誘導促進剤として実績がある3-脱-アシル化モノホスホリルリピッドA(3D-MPL)、又は、米国特許出願公開第2010/0310602号明細書で提案されている脱アシル化されていない、グルコピラノシルリピッド(Glucopyranosyl lipid)が生体への安全性の観点から好ましい。
また、上記モノホスホリルリピッドとしては、安全性及び使用前例のあるサルモネラ菌由来のものも好適に用いられる。
上記アルキルグルコサミニドフォスフェート(AGP)としては、国際公開第98/50399号若しくは米国特許第6303347号明細書(AGPを調製するための方法もまた開示される)に開示されるもの、及び、AGPの塩は、米国特許第6764840号明細書に開示されるような製薬上許容され得るものも好適に用いられる。
上記環状ジヌクレオチドとしては、環状ジプリンヌクレオチドが好ましく、その特性を有する限りその塩若しくは誘導体であってよい。環状ジプリンヌクレオチドとしては、例えば、安全性の面から、環状ジグアノシンモノフォスフェートであるc-di-GMP、環状ジアデノシンモノフォスフェートであるc-di-AMPが好ましく用いられる。
上記リポポリサッカライドの多糖部分を除去したリピドAとしては、上記グラム陰性菌由来の単離物、あるいはこれらグラム陰性菌由来の単離物と同じ構造になるように合成した物を用いてもよい。
また、上記リピドAの改変体としては、脱リン酸化を行ったモノホスホリルリピッド又はその塩も好適に用いられる。なお、本明細書にいうモノホスホリルリピッドの誘導体は、モノホスホリルリピッドの性質を有する限り本発明に用いられることができる。特に既に医療用途で免疫誘導促進剤として実績がある3-脱-アシル化モノホスホリルリピッドA(3D-MPL)、又は、米国特許出願公開第2010/0310602号明細書で提案されている脱アシル化されていない、グルコピラノシルリピッド(Glucopyranosyl lipid)が生体への安全性の観点から好ましい。
また、上記モノホスホリルリピッドとしては、安全性及び使用前例のあるサルモネラ菌由来のものも好適に用いられる。
上記アルキルグルコサミニドフォスフェート(AGP)としては、国際公開第98/50399号若しくは米国特許第6303347号明細書(AGPを調製するための方法もまた開示される)に開示されるもの、及び、AGPの塩は、米国特許第6764840号明細書に開示されるような製薬上許容され得るものも好適に用いられる。
上記環状ジヌクレオチドとしては、環状ジプリンヌクレオチドが好ましく、その特性を有する限りその塩若しくは誘導体であってよい。環状ジプリンヌクレオチドとしては、例えば、安全性の面から、環状ジグアノシンモノフォスフェートであるc-di-GMP、環状ジアデノシンモノフォスフェートであるc-di-AMPが好ましく用いられる。
上記薬物層における免疫誘導促進剤の量としては、例えば、1個体に1回投与のために、上記薬物層全量に対して、0.01μg~100mgの範囲で含有されていることが好ましい。0.01μg未満であると、充分な感染症の予防又は治療剤としての機能が得られないことがあり、100mgを超えると、安全性に関して問題となることがある。上記免疫誘導促進剤含有量のより好ましい下限は0.03μg、より好ましい上限は50mgである。
上記薬物カバー層は、薬物層の側部及び上部を被覆し、薬物層に積層されていることが好ましい。さらに、上記薬物カバー層は、薬物層の外周部より外側に外周縁を有することが好ましい。このような構成とすることで、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤が口腔内に適用された際に、口腔内粘膜への密着性が高まり、より確実に口腔内に保持されるためである。また、このような構成とすることで、必要量以上の口腔内の唾液が薬物層に接触することをより確実に防ぎ、上記薬物層が溶解した際の薬物溶液の濃度を高濃度に維持できるためである。
なお、上記薬物カバー層の上記外周縁の幅は、1mm以上であることが好ましく、2mm以上であることがより好ましい。また、薬物カバー層の上記外周縁の幅は、5mm以下であることが好ましく4mm以下であることがより好ましい。
なお、上記薬物カバー層の上記外周縁の幅は、1mm以上であることが好ましく、2mm以上であることがより好ましい。また、薬物カバー層の上記外周縁の幅は、5mm以下であることが好ましく4mm以下であることがより好ましい。
なお、上記薬物カバー層は、薬物層に含まれるワクチン抗原を含まないものである。そのため、本願発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、速溶性薬物層と持続性薬物層とを含むような薬物層が二層以上の構成を有する粘膜貼付製剤とは異なるものである。
上記薬物カバー層は、水溶性高分子としてヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート(HPMCP)、カルボキシメチルエチルセルロース(CMEC)及びエチルセルロース(EC)からなる群より選択される少なくとも1種を含むことが好ましい。
このような水溶性高分子を含む薬物カバー層は、37℃の蒸留水に対する溶解度を調整しやすく、面積20cm2厚み50μmの前記薬物カバー層の試験片を37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)を、50%以上90%以下に調整しやすい為である。
特に、上記薬物カバー層は、HPMCP及びHPMCの組合せ、HPMC及びCMECの組合せ、EC及びHPMCの組合せ、又は、CMECを単独で含むことがより好ましく、なかでも、HPMCP及びHPMCの組合せ、又は、HPMC及びCMECの組み合わせ含むことが更に好ましい。
このような水溶性高分子を含む薬物カバー層は、37℃の蒸留水に対する溶解度を調整しやすく、面積20cm2厚み50μmの前記薬物カバー層の試験片を37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)を、50%以上90%以下に調整しやすい為である。
特に、上記薬物カバー層は、HPMCP及びHPMCの組合せ、HPMC及びCMECの組合せ、EC及びHPMCの組合せ、又は、CMECを単独で含むことがより好ましく、なかでも、HPMCP及びHPMCの組合せ、又は、HPMC及びCMECの組み合わせ含むことが更に好ましい。
上記カバー層におけるヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート(HPMCP)及びヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)の配合量は、60:40~87:13であることが好ましい。
また、上記薬物カバー層におけるヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)及びカルボキシメチルエチルセルロース(CMEC)の配合量は、50:50~0:100であることが好ましい。
また、上記薬物カバー層におけるエチルセルロース(EC)及びHPMCの配合量は、40:60~50:50であることが好ましい。
また、上記薬物カバー層におけるヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)及びカルボキシメチルエチルセルロース(CMEC)の配合量は、50:50~0:100であることが好ましい。
また、上記薬物カバー層におけるエチルセルロース(EC)及びHPMCの配合量は、40:60~50:50であることが好ましい。
上記薬物カバー層は、粘膜付着層を介して薬物層と積層されていることが好ましい。
図1は、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の一形態を示す断面図であり、薬物層1、粘膜付着層2及び薬物カバー層3を有する。
上記粘膜付着層は、水溶性高分子であることが好ましい。本発明のワクチン製剤投与後の観察時間内に、ワクチン製剤が完全崩壊できるためである。
上記粘膜付着層に用いられる水溶性高分子としてヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒプロメロース(HPMC)、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、カルメロース、カルメロースナトリウム等のセルロース類、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコール等のポリマー、アルギン酸ナトリウム、プルラン、グアーガム、グルコノ-δ-ラクトン、ペクチン、デキストリン、タマリンドガム及びキサンタンガム等の多糖類、アラビアゴム末、及び、トラガント末からなる群より選択される少なくとも1種を含むことが好ましい。粘膜に対する付着性及び水溶性を有するためである。
