PT762875E - Sistema de entraga de microparticulas - Google Patents
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Description
84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ
DESCRICÃ0 "Sistema de entrega de micropartículas" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um transportador em partículas para entrega de materiais com actividade biológica. O termo "micropartícula", tal como aqui empregue, refere-se a qualquer transportador em partículas utilizado para entrega de um material biologicamente activo e inclui materiais que são microcápsulas e microesferas.
REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS 0 presente pedido é uma continuação em parte do pedido de patente copendente dos E.U.A. n°. de série 08/245 646, apresentado em 18 de Maio de 1994.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As vacinas são utilizadas há muitos anos para proteger seres humanos e animais contra uma vasta variedade de doenças infecciosas. Estas vacinas convencionais consistem em patogénios atenuados (por exemplo, vírus polio), patogénios mortos (por exemplo, Bordetella pertussis) ou componentes imunogénicos do patogénio (por exemplo, toxóide da difteria). Alguns antigénios são altamente imunogénicos e são capazes de, sozinhos, induzir respostas imunitárias de protecção. Outros antigénios, contudo, não conseguem induzir uma resposta imunitária de protecção ou induzem apenas uma fraca resposta imunitária. Esta baixa imunogenicidade pode ser significativamente melhorada se os antigénios forem co-admirtistrados com adjuvantes. Os adjuvantes aumentam a imunogenicidade de um antigénio mas não são, eles próprios, necessariamente imunogénicos. Os adjuvantes podem actuar por retenção do antigénio localmente próximo do local de administração para produzir um efeito de depósito que facilita uma libertação lenta e sustentada do antigénio para as células do sistema imunitário. Os adjuvantes podem também atrair células do sistema imunitário para um depósito de antigénio e estimular essas células para induzirem respostas imunitárias. Foram identificados adjuvantes que aumentam
84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 2 a resposta imunitária a antigénios entregues parentericamente. Alguns destes adjuvantes são, contudo, tóxicos e podem causar efeitos laterais indesejáveis, que os tornam inadequados para utilização em seres humanos e muitos animais. De facto, apenas o hidróxido de alumínio e o fosfato de alumínio são rotineiramente utilizados como adjuvantes em vacinas para seres humanos e veterinárias. Contudo, mesmo estes adjuvantes não são adequados para utilização com todos os antigénios e podem também causar irritação no local da injecção. Existe uma clara necessidade de desenvolver novos adjuvantes que sejam seguros e eficazes para aumentar a imunogenicidade de antigénios. A imunização pode também ser conseguida através da entrega de antigénios a superfícies mucosas, tal como por ingestão do antigénio. Assim, sabe-se que a ingestão de antigénios por animais pode resultar no surgimento de anticorpos IgA secretores específicos dos antigénios em lavagens intestinais, brônquicas ou nasais e noutras secreções externas. Por exemplo, estudos com voluntários humanos mostraram que a administração oral da vacina contra a influenza é eficaz para induzir anticorpos anti-influenza secretores em secreções nasais e identificaram-se substâncias que podem ser úteis como adjuvantes para estas vacinas ingeridas. Contudo, a maioria destes adjuvantes são relativamente pobres em termos de melhorar a resposta imunitária a antigénios ingeridos. Correntemente, determinou-se que alguns destes adjuvantes são seguros e eficazes no aumento de respostas imunitárias em seres humanos e animais a antigénios que são administrados através dos tractos orogastrointestinal, nasofaríngico-respiratório e genital ou nas órbitas oculares. Contudo, a administração de antigénios através destas vias é geralmente ineficaz em induzir uma resposta imunitária. Crê-se que a incapacidade para imunizar na superfície mucosa é de um modo geral devida a: destruição do antigénio ou uma redução na sua imunogenicidade nos ambientes ácido e/ou enzimaticamente hostis criados por secreções produzidas no epitélio da mucosa; diluição do antigénio para uma concentração que se crê inferior à necessária para induzir respostas imunitárias; transporte do antigénio do corpo em descargas originárias no epitélio da mucosa; e falta de adjuvantes adequados que permaneçam activos no epitélio da mucosa. 3 ΕΡ Ο 762 875/ΡΤ
Existe claramente uma necessidade de identificar adjuvantes poderosos que sejam seguros e eficazes para utilização no epitélio de mucosas nos tractos orogastrointestinal, nasofaríngico-respiratório e urogenital e nas órbitas oculares e em outros locais com mucosas.
Podem ser aprisionados antigénios sensíveis para os proteger contra destruição, redução He imunngenicidade nu diluição. O antigénio pode ser revestido por uma única parede de material polimérico ou pode ser disperso no interior de uma matriz monolítica. Assim, a Patente dos E.U.A. 5 151 264 descreve um transportador em partículas de natureza fosfolipídica/ glicolipídica/ polissacarídea que foi denominado Bio Vecteurs Supra Moléculaires (BVSM). Os transportadores em partículas destinam-se a transportar uma variedade de moléculas com actividade biológica numa das suas camadas. Contudo, a Patente dos E.U.A. 5 151 264 não descreve transportadores em partículas contendo antigénios para imunização e em particular não descreve transportadores em partículas para imunização através dos tractos orogastrointestinal, nasofaríngico-respiratório e urogenital e nas órbitas oculares ou outros locais com mucosas. A Patente dos E.U.A. 5 075 109 descreve a encapsulação dos antigénios hemocianina de lapa do género Fissurelta trinitrofenilado e enterotoxina B de estafilococos em poii(DL-lactido-co-glicolido) 50:50. São sugeridos outros polímeros para encapsulação, tais como poli(glicolido), poli(DL-lactido-co-glicolido), copolioxalatos, policaprolactona, poli(lactido-co-caprolactona), poli(esteramidas), poliortoésteres e poli(ácido 8-hidroxibutírico) e polianidridos. O antigénio encapsulado foi administrado a ratinhos por intubação gástrica e resultou no surgimento de anticorpos IgA específicos para o antigénio significativos na saliva e em secreções intestinais e no soro. Como afirmado nesta patente, em contraste, a administração oral da mesma quantidade de antigénio não encapsulàdo foi ineficaz na indução de anticorpos específicos de qualquer isotipo e em qualquer dos fluidos testados. Foram também utilizadas microcápsulas de poli(DL-lactido-co-glicolido) para administrar o antigénio por injecção parentérica. O pedido PCT publicado WO 91/06282 descreve um veículo de entrega compreendendo uma pluralidade de microesferas bioadesivas e ingredientes da vacina antigénica. As microesferas eram de amido, gelatina, dextrano, colagénio 4 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ ou albumina. Este veículo de entrega é particularmente destinado à captação de vacina através da mucosa nasal. 0 veículo de entrega pode adicionalmente conter um intensificador de absorção. Os antigénios são tipicamente encapsulados no interior de materiais poliméricos protectores.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a proporcionar um novo e útil sistema de entrega por micropartículas que pode ser útil para a entrega de materiais com actividade biológica, incluindo antigénios, a um hospedeiro.
De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um transportador em partículas que compreende: um núcleo sólido compreendendo um polissacárido e um material proteínico; e um polímero organometálico ligado ao núcleo. Um tal transportador em partículas tem geralmente um tamanho de partícula de cerca de 10 nm a cerca de 50 pm, preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 pm. 0 componente polissacárido do núcleo pode ser dextrano, amido, celulose ou seus derivados, em particular amido solúvel. O amido pode ser derivado de várias espécies de monocotiledóneas e dicotiledóneas, tais como milho, batata ou tapioca. 0 componente de material proteínico do núcleo pode ter actividade biológica. Pode também ser incluído no núcleo um material adicional com actividade biológica. As partículas proporcionam portanto um veículo de entrega para o material biologicamente activo a um hospedeiro, geralmente um animal, incluindo um ser humano. O material com actividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, inclui proteínas (tais como proteína do vírus da inf/uenza), péptidos, antigénios, bactérias, lisados de bactérias, vírus (tais como o vírus da inf/uenza), lisados de células infectadas com vírus (tais como um lisado de células infectadas com o vírus da herpes simples), anticorpos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, lípidos, haptenos, materiais farmacologicamente activos e suas combinações, derivações e misturas. 5 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 0 polímero organometálico ligado ao núcleo é preferivelmente derivado de um silicone funcionalizado, incluindo um silicone substituído nas extremidades. Uma classe particular de silicones substituídos nas extremidades a partir dos quais o polímero organometálico pode ser derivado consiste nos polidialquilsiloxanos terminados com (trialcoxisilil)alquilo.
