JP3990303B2 - 生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物活性物質を送達するための生体内分解性マイクロパーティクル(マイクロ粒子)に関し、具体的には、特定の細胞型に対して標的指向性であるようなマイクロパーティクルを得るための生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製造方法に関する。
【0002】
本出願は、1996年12月20日提出の係属出願中の米国特許第08/770,050号の一部継続出願に対応するものである。
【0003】
【従来の技術】
長年、ヒトおよび動物を様々な感染症から守るためにワクチンが用いられてきた。このような従来型のワクチンは、弱毒化病原体(例えば、ポリオウイルス)、不活化病原体(例えば、百日咳菌)、または病原体の免疫原性成分(例えば、ジフテリアトキソイドおよびB型肝炎表面抗原)から構成される。
【0004】
免疫原性が高く、単独で防御免疫応答を引き起こすことができる抗原もある。しかし、他の抗原は、防御免疫応答を誘導できないか、弱い免疫応答しか誘導しない。抗原をアジュバントと同時投与すると、弱い免疫原性抗原の免疫応答を著しく促進することができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を促進するが、それ自体が免疫原性であるとは限らない。アジュバントは、抗原を投与部位近傍の局所に維持することにより、免疫システムの細胞に対する、ゆっくりと持続する抗原の放出を容易にする貯蔵効果を生み出すことができる。アジュバントは、抗原貯蔵に免疫システムの細胞を引きつけ、これらの細胞を刺激して免疫応答を引き起こすことができる。アジュバントは、非経口的に送達された抗原に対する免疫応答を促進することが確認されている。
【0005】
通常、アジュバントは、ワクチン製剤中で抗原とともに用いられることにより、非経口的免疫感作(筋肉内または皮下)による全身的免疫誘導が得られる。このアプローチは、傷害を受けた皮膚(すなわち、破傷風)を経由して体に接近する感染性試剤に適しているが、この方法で投与される多くのアジュバントの副作用および関連する毒性に起因して遭遇する問題点がある。アルミニウム塩(リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム)から製剤化されたワクチンだけが、ヒトおよび家畜の予防接種に日常的に用いられている。しかし、これらのアジュバントでさえ、すべての抗原とともに用いるのに適しているわけではなく、注射部位に刺激を引き起こすこともある。注射部位において抗原の免疫原性を安全に促進するアジュバントの開発が必要なことは明らかである。
【0006】
用いられる抗原の性質に特有の他の問題がある。例えば、従来型の不活化ワクチンの大部分は、効果的な免疫感作に複数回の投与を必要とする。弱毒生ワクチンおよび多くの液状不活化ワクチンは、限定された保存条件が必要であるという欠点を持ち、不活化を受けやすい(例えば、熱感受性)。アジュバント不適合性、pH、緩衝方法および塩の存在に起因して、単一剤形でワクチンを混合することに関連する問題もある。
【0007】
粘膜免疫は、主に腸内、気管支または鼻洗浄液およびその他の外分泌液における分泌型免疫グロブリン(sIgA)の誘導により、誘導される。例えば、非経口のコレラワクチンでは限られた防御作用しか得られないが、一方、最近開発された経口型は非常に有効であることが分かっている(ref.1−本明細書を通じ、種々の参考文献を括弧内に引用し、本発明が関わる技術分野の状況をさらに詳しく説明する。各引用の一覧情報は、本明細書の末尾に示す。これらの参考文献の開示を、参照として本明細書中に援用する)。ヒト志願者による研究から、インフルエンザワクチン経口投与が、鼻粘膜分泌物における分泌型抗インフルエンザ抗体の誘導に有効であることがわかり、このような摂取ワクチンに対しアジュバントとして有効な物質が確認されている。しかし、これらアジュバントの大部分は、摂取ワクチンに対し免疫応答を改善することに関しては、比較的無力である。最近、これらのアジュバントの大部分が、安全で、経口的胃腸管、鼻咽頭−気道および生殖道を経由または眼窩内に投与された抗原に対し、ヒトおよび動物において免疫応答を促進するために有効であることが証明された。しかし、これらの経路を経由する抗原の投与は、通常、免疫応答を引き起こすには無効である。前述の例は、これらの免疫感作法の潜在力を示しているが、これらの経路によって使用するためのワクチン製剤の開発は、様々な理由から遅々としていた。粘膜表面において免疫感作することができないことは、通常、次のように考えられているからである。
(i)粘膜表面へ移行する間に存在する酸および/またはタンパク質分解酵素による抗原の分解、
(ii)粘膜上皮に存在する分泌物による抗原の分解、
(iii)粘膜上皮からの限られた吸収、
(iv)免疫応答を誘導するために必要な濃度以下に抗原が希釈されること、
(v)無効なアジュバントおよび/または送達システム。
【0008】
非経口ワクチン製剤におけるアジュバントの使用、および粘膜部位へワクチンを送達するための適当なシステムの欠如に関連する問題は、様々な経路により投与した場合に有効であって関連する毒性の問題または副作用のない新たな手法の必要性を暗示している。時間とコストを低減し、ヒトの医療において、入手法が制限される発展途上国では極めて重要である患者のコンプライアンスを増す利点もあることから、ヒトおよび動物に単一剤形でワクチン送達を可能にすることも望まれる。これは、これらの国々の幼児にまさに当てはまることである。
【0009】
投与された抗原に対する免疫応答を増すため、担体を用いて抗原の分解を防ぎ、in vivoにおけるこれらの物質の取り込みを変調させることができる。感受性抗原を捕捉し、破壊、免疫原性の減少または希釈から抗原を守ることができる。担体を製剤化する方法には、抗原を高分子マトリックス(単一マトリックス)中に分散する、または抗原の周りを高分子物質で被覆することにより外部防御壁(コア−シェル)を得ることが含まれる。製剤プロトコルの操作により、これらの物質の平均サイズを優先して制御することができる。このことは、経口送達を経由する腸管内のパイエル板の特定のM−細胞における微粒子の取り込みに重要であることが分かった。
【0010】
米国特許第5,151,264号は、Bio Vecteurs Supra Moleculairs(BVSM)と名付けられたリン脂質/糖脂質/多糖性質の微粒子担体について記載している。微粒子担体は、その層の1つに生物活性を有する様々な分子を運搬することを意図している。しかし、米国特許第5,151,264号は、免疫感作のための抗原を含む微粒子担体については記載しておらず、経口的胃腸管、鼻咽頭−気道および尿生殖道を経由する免疫感作、および眼窩内またはその他の粘膜部位における免疫感作のための微粒子担体について具体的に記載していない。
【0011】
Eldridge、他(ref.2および3)は、PLGまたはPLGAとして知られているポリラクチド・グリコリド共重合体から製造された生体内分解性マイクロスフェアからのin vivoにおける抗原の遅延性放出を観察した。マイクロパーティクルの製剤化に際して抗原をカプセル充填するために多数の他の高分子が用いられており、これらには、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリカプロラクトン、ポリ酸無水物、ポリオルトエステルおよびポリ(α−ヒドロキシ酪酸)が含まれる。
【0012】
米国特許第5,075,109号は、50:50のポリ(DL−ラクチド・グリコリド)中にトリニトロフェニル化キーホールリンペットヘモシアニンおよびブドウ球菌腸管毒B抗原のカプセル充填について記載している。ポリ(グリコリド)、ポリ(DL−ラクチド・グリコリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド・カプロラクトン)、ポリ(エステルアミド)、ポリオルトエステル、ポリ(α−ヒドロキシ酪酸)、およびポリ酸無水物などのカプセル充填用の他のポリマーを提案している。カプセル充填された抗原は、胃内挿管法によりマウスに投与され、唾液および腸管分泌液および血清中に顕著な抗原特異的IgA抗体の出現をもたらした。この特許に述べられているように、これとは対照的に、同量のカプセル充填しない抗原の経口投与は、試験したいずれの体液中において、いずれのイソタイプの特異的抗体の誘導に無効であった。ポリ(DL−ラクチド・グリコリド)マイクロカプセルを用いて、非経口注射によって抗原を投与することもできた。
【0013】
公開されたPCT出願WO91/06282は、多数の生体付着性マイクロスフェアおよび抗原ワクチン成分を含む送達運搬体について記載している。マイクロスフェアは、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンからなる。この送達運搬体は、鼻粘膜からのワクチン取り込みを具体的に意図している。この送達運搬体はさらに吸収促進剤を含有することができる。通常、防御性重合物質中に抗原をカプセル充填する。
【0014】
米国特許第5,571,531号は、多糖の固体マトリックスおよびタンパク性物質を含む微粒子担体について記載している。生物活性を有する物質の送達のために官能基の付いたシリコンポリマーをマトリックスに結合させている。
【0015】
抗原の遅延性放出は前述の仕事で明らかになったが、記載の方法によってマイクロパーティクルを製造する場合には困難に遭遇した。生物学的物質を用いる有機溶媒および物理的力に暴露すると変性する可能性もある。方法をスケールアップすることも困難である。さらに、親水性の抗原をカプセル充填するのは非能率的である。
【0016】
このような制限のない改善された担体を提供することが望ましいであろう。具体的には、マイクロパーティクルおよびマイクロスフェアに製剤化でき、抗原を予め選択された配位子に向けるような標的指向性の部分を含む重合物質を提供することが望まれる。これは、免疫システムの細胞に対する途方もない潜在能力を持つであろう。
【0017】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、様々な方法によってマイクロパーティクルおよびマイクロスフェアを製造するのに適した性質を有する新規で有用なポリマーの製造を対象とする。本発明において、現在のプロセッシング法の改変は、カプセル充填の効率に著しい改善をもたらす。本発明は、非経口、経口および鼻内を含む様々な免疫感作経路による抗原、または抗原とアジュバントのカクテルに有用なワクチン送達システムの製作を対象とする。
【0018】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかるポリマーの製造方法は、少なくとも1種のα−ヒドロシキ酸モノマーと、少なくとも1種の疑似−α−アミノ酸を共重合する工程を有することを特徴とする生分解性及び生体適合性を有するコポリマーの製法である。少なくとも1種のα−ヒドロシキ酸モノマーとして、ラクチド及びグリコリドが用いられる。また、疑似−α−アミノ酸としてはセリン由来のものが用いられる。この方法の好ましい態様は、不活性雰囲気条件において、モノマーとしての、少なくとも1種のα−ヒドロキシ酸及び少なくとも1種の疑似−α−アミノ酸と、エステル化触媒と、を含む有機溶媒溶液を調製する工程と、
これらのモノマーを共重合させる工程と、
得られたコポリマーを単離する工程と、
を有する。
【0019】
前記エステル化触媒としては、2−エチルヘキサン酸第一スズを用いることができる。また、前記有機溶媒としては、無水クロロホルムを用いることができる。前記の製造方法は、前記コポリマーをフィルムまたはマイクロパーティクルに成形する工程を更に含むことができる。
【0020】
また、前記少なくとも1種のα−ヒドロキシ酸として、式:R1R2COHCO2H(該式中、R1及びR2は水素原子あるいは直鎖状または分岐鎖状アルキル基である)で表されるα−ヒドロキシ酸の少なくとも1種を用いることができる。
【0021】
また、前記α−ヒドロキシ酸は、α−ヒドロキシ酸の混合物として用いることができ、該混合物は、前記式におけるR1及びR2が水素であるα−ヒドロキシ酸を含む混合物または前記式におけるR1がメチル基であり、R2が水素であるα−ヒドロキシ酸を含む混合物とすることができる。
【0022】
一方、前記少なくとも1種の擬似−α−アミノ酸として、式:R5CHNHR6CO2H(該式中、R5はヒドロキシメチル基またはメチルチオール基であり、R6はアミン保護基である。)で表される化合物の少なくとも1種を用いることができる。前記アミン保護基としては、カルボベンジルオキシ基(CBZまたはZ)、ベンジル基(Bn)、p−メトキシベンジル基(MeOBn)、ベンジルオキシメトキシ基(BOM)、tert−ブチルオキシカルボニル基(t−BOC)及び[9−フルオレニルメチルオキシ]カルボニル基(FMOC)からなる群から選択されたものを挙げることができる。
【0023】
前記少なくとも1種のα−ヒドロキシ酸として、L−乳酸、D,L−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ吉草酸及びヒドロキシ酪酸からなる群から選択されたものを、前記少なくとも1種の擬似−α−アミノ酸としてセリン由来であるものを用いることができる。
【0024】
【発明の実施の形態】
本発明の第1の態様により、下記一般式のバックボーンを有し、約5,000から約40,000の分子量を有するポリマーを含む、新規な生体内分解性、生体適合性のポリマーを提供する。
【0025】
【化1】
【0026】
上式で、R1、R2、R3、R4およびR5は独立に、H、直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、R6は、H、アミン保護基、スペーサー分枝または生物活性分子種から選択され、Xは、OまたはS基から選択され、およびxおよびyは、整数で、ポリマーの少なくとも約95%がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値をとる。
【0027】
新規なポリマーは、環状ジエステルを含む少なくとも1つのα−ヒドロキシ酸またはその誘導体、および少なくとも1つの疑似−α−アミノ酸を含む、単量体の共重合によって誘導される。α−ヒドロキシ酸は、一般式R1R2COHCO2Hを有し、R1およびR2基はH、直鎖または分枝鎖アルキル基である。α−ヒドロキシ酸は、α−ヒドロキシ酸の混合物、水素であるR1およびR2基を有するα−ヒドロキシ酸、およびCH3であるR1基およびHであるR2を有するもう1つのα−ヒドロキシ酸の少なくとも1つの混合物を含むことができる。疑似−α−アミノ酸は、一般式R5CHNHR6CO2Hを有し、R5基は、ヒドロキシメチルまたはメチルチオール基、およびR6は、アミン保護基である。
【0028】
アミン保護基は、カルボベンジルオキシ、ベンジル、パラメトキシベンジル、ベンジルオキシメトキシ、tert−ブチルオキシカルボニルまたは[9−フルオレニルメチルオキシ]カルボニルでよい。
【0029】
通常、α−ヒドロキシ酸は、L−乳酸、D,L−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシ酪酸から選択される。少なくとも1つの疑似−α−アミノ酸はセリンでよい。
【0030】
本発明の好ましい態様において、ポリマーは、ポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−Z−セリンエステル(PLGpLS)およびポリ−P,L−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル(PLGpS)である。
【0031】
このポリマーは、直接または側基を介してポリマーに共有結合した細胞生体付着性基、マクロファージ刺激物質、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸および/または保護されたアミノ酸残基などの生物活性部分を含むことができる。
【0032】
好ましい実施形態において、生物活性置換基は、アミノ酸部分のアミノ基または適当なスペーサー分子を介してポリマーと結合する。スペーサー分子は、R7またはR8基が独立に、H、直鎖または分枝アルキル単位から選択され、式R7R8COHCO2Hで表されるα−ヒドロキシ酸、およびR9基がヒドロキシメチルまたはメチルチオール基であり、R10がアミン保護基である、式R9CHNHR10CO2Hで表されるα−アミノ酸から選択することができる。
【0033】
本発明の別の態様により、本発明は、少なくとも1つのα−ヒドロキシ酸および少なくとも1つの疑似−α−アミノ酸を共重合させることを含む生体内の分解性、生体適合性ポリエステルの製造方法を提供する。
【0034】
本発明の別の態様により、不活性雰囲気条件において少なくとも1つのα−ヒドロキシ酸および少なくとも1つの疑似−α−アミノ酸のエステル化触媒を含む有機溶媒溶液を調製し、単量体を共重合させて得られるポリマーを単離することを含む、本明細書中に与えられた一般式を有する生体内分解性、生体適合性のポリマーの製造方法を提供する。用いる触媒は2−エチルヘキサン酸第一スズであるのが好ましい。この方法で生成されるポリマーは、固相触媒還元または別法により酢酸溶液中の臭化水素を用いる酸触媒により、さらに脱保護することができる。この方法は、ポリマーをフィルムまたはマイクロパーティクルに成型することを含む。
【0035】
本発明の別の態様により、下記一般式を有し、約5,000から約40,000ドルトンの分子量を有するポリマーを含み、ポリマーを含む担体である、生物活性物質を宿主に送達するための微粒子担体を提供する。
【0036】
【化2】
【0037】
上式で、R1、R2、R3、R4およびR5は独立に、H、直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、 R6は、H、アミン保護基、スペーサー分子または生物活性分子種から選択され、 Xは、OまたはS基から選択され、および xおよびyは、整数で、ポリマーの少なくとも約95%がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値をとる。
【0038】
通常、微粒子担体は、約1から10μMの粒子径を有する。
【0039】
本発明の別の態様は、少なくとも1つの生物活性物質を宿主に送達するための微粒子担体製造方法であり、その方法は、
(a)α−ヒドロキシ酸ポリマーまたは共重合体を含む有機溶媒相を、分散または溶解した生物活性物質を含む水性成分と混合し、第1の油中水型乳剤を生成させるステップ、
(b)第1の油中水型乳剤水性洗浄相に分散し、第2の水中油中水型乳剤を生成させるステップ、
(c)第2の二重エマルションから水を除去し、マイクロスフェアを生成させるステップ、および