なお、上記粘膜付着層は、上記薬物カバー層と同様に、薬物層の外周部より外側に外周縁を有することが好ましい。このような構成とすることで、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤が口腔内に適用された際に、口腔内粘膜への密着性がより高まり、口腔内の保持をより確実にすることができる。上記粘膜付着層の上記外周縁の幅は、1mm以上であることが好ましく、2mm以上であることがより好ましい。また、上記粘膜付着層の上記外周縁の幅は、5mm以下であることが好ましく、4mm以下であることがより好ましい。
図1は、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の一形態を示す断面図であり、薬物層1、粘膜付着層2及び薬物カバー層3を有する。
上記粘膜付着層は、水溶性高分子であることが好ましい。本発明のワクチン製剤投与後の観察時間内に、ワクチン製剤が完全崩壊できるためである。
上記粘膜付着層に用いられる水溶性高分子としてヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒプロメロース(HPMC)、ヒドロキシエチルセルロース(HEC)、カルメロース、カルメロースナトリウム等のセルロース類、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコール等のポリマー、アルギン酸ナトリウム、プルラン、グアーガム、グルコノ-δ-ラクトン、ペクチン、デキストリン、タマリンドガム及びキサンタンガム等の多糖類、アラビアゴム末、及び、トラガント末からなる群より選択される少なくとも1種を含むことが好ましい。粘膜に対する付着性及び水溶性を有するためである。
なお、上記粘膜付着層は、上記薬物カバー層と同様に、薬物層の外周部より外側に外周縁を有することが好ましい。このような構成とすることで、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤が口腔内に適用された際に、口腔内粘膜への密着性がより高まり、口腔内の保持をより確実にすることができる。上記粘膜付着層の上記外周縁の幅は、1mm以上であることが好ましく、2mm以上であることがより好ましい。また、上記粘膜付着層の上記外周縁の幅は、5mm以下であることが好ましく、4mm以下であることがより好ましい。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤における薬物層は、乾燥製剤の形態であることが好ましい。
なお、本明細書において、乾燥製剤とは、含水率が15質量部以下であることを意味する。上記乾燥製剤のうち、含水率が10質量部以下であるものを、特に、低含水率乾燥製剤という。
なお、ここにいう「含水率」は、第十六改正日本薬局方、一般試験法、乾燥減量試験法(以下、単に乾燥減量法ともいう)に従い求める。すなわち、乾燥製剤の形態である本発明における薬物層の試験片を105℃、3時間の条件で加熱したときの質量の減少割合により上記含水率を求める。
なお、本明細書において、乾燥製剤とは、含水率が15質量部以下であることを意味する。上記乾燥製剤のうち、含水率が10質量部以下であるものを、特に、低含水率乾燥製剤という。
なお、ここにいう「含水率」は、第十六改正日本薬局方、一般試験法、乾燥減量試験法(以下、単に乾燥減量法ともいう)に従い求める。すなわち、乾燥製剤の形態である本発明における薬物層の試験片を105℃、3時間の条件で加熱したときの質量の減少割合により上記含水率を求める。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤において、使用する容器は特に限定されないが、密封可能なものが好ましく、例えば、アルミ包材、ブリスター容器や凍結乾燥用バイアルなどが挙げられる。
なお、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、ヒト又は動物(哺乳類、鳥類等)の口腔内粘膜へ投与されるものであり、舌上、舌下、頬側粘膜、咽頭粘膜及び歯肉粘膜への投与が挙げられる。本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤に含まれる薬物の種類により、投与部位を選択することができる。例えば、強い免疫誘導を目的とする場合は、舌下投与とすることが好ましい。
なお、口腔粘膜は、一般的には、免疫が起こりにくく、これら免疫寛容を引き起こすことができても、免疫を活性化することは難しいと考えられていたが、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内粘膜上に少なくとも一種類の抗原を含む薬物溶液を高濃度で保持することが可能であるため、口腔粘膜への投与であっても、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。
なお、口腔粘膜は、一般的には、免疫が起こりにくく、これら免疫寛容を引き起こすことができても、免疫を活性化することは難しいと考えられていたが、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内粘膜上に少なくとも一種類の抗原を含む薬物溶液を高濃度で保持することが可能であるため、口腔粘膜への投与であっても、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。
なお、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、口腔内粘膜の投与部位に応じて適切な形状とすることができるが、例えば、図2に記載のように、直径φ又は一辺xが10~15mmの略円形又は略正方形とすることができる。
本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、優れたコンプライアンス、例えば、非侵襲的投与、無痛、注射の恐怖からの解放、投与が簡便なため患者が自ら投与可能であり、医療従事者の針刺し感染事故のリスクも回避でき、繰返し投与を行う場合の通院頻度の低減が可能となり患者の生活の質の向上に貢献でき、注射針のような特殊廃棄の必要な医療廃棄物が生じないという利点を有する。
また、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、粘膜上の唾液により薬物層が溶解し、高濃度の薬物溶液が一定時間口腔内に保持されるため、口腔内粘膜経路で効果的にワクチン抗原を投与することができ、ワクチン抗原量に対する薬理効果が予測されやすく、目的に応じてワクチン抗原の種類や量を適宜調節することができる。
さらに、薬物層にワクチン抗原を含む口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、注射投与と比較して強い免疫を誘導可能であるという利点も有する。
さらに、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、所定時間内で完全溶解するように制御可能であるため、投与後の時間管理が容易であり、特にアナフィラキシーショックの誘発要因となり得る薬剤の投与に対して好適に用いることができる。
また、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、粘膜上の唾液により薬物層が溶解し、高濃度の薬物溶液が一定時間口腔内に保持されるため、口腔内粘膜経路で効果的にワクチン抗原を投与することができ、ワクチン抗原量に対する薬理効果が予測されやすく、目的に応じてワクチン抗原の種類や量を適宜調節することができる。
さらに、薬物層にワクチン抗原を含む口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、注射投与と比較して強い免疫を誘導可能であるという利点も有する。
さらに、本発明の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、所定時間内で完全溶解するように制御可能であるため、投与後の時間管理が容易であり、特にアナフィラキシーショックの誘発要因となり得る薬剤の投与に対して好適に用いることができる。
