JP3428972B2 - 生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製法及び粒子担体の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術分野】本発明は、生物活性物質を送
達するための生体内分解性マイクロパーティクル（マイ
クロ粒子）に関し、具体的には、特定の細胞型に対して
標的指向性であるようなマイクロパーティクルに関す
る。本出願は、１９９６年１２月２０日提出の係属出願
中の米国特許出願第０８／７７０，０５０号の一部継続
出願である。

【従来の技術】長年、ヒトおよび動物を様々な感染症か
ら守るためにワクチンが用いられてきた。このような従
来型のワクチンは、弱毒化病原体（例えば、ポリオウイ
ルス）、不活化病原体（例えば、百日咳菌）、または病
原体の免疫原性成分（例えば、ジフテリアトキソイドお
よびＢ型肝炎表面抗原）から構成される。免疫原性が高
く、単独で防御免疫応答を引き起こすことができる抗原
もある。しかし、他の抗原は、防御免疫応答を誘導でき
ないか、弱い免疫応答しか誘導しない。抗原をアジュバ
ントと同時投与すると、弱い免疫原性抗原の免疫応答を
著しく促進することができる。アジュバントは、抗原の
免疫原性を促進するが、それ自体が免疫原性であるとは
限らない。アジュバントは、抗原を投与部位近傍の局所
に維持することにより、免疫システムの細胞に対する、
ゆっくりと持続する抗原の放出を容易にする貯蔵効果を
生み出すことができる。アジュバントは、抗原貯蔵に免
疫システムの細胞を引きつけ、これらの細胞を刺激して
免疫応答を引き起こすことができる。アジュバントは、
非経口的に送達された抗原に対する免疫応答を促進する
ことが確認されている。通常、アジュバントは、ワクチ
ン製剤中で抗原とともに用いられることにより、非経口
的免疫感作（筋肉内または皮下）による全身的免疫誘導
が得られる。このアプローチは、傷害を受けた皮膚（す
なわち、破傷風）を経由して体に接近する感染性試剤に
適しているが、この方法で投与される多くのアジュバン
トの副作用および関連する毒性に起因して遭遇する問題
点がある。アルミニウム塩（リン酸アルミニウムまたは
水酸化アルミニウム）から製剤化されたワクチンだけ
が、ヒトおよび家畜の予防接種に日常的に用いられてい
る。しかし、これらのアジュバントでさえ、すべての抗
原とともに用いるのに適しているわけではなく、注射部
位に刺激を引き起こすこともある。注射部位において抗
原の免疫原性を安全に促進するアジュバントの開発が必
要なことは明らかである。用いられる抗原の性質に特有
の他の問題がある。例えば、従来型の不活化ワクチンの
大部分は、効果的な免疫感作に複数回の投与を必要とす
る。弱毒生ワクチンおよび多くの液状不活化ワクチン
は、限定された保存条件が必要であるという欠点を持
ち、不活化を受けやすい（例えば、熱感受性）。アジュ
バント不適合性、ｐＨ、緩衝方法および塩の存在に起因
して、単一剤形でワクチンを混合することに関連する問
題もある。粘膜免疫は、主に腸内、気管支または鼻洗浄
液およびその他の外分泌液における分泌型免疫グロブリ
ン（ｓＩｇＡ）の誘導により、誘導される。例えば、非
経口のコレラワクチンでは限られた防御作用しか得られ
ないが、一方、最近開発された経口型は非常に有効であ
ることが分かっている（ｒｅｆ．１−本明細書を通じ、
種々の参考文献を括弧内に引用し、本発明が関わる技術
分野の状況をさらに詳しく説明する。各引用の一覧情報
は、本明細書の末尾、請求範囲の直前に示す。これらの
参考文献の開示を、参照として本明細書中に援用す
る）。ヒト志願者による研究から、インフルエンザワク
チン経口投与が、鼻粘膜分泌物における分泌型抗インフ
ルエンザ抗体の誘導に有効であることがわかり、このよ
うな摂取ワクチンに対しアジュバントとして有効な物質
が確認されている。しかし、これらアジュバントの大部
分は、摂取ワクチンに対し免疫応答を改善することに関
しては、比較的無力である。最近、これらのアジュバン
トの大部分が、安全で、経口的胃腸管、鼻咽頭−気道お
よび生殖道を経由または眼窩内に投与された抗原に対
し、ヒトおよび動物において免疫応答を促進するために
有効であることが証明された。しかし、これらの経路を
経由する抗原の投与は、通常、免疫応答を引き起こすに
は無効である。前述の例は、これらの免疫感作法の潜在
力を示しているが、これらの経路によって使用するため
のワクチン製剤の開発は、様々な理由から遅々としてい
た。粘膜表面において免疫感作することができないこと
は、通常、次のように考えられているからである。 （ｉ）粘膜表面へ移行する間に存在する酸および／また
はタンパク質分解酵素による抗原の分解、（ｉｉ）粘膜
上皮に存在する分泌物による抗原の分解、（ｉｉｉ）粘
膜上皮からの限られた吸収、（ｉｖ）免疫応答を誘導す
るために必要な濃度以下に抗原が希釈されること、
（ｖ）無効なアジュバントおよび／または送達システ
ム。非経口ワクチン製剤におけるアジュバントの使用、
および粘膜部位へワクチンを送達するための適当なシス
テムの欠如に関連する問題は、様々な経路により投与し
た場合に有効であって関連する毒性の問題または副作用
のない新たな手法の必要性を暗示している。時間とコス
トを低減し、ヒトの医療において、入手法が制限される
発展途上国では極めて重要である患者のコンプライアン
スを増す利点もあることから、ヒトおよび動物に単一剤
形でワクチン送達を可能にすることも望まれる。これ
は、これらの国々の幼児にまさに当てはまることであ
る。投与された抗原に対する免疫応答を増すため、坦体
を用いて抗原の分解を防ぎ、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるこ
れらの物質の取り込みを変調させることができる。感受
性抗原を捕捉し、破壊、免疫原性の減少または希釈から
抗原を守ることができる。坦体を製剤化する方法には、
抗原を高分子マトリックス（単一マトリックス）中に分
散する、または抗原の周りを高分子物質で被覆すること
により外部防御壁（コア−シェル）を得ることが含まれ
る。製剤プロトコルの操作により、これらの物質の平均
サイズを優先して制御することができる。このことは、
経口送達を経由する腸管内のパイエル板の特定のＭ−細
胞における微粒子の取り込みに重要であることが分かっ
た。米国特許第５，１５１，２６４号は、Ｂｉｏ Ｖｅ
ｃｔｅｕｒｓ ＳｕｐｒａＭｏｌｅｃｕｌａｉｒｓ（Ｂ
ＶＳＭ）と名付けられたリン脂質／糖脂質／多糖性質の
微粒子坦体について記載している。微粒子坦体は、その
層の１つに生物活性を有する様々な分子を運搬すること
を意図している。しかし、米国特許第５，１５１，２６
４号は、免疫感作のための抗原を含む微粒子坦体につい
ては記載しておらず、経口的胃腸管、鼻咽頭−気道およ
び尿生殖道を経由する免疫感作、および眼窩内またはそ
の他の粘膜部位における免疫感作のための微粒子坦体に
ついて具体的に記載していない。Ｅｌｄｒｉｄｇｅ、他
（ｒｅｆ．２および３）は、ＰＬＧまたはＰＬＧＡとし
て知られているポリラクチド・グリコリド共重合体から
製造された生体内分解性マイクロスフェアからのｉｎ
ｖｉｖｏにおける抗原の遅延性放出を観察した。マイク
ロパーティクルの製剤化に際して抗原をカプセル充填す
るために多数の他の高分子が用いられており、これらに
は、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリカプロラクト
ン、ポリ酸無水物、ポリオルトエステルおよびポリ（α
−ヒドロキシ酪酸）が含まれる。米国特許第５，０７
５，１０９号は、５０：５０のポリ（ＤＬ−ラクチド・
グリコリド）中にトリニトロフェニル化キーホールリン
ペットヘモシアニンおよびブドウ球菌腸管毒Ｂ抗原のカ
プセル充填について記載している。ポリ（グリコリ
ド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド・グリコリド）、コポリオ
キサレート、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド・カ
プロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオルト
エステル、ポリ（α−ヒドロキシ酪酸）、およびポリ酸
無水物などのカプセル充填用の他のポリマーを提案して
いる。カプセル充填された抗原は、胃内挿管法によりマ
ウスに投与され、唾液および腸管分泌液および血清中に
顕著な抗原特異的ＩｇＡ抗体の出現をもたらした。この
特許に述べられているように、これとは対照的に、同量
のカプセル充填しない抗原の経口投与は、試験したいず
れの体液中においても、いずれのイソタイプの特異的抗
体の誘導に無効であった。ポリ（ＤＬ−ラクチド・グリ
コリド）マイクロカプセルを用いて、非経口注射によっ
て抗原を投与することもできた。公告されたＰＣＴ出願
ＷＯ９１／０６２８２は、多数の生体付着性マイクロス
フェアおよび抗原ワクチン成分を含む送達運搬体につい
て記載している。マイクロスフェアは、デンプン、ゼラ
チン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンから
なる。この送達運搬体は、鼻粘膜からのワクチン取り込
みを具体的に意図している。この送達運搬体はさらに吸
収促進剤を含有することができる。通常、防御性重合物
質中に抗原をカプセル充填する。米国特許第５，５７
１，５３１号は、多糖の固体マトリックスおよびタンパ
ク性物質を含む微粒子担体について記載している。生物
活性を有する物質の送達のために官能基の付いたシリコ
ンポリマーをマトリックスに結合させている。抗原の遅
延性放出は前述の仕事で明らかになったが、記載の方法
によってマイクロパーティクルを製造する場合には困難
に遭遇した。生物学的物質を用いる有機溶媒および物理
的力に暴露すると変性する可能性もある。方法をスケー
ルアップすることも困難である。さらに、親水性の抗原
をカプセル充填するのは非能率的である。このような制
限のない改善された担体を提供することが望ましいであ
ろう。具体的には、マイクロパーティクルおよびマイク
ロスフェアに製剤化でき、抗原を予め選択された配位子
に向けるような標的指向性の部分を含む重合物質を提供
することが望まれる。これは、免疫システムの細胞に対
する途方もない潜在能力を持つであろう。発明の概要 本発明は、様々な方法によってマイクロパーティクルお
よびマイクロスフェアを製造するのに適した性質を有す
る新規で有用なポリマーの製造を対象とする。本発明に
おいて、現在のプロセッシング法の改変は、カプセル充
填の効率に著しい改善をもたらす。本発明は、非経口、
経口および鼻内を含む様々な免疫感作経路による抗原、
または抗原とアジュバントのカクテルに有用なワクチン
送達システムの製作を対象とする。本発明の第１の態様
により、下記一般式のバックボーンを有し、約５，００
０から約４０，０００の分子量を有するポリマーを含
む、新規な生体内分解性、生体適合性のポリマーを提供
する。 上式で、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５は独立に、
Ｈ、直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、Ｒ
_６は、Ｈ、アミン保護基、スペーサー分枝または生物活
性分子種から選択され、Ｘは、ＯまたはＳ基から選択さ
れ、およびｘおよびｙは、整数で、ポリマーの少なくと
も約９５％がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値を
とる。新規なポリマーは、環状ジエステルを含む少なく
とも１つのα−ヒドロキシ酸またはその誘導体、および
少なくとも１つの疑以−α−アミノ酸を含む、単量体の
共重合によって誘導される。α−ヒドロキシ酸は、一般
式Ｒ_１Ｒ_２ＣＯＨＣＯ_２Ｈを有し、Ｒ_１およびＲ_２基は
Ｈ、直鎖または分枝鎖アルキル基である。α−ヒドロキ
シ酸は、α−ヒドロキシ酸の混合物、水素であるＲ_１お
よびＲ_２基を有するα−ヒドロキシ酸、およびＣＨ_３で
あるＲ_１基およびＨであるＲ_２を有するもう１つのα−
ヒドロキシ酸の少なくとも１つの混合物を含むことがで
きる。疑似−α−アミノ酸は、一般式Ｒ_５ＣＨＮＨＲ_６
ＣＯ_２Ｈを有し、Ｒ_５基は、ヒドロキシメチルまたはメ
チルチオール基、およびＲ_６は、アミン保護基である。
アミン保護基は、カルボベンジルオキシ、ベンジル、パ
ラメトキシベンジル、ベンジルオキシメトキシ、ｔｅｒ
ｔ−ブチルオキシカルボニルまたは［９−フルオレニル
メチルオキシ］カルボニルでよい。通常、α−ヒドロキ
シ酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、グリコール酸、ヒド
ロキシ吉草酸およびヒドロキシ酪酸から選択される。少
なくとも１つの疑似−α−アミノ酸はセリンでよい。本
発明の好ましい態様において、ポリマーは、ポリ−Ｄ，
Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−Ｚ−セリンエステル
（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−Ｐ，Ｌ−ラクチド・グリ
コリド・疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）である。
このポリマーは、直接または側基を介してポリマーに共
有結合した細胞生体付着性基、マクロファージ刺激物
質、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸および／ま
たは保護されたアミノ酸残基などの生物活性部分を含む
ことができる。好ましい実施形態において、生物活性置
換基は、アミノ酸部分のアミノ基または適当なスペーサ
ー分子を介してポリマーと結合する。スペーサー分子
は、Ｒ_７またはＲ_８基が独立に、Ｈ、直鎖または分枝ア
ルキル単位から選択され、式Ｒ_７Ｒ_８ＣＯＨＣＯ_２Ｈで
表されるα−ヒドロキシ酸、およびＲ_９基がヒドロキシ
メチルまたはメチルチオール基であり、Ｒ_１０がアミン
保護基である、式Ｒ_９ＣＨＮＨＲ_１０ＣＯ_２Ｈで表され
るα−アミノ酸から選択することができる。本発明の別
の態様により、本発明は、少なくとも１つのα−ヒドロ
キシ酸および少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸を共
重合させることを含む生体内分解性、生体適合性ポリエ
ステルの製造方法を提供する。本発明の別の態様によ
り、不活性雰囲気条件において少なくとも１つのα−ヒ
ドロキシ酸および少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸
のエステル化触媒を含む有機溶媒溶液を調製し、単量体
を共重合させて得られるポリマーを単離することを含
む、本明細書中に与えられた一般式を有する生体内分解
性、生体適合性のポリマーの製造方法を提供する。用い
る触媒は２−エチルヘキサン酸第一スズであるのが好ま
しい。この方法で生成されるポリマーは、固相触媒還元
または別法により酢酸溶液中の臭化水素を用いる酸触媒
により、さらに脱保護することができる。この方法は、
ポリマーをフィルムまたはマイクロパーティクルに成型
することを含む。本発明の別の態様により、下記一般式
を有し、約５，０００から約４０，０００ドルトンの分
子量を有するポリマーを含み、ポリマーを含む担体であ
る、生物活性物質を宿主に送達するための微粒子担体を
提供する。 上式で、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５は独立に、
Ｈ、直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、Ｒ
_６は、Ｈ、アミン保護基、スペーサー分子または生物活
性分子種から選択され、Ｘは、ＯまたはＳ基から選択さ
れ、およびｘおよびｙは、整数で、ポリマーの少なくと
も約９５％がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値を
とる。通常、微粒子担体は、約１から１０μＭの粒子径
を有する。本発明の別の態様は、少なくとも１つの生物
活性物質を宿主に送達するための微粒子担体製造方法で
あり、その方法は、（ａ）α−ヒドロキシ酸ポリマーま
たは共重合体を含む有機溶媒相を、分散または溶解した
生物活性物質を含む水性成分と混合し、第１の油中水型
乳剤を生成させるステップ、（ｂ）第１の油中水型乳剤
水性洗浄相に分散し、第２の水中油中水型乳剤を生成さ
せるステップ、（ｃ）第２の二重エマルションから水を
除去し、マイクロスフェアを生成させるステップ、およ
び（ｄ）マイクロスフェアを集め、その中に生物学的物
質を捕捉させるステップを含む。本発明の微粒子担体
は、担体と混合または担体中に捕捉した生物活性物質を
有する組成物として用いることができる。用いる生物学
的物質は、免疫応答を引き起こす物質から選択すること
ができる。このような物質には、非タンパク質分解性Ｈ
ｉｎ−４７類似体、Ｄ１５、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ６な
どのヘモフィルスインフルエンゼタンパク質が含まれ
る。生物活性物質には、少なくとも１つのインフルエン
ザウイルスが含まれ、多価または１価のインフルエンザ
ウイルスワクチン、またはインフルエンザウイルス１価
タンパク質ワクチンなどのインフルエンザウイルスタン
パク質が含まれる。さらに、生物活性物質には、モラク
セラカタラーリスのＴｂｐ２タンパク質などの少なくと
も１つのモラクセラカタラーリスタンパク質が含まれ
る。さらに、用いる生物活性物質には、ウレアーゼなど
の少なくとも１つのヘリコバクターピロリタンパク質が
含まれる。他の生物物質には、タンパク質、タンパク質
様物質、細菌、細菌溶解物、ウイルス（例えば、呼吸器
合胞体ウイルス）、ウイルス感染細胞溶解物、ＤＮＡプ
ラスミド、アンチセンスＲＮＡ、ペプチド（例えば、Ｃ
ＬＴＢ−３６およびＭ２）、抗原、抗体、薬理学的試
剤、抗生物質、炭水化物、脂質、脂質化アミノ酸（例え
ば、トリパルミトイルシステイン）、糖脂質、ハプテン
およびその組合せおよびその混合物が含まれる。第１の
油中水型乳剤はさらに、親油性の少なくとも１つの有機
溶媒可溶アジュバントを含むことができる。このような
有機溶媒アジュバントは、ＢＡＹ Ｒ１−００５、トリ
パルミトイルシステインおよびＤＣ−ｃｈｏｌからなる
基選択することができる。親油性部分の存在は、カプセ
ル充填効率を高め、製剤化中の抗原を保護し、従来の製
剤より効率よく免疫システムに抗原が存在するように粒
子を放出することに役立ち、したがってより効果的なワ
クチンを提供する。さらに、第１の油中水型乳剤は、Ｐ
ＣＰＰなどの重合性の水溶性アジュバント、ＣＴ−Ｘま
たはそのサブユニットなどの粘膜アジュバントまたはＬ
Ｔといった少なくとも１つの水溶性アジュバントを含む
ことができる。水溶性アジュバントの存在は、本方法の
カプセル充填効率を高め、製剤化中の抗原を保護し、従
来の製剤より効率よく免疫システムに抗原が存在するよ
うに粒子を放出することに役立ち、それによってより効
果的なワクチンを提供する。本発明は、本明細書中で提
供される微粒子担体および生理学的に許容可能な担体を
含む免疫原性組成物も提供する。この組成物は粘膜また
は非経口的に投与できる。免疫応答は、局所の抗体応答
または血清抗体応答である。本発明のこの態様により、
安定微粒子型の制御された、または遅延した放出ワクチ
ン調製物およびそのようなワクチン調製物の製造方法を
提供する。粒子はマイクロスフェア的で、生体内分解性
ポリマーおよび抗原および／または抗原プラス・アジュ
バント含有の領域を含む。本発明の利点には、（ａ）完
全に生体内分解性および生体適合性マイクロパーティク
ル製剤化、（ｂ）免疫システムの細胞に対する抗原呈示
が容易となり、改善された抗原免疫原性をもたらす、
（ｃ）抗原の生物学的利用能を増加させる改善された製
剤化条件、が含まれる。本発明の追加の実施形態には、
診断測定におけるおよび治療戦略に対する粒子担体の用
途が含まれる。図面の簡単な説明 図面を参照しての以下の説明により、本発明をさらに理
解されるであろう。図１に、本発明の好ましい態様によ
る、乳酸２量体とグリコール酸２量体およびＮ−（カル
ボベンジルオキシ）−Ｌ−セリンとの開環重合（ＲＯ
Ｐ）と、続く脱保護を図式的に示す。図２に、ポリマー
中のα−アミノ酸サブユニットの側鎖を介する生物活性
部分のポリマーへの結合を図式的に示す。代表的な標的
基には、水溶性および循環の場合にはポリ−エチレング
リコール（ＰＥＧ）、マクロファージ刺激物質および細
胞生体付着性基が含まれる。α−ヒドロキシ酸またはα
−アミノ酸から誘導されるスペーサー配位子を組み入れ
て生物活性配位子の結合を容易にすることができる。図
３は、本発明の一実施形態によるマイクロパーティクル
製造のために用いるプロセスの詳細を図式的に示す。こ
の図において、Ｈｉｎ−４７は、ヘモフィルスインフル
エンゼに由来する非タンパク質分解性組換えタンパク質
類復体（米国特許第５，５０６，１３９号に記載）、Ｆ
ｌｕ Ｘ３１は、インフルエンザＸ３１株またはＡ−Ｔ
ｅｘａｓ株、ｒＤ−１５は、ヘモフィルスインフルエン
ゼに由来する組換えタンパク質（ＷＯ９４／１２６４１
に記載）、ＰＶＡ＝ポリビニルアルコールである。Ｆｌ
ｕ（トリ）は３価のｆｌｕ、Ｔｂｐ２は、モラクセラカ
タラーリストランスフェリン結合タンパク質２、および
ｒＵｒｅａｓｅは、組換えヘリコバクターピロリウレア
ーゼである。ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑
似−（Ｚ）−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポ
リ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエス
テル（ＰＬＧｐＳ）マイクロパーティクルをＰＢＳまた
は代表的タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７
類似体）の存在下で調製した場合の、レーザー回折測定
による代表的サイズ分布を図４に示す。リン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）の存在下でポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリ
コリド・疑似−（Ｚ）−セリンエステル（ＰＬＧｐＺ
Ｓ）およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似
−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）から調製したマイクロ
パーティクルの走査型電子顕微鏡写真を図５に示す。Ｈ
ｉｎ−４７／ＰＢＳなどの代表的抗原／ＰＢＳ混合物の
存在下でポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−
（Ｚ）−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−
Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル
（ＰＬＧｐＳ）から調製したマイクロパーティクルの走
査型電子顕微鏡写真を図６に示す。ＰＢＳ（ｐＨ＝７．
４）中でインキュベートされ３７℃に維持された試料１
４ｍｇ（代表的なコアへの充填量は、マイクロパーティ
クルｍｇあたり２．５から５．７μｇタンパク質の範囲
にある）から得られたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬ
ＧｐＳマイクロパーティクル中にカプセル充填された非
タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体の３カ月間のｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける放出経過を図７Ａに示す。ＰＢＳ
（ｐＨ＝７．４）中でインキュベートされ３７℃に維持
された試料〜１４ｍｇ（代表的なコアへの充填量は、マ
イクロパーティクルｍｇあたり２．５から５．７μｇタ
ンパク質の範囲にある）から得られたＰＬＧ、ＰＬＧｐ
ＺＳおよびＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中からの非
タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体の３カ月間の％累
積放出を図７Ｂに比較する。種々の免疫感作プロトコル
に従ってヘモフィルスインフルエンゼから得られた４７
ｋＤａ膜タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７
類似体）により皮下（Ｓ．Ｃ．）で免疫感作されたマウ
スにおける血清ＩｇＧ応答を図８Ａに示す。５匹のマウ
スからなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐ
Ｓマイクロパーティクルに取り込まれた非タンパク質分
解性Ｈｉｎ−４７類似体０．２または０．６μｇを含む
ｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、１日目および３
５日目に免疫感作した。＋１０、＋２４、＋３５、＋４
６および＋６０日目に採取した血清について、酵素結合
免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｈｉｎ−４７Ｉ
ｇＧ抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロトコル
に従ってヘモフィルスインフルエンゼから得られた４７
ｋＤａ膜タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７
類復体）により皮下（Ｓ．Ｃ．）で免疫感作されたマウ
スにおける血清ＩｇＧ応答を図８Ｂに示す。５匹のマウ
スからなる群を、ＰＬＧマイクロパーティクルと物理的
に混合した非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体０．
８または２．５μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μ