(d)マイクロスフェアを集め、その中に生物学的物質を捕捉させるステップを含む。
【0040】
本発明の微粒子担体は、担体と混合または担体中に捕捉した生物活性物質を有する組成物として用いることができる。用いる生物学的物質は、免疫応答を引き起こす物質から選択することができる。このような物質には、非タンパク質分解性Hin−47類似体、D15、P1、P2、およびP6などのヘモフィルスインフルエンザタンパク質が含まれる。生物活性物質には、少なくとも1つのインフルエンザウイルスが含まれ、多価または1価のインフルエンザウイルスワクチン、またはインフルエンザウイルス1価タンパク質ワクチンなどのインフルエンザウイルスタンパク質が含まれる。さらに、生物活性物質には、モラクセラカタラーリスのTbp2タンパク質などの少なくとも1つのモラクセラカタラーリスタンパク質が含まれる。さらに、用いる生物活性物質には、ウレアーゼなどの少なくとも1つのヘリコバクターピロリタンパク質が含まれる。他の生物物質には、タンパク質、タンパク質様物質、細菌、細菌溶解物、ウイルス(例えば、呼吸器合胞体ウイルス)、ウイルス感染細胞溶解物、DNAプラスミド、アンチセンスRNA、ペプチド(例えば、CLTB−36およびM2)、抗原、抗体、薬理学的試剤、抗生物質、炭水化物、脂質、脂質化アミノ酸(例えば、トリパルミトイルシステイン)、糖脂質、ハプテンおよびその組合せおよびその混合物が含まれる。
【0041】
第1の油中水型乳剤はさらに、親油性の少なくとも1つの有機溶媒可溶アジュバントを含むことができる。このような有機溶媒アジュバントは、BAY R1−005、トリパルミトイルシステインおよびDC−cholからなる群から選択することができる。親油性部分の存在は、カプセル充填効率を高め、製剤化中の抗原を保護し、従来の製剤より効率よく免疫システムに抗原が存在するように粒子を放出することに役立ち、したがってより効果的なワクチンを提供する。
【0042】
さらに、第1の油中水型乳剤は、PCPPなどの重合性の水溶性アジュバント、CT−Xまたはそのサブユニットなどの粘膜アジュバントまたはLTといった少なくとも1つの水溶性アジュバントを含むことができる。水溶性アジュバントの存在は、本方法のカプセル充填効率を高め、製剤化中の抗原を保護し、従来の製剤より効率よく免疫システムに抗原が存在するように粒子を放出することに役立ち、それによってより効果的なワクチンを提供する。
【0043】
本発明は、本明細書中で提供される微粒子担体および生理学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物も提供する。この組成物は粘膜または非経口的に投与できる。免疫応答は、局所の抗体応答または血清抗体応答である。本発明のこの態様により、安定微粒子型の制御された、または遅延した放出ワクチン調製物およびそのようなワクチン調製物の製造方法を提供する。粒子はマイクロスフェア的で、生体内分解性ポリマーおよび抗原および/または抗原プラス・アジュバント含有の領域を含む。
【0044】
本発明の利点には、
(a)完全に生体内分解性および生体適合性マイクロパーティクル製剤化、
(b)免疫システムの細胞に対する抗原呈示が容易となり、改善された抗原免疫原性をもたらす、
(c)抗原の生物学的利用能を増加させる改善された製剤化条件、
が含まれる。
【0045】
本発明の追加の実施形態には、診断測定におけるおよび治療戦略に対する粒子担体の用途が含まれる。
【0046】
図面を参照しての以下の説明により、本発明はさらに理解されるであろう。
図1に、本発明の好ましい態様による、乳酸2量体とグリコール酸2量体およびN−(カルボベンジルオキシ)−L−セリンとの開環重合(ROP)と、続く脱保護を図式的に示す。図2に、ポリマー中のα−アミノ酸サブユニットの側鎖を介する生物活性部分のポリマーへの結合を図式的に示す。代表的な標的基には、水溶性および循環の場合にはポリ−エチレングリコール(PEG)、マクロファージ刺激物質および細胞生体付着性基が含まれる。α−ヒドロキシ酸またはα−アミノ酸から誘導されるスペーサー配位子を組み入れて生物活性配位子の結合を容易にすることができる。
【0047】
図3は、本発明の一実施形態によるマイクロパーティクル製造のために用いるプロセスの詳細を図式的に示す。この図において、Hin−47は、ヘモフィルスインフルエンザに由来する非タンパク質分解性組換えタンパク質類似体(米国特許第5,506,139号に記載)、Flu X31は、インフルエンザX31株またはA−Texas株、rD−15は、ヘモフィルスインフルエンザに由来する組換えタンパク質(WO94/12641に記載)、PVA=ポリビニルアルコールである。Flu(トリ)は3価のflu、Tbp2は、モラクセラカタラーリストランスフェリン結合タンパク質2、およびrUreaseは、組換えヘリコバクターピロリウレアーゼである。ポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−(Z)−セリンエステル(PLGpZS)およびポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル(PLGpS)マイクロパーティクルをPBSまたは代表的タンパク質(非タンパク質分解性Hin−47類似体)の存在下で調製した場合の、レーザー回折測定による代表的サイズ分布を図4に示す。
【0048】
リン酸緩衝食塩水(PBS)の存在下でポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−(Z)−セリンエステル(PLGpZS)およびポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル(PLGpS)から調製したマイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真を図5に示す。Hin−47/PBSなどの代表的抗原/PBS混合物の存在下でポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−(Z)−セリンエステル(PLGpZS)およびポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル(PLGpS)から調製したマイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真を図6に示す。
【0049】
PBS(pH=7.4)中でインキュベートされ37℃に維持された試料14mg(代表的なコアへの充填量は、マイクロパーティクルmgあたり2.5から5.7μgタンパク質の範囲にある)から得られたPLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクル中にカプセル充填された非タンパク質分解性Hin−47類似体の3カ月間のin vitroにおける放出経過を図7Aに示す。PBS(pH=7.4)中でインキュベートされ37℃に維持された試料〜14mg(代表的なコアへの充填量は、マイクロパーティクルmgあたり2.5から5.7μgタンパク質の範囲にある)から得られたPLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクル中からの非タンパク質分解性Hin−47類似体の3カ月間の%累積放出を図7Bに比較する。
【0050】
種々の免疫感作プロトコルに従ってヘモフィルスインフルエンザから得られた47kDa膜タンパク質(非タンパク質分解性Hin−47類似体)により皮下(S.C.)で免疫感作されたマウスにおける血清IgG応答を図8Aに示す。5匹のマウスからなる群を、PLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれた非タンパク質分解性Hin−47類似体0.2または0.6μgを含むpH7.4のPBS250μLにより、1日目および35日目に免疫感作した。+10、+24、+35、+46および+60日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)により抗−Hin−47IgG抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロトコルに従ってヘモフィルスインフルエンザから得られた47kDa膜タンパク質(非タンパク質分解性Hin−47類似体)により皮下(S.C.)で免疫感作されたマウスにおける血清IgG応答を図8Bに示す。5匹のマウスからなる群を、PLGマイクロパーティクルと物理的に混合した非タンパク質分解性Hin−47類似体0.8または2.5μgを含むpH7.4のPBS250μLにより、1日目および35日目に免疫感作した。+10、+24、+35、+46および+60日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)により抗−Hin−47IgG抗体の存在を評価した。図8Aおよび図8Bで説明したように行った試験から+35および+60日目に得られたプール血液について、血清IgG応答サブタイププロフィールを図8Cに示す。
【0051】
ヘモフィルスインフルエンザから得られた47kDa膜タンパク質(非タンパク質分解性Hin−47類似体)により胃内(I.G.)で免疫感作されたマウスにおけるIgG血清抗体応答を図9Aに示す。5匹のマウスからなる群を、PLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれ、またはPLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティクルと物理的に混合された非タンパク質分解性Hin−47類似体4μgを含むpH7.4のPBS500μLにより、1、7、14および57日目に免疫感作した。+13、+35、+56および+78日目に採取した血清について、酸素結合免疫吸着検定(ELISA)により抗−Hin−47IgG抗体の存在を評価した。図9Aで説明したように行った試験から+56および+78日目に得られたプール血液について、血清IgG応答サブタイププロフィルを図9Bに示す。図9Aで説明したように行った試験から+78日目に得られたプール血液について、血清IgA応答を図9Cに示す。
【0052】
ヘモフィルスインフルエンザから得られた47kDa膜タンパク質(非タンパク質分解性Hin−47類似体)およびヘモフィルスインフルエンザから得られた115kDa膜タンパク質(rD−15)の(1:1)カクテルにより鼻腔内(I.N.)で免疫感作されたマウスにおけるIgG血清抗体応答を図10Aに示す。5匹のマウスからなる群を、PLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれ、またはPLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティクルと物理的に混合された非タンパク質分解性Hin−47類似体4μgを含むpH7.4のPBS25μLにより、1、7、14および57日目に免疫感作した。+13、+35、+56および+78日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)により抗−Hin−47IgG抗体の存在を評価した。図10Aで説明したように行った試験から+56および+78日目に得られたプール血液について、血清IgG応答サブタイプ・プロフィルを図10Bに示す。図10Aで説明したように行った試験から+78日目に得た血液について血清IgA応答を図10Cに示す。図10Aで説明したように行った試験から+78日目に得た血液について肺潅注法IgG応答を図10Dに示す。図10Aで説明したように行った試験から+78日目に得た血液について肺潅注法sIgA応答を図10Eに示す。
【0053】
種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu X31(すなわち、A型インフルエンザウイルスX31株)IgG血清抗体応答を図11に示す。6匹のマウスからなる群を、PLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれたHA1.5μgを含むpH7.4のPBS250μLにより、皮下(S.C.)で1日目に免疫感作した。+21および+33日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)により抗−FluX−31IgG抗体の存在を評価した。
【0054】
種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu X31(すなわち、A型インフルエンザウイルスX31株)IgG血清抗体応答を図12に示す。6匹のマウスからなる群を、PLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれたHA1.5μgを含むpH7.4のPBS25μLにより、鼻腔内(I.N.)で1および34日目に免疫感作した。+21、+33、+57、+78および+92日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着決定(ELISA)により抗−Flu X31IgG抗体の存在を評価した。
【0055】
単回皮下投与後にプールした血清(+21および+42または+57日目)について血球凝集反応阻害抗体検定(すなわち、インフルエンザウイルスA−Texas株)応答を図13に示す。6匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパーティクルに取り込まれたHA0.35μgまたはHA3.5μg、PLGpSマイクロパーティクルに取り込まれたHA0.35μgおよびBAY R1−005〜2μg、またはHA3.5μgおよびBAY R1−005〜20μg、PLGpSマイクロパーティクルと物理的に混合されたHA0.35μgまたはHA3.5μg、PLGpSマイクロパーティクルと物理的に混合されたHA0.35μgおよびBAY R1−005 2μg、またはHA3.5μgおよびBAY R1−005 20μgを含むpH7.4のPBS250μLにより、皮下(S.C.)で1日目に免疫感作した。+21および+42日目に採取した血清について、赤血球の血球凝集反応阻害を調べた。
【0056】
種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu(3価)IgG血清抗体応答(3価ワクチン)中に含まれる各インフルエンザウイルス株について;A−Texas(図14a)、A/Johannesburg(図14b)およびB/Harbin(図14C))を図14aからcに示す。8匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパーティクル、またはBAY R1−005、DC−CholまたはPCPPの存在下で製剤化したPLGpSマイクロパーティクル中に取り込んだ合計2.35μgのHA(各株から約1/3の特異的HA)を含むpH7.4のPBS250μLにより、皮下(S.C.)で1日目に免疫感作した。+21、+42および+57日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)を用い、抗−Flu(3価)IgG抗体(A−Texas、A/JohannesburgおよびB/Harbin)の存在を評価した。
【0057】
単回皮下投与後の株特異的血球凝集反応阻害抗体検定(すなわち、A−Texas(図15a)、A/Johannesburg(図15b)およびB/Harbin(図15c)応答を図15aからcに示す。8匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパーティクル中に取り込んだ合計2.35μgのHA、またはBAY R1−005、DC−CholまたはPCPPを一緒にカプセル充填したPLGpSマイクロパーティクル中に取り込んだ合計2.35μgのHAを含むpH7.4のPBS250μLにより、皮下(S.C.)で1日目に免疫感作した。+21、+42または+57日目に採取した血清について、赤血球の血球凝集反応阻害を評価した。
【0058】
PLGpS/Flu(3価)マイクロパーティクル、またはBAY R1−005、DC−CholまたはPCPPを一緒にカプセル充填したPLGpS/Flu(3価)マイクロパーティクルの単回投与により免疫感作したマウスで行った防御試験の結果を図16に示す。マウスを同族の生ウイルスでチャレンジし、体重変化および2週間間隔で生存をモニターした。
【0059】
種々の免疫感作プロトコルに従って、モラクセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結合タンパク質により、皮下(S.C.)で免疫感作したマウスにおける血清IgG抗体応答を図17aに示す。5匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパーティクルに取り込むか、PLGpSマイクロパーティクルと物理的に混合するか、またはAlumとともに製剤化したtbp−2 0.3μgを含むpH7.4のPBS250μLにより、1、28および43日目に免疫感作した。+14、+27、+42および+55日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)を用い、抗−tbp−2IgG抗体の存在を評価した。図17aで説明したように行った試験から+55日目に得られたプール血液について、血清IgG抗体サブタイプ応答プロフィルを図17bに示す。
【0060】
モラクセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結合タンパク質(Tbp−2)により、鼻腔内(I.N.)で免疫感作したマウスにおけるIgG血清抗体応答を図18に示す。5匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパーティクル中に取り込むか、またはPLGpSマイクロパーティクルと物理的に混合したTbp−2 6μgを含むpH7.4のPBS10μLまたは50μLにより、1、28および43日目に免疫感作した。+14、+27、+42および+55日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)を用い、抗−Tbp−2IgG抗体の存在を評価した。
【0061】