以下の実施例及び実験例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
(実験例1~4、比較実験例1~3)
下記表1の組成を有する薬物層を調製した。具体的には、下記表1に示した配合量の高分子成分及び蒸留水を容器に加え、適宜攪拌して溶解させた。次に、得られた溶液に、ワクチン抗原として1.0mg/mL_OVA溶液(OVA:卵白アルブミン蛋白、シグマアルドリッチ製)を50重量部加え、攪拌して充分に混合した。さらに、得られた溶液に1.0mg/mLアジュバント溶液(ND002、Pantoea agglomerans由来リポポリサッカライド、日東電工社製)を5重量部加え、充分に混合し、ワクチン含有製剤溶液を得た。
得られたワクチン含有製剤溶液をアルミ包材に1.0gずつ分注し、凍結乾燥させ、薬物層を得た。なお、得られた薬物層の含水率は5質量部以下であった。
下記表1の組成を有する薬物層を調製した。具体的には、下記表1に示した配合量の高分子成分及び蒸留水を容器に加え、適宜攪拌して溶解させた。次に、得られた溶液に、ワクチン抗原として1.0mg/mL_OVA溶液(OVA:卵白アルブミン蛋白、シグマアルドリッチ製)を50重量部加え、攪拌して充分に混合した。さらに、得られた溶液に1.0mg/mLアジュバント溶液(ND002、Pantoea agglomerans由来リポポリサッカライド、日東電工社製)を5重量部加え、充分に混合し、ワクチン含有製剤溶液を得た。
得られたワクチン含有製剤溶液をアルミ包材に1.0gずつ分注し、凍結乾燥させ、薬物層を得た。なお、得られた薬物層の含水率は5質量部以下であった。
表1に記載の高分子は下記の通りである。
ヒドロキシプロピルセルロース/HPC-L:日本曹達社製
ヒドロキシプロピルメチルセルロース/HPMC(5R):信越化学工業社製
デキストラン/(質量平均分子量70000):名糖産業社製
LMペクチン/(LM-102AS-J):CP Kelco社製
アルギン酸ナトリウム/(IL-2):キミカ社製
ヒドロキシプロピルセルロース/HPC-L:日本曹達社製
ヒドロキシプロピルメチルセルロース/HPMC(5R):信越化学工業社製
デキストラン/(質量平均分子量70000):名糖産業社製
LMペクチン/(LM-102AS-J):CP Kelco社製
アルギン酸ナトリウム/(IL-2):キミカ社製
(薬物層の崩壊性の測定)
バイアルに蒸留水1mLを入れて、37℃の恒温器の中で温める。本バイアル中の蒸留水をスターラーで攪拌(300rpm)しているところに、得られた薬物層を入れ、30秒後に、フィルター(0.22μm)をかけて、未溶解成分を除去し、溶液を回収した。
溶液中の薬物濃度(mg/mL)をHPLCで定量した。
上記薬物濃度が、薬物層に含まれる薬物量が蒸留水1mLに全て溶解した時の濃度に対して80%以上の場合、薬物層が速崩壊性を有すると判断した。
評価結果を下記表1に示す。
バイアルに蒸留水1mLを入れて、37℃の恒温器の中で温める。本バイアル中の蒸留水をスターラーで攪拌(300rpm)しているところに、得られた薬物層を入れ、30秒後に、フィルター(0.22μm)をかけて、未溶解成分を除去し、溶液を回収した。
溶液中の薬物濃度(mg/mL)をHPLCで定量した。
上記薬物濃度が、薬物層に含まれる薬物量が蒸留水1mLに全て溶解した時の濃度に対して80%以上の場合、薬物層が速崩壊性を有すると判断した。
評価結果を下記表1に示す。
(実験例5~11、比較実験例4~13)
下記表2の組成を有する薬物カバー層を調製した。具体的には、下記表2に示した配合量のポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)、蒸留水、エタノールをガラス瓶に添加し、充分に混合した。次に、得られた溶液に、下記表2に示した配合量の基剤を添加し、充分に混合し、薬物カバー層用組成物を得た。得られた薬物カバー層用組成物を厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)の片面に、乾燥後の厚さが50μmとなるように塗布し、30分間乾燥して薬物カバー層を作製した。
下記表2の組成を有する薬物カバー層を調製した。具体的には、下記表2に示した配合量のポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)、蒸留水、エタノールをガラス瓶に添加し、充分に混合した。次に、得られた溶液に、下記表2に示した配合量の基剤を添加し、充分に混合し、薬物カバー層用組成物を得た。得られた薬物カバー層用組成物を厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)の片面に、乾燥後の厚さが50μmとなるように塗布し、30分間乾燥して薬物カバー層を作製した。
(用いた基剤)
ヒドロキシプロピルメチルセルロース/HPMC(5R)、(5E):信越化学工業社製
カルボキシメチルエチルセルロース/CMEC:フロイント産業社製
エチルセルロースEC(7P)、(10P):日新化成社製
ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート/HPMCP(HP-55):信越化学工業社製
ヒドロキシプロピルメチルセルロース/HPMC(5R)、(5E):信越化学工業社製
カルボキシメチルエチルセルロース/CMEC:フロイント産業社製
エチルセルロースEC(7P)、(10P):日新化成社製
ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート/HPMCP(HP-55):信越化学工業社製
(薬物カバー層の崩壊性の測定)
溶出試験器(アジレント・テクノロジー社製)のベッセルに蒸留水500mLを入れて、37℃に温めた。次に、時計皿(6cmφ)の重量を測定した後、得られた薬物カバー層を、面積20cm2、厚み50μmに切り取り、時計皿に両面テープで固定した。
50rpmの速度でパドルを回転させている中に、時計皿に固定した薬物カバー層を入れ、7分後に取り出した。
取り出した薬物カバー層を100℃で1時間乾燥させた後、重量を測定し、試験前の薬物カバー層の重量に対する割合を算出し、その値を該薬物カバー層の残存率とした。残存率を下記表2に示す。
溶出試験器(アジレント・テクノロジー社製)のベッセルに蒸留水500mLを入れて、37℃に温めた。次に、時計皿(6cmφ)の重量を測定した後、得られた薬物カバー層を、面積20cm2、厚み50μmに切り取り、時計皿に両面テープで固定した。
50rpmの速度でパドルを回転させている中に、時計皿に固定した薬物カバー層を入れ、7分後に取り出した。
取り出した薬物カバー層を100℃で1時間乾燥させた後、重量を測定し、試験前の薬物カバー層の重量に対する割合を算出し、その値を該薬物カバー層の残存率とした。残存率を下記表2に示す。
(粘膜付着層の調製方法)
ガラス瓶にポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)1重量部と、エタノール90重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC-M、信越化学工業社製)4.5重量部と、ポリビニルピロリドン(PVP_K-90F、信越化学工業社製)4.5重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Aを得た。
別のガラス瓶にポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)6重量部と、エタノール80重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC-L、日本曹達社製)7重量部と、ポリビニルピロリドン(PVP_K-90F、BASFジャパン社製)7重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Bを得た。
粘膜付着層組成物Aを厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの片面に、乾燥後の厚さが20μmとなるように塗布し、30分間乾燥して粘膜付着層Aを複数枚得た。
次に、粘膜付着層用組成物Bを厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの片面に、乾燥後の厚さが50μmとなるように塗布し、30分間乾燥して粘膜付着層Bを複数枚得た。