Ｌにより、１日目および３５日目に免疫感作した。＋１
０、＋２４、＋３５、＋４６および＋６０日目に採取し
た血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）
により抗−Ｈｉｎ−４７ＩｇＧ抗体の存在を評価した。
図８Ａおよび図８Ｂで説明したように行った試験から＋
３５および＋６０日目に得られたプール血液について、
血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを図８Ｃに示す。
ヘモフィルスインフルエンゼから得られた４７ｋＤａ膜
タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体）
により胃内（Ｉ．Ｇ．）で免疫感作されたマウスにおけ
るＩｇＧ血清抗体応答を図９Ａに示す。５匹のマウスか
らなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳマ
イクロパーティクルに取り込まれ、またはＰＬＧ、ＰＬ
ＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理
的に混合された非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体
４μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ５００μＬにより、
１、７、１４および５７日目に免疫感作した。＋１３、
＋３５、＋５６および＋７８日目に採取した血清につい
て、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｈ
ｉｎ−４７ＩｇＧ抗体の存在を評価した。図９Ａで説明
したように行った試験から＋５６および＋７８日目に得
られたプール血液について、血清ＩｇＧ応答サブタイプ
プロフィルを図９Ｂに示す。図９Ａで説明したように行
った試験から＋７８日目に得られたプール血液につい
て、血清ＩｇＡ応答を図９Ｃに示す。ヘモフィルスイン
フルエンゼから得られた４７ｋＤａ膜タンパク質（非タ
ンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体）およびヘモフィル
スインフルエンゼから得られた１１５ｋＤａ膜タンパク
質（ｒＤ−１５）の（１：１）カクテルにより鼻腔内
（Ｉ．Ｎ．）で免疫感作されたマウスにおけるＩｇＧ血
清抗体応答を図１０Ａに示す。５匹のマウスからなる群
を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳマイクロパ
ーティクルに取り込まれ、またはＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳ
またはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合
された非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体４μｇを
含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５μＬにより、１、７、１４
および５７日目に免疫感作した。＋１３、＋３５、＋５
６および＋７８日目に採取した血清について、酵素結合
免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｈｉｎ−４７Ｉ
ｇＧ抗体の存在を評価した。図１０Ａで説明したように
行った試験から＋５６および＋７８日目に得られたプー
ル血液について、血清ＩｇＧ応答サブタイプ・プロフィ
ルを図１０Ｂに示す。図１０Ａで説明したように行った
試験から＋７８日目に得た血液について血清ＩｇＡ応答
を図１０Ｃに示す。図１０Ａで説明したように行った試
験から＋７８日目に得た血液について肺潅注法ＩｇＧ応
答を図１０Ｄに示す。図１０Ａで説明したように行った
試験から＋７８日目に得た血液について肺潅注法ｓＩｇ
Ａ応答を図１０Ｅに示す。種々の免疫感作プロトコルに
よる抗−Ｆｌｕ Ｘ３１（すなわち、Ａ型インフルエン
ザウイルスＸ３１株）ＩｇＧ血清抗体応答を図１１に示
す。６匹のマウスからなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳ
およびＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれた
ＨＡ１．５μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬに
より、皮下（Ｓ．Ｃ．）で１日目に免疫感作した。＋２
１および＋３３日目に採取した血清について、酵素結合
免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｆｌｕ Ｘ−３
１ＩｇＧ抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロト
コルによる抗−Ｆｌｕ Ｘ３１（すなわち、Ａ型インフ
ルエンザウイルスＸ３１株）ＩｇＧ血清抗体応答を図１
２に示す。６匹のマウスからなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧ
ｐＺＳおよびＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込
まれたＨＡ１．５μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５μ
Ｌにより、鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）で１および３４日目に免
疫感作した。＋２１、＋３３、＋５７、＋７８および＋
９２日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検
定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｆｌｕ Ｘ−３１ＩｇＧ抗
体の存在を評価した。単回皮下投与後にプールした血清
（＋２１および＋４２または＋５７日目）について血球
凝集反応阻害抗体検定（すなわち、インフルエンザウイ
ルスＡ−Ｔｅｘａｓ株）応答を図１３に示す。６匹のマ
ウスからなる群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに
取り込まれたＨＡ０．３５μｇまたはＨＡ３．５μｇ、
ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたＨＡ
０．３５μｇおよびＢＡＹ Ｒ１−００５〜２μｇ、ま
たはＨＡ３．５μｇおよびＢＡＹ Ｒ１−００５〜２０
μｇ、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合
されたＨＡ０．３５μｇまたはＨＡ３．５μｇ、ＰＬＧ
ｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合されたＨＡ
０．３５μｇおよびＢＡＹ Ｒ１−００５ ２μｇ、ま
たはＨＡ３．５μｇおよびＢＡＹ Ｒ１−００５ ２０
μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、皮下
（Ｓ．Ｃ．）で１日目に免疫感作した。＋２１および＋
４２日目に採取した血清について、赤血球の血球凝集反
応阻害を調べた。種々の免疫感作プロトコルによる抗−
Ｆｌｕ（３価）ＩｇＧ血清抗体応答（３価ワクチン中に
含まれる各インフルエンザウイルス株について；Ａ−Ｔ
ｅｘａｓ（図１４ａ）、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ
（図１４ｂ）およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ（図１４Ｃ））を
図１４ａからｃに示す。８匹のマウスからなる群を、Ｐ
ＬＧｐＳマイクロパーティクル、またはＢＡＹ Ｒ１−
００５、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰの存在下で製剤
化したＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中に取り込んだ
合計２．３５μｇのＨＡ（各株から約１／３の特異的Ｈ
Ａ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、皮下
（Ｓ．Ｃ．）で１日目に免疫感作した。＋２１、＋４２
および＋５７日目に採取した血清について、酵素結合免
疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗−Ｆｌｕ（３価）
ＩｇＧ抗体（Ａ−Ｔｅｘａｓ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂ
ｕｒｇおよびＢ／Ｈａｒｂｉｎ）の存在を評価した。単
回皮下投与後の株特異的血球凝集反応阻害抗体検定（す
なわち、Ａ−Ｔｅｘａｓ（図１５ａ）、Ａ／Ｊｏｈａｎ
ｎｅｓｂｕｒｇ（図１５ｂ）およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ
（図１５ｃ）応答を図１５ａからｃに示す。８匹のマウ
スからなる群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中に
取り込んだ合計２．３５μｇのＨＡ、またはＢＡＹ Ｒ
１−００５、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰを一緒にカ
プセル充填したＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中に取
り込んだ合計２．３５μｇのＨＡを含むｐＨ７．４のＰ
ＢＳ２５０μＬにより、皮下（Ｓ．Ｃ．）で１日目に免
疫感作した。＋２１、＋４２または＋５７日目に採取し
た血清について、赤血球の血球凝集反応阻害を評価し
た。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（３価）マイクロパーティク
ル、またはＢＡＹ Ｒ１−００５、ＤＣ−Ｃｈｏｌまた
はＰＣＰＰを一緒にカプセル充填したＰＬＧｐＳ／Ｆｌ
ｕ（３価）マイクロパーティクルの単回投与により免疫
感作したマウスで行った防御試験の結果を図１６に示
す。マウスを同族の生ウイルスでチャレンジし、体重変
化および２週間間隔で生存をモニターした。種々の免疫
感作プロトコルに従って、モラクセラカタラーリスから
得られたトランスフェリン結合タンパク質により、皮下
（Ｓ．Ｃ．）で免疫感作したマウスにおける血清ＩｇＧ
抗体応答を図１７ａに示す。５匹のマウスからなる群
を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込むか、Ｐ
ＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合するか、
またはＡｌｕｍとともに製剤化したｔｂｐ−２ ０．３
μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、１、
２８および４３日目に免疫感作した。＋１４、＋２７、
＋４２および＋５５日目に採取した血清について、酵素
結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗−ｔｂｐ−
２ＩｇＧ抗体の存在を評価した。図１７ａで説明したよ
うに行った試験から＋５５日目に得られたプール血液に
ついて、血清ＩｇＧ抗体サブタイプ応答プロフィルを図
１７ｂに示す。モラクセラカタラーリスから得られたト
ランスフェリン結合タンパク質（Ｔｂｐ−２）により、
鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）で免疫感作したマウスにおけるＩｇ
Ｇ血清抗体応答を図１８に示す。５匹のマウスからなる
群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中に取り込む
か、またはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に
混合したＴｂｐ−２ ６μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ
１０μＬまたは５０μＬにより、１、２８および４３日
目に免疫感作した。＋１４、＋２７、＋４２および＋５
５日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定
（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗−Ｔｂｐ−２ＩｇＧ抗体の存
在を評価した。種々の免疫感作プロトコルに従って、モ
ラクセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結
合タンパク質（Ｔｂｐ−２）により、非経口的に免疫感
作されたモルモットにおける血清ＩｇＧ抗体応答を図１
９に示す。２匹のモルモットからなる群を、１日目にＣ
ＦＡ４００μＬとともに製剤化したＴｂｐ−２ ５μｇ
により筋肉内で免疫感作し、続いて、１４および２８日
目にＩＦＡ５００μＬ中で製剤化したＴｂｐ−２ ５．
０μｇにより皮下で免疫感作するか、１、１４および２
８日目にＡｌｕｍ５００μＬとともに製剤化したＴｂｐ
−２ ５μｇ、または１および２８日目にＰＬＧｐＳマ
イクロパーティクルに取り込まれたＴｂｐ−２ ５μｇ
により免疫感作した。＋４０および＋５６日目に採取し
た血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）
を用い、抗−Ｔｂｐ−２ ＩｇＧ抗体の存在を評価し
た。種々の免疫感作プロトコルに従って、ヘリコバクタ
ーピロリから得られた組換えタンパク質ｒＵｒｅａｓｅ
により、皮下（Ｓ．Ｃ．）または経口（Ｉ．Ｇ．）で免
疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧ抗体サブタイプ
応答を図２０に示す。８匹のマウスからなる群を、ＰＬ
ＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたｒＵｒｅａ
ｓｅ１０．０μｇ（Ｓ．Ｃ．）または４０．０μｇ
（Ｉ．Ｇ．）、またはＰＬＧｐＳマイクロパーティクル
に取り込まれたＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＣＴ−Ｘ、ＰＣＰＰま
たはＬＴの存在下で製剤化されたｒＵｒｅａｓｅ１０．
０μｇ（Ｓ．Ｃ．）または４０．０μｇ（Ｉ．Ｇ．）を
含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、１、２８お
よび５６日目に免疫感作した。＋８５日目に採取した血
清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用
い、抗−ｒＵｒｅａｓｅＩｇＧ抗体の存在を評価した。
図２０に記載したマウスについて、８５日目のチャレン
ジ後１カ月の防御試験の結果を図２１ａからｂに示す。
ｒＵｒｅａｓｅ活性（皮下または経口経路で免疫感作さ
れたマウスについて）は、マウスを致死させて２４時間
後に胃全体の１／４（幽門洞＋胃体部）で測定した。発明の詳細な説明 本発明の新規なポリマーは、生体内に存在し、細胞生体
付着基、マクロファージ刺激物質、ポリアミノ酸および
α−ヒドロキシ酸およびα−アミノ酸から選択される少
なくとも１つのスペーサー分子を介してポリマーと結合
するポリエチレングリコールなどの生物活性部分を有す
る良性代謝物に対して生体適合性、分解性である。この
ように、新規ポリマーは、官能基を有する。生物活性物
質を含むマイクロパーティクルへのプロセッシングに有
利な性質を有するポリマーの合成方法も説明するが、生
物活性標的基による化学的修飾も可能である。好ましい
実施形態において、共重合体は、α−ヒドロキシ酸と疑
似−α−アミノ酸の重合によって製造し、およびターポ
リマー（ｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒ）は、２つのα−ヒドロ
キシ酸と疑似−α−アミノ酸との重合によって製造す
る。次いで、この共重合体またはターポリマーは、遊離
アミノ基との直接の共有結合によるアミノ酸サブユニッ
トを介して生物活性標的配位子により誘導体とされ、さ
らに適当なスペーサー配位子で誘導化することができ
る。 アミノ酸単量体合成 通常、Ｎ−保護セリン（またはシステイン）は光延反応
（ｒｅｆ．５）により環化され、４員環ラクトン（また
はチオラクトン）が得られる。この変換は、エステル
（またはチオエステル）結合を生じる。反応条件に適合
するアミノ酸前駆体のアミン部分上の保護が重要であ
る。カルボベンジルオキシ（ＣＢＺまたはＺ）基を用い
ることが好ましいが、ベンジル（Ｂｎ）、パラ−メトキ
シベンジル（ＭｅＯＢｎ）、ベンジルオキシメトキシ
（ＢＯＭ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−
ＢＯＣ）または［９−フルオレニルメチル）オキシ］カ
ルボニル（ＦＭＯＣ）などの他の適当な官能基を用いて
もよい。Ｎ−Ｚ−Ｌ−セリンβ−ラクトン単量体の合成
は、文献（ｒｅｆ．６）の改良法に基づいた。単量体を
含むα−ヒドロキシ酸およびアミノ酸の共重合、および
アミノ酸側鎖の官能基化α−ヒドロキシ酸単量体の共重
合には２つの方法が利用できる。重縮合を介する重合、
または溶融（バルク重合）による重合を選択することが
可能である。比較的低分子量の物質では、しばしば競争
的副反応が伴い、好ましくない副生成物が生じるため、
縮合重合には問題のあることが長く知られていた（ｒｅ
ｆ．７および８）。しかし、グリコリドおよびラクチド
などの環状２量体のバルク相からの開環重合（ＲＯＰ）
が、様々な触媒の存在下で容易に進行し、好ましくは、
オクタン酸第一スズにより高分子量のポリマーを与える
ことが分かった（ｒｅｆ．９から１５）。ポリ（アミノ
酸）（ｒｅｆ．１６、１７および１８）または疑似ポリ
アミノ酸）（ｒｅｆ．６および１９）の調製には多く
の方法がある。ポリ−α−ヒドロキシ酸（特に、５０：
５０ Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのポリマー）
およびポリ（アミノ酸）のよく知られた生体内分解性の
性質は、α−ヒドロキシ酸ポリマーのバックボーンにア
ミノ酸を取り込む方法を開発しようとする努力の増加を
もたらした（ｒｅｆ．２０から２５）。ラクチドまたは
グリコリドなどのα−ヒドロキシ酸サブユニット、およ
びグリシンまたはリジンなどのα−アミノ酸サブユニッ
トを含む共重合エステルアミドの製造に進歩が見られた
（ｒｅｆ．２２、２３および２６）。生体内分解性ポリ
マーの分解速度、およびグリコリド、ラクチドのホモポ
リマーまたはこれらの物質の共重合体からのカプセル充
填された物質の放出速度は、結晶性の程度、および相対
的な疎水性または親水性の程度などといったそれらの分
子量および構造に強く影響を受けることが分かった。具
体的には、α−ヒドロキシ酸から誘導された高分子量の
ポリマーから製剤化されたマイクロスフェアは、低分子
量の類似体に比べ長時間かかって分解する。同様に、高
結晶性物質は、無定形類似体に比べかなりゆっくりした
速度で崩壊する。このことは、加水分解に不安定なエス
テル結合への水の近づきやすさに関連している（ｒｅ
ｆ．２７）。５０％のＤ，Ｌ−ラクチドおよび５０％の
グリコリドからなるランダム無定形共重合体は、最も進
んだ分解速度を示すことが証明されており（ｒｅｆ．２
および３）、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中に浸けた
場合、約６週間後に５０重量％が残存する。前述の共重
合エステルアミドは半結晶物質であり、カプセル充填さ
れた物質が完全に放出された後にも長い間投与部位に滞
留する心配もある。カプセル充填された物質が完全に放
出された時点または近い時点で分解するポリマーを手に
することは利点があると考え、疑似−α−アミノ酸サブ
ユニットも含むターポリマーに等量のＤ，Ｌ−ラクチド
およびグリコリドをランダムに取り込む方法を開発し
た。無定形のターポリマーはフィルムおよびマイクロパ
ーティクルへの加工に十分な機械的強度を保持する一方
で、満足のいくポリマー分解速度および捕捉物質の放出
速度を示すのではないかということを確かめるために、
相対的に中程度の分子量のターポリマーを用いた。Ｎ−
保護−Ｌ−セリンラクトンは、エステル結合を含み、エ
ステル交換反応触媒を介して重合させることができる
（ｒｅｆ．６）。さらに、ラクチドおよびグリコリドな
どの６員環ラクトンは、挿入／配位型触媒／開始剤を用
いることにより４員環プロピオラクトンと共重合させる
ことができる（ｒｅｆ．１３）。すべての単量体単位に
比較的十分な反応性が達成されるようであれば、Ｓｎ試
薬から誘導される触媒などの効率的エステル交換反応触
媒が必要となることが予想された。オクタン酸第一スズ
が介在するグリコリド、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびＮ−Ｚ
−Ｌ−セリンラクトンの共重合を用いた。共重合体また
はターポリマーのＣＢＺ基の脱保護は、様々な方法で行
うことができる。固相触媒還元または酸触媒（ｒｅｆ．
２７）が、２つの可能性である（図１）。得られた共重
合体またはターポリマーは、図２に示すように、細胞付
着性エピトープ、体循環のためのポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）配位子、マクロファージ刺激物質およびポ
リアミノ酸グラフトなどの標的部分を付け加えることが
できる。例えば、α−ヒドロキシ酸または疑似−α−ア
ミノ酸ユニットなどのスペーサーユニットを導入し、適
当な標的ユニットで誘導化できる。このようにして生成
されたポリマーは、約５，０００から約４０，０００ダ
ルトンの分子量を有する。 マイクロパーティクルの形成 本明細書中で用いるように、「マイクロパーティクル」
という用語は、大きさが１ミクロンより大きく生物活性
物質の送達に用いる任意の粒子担体を意味する。本明細
書中で用いるように、「マイクロスフェア」という用語
は、１つまたは複数の活性成分（例えば、抗原、アジュ
バント、プラスミドＤＮＡ）を含むマイクロパーティク
ルを意味する。本明細書中に記載するマイクロパーティ
クル生成方法を例示する流れ図を図３に示す。通常、共
重合体（ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ）は、
ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトンまたはその混合
物などの適合する溶媒中に単独で溶けるか、追加の賦形
剤で可溶である。ショ糖、マンノース、トレハロースま
たはゼラチンなどの製剤化に含まれる賦形剤は、凍結防
止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）または水解防止
剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として役立つ。ＢＡ
Ｙ Ｒ１−００５（ＢＡＹ）（ｒｅｆ．２９）またはト
リパルミトイルシステイン（ＴＰＣ）（ｒｅｆ．３０）
または３ｂ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタ
ン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏ
ｌ）（ｒｅｆ．３１）などの既知のアジュバント性を有
する他の物質を製剤中に用いてもよい。全量１２ｍＬの
１％から２％の共重合体溶液を調製するのが好ましい。
この溶液に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）８００μＬ、
またはＰＢＳまたは追加の賦形剤を含むことができる他
の安定化緩衝液中の抗原溶液（通常１から２ｍｇ／ｍＬ
の濃度）８００μＬを加える。ポリ［ジ（カルボキシラ
ートフェノキシ）−ホスファゼン］ナトリウム塩、（Ｖ
ｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）（ＰＣＰＰ）またはコレラト
キシンまたはそのサブユニットなどの既知のアジュバン
ト性を有する他の物質を製剤中に用いてもよい。次い
で、この混合物を均質化して、油中水型乳剤を生成す
る。生成したら直ちに、この混合物を、０．５％から１
０．０％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、メチルセ
ルロースまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの非イオ
ン性乳剤安定化剤を含む水溶液１００ｍＬに分散させ
る。この混合物を均質化すると、水中油中水型二重乳剤
が生成する。得られた小滴の平均サイズおよび多分散性
（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）は、Ｃｏｕｌｔｅｒ
ＬＳ−１００光散乱検出器を用いることによって容易
に測定することができる。ＰＢＳまたは抗原／ＰＢＳ混
合物をカプセル充填するときの代表的なサイズ分布は、
１から２０ミクロンの範囲にある（大部分が１０ミクロ
ン未満のサイズ）。次いで、緩やかに温め、蒸発によっ
てゆっくりと溶媒を除去すると、始めのマイクロスフェ
アが固化する。溶媒を除去したら直ちに、混合物を遠心
分離してマイクロスフェアを集め、脱イオン水で繰り返
し洗浄して、残存する乳剤安定化剤を完全に除去する。
次いで、マイクロスフェアをドライアイス／アセトン中
で凍結し、一昼夜凍結乾燥すると、白色で自由に流動す
る粉末としてマイクロスフェアが得られる（光散乱測定
法による測定および走査型電子顕微鏡写真法によって直
接確認したサイズは通常１．０から１２ミクロン）。通
常、この粒子は、約１から約５０μＭの粒子径を有する
重合性マトリックスを含み、その中には、捕捉された生
物活性物質、および場合によって一緒に捕捉されたアジ
ュバントを有するポリマーを含む。重合性マトリックス
に導入される生物活性物質およびアジュバントの量は、