Num aspecto adicional da presente invenção, é proporcionada uma composição imunogénica formulada para administração parentérica ou por mucosas, compreendendo o transportador em partículas contendo um material imunogénico e um seu transportador fisiologicamente aceitável.
Num aspecto adicional, é proporcionado um método de produção de uma resposta imunitária num hospedeiro, compreendendo a administração, geralmente por administração parentérica ou por mucosas, da composição imunogénica aqui proporcionada. A resposta imunitária produzida pode ser uma resposta de anticorpos, incluindo respostas de anticorpos locais e séricos.
Num aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um método para a produção de um transportador em partículas, o qual compreende: (a) formação de uma composição aquosa compreendendo um polissacárido dissolvido e um material proteínico disperso ou dissolvido; (b) formação de uma emulsão em que a composição aquosa está na fase dispersa; (c) formação, a partir da emulsão, de um transportador em partículas compreendendo um núcleo do referido polissacárido e material proteínico possuindo a si ligado um polímero organometálico; e (d) recolha do transportador em partículas assim formado. O método pode incluir opcionalmente um passo de aplicação de ultra-sons à suspensão de microesferas para produzir uma suspensão fina antes do passo de formação (c), de modo a controlar o tamanho das partículas.
Este procedimento permite que o material proteínico seja incorporado nas micropartículas sob condições de temperatura que não desnaturem o material proteínico ou afectem adversamente a sua actividade biológica.
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As vantagens da presente invenção incluem: (a) facilidade e segurança no fabrico das micropartículas; (b) biocompatibilidade e segurança das micropartículas; (c) imunogenicidade melhorada de antigénios apresentados a células do sistema imunitário pelas micropartículas; (d) facilidade de armazenamento e administração; e (e) condições de fabrico que não afectam adversamente a actividade biológica de material proteínico ou outro.
No presente pedido, o termo micropartículas "revestidas" é utilizado para definir micropartículas que têm uma ligação a um polímero organometálico de cadeia longa, ligado ou de outro modo associado ao seu núcleo.
BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 apresenta um diagrama de fluxos para um processo para a produção de micropartículas de amido de acordo com uma concretização da invenção. Nesta figura, HSA= albumina sérica humana, lisado de HSV2/HSA = lisado de vírus de herpes simples do tipo 2 misturado com albumina sérica humana, Flu X31/HSA= estirpe X31 do vírus da influenza misturado com albumina sérica humana. A Figura 2 apresenta uma análise por microscopia electrónica de varrimento (SEM) de micropartículas contendo a estirpe A-X31 do vírus da influenza e albumina sérica humana que (A) foram revestidas com o polímero de silicone (polidimetilsiloxano terminado com (trietoxi-silil)propilo (TS-PDMS) ou (B) não foram revestidas. As imagens da SEM representam uma ampliação de 2500 diâmetros. O diâmetro nominal das micropartículas revestidas com TD-PDMS era de 10 pm e o das micropartículas não revestidas era de 10 pm. A Figura 3 apresenta a distribuição de diâmetros de micropartículas de amido contendo albumina sérica humana revestidas com o polímero de silicone polidimetilsiloxano terminado com 3-(trietoxil)sililpropilo (TS-PDMS). As partículas de amido contendo HSA (Δ) foram fabricadas e comparadas com padrões de microesferas de poliestireno por citometria de fluxo (; 10 pm, 7 ΕΡ Ο 762 875/ΡΤ 7 μηπ, 4 μηη de diâmetro). As partículas tinham um diâmetro médio de 4,18 μπη e um desvio padrão de mais ou menos 3 μιτι. A Figura 4 apresenta uma análise de imunotransferência de albumina sérica humana libertada de micropartículas de amido contendo albumina sérica humana que tinham sido revestidas com o polímero de silicone polimetilsiloxano terminado com 3-(trietoxisilil) propilo (TS-PDMS) ou não tinham sido revestidas após a suspensão das micropartículas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A pista 1 mostra 0,5 pg de um padrão de HSA. As pistas 2 a 4 mostram a HSA libertada das micropartículas revestidas com TS-PDMS incubadas in vitro durante 30 min, 1 h e 3 h em PBS in vitro e as pistas 5 a 7 mostram a HSA libertada das micropartículas não revestidas a 30 min, 1 h e 3 h in vitro. A Figura 5 apresenta as respostas de anticorpos séricos IgG anti-HSA após vários protocolos de imunização. Imunizaram-se grupos de 6 ratinhos por via intraperitoneal (I.P.) nos dias 0, 7 e 14 com 250 μΙ de PBS, pH 7,4, contendo 100 pg de HSA incorporados nas micropartículas de amido revestidas com TS-PDMS e não revestidas. Os soros obtidos nos dias 21, 35, 49, 63 e 84 foram avaliados quanto à presença de anticorpos IgG anti-HSA utilizando um ensaio imunossorvente com ligação enzimática (ELISA). Um mg de micropartículas revestidas ou não revestidas contém 50 pg de HSA. A Figura 6 apresenta a percentagem de animais que desenvolveram uma resposta de anticorpos séricos IgG anti-HSA após imunização intragástrica com HSA incorporada em micropartículas não revestidas ou revestidas com TS-PDMS, em comparação com HSA solúvel na forma livre. A Figura 7 apresenta os títulos de anticorpos séricos IgG anti-HSA em seis ratinhos imunizados intragastricamente com uma dose de 50 pg de micropartículas não revestidas ou revestidas com TS-PDMS. Os animais foram imunizados nos dias 0, 7 e 14 com 0,5 ml de NaHC03 0,2 M contendo 50 pg de HSA incorporada nas micropartículas de amido não revestidas ou revestidas com TS-PDMS ou HSA solúvel. Os soros obtidos nos dias 21, 35, 49, 63 e 84 foram avaliados quanto à presença de anticorpos IgG anti-HSA utilizando um ELISA. Um mg de micropartículas não revestidas ou revestidas contém 50 pg de HSA. 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 8
I A Figura 8 apresenta os títulos de anticorpos séricos IgG anti-HSA em seis ratinhos imunizados intragastricamente com uma dose de 75 pg de micropartículas não revestidas ou revestidas com TS-PDMS em comparação com HSA solúvel na forma livre. Os animais foram imunizados nos dias 0, 7 e 14 com 0,5 ml de NaHC03 0,2 M contendo 75 pg de HSA incorporada nas micropartículas de amido não revestidas ou revestidas com TS-PDMS ou de HSA solúvel. Os soros obtidos nos dias 21, 35, 49, 63 e 84 foram avaliados quanto à presença de anticorpos IgG anti-HSA utilizando um ELISA. Um mg de micropartículas não revestidas ou revestidas contém 50 pg de HSA.
A Figura 9 apresenta o título de anticorpos séricos IgG e IgA anti-HSA em grupos de 15 ratinhos imunizados intragastricamente com 50 pg (Painéis A e B) ou 10 pg (Painéis C e D) de micropartículas contendo HSA. Os animais foram imunizados nos dias 0, 7, 14 e 70 com HSA incorporada em micropartículas enxertadas com TS-PDMS (barras a cheio) ou não enxertadas (barras a tracejado). Os soros obtidos nos dias 35, 49, 63 e 77 foram avaliadas quanto à presença de IgG anti-HSA (Painéis A e C) ou IgA (Painéis B e D) utilizando um ELISA. * A Figura 10 apresenta os títulos de anticorpos séricos anti-Flu X31 (i.e. estirpe X31 do vírus da influenza do tipo A) em ratinhos imunizados por via intraperitoneal com FluX31/HSA solúvel, FluX31/HSA misturados com micropartículas revestidas com TS-PDMS ou Flu X31/HSA aprisionados em micropartículas revestidas com TS-PDMS. A Figura 11 apresenta os títulos de anticorpos anti-HSA nos soros de ratinhos imunizados por via intraperitoneal com FluX31/HSA solúvel, Flu X31/HSA em tampão ou misturados com micropartículas revestidas com TS-PDMS ou FluX31/HSA aprisionados em micropartículas revestidas com TS-PDMS. A Figura 12 apresenta os títulos de anticorpos anti-Flu X31 em soros de ratinhos imunizados por via intranasal com Flu X31/HSA solúvel, Flu X31/HSA aprisionados em micropartículas revestidas com TS-PDMS.
84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 9 A Figura 13 apresenta os títulos de anticorpos anti-HSA nos soros de ratinhos imunizados por via intranasal com Flu X31/HSA solúvel ou Flu X31/HSA aprisionados em micropartículas revestidas com TS-PDMS.