種々の免疫感作プロトコルに従って、モラクセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結合タンパク質(Tbp−2)により、非経口的に免疫感作されたモルモットにおける血清IgG抗体応答を図19に示す。2匹のモルモットからなる群を、1日目にCFA400μLとともに製剤化したTbp−2 5μgにより筋肉内で免疫感作し、続いて、14および28日目にIFA500μL中で製造化したTbp−2 5.0μgにより皮下で免疫感作するか、1、14および28日目にAlum500μLとともに製剤化したTbp−2 5μg、または1および28日目にPLGpSマイクロパーティクルに取りまれたTbp−2 5μgにより免疫感作した。+40および+56日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)を用い、抗−Tbp−2 IgG抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロトコルに従って、ヘリコバクターピロリから得られた組換えタンパク質rUreaseにより、皮下(S.C.)または経口(I.G.)で免疫感作されたマウスにおける血清IgG抗体サブタイプ応答を図20に示す。8匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパーティクルに取り込まれたrUrease10.0μg(S.C.)または40.0μg(I.G.)、またはPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれたDC−Chol、CT−X、PCPPまたはLTの存在下で製剤化されたrUrease10.0μg(S.C.)または40.0μg(I.G.)を含むpH7.4のPBS250μLにより、1、28および56日目に免疫感作した。+85日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)を用い、抗−rUreaseIgG抗体の存在を評価した。
【0062】
図20に記載したマウスについて、85日目のチャレンジ後1カ月の防御試験の結果を図21aからbに示す。rUrease活性(皮下または経口経路で免疫感作されたマウスについて)は、マウスを致死させて24時間後に胃全体の1/4(幽門洞+胃体部)で測定した。
【0063】
本発明の新規なポリマーは、生体内に存在し、細胞生体付着基、マクロファージ刺激物質、ポリアミノ酸およびα−ヒドロキシ酸およびα−アミノ酸から選択される少なくとも1つのスペーサー分子を介してポリマーと結合するポリエチレングリコールなどの生物活性部分を有する良性代謝物に対して生体適合性、分解性である。このように、新規ポリマーは、官能基を有する。生物活性物質を含むマイクロパーティクルへのプロセッシングに有利な性質を有するポリマーの合成方法も説明するが、生物活性標的基による化学的修飾も可能である。
【0064】
好ましい実施形態において、共重合体は、α−ヒドロキシ酸と疑似−α−アミノ酸の重合によって製造し、およびターポリマー(terpolymer)は、2つのα−ヒドロキシ酸と疑似−α−アミノ酸との重合によって製造する。次いで、この共重合体またはターポリマーは、遊離アミノ基との直接の共有結合によるアミノ酸サブユニットを介して生物活性標的配位子により誘導体とされ、さらに適当なスペーサー配位子で誘導化することができる。
【0065】
アミノ酸単量体合成
通常、N−保護セリン(またはシステイン)は光延反応(ref.5)により環化され、4員環ラクトン(またはチオラクトン)が得られる。この変換は、エステル(またはチオエステル)結合を生じる。反応条件に適合するアミノ酸前駆体のアミン部分上の保護が重要である。カルボベンジルオキシ(CBZまたはZ)基を用いることが好ましいが、ベンジル(Bn)、パラ−メトキシベンジル(MeOBn)、ベンジルオキシメトキシ(BOM)、tert−ブチルオキシカルボニル(t−BOC)または[9−フルオレニルメチル)オキシ]カルボニル(FMOC)などの他の適当な官能基を用いてもよい。
【0066】
N−Z−L−セリンβ−ラクトン単量体の合成は、文献(ref.6)の改良法に基づいた。
【0067】
単量体を含むα−ヒドロキシ酸およびアミノ酸の共重合、およびアミノ酸側鎖の官能基化
α−ヒドロキシ酸単量体の共重合には2つの方法が利用できる。重縮合を介する重合、または溶解(バルク重合)による重合を選択することが可能である。比較的低分子量の物質では、しばしば競争的副反応が伴い、好ましくない副生成物が生じるため、縮合重合には問題のあることが長く知られていた(ref.7および8)。しかし、グリコリドおよびラクチドなどの環状2量体のバルク相からの開環重合(ROP)が、様々な触媒の存在下で容易に進行し、好ましくは、オクタン酸第一スズにより高分子量のポリマーを与えることが分かった(ref.9から15)。
【0068】
ポリ(アミノ酸)(ref.16、17および18)または疑似ポリ(アミノ酸)(ref.6および19)の調製には多くの方法がある。ポリ−α−ヒドロキシ酸(特に、50:50 D,L−ラクチドおよびグリコリドのポリマー)およびポリ(アミノ酸)のよく知られた生体内分解性の性質は、α−ヒドロキシ酸ポリマーのバックボーンにアミノ酸を取り込む方法を開発しようとする努力の増加をもたらした(ref.20から25)。ラクチドまたはグリコシドなどのα−ヒドロキシ酸サブユニット、およびグリシンまたはリジンなどのα−アミノ酸サブユニットを含む共重合エステルアミドの製造に進歩が見られた(ref.22,23および26)。
【0069】
生体内分解性ポリマーの分解速度、およびグリコリド、ラクチドのホモポリマーまたはこれらの物質の共重合体からのカプセル充填された物質の放出速度は、結晶性の程度、および相対的な疎水性または親水性の程度などといったそれらの分子量および構造に強く影響を受けることが分かった。具体的には、α−ヒドロキシ酸から誘導された高分子量のポリマーから製剤化されたマイクロスフェアは、低分子量の類似体に比べ長時間かかって分解する。同様に、高結晶性物質は、無定形類似体に比べかなりゆっくりした速度で崩壊する。このことは、加水分解に不安定なエステル結合への水の近づきやすさに関連している(ref.27)。50%のD,L−ラクチドおよび50%のグリコリドからなるランダム無定形共重合体は、最も進んだ分解速度を示すことが証明されており(ref.2および3)、PBS緩衝液(pH=7.4)中に浸けた場合、約6週間後に50重量%が残存する。
【0070】
前述の共重合エステルアミドは半結晶物質であり、カプセル充填された物質が完全に放出された後にも長い間投与部位に滞留する心配もある。カプセル充填された物質が完全に放出された時点または近い時点で分解するポリマーを手にすることは利点であると考え、疑似−α−アミノ酸サブユニットも含むターポリマーに等量のD,L−ラクチドおよびグリコリドをランダムに取り込む方法を開発した。無定形のターポリマーはフィルムおよびマイクロパーティクルへの加工に十分な機械的強度を保持する一方で、満足のいくポリマー分解速度および捕捉物質の放出速度を示すのではないかということを確かめるために、相対的に中程度の分子量のターポリマーを用いた。
【0071】
N−保護−L−セリンラクトンは、エステル結合を含み、エステル交換反応触媒を介して重合させることができる(ref.6)。さらに、ラクチドおよびグリコリドなどの6員環ラクトンは、挿入/配位型触媒/開始剤を用いることにより4員環プロピオラクトンと共重合させることができる(ref.13)。すべての単量体単位に比較的十分な反応性が達成されるようであれば、Sn試薬から誘導される触媒などの効率的エステル交換反応触媒が必要となることが予想された。
【0072】
オクタン酸第一スズが介在するグリコリド、D,L−ラクチドおよびN−Z−L−セリンラクトンの共重合を用いた。共重合体またはターポリマーのCBZ基の脱保護は、様々な方法で行うことができる。固相触媒還元または酸触媒(ref.27)が、2つの可能性である(図1)。
【0073】
得られた共重合体またはターポリマーは、図2に示すように、細胞付着性エピトープ、体循環のためのポリエチレングリコール(PEG)配位子、マクロファージ刺激物質およびポリアミノ酸グラフトなどの標的部分を付け加えることができる。例えば、α−ヒドロキシ酸または疑似−α−アミノ酸ユニットなどのスペーサーユニットを導入し、適当な標的ユニットで誘導化できる。このようにして生成されたポリマーは、約5,000から約40,000ダルトンの分子量を有する。
【0074】
マイクロパーティクルの形成
本明細書中で用いるように、「マイクロパーティクル」という用語は、大きさが1ミクロンより大きく生物活性物質の送達に用いる任意の粒子担体を意味する。本明細書中で用いるように、「マイクロスフェア」という用語は、1つまたは複数の活性成分(例えば、抗原、アジュバント、プラスミドDNA)を含むマイクロパーティクルを意味する。
【0075】
本明細書中に記載するマイクロパーティクル生成方法を例示する流れ図を図3に示す。通常、共重合体(PLG、PLGpZSまたはPLGpS)は、ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトンまたはその混合物などの適合する溶媒中に単独で溶けるか、追加の賦形剤で可溶である。ショ糖、マンノース、トレハロースまたはゼラチンなどの製剤化に含まれる賦形剤は、凍結防止剤(cryoprotectant)または水解防止剤(lyoprotectant)として役立つ。BAY R1−005(BAY)(ref.29)またはトリパルミトイルシステイン(TPC)(ref.30)または3b[N−(N′,N′−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール(DC−Chol)(ref.31)などの既知のアジュバント性を有する他の物質を製剤中に用いてもよい。
【0076】
全量12mLの1%から2%の共重合体溶液を調製するのが好ましい。この溶液に、リン酸緩衝食塩水(PBS)800μL、またはPBSまたは追加の賦形剤を含むことができる他の安定化緩衝液中の抗原溶液(通常1から2mg/mLの濃度)800μLを加える。ポリ[ジ(カルボキシラートフェノキシ)−ホスファゼン]ナトリウム塩、(Virs Research Institute、Cambridge MA)(PCPP)またはコレラトキシンまたはそのサブユニットなどの既知のアジュバント性を有する他の物質を製剤中に用いてもよい。次いで、この混合物を均質化して、油中水型乳剤を生成する。生成したら直ちに、この混合物を、0.5%から10.0%のポリビニルアルコール(PVA)、メチルセルロースまたはTriton X−100などの非イオン性乳剤安定化剤を含む水溶液100mLに分散させる。この混合物を均質化すると、水中油中水型二重乳剤が生成する。得られた小滴の平均サイズおよび多分散性(polydispersity)は、Coulter LS−100光散乱検出器を用いることによって容易に測定することができる。PBSまたは抗原/PBS混合物をカプセル充填するときの代表的なサイズ分布は、1から20ミクロンの範囲にある(大部分が10ミクロン未満のサイズ)。次いで、緩やかに温め、蒸発によってゆっくりと溶媒を除去すると、始めのマイクロスフェアが固化する。溶媒を除去したら直ちに、混合物を遠心分離してマイクロスフェアを集め、脱イオン水で繰り返し洗浄して、残存する乳剤安定化剤を完全に除去する。次いで、マイクロスフェアをドライアイス/アセトン中で凍結し、一昼夜凍結乾燥すると、白色で自由に流動する粉末としてマイクロスフェアが得られる(光散乱測定法による測定および走査型電子顕微鏡写真法によって直接確認したサイズは通常1.0から12ミクロン)。
【0077】
通常、この粒子は、約1から約50μMの粒子径を有する重合性マトリックスを含み、その中には、捕捉された生物活性物質、および場合によって一緒に捕捉されたアジュバントを有するポリマーを含む。重合性マトリックスに導入される生物活性物質およびアジュバントの量は、大きく異なり、全粒子塊の50重量%まで含むことができる。
【0078】
本発明の様々な実施形態は、医療の分野および特に、ワクチン接種、細菌およびウイルスを含む病原体による感染症の診断および治療の分野で多くの応用が可能であることは、当業者には明らかである。そのような使用についての限定的でない説明を以下に行う。
【0079】
ワクチン調製
ある実施形態において、例えば、ワクチンとして用いるのに適当な免疫原性組成物は、本明細書中に開示するマイクロパーティクルから調製することができる。生物活性免疫原性物質を含む免疫原性組成物は、宿主による抗体の産生を含む、投与された宿主による免疫応答を引き起こす。
【0080】
免疫原性組成物は、液体水剤または乳剤などの注射液として調製することができる。マイクロパーティクルは、マイクロパーティクルと適合する生理学的に許容可能な賦形剤と混合することができる。賦形剤には、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびその組合せが含まれる。さらに、ワクチンは、ワクチンの有効性を促進するために湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、またはアジュバントなどの追加の物質を含んでもよい。ワクチンは、非経口で、皮下注射または筋肉内注射により投与することができる。
【0081】
あるいは、本発明により生成されたマイクロパーティクルを含む免疫原性組成物は、粘膜表面で免疫応答を引き起こすような方法で送達することができる。したがって、免疫原性組成物は、鼻内、経口(胃内)、頬側または直腸経路により、粘膜表面に投与することができる。経口製剤には、医薬等級のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤が含まれる。
【0082】
これらの組成物は、水剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形をとることができる。経口経路で投与された場合に、マイクロパーティクルおよびマイクロパーティクルのコア中に含まれる、またはマイクロパーティクルと物理的に混合されてカプセル充填された物質を胃の酸性から守るために、マイクロパーティクルの投与前、投与と同時、または投与直後に酸中和調製物(重炭酸ナトリウム調製物など)を投与すると有利である。
【0083】
ワクチンは、剤形に適合した方法で、治療上有効で、防御的および免疫原性となるような量で投与する。投与される量は、治療を受ける対象、例えば、抗体を合成し、必要ならば、細胞媒介性の免疫応答を生み出すという対象の免疫システムの能力によって決まる。投与する必要のある生物活性を有するマイクロパーティクルおよび物質の正確な量は、専門家の判断によって決まる。しかし、適当な投与量範囲は当業者によって容易に決定可能であり、数マイクログラムから数ミリグラム程度でよい。初回投与および追加免疫投与の適当な処方も変化するが、初回投与と、それに続く投与を含むことができる。ワクチンの用法は投与経路で決まるが、ある宿主から他の宿主へと変化する。
【0084】
ワクチン製剤化に応用される本発明のポリマーは、DNAまたはアンチセンスRNAなどを用いるワクチン戦略にとっても有用である。マイクロパーティクル担体として、本発明のポリマーは、コアタンパク質またはエンベロープタンパク質などのウイルスの抗原部分のある遺伝子または複数の遺伝子をコードするDNAを含むように調製することができる。DNAが担体から放出されるにしたがって、宿主細胞は異種DNAを取り込み、問題の遺伝子を発現し、細胞内で対応するウイルスタンパク質を合成する。有利には、ウイルスタンパク質は、細胞媒介性免疫を引き起こす細胞の主要組織適合性複合体経路に入る。これに比べ、標準的なワクチン抗原は、細胞に取り込まれ、抗体応答を刺激するMHC IIクラスシステムによって処理される。
【0085】
DNAは、すべての関連タンパク質を持たず、複合体ベクターシステムを必要としない裸のDNAの形でよい。所望の遺伝子は、本命書中に記載のマイクロパーティクル中にカプセル充填されたプラスミドなどのベクターに挿入され、哺乳動物の組織中に注射されて遺伝子産生を発現し、免疫応答を引き起こすことができる。
【0086】
本発明のポリマーと組合せてアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることもできる。核酸配列は、タンパク質の産生を阻害する既知のタンパク質に具体的に対応するmRNA配列に結合するようにデザインすることができる。本明細書中に記載するマイクロパーティクルを用い、様々な免疫学的疾患ならびに高血圧、心血管疾患およびガンの治療に対する医療戦略としてこのようなアンチセンスヌクレオチド(オリゴヌクレオチドまたは発現したヌクレオチド)を送達することができる。
【0087】
本明細書中で開発したポリマー・マイクロパーティクルの徐放性の特徴は、マイクロパーティクルを用いて薬理学的試剤をゆっくりと連続的に送達するような薬理学の分野における用途も有する。血圧降下剤、鎮痛剤、ステロイド剤および抗生物質などの広範な薬物を本発明によって使用し、徐放薬物送達システムを得ることができる。
【0088】
捕捉または物理的に混合された生物学的試剤を有するフィルム型のポリマーには、外科的移植組織および器具のコーティングとしての用途を持つ。例えば、マイクロパーティクルに取り込まれた抗生物質を有するフィルム状のポリマーを用いて外科的に埋め込まれたカテーテルを被覆し、感染と闘う抗生物質を継続的に徐放することができる。
【0089】
マイクロパーティクル担体は、診断試薬としても有用である。適当な抗体とともに、イメージング試薬をマイクロパーティクルに導入することができる。このようにして、患者の臨床的経過を確認またはモニターするために罹患組織を標的とし、これをイメージすることができる。
【0090】
マイクロパーティクルとしてのポリマーは、適当な抗体と組み合わせて用いれば診断キットとしての用途も持つ。
【0091】
実施例
前述の開示は本発明を一般的に説明するものである。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単に例示目的で記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。付随的な事柄が手段を示唆あるいは伝えることもあるため、変形形態および等価形態の置き換えを企図している。本明細書中で特定の用語を用いたが、このような用語は、説明を意図したもので、限定を目的としたものではない。
【0092】
本開示中で用いるが明確に説明していない化学、有機化学、ポリマー化学、タンパク質生化学および免疫学の方法、およびこれらの実施例は、科学文献に詳しく報告されており、当業者の能力に含まれるものである。
【0093】
実施例1:
この実施例は、N−Z−L−セリンβ−ラクトンの調製を例示する。
【0094】
このN−保護アミノ酸ラクトンの調製は、改良法に基づくもので、N−保護−α−アミノ酸を反応させて、環化した疑似−α−アミノ酸単量体を得る(ref.6)。すべてのガラス器具は、120℃に設定したオーブン中で一昼夜予備乾燥する。使用に先立って、真空デシケータ中で冷却し、乾燥窒素流中10分間通気する。
【0095】