大きく異なり、全粒子塊の５０重量％まで含むことがで
きる。本発明の様々な実施形態は、医療の分野および特
に、ワクチン接種、細菌およびウイルスを含む病原体に
よる感染症の診断および治療の分野で多くの応用が可能
であることは、当業者には明らかである。そのような使
用についての限定的でない説明を以下に行う。ワクチン調製 ある実施形態において、例えば、ワクチンとして用いる
のに適当な免疫原性組成物は、本明細書中に開示するマ
イクロパーティクルから調製することができる。生物活
性免疫原性物質を含む免疫原性組成物は、宿主による抗
体の産生を含む、投与された宿主による免疫応答を引き
起こす。免疫原性組成物は、液体水剤または乳剤などの
注射液として調製することができる。マイクロパーティ
クルは、マイクロパーティクルと適合する生理学的に許
容可能な賦形剤と混合することができる。賦形剤には、
水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノー
ルおよびその組合せが含まれる。さらに、ワクチンは、
ワクチンの有効性を促進するために湿潤剤または乳化
剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの追加の物質
を含んでもよい。ワクチンは、非経口で、皮下注射また
は筋肉内注射により投与することができる。あるいは、
本発明により生成されたマイクロパーティクルを含む免
疫原性組成物は、粘膜表面で免疫応答を引き起こすよう
な方法で送達することができる。したがって、免疫原性
組成物は、鼻内、経口（胃内）、頬側または直腸経路に
より、粘膜表面に投与することができる。経口製剤に
は、医薬等級のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグ
ネシウムなどの通常用いられる賦形剤が含まれる。これ
らの組成物は、水剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル
剤、徐放性製剤または散剤の形をとることができる。経
口経路で投与された場合に、マイクロパーティクルおよ
びマイクロパーティクルのコア中に含まれる、またはマ
イクロパーティクルと物理的に混合されてカプセル充填
された物質を胃の酸性から守るために、マイクロパーテ
ィクルの投与前、投与と同時、または投与直後に酸中和
調製物（重炭酸ナトリウム調製物など）を投与すると有
利である。ワクチンは、剤形に適合した方法で、治療上
有効で、防御的および免疫原性となるような量で投与す
る。投与される量は、治療を受ける対象、例えば、抗体
を合成し、必要ならば、細胞媒介性の免疫応答を生み出
すという対象の免疫システムの能力によって決まる。投
与する必要のある生物活性を有するマイクロパーティク
ルおよび物質の正確な量は、専門家の判断によって決ま
る。しかし、適当な投与量範囲は当業者によって容易に
決定可能であり、数マイクログラムから数ミリグラム程
度でよい。初回投与および追加免疫投与の適当な処方も
変化するが、初回投与と、それに続く投与を含むことが
できる。ワクチンの用法は投与経路で決まるが、ある宿
主から他の宿主へと変化する。ワクチン製剤化に応用さ
れる本発明のポリマーは、ＤＮＡまたはアンチセンスＲ
ＮＡなどを用いる新しいワクチン戦略にとっても有用で
ある。マイクロパーティクル担体として、本発明のポリ
マーは、コアタンパク質またはエンベロープタンパク質
などのウイルスの抗原部分のある遺伝子または複数の遺
伝子をコードするＤＮＡを含むように調製することがで
きる。ＤＮＡが担体から放出されるにしたがって、宿主
細胞は異種ＤＮＡを取り込み、問題の遺伝子を発現し、
細胞内で対応するウイルスタンパク質を合成する。有利
には、ウイルスタンパク質は、細胞媒介性免疫を引き起
こす細胞の主要組織適合性複合体経路に入る。これに比
べ、標準的なワクチン抗原は、細胞に取り込まれ、抗体
応答を刺激するＭＨＣＩＩクラスシステムによって処理
される。ＤＮＡは、すべての関連タンパク質を持たず、
複合体ベクターシステムを必要としない裸のＤＮＡの形
でよい。所望の遺伝子は、本命書中に記載のマイクロパ
ーティクル中にカプセル充填されたプラスミドなどのベ
クターに挿入され、哺乳動物の組織中に注射されて遺伝
子産生を発現し、免疫応答を引き起こすことができる。
本発明のポリマーと組合せてアンチセンスオリゴヌクレ
オチドを用いることもできる。核酸配列は、タンパク質
の産生を阻害する既知のタンパク質に具体的に対応する
ｍＲＮＡ配列に結合するようにデザインすることができ
る。本明細書中に記載するマイクロパーティクルを用
い、様々な免疫学的疾患ならびに高血圧、心血管疾患お
よびガンの治療に対する医療戦略としてこのようなアン
チセンスヌクレオチド（オリゴヌクレオチドまたは発現
したヌクレオチド）を送達することができる。本明細書
中で開発したポリマー・マイクロパーティクルの徐放性
の特徴は、マイクロパーティクルを用いて薬理学的試剤
をゆっくりと連続的に送達するような薬理学の分野にお
ける用途も有する。血圧降下剤、鎮痛剤、ステロイド剤
および抗生物質などの広範な薬物を本発明によって使用
し、徐放薬物送達システムを得ることができる。捕捉ま
たは物理的に混合された生物学的試剤を有するフィルム
型のポリマーには、外科的移植組織および器具のコーテ
ィングとしての用途を持つ。例えば、マイクロパーティ
クルに取り込まれた抗生物質を有するフィルム状のポリ
マーを用いて外科的に埋め込まれたカテーテルを被覆
し、感染と闘う抗生物質を継続的に徐放することができ
る。マイクロパーティクル担体は、診断試薬としても有
用である。適当な抗体とともに、イメージング試薬をマ
イクロパーティクルに導入することができる。このよう
にして、疾患の臨床的経過を確認またはモニターするた
めに罹患組織を標的とし、これをイメージすることがで
きる。マイクロパーティクルとしてのポリマーは、適当
な抗体と組み合わせて用いれば診断キットとしての用途
も持つ。実施例 前述の開示は本発明を一般的に説明するものである。以
下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な
理解を得ることができる。これらの実施例は、単に例示
目的で記載するものであり、本発明の範囲を限定するこ
とを意図していない。付随的な事柄が手段を示唆あるい
は伝えることもあるため、変形形態および等価形態の置
き換えを企図している。本明細書中で特定の用語を用い
たが、このような用語は、説明を意図したもので、限定
を目的としたものではない。本開示中で用いるが明確に
説明していない化学、有機化学、ポリマー化学、タンパ
ク質生化学および免疫学の方法、およびこれらの実施例
は、科学文献に詳しく報告されており、当業者の能力に
含まれるものである。 実施例１：この実施例は、Ｎ−Ｚ−Ｌ−セリンβ−ラク
トンの調製を例示する。このＮ−保護アミノ酸ラクトン
の調製は、改良法に基づくもので、Ｎ−保護−α−アミ
ノ酸を反応させて、環化した疑似−α−アミノ酸単量体
を得る（ｒｅｆ．６）。すべてのガラス器具は、１２０
℃に設定したオーブン中で一昼夜予備乾燥する。使用に
先立って、真空デシケータ中で冷却し、乾燥窒素流中１
０分間通気する。１Ｌの３頸丸底フラスコに、窒素中で
トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ；Ａｌｄｒｉｃｈ；
７．８７ｍＬ；５０ｍｍｏｌ；ＦＷ：１７４．１６）を
加えた。これに、無水アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ；Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）および無水テトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ；Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液（体積比８５：１５）２００
ｍＬを注射器で加え、固体ＴＰＰが溶けるまで撹拌し
た。この溶液に、アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡ
Ｄ；Ａｌｄｒｉｃｈ；７．８７ｍＬ；５０ｍｍｏｌ；Ｆ
Ｗ：２６２．２９）を注射器で加え、溶液を室温で３０
分間撹拌した。反応溶液をアセトニトリル／ドライアイ
ス浴に浸けて溶液を約−４５℃から−４８℃まで冷却し
た。溶液の内温が約−４５℃に達したら直ちに、Ｎ−カ
ルボベンジルオキシ−Ｌ−セリン（Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−セ
リン；Ｓｉｇｍａ；１１．９４ｇ；４９．８ｍｍｏｌ；
ＦＷ：２３９．２）の無水ＣＨ_３ＣＮ：ＴＨＦ（体積比
８５：１５）２００ｍＬ溶液を注射器により１時間以上
かけてゆっくり滴下した。添加中は溶液の温度を約−４
５℃に維持し、添加が終了すると同時に室温までゆっく
りと温め、一昼夜撹拌を継続した。この反応で、ＣＢＺ
保護α−アミノ基の存在下に、セリンヒドロキシ側鎖と
カルボン酸の間にエステル結合の生成が起きる。反応完
了後、蒸発により溶媒を除去した（３５℃から４５
℃）。黄色の油／スラリ（〜３５ｇ）が得られる。この
スラリに、ジクロロメタン：酢酸エチル（体積比８５：
１５）溶液５０ｍＬを加えると、副生成物の１，２−ジ
カルベトキシヒドラジンの沈殿が生じる。この物質を減
圧ろ過により除去し、続いて、蒸発により溶媒を除去し
た。前記手順を繰り返し、残存する副生成物をさらに除
去することができる。次いで、ろう状固体の粗生成物
を、溶離液として８５：１５ジクロロメタン：酢酸エチ
ルを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製し
た。生成物のセリンラクトンは、薄層クロマトグラフィ
により、１ＭＨ_２ＳＯ_４溶液による発色およびＵＶ検出
した場合に、この物質が８５：１５ジクロロメタン：酢
酸エチルで展開するシリカゲルプレート上で０．７５の
Ｒ_ｆを有することが確認できる。この生成物を酢酸エチ
ル：ヘキサン（〜１Ｌ）で再結晶し、ろ過して真空乾燥
した。再結晶後、融点（Ｔｍ＝１３３〜１３４℃）の純
粋な白色の固体が４０％の収率で得られ、他のすべての
物理パラメータ（ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、元素分
析）は従来明らかにされたものと一致する（ｒｅｆ．
６）。 実施例２：本実施例は、図１に示すポリ−Ｄ，Ｌ−ラク
チド・グリコリド・疑似−Ｚ−セリンエステル（ＰＬＧ
ｐＺＳ）共重合体の調製を例示する。ガラス製器具は一
昼夜予備乾燥した。使用に先立って、真空デシケータ中
で冷却した。さらに、重合容器（ガラスアンプル）はシ
リコン被覆（ＳｕｒｆａＳｉｌ；Ｐｉｅｒｃｅ；２％ト
ルエン溶液）されなければならず、すべての転移反応お
よび重合容器への試薬類および単量体の添加は、乾燥窒
素環境に保持されたグローブ・ボックス中で行わなけれ
ばならない。重合に先立ち、Ｄ，Ｌ−ラクチド（２，６
−ジメチル−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン；Ａ
ｌｄｒｉｃｈ；ＦＷ：１４４．１３）およびグリコリド
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ；ＦＷ：
１１６．０９６）を、グローブ・ボックス中で無水酢酸
エチルから再結晶し、約２日間真空で乾燥した。十分乾
燥したら直ちに、直接グローブ・ボックスに入れた実施
例１の新たに再結晶したセリンラクトン（０℃で保存）
とともに単量体をグローブ・ボックス中に保存できる。
すべての単量体および触媒／開始剤を秤量し、グローブ
・ボックス中のガラスアンプルに移す。アンプルに移す
単量体の総量は１ｇから５ｇの範囲であり、Ｄ，Ｌ−ラ
クチド：グリコリド：セリンラクトンのモル比は４２．
５：４２．５：１５．０から４９．０：４９．０：２．
０の範囲である。好ましい実施形態においては、Ｄ，Ｌ
−ラクチド：グリコリド：セリンラクトンのモル比、４
７．５：４７．５：５．０を用いた。触媒（２−エチル
ヘキサン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）_２；Ｓｉｇｍａ；
ＦＷ：４０５．１、１．２５ｇ／ｍＬ）の無水クロロホ
ルム（Ａｌｄｒｉｃｈ）保存溶液をグローブ・ボックス
中で調製し、マイクロシリンジでガラスアンプルに加え
た（触媒の単量体に対するモル比＝１／１０００）。ア
ンプル中に撹拌棒を置いた。グリースを付けたすりガラ
スのジョイントバルブをアンプル上に置き、グローブ・
ボックスから取り出している間の不活性環境を維持し
た。次いで、アンプルを直接真空ラインにつなげ、蒸発
によりクロロホルムをゆっくりと除去した。次いで、ア
ンプルを約１２０℃の油浴中においてすべての試薬を溶
融状態とし、続いて、火炎密封して、１２０℃に温度制
御されたオーブン中に２８時間置いた。反応後、アンプ
ルを液体窒素中に入れてクエンチし、さらに処理するま
で−２０℃で保存する。アンプルにひびを入れ、粗製ポ
リマーをクロロホルムに溶かして回収した。溶媒を蒸発
により除去し、粗製ポリマーを真空乾燥すると、黄褐色
の結晶性物質が得られた（収率は８０％から９０％）。
このポリマーをクロロホルムに溶かし、不溶の物質をろ
過により除き、ヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）で沈殿させ
ることにより精製した。ポリマーをろ過して回収し、こ
の手順を繰り返して、未反応単量体が完全に除去された
ことを確認した。２回の沈殿操作の後、ポリマーを約２
日間真空乾燥すると、全収率３０％から３５％で純粋な
白色の粉末が得られた。この物質の分子量は、反応時間
に左右されたが、代表的な値はＭｗ＝１７，０００〜２
２，０００、Ｍｎ＝６，５００〜８，０００であった。
示差走査熱量計（ＤＳＣ）分析は、ランダム無定形ポリ
マーを示す単一の転移を示す。ガラス転移（Ｔｇ）は得
られた物質の分子量により３９℃から４３℃の範囲にあ
る。ポリマーのセリン含有量は、ポリマーの加水分解に
よって得られたフェニルチオイソシアネートセリン誘導
体の測定に役立つアミノ酸分析（ＡＡＡ）、^１Ｈ ＮＭ
Ｒ（グリコリドおよびＤ，Ｌ−ラクチドサブユニットに
対するセリンＣＢＺ保護基の芳香族残基の積算）、およ
び元素分析（セリンの側鎖にのみ存在する窒素）により
決定した。ＡＡＡ分析は、通常１．７％から２．１％の
セリン含有量を示し、^１Ｈ ＮＭＲは、２．０％から
２．５％、元素分析は、２．４％から３．４％のセリン
をそれぞれ示した。ポリマーのＩＲ分析は、エステル、
カーバメートおよびヒドロキシル基の存在を調べるのに
役立った。^１Ｈ ＮＭＲは、記載した反応条件下におけ
るすべての単量体成分の相対的取り込み効率の決定を可
能にした。精製ポリマーで測定されたＤ，Ｌ−ラクチ
ド：グリコリド：Ｚ−セリンの代表的な比は、再現性よ
く、それぞれＤ，Ｌ−ラクチド５２．０％から５４．０
％、グリコリド４１．０％から４３．５％、Ｚ−セリン
２．０％から２．５％であった。グリコリドまたはＤ，
Ｌ−ラクチドに独特の共鳴^１Ｈ ＮＭＲおよび^１３ＣＮ
ＭＲシグナル強度は、互いと良く分離し、配列効果にも
感度がよかった。観測されたパターンから、ランダム配
列分布が支持された。 実施例３：本実施例は、図１に示すポリ−Ｄ，Ｌ−ラク
チド・グリコリド・疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐ
Ｓ）共重合体の調製を例示する。すべてのガラス製器具
は、一昼夜予備乾燥した。使用に先立って、真空デシケ
ータ中で冷却し、乾燥窒素流で１０分間通気した。すべ
ての反応は乾燥窒素の不活性雰囲気中で行った。撹拌棒
を備えた２頸の１００ｍＬ丸底フラスコにポリマー（Ｐ
ＬＧｐＺＳ）４００ｍｇを入れた。これに、臭化水素の
３０％酢酸溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ；ＦＷ：８０．９２）
１０ｍＬを加え、十分にスラリを生成させた。このスラ
リを３０から４５分間撹拌し、無水ジエチルエーテル
（Ａｌｄｒｉｃｈ）と、続いて、無水メタノール（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ）を滴下してクエンチした。その結果、ポリ
マー沈殿が生じ、次いで、真空ろ過により単離した。粗
製のポリマー沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、クロロ
ホルム：ヘキサンから再沈殿させた。精製ポリマーを２
日間真空乾燥すると、全収率５０％から６０％で純粋な
白色の粉末が得られた。分子量は、Ｍｗ＝１５，０００
〜１８，０００、Ｍｎ＝５，０００〜６，５００の範囲
にあった。ＣＢＺ基の脱保護速度は、ＨＢｒ／酢酸によ
るエステルバックボーンの競争的開裂より速かった。し
かし、これらの条件の下では、この試薬を用いた結果と
して、分子量分布の広がり、および生成物の分子量の減
少がある。この傾向は、より短時間で反応を行うことに
よって低減され、またはパラジウム炭素の存在下、水素
を用いる水素添加による保護基の除去によりこの傾向を
無くすことができる。ＤＳＣ分析は、ランダム無定形ポ
リマーを示す単一転移を示す。ガラス転移（Ｔｇ）は得
られた物質の分子量により４２℃から４５℃の範囲にあ
る。ポリマーのセリン含有量は、ポリマーの加水分解に
よって得られたフェニルチオイソシアネートセリン誘導
体の検出に役立つアミノ酸分析（ＡＡＡ）および元素分
析（セリンの側鎖にのみ存在する窒素）により決定し
た。ＡＡＡ分析は、通常１．４％から１．７％のセリン
含有量を示し、元素分析は、２．０％から２．７％のセ
リンをそれぞれ示した。ポリマーのＩＲ分析は、エステ
ル、アミンおよびヒドロキシル基の存在を検出するのに
役立った。残存する保護ポリマーについての^１Ｈ ＮＭ
Ｒは、９０％以上のＮ−カルボベンジルオキシ基がうま
く除去されたことを示した。より短い反応時間では、脱
保護の含有量は並行して減少する。精製ポリマーで測定
されたＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド：Ｚ−セリン：セ
リンの代表的な比は、再現性よく、それぞれＤ，Ｌ−ラ
クチド５３．０％から５５．０％、グリコリド４０．０
％から４３．０％、Ｚ−セリン０．１５％から０．２５
％およびセリン１．７％から２．１％であった。 実施例４：本実施例は、実施例２および３において合成
されたコポリマーからのフィルムの生成を説明する。フ
ィルムを生成するために、５０ｍｇのポリ−Ｄ，Ｌ−ラ
クチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）（分子量＝３１，０
００）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド−コ
−シュード−Ｚ−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）（分
子量＝２０，０００）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−
グリコリド−コ−シュード−セリンエステル（ＰＬＧｐ
Ｓ）（分子量＝１９，０００）を秤量し、１０ｍＬビー
カー中に置いた。無水クロロホルム（１ｍＬ）を添加し
て、コポリマーを溶解した。この溶液を濾過し、ペトリ
ディシュ中に置いた顕微鏡スライドに滴下して添加し
た。次いで、ペトリディッシュを２５０ｍＬビーカーで
覆い、４８時間にわたり、ゆっくりと確実にエバポレー
ションさせた。得られたフィルムは半透明であり、そし
て角度測定器を用いて行った接触角の測定はそれぞれ、
ＰＬＧについて７５°、ＰＬＧｐＺＳについて７５°、
ＰＬＧｐＳについて６８．２°の平均値を与えた。従っ
て、ＰＬＧおよびＰＬＧｐＺＳコポリマーは疎水性が同
等であるが、ＰＬＧｐｓコポリマーはわずかに親水性が
高く、表面エネルギーも高いことが判明した。実施例５： 本実施例は、ＰＢＳまたは抗原／ＰＢＳをカ
プセル化する微粒子形成のプロセスを説明する（ミクロ
スフェア形成）。本明細書中に記載される微粒子形成の
プロセスを説明する流れ図を図３に示す。具体的には、
１００ｍｇのコポリマーを、１２ｍＬのジクロロメタン
に添加した。これに、８００μＬのリン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ）溶液または８００μＬの、ＰＢＳ中の非
タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７アナログ（典型的に、１
〜２ｍｇ／ｍＬの濃度）を添加した。次いで、この混合
物をホモジナイズした（６，０００ｒｐｍで２０秒
間）。この混合物を、形成後、１００ｍＬのポリビニル
アルコール（ＰＶＡ）の１．０％水溶液中に分散し、そ
して即座にホモジナイズして（８，０００ｒｐｍで４０
秒間）、水中油中水の二重乳濁液を形成した。ＰＢＳま
たは典型的な抗原（Ｈｉｎ−４７／ＰＢＳ）をカプセル
化物として使用する場合の典型的なサイズ分布を、図４
に示す。多分散系の微粒子（大部分が、１０ミクロン未
満の大きさ）が、これらの条件下で形成された。次い
で、エバポレーションにより溶媒をゆっくりと除去し、
ミクロスフェアを遠心分離によって回収した。粒子を脱
イオン水で洗浄し（５×）、次いでドライアイス／アセ
トン浴中で凍結し、そして一晩凍結乾燥して、ミクロス
フェアの白色の自由に流動する粉末を得た（光走査測定
によって決定され、走査電子顕微鏡検査によって直接的
に確認されるように、典型的には、１．５〜１０ミクロ
ンのサイズ）。ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳミクロス
フェアについての代表的な走査電子顕微鏡写真を、図５
に示す。ＰＢＳ中の典型的な抗原（非タンパク質分解性
のＨｉｎ−４７アナログ）をカプセル化する、ＰＬＧｐ
ＺＳまたはＰＬＧｐＳミクロスフェアについての代表的
な走査電子顕微鏡写真を、図６に示す。上記の方法によ
って、いくつかの異なる抗原および／または抗原＋アジ
ュバントを含む微粒子が調製された（表１および５を参
照のこと）。 実施例６：この実施例は、微粒子コアローティング効
率、およびこのような微粒子からの抗原エピトープの回
復を説明する。同じ方法の２つの改変を用いて、単離さ
れた微粒子の抗原含量または「コアローディング」を測
定した。アミノ酸解析を、固体粒子の酸加水分解（６Ｍ
ＨＣｌ）によるか、または塩基／ＳＤＳ加水分解（０．
１Ｎ ＮａＯＨ／１％ ＳＤＳ）のいずれかによって、
次いで０．１Ｎ ＨＣｌでの中和化によって、得られた
微粒子の加水分解物に対して行った。あるいは、固体の
ミクロスフェアは、ＤＭＳＯ（ポリマーおよびタンパク
質の両方を可溶化する相溶性の溶媒）中に溶解すること
ができ、アミノ酸解析を、凍結乾燥されたサンプルに対
して直接行うことができる。酸または塩基媒介性の加水
分解は、最も再現可能な結果（＋／−５％）を与える好
ましい方法であることを証明した。利用可能な場合、有
効な固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）ポリクローナル
アッセイが加水分解物に対して行われ、エピトープ当量
を決定した。具体的には、ＥＬＩＳＡによる非タンパク
質分解性Ｈｉｎ−４７アナログの定量について、非タン
パク質分解性Ｈｉｎ−４７アナログ抗原を、アフィニテ
ィー精製したモルモット抗Ｈｉｎ−４７が被覆されたマ
イクロタイターウェル上に捕獲し（ウエル当たり非タン
パク質分解性Ｈｉｎ−４７アナログ抗原の２μｇ／ｍＬ
溶液の５０μＬを添加した）、これをＰＢＳ中の５％ス
キムミルクでブロックした。抗原の呈示を、アフィニテ
ィー精製したウサギ抗Ｈｉｎ−４７、次いで西洋ワサビ
ペルオキシダーゼＦ（ａｂｓ）２、ロバ抗ウサギＩｇＧ
によって検出した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
（割合１）の存在下の基質Ｈ_２Ｏ_２（割合９）を１００
μＬ添加して、この反応を呈色し、そして２Ｍ硫酸溶液
を各ウエルに添加することによって、反応の進行を終結
した。色の強度（４５０ｎｍでの読み取り）は、ウエル
における非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７アナログの量
に正比例した。各試験サンプルにおける非タンパク質分
解性Ｈｉｎ−４７アナログの濃度は、参照サンプルの倍
数希釈によって得られる標準曲線からの外挿によって得
られた。全てのサンプルを、二連で分析した。ＰＬＧ、
ＰＬＧｐＺＳ、およびＰＬＧｐＳコポリマー内に非タン
パク質分解性Ｈｉｎ−４７アナログまたは非タンパク質
分解性Ｈｉｎ−４７アナログ＋ＢＡＹＲ１−００５をカ
プセル化する微粒子に対するエピトープ回復の、コアロ
ーディングについてのアミノ酸解析、およびＨｉｎ−４
７特異的ポリクローナルＥＬＩＳＡ分析を、表２に示
す。Ｈｉｎ−４７から単独で調製された微粒子について
のコアローディングは、２０％〜４３％の範囲であり、
１０％〜３１％のエピトープが、処方の間に保存され
た。ＢＡＹ Ｒ１−００５の存在下で非タンパク質分解
性Ｈｉｎ−４７アナログから調製された微粒子について
のコアローディングは、２６％〜５９％の範囲（６％〜
１６％の絶対増加）であり、２０％〜３９％（４％〜１
８％の絶対増加）のエピトープが、処方の間に保存され
た。従って、ＢＡＹ Ｒ１−００５の存在下での処方
は、付随して、ローディング効率を増加し、エピトープ
を保護するために作用する。ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳ、お
よびＰＬＧｐＳコポリマー内にｒＤ−１５をカプセル化
する微粒子についてのコアローディングのアミノ酸解析
を、表３に示す。３９％〜４４％の範囲のコアローディ
ングが得られた。このタンパク質は、膜由来であり、従
って、以前の実施例の非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７
アナログよりも疎水性である。この抗原を使用する場
合、実施例１０の非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７アナ
ログに対して増加されたカプセル化効率が、常に観察さ
れた。ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳ、およびＰＬＧｐＳコポリ