As figuras 14 e 15 apresentam, em duas experiências diferentes (Exp #1 e Exp #2, respectivamente), os títulos de anticorpos anti-HSV-2 nos soros de ratinhos imunizados por via intraperitoneal com lisado de células infectadas com vírus de herpes simples do tipo 2 (HSV-2) administrado sob várias formas. TC = toxina da cólera, NR = não revestido, TK = timidina-quinase. A Figura 16 apresenta as respostas de IgG sérico em ratinhos imunizados por via intraperitoneal pela proteína de membrana de 47 kDa de Haemophilus influenzae (Hin47 MP) sob várias formas. EL= eluado, SOL= solúvel, FCA = Adjuvante Completo de Freund, Ex 1 = experiência 1, Ex 2= experiência 2.
DESCRICÃO GERAL DA INVENÇÃO
Tal como anteriormente notado, a presente invenção refere-se a um transportador em partículas ou micropartículas, que é útil para a entrega de materiais biologicamente activos a um vertebrado, geralmente um animal incluindo seres humanos, incluindo a entrega de antigénios ao sistema imunitário, por administração parentérica ou por mucosas. 0 transportador em partículas compreende dois componentes, nomeadamente um núcleo sólido e um polímero organometálico ligado ao núcleo. O núcleo sólido compreende pelo menos dois componentes, nomeadamente um polissacárido e um material proteínico. 0 polissacárido pode ser um de uma vasta gama destes materiais, preferivelmente amido, em particular amido que tenha sido tratado de modo a ficar amido "solúvel" (i.e., um amido que lenha sido tratado para proporcionar um amido que é solúvel em água). Contudo, podem ser utilizados outros materiais polissacarídeos, incluindo dextrano e celulose, bem como derivados e misturas de dois ou mais polissacáridos. 10 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ Ο transportador em partículas pode ter um tamanho de partículas que varia geralmente de cerca de 10pm a cerca de 50 pm e preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 pm para administração por mucosas de antigénios. O material proteínico pode ser qualquer material proteínico desejado e pode ele próprio ter actividade biológica. Os exemplos de materiais proteínicos que podem ser utilizados são proteínas derivadas de vários vírus e bactérias incluindo toxóide do tétano, toxóide da difteria, toxóide da cólera e suas subunidades, toxóide de pertussis, subunidades virais, tais como as proteínas Ε1, E2 e C do vírus da rubéola, subunidades bacterianas, tais como as proteínas P41, OspA e OspB de B. burgdorferi, conjugados de proteína-polissacárido, subunidades de protozoários, tais como P30 de T. gondi, anticoagulantes, venenos, tais como veneno de cobra, citóquinas, tais como as interleucinas 4, 5, 6 e 12, interferões, factor de necrose tumoral, e albuminas, tais como albumina sérica humana, albumina sérica bovina e ovalbumina, bem como proteínas recombinantes, péptidos e lipopéptidos e seus análogos, incluindo dipéptido de muramilo, lipopolissacárido e lípido A ou análogos destas proteínas ou de regiões imunológicas destas proteínas.
Quando o material proteínico tem actividade biológica, pode ou não ser incluído no núcleo um material biologicamente activo adicional. Quando o material proteínico não tem actividade biológica, pode ser incorporado no núcleo um material com actividade biológica, de modo a que o material proteínico actua como um transportador para o material biologicamente activo.
Tanto o polissacárido como o material proteínico têm que estar presentes para a formação das micropartículas e o revestimento com polímero organometálico. Na ausência de um dos componentes, não foi possível obter a transportador em partículas de acordo com a invenção. A proporção do núcleo compreendendo o material proteínico pode variar até cerca de 33% em peso, geralmente de cerca de 0,5% em peso a cerca de 10% em peso.
Quando o material biologicamente activo está presente no núcleo que não na forma de material proteínico, este material pode constituir de cerca de 0,5 a cerca de 30% em peso do núcleo, preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 5,0% em peso. Um tal material biologicamente activo pode ser qualquer membro das várias classes de materiais biologicamente activos conhecidos, 11 04 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ incluindo proteínas, péptidos, antigénios, anticorpos, moléculas de imunodireccionamento, bactérias, lisados bacterianos, vírus, lisados de células infectadas com vírus, anticorpos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, lípidos, glicolípidos, haptenos, materiais farmacologicamente activos, bem como suas combinações, derivados e misturas. Os exemplos específicos de tais materiais incluem vírus da influenza, vírus de parainfluenza, vírus respiratórios, vírus de sarampo, vírus de papeira, vírus de imunodefiniência humana, vírus polio, vírus de rubéola, vírus de herpes simples, do tipo 1 e 2, vírus de hepatite, tipos A, B e C, vírus de febre amarela, vírus de varicela, vírus de raiva, vírus de vacina, reovírus, rinovírus, vírus de Coxsackie, ecovírus, rotavírus, vírus de papiloma, paravovírus e adenovírus; E. coli, V. cho/era, BCG, C. diphtheria, Y. pestis, S. typhi, B. pertussis, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. mutans, Miocoplasmas, Leveduras, C. tetani, meningococos (N. meningitis), Shigella spp, Campylobacter spp, Proteus spp, Neisseria gonorrhoea, e Haemophilus influenzae: bem como proteínas obtidas destes vírus e bactérias. O núcleo sólido tem um polímero organometálico a si ligado. Estes compostos organometálicos podem incluir silicones lineares, ramificados ou reticulados, que estão ligados nas extremidades de cadeias poliméricas ao núcleo, apesar de o polímero poder estar ligado ao núcleo em locais ao longo do comprimento da cadeia. Estes polissiloxanos podem variar em peso molecular de cerca de 400 até cerca de 1 000 000 Daltons e preferivelmente de cerca de 700 a cerca de 60 000 Daltons.
Podem ser empregues vários polissiloxanos. Para a finalidade de ligação do polissiloxano ao núcleo sólido, os polissiloxanos são preferivelmente derivados de materiais funcionalizados que têm grupos funcionais nas extremidades da cadeia polimérica que facilitam a ligação das extremidades da cadeia do polissiloxano ao núcleo sólido. Contudo, preferivelmente, quando estes grupos funcionais estão presentes, estão ligados à cadeia de polissiloxano através de grupos que bloqueiam as extremidades.
Os silicones funcionalizados adequados úteis para a formação de produtos de acordo com a invenção incluem polidialquilsiloxanos terminados com (trialcoxisilil)alquilo e polidialquilsiloxanos terminados com trialcoxisililo. Um membro útil deste grupo de compostos é o polidimetilsiloxano terminado com 3-(trietoxi-silil)propilo (aqui abreviado para TS-PDMS). 12 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ Ο polímero organometálico está presente no transportador em partículas em quantidades relativamente minoritárias, geralmente de cerca de 0,5 a cerca de 5% em peso do núcleo sólido. A presença do polímero organometálico, em particular um silicone, ligado ao núcleo sólido permite que materiais biologicamente activos sejam administrados a um hospedeiro, em particular por administração por mucosas, para conseguir uma resposta biológica aumentada a esse material, por exemplo, uma resposta imunitária aumentada a um antigénio, em comparação com a entrega do material pelo mesmo material em partículas sem o polímero organometálico a ele ligado, como observado dos dados aqui apresentados. O transportador em partículas aqui proporcionado pode ser formado de qualquer modo conveniente que permita a formação de partículas revestidas. É descrito abaixo um procedimento preferido com referência à Figura 1.