1Lの3頸丸底フラスコに、窒素中でトリフェニルホスフィン(TPP;Aldrich;7.87mL;50mmol;FW:174.16)を加えた。これに、無水アセトニトリル(CH3CN;Aldrich)および無水テトラヒドロフラン(THF;Aldrich)溶液(体積比85:15)200mLを注射器で加え、固体TPPが溶けるまで撹拌した。この溶液に、アゾジカルボン酸ジエチル(DEAD;Aldrich;7.87mL;50mmol;FW:262.29)を注射器で加え、溶液を室温で30分間撹拌した。反応溶液をアセトニトリル/ドライアイス浴に浸けて溶液を約−45℃から−48℃まで冷却した。溶液の内温が約−45℃に達したら直ちに、N−カルボベンジルオキシ−L−セリン(N−CBZ−L−セリン;Sigma;11.94g;49.8mmol;FW:239.2)の無水CH3CN:THF(体積比85:15)200mL溶液を注射器により1時間以上かけてゆっくり滴下した。添加中は溶液の温度を約−45℃に維持し、添加が終了すると同時に室温までゆっくりと温め、一昼夜撹拌を継続した。この反応で、CBZ保護α−アミノ基の存在下に、セリンヒドロキシ側鎖とカルボン酸の間にエステル結合の生成が起きる。反応完了後、蒸発により溶媒を除去した(35℃から45℃)。黄色の油/スラリ(〜35g)が得られる。このスラリに、ジクロロメタン:酢酸エチル(体積比85:15)溶液50mLを加えると、副生成物の1,2−ジカルベトキシヒドラジンの沈殿が生じる。この物質を減圧ろ過により除去し、続いて、蒸発により溶媒を除去した。前記手順を繰り返し、残存する副生成物をさらに除去することができる。次いで、ろう状固体の粗生成物を、溶離液として85:15ジクロロメタン:酢酸エチルを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。生成物のセリンラクトンは、薄層クロマトグラフィにより、1M H2SO4溶液による発色およびUV検出した場合に、この物質が85:15ジクロロメタン:酢酸エチルで展開するシリカゲルプレート上で0.75のRfを有することが確認できる。この生成物を酢酸エチル:ヘキサン(〜1L)で再結晶し、ろ過して真空乾燥した。
【0096】
再結晶後、融点(Tm=133〜134℃)の純粋な白色の固体が40%の収率で得られ、他のすべての物理パラメータ(NMR、IR、質量分析法、元素分析)は従来明らかにされたものと一致する(ref.6)。
【0097】
実施例2:
本実施例は、図1に示すポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−Z−セリンエステル(PLGpZS)共重合体の調製を例示する。ガラス製器具は一昼夜予備乾燥した。使用に先立って、真空デシケータ中で冷却した。さらに、重合容器(ガラスアンプル)はシリコン被覆(SurfaSil;Pierce;2%トルエン溶液)されなければならず、すべての転移反応および重合容器への試薬類および単量体の添加は、乾燥窒素環境に保持されたグローブ・ボックス中で行わなければならない。
【0098】
重合に先立ち、D,L−ラクチド(2,6−ジメチル−1,4−ジオキサン−2,5−ジオン;Aldrich;FW:144.13)およびグリコリド(Boehringer Ingelheim;FW:116.096)を、グローブ・ボックス中で無水酢酸エチルから再結晶し、約2日間真空で乾燥した。十分乾燥したら直ちに、直接グローブ・ボックスに入れた実施例1の新たに再結晶したセリンラクトン(0℃で保存)とともに単量体をグローブ・ボックス中に保存できる。すべての単量体および触媒/開始剤を秤量し、グローブ・ボックス中のガラスアンプルに移す。
【0099】
アンプルに移す単量体の総量は1gから5gの範囲であり、D,L−ラクチド:グリコリド:セリンラクトンのモル比は42.5:42.5:15.0から49.0:49.0:2.0の範囲である。好ましい実施形態においては、D,L−ラクチド:グリコリド:セリンラクトンのモル比、47.5:47.5:5.0を用いた。触媒(2−エチルヘキサン酸第一スズ(Sn(Oct)2;Sigma;FW:405.1、1.25g/mL)の無水クロロホルム(Aldrich)保存溶液をグローブ・ボックス中で調製し、マイクロシリンジでガラスアンプルに加えた(触媒の単量体に対するモル比=1/1000)。アンプル中に撹拌棒を置いた。グリースを付けたすりガラスのジョイントバルブをアンプル上に置き、グローブ・ボックスから取り出している間の不活性環境を維持した。次いで、アンプルを直接真空ラインにつなげ、蒸発によりクロロホルムをゆっくりと除去した。次いで、アンプルを約120℃の油浴中においてすべての試薬を溶融状態とし、続いて、火炎密封して、120℃に温度制御されたオーブン中に28時間置いた。反応後、アンプルを液体窒素中に入れてクエンチし、さらに処理するまで−20℃で保存する。アンプルにひびを入れ、粗製ポリマーをクロロホルムに溶かして回収した。溶媒を蒸発により除去し、新製ポリマーを真空乾燥すると、黄褐色の結晶性物質が得られた(収率は80%から90%)。
【0100】
このポリマーをクロロホルムに溶かし、不溶の物質をろ過により除き、ヘキサン(Aldrich)で沈殿させることにより精製した。ポリマーをろ過して回収し、この手順を繰り返して、未反応単量体が完全に除去されたことを確認した。2回の沈殿操作の後、ポリマーを約2日間真空乾燥すると、全収率30%から35%で純粋な白色の粉末が得られた。この物質の分子量は、反応時間に左右されたが、代表的な値はMw=17,000〜22,000、Mn=6,500〜8,000であった。示差走査熱量計(DSC)分析は、ランダム無定形ポリマーを示す単一の転移を移す。ガラス転移(Tg)は得られた物質の分子量により39℃から43℃の範囲にある。ポリマーのセリン含有量は、ポリマーの加水分解によって得られたフェニルチオイソシアネートセリン誘導体の測定に役立つアミノ酸分析(AAA)、1H NMR(グリコリドおよびD,L−ラクチドサブユニットに対するセリンCBZ保護基の芳香族残基の積算)、および元素分析(セリンの側鎖にのみ存在する窒素)により決定した。AAA分析は、通常1.7%から2.1%セリン含有量を示し、1H NMRは、2.0%から2.5%、元素分析は、2.4%から3.4%のセリンをそれぞれ示した。ポリマーのIR分析は、エステル、カーバメートおよびヒドロキシ基の存在を調べるのに役立った。
【0101】
1H NMRは、記載した反応条件下におけるすべての単量体成分の相対的取り込み効率の決定を可能にした。精製ポリマーで測定されたD,L−ラクチド:グリコリド:Z−セリンの代表的な比は、再現性よく、それぞれD,L−ラクチド52.0%から54.0%、グリコリド41.0%から43.5%、Z−セリン2.0%から2.5%であった。
【0102】
グリコリドまたはD,L−ラクチドに独特の共鳴1H NMRおよび13C NMRシグナル強度は、互いと良く分離し、配列効果にも感度がよかった。観測されたパターンから、ランダム配列分布が支持された。
【0103】
実施例3:
本実施例は、図1に示すポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル(PLGpS)共重合体の調製を例示する。すべてのガラス製器具は、一昼夜予備乾燥した。使用に先立って、真空デシケータ中で冷却し、乾燥窒素流で10分間通気した。すべての反応は乾燥窒素の不活性雰囲気中で行った。撹拌棒を備えた2頸の100mL丸底フラスコにポリマー(PLGpZS)400mgを入れた。これに、臭化水素の30%酢酸溶液(Aldrich;FW:80.92)10mLを加え、十分にスラリを生成させた。このスラリを30から45分間撹拌し、無水ジエチルエーテル(Aldrich)と、続いて、無水メタノール(Aldrich)を滴下してクエンチした。その結果、ポリマー沈殿が生じ、次いで、真空ろ過により単離した。粗製のポリマー沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、クロロホルム:ヘキサンから再沈殿させた。精製ポリマーを2日間真空乾燥すると、全収率50%から60%で純粋な白色の粉末が得られた。分子量は、Mw=15,000〜18,000、Mn=5,000〜6,500の範囲にあった。CBZ基の脱保護速度は、HBr/酢酸によるエステルバックボーンの競争的開裂より速かった。しかし、これらの条件の下では、この試薬を用いた結果として、分子量分布の広がり、および生成物の分子量の減少がある。この傾向は、より短時間で反応を行うことによって低減され、またはパラジウム炭素の存在下、水素を用いる水素添加による保護基の除去によりこの傾向を無くすことができる。DSC分析は、ランダム無定形ポリマーを示す単一転移を示す。ガラス転移(Tg)は得られた物質の分子量により42℃から45℃の範囲にある。ポリマーのセリン含有量は、ポリマーの加水分解によって得られたフェニルチオイソシアネートセリン誘導体の検出に役立つアミノ酸分析(AAA)および元素分析(セリンの側鎖にのみ存在する窒素)により決定した。AAA分析は、通常1.4%から1.7%のセリン含有量を示し、元素分析は、2.0%から2.7%のセリンをそれぞれ示した。ポリマーのIR分析は、エステル、アミンおよびヒドロキシル基の存在を検出するのに役立った。
【0104】
残存する保護ポリマーについての1H NMRは、90%以上のN−カルボベンジルオキシ基がうまく除去されたことを示した。より短い反応時間では、脱保護の含有量は並行して減少する。精製ポリマーで測定されたD,L−ラクチド:グリコリド:Z−セリン:セリンの代表的な比は、再現性よく、それぞれD,L−ラクチド53.0%から55.0%、グリコリド40.0%から43.0%、Z−セリン0.15%から0.25%およびセリン1.7%から2.1%であった。
【0105】
実施例4:
本実施例は、実施例2および3において合成されたコポリマーからのフィルムの生成を説明する。フィルムを生成するために、50mgのポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド(PLG)(分子量=31,000)、ポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド−コ−シュード−Z−セリンエステル(PLGpZS)(分子量=20,000)、ポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド−コ−シュード−セリンエステル(PLGpS)(分子量=19,000)を秤量し、10mLビーカー中に置いた。無水クロロホルム(1mL)を添加して、コポリマーを溶解した。この溶液を濾過し、ペトリディシュ中に置いた顕微鏡スライドに滴下して添加した。次いで、ペトリディッシュを250mLビーカーで覆い、48時間にわたり、ゆっくりと確実にエバポレーションさせた。得られたフィルムは半透明であり、そして角度測定器を用いて行った接触角の測定はそれぞれ、PLGについて75゜、PLGpZSについて75゜、PLGpSについて68.2゜の平均値を与えた。従って、PLGおよびPLGpZSコポリマーは疎水性が同等であるが、PLGpsコポリマーはわずかに親水性が高く、表面エネルギーも高いことが判明した。
【0106】
実施例5:
本実施例は、PBSまたは抗原/PBSをカプセル化する粒子形成のプロセスを説明する(ミクロスフェア形成)。
【0107】
本明細書中に記載される微粒子形成のプロセスを説明する流れ図を図3に示す。具体的には、100mgのコポリマーを、12mLのジクロロメタンに添加した。これに、800μLのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)溶液または800μLの、PBS中の非タンパク質分解性Hin−47アナログ(典型的に、1〜2mg/mLの濃度)を添加した。次いで、この混合物をホモナイズした(6,000rpmで20秒間)。この混合物を、形成後、100mLのポリビニルアルコール(PVA)の1.0%水溶液中に分散し、そして即座にホモジナイズして(8,000rpmで40秒間)、水中油中水の二重乳濁液を形成した。PBSまたは典型的な抗原(Hin−47/PBS)をカプセル化物として使用する場合の典型的なサイズ分布を、図4を示す。多分散系の微粒子(部分が、10ミクロン未満の大きさ)が、これらの条件下で形成された。次いで、エバポレーションにより溶媒をゆっくりと除去し、ミクロスフェアを遠心分離によって回収した。粒子を脱イオン水で洗浄し(5×)、次いでドライアイス/アセトン浴中で凍結し、そして一晩凍結乾燥して、ミクロスフェアの白色の自由に流動する粉末を得た(光走査測定によって決定され、走査電子顕微鏡検査によって直接的に確認されるように、典型的には、1.5〜10ミクロンのサイズ)。PLGpZSまたはPLGpSミクロスフェアについての代表的な走査電子顕微鏡写真を、図5に示す。PBS中の典型的な抗原(非タンパク質分解性のHin−47アナログ)をカプセル化する、PLGpZSまたはPLGpSミクロスフェアについての代表的な走査電子顕微鏡写真を、図6に示す。
【0108】
上記の方法によって、いくつかの異なる抗原および/または抗原+アジュバントを含む微粒子が調製された(表1および5を参照のこと)。
実施例6:
この実施例は、微粒子コアローティング効率、およびこのような微粒子からの抗原エピトープの回復を説明する。同じ方法の2つの改変を用いて、単離された微粒子の抗原含量または「コアローディング」を測定した。アミノ酸解析を、固体粒子の酸加水分解(6M HCl)によるか、または塩基/SDS加水分解(0.1N NaOH/1%SDS)のいずれかによって、次いで0.1N HClでの中和化によって、得られた微粒子の加水分解物に対して行った。あるいは、固体のミクロスフェアは、DMSO(ポリマーおよびタンパク質の両方を可溶化する相溶性の溶媒)中に溶解することができ、アミノ酸解析を、凍結乾燥されたサンプルに対して直接行うことができる。酸または塩基媒介性の加水分解は、最も再現可能な結果(+/− 5%)を与える好ましい方法であることを証明した。利用可能な場合、有効な固相酵素免疫検定法(ELISA)ポリクローナルアッセイが加水分解物に対して行われ、エピトープ当量を決定した。
【0109】
具体的には、ELISAによる非タンパク質分解性Hin−47アナログの定量について、非タンパク質分解性Hin−47アナログ抗原を、アフィニティー精製したモルモット抗Hin−47が被覆されたマイクロタイターウェル上に捕獲し(ウエル当たり非タンパク質分解性Hin−47アナログ抗原の2μg/mL溶液の50μLを添加した)、これをPBS中の5%スキムミルクでブロックした。抗原の呈示を、アフィニティー精製したウサギ抗Hin−47、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼF(abs)2、ロバ抗ウサギIgGによって検出した。テトラメチルベンジジン(TMB)(割合1)の存在下の基質H2O2(割合9)を100μL添加して、この反応を呈色し、そして2M硫酸溶液を各ウエルに添加することによって、反応の進行を終結した。色の強度(450nmでの読取り)は、ウエルにおける非タンパク質分解性Hin−47アナログの量に正比例した。各試験サンプルにおける非タンパク質分解性Hin−47アナログの濃度は、参照サンプルの倍数希釈によって得られる標準曲線からの外挿によって得られた、全てのサンプルを、二連で分析した。
【0110】
PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内に非タンパク質分解性Hin−47アナログまたは非タンパク質分解性Hin−47アナログ+BAY R1−005をカプセル化する微粒子に対するエピトープ回復の、コアローディングについてのアミノ酸解析、およびHin−47特異的ポリクローナルELISA分析を、表2に示す。Hin−47から単独で調製された微粒子についてのコアローディングは、20%〜43%の範囲であり、10%〜31%のエピトープが、処方の間に保存された。BAY R1−005の存在下で非タンパク質分解性Hin−47アナログから調製された微粒子についてのコアローディングは、26%〜59%の範囲(6%〜16%の絶対増加)であり、20%〜39%(4%〜18%の絶対増加)のエピトープが、処方の間に保存された。従って、BAY R1−005の存在下での処方は、付随して、ローディング効率を増加し、エピトープを保護するために作用する。
【0111】
PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内にrD−15をカプセル化する微粒子についてのコアローディングのアミノ酸解析を、表3に示す。39%〜44%の範囲のコアローディングが得られた。このタンパク質は、膜由来であり、従って、以前の実施例の非タンパク質分解性Hin−47アナログよりも疎水性である。この抗原を使用する場合、実施例10の非タンパク質分解性Hin−47アナログに対して増加されたカプセル化効率が、常に観察された。
【0112】
PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内に、非タンパク質分解性Hin−47アナログとrD−15とのカクテル(1:1のカクテル)をカプセル化する微粒子に対する、コアローディングについてのアミノ酸解析、およびエピトープ回復を、表3に示す。rD−15の存在下での非タンパク質分解性Hin−47アナログの同時カプセル化は、より高い全体のローディング効率を生じることが予測された。35%〜62%の範囲のコアローディングが得られ、8%〜26%の、非タンパク質分解性Hin−47アナログを使用たエピトープが、処方の間保存された。PLGpZSまたはPLGpSコポリマーで処方される場合、より親水性の成分(非タンパク質分解性Hin−47アナログ)の全体のローディング効率は、rD−15との同時カプセル化によって増加された。PLGを使用した場合、この効果は観察されなかった。コポリマー処方に関係なく、実施例10と比較して、類似の非タンパク質分解性Hin−47アナログのエピトープ回復が得られた。
【0113】
PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリ−マー内に、Flu X−31またはFlu X−31+BAY R1−005をカプセル化する微粒子についての、コアローディングのアミノ酸解析を、表4に示す。26%〜40%の範囲のコアローディングが、Flu X−31で得られ、そしてBAY R1−005の存在下のFlu X−31については、31%〜953%の範囲のコアローディングが得られた。従って、5%〜13%の絶対増加が、BAY R1−005の存在下で処方した場合に得られた。唯一の例外は、BAY R1−005およびPLGpSとのFlu X−31の処方であり、ここでは9%の絶対減少を観察した。
【0114】
Flu A−Texasをカプセル化するPLGpS微粒子についての21%コアローディングが得られた。BAY R1−005の存在下でFlu A−Texasをカプセル化するPLGps微粒子について、32%のコアローディングが得られた。