粘膜付着層A、粘膜付着層B、粘膜付着層A、粘膜付着層B及び粘膜付着層Aの順に積層して、粘膜付着層を得た。
ガラス瓶にポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)1重量部と、エタノール90重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC-M、信越化学工業社製)4.5重量部と、ポリビニルピロリドン(PVP_K-90F、信越化学工業社製)4.5重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Aを得た。
別のガラス瓶にポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)6重量部と、エタノール80重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC-L、日本曹達社製)7重量部と、ポリビニルピロリドン(PVP_K-90F、BASFジャパン社製)7重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Bを得た。
粘膜付着層組成物Aを厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの片面に、乾燥後の厚さが20μmとなるように塗布し、30分間乾燥して粘膜付着層Aを複数枚得た。
次に、粘膜付着層用組成物Bを厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの片面に、乾燥後の厚さが50μmとなるように塗布し、30分間乾燥して粘膜付着層Bを複数枚得た。
粘膜付着層A、粘膜付着層B、粘膜付着層A、粘膜付着層B及び粘膜付着層Aの順に積層して、粘膜付着層を得た。
(粘膜付着薬物カバー層の調製方法)
得られた薬物カバー層と粘膜付着層とを積層して、粘膜付着層を有する薬物カバー層を得た。
次に得られた粘膜付着層を有する薬物カバー層を1cm2に打ち抜き、粘膜付着薬物カバー層を得た。
更に、以下に示す方法でパネリストに対し、得られた粘膜付着薬物カバー層の崩壊性試験を実施した。
得られた薬物カバー層と粘膜付着層とを積層して、粘膜付着層を有する薬物カバー層を得た。
次に得られた粘膜付着層を有する薬物カバー層を1cm2に打ち抜き、粘膜付着薬物カバー層を得た。
更に、以下に示す方法でパネリストに対し、得られた粘膜付着薬物カバー層の崩壊性試験を実施した。
(ヒトに対する粘膜付着薬物カバー層の崩壊性試験)
得られた粘膜付着薬物カバー層をパネリストの舌下に投与し、投与後2分及び30分時点での粘膜付着薬物カバー層の崩壊性を目視により確認した。
また、残存面積が50%未満であれば崩壊と判断した。結果を下記表2に示す。
得られた粘膜付着薬物カバー層をパネリストの舌下に投与し、投与後2分及び30分時点での粘膜付着薬物カバー層の崩壊性を目視により確認した。
また、残存面積が50%未満であれば崩壊と判断した。結果を下記表2に示す。
以上より、表1の実験例1~4に係る薬物層は、速崩壊性を示した。
一方、表2の実験例5~11及び比較実験例4~13では、いずれも面積20cm2厚み50μmの薬物カバー層を37℃の蒸留水500mLに浸漬させ浸漬開始から7分後の残存率が0%となっていないことから、速崩壊性は有していないことが確認された。従って、上記実験例1~4に係る薬物層、及び、上記実験例5~11及び比較実験例4~13に係る薬物カバー層を用いた口腔内付着型ワクチン製剤は、37℃の蒸留水に対する、薬物層の崩壊性(A)>薬物カバー層の崩壊性(B)の関係を満たす。
また、実験例5~11の薬物カバー層を有する粘膜付着薬物カバー層は、パネリストの舌下に投与された後、2分後において形状保持されているが、30分後において粘膜付着薬物カバー層が崩壊していた。従って、実験例5~11の薬物カバー層は、一定時間は崩壊しないが一定時間経過後であって特定の時間内(30分)に崩壊する薬物カバー層であることが確認された。
一方、表2の実験例5~11及び比較実験例4~13では、いずれも面積20cm2厚み50μmの薬物カバー層を37℃の蒸留水500mLに浸漬させ浸漬開始から7分後の残存率が0%となっていないことから、速崩壊性は有していないことが確認された。従って、上記実験例1~4に係る薬物層、及び、上記実験例5~11及び比較実験例4~13に係る薬物カバー層を用いた口腔内付着型ワクチン製剤は、37℃の蒸留水に対する、薬物層の崩壊性(A)>薬物カバー層の崩壊性(B)の関係を満たす。
また、実験例5~11の薬物カバー層を有する粘膜付着薬物カバー層は、パネリストの舌下に投与された後、2分後において形状保持されているが、30分後において粘膜付着薬物カバー層が崩壊していた。従って、実験例5~11の薬物カバー層は、一定時間は崩壊しないが一定時間経過後であって特定の時間内(30分)に崩壊する薬物カバー層であることが確認された。
(実施例1及び2、比較例1~3)
下記表3の組成を有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を調製した。具体的には、下記の通り薬物層、粘膜付着層及び薬物カバー層を調製し、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を調製した。なお、実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、被験動物(ウサギ)へ投与しやすいサイズを選定している。そのため、上述の試験例に記載のサイズと異なる場合がある。
下記表3の組成を有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を調製した。具体的には、下記の通り薬物層、粘膜付着層及び薬物カバー層を調製し、口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を調製した。なお、実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、被験動物(ウサギ)へ投与しやすいサイズを選定している。そのため、上述の試験例に記載のサイズと異なる場合がある。
(薬物層の調製方法)
下記表3に示した配合量の高分子成分及び蒸留水を容器に加え、適宜攪拌して溶解させた。次に、得られた溶液に、ワクチン抗原として1.0mg/mL_OVA溶液50重量部と、1.0mg/mLアジュバント溶液(ND002、日東電工社製)5重量部と加え、充分に混合し、ワクチン含有製材溶液を得た。
得られたワクチン含有製剤溶液を容器(2mmφ)に約2μL(2mg)ずつ分注し、凍結乾燥させ、薬物層を得た。なお、得られた薬物層の直径は1.5mmφであり、含水率は薬物層全質量の10%以下であった。また、得られた薬物層には、ワクチン抗原が1.0μgアジュバントが0.1μg含まれていた。
下記表3に示した配合量の高分子成分及び蒸留水を容器に加え、適宜攪拌して溶解させた。次に、得られた溶液に、ワクチン抗原として1.0mg/mL_OVA溶液50重量部と、1.0mg/mLアジュバント溶液(ND002、日東電工社製)5重量部と加え、充分に混合し、ワクチン含有製材溶液を得た。
得られたワクチン含有製剤溶液を容器(2mmφ)に約2μL(2mg)ずつ分注し、凍結乾燥させ、薬物層を得た。なお、得られた薬物層の直径は1.5mmφであり、含水率は薬物層全質量の10%以下であった。また、得られた薬物層には、ワクチン抗原が1.0μgアジュバントが0.1μg含まれていた。
(粘膜付着層の調製方法)
ガラス瓶にポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)1重量部と、エタノール90重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC-M、信越化学工業社製)4.5重量部と、ポリビニルピロリドン(PVP_K-90F、信越化学工業社製)4.5重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Aを得た。
別のガラス瓶にポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)6重量部と、エタノール80重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC-L、日本曹達社製)7重量部と、ポリビニルピロリドン(PVP_K-90F、BASFジャパン社製)7重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Bを得た。