DESCRICÃO DA CONCRETIZAÇÃO PREFERIDA
Com referência à Figura 1, apresenta-se um método para a preparação de micropartículas de amido de acordo com uma concretização da presente invenção. As micropartículas de amido contendo antigénio são fabricadas por mistura do amido e do antigénio em solventes, formando uma emulsão em óleo, e depois dispersando a emulsão numa solução de acetona com agitação vigorosa e recolhendo as partículas formadas. 0 amido ou outro polissacárido é primeiro dissolvido num solvente adequado para o polissacárido. Para o amido, o solvente preferido é o dimetilsulfóxido, no qual o amido, por exemplo, amido "solúvel", é dissolvido a uma temperatura elevada, por exemplo, uma temperatura de cerca de 50° a cerca de 100°C, preferivelmente cerca de 75° a cerca de 90°C e depois é arrefecido a uma temperatura mais baixa, em particular a uma temperatura inferior a cerca de 35°C, sem a sua precipitação. Solventes polares alternativos que podem ser utilizados como solventes para o amido, incluem dimetilformamida bem como vários álcoois. A solução de amido é misturada com uma solução e/ou dispersão aquosas de um material proteínico, na concretização ilustrada, albumina sérica humana (HSA), que pode ser utilizada sozinha como um antigénio ou combinada com outro material antigénico, por exemplo, um lisado de células infectadas
84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 13 com vírus de herpes simples do tipo 2 (HSV-2) ou uma estirpe completa de influenza X31 (FluX31), caso em que a HSA actua também como uma proteína transportadora. A mistura da solução de amido e da composição de antigénio produz geralmente, por agitação, uma mistura altamente viscosa, que é então adicionada gota a 0°ta a ólen vegetal ou outro fluido imiscível com água que seja capaz de formar uma emulsão de água em óleo, incluindo óleos de silicone ou seus derivados ou suas misturas, com agitação vigorosa para promover a formação de uma emulsão de água em óleo, em que são dispersas gotículas da composição de material proteínico-amido no óleo vegetal. Este passo do processo envolve portanto a formação de uma emulsão em que a composição aquosa é a fase dispersa. O tamanho de partícula das gotículas líquidas, que determina o tamanho das micropartículas de transportador acabadas, é determinado pela razão volumétrica de fase aquosa para fase de óleo, pelo grau de agitação da emulsão de água em óleo e pode ser adicionalmente controlado com ultra-sons. O controlo adicional do tamanho das partículas pode ser conseguido empregando um tensioactivo no óleo, tais como tensioactivos não iónicos do tipo TWEEN ou SPAN. A emulsão de água em óleo pode então ser adicionada gota a gota a um solvente para o óleo e o meio aquoso contendo o amido, o material proteínico e o antigénio, para resultar na formação de micropartículas. No procedimento de acordo com a presente invenção, o solvente contém também um material de polímero de silicone que se pode ligar ao núcleo sólido produzido pelo solvente. Alternativamente, algum ou todo o óleo de silicone pode ser incluído no óleo vegetal ou o óleo de silicone pode substituir todo ou parte do óleo vegetal. (A Figura 1 ilustra também um procedimento alternativo, empregue nos exemplos abaixo para produzir o transportador em partículas sem o polímero de silicone, para as experiências de comparação). O solvente que pode ser empregue para esta dessecação e dissolução de óleo pode ser qualquer solvente orgânico miscível com as fases de óleo e água da emulsão e em que o amido e o material proteínico são substancialmente 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ insolúveis. Estes solventes incluem, mas não se lhes limitam, cetonas, tais como acetona e etilmetilcetona. 0 polímero de silicone dissolvido no solvente pode ser um polissiloxano funcionalizado, em particular funcionalizado nas extremidades, para permitir a ligação do polissiloxano ao núcleo sólido do material em partículas. Estes polissiloxano funcionalizado pode incluir polidialquilsiloxanos terminados com 3-(trialcoxi-silil)alquilo, em particular polidimetilpolissiloxano terminado com 3-trietoxi-silil)propilo (TS-PDMS).
0 material em partículas resultante pode ser recolhido do meio residual por qualquer meio conveniente, incluindo centrifugação, separado e seco. O material em partículas resultante deste procedimento está então numa forma adequada para formulação para administração do material biologicamente activo. É evidente para um perito na arte que as várias concretizações da presente invenção têm muitas aplicações nos campos da medicina e em particular na vacinação, no diagnóstico e no tratamento de infecções com patogénios incluindo bactérias e vírus. É apresentada em seguida uma discussão adicional não limitante destas utilizações.
Preparação e utilização de vacinas
Numa concretização, composições imunogénicas adequadas para serem utilizadas como, por exemplo, vacinas, podem ser preparadas a partir de micropartículas tais como as aqui reveladas. A composição imunogénica induz uma resposta imunitária pelo hospedeiro ao qual é administrada incluindo a produção de anticorpos pelo hospedeiro. A composição imunogénica pode ser preparada em formas injectáveis, tais como soluções ou emulsões líquidas. As micropartículas podem ser misturadas com transportadores fisiologicamente aceitáveis que sejam compatíveis com as micropartículas. Estes podem incluir água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol e suas combinações. A vacina pode ainda conter substâncias auxiliares tais como agentes molhantes e emulsionantes, agentes 15 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ tamponantes de ρΗ ou adjuvantes para aumentar mais a eficácia das vacinas. As vacinas podem ser administradas por injecção subcutânea ou intramuscular.
Alternativamente, e numa concretização preferida, as composições imunogénicas compreendendo micropartículas formadas de acordo com a presente invenção, podem ser entregues de uma maneira que evoque uma resposta imunitária em superfícies mucosas. Assim, a composição imunogénica pode ser administrada a superfícies mucosas, por exemplo, pelas vias nasal ou oral (intragástrica). Alternativamente, podem ser desejáveis outros modos de administração incluindo supositórios. Para supositórios, os aglutinantes e os transportadores podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicóis e triglicéridos. As formulações orais podem incluir incipientes normalmente empregues, tais como qualidades farmacêuticas de sacarina, celulose e carbonato de magnésio.
Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação sustentada ou pós e conter 1 a 95% das micropartículas da presente invenção. De modo a proteger as micropartículas e o material com actividade biológica contido no núcleo das micropartículas, da acidez gástrica quando administradas por via oral, uma preparação neutralizante de ácido (tal como uma preparação de bicarbonato de sódio) é portanto administrada com vantagem, simultânea ou imediatamente após a administração.
As vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal que seja terapeuticamente eficaz, protectora e imunogénica. A quantidade a administrar depende do indivíduo a tratar, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos, e se necessário, para produzir uma resposta imunitária mediada por células. As quantidades precisas de micropartículas e material com actividade biológica necessárias para administrar dependem da opinião do médico. Contudo, são rapidamente determináveis por um perito na arte gamas de dosagem adequadas e podem ser da ordem de microgramas a miligramas. Os regimes adequados para administração inicial e doses de reforço são também variáveis, mas podem incluir uma administração inicial seguida por administrações subsequentes. A dosagem da vacina pode também depender da via de administração e variará de acordo com o tamanho do hospedeiro. 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 16
EXEMPLOS A descrição anterior descreve de um modo geral a presente invenção. Pode-se obter uma mais completa compreensão com referência aos seguintes exemplos específicos. Estes exemplos são descritos somente para fins de ilustração e não se pretende com eles limitar o âmbito da invenção. Estão contempladas alterações em forma e substituição de equivalentes conforme as circunstâncias possam sugerir ou tornar expedito. Apesar de se terem aqui empregue termos específicos, esses termos devem ser entendidos num sentido descritivo e não para fins de limitação.
Exemplo 1
Este exemplo descreve a produção de micropartículas de amido contendo antigénio. É mostrado na Figura 1 um diagrama de fluxos que resume o processo de produção de micropartículas de amido aqui efectuado. Fabricaram-se micropartículas de amido contendo antigénio misturando o amido e o antigénio em solventes, formando uma emulsão em óleo e depois dispersando a emulsão numa solução de acetona com agitação vigorosa e recolhendo as partículas formadas. As micropartículas de amido foram fabricadas separadamente contendo os antigénios, albumina sérica humana (HSA), toxóide do tétano (TT) ovalbumina (OVA), Hin47, lisado de células infectadas com vírus do herpes simples do tipo 2 (HSV-2) e vírus da influenza completo. Para formar as micropartículas de amido contendo toxóide do tétano, Hin47, HSV-2 e vírus da influenza, incluiu-se HSA como proteína de "enchimento".
Especificamente, adicionou-se 1 g de amido de batata solúvel a 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) enquanto se agitava a mistura. Dissolveu-se o amido por aquecimento da mistura a 85°C durante 5 minutos. Prepararam-se as seguintes quantidades (Tabela 1) de antigénio para formar as micropartículas contendo antigénio indicadas: 04 007 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ
L 17 TABELA 1
Antigénio aprisionado nas micropartículas de amido Preparação de antigénio HSA 0,1 g de HSA dissolvido em 1,0 ml de água à temperatura ambiente. TT 70 mg de TT e 30 mg de HSA dissolvidos em 1,0 ml de H20 à temperatura ambiente. OVA 100 mg de OVA dissolvidos em 1,0 ml de H20 à temperatura ambiente. Hin47 10 mg de Hin47 e 90 mg de HSA dissolvidos em 1,0 ml de H20 à temperatura ambiente. Lisado de células infectadas com HSV-2/HSA 25 mg de HSV-2 em 0,5 ml de tampão e 75 mg de HSA em 0,5 ml de H20. InfluenzalHSfK 25 mg de Flu X31 em 1 ml de Tris 0,1M, EDTA 5 mM, pH 7,5, 75 mg de HSA em 0,375 ml de H20.