マー内に、非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７アナログと
ｒＤ−１５とのカクテル（１：１のカクテル）をカプセ
ル化する微粒子に対する、コアローディングについての
アミノ酸解析、およびエピトープ回復を、表３に示す。
ｒＤ−１５の存在下での非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４
７アナログの同時カプセル化は、より高い全体のローデ
ィング効率を生じることが予測された。３５％〜６２％
の範囲のコアローディングが得られ、８％〜２６％の、
非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７アナログを使用たエピ
トープが、処方の間保存された。ＰＬＧｐＺＳまたはＰ
ＬＧｐＳコポリマーで処方される場合、より親水性の成
分（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７アナログ）の全体
のローディング効率は、ｒＤ−１５との同時カプセル化
によって増加された。ＰＬＧを使用した場合、この効果
は観察されなかった。コポリマー処方に関係なく、実施
例１０と比較して、類似の非タンパク質分解性Ｈｉｎ−
４７アナログのエピトープ回復が得られた。ＰＬＧ、Ｐ
ＬＧｐＺＳ、およびＰＬＧｐＳコポリーマー内に、Ｆｌ
ｕ Ｘ−３１またはＦｌｕ Ｘ−３１＋ＢＡＹ Ｒ１−
００５をカプセル化する微粒子についての、コアローデ
ィングのアミノ酸解析を、表４に示す。２６％〜４０％
の範囲のコアローディングが、Ｆｌｕ Ｘ−３１で得ら
れ、そしてＢＡＹ Ｒ１−００５の存在下のＦｌｕ Ｘ
−３１については、３１％〜５３％の範囲のコアローデ
ィングが得られた。従って、５％〜１３％の絶対増加
が、ＢＡＹ Ｒ１−００５の存在下で処方した場合に得
られた。唯一の例外は、ＢＡＹ Ｒ１−００５およびＰ
ＬＧｐＳとのＦｌｕ Ｘ−３１の処方であり、ここでは
９％の絶対減少を観察した。Ｆｌｕ Ａ−Ｔｅｘａｓを
カプセル化するＰＬＧｐＳ微粒子についての２１％のコ
アローディングが得られた。ＢＡＹ Ｒ１−００５の存
在下でＦｌｕ Ａ−Ｔｅｘａｓをカプセル化するＰＬＧ
ｐｓ微粒子について、３２％のコアローディングが得ら
れた。Ｆｌｕの異なる系統（Ａ−Ｔｅｘａｓ）を、ＢＡ
Ｙ Ｒ１−００５およびＰＬＧｐＳコポリマーとともに
用いた場合、カプセル化効率を増加する傾向がまた観察
された。ＢＡＹ Ｒ１−００５の存在下でＦｌｕ Ａ−
ＴｅｘａｓとともにＰＬＧｐＳを処方する場合、１１％
の絶対増加が得られた。これは、ＢＡＹ Ｒ１−００５
の存在下でのＰＬＧｐＳおよびタンパク質についての処
方は、各場合において最適化されなくてはならないこと
を示唆する。実施例１０におけるように、コアジュバン
トのＢＡＹ Ｒ１−００５の添加は、より高いローディ
ング効率を生じた。ＰＬＧｐｓコポリマー内にＦｌｕ
（３価）ワクチンまたはＦｌｕ（３価）ワクチンと、Ｂ
ＡＹ Ｒ１−００５、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、またはＰＣＰＰ
とをカプセル化する微粒子についての、コアローディン
グのアミノ酸解析を、表６に示す。７２％〜１０４％の
範囲の非常に優れたコアローディング効率は、実施例５
の手順を使用して得られた。カプセル化効率における改
良は、至適な濃度のタンパク質が使用されて主な乳濁液
が形成される場合に観察される、一般的な結果である。
この場合において、至適な濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬで
あることが、実験的に決定された。コポリマー内に、ｒ
Ｕｒｅａｓｅ、またはｒＵｒｅａｓｅ＋ＤＣ−Ｃｈｏ
ｌ、ＰＣＰＰ、もしくはＣＴ−Ｘをカプセル化する微粒
子に対するエピトープ回復の、コアローディングについ
てのアミノ酸解析、およびｒＵｒｅａｓｅ特異的ポリク
ローナルＥＬＩＳＡ分析を、表７に示す。エピトープ回
復は、アミノ酸解析によって得られる全タンパク質と、
ポリクローナルＥＬＩＳＡによって得られる全タンパク
質との差として規定され、パーセントで表現される。ｒ
Ｕｒｅａｓｅから単独で調製された微粒子についてのコ
アローディングは約４６％であり、約７２％のエピトー
プが、処方の間に回復された。同様に、ＤＣ−Ｃｈｏｌ
の存在下でｒＵｒｅａｓｅから調製される微粒子につい
てのコアローディングは約４４％であり、約６９％のエ
ピトープが回復された。わずかに高い全タンパク質が、
ＰＣＰＰの存在下でｒＵｒｅａｓｅから調製された微粒
子について確定された。６７％のコアローディングおよ
び約５５％のエピトープ回復が、この組み合わせについ
て観察された。ｒＵｒｅａｓｅおよびＣＴ−Ｘの両方が
この値に寄与するので、ｒＵｒｅａｓｅ／ＣＴ−Ｘの組
合せに関しては、ｒＵｒｅａｓｅについての全体のコア
ローディングは、アミノ酸解析によって評価することが
できなかった。ＣＴ−ＸについてのポリクローナルＥＬ
ＩＳＡアッセイを創出し、微粒子加水分解物を、全体の
ｒＵｒｅａｓｅおよびＣＴ−Ｘのそれぞれについて、ア
ッセイした。ｒＵｒｅａｓｅについて５３％の、および
ＣＴ−Ｘについて５９％のエピトープ回復が、それぞれ
見出された。これらの微粒子加水分解物に対して行われ
たＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによっ
て、非分解のｒＵｒｅａｓｅおよびＣＴ−Ｘの存在が確
認された。ｒＵｒｅａｓｅについてのポリクローナルＥ
ＬＩＳＡアッセイが、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＰＣＰＰの
ような付加物によって影響されなかったことを確認する
ために、適切なコントロール試験を行った。ＰＣＰＰの
場合、アッセイは、しばしば問題があり、一定ではなか
った。ＤＣ−Ｃｈｏｌの存在下でｒＵｒｅａｓｅをアッ
セイした場合は、同様な問題はなにも見出されなかっ
た。 実施例７：この実施例は、ＰＬＧ（比較の目的のために
コントロールとして使用した）および合成されたコポリ
マーＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐｓ内にカプセル化され
た、モデル抗原（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７アナ
ログ）についてのインビトロ放出速度、およびタンパク
質の全体の累積回復％を説明する。抗原を含有するミク
ロスフェア内に処方されたＰＬＧは、分子量＝２６，０
００であり、５０：５０の割合のＤ，Ｌ−ラクチド：グ
リコリドを有することが確定された。この物質は、実施
例２および３のコポリマーＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐ
Ｓについて得られたものに、構成および分子量が類似す
る。典型的な実験において、１４ｍｇのミクロスフェア
（ミクロスフェア加水分解物のアミノ酸分析によって確
定されるように、非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７アナ
ログのコアローディングは、ＰＬＧについて２．８μｇ
／ｍｇ、ＰＬＧｐＺＳについて５．７μｇ／ｍｇ、およ
びＰＬＧｐＳについて２．５μｇ／ｍｇ）を、２ｍＬの
エッペンドルフチューブ中に置き、これに１．０ｍＬの
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を添加した。次いで、３７℃に
維持した熱調節化オーブンに、攪拌しないでチューブを
置いた。種々の時間間隔で、ＰＢＳ溶液を抽出して、そ
してアミノ酸解析により、全タンパク質について分析し
た。各抽出後、ＰＢＳ溶液は、最大９０日まで、連続し
てサンプリングと置き換えられた。コントロール実験に
おいて、ＰＬＧまたはＰＬＧｐＳコポリマーから調製さ
れた大部分のミクロスフェア（８０重量％を超える）
が、４５日目までに消滅した。ＰＬＧｐＺＳコポリマー
から処方された、ミクロスフェアの分解は、いくらか遅
延され、本質的に同じ程度まで侵食されるまでに６０日
を要した。各群の微粒子で同様の抗原放出傾向が観察さ
れ、ここでは少量のタンパク質が、最初の数日にわたっ
て放出された。これは、１４日目までに、検出できない
限界近くまで減少し、これ以後、タンパク質放出速度
は、約３０日目での最大値まで、着実に増加した。この
時点以後、タンパク質の放出は、再び検出の限界に接近
するレベルになった。これらのサンプルからのタンパク
質の全体の累積回復％は、各群のミクロスフェアのそれ
ぞれのコアローディングに関して、４０％〜６５％の範
囲であった。図７Ａは、各サンプルについての特定の時
点での放出速度を説明し、および図７Ｂは、試験した各
サンプルについての累積放出％を示す。これらの条件下
で、ミクロスフェアからのタンパク質の最も良好な回復
は、ＰＬＧｐＳ／ＰＬＧ／ＰＬＧｐＺＳの順であるが、
ＰＬＧｐＺＳ微粒子のコアローディングは、ＰＬＧまた
はＰＬＧｐＳアナログのコアローディングの約２倍であ
り、これは放出速度を影響し得る。さらに、このマトリ
クスは、より遅延された速度で分解されることが示さ
れ、従って、微粒子内に残留物質が存在し得る。このこ
とについての証拠は、図７Ｂにおいて見ることができ、
これによってタンパク質回復の限界増加が、ＰＬＧｐＺ
Ｓ微粒子について、６０日目〜９０日目に観察された。
この同じ時間間隔にわたって、ＰＬＧまたはＰＬＧｐＳ
微粒子から回復されたタンパク質は、本質的に存在しな
かった。コントロール実験において、３７℃でインキュ
ベートされた、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳ、またはＰＬＧｐ
Ｓ微粒子を負荷されたＰＢＳの定期的な抽出物から得ら
れたＰＢＳの上清溶液を、ｐＨ変化についてモニターし
た。ＰＬＧＡマトリクスについての侵食プロセスには、
微粒子内のｐＨ微環境の変化が伴うことが知られている
（参考文献３６）。これらの変化の結果として、ｐＨ誘
導性の構造変化が生じ得るので、これはタンパク質の安
定性に対して重大な影響を有し得る。これらの変化の大
きさの指標は、周囲の媒体のｐＨをモニターすることに
よって得ることができる。本発明者らは、コポリマー内
の小さなパーセントのアミノ酸サブユニットの取込み
が、このプロセスを遅延し得ることを見出した。このこ
とは、酸性ｐＨに感受性であるタンパク質の放出期に重
要である。具体的には、１．２ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．４）中の〜１０ｍｇの微粒子をインキュベート
する場合、ＰＬＧ（分子＝２６，０００ダルトン）の上
清抽出物が、ｐＨ５．０以下になるために、約１６日間
を必要とする。類似して、ＰＬＧｐＺＳ（分子量＝２
０，０００ダルトン、約２．０％のセリンを混入）、ま
たはＰＬＧｐＳ（分子量＝１８，０００ダルトン、約
１．７％のセリンを混入）から得られた上清抽出物のｐ
Ｈは、それぞれ、約５．５〜６．２であると確定され
た。この研究において試験されたＰＬＧおよびＰＬＧｐ
Ｓについての分解速度は同様であったが（マトリクスの
質量損失によって測定される）、ＰＬＧｐＳマトリクス
の分解速度は減少した。従って、インビトロ放出研究
は、単一用量の遅延された放出送達系が、ＰＬＧｐＺＳ
またはＰＬＧｐＳコポリマーから処方されたポリマーの
微粒子の使用により達成され得ることを実証する。さら
に、マトリクス侵食を伴うｐＨ変化は、タンパク質安定
性に対する有害な影響を有し得るので、偽生理食塩水エ
ステル（例えば、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ）に由
来するマトリクス（ここではタンパク質放出期のこれら
の変化について、いくらかの緩衝能力が存在する）を使
用することが有利である。 実施例８：本実施例では、微粒子でカプセル化または微
粒子と物理的に混合した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似
体をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性を説明す
る。本発明にしたがって形成させたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺ
ＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Ｈ
ｉｎ−４７類似体を試験するために、以下の量の抗原を
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬに溶解させ、試験１日
および試験３５日目に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウ
ス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
ＬａｂｏｒａＴｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，
ＭＡ）雌１群５匹に皮下（Ｓ．Ｃ．）免疫投与した：
実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４
７類似体０．２μｇまたは０．６μｇを含むＰＬＧ、Ｐ
ＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子（図８Ａ）、および
実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４
７類似体０．８μｇまたは２．５μｇと物理的に混合し
たＰＬＧ微粒子（図８Ｂ）。カプセル化した非蛋白分解
性Ｈｉｎ−４７類似体を含む微粒子または非蛋白分解性
Ｈｉｎ−４７類似体と物理的に混合した微粒子を投与し
ても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認め
られなかった。試験＋１０、＋２４、＋３５、＋４５お
よび＋６０日に血清を採取し、抗原特異性ＥＬＩＳＡを
用い、抗Ｈｉｎ−４７ ＩｇＧ抗体の有無を評価した。
試料は、全て２回分析した。０．２μｇ／ｍＬの非蛋白
分解性Ｈｉｎ−４７類似体を含む０．０５Ｍ炭酸塩−重
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１００μＬをミクロタイタ
ープレートのウエルに添加し、室温で１夜インキュベー
ションした。ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０
（機能上、洗浄緩衝液と定義する）でプレートを洗浄し
た。ウエルに５％スキムミルク２００μＬ（機能上、ブ
ロッキング緩衝液と定義する）を加えて、インキュベー
ションした。ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で
洗浄した後、ブロッキング緩衝液で逐次希釈した試料１
００μＬをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベ
ーションした。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０で洗浄し、ＨＲＰ−共役抗体（ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）、ヒツジ抗マウスＩ
ｇＧ１（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ
（Ｃａｌｔａｇ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（Ｃａ
ｌｔａｇ））を加えたブロッキング緩衝液１００μＬを
各ウエルに添加した。３７℃で１時間インキュベーショ
ンした後、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０でウ
エルを５回洗浄し、新たに調製した発色用基質〔Ｈ_２Ｏ
_２９部およびＴＭＢ１部〕を各ウエルに添加した。暗黒
下の室温で５分間インキュベーションした後、２Ｍ Ｈ
_２ＳＯ_４溶液５０μＬを添加して反応を停止させ、ミク
ロプレートリーダーを用いて各ウェル中の液体の吸光度
を４５０ｎｍで測定した。正常なマウスのプール血清を
用いて、分析における吸光度のベースラインを確定し
た。陽性対照として、高度免疫性マウスのＨｉｎ−４７
抗血清を用いた。陰性対照として、免疫投与前血清を用
いた。血清ＩｇＡの分析は、上記の方法を以下のように
改良して行った。１．３μｇ／ｍＬの非蛋白分解性Ｈｉ
ｎ−４７類似体を含む０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝
液（ｐＨ＝９．０）１００μＬをミクロタイタープレー
トのウェルに注入して、室温で１夜インキュベーション
し、０．０６μｇ／ｍＬのウサギのＨＲＢ接合抗マウス
ＩｇＡ（ＺＹＭＥＤ、ＣＡ）１００μＬを各ウェルに添
加した。分泌型ＩｇＡの分析は、上記の方法を以下のよ
うに改良して行った。０．０６μｇ／ｍＬのラットのＨ
ＲＰ共役抗マウスＩｇＡ（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｐｈａｒｍｉ
ｇｅｎ）１００μＬを各ウエルに添加した。免疫投与後
の血清抗体の力価を図８Ａおよび８Ｂに示す。免疫投与
の結果から、ＰＬＧまたはＰＬＧｐＳ微粒子（図８Ａ）
に捕捉させた抗原を免疫システムに提供すると、可溶性
抗原単独の場合に要求される最適用量以下で、可溶性抗
原に比較して免疫原性が高くなることが認められた。さ
らに、投与量０．２μｇまたは０．６μｇのカプセル化
非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体では、投与量依存性は
認められなかったが、投与量０．８μｇまたは２．５μ
ｇの可溶性非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７の場合には、わず
かながら力価の増大が認められた。免疫投与の結果か
ら、抗原をＰＬＧ微粒子と物理的に混合して免疫システ
ムに提供すると（図８Ｂ）、可溶性抗原単独の場合と同
じ用量（０．８μｇまたは２．５μｇ）で、可溶性抗原
に比較して免疫原性がわずかに高くなることが認められ
た。しかし、溶解状態または微粒子と混合した形態で投
与すると、微粒子でカプセル化した抗原よりも数桁小さ
い反応が誘導されたに過ぎなかったことから、カプセル
化すると溶解状態または物理的混合よりも利点のあるこ
とが立証された。興味あることに、非蛋白分解性Ｈｉｎ
−４７類似体をカプセル化させた微粒子、非蛋白分解性
Ｈｉｎ−４７類似体を物理的に混合した微粒子または可
溶性非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を投与し、試験３
５日および試験６０日目に採取した血液プールのＩｇＧ
サブタイプのプロフィール（図８Ｃ）から、試験３５日
目までは、製剤に関係なく、ＩｇＧ１が優勢なサブタイ
プであり、ほかに少量のＩｇＧ２ｂが検出された。試験
６０日目には、微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Ｈ
ｉｎ−４７類似体で誘導されるＩｇＧサブタイプにクラ
ススイッチがみられ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇ
Ｇ２ｂに量的な差は認められなくなった。微粒子と物理
的に混合させた非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類復体、また
は溶解させた同類似体によって産生されるＩｇＧサブタ
イプの種類は、試験３５日目に測定した場合と実質的に
同じで、ＩｇＧ１サブタイプが優勢であった。以上のよ
うに、微粒子カプセル化抗原によってもたらされる免疫
反応には、物理的に混合した微粒子または可溶性抗原の
みの場合とは質的にかなり異なると結論される。ＢＡＢ
ＬＢ／ｃ系マウスにおけるＩｇＧ２ａサブタイプの存在
はＴＨ_１経路を示唆し、ＩｇＧ１の存在はＴＨ_２経路を
示唆していると一般的に考えられている。皮下免疫投与
の場合、可溶性抗原または微粒子と物理的に混合した抗
原ではＴＨ_２経路が優勢であり、一方微粒子でカプセル
化した抗原では比較的バランスのとれたＴＨ_１／ＴＨ_２
反応が得られる。 実施例９：本実施例では、本発明にしたがって形成させ
たＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉
させた非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体をマウスに胃内
免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗
原を０．１５Ｍ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．０）２５０μ
Ｌに溶解させ、試験１、７、１４および５７日目に６〜
８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉ
ｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）雌１群５匹に胃内
（Ｉ．Ｇ．）免疫投与した：実施例５にしたがって調製
し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体４．０μｇを含む
ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子、および
実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４
７類似体４．０μｇと物理的に混合したＰＬＧ、ＰＬＧ
ｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子（図９Ａ）。カプセル化
した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類復体を含む微粒子また
は非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体と物理的に混合した
微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行
動の変化は認められなかった。試験＋１３、＋３５、＋
６５および＋７８日に血清を採取し、実施例８に示す抗
原特異性ＥＬＩＳＡを用い、抗Ｈｉｎ−４７ ＩｇＧお
よびＩｇＡ抗体の有無を評価した。血清および腸内洗浄
液について、Ｈｉｎ−４７特異性抗体の有無を調べた。
腸管内の抗Ｈｉｎ−４７ ＩｇＧおよびｓＩｇＡを検出
し定量するために、頚椎脱臼法によりマウスを屠殺し、
小腸を摘出し、抗原特異性抗体の有無を調べた。各小腸
を幽門括約筋から盲腸の間で摘出し、毛細管を挿入して
反転させた。氷冷した酵素阻害剤溶液（０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．００５Ｍ
ＥＤＴＡ、０．００２Ｍ ＰＭＳＦ、０．０５Ｕ／ｍＬ
アプロチニンおよび０．０２％ｖ／ｖ ＮａＮ_３）５ｍ
Ｌに反転させた腸管を浸漬し、４時間インキュベーショ
ンした。小腸を除去し、遠心分離（１０００×ｇ、２０
分間）により上清を分取し、分析するまで０℃で保存し
た。上記のＨｉｎ−４７特異性ＥＬＩＳＡを用い、試料
中の抗Ｈｉｎ−４７ ＩｇＧおよびｓＩｇＡ力価を測定
した。ただし、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清の代わりにヤ
ギ抗マウスＩｇＡ抗血清を使用した。Ｉ．Ｇ．免疫投与
後の血清ＩｇＧ Ｈｉｎ−４７特異性抗体の力価を図９
Ａに示す。これらの結果から、腸内投与の場合、ＰＬ
Ｇ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子に結合した抗
原（非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体）は、同量（４μ
ｇ）の可溶性抗原に比較してかなり高い免疫原性を示
し、微粒子と物理的に混合した抗体よりも優れているこ
とが認められた。可溶性抗原から本質的に同等の反応を
誘導させるためには、微粒子でカプセル化して投与した
抗体（４μｇ）の５倍の用量（２０μｇ）が必要である
ことを実験的に確認した。腸内投与によって血清ＩｇＧ
抗体の顕著な反応を誘導するためには、１００μｇを超
える抗原を必要とする例が多いので、ほとんどすべての
蛋白質について、この結果は例外的である。非蛋白分解
性Ｈｉｎ−４７類似体をカプセル化した微粒子、非蛋白
分解性Ｈｉｎ−４７類復体と物理的に混合した微粒子ま
たは可溶性非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を投与し
て、試験５６日および試験７８日目に採取した血液から
得られた血清のＩｇＧサブタイプのプロフィール（図９
Ｂ）では、実施例８で確認した傾向と似た傾向が認めら
れた。抗原を溶解状態または微粒子と混合した形態で投
与すると、ＩｇＧ１サブタイプが優勢である。微粒子で
カプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体の場合
は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａがほぼ等しく生成し、バ
ランスのとれたプロフィールが認められた。このよう
に、微粒子でカプセル化した抗原の胃経由投与により、
比較的バランスのとれたＴＨ_１／ＴＨ_２反応が得られ
た。試験７８日目の採血から得られた抗Ｈｉｎ−４７
ＩＧＡ抗体反応の結果を図９Ｃに示す。１回量が４μｇ
の可溶性抗原の場合は、検出可能な血清ＩｇＡを確認す
ることができなかった。しかし、１回量が２０μｇで
は、反応を示す例が少数認められた。顕著な反応が認め
られたのは、ＰＬＧ微粒子でカプセル化した抗原の場合
であり、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子でカプセ
ル化した抗原に対しては、中程度の反応が認められた。
ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的