粘膜付着層組成物Aを厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの片面に、乾燥後の厚さが20μmとなるように塗布し、30分間乾燥して粘膜付着層Aを複数枚得た。
次に、粘膜付着層用組成物Bを厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの片面に、乾燥後の厚さが50μmとなるように塗布し、30分間乾燥して粘膜付着層Bを複数枚得た。
粘膜付着層A、粘膜付着層B、粘膜付着層A、粘膜付着層B及び粘膜付着層Aの順に積層して、粘膜付着層を得た。
ガラス瓶にポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)1重量部と、エタノール90重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC-M、信越化学工業社製)4.5重量部と、ポリビニルピロリドン(PVP_K-90F、信越化学工業社製)4.5重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Aを得た。
別のガラス瓶にポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)6重量部と、エタノール80重量部とを添加して充分に混合した。次に、得られた溶液に、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC-L、日本曹達社製)7重量部と、ポリビニルピロリドン(PVP_K-90F、BASFジャパン社製)7重量部とを添加し、充分に混合し、粘膜付着層用組成物Bを得た。
粘膜付着層組成物Aを厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの片面に、乾燥後の厚さが20μmとなるように塗布し、30分間乾燥して粘膜付着層Aを複数枚得た。
次に、粘膜付着層用組成物Bを厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの片面に、乾燥後の厚さが50μmとなるように塗布し、30分間乾燥して粘膜付着層Bを複数枚得た。
粘膜付着層A、粘膜付着層B、粘膜付着層A、粘膜付着層B及び粘膜付着層Aの順に積層して、粘膜付着層を得た。
(薬物カバー層の調製方法)
ガラス瓶に、下記表3に示した配合量のポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)、蒸留水、エタノールを添加し、充分に混合した。次に、得られた溶液に、下記表3に示した配合量の基剤を添加し、充分に混合し、薬物カバー層用組成物を得た。得られた薬物カバー層用組成物を厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)の片面に、乾燥後の厚さが20μmとなるように塗布し、30分間乾燥して薬物カバー層を作製した。
ガラス瓶に、下記表3に示した配合量のポリエチレングリコール400(PEG400、三洋化成工業製)、蒸留水、エタノールを添加し、充分に混合した。次に、得られた溶液に、下記表3に示した配合量の基剤を添加し、充分に混合し、薬物カバー層用組成物を得た。得られた薬物カバー層用組成物を厚さ75μmのポリエチレンテレフタレート(PET)の片面に、乾燥後の厚さが20μmとなるように塗布し、30分間乾燥して薬物カバー層を作製した。
(ワクチン製剤の調製方法)
得られた薬物カバー層と粘膜付着層とを積層して、粘膜付着層を有する薬物カバー層を得た。
次に得られた粘膜付着層を有する薬物カバー層を直径3mmφに打ち抜き、粘膜付着層を介して薬物カバー層と、得られた薬物層とを付着させて実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を得た。
更に、以下に示す方法で免疫評価用モデル動物に対し、得られた実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の崩壊性試験及び免疫誘導試験を実施した。
結果を、表4に示す。
得られた薬物カバー層と粘膜付着層とを積層して、粘膜付着層を有する薬物カバー層を得た。
次に得られた粘膜付着層を有する薬物カバー層を直径3mmφに打ち抜き、粘膜付着層を介して薬物カバー層と、得られた薬物層とを付着させて実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤を得た。
更に、以下に示す方法で免疫評価用モデル動物に対し、得られた実施例及び比較例に係る口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の崩壊性試験及び免疫誘導試験を実施した。
結果を、表4に示す。
(ウサギに対する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の崩壊性試験)
得られた口腔内付着型ワクチン製剤をウサギの舌下に投与し、投与後2分及び30分時点での薬物層及び薬物カバー層の崩壊性を目視により確認した。
また、残存面積が50%未満であれば崩壊と判断した。
崩壊性の結果は下記表4に示す。
得られた口腔内付着型ワクチン製剤をウサギの舌下に投与し、投与後2分及び30分時点での薬物層及び薬物カバー層の崩壊性を目視により確認した。
また、残存面積が50%未満であれば崩壊と判断した。
崩壊性の結果は下記表4に示す。
(マウスに対する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤の粘膜免疫評価)
マウス(C57/BL6 NCr メス7週齢)の舌下に蒸留水2μLを入れた後、得られた口腔内付着型ワクチン製剤(薬物層:直径1.5mmφ、薬物カバー層 3mmφ)を貼付した。その上から、マウス唾液20μLを添加した。投与1週間後、同様にしてマウスの舌下に口腔内付着型ワクチン製剤を投与した。
2度目の投与から更に1週間後に、マウスの血清を採取し、血清中の抗原特異的IgG抗体価をELISA法により測定した。
測定結果は下記表4及び図3に示す。
マウス(C57/BL6 NCr メス7週齢)の舌下に蒸留水2μLを入れた後、得られた口腔内付着型ワクチン製剤(薬物層:直径1.5mmφ、薬物カバー層 3mmφ)を貼付した。その上から、マウス唾液20μLを添加した。投与1週間後、同様にしてマウスの舌下に口腔内付着型ワクチン製剤を投与した。
2度目の投与から更に1週間後に、マウスの血清を採取し、血清中の抗原特異的IgG抗体価をELISA法により測定した。
測定結果は下記表4及び図3に示す。
(マウス血清中抗原特異的IgG力価測定方法(ELISA法))
ELISA用96ウェルプレートに炭酸緩衝液にて希釈したOVA含有溶液(100μg/mL)を100μLずつ別々のプレートに添加し、一晩放置する。
予め準備した洗浄液(Tween20含有PBS)で3回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤(Block Ace、大日本住友製薬社製)を精製水で4g/100mLに希釈したブロッキング溶液を200μLずつ添加し、2時間室温で放置した。その後、洗浄液で3回ウェルを洗浄した。
予めマウスから採取した血清を4℃、3000gで10分間遠心分離し、上清を回収した。ブロッキング剤をリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)で0.4g/100mLに希釈した溶液を用いて、前述の上清もしくは鼻腔洗浄液を2倍ずつ段階希釈し、その溶液をそれぞれ50μLずつ添加し、2時間室温で放置した。
その後、洗浄液で3回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤をリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)で0.4g/100mLに希釈した溶液でHRP標識抗マウスIgG抗体(Goat-anti mouse IgG Fc HRP、BETHYL社製)を10000倍に希釈し、100μLずつ添加し、1時間室温で放置した。
その後、洗浄液で3回ウェルを洗浄し、TMB溶液(ELISA POD TMBキット、ナカライテスク社製)を100μLずつ添加し、暗所にて30分放置した。