【0115】
Fluの異なる系統(A−Texas)を、BAY R1−005およびPLGpSコポリマーとともに用いた場合、カプセル化効率を増加する傾向がまた観察された。BAY R1−005の存在下でFlu A−TexasとともにPLGpSを処方する場合、11%の絶対増加が得られた。これは、BAY R1−005の存在下でのPLGpSおよびタンパク質についての処方は、各場合において最適化されなくてはならなことを示唆する。実施例10におけるように、コアジュバントのBAY R1−005の添加は、より高いローディング効率を生じた。
【0116】
PLGpsコポリマー内にFlu(3価)ワクチンまたはFlu(3価)ワクチンと、BAY R1−005、DC−Chol、またはPCPPとをカプセル化する微粒子についての、コアローディングのアミノ酸解析を、表6に示す。72%〜104%の範囲の非常に優れたコアローディング効率は、実施例5の手順を使用して得られた。カプセル化率における改良は、至適な濃度のタンパク質が使用されて主な乳濁液が形成される場合に視察される、一般的な結果である。この場合において、至適な濃度は約0.5mg/mLであることが、実験的に決定された。
【0117】
コポリマー内に、rUrease、またはrUrease+DC−Chol、PCPP、もしくはCT−Xをカプセル化する微粒子に対するエピトープ回復の、コアローディングについてのアミノ酸解析、およびrUrease特異的ポリクローナルELISA分析を、表7に示す。エピトープ回復は、アミノ酸解析によって得られる全タンパク質と、ポリクローナルELISAによって得られる全タンパク質との差として規定され、パーセントで表現される。rUreaseから単独で調製された微粒子についてのコアローディングは約46%であり、約72%のエピトープが、処方の間に回復された。同様に、DC−Cholの存在下でrUreaseから調製される微粒子についてのコアローディングは約44%であり、約69%のエピトープが回復された。わずかに高い全タンパク質が、PCPPの存在下でrUreaseから調製された微粒子について確定された。67%のコアローディングおよび約55%のエピトープ回復が、この組み合わせについて観察された。rUreaseおよびCT−Xの両方がこの値に寄与するので、rUrease/CT−Xの組合せに関しては、rUreaseについての全体のコアローディングは、アミノ酸解析によって評価することができなかった。CT−XについてのポリクローナルELISAアッセイを創出し、微粒子加水分解物を、全体のrUreaseおよびCT−Xのそれぞれについて、アッセイした。rUreaseについて53%の、およびCT−Xについて59%のエピトープ回復が、それぞれ見出された。これらの微粒子加水分解物に対して行われたSDS−PAGEおよびウェスタンブロットによって、非分解のrUreaseおよびCT−Xの存在が確認された。
【0118】
rUreaseについてのポリクローナルELISAアッセイが、DC−CholおよびPCPPのような付加物によって影響されなかったことを確認するために、適切なコントロール試験を行った。PCPPの場合、アッセイは、しばしば問題があり、一定ではなかった。DC−Cholの存在下でrUreaseをアッセイした場合は、同様な問題はなにも見出されなかった。
【0119】
実施例7:
この実施例は、PLG(比較の目的のためにコントロールとして使用した)および合成されたコポリマーPLGpZSおよびPLGps内にカプセル化された、モデル抗原(非タンパク質分解性Hin−47アナログ)についてのインビトロ放出速度、およびタンパク質の全体の累積回復%を説明する。
【0120】
抗原を含有するミクロスフェア内に処方されたPLGは、分子量=26,000であり、50:50の割合のD,L−ラクチド:グリコリドを有することが確定された。この物質は、実施例2および3のコポリマーPLGpZSおよびPLGpSについて得られたものに、構成および分子量が類似する。典型的な実験において、14mgのミクロスフェア(ミクロスフェア加水分解物のアミノ酸分析によって確定されるように、非タンパク質分解性Hin−47アナログのコアローディングは、PLGについて2.8μg/mg、PLGpZSについて5.7μg/mg、およびPLGpSについて2.5μg/mg)を、2mLのエッペンドルフチューブ中に置き、これに1.0mLのPBS(pH=7.4)を添加した。次いで、37℃に維持した熱調節化オーブンに、攪拌しないでチューブを置いた。種々の時間間隔で、PBS溶液を抽出して、そしてアミノ酸解析により、全タンパク質について分析した。各抽出後、PBS溶液は、最大90日まで、連続してサンプリングと置き換えられた。コントロール実験において、PLGまたはPLGpSコポリマーから調製された大部分のミクロスフェア(80重量%を超える)が、45日目までに消滅した。PLGpZSコポリマーから処方された、ミクロスフェアの分解は、いくらか遅延され、本質的に同じ程度まで侵食されるまでに60日を要した。
【0121】
各群の微粒子で同様の抗原放出傾向が観察され、ここでは少量のタンパク質が、最初の数日にわたって放出された。これは、14日目までに、抽出できない限界近くまで減少し、これ以後、タンパク質放出速度は、約30日目での最大値まで、着実に増加した。この時点以後、タンパク質の放出は、再び検出の限界に近接するレベルになった。これらのサンプルからのタンパク質の全体の累積回復%は、各群のミクロスフェアのそれぞれのコアローディングに関して、40%〜65%の範囲であった。
【0122】
図7Aは、各サンプルについての特定の時点での放出速度を説明し、および図7Bは、試験した各サンプルについての累積放出%を示す。これらの条件下で、ミクロスフェアからのタンパク質の最も良好な回復は、PLGpS/PLG/PLGpZSの順であるが、PLGpZS微粒子のコアローディングは、PLGまたはPLGpSアナログのコアローディングの約2倍であり、これは放出速度を影響し得る。さらに、このマトリクスは、より遅延された速度で分解されることが示され、従って、微粒子内に残留物質が存在し得る。このことについての証拠は、図7Bにおいて見ることができ、これによってタンパク質回復の限界増加が、PLGpZS微粒子について、60日目〜90日目に観察された。この同じ時間間隔にわたって、PLGまたはPLGpS微粒子から回復されたタンパク質は、本質的に存在しなかった。
【0123】
コントロール実験において、37℃でインキュベートされた、PLG、PLGpZS、またはPLGpS微粒子を負荷されたPBSの定期的な抽出物から得られたPBSの上清溶液を、pH変化についてモニターした。PLGAマトリクスについての侵食プロセスには、微粒子内のpH微環境の変化が伴うことが知られている(参考文献36)。これらの変化の結果として、pH誘導性の構造変化が生じ得るので、これはタンパク質の安定性に対して重大な影響を有し得る。これらの変化の大きさの指標は、周囲の媒体のpHをモニターすることによって得ることができる。本発明者らは、コポリマー内の小さなパーセントのアミノ酸サブユニットの取込みが、このプロセスを遅延し得ることを見出した。このことは、酸性pHに感受性であるタンパク質の放出期に重要である。具体的には、1.2mLのPBS緩衝液(pH=7.4)中の〜10mgの微粒子をインキュベートする場合、PLG(分子=26,000ダルトン)の上清抽出物が、pH5.0以下になるために、約16日間を必要とする。類似して、PLGpZS(分子量=20,000ダルトン、約2,0%のセリンを混入)、またはPLGpS(分子量=18,000ダルトン、約1.7%のセリンを混入)から得られた上清抽出物のpHは、それぞれ、約5.5〜6.2であると確定された。この研究において試験されたPLGおよびPLGpSについての分解速度は同様であったが(マトリクスの質量損失によって測定される)、PLGpSマトリクスの分解速度は減少した。
【0124】
従って、インビトロ放出研究は、単一用量の遅延された放出送達系が、PLGpZSまたはPLGpSコポリマーから処方されたポリマーの微粒子の使用により達成され得ることを実証する。さらに、マトリクス侵食を伴うpH変化は、タンパク質安定性に対する有害な影響を有し得るので、偽生理食塩水エステル(例えば、PLGpZSまたはPLGpS)に由来するマトリクス(ここではタンパク質放出期のこれらの変化について、いくらかの緩衝能力が存在する)を使用することが有利である。
【0125】
実施例8:
本実施例では、微粒子でカプセル化または微粒子と物理的に混合した非蛋白分解性Hin−47類似体をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。本発明にしたがって形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Hin−47類似体を試験するために、以下の量の抗原をPBS(pH7.4)250μLに溶解させ、試験1日および試験35日目に6〜8週齢のBALB/c系マウス(Charles River Breeding LaboraTories,Wilmington,MA)雌1群5匹に皮下(S.C.)免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、非蛋白分解性Hin−47類似体0.2μgまたは0.6μgを含むPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子(図8A)、および実施例5にしたがって調製し、非蛋白分解性Hin−47類似体0.8μgまたは2.5μgと物理的に混合したPLG微粒子(図8B)。
【0126】
カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体を含む微粒子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験+10、+24、+35、+45および+60日に血清を採取し、抗原特異性ELISAを用い、抗Hin−47IgG抗体の有無を評価した。試料は、全て2回分析した。0.2μg/mLの非蛋白分解性Hin−47類似体を含む0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液(pH9.0)100μLをミクロタイタープレートのウエルに添加し、室温で1夜インキュベーションした。PBS+0.05%Tween20(機能上、洗浄緩衝液と定義する)でプレートを洗浄した。ウエルに5%スキムミルク200μL(機能上、ブロッキング緩衝液と定義する)を加えて、インキュベーションした。PBS+0.05%Tween20で洗浄した後、ブロッキング緩衝液で逐次希釈した試料100μLをウェルに添加し、37℃で1時間インキュベーションした。ウェルをPBS+0.05%Tween20で洗浄し、HRP−共役抗体(ヤギ抗マウスIgG(H+L)(Jackson)、ヒツジ抗マウスIgG1(Serotec),ヤギ抗マウスIgG2a(Caltag)またはヤギ抗マウスIgG2b(Caltag))を加えたブロッキング緩衝液100μLを各ウエルに添加した。37℃で1時間インキュベーションした後、PBS+0.05%Tween20でウエルを5回洗浄した、新たに調製した発色用基質〔H2O2 9部およびTMB 1部〕を各ウエルに添加した。暗黒下の室温で5分間インキュベーションした後、2M H2SO4溶液50μLを添加して反応を停止させ、ミクロプレートリーダーを用いて各ウェル中の液体の吸光度を450nmで測定した。正常なマウスのプール血清を用いて、分析における吸光度のベースラインを確定した。陽性対照として、高度免疫性マウスのHin−47抗血清を用いた。陰性対照として、免疫投与前血清を用いた。
【0127】
血清IgAの分析は、上記の方法を以下のように改良して行った。1.3μg/mLの非蛋白分解Hin−47類似体を含む0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液(pH=9.0)100μLをミクロタイタープレートのウェルに注入して、室温で1夜インキュベーションし、0.06μg/mLのウサギのH R B接合抗マウスIgA(ZYMED、CA)100μLを各ウェルに添加した。
【0128】
分泌型IgAの分析は、上記の方法を以下のように改良して行った。0.06μg/mLのラットのHRP共役抗マウスIgA(Biotin−Pharmigen)100μLを各ウエルに添加した。免疫投与後の血清抗体の力価を図8Aおよび8Bに示す。免疫投与の結果から、PLGまたはPLGpS微粒子(図8A)に捕捉させた抗原を免疫システムに提供すると、可溶性抗原単独の場合に要求される最適用量以下で、可溶性抗原に比較して免疫原性が高くなることが認められた。さらに、投与量0.2μgまたは0.6μgのカプセル化非蛋白分解性Hin−47類似体では、投与量依存性は認められなかったが、投与量0.8μgまたは2.5μgの可溶性非蛋白分解性Hin−47の場合には、わずかながら力価の増大が認められた。
【0129】
免疫投与の結果から、抗原をPLG微粒子と物理的に混合して免疫システムに提供すると(図8B)、可溶性抗原単独の場合と同じ用量(0.8μgまたは2.5μg)で、可溶性抗原に比較して免疫原性がわずかに高くなることが認められた。しかし、溶解状態または微粒子と混合した形態で投与すると、微粒子でカプセル化した抗原よりも数桁小さい反応が誘導されたに過ぎなかったことから、カプセル化すると溶解状態または物理的混合よりも利点のあることが立証された。
【0130】
興味あることに、非蛋白分解性Hin−47類似体をカプセル化させた微粒子、非蛋白分解性Hin−47類似体を物理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分解性Hin−47類似体を投与し、試験35日および試験60日目に採取した血液プールのIgGサブタイプのプロフィール(図8C)から、試験35日目までは、製剤に関係なく、IgG1が優勢なサブタイプであり、ほかに少量のIgG2bが検出された。試験60日目には、微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体で誘導されるIgGサブタイプにクラススイッチがみられ、IgG1、IgG2aおよびIgG2bに量的な差は認められなくなった。微粒子と物理的に混合させた非蛋白分解性Hin−47類似体は、また溶解させた同類似体によって産生されるIgGサブタイプの種類は、試験35日目に測定した場合と実質的に同じで、IgG1サブタイプが優勢であった。
【0131】
以上のように、微粒子カプセル化抗原によってもたらされる免疫反応には、物理的に混合した微粒子または可溶性抗原のみの場合とは質的にかなり異なると結論される。BABLB/c系マウスにおけるIgG2aサブタイプの存在はTH1経路を示唆し、IgG1の存在はTH2経路を示唆していると一般的に考えられている。皮下免疫投与の場合、可溶性抗原または微粒子と物理的に混合した抗原ではTH2経路が優勢であり、一方微粒子でカプセル化した抗原では比較的バランスのとれたTH1/TH2反応が得られる。
【0132】
実施例9:
本実施例では、本発明にしたがって形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Hin−47類似体をマウスに胃内免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗原を0.15M NaHCO3(pH9.0)250μLに溶解させ、試験1、7、14および57日目に6〜8週齢のBALB/c系マウス(Charles River Breeding Laboratories,Wilmington,MA)雌1群5匹に胃内(I.G.)免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、非蛋白分解性Hin−47類似体4.0μgを含むPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子、および実施例5にしたがって調製し、非蛋白分解性Hin−47類似体4.0μgと物理的に混合したPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子(図9A)。カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体を含む微粒子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験、+13、+35、+65および+78日に血清を採取し、実施例8に示す抗原特異性ELISAを用い、抗Hin−47IgGおよびIgA抗体の有無を評価した。
【0133】
血清および腸内洗浄液について、Hin−47特異性抗体の有無を調べた。腸管内の抗Hin−47IgGおよびsIgAを検出し定量するために、頚椎脱臼法によりマウスを屠殺し、小腸を摘出し、抗原特異性抗体の有無を調べた。各小腸を幽門括約筋から盲腸の間で摘出し、毛細管を挿入して反転させた。水冷した酵素阻害剤溶液(0.15M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.005M EDTA、0.002M PMSF、0.05U/mLアプロチニンおよび0.02%v/v NaN3)5mLに反転させた腸管を浸漬し、4時間インキュベーションした。小腸を除去し、遠心分離(1000×g、20分間)により上清を分取し、分析するまで0℃で保存した。上記のHin−47特異性ELISAを用い、試料中の抗Hin−47IgGおよびsIgA力価を測定した。ただし、ヤギ抗マウスIgG抗血清の代わりにヤギ抗マウスIgA抗血清を使用した。
【0134】
I.G.免疫投与後の血清IgG Hin−47特異性抗体の力価を図9Aに示す。これらの結果から、腸内投与の場合、PLG、PLGpZSまたはPLGpS微粒子に結合した抗原(非蛋白分解性Hin−47類似体)は、同量(4μg)の可溶性抗原に比較してかなり高い免疫原性を示し、微粒子と物理的に混合した抗体よりも優れていることが認められた。可溶性抗原から本質的に同等の反応を誘導させるためには、微粒子でカプセル化して投与した抗体(4μg)の5倍の用量(20μg)が必要であることを実験的に確認した。腸内投与によって血清IgG抗体の顕著な反応を誘導するためには、100μgを超える抗原を必要とする例が多いので、ほとんどすべての蛋白質について、この結果は例外的である。
【0135】
非蛋白分解性Hin−47類似体をカプセル化た微粒子、非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分解性Hin−47類似体を投与して、試験56日および試験78日目に採取した血液から得られた血清のIgGサブタイプのプロフィール(図9B)では、実施例8で確認した傾向と似た傾向が認められた。抗原を溶解状態または微粒子と混合した形態で投与すると、IgG1サブタイプが優勢である。微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体の場合は、IgG1およびIgG2aがほぼ等しく生成し、バランスのとれたプロフィールが認められた。このように、微粒子でカプセル化した抗原の胃経由投与により、比較的バランスのとれたTH1/TH2反応が得られた。