Quando a solução de amido arrefeceu .para uma temperatura inferior a 37°C, adicionou-se a preparação de antigénio indicada acima à solução arrefecida e agitou-se a mistura (500 rpm) à temperatura ambiente durante 20 minutos para formar uma mistura altamente viscosa. Esta mistura viscosa foi adicionada gota a gota a 30,0 ml de óleo vegetal e agitou-se vigorosamente (1500 rpm) durante 15 minutos à temperatura ambiente para produzir uma emulsão de água em óleo. Esta emulsão de água em óleo foi submetida a ultra-sons em gelo durante 60 segundos com agitação. Adicionou-se então a emulsão gota a gota com agitação (1000 rpm) a 400 ml de acetona contendo 0,125% v/v de Tween 80. As partículas resultantes, de aproximadamente 4,18±3 μ foram recolhidas por centrifugação, (200xg, 5 minutos), lavadas duas vezes com acetona e secas por exposição ao ar à temperatura ambiente durante 48 horas.
Exemplo 2
Este exemplo descreve o revestimento de micropartículas de amido contendo antigénio.
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EP 0 762 875/PT 18
As micropartículas formadas no Exemplo 1 podem ser revestidas com vários silicones, através de interacções de ligação na superfície, incluindo polidimetilsiloxanos (PDMS) com diferentes pesos moleculares e vários blocos nas extremidades. Um silicone convenientemente funcionalizado nas extremidades foi o polidimetilsiloxano terminado com 3-(trietoxi-silil)propilo (abreviado para TS-PDMS). ' 0 TS-PDMS foi sintetizado por adição hidro-sililativa de PDMS terminado com hidrogénio a aliltrietoxi-silano sob catálise de H2PtCI6 como se segue. A uma mistura de 17,0 ml de PDMS terminado com hidrogénio (Hiils, PDMSH, viscosidade de 1 000 cs) e 0,8 ml de aliltrietoxissilano (Aldrich) (razão molar dos grupos funcionais PDMSh:H2C = CH 1:3) foram adicionados 0,05 ml de uma solução de hidrato de hexacloroplatinato (IV) de hidrogénio (H2PtCl6) 0,1 M em i-propanol (Caledon) com agitação, sob a protecção de azoto a 0°C. Deixou-se a solução voltar à temperatura ambiente durante a noite. Evaporaram-se o i-propanol e o aliltrietoxi-silano que não reagiu sob pressão reduzida e elevou-se a temperatura até 140°C durante 6 horas até cessar o borbulhamento de gás a partir do fluido viscoso. Submeteu-se o resíduo a uma lavagem adicional com água destilada quatro vezes para remover quaisquer impurezas. Caracterizou-se o produto por ’Η RMN, 29Si RMN, GPC e IV. A reacção envolvida é ilustrada pela seguinte equação: \ /ΛΙ \ / l\ / Si
HrftGi \ / \ / \ / onde n é o número de grupos siloxano. A utilização de um silicone funcionalizado nas extremidades resultou na formação de ligações químicas à superfície do amido.
Para produzir partículas revestidas com TS-PDMS e possuindo antigénios aprisionados no seu interior, a emulsão de água em óleo submetida a ultra-sons produzida pelo procedimento descrito anteriormente no Exemplo 1 foi 19 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ adicionada, gota a gota, com agitação (1 000 rpm) a 400 ml de acetona contendo 0,125% v/v de TS-PDMS (1 000 c.s.) em vez de Tween 80. As partículas revestidas resultantes foram recolhidas e secas como descrito no Exemplo 1.
Exemplo 3
Este exemplo descreve uma análise das micropartículas de amido contendo antigénio.
As distribuições de tamanhos das micropartículas de amido contendo antigénio preparadas como descrito nos exemplos 1 e 2 foram obtidas por microscopia electrónica de varrimento e citometria de fluxo utilizando padrões de micropartículas de poliestireno. A Figura 2 apresenta uma análise por microscopia electrónica de varrimento de micropartículas contendo HSA que foram revestidas com TS-PDMS ou não foram revestidas. O tamanho das micropartículas variava de 1 a 100 μιη com um diâmetro médio de 4 a 5 pm, como determinado por citometria de fluxo (Figura 3). A eficiência da incorporação de antigénio nas micropartículas de amido estava entre 70 e 90%. O teor de antigénio das micropartículas carregadas de HSA (aqui denominada a "carga do núcleo") foi determinado por incorporação de um traçador 125I-HSA de actividade específica conhecida na preparação de antigénio, antes da formação das micropartículas. Verificou-se que a carga do núcleo proteico de HSA nas micropartículas de amido era de cerca de 5 a 6% em peso. A carga do núcleo de TT nas micropartículas foi estimada por ELISA como sendo 0,34% p/p com uma carga do núcleo proteico total de 14,1 % p/p. A carga do núcleo de OVA nas micropartículas foi estimada como sendo 7,75% p/p utilizando um espectrofotómetro a D028o· A carga do núcleo de Hin47 nas micropartículas foi estimada por ELISA como sendo de 0,03% p/p com uma carga do núcleo proteico total de 14% p/p. A "carga do núcleo" das micropartículas contendo vírus da influenza completo foi assim estimada através da libertação de vírus por degradação das micropartículas por hidrólise ácida com HCI ou hidrólise enzimática com saliva humana. A hidrólise enzimática das micropartículas com saliva humana era originalmente o método preferido uma vez que não se previa que alterasse 20 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ apreciavelmente a integridade antigénica das proteínas virais. As micropartículas foram digeridas com 250 μΙ de saliva clarificada por centrifugação durante a noite a 37°C. As suspensões foram centrifugadas a 5000 xg durante 10 minutos e diluíram-se os sobrenadantes 1:10 com solução salina tamponada com base Tris (TBS, pH 7,2) contendo NaN3 a 0,1% e armazenadas a 4°C até serem analisadas por SDS-PAGE. A "carga do núcleo" foi determinada por hidrólise ácida das micropartículas. Assim, as micropartículas foram incubadas em HCI 0,1 M durante 24 horas a 37°C. Os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação a 3000 rpm e filtrados através de um filtro de 0,45 μ. A solução foi neutralizada com NaOH 1 Μ. A proteína libertada das micropartículas hidrolisadas com ácido foi detectada utilizando um ELISA.
Estimou-se que as micropartículas de Flu X31/HSA continham cerca de 0,3 a 0,5% de Flu X31 e cerca de 5 a 6% de HSA (p/p). Apesar de a HSA pode ser incorporada nas micropartículas em preferência a Flu X31, as tentativas para fabricar micropartículas revestidas sem proteína não foram bem sucedidas.
Exemplo 4
Este exemplo descreve os efeitos nos antigénios do seu aprisionamento nas micropartículas de amido.
As amostras ao longo do tempo dos estudos de libertação de antigénio descritos para micropartículas contendo HSA no Exemplo 3 foram também analisadas por análise de Western (imunotransferência) utilizando um anti-soro policlonal específico para HSA. Para a análise por imunodetecção da HSA libertada, o gel foi equilibrado em tampão de transferência (glicina 0,2 M, metanol a 15%, Base Tris 0,025 M, pH 8,3) durante 15 minutos juntamente com membranas de nitrocelulose (NC) e papel de filtro, ambos cortados do mesmo tamanho que o gel. O aparelho de imunotransferência foi então colocado no dispositivo de transferência e realizou-se a transferência electroforética durante a noite a 30 volt. Após a transferência, a membrana de NC foi incubada com agitação em 100 ml de tampão de bloqueio (leite em pó magro a 5% p/v em PBS) durante 2 horas. A membrana de NC foi então incubada com 100 ml de uma diluição de 1:500 de anti-HSA de cabra conjugado com fosfatase 21 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ alcalina em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente, numa plataforma oscilatória. A membrana de NC foi lavada 3 vezes (10 minutos cada) com PBS, e as proteínas foram visualizadas por incubação da membrana com 30 ml de tampão de revelação (Base Tris 100 mM, NaCI 100 mM, MgCI2 5 mM, pH 9,5) contendo 200 μΙ de 50 mg/ml de azul de nitrotetrazólio e 100μΙ de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato a 50 mg/ml, durante 60 minutos. A membrana foi enxaguada 3 vezes com H20 e seca ao ar. Os resultados da análise de imunotransferência estão apresentados na Figura 4. Esta análise mostrou que a HSA libertada para os sobrenadantes por tratamento com HCI ou incubação das micropartículas em PBS era detectável por um anti-soro policlonal específico para HSA. A HSA libertada das micropartículas revestidas com TS-PDMS e não revestidas não foi fragmentada pelo processo de fabrico e não foi alterada de modo a impedir a sua detecção por anticorpos específicos para HSA.