その後、1M硫酸用液を100μLずつ添加し、当該96ウェルプレートをマイクロプレートリーダー(SpectraMax M2e、モレキュラーデバイス社製)で450nmの吸光度を測定した。段階希釈時の吸光度を基に、マウス血清中のIgG抗体力価をLog2で求めた。
ELISA用96ウェルプレートに炭酸緩衝液にて希釈したOVA含有溶液(100μg/mL)を100μLずつ別々のプレートに添加し、一晩放置する。
予め準備した洗浄液(Tween20含有PBS)で3回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤(Block Ace、大日本住友製薬社製)を精製水で4g/100mLに希釈したブロッキング溶液を200μLずつ添加し、2時間室温で放置した。その後、洗浄液で3回ウェルを洗浄した。
予めマウスから採取した血清を4℃、3000gで10分間遠心分離し、上清を回収した。ブロッキング剤をリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)で0.4g/100mLに希釈した溶液を用いて、前述の上清もしくは鼻腔洗浄液を2倍ずつ段階希釈し、その溶液をそれぞれ50μLずつ添加し、2時間室温で放置した。
その後、洗浄液で3回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤をリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)で0.4g/100mLに希釈した溶液でHRP標識抗マウスIgG抗体(Goat-anti mouse IgG Fc HRP、BETHYL社製)を10000倍に希釈し、100μLずつ添加し、1時間室温で放置した。
その後、洗浄液で3回ウェルを洗浄し、TMB溶液(ELISA POD TMBキット、ナカライテスク社製)を100μLずつ添加し、暗所にて30分放置した。
その後、1M硫酸用液を100μLずつ添加し、当該96ウェルプレートをマイクロプレートリーダー(SpectraMax M2e、モレキュラーデバイス社製)で450nmの吸光度を測定した。段階希釈時の吸光度を基に、マウス血清中のIgG抗体力価をLog2で求めた。
上記表4の結果から、薬物層として、上述の実験例1で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の実験例6で調製した薬物カバー層(残存率(C)が51%)を用いた実施例1に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、2分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層は形状が保持されていた。また、30分後の製剤形状を確認すると、薬物カバー層が崩壊しウサギの口腔内から製剤がなくなっていた。また、実施例1によると、高濃度の薬液が一定時間保持されたため、マウスに対して充分な免疫誘導効果が確認された。
また、薬物層として、上述の実験例1で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の実験例10で調製した薬物カバー層(残存率(C)が64%)を用いた実施例2に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、2分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層は形状が保持されていた。また、30分後の製剤形状を確認すると、薬物カバー層が崩壊しウサギの口腔内から製剤がなくなっていた。また、実施例2によると、高濃度の薬液が一定時間保持されたため、マウスに対して充分な免疫誘導効果が確認された。
また、薬物層として、上述の実験例1で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の実験例10で調製した薬物カバー層(残存率(C)が64%)を用いた実施例2に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、2分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層は形状が保持されていた。また、30分後の製剤形状を確認すると、薬物カバー層が崩壊しウサギの口腔内から製剤がなくなっていた。また、実施例2によると、高濃度の薬液が一定時間保持されたため、マウスに対して充分な免疫誘導効果が確認された。
上記表4の結果から、薬物層として、上述の実験例1で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の比較実験例7で調製した薬物カバー層(残存率(C)が38%)を用いた比較例1に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、2分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層も崩壊していた。比較例1によると、高濃度の薬液が一定時間保持されなかったため、マウスに対する充分な免疫誘導効果が得られなかった。
また、薬物層として上述の実験例1で調製した薬物層を用い、薬物カバー層を有さない比較例3に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、2分後に薬物層が崩壊していた。比較例3によると、高濃度の薬液が一定時間保持されなかったため、マウスに対する充分な免疫誘導効果が得られなかった。
一方、薬物層として、上述の実験例1で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の比較実験例5で調製した薬物カバー層(残存率(C)が95%)を用いた比較例2に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、2分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層は形状が保持されていた。また、30分後の製剤形状を確認すると、薬物カバー層が形状を保っており、ウサギの口腔内に製剤が残存していた。比較例2によると、高濃度の薬液が一定時間保持されたため、マウスに対して充分な免疫誘導効果が確認されたが、ワクチン製剤投与後30分の時点で薬物層の形状が保持されており、所望の時間において崩壊するワクチン製剤を得ることができなかった。
また、薬物層として上述の実験例1で調製した薬物層を用い、薬物カバー層を有さない比較例3に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、2分後に薬物層が崩壊していた。比較例3によると、高濃度の薬液が一定時間保持されなかったため、マウスに対する充分な免疫誘導効果が得られなかった。
一方、薬物層として、上述の実験例1で調製した薬物層を用い、薬物カバー層として、上述の比較実験例5で調製した薬物カバー層(残存率(C)が95%)を用いた比較例2に係る口腔内付着型ワクチン製剤は、ウサギの舌下に製剤が投与された後、2分後に目視で観察すると薬物層は崩壊していたが、薬物カバー層は形状が保持されていた。また、30分後の製剤形状を確認すると、薬物カバー層が形状を保っており、ウサギの口腔内に製剤が残存していた。比較例2によると、高濃度の薬液が一定時間保持されたため、マウスに対して充分な免疫誘導効果が確認されたが、ワクチン製剤投与後30分の時点で薬物層の形状が保持されており、所望の時間において崩壊するワクチン製剤を得ることができなかった。
以上より、ワクチン製剤における薬物カバー層の厚みが15μm以上あり、薬物層の崩壊性(A)と薬物カバー層の崩壊性(B)とが、(A)>(B)の関係を有し、薬物カバー層の残存率(C)が、50%以上90%以下である実施例1及び2にかかる口腔内粘膜付着型ワクチン製剤は、該製剤における薬物カバー層が一定時間崩壊することなく、高濃度の薬物溶液を一定時間安定して粘膜面に暴露させることができた。これにより、高濃度の薬物溶液が口腔内の唾液に希釈されることなく、投与された薬物量に応じて充分な免疫誘導効果を得ることができた。さらに、所望の時間で薬物カバー層が崩壊し、時間管理の負担が軽減された。