【0136】
試験78日目の採血から得られた抗Hin−47IGA抗体反応の結果を図9Cに示す。1回量が4μgの可溶性抗原の場合は、検出可能な血清IgAを確認することができなかった。しかし、1回量が20μgでは、反応を示す例が少数認められた。顕著な反応が認められたのは、PLG微粒子でカプセル化した抗原の場合であり、PLGpZSまたはPLGpS微粒子でカプセル化した抗原に対しては、中程度の反応が認められた。PLG、PLGpZSまたはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原については、同様に穏やかな反応が認められた。PLGpS微粒子でカプセル化した抗原の場合に、血清IgAの平均濃度が最も高かった。
【0137】
PLG、PLGpZSまたはPLGpS微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体に特異的なIgGまたはsIgAの濃度が最も低かったのは、試験78日目に行った腸管洗浄の場合であった。これは、恐らくこの実験に供したカプセル化抗原の濃度が非常に低かった(1回量4μg)ためである。経口投与の場合、他の粘膜アジュバントが存在しない状態で粘膜の顕著な反応を誘導するためには、通常30〜100μgの範囲の抗原が必要である。
【0138】
実施例10:
本実施例では、本発明にしたがって形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Hin−47類似体の、マウスに鼻腔内免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗原をPBS(pH7.4)25μLに溶解させ、試験1、7、14および57日目に6〜8週齢のBALB/c系マウス(Charles River Breeding Laboratories,Wilmington,MA)雌1群5匹に鼻腔内(I.N.)免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、非蛋白分解性Hin−47類自体4.0μgを含むPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子、および実施例5にしたがって調製し、非蛋白性Hin−47類似体4.0μgと物理的に混合したPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子(図10A)。
【0139】
カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体を含む微粒子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験+13、+35、+56および+78日に血清を採取し、実施例8に示す抗原特異性ELISAを用い、抗Hin−47IgGおよびIgA抗体の有無を評価した。血清および肺洗浄液についてHin−47特異性抗体の有無を調べた。気道中の抗Hin−47IgGおよびsIgAを検出し定量するために、頚椎脱臼法によりマウスを屠殺し、気管に小さな切り口を作り、チューブを気管から肺に挿入し、400μLの酵素阻害剤溶液(0.15M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.005M EDATA、0.002M PMSF、0.05U/mLアプロチニンおよび0.2%v/v NaN3)を肺に注入した。次いでこの溶液を抜き取り、氷上に置き、遠心分離(1000×g、20分間)により上清を分取し、分析するまで0℃で保存した。実施例8に示すHin−47特異性ELISAを用い、試料中の抗Hin−47IgGおよびsIgA力価を測定した。
【0140】
I.N.免疫投与後の血清IgG Hin−47特異性抗体の力価を図10Aに示す。これらの結果から、PLG、PLGpZSまたはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原(非蛋白分解性Hin−47類自体)は、同程度の用量(4μg)の可溶性抗原に比較して高い免疫原性を有することが認められた。鼻腔経由で投与した場合、カプセル化した抗原および微粒子と物理的に混合した抗原では、本質的に同程度の反応が得られた。
【0141】
非蛋白分解性Hin−47類似体をカプセル化した微粒子、非蛋白分解性Hin−47類似体を物理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分解性Hin−47類似体を投与し、試験56日および試験78日目に採取したプール血液のIgGサブタイプのプロフィール(図10B)からは、実施例8または実施例9に示した傾向とは異なった傾向が認められた。微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体の場合、いずれの検査時期(試験56日目または試験78日目)にもIgG1、IgG2aおよびIgG2bが本質的に同程度存在し、他に比較してバランスの取れたプロフィールが認められた。溶解状態または微粒子と物理的に混合した形態で投与した抗原に関しては、試験78日までに類似のプロフィールが認められ、顕著な濃度のIgG2aも確認することができた。
【0142】
このように、鼻腔経由で投与した場合、抗原が微粒子内にカプセル化されているか、微粒子と物理的に混合されているか、溶解した形態であるにかかわらず、TH1/TH2反応は本質的に同じであった。試験78日目の採血から得られた抗Hin−47IgA抗体についての結果を図10Cに示す。可溶性抗原に関しては、血清IgGは検出できなかった。しかし、微粒子でカプセル化または微粒子と物理的に混合した抗原の場合には、顕著な反応が認められた。PLGpS微粒子でカプセル化した抗原、またはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原の場合に、最も高い濃度が得られた。
【0143】
試験78日目に行った肺洗浄では、分泌物から検出したIgGおよびsIgAに関してかなりの差が認められた。可溶性抗原からの抗Hin−47IgG抗体反応(図10D)は、無視できる程度であったが、微粒子でカプセル化またはPLG微粒子と物理的に混合した抗原では、検査した各群の半数の動物から顕著な濃度のIgGが確認された。PLGpZSまたはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原では最も再現性の高いIgG反応が認められ、検査したほとんどまたは全てのマウスで顕著な濃度のIgGが認められた。
【0144】
抗Hin−47sIgA抗体反応(図10E)は、図10Dに示すIgGで得られた反応と類似していた。可溶性抗原の反応は無視できる程度であり、PLG微粒子でカプセル化またはPLG微粒子と物理的に混合した抗原ではある程度の反応が認められた。PLGpZSまたはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原では最も顕著なsIgA反応が認められ、大部分のマウスでかなりの濃度のsIgAが検出された。
【0145】
粘膜表面に局部的な防護を誘導すると、しばしば局部分泌物中にIgGおよびsIgAが検出される。鼻腔免疫投与しても上気道に免疫を誘導しないという可能性を否定することはできないが、微粒子でカプセル化または微粒子と混合した抗原は血清IgG抗体反応を誘導することは明らかである。IgGおよびsIgAを局部的に誘導するためには、微粒子、特にPLGpZSまたはPLGpS微粒子と抗原を物理的に混合することがこれらの条件下で比較的適した方法であると思われる。
【0146】
実施例11:
本実施例では、本発明にしたがって形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させたFlu X−31またはFlu X−31+co−アジュバントBAY R1−005をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。
【0147】
以下の量の抗原をPBS(pH7.4)250μLに溶解させ、試験1日目に6〜8週齢のBALB/c系マウス(Charles River Breeding Laboratories,Wilminton,MA)雌1群6匹に皮下(S.C.)免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、5.0μgのFlu X−31(HA 1.5μg)または5.0μgのFlu X−31(HA 1.5μg)+50μgのBAY R1−005(溶液投与)または約20μgのBAY R1−005(co−カプセル投与)を含むPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子(図11)。
【0148】
カプセル化したFlu X−31またはFlu X−31+BAY R1−005を含む微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験+21および+33日に血清を採取し、実施例8に示す抗原特異性ELISAを用い、抗Flu X−31IgG抗体の有無を評価した。試料は、全て2回分析した。4.0μg/mLのFlu X−31を含む0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液(pH9.6)500μLをミクロタイタープレートのウェルに添加し、室温で1夜インキュベートした。PBS+0.05%Tween20(機能上、洗浄緩衝液と定義する)でプレートを洗浄した。ウェルに5%スキムミルク200μL(機能上、ブロッキング緩衝液と定義する)を添加して、インキュベーションした。PBS+0.05%Tween20で洗浄した後、ブロッキング緩衝液で逐次希釈した試料100μLをウェルに添加し、37℃で1時間インキュベーションした。ウェルをPBS+0.05%Tween20で洗浄し、HRP−共役抗体(ヤギ抗マウスIGG(H+L)、IgG1、IgG2aまたはIgG2b)を加えたブロッキング緩衝液100μLを各ウェルに添加した。37℃で1時間インキュベーションした後、PBS+0.05%Tween20でウェルを5回洗浄し、新たに調製した発色用基質〔H2O2 9部およびTMB 1部〕を各ウェルに添加した。暗黒下の室温で5分間インキュベーションした後、2M H2SO4溶液50μLを添加して反応を停止させ、ミクロプレートリーダーを用いてウェル中の液体の吸光度を40nmで測定した。正常なマウスの血液プールを用いて、分析における吸光度のベースラインを確定した。陽性対照として、高度免疫性マウスのFlu X−31抗血清を用いた。陰性対照として、免疫投与前血清を用いた。
【0149】
免疫投与後の血清抗体の力価を図11に示す。1回の免疫投与(試験1日目)の結果から、抗原をPLGまたはPLGpS微粒子に捕捉させて免疫システムに提供すると、可溶性抗原単独の場合に比較して免疫原性が高くなることが認められた。PLGpZS微粒子でカプセル化したFlu X−31またはFlu X−31+BAY Rl−005で、最も顕著な結果が得られた。試験した全ての微粒子で最適用量以下の用量のBAY R1−005をカプセル化したが、PLGpZS微粒子では可溶性Flu X−31およびBAY R1−005単独の場合に比較して免疫原性反応が顕著に高くなることが認められた。本実施例に示した試験によって、本発明にたがって調製した微粒子に抗原を捕捉させると、インフルエンザビールスから得られたビールス性抗原の免疫原性が高く、高濃度の血清IgG抗体を産生した、さらに、微粒子システムを一回だけ免疫投与した場合でも、免疫原性が他の場合に比較して顕著に増進したことから、これらの材料で単回投与ワクチンを開発することができると考えられる。
【0150】
実施例12:
実施例では、本発明にしたがって形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させたFlu−X−31またはFlu−X−31+co−アジュバントのマウスに鼻腔内免疫投与したときの免疫原性を説明する。
【0151】
以下の量の抗原をPBS(pH7.4)25μLに溶解させ、試験1日および試験34日目に6〜8週齢のBALB/c系マウス(Charles River Breeding Laboratories,Wilmington,MA)雌1群6匹に鼻腔内(I.N.)免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、5.0μgのFlu−X−31(HA 1.5μg)または5.0μgのFlu−X−31(HA 1.5μg)+50μgのBAY R1−005(溶液投与)または約20μgのBAY R1−005(co−カプセル投与)を含むPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子(図12)。カプセル化したFlu−X−31またはFlu−X−31+BAY R1−005を含む微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験+21、+33および+92日に血清を採取し、実施例10に示す抗原特異性ELISAを用い、抗Flu−X−31IgG抗体の有無を評価した。試料は、全て2回分析した。可溶性抗原、可溶性抗原+co−アジュバントまたはカプセル化抗原を鼻腔内免疫投与したマウスで、同程度の抗Flu−X−31IgG抗体反応が認められた。興味あることに、カプセル化抗原+co−アジュバントでは、鼻腔経由で投与した場合、試験+21日および+33日に可溶性抗原、可溶性抗原+アジュバントまたはカプセル化抗原と比較して免疫反応の低下(放出遅延によるものと思われる)が認められた。しかし、2回目の免疫投与後(試験34日)には、これらの群でも顕著な反応の上昇が認められ、試験+92日には用いたアジュバントには関係なく、基本的に同じ程度の免疫原性が認められた。
【0152】
本実施例で記載した鼻腔内免疫投与の結果から、本発明に係わる微粒子に捕捉させても、抗原または抗原+CO−アジュバントの免疫原性には顕著な増進が認められなかった。
【0153】
実施例13:
本実施例では、微粒子でカプセル化または物理的に微粒子と混合したFlu−A−TexasまたはFlu−A−Texas+BAY R1−005をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。ほとんどの非複製ウイルスワクチンは、防御効果のある十分な血清抗体力価を得るために反復投与が必要であることは公知である。したがって、抗原を単回投与することによって同様な効果を上げることが強く望まれている。
【0154】
我々は、本発明にしたがって形成されたPLGpS微粒子に捕捉させ、または微粒子と物理的に混合したFlu−A−TexasまたはFlu−A−Texas+co−アジュバントを単回投与したときの免疫原性を検討した。以下の量の抗原をPBS(pH7.4)250μLに溶解させ、試験1日目に6〜8週齢のDBA2系マウス(Charles River Breeding Laboratorise,Wilmington,MA)雌1群6匹に皮下免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、1.0μgのFlu−A−Texas(HA 0.35μg)または10.0μgのFlu−A−Texas(HA 3.5μg)+約2.0μgのBAY R1−005または約10.0μgのFlu−A−Texas(HA 3.5μg)+約20μgのBAY R1−005を含むPLGpZS、または実施例5にしたがって調製し、1.0μgのFlu−A−Texas(HA 0.35μg)+約20μgのBAY R1−005または10.0μgのFlu−A−Texas(HA 3.5μg)+20μgのBAY R1−005と物理的に混合した微粒子(図13)。
【0155】
Flu−A−Texas−BAY R1−005を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、アミノ酸分析によって測定した(表1)。投与した微粒子の質量は、低用量群にはFlu−A−Texasとして1.0μg(HA 0.35μg)になるように、高用量群にはFlu−A−Texasとして10.0μg(HA 3.5μg)になるように調整した。したがって、高用量群に投与したBAY R1−005の用量は、低用量群に投与したBAY R1−005よりも10倍高かった。co−カプセル化するBAY R1−005の量がほぼ等しくなるように製剤条件は調整できるものと期待される。
【0156】
カプセル化されたFlu−A−TexasまたはFlu−A−Texas+BAY R1−005を含む微粒子を投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験+21および+42日または+57日に血清を採取し、赤血球凝集抗体試験(HAI)で機能抗体の有無を評価した。試料は、全て2回分析した。
【0157】
非特異的阻害剤を除去するために10%ニワトリ赤血球細胞とともに30分間インキュベーションした熱不活性化マウス血清を用い、インフルエンザHAI試験を行った。2倍に希釈した血清を96穴マイクロタイタープレートに添加し、等量のウイルス懸濁液(8HA単位)を各ウエルに添加し、室温で30分間インキュベーションした。10%ニワトリ赤血球細胞懸濁液を各ウエルに添加し、室温で30分間インキュベーションした。試験には陽性血清および陰性血清を含め、試験の特異性および感受性を確認した。陽性血清はインフルエンザウイルスを免疫投与した動物から得た。陰性血清はPBSを免疫投与した動物から得、力価は15またはそれ以下とした。HAI力価は、赤血球の凝集を完全に阻害する最高希釈率の逆数で表示される。
【0158】