Exemplo 5
Este exemplo descreve a imunogenicidade de HSA aprisionada em micropartículas em ratinhos imunizados por via intraperitoneal.
Para examinar a imunogenicidade da HSA aprisionada nas micropartículas de amido formadas de acordo com a presente invenção, imunizaram-se por via intraperitoneal (IP) grupos de seis ratinhos BALB/c fêmea de 6 a 8 semanas de idade (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA), com as seguintes quantidades de antigénio em 250 μΙ de PBS (pH 7,4) nos dias 0, 7 e 14: 2 mg de micropartículas revestidas com TS-PDMS preparadas como descrito nos exemplos 1 e 2 contendo 100pg de HSA; e 2 mg de micropartículas não revestidas contendo 100 pg de HSA.
Os ratinhos não apresentaram grandes patologias ou alterações comportamentais após receberem as micropartículas revestidas com TS-PDMS ou não revestidas. Os soros foram obtidos nos dias +21, +35, +49, +63 e + 84 e toram avaliados quanto à presença de anticorpos IgG anti-HSA por ELISA específico para o antigénio. Todas as amostras foram analisadas em duplicado. Os poços da placa de microtítulo foram incubados durante a noite a 4°C com 100 μΙ de HSA a 10 pg/ml em TBS. Lavaram-se as placas com tampão Tris-T (Tween 20 a 0.05% em Base Tris 0,02 M, pH 7,4, contendo NaCI
84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 22 0,15 Μ e KCI 0,005 Μ). Incubaram-se os poços com 200 μΙ de gelatina a 0,1% em solução salina tamponada com Tris 0,02 M (TBS), pH 7,4 (operacionalmente definida como tampão de bloqueio). Após lavagem com Tris-T, incubaram-se as placas durante 2 h a 37°C com 100 μΙ de amostra diluída em série em tampão de bloqueio. Lavaram-se os poços com Tris-T e adicionaram-se a cada poço 100 μΙ de IgG de cabra anti-ratinho conjugada com fosfatase alcalina em tampão de bloqueio. Após 2 horas de incubação a 37°C, lavaram-se os poços com Tris-T e 100μΙ de tampão de dietanolamina 1,0 M, pH 9,8, contendo MgCI2 0,05 M e adicionou-se 1,0 mg/ml de p-nitrofenilfosfato a cada poço. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, a densidade óptica do fluido em cada poço, foi determinada a 405 nm utilizando um leitor de placas de microtítulo. Utilizou-se um banco de soros de ratinho normais para estabelecer a linha de base dos valores de densidade óptica no ensaio. Utilizou-se anti-soro para HSA de ratinho hiperimune como controlo positivo.
Os títulos de anticorpo sérico após a imunização são apresentados na Figura 5. Os resultados das imunizações com um antigénio de teste conveniente (HSA) indicam que o antigénio apresentado ao sistema imunitário aprisionado nas micropartículas de amido com TS-PDMS é substancialmente mais imunogénico do que o antigénio solúvel ou o antigénio aprisionado em micropartículas de amido não revestidas.
Exemplo 6
Este exemplo descreve a imunogenicidade de HSA aprisionado em micropartículas de amido em ratinhos imunizados por via intragástrica.
Para examinar a imunogenicidade de HSA aprisionado nas micropartículas de amido formadas de acordo com a presente invenção, imunizaram-se por via intragástrica (IG) grupos de seis ratinhos BALB/c fêmea de 6 a δ semanas de idade, com micropartículas contendo HSA, preparadas como descrito no Exemplo 1 (não revestidas) e 2 (revestidas) anteriores, (Tabela II) nos dias 0, + 7 e +14:
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TABELA II
Grupo: Tído de microDartículas1 mg de ua de HSA microDartículas A Revestida com TS-PDMS 15 750 B Revestida com TS-PDMS 10 500 C Revestida com TS-PDMS 3 150 D Revestida com TS-PDMS 1.5 75 E Revestida com TS-PDMS 1 50 F Não revestida 15 750 G Não revestida 10 500 H Não revestida 3 150 I Não revestida 1,5 75 J Não revestida 1 50 K nenhuma 0 0 N Nenhuma - - 0 Nenhuma - 750 P Nenhuma - 500 Q Nenhuma - 150 R Nenhuma - 75 S nenhuma - 50 1 mg de micropartículas revestidas com TS-PDMS contém 50 pg de HSA.
Examinaram-se soros e lavagens intestinais quanto à presença de anticorpos específicos para HSA. Para detectar e quantificar slgA anti-HSA no lúmen intestinal, os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical, os seus intestinos delgados foram removidos e examinados quanto à presença de anticorpos específicos para o antigénio. Destacaram-se os intestinos delgados individuais do esfíncter pilórico até ao ceco e everteram-se sobre tubos capilares. Incubaram-se os intestinos evertidos em 5 ml de solução de inibidor enzimático gelado (NaCI 0,15 M, Na2HP04 0,01 M, EDTA 0,005 M, PMSF 0,002 M, Aprotinina 0,05 U/ml e NaN3 a 0,02% v/v) durante 4 horas. Removeram-se os intestinos e clarificaram-se os sobrcnadantes por centrifugação (1000 xg, 20 minutos) e armazenaram-se a 0°C até ao ensaio. Os títulos de slgA anti-HSA nas amostras foram determinados por ELISA específico para HSA como descrito acima mas utilizou-se um anti-soro de IgA de cabra anti-ratinho em vez do anti-soro de IgG de cabra anti-ratinho.
84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ A percentagem de ratinhos que respondiam imunologicamente à imunização intragástrica está apresentada na Figura 6. Estes resultados mostram que há uma proporção muito superior de animais que respondem imunologicamente a um antigénio de teste (HSA) quando administrado utilizando micropartículas revestidas com PDMS em comparação com micropartículas não revestidas em doses fisiologicamente relevantes, por exemplo, 75 pg ou menos.
Os títulos de anticorpo específico para HSA, IgG sérico, após a imunização IG estão apresentados nas figuras 7 (50 pg de HSA) e 8 (75 pg de HSA). Estes resultados indicam que um antigénio de teste (HSA) incorporado em micropartículas revestidas com PDMS é substancialmente mais imunogénico do que antigénio incorporado em partículas não revestidas quando entregue pela via intragástrica.
Exemplo 7
Repetiu-se o procedimento do Exemplo 6 imunizando intragastricamente grupos de 15 ratinhos com 50 pg e 10pg de HSA aminoencapsulada, preparada como descrito no Exemplo 1 (não revestidas) e no Exemplo 2 (revestidas) anteriores. Os animais foram imunizados nos dias 0, 7, 14 e 70 com as microcápsulas contendo HSA (MP). Examinaram-se os soros quanto à presença de anticorpos específicos para HSA nos dias 35, 49, 63 e 77. Os resultados quanto a respostas de IgG (Painéis A e C) e IgA (Painéis B e D) são apresentados na Figura 4. A Figura 4 mostra que, em vários tempos após a imunização IG terciária, os títulos séricos de IgG anti-HSA induzidos pela administração IG de 50 pg (Painéis A e B) ou 10 pg (Painel C) de MP enxertadas com TS-PDMS contendo HSA (barras a cheio) eram significativamente maiores quando comparados com respostas de IgG induzidas após imunização com MP não enxertadas (barras a tracejado) (p<0,005). Os IgG séricos induzidos por imunização IG eram quase exclusivamente IgG, sendo muito poucos os anticorpos lgG2a ou lgG2b e sem igG3.
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Adicionalmente, a administração IG de 50 pg (Painel B) ou 10 pg (painel D) de HSA em MP enxertadas com TS-PDMS, estimulou respostas de IgA sérico anti-HSA mais fortes, sendo as respostas de IgA sérico significativamente maiores quando os animais foram imunizados com 50 pg de MP não enxertadas contendo HSA (p< 0,001). Em todos os momentos, os animais imunizados IG com HSA solúvel não produziram qualquer IgG ou IgA séricos anti-HSA detentávfiis.
Após um reforço IG no dia 70, os títulos de IgG sérico anti-HSA induzidos com 50 pg de HSA contidos em MP enxertadas com TS-PDMS foram significativamente aumentados em relação aos títulos antes do reforço (p<0,001). Estes resultados demonstram a eficácia de imunização IG com MP com TS-PDMS na estimulação de vigorosa resposta de anticorpos em circulação.