一方、薬物カバー層の残存率(C)が、50%未満である比較例1にかかる口腔内付着型ワクチン製剤は、口腔内に投与された後2分後に、薬物カバー層が崩壊し、高濃度の薬物溶液が口腔内に一定時間保持されなかった。そのため、マウスに対する充分な免疫誘導効果を得ることができなかった。薬物カバー層を有さない比較例3に係る粘膜付着型ワクチン製剤についても、同様にマウスに対する十分な免疫誘導効果は得られなかった。
また、薬物カバー層の残存率(C)が、90%を超える比較例2にかかる口腔内付着型ワクチン製剤は、口腔内投与後、所望の時間が経過しても口腔内に残存していた。すなわち、時間管理の負担を軽減できる製剤とはならなかった。
一方、薬物カバー層の残存率(C)が、50%未満である比較例1にかかる口腔内付着型ワクチン製剤は、口腔内に投与された後2分後に、薬物カバー層が崩壊し、高濃度の薬物溶液が口腔内に一定時間保持されなかった。そのため、マウスに対する充分な免疫誘導効果を得ることができなかった。薬物カバー層を有さない比較例3に係る粘膜付着型ワクチン製剤についても、同様にマウスに対する十分な免疫誘導効果は得られなかった。
また、薬物カバー層の残存率(C)が、90%を超える比較例2にかかる口腔内付着型ワクチン製剤は、口腔内投与後、所望の時間が経過しても口腔内に残存していた。すなわち、時間管理の負担を軽減できる製剤とはならなかった。
(実験例12)
表5に示す成分濃度及び配合で医薬組成物を調製した。すなわち、40質量部の精製水に、賦形剤としてDextran 70(名糖産業社製)を5質量部加え、適宜撹拌して溶解させた。
得られた溶液に1mg/mLOVA溶液を50質量部、1mg/mLアジュバント(ND002)溶液を5質量部加え、充分に混合した。
得られた抗原含有製剤溶液をアルミ包材に1.0gずつ分注し、凍結乾燥させ、医薬組成物を得た。なお、得られた医薬組成物の含水率は10質量%以下であった。
得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水1.0mLに溶解させ、粘度測定装置(RheoStress 600、THeromo HAAKE社製)を用いて37℃における溶液粘度を測定した。
更に、以下に示す方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を、図4、5に示した。
表5に示す成分濃度及び配合で医薬組成物を調製した。すなわち、40質量部の精製水に、賦形剤としてDextran 70(名糖産業社製)を5質量部加え、適宜撹拌して溶解させた。
得られた溶液に1mg/mLOVA溶液を50質量部、1mg/mLアジュバント(ND002)溶液を5質量部加え、充分に混合した。
得られた抗原含有製剤溶液をアルミ包材に1.0gずつ分注し、凍結乾燥させ、医薬組成物を得た。なお、得られた医薬組成物の含水率は10質量%以下であった。
得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水1.0mLに溶解させ、粘度測定装置(RheoStress 600、THeromo HAAKE社製)を用いて37℃における溶液粘度を測定した。
更に、以下に示す方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を、図4、5に示した。
(舌下投与によるマウス免疫試験)
上記の通りに製造した医薬組成物を用いて、モデル動物であるマウスによる免疫誘導試験を行った。
まず、医薬組成物を精製水1mLに溶解させ、ワクチン製剤溶液を得た。
次に、予め準備したマウス(BALB/cマウス、メス7週齢)に麻酔処理を行った後、得られたワクチン製剤溶液をマウス舌下に20μL投与した。また陽性比較例(PC)として、ワクチン製剤溶液と同様のOVA及びアジュバントND002濃度の溶液を用事調製し、同様に投与を行った。
当該投与から1週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれ同様に投与した。2度目の投与から更に1週間後に、マウス血清及び鼻腔洗浄液を採取した。血液は4℃下3000Gで10分間遠心し、上清20μLにリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)300μLを加えて血清サンプルとした。
鼻腔洗浄液は、マウスの気道下部に切れ込みを入れ、200μLのリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)を流し込み、鼻腔に出てきたサンプルを回収し、鼻腔洗浄液サンプルとした。
マウス血清中のOVA特異的IgG抗体を測定することにより、全身性免疫応答を評価した。またマウス鼻腔洗浄液中の免疫抗原特異的IgA力価を測定することにより、粘膜免疫応答を評価した。
上記の通りに製造した医薬組成物を用いて、モデル動物であるマウスによる免疫誘導試験を行った。
まず、医薬組成物を精製水1mLに溶解させ、ワクチン製剤溶液を得た。
次に、予め準備したマウス(BALB/cマウス、メス7週齢)に麻酔処理を行った後、得られたワクチン製剤溶液をマウス舌下に20μL投与した。また陽性比較例(PC)として、ワクチン製剤溶液と同様のOVA及びアジュバントND002濃度の溶液を用事調製し、同様に投与を行った。
当該投与から1週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれ同様に投与した。2度目の投与から更に1週間後に、マウス血清及び鼻腔洗浄液を採取した。血液は4℃下3000Gで10分間遠心し、上清20μLにリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)300μLを加えて血清サンプルとした。
鼻腔洗浄液は、マウスの気道下部に切れ込みを入れ、200μLのリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)を流し込み、鼻腔に出てきたサンプルを回収し、鼻腔洗浄液サンプルとした。
マウス血清中のOVA特異的IgG抗体を測定することにより、全身性免疫応答を評価した。またマウス鼻腔洗浄液中の免疫抗原特異的IgA力価を測定することにより、粘膜免疫応答を評価した。
(マウス血清中抗原特異的IgG力価測定方法(ELISA法))
上述と同様の操作を行い、抗原特異的IgG力価を測定した。
上述と同様の操作を行い、抗原特異的IgG力価を測定した。
(マウス鼻腔洗浄液中抗原特異的IgA力価測定方法(ELISA法))
基本的には抗原特異的IgG力価測定方法と同様であるが、測定サンプルは鼻腔洗浄液であり、またHRP標識抗マウスIgG抗体の代わりにHRP標識抗マウスIgA抗体(Goat-anti-mouse IgA α HRP、BETHYL社製)を用いた。
それ以外の操作は全て抗原特異的IgG力価測定方法と同様とした。
基本的には抗原特異的IgG力価測定方法と同様であるが、測定サンプルは鼻腔洗浄液であり、またHRP標識抗マウスIgG抗体の代わりにHRP標識抗マウスIgA抗体(Goat-anti-mouse IgA α HRP、BETHYL社製)を用いた。
それ以外の操作は全て抗原特異的IgG力価測定方法と同様とした。
(実験例13~24)
実験例12と同様の手順で、下記表5~8に示した成分濃度及び配合量にて溶液を調製し、凍結乾燥を行い、医薬組成物を得た。なお、賦形剤として、実験例13~15ではDextran 70(名糖産業社製)(質量平均分子量70000)、実験例16~18ではLMペクチン(GENU PECTIN Type LM-102AS-J、CP Kelco社製)、実験例19~21ではHMペクチン(GENU PECTIN Type USP-H、CP Kelco社製)、実験例22~24ではアルギン酸ナトリウム(キミカアルギン IL-2、キミカ社製)を使用した。実験例13~24で得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水1.0mLに溶解させ、上述した方法で37℃における溶液粘度を測定した。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも10質量%以下であった。
更に、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図4~11に示した。