に混合した抗原については、同様に穏やかな反応が認め
られた。ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原の場合
に、血清ＩｇＡの平均濃度が最も高かった。ＰＬＧ、Ｐ
ＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した非
蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体に特異的なＩｇＧまたは
ｓＩｇＡの濃度が最も低かったのは、試験７８日目に行
った腸管洗浄の場合であった。これは、恐らくこの実験
に供したカプセル化抗原の濃度が非常に低かった（１回
量４μｇ）ためである。経口投与の場合、他の粘膜アジ
ュバントが存在しない状態で粘膜の顕著な反応を誘導す
るためには、通常３０〜１００μｇの範囲の抗原が必要
である。 実施例１０：本実施例では、本発明にしたがって形成さ
せたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕
捉させた非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体の、マウスに
鼻腔内免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の
量の抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５μＬに溶解させ、
試験１、７、１４および５７日目に６〜８週齢のＢＡＬ
Ｂ／ｃ系マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅ
ｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉ
ｎｇｔｏｎ， ＭＡ）雌１群５匹に鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）
免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、非蛋白分
解性Ｈｉｎ−４７類似体４．０μｇを含むＰＬＧ、ＰＬ
ＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子、および実施例５にし
たがって調製し、非蛋白性Ｈｉｎ−４７類似体４．０μ
ｇと物理的に混合したＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬ
ＧｐＳ微粒子（図１０Ａ）。カプセル化した非蛋白分解
性Ｈｉｎ−４７類似体を含む微粒子または非蛋白分解性
Ｈｉｎ−４７類似体と物理的に混合した微粒子を投与し
ても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認め
られなかった。試験＋１３、＋３５、＋５６および＋７
８日に血清を採取し、実施例８に示す抗原特異性ＥＬＩ
ＳＡを用い、抗Ｈｉｎ−４７ ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体
の有無を評価した。血清および肺洗浄液についてＨｉｎ
−４７特異性抗体の有無を調べた。気道中の抗Ｈｉｎ−
４７ ＩｇＧおよびｓＩｇＡを検出し定量するために、
頚椎脱臼法によりマウスを屠殺し、気管に小さな切り口
を作り、チューブを気管から肺に挿入し、４００μＬの
酵素阻害剤溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．００５Ｍ ＥＤＴＡ、０．００２
Ｍ ＰＭＳＦ、０．０５Ｕ／ｍＬアプロチニンおよび
０．０２％ｖ／ｖＮａＮ_３）を肺に注入した。次いでこ
の溶液を抜き取り、氷上に置き、遠心分離（１０００×
ｇ、２０分間）により上清を分取し、分析するまで０℃
で保存した。実施例８に示すＨｉｎ−４７特異性ＥＬＩ
ＳＡを用い、試料中の抗Ｈｉｎ−４７ ＩｇＧおよびｓ
ＩｇＡ力価を測定した。Ｉ．Ｎ．免疫投与後の血清Ｉｇ
Ｇ Ｈｉｎ−４７特異性抗体の力価を図１０Ａに示す。
これらの結果から、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧ
ｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原（非蛋白分解性Ｈｉ
ｎ−４７類似体）は、同程度の用量（４μｇ）の可溶性
抗原に比較して高い免疫原性を有することが認められ
た。鼻腔経由で投与した場合、カプセル化した抗原およ
び微粒子と物理的に混合した抗原では、本質的に同程度
の反応が得られた。非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を
カプセル化した微粒子、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似
体を物理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分解性
Ｈｉｎ−４７類似体を投与し、試験５６日および試験７
８日目に採取したプール血液のＩｇＧサブタイプのプロ
フィール（図１０Ｂ）からは、実施例８または実施例９
に示した傾向とは異なった傾向が認められた。微粒子で
カプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体の場
合、いずれの検査時期（試験５６日目または試験７８日
目）にもＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂが本質
的に同程度存在し、他に比較してバランスの取れたプロ
フィールが認められた。溶解状態または微粒子と物理的
に混合した形態で投与した抗原に関しては、試験７８日
までに類似のプロフィールが認められ、顕著な濃度のＩ
ｇＧ２ａも確認することができた。このように、鼻腔経
由で投与した場合、抗原が微粒子内にカプセル化されて
いるか、微粒子と物理的に混合されているか、溶解した
形態であるかにかかわらず、ＴＨ_１／ＴＨ_２反応は本質
的に同じであった。試験７８日目の採血から得られた抗
Ｈｉｎ−４７ ＩｇＡ抗体についての結果を図１０Ｃに
示す。可溶性抗原に関しては、血清ＩｇＧは検出できな
かった。しかし、微粒子でカプセル化または微粒子と物
理的に混合した抗原の場合には、顕著な反応が認められ
た。ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原、またはＰ
ＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原の場合に、最も
高い濃度が得られた。試験７８日目に行った肺洗浄で
は、分泌物から検出したＩｇＧおよびｓＩｇＡに関して
かなりの差が認められた。可溶性抗原からの抗Ｈｉｎ−
４７ ＩｇＧ抗体反応（図１０Ｄ）は、無視できる程度
であったが、微粒子でカプセル化またはＰＬＧ微粒子と
物理的に混合した抗原では、検査した各群の半数の動物
から顕著な濃度のＩｇＧが確認された。ＰＬＧｐＺＳま
たはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原では最も
再現性の高いＩｇＧ反応が認められ、検査したほとんど
または全てのマウスで顕著な濃度のＩｇＧが認められ
た。抗Ｈｉｎ−４７ ｓＩｇＡ抗体反応（図１０Ｅ）
は、図１０Ｄに示すＩｇＧで得られた反応と類似してい
た。可溶性抗原の反応は無視できる程度であり、ＰＬＧ
微粒子でカプセル化またはＰＬＧ微粒子と物理的に混合
した抗原ではある程度の反応が認められた。ＰＬＧｐＺ
ＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原では
最も顕著なｓＩｇＡ反応が認められ、大部分のマウスで
かなりの濃度のｓＩｇＡが検出された。粘膜表面に局部
的な防護を誘導すると、しばしば局部分泌物中にＩｇＧ
およびｓＩｇＡが検出される。鼻腔免疫投与しても上気
道に免疫を誘導しないという可能性を否定することはで
きないが、微粒子でカプセル化または微粒子と混合した
抗原は血清ＩｇＧ抗体反応を誘導することは明らかであ
る。ＩｇＧおよびｓＩｇＡを局部的に誘導するために
は、微粒子、特にＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子
と抗原を物理的に混合することがこれらの条件下で比較
的適した方法であると思われる。 実施例１１：本実施例では、本発明にしたがって形成さ
せたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕
捉させたＦｌｕ Ｘ−３１またはＦｌｕ Ｘ−３１＋ｃ
ｏ−アジュバントＢＡＹ Ｒ１−００５をマウスに皮下
免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗
原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬに溶解させ、試験
１日目に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（Ｃｈａｒ
ｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）雌１
群６匹に皮下（Ｓ．Ｃ．）免疫投与した：実施例５にし
たがって調製し、５．０μｇのＦｌｕ Ｘ−３１（ＨＡ
１．５μｇ）または５．０μｇのＦｌｕ Ｘ−３１
（ＨＡ １．５μｇ）＋５０μｇのＢＡＹ Ｒ１−００
５（溶液投与）または約２０μｇのＢＡＹ Ｒ１−００
５（ｃｏ−カプセル投与）を含むＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳ
およびＰＬＧｐＳ微粒子（図１１）。カプセル化したＦ
ｌｕ Ｘ−３１またはＦｌｕ Ｘ−３１＋ＢＡＹ Ｒ１
−００５を含む微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病
理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋２
１および＋３３日に血清を採取し、実施例８に示す抗原
特異性ＥＬＩＳＡを用い、抗Ｆｌｕ Ｘ−３１ ＩｇＧ
抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。
４．０μｇ／ｍＬのＦｌｕ Ｘ−３１を含む０．０５Ｍ
炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）５００μＬをミ
クロタイタープレートのウェルに添加し、室温で１夜イ
ンキュベーションした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０（機能上、洗浄緩衝液と定義する）でプレートを
洗浄した。ウェルに５％スキムミルク２００μＬ（機能
上、ブロッキング緩衝液と定義する）を添加して、イン
キュベーションした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０で洗浄した後、ブロッキング緩衝液で逐次希釈した
試料１００μＬをウェルに添加し、３７℃で１時間イン
キュベーションした。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ ２０で洗浄し、ＨＲＰ−共役抗体（ヤギ抗マウ
スＩＧＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇ
Ｇ２ｂ）を加えたブロッキング緩衝液１００μＬを各ウ
ェルに添加した。３７℃で１時間インキュベーションし
た後、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０でウェルを
５回洗浄し、新たに調製した発色用基質〔Ｈ_２Ｏ_２９部
およびＴＭＢ１部〕を各ウェルに添加した。暗黒下の室
温で５分間インキュベーションした後、２Ｍ Ｈ_２ＳＯ
_４溶液５０μＬを添加して反応を停止させ、ミクロプレ
ートリーダーを用いてウェル中の液体の吸光度を４５０
ｎｍで測定した。正常なマウスの血液プールを用いて、
分析における吸光度のベースラインを確定した。陽性対
照として、高度免疫性マウスのＦｌｕ Ｘ−３１抗血清
を用いた。陰性対照として、免疫投与前血清を用いた。
免疫投与後の血清抗体の力価を図１１に示す。１回の免
疫投与（試験１日目）の結果から、抗原をＰＬＧまたは
ＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させて免疫システムに提供する
と、可溶性抗原単独の場合に比較して免疫原性が高くな
ることが認められた。ＰＬＧｐＺＳ微粒子でカプセル化
したＦｌｕ Ｘ−３１またはＦｌｕ Ｘ−３１＋ＢＡＹ
Ｒ１−００５で、最も顕著な結果が得られた。試験し
た全ての微粒子で最適用量以下の用量のＢＡＹ Ｒ１−
００５をカプセル化したが、ＰＬＧｐＺＳ微粒子では可
溶性ＦＬｕ Ｘ−３１およびＢＡＹ Ｒ１−００５単独
の場合に比較して免疫原性反応が顕著に高くなることが
認められた。本実施例に示した試験によって、本発明に
したがって調製した微粒子に抗原を捕捉させると、イン
フルエンザビールスから得られたビールス性抗原の免疫
原性が高く、高濃度の血清ＩｇＧ抗体を産生した。さら
に、微粒子システムを一回だけ免疫投与した場合でも、
免疫原性が他の場合に比較して顕著に増進したことか
ら、これらの材料で単回投与ワクチンを開発することが
できると考えられる。 実施例１２：本実施例では、本発明にしたがって形成さ
せたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕
捉させたＦｌｕ−Ｘ−３１またはＦｌｕ−Ｘ−３１＋ｃ
ｏ−アジュバントのマウスに鼻腔内免疫投与したときの
免疫原性を説明する。以下の量の抗原をＰＢＳ（ｐＨ
７．４）２５μＬに溶解させ、試験１日および試験３４
日目に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（Ｃｈａｒｌ
ｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）雌１群６匹
に鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）免疫投与した：実施例５にしたが
って調製し、５．０μｇのＦｌｕ−Ｘ−３１（ＨＡ１．
５μｇ）または５．０μｇのＦｌｕ−Ｘ−３１（ＨＡ
１．５μｇ）＋５０μｇのＢＡＹ Ｒ１−００５（溶液
投与）または約２０μｇのＢＡＹ Ｒ１−００５（ｃｏ
−カプセル投与）を含むＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰ
ＬＧｐＳ微粒子（図１２）。カプセル化したＦｌｕ−Ｘ
−３１またはＦｌｕ−Ｘ−３１＋ＢＡＹ Ｒ１−００５
を含む微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化ま
たは行動の変化は認められなかった。試験＋２１、＋３
３および＋９２日に血清を採取し、実施例１０に示す抗
原特異性ＥＬＩＳＡを用い、抗Ｆｌｕ−Ｘ−３１ Ｉｇ
Ｇ抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。
可溶性抗原、可溶性抗原＋ｃｏ−アジュバントまたはカ
プセル化抗原を鼻腔内免疫投与したマウスで、同程度の
抗Ｆｌｕ−Ｘ−３１ ＩｇＧ抗体反応が認められた。興
味あることに、カプセル化抗原＋ｃｏ−アジュバントで
は、鼻腔経由で投与した場合、試験＋２１日および＋３
３日に可溶性抗原、可溶性抗原＋アジュバントまたはカ
プセル化抗原と比較して免疫反応の低下（放出遅延によ
るものと思われる）が認められた。しかし、２回目の免
疫投与後（試験３４日）には、これらの群でも顕著な反
応の上昇が認められ、試験＋９２日には用いたアジュバ
ントには関係なく、基本的に同じ程度の免疫原性が認め
られた。本実施例で記載した鼻腔内免疫投与の結果か
ら、本発明に係わる微粒子に捕捉させても、抗原または
抗原＋ＣＯ−アジュバントの免疫原性には顕著な増進が
認められなかった。 実施例１３：本実施例では、微粒子でカプセル化または
物理的に微粒子と混合したＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓまた
はＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ＋ＢＡＹ Ｒ１−００５をマ
ウスに皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。ほ
とんどの非複製ウイルスワクチンは、防御効果のある十
分な血清抗体力価を得るために反復投与が必要であるこ
とは公知である。したがって、抗原を単回投与すること
によって同様な効果を上げることが強く望まれている。
我々は、本発明にしたがって形成させたＰＬＧｐＳ微粒
子に捕捉させ、または微粒子と物理的に混合したＦｌｕ
−Ａ−ＴｅｘａｓまたはＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ＋ｃｏ
−アジュバントを単回投与したときの免疫原性を検討し
た。以下の量の抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬ
に溶解させ、試験１日目に６〜８週齢のＤＢＡ２系マウ
ス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍ
Ａ）雌１群６匹に皮下免疫投与した：実施例５にしたが
って調製し、１．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ（Ｈ
Ａ０．３５μｇ）または１０．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔ
ｅｘａｓ（ＨＡ３．５μｇ）＋約２．０μｇのＢＡＹ
Ｒ１−００５または約１０．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔｅ
ｘａｓ（ＨＡ３．５μｇ）＋約２０μｇのＢＡＹ Ｒ１
−００５を含むＰＬＧｐＺＳ、または実施例５にしたが
って調製し、１．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ（Ｈ
Ａ０．３５μｇ）＋約２０μｇのＢＡＹ Ｒ１−００５
または１０．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ（ＨＡ
３．５μｇ）＋２０μｇのＢＡＹ Ｒ１−００５と物理
的に混合した微粒子（図１３）。Ｆｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａ
ｓ＋ＢＡＹ Ｒ１−００５を含むＰＬＧｐＳ微粒子のコ
ア負荷量は、アミノ酸分析によって測定した（表１）。
投与した微粒子の質量は、低用量群にはＦｌｕ−Ａ−Ｔ
ｅｘａｓとして１．０μｇ（ＨＡ０．３５μｇ）になる
ように、高用量群にはＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓとして１
０．０μｇ（ＨＡ３．５μｇ）になるように調整した。
したがって、高用量群に投与したＢＡＹＲ１−００５の
用量は、低用量群に投与したＢＡＹ Ｒ１−００５より
も１０倍高かった。ｃｏ−カプセル化するＢＡＹ Ｒ１
−００５の量がほぼ等しくなるように製剤条件は調整で
きるものと期待される。カプセル化したＦｌｕ−Ａ−Ｔ
ｅｘａｓまたはＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ＋ＢＡＹ Ｒ１
−００５を含む微粒子を投与したマウスで、肉眼的病理
変化または行動の変化は認められなかった。試験＋２１
および＋４２日または＋５７日に血清を採取し、赤血球
凝集抗体試験（ＨＡＩ）で機能抗体の有無を評価した。
試料は、全て２回分析した。非特異的阻害剤を除去する
ために１０％ニワトリ赤血球細胞とともに３０分間イン
キュベーションした熱不活性化マウス血清を用い、イン
フルエンザＨＡＩ試験を行った。２倍に希釈した血清を
９６穴マイクロタイタープレートに添加し、等量のウイ
ルス懸濁液（８ＨＡ単位）を各ウエルに添加し、室温で
３０分間インキュベーションした。１０％ニワトリ赤血
球細胞懸濁液を各ウエルに添加し、室温で３０分間イン
キュベーションした。試験には陽性血清および陰性血清
を含め、試験の特異性および感受性を確認した。陽性血
清はインフルエンザウイルスを免疫投与した動物から得
た。陰性血清はＰＢＳを免疫投与した動物から得、力価
は１５またはそれ以下とした。ＨＡＩ力価は、赤血球の
凝集を完全に阻害する最高希釈率の逆数で表示される。
図１３に示す単回免疫投与（試験１日）の結果から、溶
液の形状またはＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉された状態で免
疫系に投与した抗原（図１３）は試験＋４２日までに無
視できる程度またはきわめて低い機能的抗体を発現した
に過ぎなかった。ＢＡＹ Ｒ１−００５と物理的に混合
した形態で免疫系に投与したＦｌｕ（１０μｇ）では、
発現したＨＡＩ反応が可溶性抗原を同じ用量で投与した
場合と比較して８倍高く、ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ微粒子を
いずれかの用量で投与した場合と比較して６倍高かっ
た。最も顕著な結果が得られたのはＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ
（Ａ−Ｔｅｘａｓ）／ＢＡＹ Ｒ１−００５微粒子製剤
であり、低用量（１μｇ）でもＨＡＩ力価は可溶性抗原
の８倍、高用量（１０μｇ）では可溶性抗原の３２倍で
あった。Ｆｌｕ＋ＰＬＧｐＳ微粒子またはＦｌｕ＋ＰＬ
ＧｐＳ微粒子＋ＢＡＹＲ１−００５の物理的混合物を投
与した対照群でも、ＨＡＩ力価の中等度の増加が認めら
れた。Ｆｌｕ＋ＰＬＧｐＳ微粒子の物理的混合物で表現
されたＨＡＩ反応は、可溶性抗原を同じ用量で投与した
場合と比較して低用量では４倍、高用量では８倍高かっ
た。Ｆｌｕ＋ＰＬＧｐＳ微粒子＋ＢＡＹ Ｒ１−００５
の物理的混合物で表現されたＨＡＩ反応は、可溶性抗原
を対応する用量で投与した場合と比較して４倍高かっ
た。本実施例に示した試験で、インフルエンザウイルス
から得たウイルス抗原は抗原を本発明にしたがって形成
させた微粒子に追加アジュバントの存在下で捕捉させた
場合、高レベルの機能的抗体を表現することが確認され
た（ＨＡＩ力価で測定）。単回免疫投与後に微粒子抗原
＋アジュバントｃｏ−カプセル化系で用量依存性が認め
られたこと、さらに著しく高い機能的抗体（防御作用と
相関がある）が表現されたことから、さらにこれらの材
料を用いて単回投与剤型を開発することができる可能性
を示唆している。 実施例１４：本実施例では、マイクロカプセル化に典型
的に用いた製剤条件のＦｌｕ（三価）ワクチンの各成分
に対する影響を検査する。Ｆｌｕ（三価）ワクチンは、
３種類の相同ＨＡストレイン（Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／Ｊ
ｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）をほぼ等
量含む。各特異的ＨＡ成分の定量は、単一放射免疫拡散
法（ＳＲＩＤ）で行った（参考文献３２）。ＳＲＩＤ法
では、各ＨＡ成分の検出にポリクロナール血清を用い、
この血清は配座の変化に感受性が高い。この検定法で検
出される各成分の最低濃度は、約１０μｇ／ｍＬであ
る。Ｆｌｕ（三価）ワクチン２．０ｍＬ（濃度＝２６５
μｇ／ｍＬ）を含む一連の試料を調製した。これらの各
試料について、ＳＲＩＤでＡ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡ＝
２０．２５μｇ／ｍＬ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ
特異性ＨＡ＝２０．６０μｇ／ｍＬ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ
特異性ＨＡ＝２１．４２μｇ／ｍＬを測定した。マイク
ロカプセル化手順に典型的に用いた溶媒、例えばジクロ
ロメタン（ＤＣＭ）または酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）の
影響を、ホモジナイズ手順と同様の条件下で評価した。
ホモジナイズ手順のモデルとして、短時間（３０秒間）
の超音波処理を用いた。さらに、少量の添加物、例えば
ＢＡＹ（糖脂質ペプチド）およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（カチ
オン性脂質）を用い、抗原の回収率が向上するか否か検
討した。反応のスケールは、実施例５で記載した手順と
同様になるように設計した。ＳＲＩＤ分析を行う前に各
混合液の有機溶媒を留去し、適当な対照を検査し、有機
溶媒、ホモジナイズの方法またはＢＡＹまたはＤＣ−Ｃ
ｈｏｌの添加が結果に影響を及ぼしたか否か検討した。
この試験の結果を表８に示す。エントリー１と２を比較
して明らかなように、超音波処理の影響はきわめてわず
かであった。エントリー３と４から、ＥｔＯＡｃまたは
ＤＣＭ等の有機溶媒中で超音波処理すると、抗原の回収
率に影響が認められた。ＥｔＯＡｃを用いた場合、Ａ／
Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡおよびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕ
ｒｇ特異性ＨＡの回収率はそれぞれ７５％および７８％
であった。ＥｔＯＡｃ処理後には、この方法でＢ／Ｈａ
ｒｂｉｎ特異性ＨＡ成分は検出されなかった。この成分
の検出限界は低く、約１０μｇ／ｍＬであったことか
ら、この成分の実際の回収率は５０％以下であったと考
えられる。溶媒としてＤＣＭを用いた場合、Ａ／Ｔｅｘ
ａｓ特異性ＨＡおよびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ特
異性ＨＡの回収率はそれぞれ８５％および９６％で、Ｂ
／Ｈａｒｂｉｎ特異性ＨＡの回収率は５０％以下であっ
た。エントリー５および６では、溶媒としてＥｔＯＡｃ
を用いたときの有機相に対する添加物ＢＡＹおよびＤＣ
−Ｃｈｏｌの影響を検討した。この組合せでは全ての成