Em contraste com a falha da HSA solúvel para provocar uma resposta de IgA apreciável nas secreções intestinais quando administrada IG, a entrega de iguais quantidades de HSA aprisionada em MP não enxertadas ou enxertadas com TS-PDMS resultou em respostas de IgA específicos para HSA em secreções intestinais (p>0,001).
Exemplo 8
Este exemplo descreve a imunogenicidade de antigénios de vírus de herpes simples do tipo 2 (HSV-2), aprisionados em micropartículas, em ratinhos imunizados pelas vias intraperitoneal e intragástrica.
Para examinar a estimulação de respostas imunitárias específicas para o vírus por antigénios virais aprisionados em micropartículas, os ratinhos foram imunizados IP e IG com lisados de células infectadas com HSV-2 no interior de micropartículas revestidas com TS-PDMS contendo HSA como uma proteína transportadora. Imunizaram-se grupos de 5 ratinhos BALB/c fêmea, de 6-8 semanas de idade, por via intraperitoneal (IP) e intragástrica (IG) com os seguintes materiais nos dias O, + 7 e +14: 1. 125 pg de proteína de lisado de células infectadas com HSV-2 em 250 μΙ de PBS (IP) ou 500 μΙ de NaHC03 (IG). 04 007 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 26
2. 16 mg de micropartículas revestidas com TS-PDMS contendo cerca de 125 pg de lisado de células infectadas com HSV-2. 3. 8 mg de micropartículas revestidas com TS-PDMS contendo cerca de 63 pg de proteína de lisado de células infectadas com HSV-2.
Examinaram-se os soros quanto à presença de anticorpos IgG específicos para HSV-2 e demonstrou-se que as proteínas virais podem ser aprisionadas no interior de micropartículas de amido revestidas com TS-PDMS sem redução de imunogenicidade.
Exemplo 9
Este exemplo descreve a imunogenicidade de vírus da influenza completo aprisionado em micropartículas, em ratinhos imunizados IP.
Para examinar a imunogenicidade de micropartículas revestidas com TS-PDMS com FluX31/HSA, preparadas como descrito no Exemplo 2, imunizaram-se grupos de seis ratinhos Balb/c por via intraperitoneal (IP) com os seguintes materiais: 1. 5 pg de Flu X31 e 15 pg de HSA na forma solúvel. 2. 5 pg de Flu X31 e 15 pg de HSA misturados com micropartículas revestidas com TS-PDMS. 3. Micropartículas revestidas com TS-PDMS, com Flu X31/HSA, contendo 5 pg de Flu X31 e 1 5 pg de HSA.
Os ratinhos receberam uma única imunização IP no dia 0 e foram sangrados nos dias +20 e +35. Ensaiaram-se os soros obtidos quanto a anticorpos IgG anti-Flu X31 e anti-HSA por ELISA específicos para os antigénios. 0 ELISA anti-Flu X31 foi realizado como descrito acima mas as placas foram revestidas durante a noite a 4°C com 100 pl de vírus da influenza completo a 5 pg por ml em vez da HSA e utilizou-se um anticorpo anti-Flu como controlo positivo. Estes títulos de anticorpos estão apresentados nas figuras 10 e 11 para ratinhos imunizados com Flu X31 e HSA, respectivamente.
84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 27
Como descrito no Exemplo 5 anterior, a HSA sozinha e a HSA misturada com micropartículas revestidas com TS-PDMS foram pobremente imunogénicas. Em contraste, a HSA aprisionada em micropartículas revestidas com TS-DMS induziu altos títulos de anticorpos.
Ratinhos imunizados IP com todas as três preparações apresentaram respostas de anticorpos IgG séricos anti-Flu X31 semelhantes no dia +20. No dia +35 o título de anticorpo IgG anti-Flu X31 no soro de ratinhos imunizados IP com Flu X31/HSA incorporado em micropartículas revestidas com TS-PDMS foi cerca de 10 vezes superior aos títulos obtidos após imunização com Flu X31 solúvel ou Flu X31 misturado com micropartículas revestidas com TS-PDMS.
Os estudos apresentados neste exemplo demonstram que podem tornar-se antigénios virais de vírus da influenza mais imunogénicos e induzir elevados níveis de anticorpos IgG séricos, quando os antigénios são aprisionados em micropartículas formadas de acordo com a presente invenção.
Exemplo 10
Este exemplo descreve a imunogenicidade de vírus da influenza completo aprisionado em micropartículas, em ratinhos imunizados IN.
Para examinar a imunogenicidade de micropartículas revestidas com TS-DMS com FluX31/HSA, preparadas como descrito no Exemplo 2, imunizaram-se grupos de seis ratinhos Balb/c por via intranasal (IN) com os seguintes materiais: 1. 10 pg de Flu X31 e 30 pg de HSA na forma solúvel. 2. Micropartículas revestidas com TS-PDMS com FluX31/HSA contendo 10 pg de Flu X31 e 30 pg de HSA.
Imunizaram-se ratinhos IN nos dias 0, +7 e +14 e sangraram-se nos dias +20 e +35. Ensaiaram-se os soros obtidos quanto a anticorpos IgG anti-Flu x31 e anti-HSA por ELISA específico para o antigénio como descrito acima. Estes títulos de anticorpos séricos são apresentados nas figuras 12 e 13 para a HSA e Flu X31, respectivamente. 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 28
Os ratinhos imunizados IN com antigénio solúvel tinham níveis indetectáveis de anticorpos IgG séricos específicos para HSA. Os ratinhos imunizados com micropartículas revestidas com TS-PDMS com FluX31/HSA apresentaram uma resposta de anticorpos anti-HSA séricos.
Os títulos de anticorpo anti-Flu X31 em ratinhos imunizados IN estão aprpspntaHos na Figura 13 e mostram que os títulos mais altos foram obtidos após imunização com micropartículas revestidas com TS-PDMS com Flu X31/HSA.
Os resultados das imunizações IN descritas neste exemplo mostram que a imunogenicidade de um antigénio (HSA) e de uma mistura de antigénios de vírus da influenza pode ser aumentada por aprisionamento em micropartículas formadas de acordo com a presente invenção. Em particular, o antigénio HSA, normalmente não imunogénico, após incorporação em micropartículas tornou-se imunogénico.
Exemplo 11
Este exemplo descreve a imunogenicidade de HSV-2 aprisionado em micropartículas, em ratinhos imunizados intragastricamente (IG).
Fabricaram-se micropartículas (MP) não enxertadas (NE) e enxertadas com TS-PDMS (CT) de modo a conterem lisado de células VERO infectadas com HSV-2 e HSA, como descrito nos exemplos 1 e 2. No primeiro conjunto de experiências, utilizando os dados de carga do núcleo determinados no Exemplo 2, imunizaram-se grupos de 10 ratinhos, intragastricamente (IG), nos dias 0, 7, 14 e 77, com 25 pg de lisado de células infectadas com HSV-2 aprisionado em MP enxertadas e não enxertadas (MP HSV-2 CT e MP HSV-2 NE, respectivamente), 25 pg de lisado de células infectadas com HSV-2 suspenso em tampão (HSV-2 solúvel) ou só tampão (Tampão). Sangraram-se os ratinhos no dia 77 através do plexo rectro-orbital e ensaiaram-se os seus soros quanto à presença de IgG específico para HSV-2. Os resultados obtidos são expressos como o recíproco dos títulos no ponto final e estão ilustrados na Figura 14. ("Exp. 1").
84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 29
Como se pode observar nesta figura, o lisado de células infectadas com HSV-2 em MP CT foi significativamente mais proficiente na estimulação de anticorpos IgG específicos para HSV-2 do que as MP NE com HSV-2 aprisionado ou HSV-2 solúvel.
Num segundo conjunto de experiências, imunizaram-se grupos de 10 ratinhos intraperitonealmente (IP) nos dias 0, 7 e 14, com uma das seguintes preparações: 5 pg de lisado de células infectadas com HSV-2 aprisionado em MP CT (MP HSV-2 CT) - 5 pg de HSV-2 solúvel dissolvido em tampão (HSV-2 solúvel) - 5 pg de HSV-2 solúvel dissolvido em tampão e misturado com MP CT contendo HSA (HSV-2 sol. + MP) 1x105 unidades formadora de placas (PFU) de ATK-HSV-2 (um mutante de HSV-2 não letal, atenuado, que é altamente imunogénico) (TK-HSV-2) 1x105 PFU de ATK-HSV-2 misturado com MP CT contendo HSA (TK-HSV-2+ MP).
No dia 21, sangraram-se os ratinhos e ensaiaram-se os seus soros quanto a anticorpos IgG específicos para HSV-2. Os resultados obtidos são expressos como o recíproco dos títulos no ponto final e estão ilustrados na Figura 15 ("Exp. 2").