実験例12と同様の手順で、下記表5~8に示した成分濃度及び配合量にて溶液を調製し、凍結乾燥を行い、医薬組成物を得た。なお、賦形剤として、実験例13~15ではDextran 70(名糖産業社製)(質量平均分子量70000)、実験例16~18ではLMペクチン(GENU PECTIN Type LM-102AS-J、CP Kelco社製)、実験例19~21ではHMペクチン(GENU PECTIN Type USP-H、CP Kelco社製)、実験例22~24ではアルギン酸ナトリウム(キミカアルギン IL-2、キミカ社製)を使用した。実験例13~24で得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水1.0mLに溶解させ、上述した方法で37℃における溶液粘度を測定した。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも10質量%以下であった。
更に、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図4~11に示した。
(比較実験例14~21)
実験例12と同様の手順で、表5~8に示した配合量にて溶液を調製し、凍結乾燥を行い、医薬組成物を得た。得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水1.0mLに溶解させ、上述した方法で37℃における溶液粘度を測定した。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも10質量%以下であった。
更に、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図4~11に示した。
実験例12と同様の手順で、表5~8に示した配合量にて溶液を調製し、凍結乾燥を行い、医薬組成物を得た。得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水1.0mLに溶解させ、上述した方法で37℃における溶液粘度を測定した。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも10質量%以下であった。
更に、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図4~11に示した。
(実験例25~32)
実験例12と同様の手順で、表9に示した成分濃度及び配合量にて溶液を調製し、アルミ包材に1.0gずつ分注し、凍結乾燥させ、医薬組成物を得た。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも10質量%以下であった。
得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水1.0mLに溶解させ、上述の粘度測定装置を用いて37℃時の溶液粘度を測定した。
さらに、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図12、13に示した。
実験例12と同様の手順で、表9に示した成分濃度及び配合量にて溶液を調製し、アルミ包材に1.0gずつ分注し、凍結乾燥させ、医薬組成物を得た。なお、得られた医薬組成物の含水率は、いずれも10質量%以下であった。
得られた医薬組成物の質量を測定後、精製水1.0mLに溶解させ、上述の粘度測定装置を用いて37℃時の溶液粘度を測定した。
さらに、上述した方法で免疫評価用モデル動物による免疫誘導試験を実施した。
結果を図12、13に示した。
表5~8で示したように、賦形剤の配合量を増加させることにより、医薬組成物の溶液粘度が増大することがわかった。その結果、溶液粘度が20mPa・s以下を示す溶液で充分な免疫誘導が得られることがわかった。
表9で示したように、表5~8において溶液粘度が20 mPa・sを超える配合組成であっても、製剤の質量を減らすことで1回投与量の溶液粘度が20 mPa・s以下に減少し、充分な免疫誘導が得られることがわかった。
つまり、配合溶液や医薬組成物における賦形剤の比率ではなく、製剤のサイズや溶解させて得られた溶液粘度が重要なパラメータであることが示された。
表9で示したように、表5~8において溶液粘度が20 mPa・sを超える配合組成であっても、製剤の質量を減らすことで1回投与量の溶液粘度が20 mPa・s以下に減少し、充分な免疫誘導が得られることがわかった。
つまり、配合溶液や医薬組成物における賦形剤の比率ではなく、製剤のサイズや溶解させて得られた溶液粘度が重要なパラメータであることが示された。
以上の実験例12~32及び比較実験例14~21により、薬物層は、37℃の蒸留水1.0mLに1回投与分を溶解させたときの溶液粘度(D)が、20mPa・s以下であることが、ワクチン製剤を投与し口腔内粘膜経路で免疫を誘導するためには好適であることが確認された。
1 薬物層
2 粘膜付着層
3 薬物カバー層
2 粘膜付着層
3 薬物カバー層
Claims (7)
- ワクチン抗原を含む薬物層と、薬物カバー層とを有する口腔内粘膜付着型ワクチン製剤であって、
前記薬物カバー層の厚みが、15μm以上であって、
37℃の蒸留水に対する、前記薬物層の崩壊性(A)及び前記薬物カバー層の崩壊性(B)が、(A)>(B)の関係を有し、
面積20cm2厚み50μmの前記薬物カバー層の試験片を、37℃の蒸留水500mLに浸漬させ、浸漬開始から7分後の残存率(C)が、50%以上90%以下である
ことを特徴とする口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。 - 薬物層は、37℃の蒸留水1.0mLに1回投与分を溶解させたときの溶液粘度(D)が、20mPa・s以下である請求項1に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
- 薬物層は、さらに高分子成分を含む請求項1又は2に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
- 高分子成分は、デキストラン、ペクチン及びアルギン酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも1種である請求項3に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
- 高分子成分は、デキストランである請求項4に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
- 薬物層は、さらに少なくとも1種の免疫誘導促進剤を含む請求項1、2、3、4又は5に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
- ワクチン抗原は、ペプチド抗原、タンパク質抗原及び核酸からなる群より選択される少なくとも1種である請求項1、2、3、4、5又は6に記載の口腔内粘膜付着型ワクチン製剤。
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JP2006528975A (ja) * | 2003-05-09 | 2006-12-28 | セフアロン・インコーポレーテツド | 経粘膜送達デバイスとともに使用のための溶解可能な裏打ち層 |
JP2010138124A (ja) * | 2008-12-12 | 2010-06-24 | Kyukyu Yakuhin Kogyo Kk | 口腔内粘膜貼付製剤 |
JP2014169283A (ja) * | 2013-02-05 | 2014-09-18 | Nitto Denko Corp | 粘膜投与用ワクチン組成物 |
-
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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MASEK J. ET AL.: "Multi-layered nanofibrous mucoadhesive films for buccal and sublingual administration of drug-delivery and vaccination nanoparticles - important step towards effective mucosal vaccines", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 249, 2017, pages 183 - 195, XP029927819, DOI: 10.1016/j.jconrel.2016.07.036 * |
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