分が検出され（検出限界＞５０％）、回収率はＡ／Ｔｅ
ｘａｓ特異性ＨＡで６５％（ＢＡＹ）および８２％（Ｄ
Ｃ−Ｃｈｏｌ）、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ特異性ＨＡで８２％
（ＢＡＹ）および７０％（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）およびＡ／
Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ特異性ＨＡで８７％（ＢＡ
Ｙ）および８８％（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）であった。エント
リー７および８では、溶媒としてＤＣＭを用いたときの
有機相に対する添加物ＢＡＹおよびＤＣ−Ｃｈｏｌの影
響を検討した。分析の結果、一部の成分は完全には回収
されず、分析にある程度の影響が認められた。特に、Ａ
／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡは９１％（ＢＡＹ）および９２
％（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が回収された。Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ
特異性ＨＡの回収率は、いずれの場合も５０％以下であ
った。Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ特異性ＨＡでは、
これらの組合せで直線性からのかけ離れがあったため、
明瞭な結果が得られなかった。これは、溶媒としてＤＣ
Ｍを用いた場合にのみ認められた。ＥｔＯＡｃに溶解さ
せたＦｌｕ（三価）ワクチンおよび添加物としてＢＡＹ
またはＤＣ−Ｃｈｏｌを用いた製剤では、いずれの成分
でも最高の回収率が得られた。この実施例から、ＢＡＹ
またはＤＣ−Ｃｈｏｌ等の親油性物質は感受性成分を含
む製剤の安定化に使用できると考えられる。このような
性質を有する物質はインターフェースとして作用し、ホ
モジナイズの過程で蛋白が空気／水疎水性表面に接触す
るのを防止する。蛋白構造は、これらの作用に特に感受
性が高い。この実施例で報告したＳＲＩＤ分析結果は、
この結論を裏づけている。 実施例１５：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子でｃｏ−
カプセル化したＦｌｕ（三価）またはＦｌｕ（三価）＋
アジュバントカクテルをマウスに皮下免疫投与したとき
の免疫原性について説明する。Ｆｌｕ（三価）ワクチン
は、３種類の相同ＨＡストレイン（Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ
／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）をほ
ぼ等量含む。Ｆｌｕ（三価）ワクチン１０．０μｇ中の
総ＨＡ含有量は、２．３５μｇである。単一放射免疫拡
散法（ＳＲＩＤ）（参考文献３２）で各特異性ＨＡ成分
を測定したところ、Ａ／Ｔｅｘａｓで０．７６μｇ、Ａ
／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇで０．８１μｇ、Ｂ／Ｈａ
ｒｂｉｎで０．７８μｇであった。この試験では、各成
分のＨＡ投与量が実施例１３と比較して著しく低かっ
た。すなわち、実施例１３で用いた単価ワクチンは、約
３．２５μｇのＡ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡを含んでい
た。Ｔｈ_２／Ｔｈ_１プロファイルに基づいて選抜したア
ジュバント、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（カチオン性脂質）、ＢＡ
Ｙ Ｒ１−００５（Ｔｈ_２／Ｔｈ_１のバランスのとれた
糖脂質ペプチド）、主要Ｔｈ_２のＰＣＰＰ（ポリ［ジ
（カルボキシラートヘノキシ）−ホスファゼン］ナトリ
ウム塩）（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）の存在下で、マ
ウスに皮下免疫投与した。ＰＬＧｐＳ微粒子は、実施例
８と同様にバランスのとれたＴｈ_２／Ｔｈ_１プロファイ
ルを誘導することが認められた。６〜８週齢のＤＢＡ−
２系マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄ
ｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔ
ｏｎ、ＭＡ）雌１群８匹に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５
０μＬに溶解させた抗原を試験１日目に以下の用量で免
疫投与した。実施例５で調製し、Ｆｌｕ（三価、ＨＡと
して２．３５μｇ）１０．０μｇまたはＦｌｕ（三価、
ＨＡとして２．３５μｇ）１０．０μｇ＋ＢＡＹ Ｒ１
−００５、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰを含むＰＬＧ
ｐＳ微粒子（表５）。Ｆｌｕ（三価）を含むＰＬＧｐＳ
微粒子のコア負荷量は、アミノ酸分析によって測定した
（表６）。いずれのＰＬＧｐＳ微粒子製剤でも、抗原の
回収率は良好であった（＞７０％）。この結果は、蛋白
溶液の初期濃度がカプセル化効率に顕著な影響を及ぼす
という我々の知見と一致した。投与した微粒子の質量
は、Ｆｌｕとして１０．０μｇ（三価、総ＨＡ２．３５
μｇ）の必要容量になるように調整した。共投与したア
ジュバントの用量を最適化する努力は行わなかったが、
これは製剤条件によって決まると期待される。カプセル
化したＦｌｕ（三価）ワクチンまたはＦｌｕ（三価）ワ
クチン＋アジュバントカクテルを含むＰＬＧｐＳ微粒子
を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の
変化は認められなかった。試験２１、４２および５７日
に血清を採取し、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａを評
価し、赤血球凝集抗体試験（ＨＡＩ）で機能抗体の有無
を評価した。各ストレイン（Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／Ｊｏ
ｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）について検
査を行い、カプセル化および放出のマルチコンポーネン
ト系における免疫原性および機能抗体に対する影響を検
討した。試料は、全て２回分析した。抗体ＥＬＩＳＡ
は、実施例１３と同様に行った。図１４ａ〜ｃに示すよ
うに、ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）微粒子製剤によって
Ｆｌｕ（三価）ワクチンに含まれる各ストレインに特異
的なＩｇＧ抗体反応が誘導された。試験５７日までに総
ＩｇＧ力価が最も高かったのは、ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ
（三価）／ＤＣ−Ｃｈｏｌ微粒子製剤であった。この結
果は、検査したいずれのストレインにも該当した（Ａ／
Ｔｅｘａｓ＝可溶性Ｆｌｕ対照の３２倍、Ａ／Ｊｏｈａ
ｎｎｅｓｂｕｒｇ＝可溶性Ｆｌｕ対照の６４倍、Ｂ／Ｈ
ａｒｂｉｎ＝可溶性Ｆｌｕ対照の６４倍）。試験５７日
までにＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＰＣＰＰ微粒子製
剤で比較的高いＩｇＧ抗体反応（力価に基づく）が認め
られたのは、Ａ／Ｔｅｘａｓ（可溶性Ｆｌｕ対照の２
倍）、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ（可溶性Ｆｌｕ対
照の４倍）であった。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）、Ｐ
ＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＢＡＹ微粒子製剤および可
溶性Ｆｌｕ（三価）ワクチン対照では、試験５７日まで
に誘導された総特異性ＩｇＧ抗体反応に基本的に差がな
かった。これは、単価ワクチンを用いた実施例１３の結
果（これら３種類の系で結果に差が認められなかった）
と一致した。各ＨＡストレインについてインフルエンザ
ＨＡＩ試験を行うために血清試料を５６℃で３０分間加
熱して補体を不活性化し、トリプシン（８ｍｇ／ｍＬを
０．１ｍＬ）／過ヨウ素酸塩（０．００１Ｍを１２．５
μＬ）で前処理を行って内在血球凝集阻害物質を破壊し
た。連続希釈した抗血清について、標準的なＨＡＩ法
（参考文献３３）を用い、それぞれ４ＨＡＵのＡ／Ｔｅ
ｘａｓ、Ａ／ＪｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇまたはＢ／Ｈａ
ｒｂｉｎウイルスによる１％ニワトリ赤血球細胞の凝集
阻害能を２連で測定した。図１５ａ〜ｃに示すように、
三価ワクチンに含まれる各ＨＡストレインに対して特異
的なＨＡＩ力価が誘導された。Ｆｌｕ（三価）ワクチン
＋ＤＣ−Ｃｈｏｌを含むＰＬＧｐＳ微粒子製剤では、試
験５７日までに最も高く持続性のあるＨＡＩ力価が認め
られた（ＨＡ特異性Ａ／ＴｅｘａｓではＨＡＩ力価２４
０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の８倍）、ＨＡ特異性Ａ
／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇでは２４０（可溶性Ｆｌｕ
（三価）対照の１６倍）、ＨＡ特異性Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ
では６０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の８倍））。Ｆｌ
ｕ（三価）＋ＢＡＹを含むＰＬＧｐＳ微粒子製剤でも、
特に高いＨＡＩ力価が認められた（ＨＡ特異性Ａ／Ｔｅ
ｘａｓではＨＡＩ力価６０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照
の２倍）、ＨＡ特異性Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇで
は６０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の４倍）、ＨＡ特異
性Ｂ／Ｈａｒｂｉｎでは１５（可溶性Ｆｌｕ（三価）対
照と同等））。この実施例でＦｌｕ（三価）ワクチンを
含むＢＡＹ製剤で認められたＨＡＩ力価は、実施例１３
の低用量（Ｆｌｕ（単価）ワクチン１μｇ−Ａ／Ｔｅｘ
ａｓ特異性ＨＡとして０．３２５μｇを投与）と同等で
あった。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＰＣＰＰ微粒子
製剤では、検出されるほどの機能抗体反応の誘導は認め
られなかった。高用量のＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／
ＤＣ−Ｃｈｏｌ製剤微粒子を投与した実験を行った。こ
の群のマウスには、試験１日目に別の群に投与したＦｌ
ｕ（三価）ワクチンの約２倍を免疫投与した（投与量：
Ｆｌｕ（三価）＝２１．２μｇ、総ＨＡ＝５．００μ
ｇ）。この高用量で得られた結果は、図１５ａ〜ｃに示
す。可溶性Ｆｌｕ（三価）ワクチンをこの用量で免疫投
与した対照群で誘導されたＨＡＩ力価はわずかであり、
検査した低用量群と基本的に同等であった（結果は表示
せず）。試験５７日までに、この製剤では低用量群と比
較して著しく高い特異性ＨＡＩ力価の誘導が認められた
（ＨＡＩ力価：ＨＡ特異性Ａ／Ｔｅｘａｓで４８０（可
溶性Ｆｌｕ（三価）対照の５倍）、ＨＡ特異性Ａ／Ｊｏ
ｈａｎｎｅｓｂｕｒｇで４８０（可溶性Ｆｌｕ（三価）
対照の５倍）、ＨＡ特異性Ｂ／Ｈａｒｂｉｎで１２０
（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の３倍））。さらに、誘導
されたＨＡＩ力価は持続性があり、試験２１日から５７
日まで同じレベルに保たれることが確認された。ＢＡＹ
またはＤＣ−Ｃｈｏｌ等の添加物はポリマーおよび有機
溶媒を含む有機相に導入され、インターフェースとして
作用し、製剤の過程で抗原を防御する（実施例１３、表
>８参照）。それによって、抗原物質の回収率が高くな
る。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行った放出試験で、３
日以内にカプセル封入成分のかなりの量が放出されるこ
とが確認された。カプセル封入抗原の約５〜１５％が、
この段階で検出されることが実験的に確認された（微粒
子の表面に局在している抗原）。初回免疫は、アジュバ
ントの共放出によって著しく増強される。これは、初期
放出段階で抗原の周囲に局在していることによるものと
思われる。ＰＣＰＰ等のアジュバントと抗原をｃｏ−カ
プセル化したＰＬＧｐＳ微粒子製剤では、ワクチン効果
の改善が得られないことは注目に値する。この物質は一
次乳化液の水相に添加したが、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＢ
ＡＹの親油性を保持していない。ＰＣＰＰは別の系で強
いアジュバント特性を有することが知られているが、こ
の実施例ではカプセル化効果または微粒子製剤の抗原性
補強効果にはきわめてわずかな改善が認められたに過ぎ
なかった。この実施例に示す試験で、多成分系インフル
エンザウイルスのウイルス抗原はＦｌｕ抗原をｃｏ−カ
プセル化したＢＡＹまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ等の存在下で
微粒子に捕捉させると高レベルの総ＩｇＧ抗体および機
能抗体（ＨＡＩ）を誘導することが確認された。 実施例１６：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子製剤をマ
ウスモデルに単回皮下免疫投与したときの感染率および
防御率を評価した結果を説明する。卵由来尿膜腔液中の
生インフルエンザウイルスＡ／台湾／１／８６（Ｈ１Ｎ
１）、マウス適応Ａ／台湾／１／８６および市販のＡ／
台湾／１／８６単価サブユニットワクチン（Ｆｌｕｚｏ
ｎｅ^Ｒ）を、Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｃｏｎ
ｎａｕｇｈｔ、米国（Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡ）か
ら入手した。Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂ
ｕｒｇおよびＢ／Ｈａｒｂｉｎストレイン（ＰＢＳ０．
２５ｍＬ中総ＨＡ２．３５μｇ）を含むＦｌｕ（三価）
ワクチンを、試験１日目に６〜８週齢のＤＢＡ−２系マ
ウス雌（実施例１４に記載）１群８匹に皮下免疫投与し
た。対照群のマウスには、ＰＢＳのみまたは尿膜腔液と
して生Ａ／Ｔｅｘａｓウイルスを４００血球凝集単位
（ＨＡＵ）で投与した。１４日後に麻酔下のマウスに尿
膜腔液中のマウス適応生Ａ／台湾／１／８６ワクチン５
０μＬを鼻腔内攻撃投与した（ＬＤ５０の５倍）。攻撃
投与後１４日間にわたって、毎日死亡率を測定し、２日
に１回罹病率（体重変化）を測定して防御率を評価し
た。攻撃投与の結果を図１６に示す。期待したように、
相同性生（Ａ／Ｔｅｘａｓ）ウイルスを免疫投与した全
てのマウスで認められた体重の減少は最小限で、ベース
ラインからの体重変化率に基づいて判断したところ、攻
撃投与後２週間以内に完全に回復した。また、ＰＢＳを
免疫投与したマウスでは期待したように急激な体重の減
少が認められ、試験１０日までにベースラインの３０％
以下に減少した。この対照群では、１０日までに全ての
動物が死亡した。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＤＣ−
Ｃｈｏｌ微粒子製剤を免疫投与したマウスでは攻撃投与
後４日以内に体重の平均減少率が８％であったことか
ら、感染が起こったと考えられた。検査したＰＬＧｐＳ
製剤群の動物のうちこれらのマウスでは急速な回復が認
められ、２週間後にはベースラインの１００％に達し
た。群全体の動物が回復し、各マウスで防御力価が上昇
したものと考えられた。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／
ＢＡＹ微粒子製剤を免疫投与したマウスでは攻撃投与後
１０日以内に体重の平均減少率が１０％であったことか
ら、感染が認められた。これらのマウスでは緩慢な回復
が認められ、２週間後にはベースラインの９５％に達し
た。群全体の動物が回復し、これらの各マウスで防御力
価の上昇が認められたが、回復速度から防御レベルは同
じ用量を投与したＤＣ−Ｃｈｏｌ群よりも低かったもの
と考えられる。これは、実施例１５で測定したこれら２
群のＨＡＩ値と一致する。可溶性Ｆｌｕ（三価）ワクチ
ン対照群およびＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）またはＰＬ
ＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＰＣＰＰ微粒子製剤群では、
効果が低かった。これらの群では、攻撃投与後８〜１０
日までに２３〜２９％の平均体重の減少が認められた。
これらのマウスでは回復速度が最も遅く、２週間後にベ
ースラインの８６〜９２％に回復した。さらに、これら
の群では数匹の死亡例がみられた。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ
（三価）微粒子製剤群では、８匹中６匹が生存した。Ｐ
ＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＰＣＰＰ製剤群では８匹中
７匹、Ｆｌｕ（三価）対照群では８匹中６匹が生存し
た。これらの例では、防御が認められないか、認められ
ても低かった。実施例１４で、我々はマイクロカプセル
化条件のＦｌｕ（三価）ワクチンに対する影響を評価し
た。ＳＲＩＤ法で抗原回復のストレイン特異性（Ａ／Ｔ
ｅｘａｓ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、Ｂ／Ｈａｒ
ｂｉｎ）分析を行ったところ、ＰＬＧｐＳポリマーおよ
びＥｔＯＡｃを溶媒とし、有機相にＣｈｏｌまたはＢＡ
Ｙを用いた場合、この多成分系の３ストレイン全てで抗
原活性の低下がきわめてわずかであることが認められ
た。実施例１５で、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＢＡＹの存在
下で製剤したＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）ワクチンの単
回皮下投与で高い機能抗体（防御に関連がある）が誘導
されたことから、これらの製剤はマウスモデルに利用で
きることが確認された。実施例１６で記載した攻撃／防
御試験の結果は、機能抗体試験で得られた防御効果の順
位とよく一致した。抗原およびアジュバントを生分解性
微粒子に捕捉させて投与すると、さらに効果的に免疫系
に提供することができる。ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＢＡＹ
と抗原の可溶性混合物で認められた免疫増強効果は、こ
れを製剤に利用することによって免疫活性がさらに向上
することを示唆している。これらの結果は、使用回数お
よび用量（抗原／アジュバント）を軽減できることを示
唆している。特に、この実施例はこれら新規微粒子製剤
を単回投与で有効な製剤の開発に利用できることを強く
示唆している。 実施例１７：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子中にカプ
セル化したＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉ
ｓ由来トランスフェリン結合蛋白（Ｔｂｐ−２）（ＷＯ
９７／１３７８５、本出願人、参考例としてここに引
用する）、ＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合したＴｂｐ
−２または明礬で製剤したＴｂｐ−２をマウスに皮下免
疫投与したときの免疫原性について説明する。６〜８週
齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅ
ｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗ
ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）雌１群５匹に、ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）２５０μＬに溶解させた抗原を試験１、２８
および４３日目に以下の用量で皮下免疫投与した：実施
例５にしたがって調製し、０．３μｇのＴｂｐ−２を含
むＰＬＧｐＳ微粒子、実施例５にしたがって調製し、
０．３μｇのＴｂｐ−２と物理的に混合したＰＬＧｐＳ
微粒子、および０．３μｇのＴｂｐ−２と製剤した明礬
（１．５ｍｇ／回）（表５）。カプセル化したＴｂｐ−
２を含む微粒子、Ｔｂｐ−２を物理的に混合した微粒子
またはＴｂｐ−２を物理的に混合した明礬を投与したマ
ウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められな
かった。試験＋１４、＋２７、＋４２および＋５５日で
血清を採取し、実施例８と同様に抗原特異性ＥＬＩＳＡ
で抗Ｔｂｐ−２ＩｇＧ抗体の有無を評価した。試料は、
全て２回分析した。Ｔｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子
のコア負荷量は、実施例６と同様にアミノ酸分析によっ
て測定した（４．０μｇ／ｍｇ（３２．８％））。免疫
投与の結果（図１７ａ）から明らかなように、ＰＬＧｐ
Ｓ微粒子に捕捉させて免疫系に投与した抗原は可溶性抗
原またはＰＬＧｐＳ微粒子のみと物理的に混合した抗原
と比較してかなり高い力価を誘導した。さらに、この試
験でマイクロカプセル化製剤は従来の明礬アジュバント
化システムと同様に免疫原性を有するものと思われる。
免疫反応のカイネティックスは、両製剤で差がなかっ
た。試験５５日に採取した血液のＩｇＧサブタイププロ
ファイル（図１７ｂ）で、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル
化したＴｂｐ−２とＰＬＧｐＳ微粒子に物理的に混合し
たＴｂｐ−２または明礬で製剤したＴｂｐ−２で誘導さ
れる免疫反応に差が認められた。抗原を可溶性の形態ま
たはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合し、または明礬で
製剤して投与した場合、検出された優勢なサブタイプは
ＩｇＧ１であった（ＩｇＧ２もある程度認められた）。
この実施例で、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化したＴｂ
ｐ−２で誘導されるＩｇＧサブタイプはさらに高いＩｇ
Ｇ２ａを誘導した。この傾向は、実施例８でＨｉｎ−４
７で認められた傾向と同様であった。これらの結果か
ら、カプセル化抗原の免疫投与で誘導される免疫の機構
は明礬で誘導されるものとは異なるものと思われる。抗
原を微粒子でカプセル化して投与すると、さらにバラン
スのとれたＴｈ_２／Ｔｈ_１プロファイル（ＩｇＧ２ａ：
ＩｇＧ１の比）が認められた。ここに示した結果から明
らかなように、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原
で仲介される免疫反応は、ＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に
混合した抗原、明礬で製剤した抗原または可溶性抗原と
して投与したもので得られる免疫反応とは質的にかなり
異なる。さらに、抗原／明礬製剤で明礬により誘導され
る免疫反応の程度はカプセル化した抗原を含む微粒子の
免疫反応とほぼ同じであった。 実施例１８：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセ
ル化したＴｂｐ−２およびＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に
混合したＴｂｐ−２を鼻腔内免疫投与したマウスにおけ
る免疫原性を説明する。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マ
ウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、
ＭＡ）雌１群５匹に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０または
５０μＬに溶解させた抗原を試験１、２８および４３日
目に以下の用量で鼻腔内免疫投与した：実施例５にした
がって調製し、６．０μｇのＴｂｐ−２を含むＰＬＧｐ
Ｓ微粒子、および実施例５にしたがって調製し、６．０
μｇのＴｂｐ−２と物理的に混合したＰＬＧｐＳ微粒子
（表５）。カプセル化したＴｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ
微粒子またはＴｂｐ−２を物理的に混合したＰＬＧｐＳ
微粒子を投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動
の変化は認められなかった。試験１４、２７、４２およ
び５５日で血清を採取し、実施例８と同様に抗原特異性
ＥＬＩＳＡで抗Ｔｂｐ−２ ＩｇＧ抗体の有無を評価し
た。試料は、全て２回分析した。Ｔｂｐ−２を含むＰＬ
ＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、実施例６と同様にアミノ
酸分析によって測定した（４．０μｇ／ｍｇ（３２．８
％））。鼻腔内免疫投与後の血清ＩｇＧ Ｔｂｐ−２特
異性抗体力価を図１８に示す。これらの結果から、投与
容量が少ない（１０μＬ）と、ＰＬＧｐＳ微粒子に取り
込まれた抗原（Ｔｂｐ−２）またはＰＬＧｐＳ微粒子と