Como se pode observar destes resultados, as MP HSV-2 CT induziram as mais fortes respostas de anticorpos IgG específicos para HSV-2, maiores do que as estimuladas pelo "padrão de ouro", ATK-HSV-2. Misturando MP HSA CT e ATK-HSV-2 ou HSV-2 solúvel, nem aumentou nem diminuiu a resposta de anticorpos observada, demonstrando que o efeito de imunopotenciação de HSV-2 encapsulado requer aprisionamento de antigénio no interior das partículas.
Exemplo 12
Este exemplo descreve a imunogenicidade de Hin47 aprisionado em micropartículas, em ratinhos imunizados intraperitonealmente (IP). 30 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ
Prepararam-se micropartículas contendo antigénio Hin47 como descrito no Exemplo 2. Utilizando os dados de carga do núcleo de Hin47 determinados no Exemplo 2, administraram-se injecções intraperitoneais a grupos de 6 a 10 ratinhos, de 3 pg por ratinho nos dias 0, 7 e 14. Sangraram-se os ratinhos através do plexo rectro-orbital no dia 5 e ensaiaram-se os seus soros quanto a IgG anti-Hin47. Os resultados obtidos estão apresentados na Figura 13.
Como se pode observar na Figura 16, o Hin47 solúvel (3 pg) em tampão (Hin47 sol.) induziu respostas de IgG de aproximadamente 1000 unidades. O Hin47 (3 pg) em conjunção com FCA produziu respostas de IgG de aproximadamente 18 000 unidades. Em comparação, o Hin47 em micropartículas enxertadas com silicone (MP Hin47 Ex. 1 e MP Hin47 Ex. 2) induziu respostas de cerca de 15 000 unidades, i.e., cerca de 84% da que foi observada com FCA.
Noutra experiência, as micropartículas de Hin47 foram extraídas com tampão in vitro durante 18 horas a 37°C, clarificadas por centrifugação e filtração e administraram-se IP 3 pg de Hin47 contido no extracto. Como observado na Figura 16, esta preparação (MP Hin47 EL) induziu respostas de IgG de aproximadamente 9 000 unidades.
SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO
Em resumo desta descrição, a presente invenção proporciona um transportador em partículas para um agente, em particular um agente com actividade biológica, compreendendo um núcleo de polissacárido e material proteínico e um polímero organometálico ligado ao núcleo. Os transportadores em partículas na forma de micropartículas são capazes de entregar eficientemente agentes às células do sistema imunitário de um indivíduo após administração por mucosas ou parentérica para produzir uma resposta imunitária. São possíveis modificações dentro do âmbito da presente invenção.
Por McMASTER UNIVERSITY - O AGENTE OFICIAL -
O ADJUfeJTO
EHG.· ÀNTÓHIO JOÃO DA CUNHA FERREI RA Ag. Of. Pr. Ind.
Rua das Flores, 74 - 4/
1BQO LISBOA
Claims (33)
- 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Transportador em partículas para entrega de materiais com actividade biológica a um hospedeiro, caracterizado por: um núcleo sólido compreendendo um polissacárido e um material proteínico, e um polímero organometálion ligado ao núcleo.
- 2. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 1 em que o polissacárido é seleccionado de entre o grupo que consiste em dextrano, amido, celulose, seus derivados e misturas.
- 3. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 1 em que o polissacárido é um amido solúvel.
- 4. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o material proteínico é um material com actividade biológica.
- 5. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido núcleo contém um material com actividade biológica.
- 6. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 5 em que o material com actividade biológica é seleccionado de entre o grupo que consiste em proteínas, péptidos, antigénios, bactérias, lisados bacterianos, vírus, lisados de células infectadas com vírus, anticorpos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, lípidos, glicolípidos, haptenos, materiais farmacologicamente activos e suas combinações, seus derivados e suas misturas.
- 7. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que o material com actividade biológica é imunogénico.
- 8. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, em que o material com actividade biológica compreende albumina sérica humana, lisado de células infectadas com vírus de herpes84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 2/5 simples do tipo 2, um vírus da influenza ou uma proteína virai do vírus da inf/uenza.
- 9. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o referido material biologicamente activo está presente numa quantidade de 0,5 a 30% em peso do núcleo.
- 10. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 9 em que o referido material biologicamente activo compreende cerca de 0,5 a cerca de 5,0% do núcleo.
- 11. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o polímero organometálico é derivado de um silicone funcionalizado.
- 12. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 11 em que o silicone funcionalizado compreende um silicone substituído nas extremidades.
- 13. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 12 em que o silicone substituído nas extremidades é polidialquilsiloxano terminado com (trialcoxi-silil)alquilo.
- 14. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 13 em que o silicone substituído nas extremidades é polidimetilsiloxano terminado com 3-(trietoxi-silil)propilo.
- 15. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, em que o referido silicone tem um peso molecular de 400 a 1 000 000 Dalton.
- 16. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 15 em que o referido siloxano tem um peso molecular de 700 a 60 000 Dalton.
- 17. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o referido núcleo sólido tem um tamanho de partícula de 10 nm a 50 pm compreendendo um polissacárido e até 33% em84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ 3/5 peso de um material proteínico, e o referido polímero organometálico está presente numa quantidade de 0,5 a 5% em peso do referido núcleo, ligados ao núcleo.
- 18. Transportador em partículas de acordo com a reivindicação 17 em que o referido material proteínico compreende de 0,5 a 10% em peso do referido núrlen.
- 19. Transportador em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, o qual tem um tamanho de partícula de 1 a 10 pm.
- 20. Método para a produção de um transportador em partículas para a entrega de materiais com actividade biológica a um hospedeiro, caracterizado por: (a) formação de uma composição aquosa compreendendo um polissacárido dissolvido e um material proteínico disperso ou dissolvido; (b) formação de uma emulsão em que a composição aquosa está na fase dispersa; (c) formação, a partir da referida emulsão, de um transportador em partículas compreendendo um núcleo do referido polissacárido e material proteínico possuindo a si ligado um polímero organometálico; e (d) recolha do transportador em partículas assim formado.
- 21. Método de acordo com a reivindicação 21 em que a referida composição aquosa é formada por dissolução do referido polissacárido num solvente polar para formar uma solução, dissolução ou dispersão do referido material proteínico num solvente aquoso para formar uma solução ou dispersão, e mistura dos meios resultantes.
- 22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o referido polissacárido é amido e o referido solvente para o referido amido é dimetilsulfóxido.
- 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, em que a referida emulsão é formada por dispersão da referida composição aquosa num fluido imiscível com água capaz de formar uma emulsão de água em óleo. 84 807 ΕΡ 0 762 875/ΡΤ4/5
- 24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o referido fluido imiscível com água compreende um óleo vegetal.
- 25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou 24, em que a referida emulsão de água em óleo também contém um tensioactivo.
- 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, em que o referido transportador em partículas é formado por adição da referida emulsão de água em óleo, gota a gota, a um solvente para água e o referido fluido imiscível com água contendo um polímero organometálico funcionalizado.
- 27. Método de acordo com a reivindicação 26 em que o referido polímero organometálico funcionalizado compreende um silicone substituído nas extremidades.
- 28. Método de acordo com a reivindicação 26 ou 27, em que o referido solvente compreende uma cetona.
- 29. Método de acordo com a reivindicação 28 em que a referida cetona é acetona.
- 30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 29 que é realizado sob condições que não conduzem a desnaturação do referido material proteínico.
- 31. Composição imunogénica formulada para administração por mucosas ou parentérica, compreendendo o transportador em partículas de acordo com a reivindicação 7 ou 8 e um seu transportador fisiologicamente aceitável.
- 32. Transportador em partículas compreendendo um núcleo sólido compreendendo um polissacárido e um material proteínico, e um polímero organometálico ligado ao núcleo, para utilização na entrega de materiais com actividade biológica num hospedeiro. ΕΡ Ο 762 875/ΡΤ 5/5
- 33. Utilização de um transportador em partículas compreendendo um núcleo sólido compreendendo um polissacárido, um material proteínico e um material com actividade biológica, e um polímero organometálico ligado ao núcleo, no fabrico de uma composição imunogénica para entrega do material com actividade biológica a um hospedeiro. Lisboa, Por McMASTER UNIVERSITY - 0 AGENTE OFICIAL - O ADMJhJT%ENG.* ANTÓNIO JOÀ® DA CUNHA FERREIRA Âg. O/. Pr. Ind. Rue des Flores, 74 - 4.® 1ΘΘΟ LISBOA
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