物理的に混合した抗原は同じ用量（６．０μｇ）の可溶
性抗原と比較して免疫原性が低い。投与容量を高くする
（５０μＬ）と、いずれの群でも全体的な力価が著しく
増加した。これらの結果から、ＰＬＧｐＳ微粒子と物理
的に混合した抗原（Ｔｂｐ−２）は、さきにＨｉｎ−４
７の鼻腔内免疫投与（実施例１０）で認められた結果と
同様に同じ用量（６．０μＬ）の微粒子カプセル化抗原
または可溶性抗原と比較して免疫原性がかなり高かっ
た。さきに行ったＨｉｎ−４７の鼻腔内免疫投与試験
（実施例１０）で、微粒子と物理的に混合したＨｉｎ−
４７を投与すると強い体液反応および分泌反応が認めら
れた。Ｔｂｐ−２を用いたこの試験でも、同様な反応が
認められた。さらに、投与容量によって、発現する免疫
反応の種類および強さが異なることを確認した。 実施例１９：本実施例では、微粒子による抗原の放出を
説明する。ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原は明
礬製剤と同様に免疫原性を有することが確認されたこと
から、これら高分子マトリックスでカプセル化した抗原
の初期放出および徐放特性が免疫投与量の軽減に利用で
きるか否か検討した。この実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒
子でカプセル化したＴｂｐ−２、ＰＬＧｐＳ微粒子と物
理的に混合したＴｂｐ−２、および明礬またはＣＦＡ／
ＩＦＡで製剤したＴｂｐ−２をモルモットに皮下免疫投
与して免疫原性を検査した。６〜８週齢のモルモット
（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＢｒｅｅｄｉｎｇＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）
雌１群２匹に、抗原を以下の用量で皮内免疫投与した：
試験１および２８日に実施例５にしたがって調製し、Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．４）５００μＬに懸濁させた５．０μｇ
のＴｂｐ−２をカプセル化したＰＬＧｐＳ微粒子、およ
び試験１日に５．０μｇのＴｂｐ−２を含むＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）を混合したフロイントの完全アジュバント
（ＣＦＡ）、ついで試験１４および２８日に５．０μｇ
のＴｂｐ−２を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を混合したフ
ロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、または試験
１、１４および２８日に５．０μｇのＴｂｐ−２を含む
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を混合した明礬（表５）。カプセ
ル化したＴｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子、Ｔｂｐ−
２を物理的に混合したＰＬＧｐＳ微粒子、Ｔｂｐ−２の
ＣＦＡ／ＩＦＡ製剤またはＴｂｐ−２明礬製剤を免疫投
与したモルモットで、肉眼的病理変化または行動の変化
は認められなかった。試験４０および５６日で血清を採
取し、抗原特異性ＥＬＩＳＡで抗Ｔｂｐ−２ ＩｇＧ抗
体の有無を検査した。試料は、全て２回分析した。抗体
ＥＬＩＳＡ法は、実施例８と同様である。Ｔｂｐ−２を
含むＰＬＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、実施例６と同様
にアミノ酸分析によって測定した（４．０μｇ／ｍｇ
（３２．８％））。図１９に示す結果から明らかなよう
に、ＰＬＧｐＳでマイクロカプセル化したＴｂｐ−２を
２回投与すると、ＣＦＡ／ＩＦＡまたは明礬で製剤した
Ｔｂｐ−２を３回投与した場合と同程度の抗Ｔｂｐ−２
抗体反応を誘発した。これらの結果から、マイクロカプ
セル化したＴｂｐ−２は２回投与用のワクチンとして開
発する価値があると思われる。 実施例２０：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセ
ル化したｒウレアーゼまたはｒウレアーゼ／アジュバン
トカクテルをマウスに皮下または胃内免疫投与したとき
の免疫原性を説明する。６〜８週齢の非近交系Ｓｗｉｓ
ｓマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、フランス）１群８匹に、Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．４）３００μＬに溶解させた抗原を以下
の用量で試験１、２８および５６日に皮下（Ｓ．Ｃ．）
免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、１０．０
μｇのｒウレアーゼを含むＰＬＧｐＳ微粒子、実施例５
にしたがって調製し、１０．０μｇのｒウレアーゼ＋Ｄ
Ｃ−Ｃｈｏｌ、ＰＣＰＰまたはＣＴ−Ｘをｃｏ−カプセ
ル化したＰＬＧｐＳ微粒子、対照として１０．０μｇの
ｒウレアーゼ＋可溶性のＤＣ−Ｃｈｏｌ（６５μｇ／
回）またはＰＣＰＰ（１００μｇ／回）、または試験
１、２８および５６日に０．１５Ｍ ＮａＨＣＯ_３（ｐ
Ｈ９．０）３００μＬに溶解させた抗原を以下の用量で
胃内免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、４
０．０μｇのｒウレアーゼを含むＰＬＧｐＳ微粒子、実
施例５にしたがって調製し、４０．０μｇのｒウレアー
ゼ＋ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＣＰＰまたはＣＴ−Ｘをｃｏ−
カプセル化したＰＬＧｐＳ微粒子（表５）。ｒウレアー
ゼを含むＰＬＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、実施例６と
同様にアミノ酸分析またはポリクロナールｒウレアーゼ
特異性ＥＬＩＳＡによって測定した（表７）。ＰＬＧｐ
Ｓ微粒子抽出物についてポリクロナールＥＬＩＳＡ分析
を行うと、典型的にカプセル化した総蛋白量（回収され
たエピトープ）が得られる。対照実験で、抗原の完全性
に対する溶媒／塩基（ＳＤＳ）の影響を定量することが
できる。用いた条件下で、抽出された蛋白の約６５〜７
５％がこの検定法で完全に検出される形態で残っていた
と推定される。したがって、この測定法で得られた値
は、アミノ酸分析（ＡＡＡ）で得られた値よりも低い。
アジュバント（ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＣＴ−ＸまたはＰＣＰ
Ｐ）が存在していても測定値を妨害しないことを確認す
るため、適当な対照を実験に含めた。ＤＣ−Ｃｈｏｌが
存在していても分析には影響がないと思われたが、ＰＣ
ＰＰが存在すると異常値が得られ、ＡＡＡ法による分析
値と比較して非特徴的に高かった。ＣＴ−Ｘの場合は、
ｃｏ−カプセル化されたＣＴ−Ｘの量を定量するために
別のポリクロナールＥＬＩＳＡ法を開発した。微粒子の
投与質量は、ｒウレアーゼの投与量が１０．０μｇ（皮
下投与）または４０．０μｇ（経口投与）になるように
調整した。カプセル化したｒウレアーゼまたはｃｏ−カ
プセル化したｒウレアーゼとアジュバントの混合物を含
むＰＬＧｐＳ微粒子を免疫投与したマウスで、肉眼的病
理変化または行動の変化は認められなかった。試験８５
日に血清を採取し、抗原特異性ＥＬＩＳＡで抗ｒウレア
ーゼＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の有無を評価した。
いずれの試料も２回分析した。ＥＬＩＳＡは標準的なプ
ロトコール（ビオチン抱合体、ストレプタビジン ペル
オキシダーゼ複合体はＡｍｅｒｓｈａｍから、ｏ−フェ
ニレンジアミン 二塩酸塩（ＯＰＤ）基質はＳｉｇｍａ
から入手した）。０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ
９．６）に懸濁させたＨ．ｐｙｌｏｒｉ抽出物（５μｇ
／ｍＬ）で、プレートを一夜コーティングした（４
℃）。ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で飽和させた後、プレート
を血清（１．５時間）、ビオチン抱合体（１．５時
間）、ストレプタビジン ペルオキシダーゼ複合体（１
時間）および基質（ＯＰＤ−１０分間）とともにインキ
ュベーションした。対照として、各実験にＨ．ｐｙｌｏ
ｒｉ抽出物に対するポリクロナールマウス血清を設け
た。力価は、４９２ｎｍにおける最大吸収の５０％を与
える希釈率の逆数で表示した。陰性対照として、免疫投
与前の血清を用いた。マウスに、Ｔｈ_２／Ｔｈ_１プロフ
ァイルに基づいて選んだアジュバント（ＤＣ−Ｃｈｏｌ
−バランスのとれたＴｈ_２／Ｔｈ_１、ＰＣＰＰ−一次Ｔ
ｈ_２）または既知の粘膜アジュバント活性に基づいて選
んだアジュバント（コレラ毒素（ＣＴ−Ｘ）またはＥ．
ｃｏｌｉの熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ））の存在
下で皮下または胃内免疫投与した。ＰＬＧｐＳ微粒子
は、その他の典型的なアジュバント、例えば明礬と比較
して一層バランスのとれたＴｈ_２／Ｔｈ_１プロファイル
を誘導することが認められている。皮下免疫投与後試験
８５日に得たプール血液のＩｇＧサブタイプを図２０に
示す。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ微粒子製剤を皮下投与
した場合は、いずれもＩｇＧ１反応がＩｇＧ２ａ反応と
比較して高かった（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比は０．０８
〜０．３３の範囲にあった）。可溶性対照群（ｒウレア
ーゼ＋ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰ）の総ＩｇＧ１反
応は、同じ絶対値の範囲にあった。抗原とｃｏ−カプセ
ル化した場合も、抗原と物理的に混合して投与した場合
にも、アジュバントシステム間でＩｇＧ２ａに差が認め
られた。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ微粒子（ＩｇＧ２
ａ：ＩｇＧ１＝０．３３）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ
微粒子／ＣＴ−Ｘ（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１＝０．３０）
およびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ微粒子／ＤＣ−Ｃｈｏ
ｌ（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１＝０．２０）では、バランス
のとれたＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１抗体反応（Ｔｈ_２／Ｔｈ
_１で評価）が得られた。一方、ｒウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃ
ｈｏｌ対照群では、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１＝０．０３で
あった。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ微粒子製
剤では、主としてＴＨ_２反応が認められ、ＩｇＧ２ａ：
ＩｇＧ１比は０．０８であった。ｒウレアーゼ＋ＰＣＰ
Ｐの相同可溶性混合物ではＴｈ_２が強く、ＩｇＧ２ａ：
ＩｇＧ１比はきわめて低く、０．００３であった。一般
に、これらのアジュバントの存在下で抗原をｃｏ−カプ
セル化すると、典型的な免疫プロファイルがバランスの
とれたＴｈ_２／Ｔｈ_１反応の方向にシフトする傾向が認
められた。胃内免疫投与すると、ほとんどの場合検出可
能な浸透反応が認められなかった。特記すべき例外は、
中等度の浸透反応が認められたＬＴ陽性対照（ＩｇＧ２
ａ：ＩｇＧ１比＝０．１）およびＣＴ−Ｘとｃｏ−カプ
セル化したｒウレアーゼ／ＰＬＧｐＳ微粒子（ＩｇＧ２
ａ：ＩｇＧ１比＝２．１）であった。興味あることに、
経口免疫投与では、抗原＋粘膜アジュバントをカプセル
化するときわめて異なった浸透抗体反応が認められた。
この場合、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比がＩｇＧ２ａに片寄
り、Ｔｈ_１経路を示唆していた。文献調査で、ＣＴ−Ｘ
を抗原と経口共投与すると典型的にＬＴで認められたよ
うな免疫反応を誘導するという報告があった。主とし
て、ＩｇＧ１またはＴｈ_２型の反応が報告されている
（参考文献３４）。この試験は、ＰＬＧｐＳ微粒子でｃ
ｏ−カプセル化すると免疫反応が質的に変化することを
示唆している。 実施例２１：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子／ｒウレ
アーゼ製剤をマウスモデルに皮下または経口免疫投与し
たときの感染率および防御率を評価する。マウスを用
い、２回目の追加免疫投与６週間後（試験８５日）に、
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌（３ ｘ １０^６ｃｆｕ）懸濁液
３００μＬを胃内に強制攻撃投与した。Ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏの放出試験（実施例７）から微粒子からの抗原の放出
には約４週間を要すると考えられたので、この時から２
週間後に攻撃投与を計画した。攻撃投与４週間後にマウ
スを屠殺し、ウレアーゼ活性（Ｊａｔｒｏｘテスト、Ｐ
ｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ）を評価するために無
菌層流フード内で胃を採取した。ウレアーゼ活性は、屠
殺２４時間後に５５０ｎｍにおける吸収を測定すること
により評価した。このテストの原理は、Ｈｅｌｉｃｏｂ
ａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉのウレアーゼによって反応液
中の尿素を分解させ、ｐＨの上昇による反応液中のｐＨ
指示薬（フェノール レッド）の黄色から淡赤色への色
の変化を測定するものである。マウスは、Ｈ．ｐｙｌｏ
ｒｉのストレプトマイシン耐性マウス適応株（Ｘ４３−
２ＡＮ）を感染させた。胃におけるウレアーゼ活性の測
定値（Ｊａｔｒｏｘテスト）に基づいて判定したとこ
ろ、感染率には再現性があり、全ての実験で１００％の
マウスが感染した。攻撃投与に用いた菌株はストレプト
マイシン耐性であったため、選択性の高い培地でも生育
することができ、したがってこのテストの感度はきわめ
て高かった（正常な細菌相による汚染はみられなかっ
た）。この菌株は２０％ｖ／ｖグリセロールおよび１０
％ｖ／ｖ牛胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）添加
Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス（ＢＢ）（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕ
ｘ）中−７０℃で保存した。攻撃投与用懸濁液は、以下
のように調整した：前培養は、５％ｖ／ｖヒツジ血液
（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ Ｘ
４３−２ＡＮ株の選択マーカー抗生物質（スリメトプリ
ム（５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（１０μｇ／ｍ
Ｌ）、ポリミキシンＢ硫酸塩（５μｇ／ｍＬ）、アンホ
テリシン（５μｇ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン
（５０μｇ／ｍＬ））（ＴＶＰＡＳ）を含むＭｕｅｌｌ
ｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天（ＭＨＡ；Ｄｉｆｃｏ）上で
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉを培養した。抗生物質は、全てＳｉｇ
ｍａから購入した。ＭＨＡ−ＴＶＰＡＳプレートを好気
的条件下、３７℃で３日間培養した。前培養した菌株を
用い、５％ｖ／ｖＦＢＳおよびすべての抗生物質（ＴＶ
ＰＡＳ）を添加したＢＢ５０ｍＬを含む７５ｃｍ^２の通
気口付きフラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）に接種した。フラス
コを、好気的条件下で２４時間ゆっくりと振とうした。
グラム染色、ウレアーゼ活性（尿素インドール培地、Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃＰａｓｔｅｕｒ）、カタラーゼ（Ｈ
_２Ｏ_２、３％ｖ／ｖ）およびオキシダーゼ活性（Ｂｉｏ
ｍｅｒｉｅｕｘディスク）を測定し、懸濁液の特性を検
討した。位相差顕微鏡下で、生存率および運動性を検査
した。５５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．１になるよう
にＢＢで懸濁液を希釈した（１ｘ１０^７ＣＦＵ／ｍ
Ｌ）。この試験では、ＯＤ．＜０．１または細菌数が少
なくとも１０^３〜１０^４／胃（対照では１０^５〜１
０^６）のマウスは防御能を有すると考えた。この試験で
は、非免疫投与／感染および非免疫投与／非感染対照群
のマウスも設けた（結果は表示せず）。図２１ａから明
らかなように、上記の検定法で判断した防御効果（皮下
投与による）の順位は、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／Ｄ
Ｃ−Ｃｈｏｌ（幾何学的平均＝０．０９２）＞ＰＬＧｐ
Ｓ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ（幾何学的平均＝０．１０
５）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ（幾何学的平均＝０．
１６３）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ（幾何
学的平均＝０．２６９）であった。この試験では、防御
の標準としてＬＴ＋ｒウレアーゼ（経口）陽性対照（幾
何学的平均＝０．１３６）を用いた。興味あることに、
ｒウレアーゼ＋可溶性ＤＣ−Ｃｈｏｌ（幾何学的平均＝
０．６００）またはｒウレアーゼ＋ＰＣＰＰ（幾何学的
平均＝１．０７）対照群では抗原とアジュバントをＰＬ
ＧｐＳ微粒子製剤としてカプセル化する明瞭な利点が認
められた。データをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの方法で
統計学的に解析し、以下の結論が得られた。ＰＬＧｐＳ
／ｒウレアーゼ／ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＰＬＧｐＳ／ｒ
ウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ製剤は、ＬＴ＋ｒウレアーゼ陽性
対照群と比較して有意差が認められなかった。ＰＬＧｐ
Ｓ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ、ｒウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃ
ｈｏｌおよびｒウレアーゼ＋ＰＣＰＰ群ではこれらの群
と比較して有意差が認められ（ｐ＜０．０１）、ＰＬＧ
ｐＳ／ｒウレアーゼ群ではＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／
ＰＣＰＰ、ｒウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃｈｏｌおよびｒウレ
アーゼ＋ＰＣＰＰ群と比較して有意差が認められた（ｐ
＜０．０１）。この統計学的解析から、ＰＬＧｐＳ／ｒ
ウレアーゼ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ（マウス７／８匹でＯＤ．
＜０．１）およびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ
（マウス５／８匹でＯＤ．＜０．１）微粒子群では明瞭
な防御効果が認められ、一方ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ
（マウス２／８匹でＯＤ．＜０．１）微粒子群およびｒ
ウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃｈｏｌ群（マウス２／１０匹でＯ
Ｄ．＜０．１）群では中等度の防御効果が認められ、Ｐ
ＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ（マウス０／８匹で
ＯＤ．＜０．１）微粒子群およびｒウレアーゼ＋ＰＣＰ
Ｐ群（マウス０／１０匹でＯＤ．＜０．１）群では防御
効果が低いか、全く認められなかった。この傾向は、免
疫原性試験（実施例２０）で得られたＴｈ_２／Ｔｈ_１バ
ランス比と一致した。図２１ｂに示すように、経口免疫
投与では、アジュバントを含むＰＬＧｐＳ微粒子を免疫
投与したいずれの群のマウスでも完全な防御効果は得ら
れなかった。統計学的順位は、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアー
ゼ／ＣＴ−Ｘ（幾何学的平均＝０．２２９）＞ＰＬＧｐ
Ｓ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ（幾何学的平均＝
０．４０３）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ（幾何学的平
均＝０．４７５）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰ
Ｐ（幾何学的平均＝０．４９３）であった。この試験で
は、陽性対照としてＬＴ＋ｒウレアーゼ（経口）群（幾
何学的平均＝０．１３６）を用いた。データをＭａｎｎ
−Ｗｈｉｔｎｅｙの方法で統計学的に解析し、以下の結
論が得られた。ＬＴ＋ｒウレアーゼ陽性対照群ではＰＬ
ＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＰＬＧｐ
Ｓ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ製剤と比較して有意差が認
められた（ｐ＜０．０１）。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ
／ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／Ｃ
Ｔ−Ｘ製剤では、その他の群と比較して有意差が認めら
れなかった。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼおよびＰＬＧｐ
Ｓ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰでは、その他の群と比較し
て有意差が認められなかった。この試験で、ＰＬＧｐＳ
／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ（マウス２／８匹でＯＤ．＜
０．１）およびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−Ｃｈ
ｏｌ（マウス１／８匹でＯＤ．＜０．１）微粒子製剤群
では部分的な防御効果が認められた。一方ｒウレアーゼ
＋ＬＴ陽性対照群では完全な防御効果が認められた（マ
ウス７／８匹でＯＤ．＜０．１）。実施例１４〜１６で
明らかなように、アジュバントをＰＬＧｐＳ微粒子等の
担体とともに免疫系に供給するとアジュバント効果が高
くなり、その結果ワクチンの効果も高くなる。特に、こ
の実施例における典型的な対照試験でＤＣ−Ｃｈｏｌま
たはＰＣＰＰ等のアジュバントと、ｒウレアーゼの可溶
性混合物を皮下免疫投与後の免疫原性および防御効果を
測定したところ、防御効果は低いか、中等度であること
が確認された。これらの結果から、抗原とアジュバント
を微粒子状のマトリックスとともに供給するとかなり効
果の高いワクチンが得られるという証拠が得られた。こ
の実施例では、さらにアジュバントの毒性軽減およびこ
の種のアジュバントの特徴である免疫反応の質的改善等
の利点があることが実証された。ＰＬＧｐＳ／ｒウレア
ーゼ／ＣＴ−Ｘ製剤微粒子の経口免疫投与後に得られた
ｒウレアーゼに対するＩｇＧサブタイプ抗体反応が非特
徴的にＩｇＧ２ａ側（Ｔｈ_１経路）にかたよるというこ
とも実験的に実証された。また、ｃｏ−カプセル化した
抗原とＣＴ−Ｘ（既知の粘膜アジュバント）を皮下また
は経口投与した場合、この物質は製剤および貯蔵中に高
分子マトリックス内の抗原を安定化させ、ＨＳＡまたは
ＢＳＡの存在下で調製した微粒子と同様な機構（参考文
献３５）で放出するものと思われる。結論として、この
試験で、ＰＬＧｐＳ微粒子を利用した全身免疫投与によ
り、マウスモデルでＨ．ｐｙｌｏｒｉの感染に対して著
しい防御効果を誘導する効果のあることが確認された。
また、この試験で、ＰＬＧｐＳ微粒子を利用した経口免
疫投与により、マウスモデルでＨ．ｐｙｌｏｒｉの感染
に対して部分的な防御効果を誘導する効果のあることも
確認された。さらに、アジュバント（特にＤＣ−Ｃｈｏ
ｌまたはＣＴ−Ｘ）とともにｒウレアーゼをｃｏ−カプ
セル化すると、ワクチン効果の顕著な向上が得られる。開示の要約 本発明は、高分子と生物学的に活性な物質のマトリック
スからなる物質、特に生物学的活性を有する物質の粒状
担体を提供する。粒状担体は微粒子の形態で、粘膜また
は非経口的に投与すると、検体の免疫系細胞に物質を効
果的に運搬し、免疫反応を誘導することができる。本発
明の範囲で、改良が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】開環重合と脱保護の工程を示す図である。

【図２】ポリマー中の生物活性部分のポリマーへの結合
を示す図である。

【図３】マイクロパーティクルの製造工程を示す図であ
る。

【図４】レーザー回折測定の代表的サイズ分布を示す図
である。

【図５】マイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真
を示す図である。

【図６】マイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真
を示す図である。

【図７Ａ】ｉｎ ｖｉｖｏにおける放出過程を示す図で
ある。

【図７Ｂ】３ヶ月間の％累積放出を示す図である。

【図８Ａ】免疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧ応
答を示す図である。

【図８Ｂ】免疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧ応
答を示す図である。

【図８Ｃ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示す
図である。

【図９Ａ】試験の概要を示す図である。

【図９Ｂ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示す
図である。

【図９Ｃ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示す
図である。

【図１０Ａ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示
す図である。

【図１０Ｂ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示
す図である。

【図１０Ｃ】血清ＩｇＡ応答を示す図である。

【図１０Ｄ】ＩｇＧ応答を示す図である。

【図１０Ｅ】ＩｇＧ応答を示す図である。

【図１１】ＩｇＧ血清抗体応答を示す図である。

【図１２】ＩｇＧ血清抗体応答を示す図である。

【図１３】血球凝集反応阻害抗体検定での応答を示す図
である。

【図１４Ａ】ＩｇＧ抗体の存在を評価に関する図であ
る。

【図１４Ｂ】ＩｇＧ抗体の存在を評価に関する図であ
る。

【図１４Ｃ】ＩｇＧ抗体の存在を評価に関する図であ
る。

【図１５Ａ】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定におけ
る結果を示す図である。

【図１５Ｂ】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定におけ
る結果を示す図である。

【図１５Ｃ】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定におけ
る結果を示す図である。

【図１６】防御試験の結果を示す図である。

【図１７Ａ】血清ＩｇＧ抗体応答を示す図である。

【図１７Ｂ】血清ＩｇＧ抗体サブタイプ応答プロフィル
を示す図である。

【図１８】抗体の存在の評価に関する図である。

【図１９】血清ＩｇＧ抗体応答を示す図である。

【図２０】ＩｇＧ抗体応答を示す図である。

【図２１Ａ】防御試験の結果を示す図である。

【図２１Ｂ】防御試験の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０８Ｌ 67:04 Ｃ０８Ｌ 67:04 (72)発明者 チャング、 ペレ カナダ国 エル４シー ０ビー６ オン タリオ州 リッチモンドヒル エストリ ル ストリート 32 (72)発明者 クライン、 マイケル、 エイチ. カナダ国 エム２ピー １ビー９ オン タリオ州 ウィロウダール マンロウ ブールヴァード 16 (56)参考文献 特許3242118（ＪＰ，Ｂ２) 欧州特許出願公開600161（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C08G 63/00 - 63/91 C08J 3/14 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１種の生物学的に活性な物質
   を宿主に配送するための粒子担体の製法であって、 （ａ）α−ヒドロキシ酸ポリマーまたはコポリマーを含
   む有機溶媒相を、分散または溶解した生物学的に活性な
   物質を含む水性組成物と混合して、第１の油中水型エマ
   ルジョンを形成する工程と、 （ｂ）前記第１の油中水型エマルジョンを、水性洗剤相
   に分散して、第２の水中油中水型ダブルエマルジョンを
   形成する工程と、 （ｃ）前記第２のダブルエマルジョンから水を除去し
   て、ミクロスフェア（微小球体）を形成する工程と、 （ｄ）前記ミクロスフェアを回収し、その中に前記生物
   学的に活性な物質を閉じ込める工程とを有することを特
   徴とする粒子担体の製法。
2. 【請求項２】 前記ポリマーが、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチ
   ド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラク
   チド−ｃｏ−グリコリド−ｃｏ−疑似−Ｚ−セリンエス
   テル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−
   ｃｏ−グリコリド−ｃｏ−疑似−セリンエステル（ＰＬ
   ＧｐＳ）からなる群から選択されたものである請求項１
   に記載の製法。
3. 【請求項３】 前記有機溶媒が、ジクロロメタン、酢酸
   エチル、アセトンおよびそれらの混合物からなる群から
   選択されたものである請求項１または２に記載の製法。
4. 【請求項４】 前記水性洗剤相が、少なくとも１種の非
   イオン性エマルジョン安定剤を含む請求項１〜３のいず
   れかに記載の製法。
5. 【請求項５】 前記少なくとも１種の非イオン性エマル
   ジョン安定剤が、ポリビニルアルコール、メチルセルロ
   ースおよびオクトキシノール（octoxynol、商標名：ト
   リトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）からなる群から選
   択されたものである請求項４に記載の製法。
6. 【請求項６】 前記第１の油中水型エマルジョンが少な
   くとも1種のアジュバントを追加的に含む請求項１〜５
   のいずれかに記載の製法。
7. 【請求項７】 前記第１の油中水型エマルジョンが、少
   なくとも１種の界面活性剤を追加的に含む請求項１〜６
   のいずれかに記載の製法。
8. 【請求項８】 前記α−ヒドロキシ酸コポリマーが５０
   ００〜４００００ダルトンの分子量を有する請求項１〜
   ７のいずれかに記載の製法。
9. 【請求項９】 前記粒子担体が１〜５０μｍの粒径を有
   する請求項１〜８のいずれかに記載の製法。