図13に示す単回免疫投与(試験1日)の結果から、溶液の形状またはPLGpS微粒子に捕捉された状態で免疫系に投与した抗原(図13)は試験+42日までに無視できる程度またはきわめて低い機能的抗体を発現したに過ぎなかった。BAY R1−005と物理的に混合した形態で免疫系に投与したFlu(10μg)では、発現したHAI反応が可溶性抗原を同じ用量で投与した場合と比較して8倍高く、PLGpS/Flu微粒子をいずれかの用量で投与した場合と比較して6倍高かった。最も顕著な結果が得られたのはPLGpS/Flu(A−Texas)/BAY R1−005微粒子製剤であり、低用量(1μg)でもHAI力価は可溶性抗原の8倍、高用量(10μg)では可溶性抗原の32倍であった。Flu+PLGpS微粒子またはFlu+PLGpS微粒子+BAY R1−005の物理的混合物を投与した対照群でも、HAI力価の中等度の増加が認められた。Flu+PLGpS微粒子の物理的混合物で表現されたHAI反応は、可溶性抗原を同じ用量で投与した場合と比較して低用量では4倍、高用量では8倍高かった。Flu+PLGpS微粒子+BAY R1−005の物理的混合物で表現されたHAI反応は、可溶性抗原を対応する用量で投与した場合と比較して4倍高かった。本実施例に示した試験で、インフルエンザウイルスから得たウイルス抗原は抗原を本発明にしたがって形成させた微粒子に追加アジュバントの存在下で捕捉させた場合、高レベルの機能的抗体を表現することが確認された(HAI力価で測定)。単回免疫投与後に微粒子抗原+アジュバントco−カプセル化系で用量依存性が認められたこと、さらに著しく高い機能的抗体(防御作用と相関がある)が表現されたことから、さらにこれらの材料を用いて単回投与剤型を開発することができる可能性を示唆している。
【0159】
実施例14:
本実施例では、マイクロカプセル化に典型的に用いた製剤条件のFle(三価)ワクチンの各成分に対する影響を検査する。Flu(三価)ワクチンは、3種類の相同HAストレイン(A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbin)をほぼ等量含む。各特異的HA成分の定量は、単一放射免疫拡散法(SRID)で行った(参考文献32)。SRID法では、各HA成分の検出にポリクロナール血清を用い、この血清は配座の変化に感受性が高い。この検定法で検出される各成分の最低濃度は、約10μg/mLである。Flu(三価)ワクチン2.0mL(濃度=265μg/mL)を含む一連の試料を調製した。これらの各試料について、SRIDでA/Texas特異性HA=20.25μg/mL、A/Johannesburg特異性HA=20.60μg/mL、B/Harbin特異性HA=21.42μg/mLを測定した。
【0160】
マイクロカプセル化手順に典型的に用いた溶媒、例えばジクロロメタン(DCM)または酢酸エチル(EtOAc)の影響を、ホモジナイズ手順と同様の条件下で評価した。ホモジナイズ手順のモデルとして、短時間(30秒間)の超音波処理を用いた。さらに、少量の添加物、例えばBAY(糖脂質ペプチド)およびDC−Chol(カチオン性脂質)を用い、抗原の回収率が向上するか否か検討した。反応のスケールは、実施例5で記載した手順と同様になるように設計した。SRID分析を行う前に各混合液の有機溶媒を留去し、適当な対照を検査し、有機溶媒、ホモジナイズの方法またはBAYまたはDC−Cholの添加が結果に影響を及ぼしたか否か検討した。
【0161】
この試験の結果を表8に示す。エントリー1と2を比較して明らかなように、超音波処理の影響はきわめてわずかであった。エントリー3と4から、EtOAcまたはDCM等の有機溶媒中で超音波処理すると、抗原の回収率に影響が認められた。EtOAcを用いた場合、A/Texas特異性HAおよびA/Johannesburg異性体HAの回収率はそれぞれ75%および78%であった。EtOAc処理後には、この方法でB/Harin特異性HA成分は検出されなかった。この成分の検出限界は低く、約10μg/mLであったことから、この成分の実際の回収率は50%以下であったと考えられる。溶媒としてDCMを用いた場合、A/Texas特異性HAおよびA/Johannesburg特異性HAの回収率はそれぞれ85%および96%で、B/Harbin特異性HAの回収率は50%以下であった。
【0162】
エントリー5および6では、溶媒としてEtOAcを用いたときの有機相に対する添加物BAYおよびDC−Cholの影響を検討した。この組合せでは全ての成分が検出され(検出限界>50%)、回収率はA/Texas特異性HAで65%(BAY)および82%(DC−Chol)、B/Harbin特異性HAで82%(BAY)および70%(DC−Chol)およびA/Johannesburg特異性HAで87%(BAY)および88%(DC−Chol)であった。エントリー7および8では、溶媒としてDCMを用いたときの有機相に対する添加物BAYおよびDC−Cholの影響を検討した。分析の結果、一部の成分は完全には回収されず、分析にある程度の影響が認められた。特に、A/Texas特異性HAは91%(BAY)および92%(DC−Chol)が回収された。B/Harbin特異性HAの回収率は、いずれの場合も50%以下であった。A/Johannesburg特異性HAでは、これらの組合せで直線性からのかけ離れがあったため、明瞭な結果が得られなかった。これは、溶媒としてDCMを用いた場合にのみ認められた。
【0163】
EtOAcに溶解させたFlu(三価)ワクチンおよび添加物としてBAYまたはDC−Cholを用いた製剤では、いずれの成分でも最高の回収率が得られた。この実施例から、BAYまたはDC−Chol等の親油性物質は感受性成分を含む製剤の安定化に使用できると考えられる。このような性質を有する物質はインターフェースとして作用し、ホモジナイズの過程で蛋白が空気/水疎水性表面に接触するのを防止する。蛋白構造は、これらの作用に特に感受性が高い。この実施例で報告したSRID分析結果は、この結論を裏づけている。
【0164】
実施例15:
本実施例では、PLGpS微粒子でco−カプセル化したFlu(三価)またはFlu(三価)+アジュバントカクテルをマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性について説明する。
【0165】
Flu(三価)ワクチンは、3種類の相同HAストレイン(A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbin)をほぼ等量含む。Flu(三価)ワクチン10.0μg中の総HA含有量は、2.35μgである。単一放射免疫拡散法(SRID)(参考文献32)で各特異性HA成分を測定したところ、A/Texasで0.76μg、A/Johannesburgで0.81μg、B/Harbinで0.78μgであった。
【0166】
この試験では、各成分のHA投与量が実施例13と比較して著しく低かった。すなわち、実施例13で用いた単価ワクチンは、約3.25μgのA/Texas特異性HAを含んでいた。
【0167】
Th2/Th1プロファイルに基づいて選抜したアジュバント、DC−Chol(カチオン性脂質)、BAY R1−005(Th2/Th1のバランスのとれた糖脂質ペプチド)、主要Th2のPCPP(ポリ[ジ(カルボキシラートヘノキシ)−ホスファゼン]ナトリウム塩)(Virus Research Institute,Cambridge MA)の存在下で、マウスに皮下免疫投与した。PLGpS微粒子は、実施例8と同様にバランスのとれたTh2/Th1プロファイルを誘導することが認められた。
【0168】
6〜8週齢のDBA−2系マウス(Charles River Breeding Laboratories、Wilmington、MA)雌1群8匹に、PBS(pH7.4)250μLに溶解させた抗原を試験1日目に以下の用量で免疫投与した。実施例5で調製し、Flu(三価、HAとして2.35μg)10.0μgまたはFlu(三価、HAとして2.35μg)10.0μg+BAY R1−005、DC−CholまたはPCPPを含むPLGpS微粒子(表5)。
【0169】
Flu(三価)を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、アミノ酸分析によって測定した(表6)。いずれのPLGpS微粒子製剤でも、抗原の回収率は良好であった(>70%)。この結果は、蛋白溶液の初期濃度がカプセル化効率に顕著な影響を及ぼすという我々の知見と一致した。
【0170】
投与した微粒子の質量は、Fluとして10.0μg(三価、総HA 2.35μg)の必要容量になるように調整した。共投与したアジュバントの用量を最適化する努力は行わなかったが、これは製剤条件によって決まると期待される。
【0171】
カプセル化したFlu(三価)ワクチンまたはFlu(三価)ワクチン+アジュバントカクテルを含むPLGpS微粒子を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験21、42および57日に血清を採取し、総IgG、IgG1、IgG2aを評価し、赤血球凝集抗体試験(HAI)で機体抗体の有無を評価した。各ストレイン(A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbin)について検査を行い、カプセル化および放出のマルチコンポーネント系における免疫原性および機能抗体に対する影響を検討した。試料は、全て2回分析した。抗体ELISAは、実施例13と同様に行った。
【0172】
図14a〜cに示すように、PLGpS/Flu(三価)微粒子製剤によってFlu(三価)ワクチンに含まれる各ストレインに特異的なIgG抗体反応が誘導された。試験57日までに総IgG力価が最も高かったのは、PLGpS/Flu(三価)/DC−Chol微粒子製剤であった。この結果は、検査したいずれのストレインにも該当した(A/Texas=可溶性Flu対照の32倍、A/Johannesburg=可溶性Flu対照の64倍、B/Harbin=可溶性Flu対照の64倍)。試験57日までにPLGpS/Flu(三価)/PCPP微粒子製剤で比較的高いIgG抗体反応(力価に基づく)が認められたものは、A/Texas(可溶性Flu対照の2倍)、A/Johannesburg(可溶性Flu対照の4倍)であった。PLGpS/Flu(三価)、PLGpS/Flu(三価)/BAY微粒子製剤および可溶性Flu(三価)ワクチン対照では、試験57日までに誘導された総特異性IgG抗体反応に基本的に差がなかった。これは、単価ワクチンを用いた実施例13の結果(これら3種類の系で結果に差が認められなかった)と一致した。
【0173】
各HAストレインについてインフルエンザHAI試験を行うために血清試料を56℃で30分間加熱して補体を不活性化し、トリプシン(8mg/mLを0.1mL)/過ヨウ素酸塩(0.001Mを12.5μL)で前処理を行って内在血球凝集阻害物質を破壊した。連続希釈した抗血清について、標準的なHAI法(参考文献33)を用い、それぞれ4HAUのA/Texas、A/JohannesburgまたはB/Harbinウイルスによる1%ニワトリ赤血球細胞の凝集阻害能を2連で測定した。
【0174】
図15a〜cに示すように、三価ワクチンに含まれる各HAストレインに対して特異的なHAI力価が誘導された。Flu(三価)ワクチン+DC−Cholを含むPLGpS微粒子製剤では、試験57日までに最も高く持続性のあるHAI力価が認められた(HA特異性A/TexasではHAI力価240(可溶性Flu(三価)対照の8倍)、HA特異性A/Johannesburgでは240(可溶性Flu(三価)対照の16倍)、HA特異性B/Harbinでは60(可溶性Flu(三価)対照の8倍))。Flu(三価)+BAYを含むPLGpS微粒子製剤でも、特に高いHAI力価が認められた(HA特異性A/TexasではHAI力価60(可溶性Flu(三価)対照の2倍)、HA特異性A/Johannesburgでは60(可溶性Flu(三価)対照の4倍)、HA特異性B/Harbinでは15(可溶性Flu(三価)対照と同等))。この実施例でFlu(三価)ワクチンを含むBAY製剤で認められたHAI力価は、実施例13の低用量(Flu(単価)ワクチン1μg−A/Texas特異性HAとして0.325μgを投与)と同等であった。PLGpS/Flu(三価)/PCPP微粒子製剤では、検出されるほどの機能抗体反応の誘導は認められなかった。
【0175】
高用量のPLGpS/Flu(三価)/DC−Chol製剤微粒子を投与した実験を行った。この群のマウスには、試験1日目に別の群に投与したFlu(三価)ワクチンの約2倍を免疫投与した(投与量:Flu(三価)=21.2μg、総HA=5.00μg)。この高用量で得られた結果は、図15a〜cに示す。可溶性Flu(三価)ワクチンをこの用量で免疫投与した対照群で誘導されたHAI力価はわずかであり、検査した低用量群と基本的に同等であった(結果は表示せず)。試験57日までに、この製剤では低用量群と比較して著しく高い特異性HAI力価の誘導が認められた(HAI力価:HA特異性A/Texasで480(可溶性Flu(三価)対照の5倍)、HA特異性A/Johannesburgで480(可溶性Flu(三価)対照の5倍)、HA特異性B/Harbinで120(可溶性Flu(三価)対照の3倍))。さらに、誘導されたHAI力価は持続性があり、試験21日から57日まで同じレベルに保たれることが確認された。BAYまたはDC−Chol等の添加物はポリマーおよび有機溶媒を含む有機相に導入され、インターフェースとして作用し、製剤の過程で抗原を防御する(実施例13、表8参照)。それによって、抗原物質の回収率が高くなる。
【0176】
さらに、in ivtroで行った放出試験で、3日以内にカプセル封入成分のかなりの量が放出されることが確認された。カプセル封入抗原の約5〜15%が、この段階で検出されることが実験的に確認された(微粒子の表面に局在している抗原)。初回免疫は、アジュバントの共放出によって著しく増強される。これは、初期放出段階で抗原の周囲に局在していることによるものと思われる。PCPP等のアジュバントと抗原をco−カプセル化したPLGpS微粒子製剤では、ワクチン効果の改善が得られないことは注目に値する。この物質は一次乳化液の水相に添加したが、DC−CholまたはBAYの親油性を保持していない、PCPPは別の系で強いアジュバント特性を有することが知られているが、この実施例ではカプセル化効果または微粒子製剤の抗原性補強効果にはきわめてわずかな改善が認められたに過ぎなかった。
【0177】
この実施例に示す試験で、多成分系インフルエンザウイルスのウイルス抗原はFlu抗原をco−カプセル化したBAYまたはDC−Chol等の存在下で微粒子に捕捉させると高レベルの総IgG抗体および機能抗体(HAI)を誘導することが確認された。
【0178】
実施例16:
本実施例では、PLGpS微粒子製剤をマウスモデルに単回皮下免疫投与したときの感染率および防御率を評価した結果を説明する。卵由来尿膜腔液中の生インフルエンザウイルスA/台湾/1/86(H1N1)、マウス適応A/台湾/1/86および市販のA/台湾/1/86単価サブユニットワクチン(FluzoneR)を、Pasteur Merieux、Connaught、米国(Swiftwater、PA)から入手した。A/Texas、A/JohannesburgおよびB/Harbinストレイン(PBS0.25mL中総HA2.35μg)を含むFlu(三価)ワクチンを、試験1日目に6〜8週齢のDBA−2系マウス雌(実施例14に記載)1群8匹に皮下免疫投与した。対照群のマウスには、PBSのみまたは尿膜腔液として生A/Texasウイルスを400血球凝集単位(HAU)で投与した。14日後に麻酔下のマウスに尿膜腔液中のマウス適応生A/台湾/1/86ワクチン50μLを鼻腔内攻撃投与した(LD50の5倍)。攻撃投与後14日間にわたって、毎日死亡率を測定し、2日に1回罹病率(体重変化)を測定して防御率を評価した。
【0179】
攻撃投与の結果を図16に示す。期待したように、相同性生(A/Texas)ウイルスを免疫投与した全てのマウスで認められた体重の減少は最小限で、ベースラインからの体重変化率に基づいて判断したところ、攻撃投与後2週間以内に完全に回復した。また、PBSを免疫投与したマウスでは期待したように急激な体重の減少が認められ、試験10日までにベースラインの30%以下に減少した。この対照群では、10日までに全ての動物が死亡した。
【0180】
PLGpS/Flu(三価)/DC−Chol微粒子製剤を免疫投与したマウスでは攻撃投与後4日以内に体重の平均減少率が8%であったことから、感染が起こったと考えられた。検査したPLGpS製剤群の動物のうちこれらのマウスでは急速な回復が認められ、2週間後にはベースラインの100%に達した。群全体の動物が回復し、各マウスで防御力価が上昇したものと考えられた。
【0181】
PLGpS/Flu(三価)/BAY微粒子製剤を免疫投与したマウスでは攻撃投与後10日以内に体重の平均減少率が10%であったことから、感染が認められた。これらのマウスでは緩慢な回復が認められ、2週間後にはベースラインの95%に達した。群全体の動物が回復し、これらの各マウスで防御力価の上昇が認められたが、回復速度から防御レベルは同じ用量を投与したDC−Chol群よりも低かったものと考えられる。これは、実施例15で測定したこれら2群のHAI値と一致する。
【0182】
可溶性Flu(三価)ワクチン対照群およびPLGpS/Flu(三価)またはPLGpS/Flu(三価)/PCPP微粒子製剤群では、効果が低かった。これらの群では、攻撃投与後8〜10日までに23〜29%の平均体重が減少が認められた。これらのマウスでは回復速度が最も遅く、2週間後にベースラインの86〜92%に回復した。さらに、これらの群では数匹の死亡例がみられた。PLGpS/Flu(三価)微粒子製剤群では、8匹中6匹が生存した。PLGpS/Flu(三価)/PCPP製剤群では8匹中7匹、Flu(三価)対照群では8匹中6匹が生存した。これらの例では、防御が認められないか、認められても低かった。
【0183】
実施例14で、我々はマイクロカプセル化条件のFlu(三価)ワクチンに対する影響を評価した。SRID法で抗原回復のストレイン特異性(A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbin)分析を行ったところ、PLGpSポリマーおよびEtOAcを溶媒とし、有機相にCholまたはBAYを用いた場合、この多成分系の3ストレイン全てで抗原活性をの低下がきわめてわずかであることが認められた。実施例15で、DC−CholまたはBAYの存在下で製剤したPLGpS/Flu(三価)ワクチンの単回皮下投与で高い機能抗体(防御に関連がある)が誘導されたことから、これらの製剤はマウスモデルに利用できることが確認された。実施例16で記載した攻撃/防御試験の結果は、機能抗体試験で得られた防御効果の順位とよく一致した。
【0184】
抗原およびアジュバントを生分解性微粒子に捕捉させて投与すると、さらに効果的に免疫系に提供することができる。DC−CholまたはBAYと抗原の可溶性混合物で認められた免疫増強効果は、これを製剤に利用することによって免疫活性がさらに向上することを示唆している。これらの結果は、使用回数および用量(抗原/アジュバント)を軽減できることを示唆している。特に、この実施例はこれら新規微粒子製剤を単回投与で有効な製剤の開発に利用できることを強く示唆している。
【0185】
実施例17:
本実施例では、PLGpS微粒子中にカプセル化したMoraxella catarrhalis由来トランスフェリン結合蛋白(Tbp2)(WO 97/13785、本出願人、参考例としてここに引用する)、PLGpS微粒子と物理的に混合したTbp−2または明礬で製剤したTbp−2をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性について説明する。6〜8週齢のBALB/c系マウス(Charles River Breeding Laboratories、Wilmington,MA)雌1群5匹に、PBS(pH7.4)250μLに溶解させた抗原を試験1、28および43日目に以下の用量で皮下免疫投与した:実施例5にしたがって調整し、0.3μgのTbp−2を含むPLGpS微粒子、実施例5にしたがって調製し、0.3μgのTbp−2と物理的に混合したPLGpS微粒子、および0.3μgのTbp−2と製剤した明礬(1.5mg/回)(表5)。
【0186】
カプセル化したTbp−2を含む微粒子、Tbp−2を物理的に混合した微粒子またはTbp−2を物理的に混合した明礬を投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験+14、+27、+42および+55日で血清を採取し、実施例8と同様に抗原特異性ELISAで抗Tbp−2 IgG抗体の有無を評価した。試料は、全て2回分析した。Tbp−2を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実施例6と同様にアミノ酸分析によって測定した(4.0μg/mg(32.8%))。
【0187】
免疫投与の結果(図17a)から明らかなように、PLGpS微粒子に捕捉させて免疫系に投与した抗原は可溶性抗原またはPLGpS微粒子のみと物理的に混合した抗原と比較してかなり高い力価を誘導した。さらに、この試験でマイクロカプセル化製剤は従来の明礬アジュバント化システムと同様に免疫原性を有するものと思われる。免疫反応のカイネティックスは、両製剤で差がなかった。
【0188】
試験55日に採取した血液のIgGサブタイププロファイル(図17b)で、PLGpS微粒子でカプセル化したTbp−2とPLGpS微粒子に物理的に混合したTbp−2または明礬で製剤したTbp−2で誘導される免疫反応に差が認められた。抗原を可溶性の形態またはPLGpS微粒子と物理的に混合し、または明礬で製剤して投与した場合、検出された優勢なサブタイプはIgG1であった(IgG2もある程度認められた)。
【0189】
この実施例で、PLGpS微粒子でカプセル化したTbp−2で誘導されるIgGサブタイプはさらに高いIgG2aを誘導した。この傾向は、実施例8でHin−47で認められた傾向と同様であった。
【0190】
これらの結果から、カプセル化抗原の免疫投与で誘導される免疫の機構は明礬で誘導されるものとは異なるものと思われる。抗原を微粒子でカプセル化して投与すると、さらにバランスのとれたTh2/Th1プロファイル(IgG2a:IgG1の比)が認められた。
【0191】
ここに示した結果から明らかなように、PLGpS微粒子でカプセル化した抗原で仲介される免疫反応は、PLGpS微粒子と物理的に混合した抗原、明礬で製剤した抗原または可溶性抗原として投与したもので得られる免疫反応とは質的にかなり異なる。さらに、抗原/明礬製剤で明礬により誘導される免疫反応の程度はカプセル化した抗原を含む微粒子の免疫反応とほぼ同じであった。
【0192】
実施例18:
本実施例では、PLGpS微粒子でカプセル化したTbp−2およびPLGpS微粒子と物理的に混合したTbp−2を鼻腔内免疫投与したマウスにおける免疫原性を説明する。6〜8週齢のBALB/c系マウス(Charles River Breeding Laboratories、Wilmington、MA)雌1群5匹に、PBS(pH7.4)10または50μLに溶解させた抗原を試験1、28および43日目に以下の用量で鼻腔内免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、6.0μgのTbp−2を含むPLGpS微粒子、および実施例5にしたがって調製し、6.0μgのTbp−2と物理的に混合したPLGpS微粒子(表5)。
【0193】
カプセル化したTbp−2を含むPLGpS微粒子またはTbp−2を物理的に混合したPLGpS微粒子を投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験14、27、42および55日で血清を採取し、実施例8と同様に抗原特異性ELISAで抗Tbp−2 IgG抗体の有無を評価した。試料は、全て2回分析した。Tbp−2を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実施例6と同様にアミノ酸分析によって測定した(4.0μg/mg(32.8%))。鼻腔内免疫投与後の血清IgG Tbp−2特異性抗体力価を図18に示す。これらの結果から、投与容量が少ない(10μL)と、PLGpS微粒子に取り込まれた抗原(Tbp−2)またはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原は同じ用量(6.0μg)の可溶性抗原と比較して免疫原性が低い。
【0194】
投与用量を高くする(50μL)と、いずれの群でも全体的な力価が著しく増加した。これらの結果から、PLGpS微粒子と物理的に混合した抗原(Tbp−2)は、さきにHin−47の鼻腔内免疫投与(実施例10)で認められた結果と同様に同じ用量(6.0μL)の微粒子カプセル化抗原または可溶性抗原と比較して免疫原性がかなり高かった。さきに行ったHin−47の鼻腔内免疫投与試験(実施例10)で、微粒子と物理的に混合したHin−47を投与すると強い体液反応および分泌反応が認められた。Tbp−2を用いたこの試験でも、同様な反応が認められた。さらに、投与容量によって、発現する免疫反応の種類および強さが異なることを確認した。
【0195】
実施例19:
本実施例では、微粒子による抗原の放出を説明する。PLGpS微粒子でカプセル化した抗原は明礬製剤と同様に免疫原性を有することが確認されたことから、これら高分子マトリックスでカプセル化した抗原の初期放出および徐放特性が免疫投与量の軽減に利用できるか否か検討した。
【0196】
この実施例では、PLGpS微粒子でカプセル化したTbp−2、PLGpS微粒子と物理的に混合したTbp−2、および明礬またはCFA/IFAで製剤したTbp−2をモルモットに皮下免疫投与して免疫原性を検査した。6〜8週齢のモルモット(Charles River Breeding Laboratories、Wilmington、MA)雌1群2匹に、抗原を以下の用量で皮内免疫投与した:試験1および28日に実施例5にしたがって調製し、PBS(pH7.4)500μLに懸濁させた5.0μgのTbp−2をカプセル化したPLGpS微粒子、および試験1日に5.0μgのTbp−2を含むPBS(pH7.4)を混合したフロイントの完全アジュバント(CFA)、ついで試験14および28日に5.0μgのTbp−2を含むPBS(pH7.4)を混合したフロイントの不完全アジュバント(IFA)、または試験1、14および28日に5.0μgのTbp−2を含むPBS(pH7.4)を混合した明礬(表5)。
【0197】
カプセル化したTbp−2を含むPLGpS微粒子、Tbp−2を物理的に混合したPLGpS微粒子、Tbp−2のCFA/IFA製剤またはTbp−2明礬製剤を免疫投与したモルモットで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験40および56日で血清を採取し、抗原特異性ELISAで抗Tbp−2 IgG抗体の有無を検査した。試料は、全て2回分析した。抗体ELISA法は、実施例8と同様である。Tbp−2を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実施例6と同様にアミノ酸分析によって測定した(4.0μg/mg(32.8%))。
【0198】
図19に示す結果から明らかなように、PLGpSでマイクロカプセル化したTbp−2を2回投与すると、CFA/IFAまたは明礬で製剤したTbp−2を3回投与した場合と同程度の抗Tbp−2抗体反応を誘発した。これらの結果から、マイクロカプセル化したTbp−2は2回投与用のワクチンとして開発する価値があると思われる。
【0199】
実施例20:
本実施例では、PLGpS微粒子でカプセル化したrウレアーゼまたはrウレアーゼ/アジュバントカクテルをマウスに皮下または胃内免疫投与したときの免疫原性を説明する。
【0200】
6〜8週齢の非近交系Swissマウス(Janvier、フランス)1群8匹に、PBS(pH7.4)300μLに溶解させた抗原を以下の用量で試験1、28および56日に皮下(S.C.)免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、10.0μgのrウレアーゼを含むPLGpS微粒子、実施例5にしたがって調製し、10.0μgのrウレアーゼ+DC−Chol、PCPPまたはCT−Xをco−カプセル化したPLGpS微粒子、対照として10.0μgのrウレアーゼ+可溶性のDC−Chol(65μg/回)またはPCPP(100μg/回)、または試験1、28および56日に0.15M NaHCO3(pH9.0)300μLに溶解させた抗原を以下の用量で胃内免疫投与した:実施例5にしたがって調製し、40.0μgのrウレアーゼを含むPLGpS微粒子、実施例5にしたがって調製し、40.0μgのrウレアーゼ+DC−Chol、PCPPまたはCT−Xをco−カプセル化したPLGpS微粒子(表5)。
【0201】
rウレアーゼを含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実施例6と同様にアミノ酸分析またはポリクロナールrウレアーゼ特異性ELISAによって測定した(表7)。PLGpS微粒子抽出物についてポリクロナールELISA分析を行うと、典型的にカプセル化した総蛋白量(回収されたエピトープ)が得られる。対照実験で、抗原の完全性に対する溶媒/塩基(SDS)の影響を定量することができる。用いた条件下で、抽出された蛋白の約65〜75%がこの検定法で完全に検出される形態で残っていたと推定される。したがって、この測定法で得られた値は、アミノ酸分析(AAA)で得られた値よりも低い。アジュバント(DC−Chol、CT−XまたはPCPP)が存在していても測定値を妨害しないことを確認するため、適当な対照を実験に含めた。DC−Cholが存在していても分析には影響がないと思われたが、PCPPが存在すると異常値が得られ、AAA法による分析値と比較して非特徴的に高かった。CT−Xの場合は、co−カプセル化されたCT−Xの量を定量するために別のポリクロナールELISA法を開発した。
【0202】
微粒子の投与質量は、rウレアーゼの投与量が10.0μg(皮下投与)または40.0μg(経口投与)になるように調整した。
【0203】
カプセル化したrウレアーゼまたはco−カプセル化したrウレアーゼとアジュバントの混合物を含むPLGpS微粒子を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験85日に血清を採取し、抗原特異性ELISAで抗rウレアーゼIgG1およびIgG2aの抗体の有無を評価した。いずれの試料も2回分析した。
【0204】
ELISAは標準的なプロトコール(ビオチン抱合体、ストレプタビジン、ペルオキシダーゼ複合体はAmershamから、o−フェニレンジアミン 二塩酸塩(OPD)基質はSigmaから入手した)。0.05M炭酸−重炭酸緩衝液(pH9.6)に懸濁させたH.pylori抽出物(5μg/mL)で、プレートを一夜コーティングした(4℃)。BSA(Sigma)で飽和させた後、プレートを血清(1.5時間)、ビチオン抱合体(1.5時間)、ストレプタビジン ペルオキシダーゼ複合体(1時間)および基質(OPD−10分間)とともにインキュベートした。対照として、各実験にH.pylori抽出物に対するポリクロナールマウス血清を設けた。力価は、492nmにおける最大吸収の50%を与える希釈率の逆数で表示した。陰性対照として、免疫投与前の血清を用いた。
【0205】
マウスに、Th2/Th1プロファイルに基づいて選んだアジュバント(DC−Chol−バランスのとれたTh2/Th1、PCPP−一次Th2)または既知の粘膜アジュバント活性に基づいて選んだアジュバント(コレラ毒素(CT−X)またはE.coliの熱不安定エンテロトキシン(LT))の存在下で皮下または胃内免疫投与した。PLGpS微粒子は、その他の典型的なアジュバント、例えば明礬と比較して一層バランスのとれたTh2/Th1プロファイルを誘導することが認められている。
【0206】
皮下免疫投与後試験85日に得たプール血液のIgGサブタイプを図20に示す。PLGpS/rウレアーゼ微粒子製剤を皮下投与した場合は、いずれもIgG1反応がIgG2a反応と比較して高かった(IgG2a:IgG1比は0.08〜0.33の範囲にあった)。可溶性対照群(rウレアーゼ+DC−CholまたはPCPP)の総IgG1反応は、同じ絶対値の範囲にあった。抗原とco−カプセル化した場合も、抗原と物理的に混合して投与した場合にも、アジュバントシステム間でIgG2aに差が認められた。PLGpS/rウレアーゼ微粒子(IgG2a:IgG1=0.33)、PLGpS/rウレアーゼ微粒子/CT−X(IgG2a:IgG1=0.30)およびPLGpS/rウレアーゼ微粒子/DC−Chol(IgG2a:IgG1=0.20)では、バランスのとれたIgG2a:IgG1抗体反応(Th2/Th1で評価)が得られた。一方、rウレアーゼ+DC−Chol対照群では、IgG2a:IgG1=0.03であった。PLGpS/rウレアーゼ/PCPP微粒子製剤では、主としてTH2反応が認められ、IgG2a:IgG1比は0.08であった。rウレアーゼ+PCPPの相同可溶性混合物ではTh2が強く、IgG2a:IgG1比はきわめて低く、0.003であった。
【0207】
一般に、これらのアジュバントの存在下で抗原をco−カプセル化すると、典型的な免疫プロファイルがバランスのとれたTh2/Th1反応の方向にシフトする傾向が認められた。
【0208】
胃内免疫投与すると、ほとんどの場合検出可能な浸透反応が認められなかった。特記すべき例外は、中等度の浸透反応が認められたLT陽性対照(IgG2a:IgG1比=0.1)およびCT−Xとco−カプセル化したrウレアーゼ/PLGpS微粒子(IgG2a:IgG1比=2.1)であった。興味あることに、経口免疫投与では、抗原+粘膜アジュバントをカプセル化するときわめて異なった浸透抗体反応が認められた。この場合、IgG2a:IgG1比がIgG2aに片寄り、TH1経路を示唆していた。文献調査で、CT−Xを抗原と経口共投与すると典型的にLTで認められたような免疫反応を誘導するという報告があった。主として、IgG1またはTh2型の反応が報告されている(参考文献34)。この試験は、PLGpS微粒子でco−カプセル化すると免疫反応が質的に変化することを示唆している。
【0209】
実施例21:
本実施例では、PLGpS微粒子/rウレアーゼ製剤をマウスモデルに皮下または経口免疫投与したときの感染率および防御率を評価する。マウスを用い、2回目の追加免疫投与6週間後(試験85日)に、H.pylori細菌(3x106cfu)懸濁液300μLを胃内に強制攻撃投与した。In vitroの放出試験(実施例7)から微粒子からの抗原の放出には約4週間を要すると考えられたので、この時から2週間後に攻撃投与を計画した。
【0210】
攻撃投与4週間後にマウスを屠殺し、ウレアーゼ活性(Jatroxテスト、Procter & Gamble)を評価するために無菌層流フード内で胃を採取した。ウレアーゼ活性は、屠殺24時間後に550nmにおける吸収を測定することにより評価した。このテストの原理は、Helicobacter pyloriのウレアーゼによって反応液中の尿素を分解させ、pHの上昇による反応液中のpH指示薬(フェノール レッド)の黄色から淡赤色への色の変化を測定するものである。
【0211】
マウスは、H.pyloriのストレプトマイシン耐性マウス適応株(X43−2AN)を感染させた。胃におけるウレアーゼ活性の測定値(Jatroxテスト)に基づいて判定したところ、感染率には再現性があり、全ての実験で100%のマウスが感染した。攻撃投与に用いた菌株はストレプトマイシン耐性であったため、選択性の高い培地でも生育することができ、したがってこのテストの感度はきわめて高かった(正常な細菌相による汚染はみられなかった)。
【0212】
この菌株は20%v/vグリセロールおよび10%v/v牛胎仔血清(FBS)(Hyclone)添加Brucellaブロス(BB)(Biomerieux)中−70℃で保存した。攻撃投与用懸濁液は、以下のように調整した:前培養は、5%v/vヒツジ血液(Biomerieux)およびH.pylori X43−2AN株の選択マーカー抗生物質(スリメトプリム(5μg/mL)、バンコマイシン(10μg/mL)、ポリミキシンB硫酸塩(5μg/mL)、アンホテリシン(5μg/mL)、およびストレプトマイシン(50μg/mL))(TVPAS)を含むMueller−Hinton寒天(MHA;Difco)上でH.pyloriを培養した。抗生物質は、全てSigmaから購入した。MHA−TVPASプレートを好気的条件下、37℃で3日間培養した。前培養した菌株を用い、5%v/v FBSおよびすべての抗生物質(TVPAS)を添加したBB50mLを含む75cm2の通気口付きフラスコ(Costar)に接種した。フラスコを、好気的条件下で24時間ゆっくりと振とうした。グラム染色、ウレアーゼ活性(尿素インドール培地、Diagnostic Pasteur)、カタラーゼ(H2O2、3%v/v)およびオキシダーゼ活性(Biomerieuxディスク)を測定し、懸濁液の特性を検討した。位相差顕微鏡下で、生存率および運動性を検査した。550nmにおけるO.D.が0.1になるようにBBで懸濁液を希釈した(1x107CFU/mL)。この試験では、OD.<0.1または細菌数が少なくとも103〜104/胃(対照では105〜106)のマウスは防御能を有すると考えた。この試験では、非免疫投与/感染および非免疫投与/非感染対照群のマウスも設けた(結果は表示せず)。
【0213】
図21aから明らかなように、上記の検定法で判断した防御効果(皮下投与による)の順位は、PLGpS/rウレアーゼ/DC−Chol(幾何学的平均=0.092)>PLGpS/rウレアーゼ/CT−X(幾何学的平均=0.105)、PLGpS/rウレアーゼ(幾何学的平均=0.163)、PLGpS/rウレアーゼ/PCPP(幾何学的平均=0.269)であった。この試験では、防御の標準としてLT+rウレアーゼ(経口)陽性対照(幾何学的平均=0.136)を用いた。興味あることに、rウレアーゼ+可溶性DC−Chol(幾何学的平均=0.600)またはrウレアーゼ+PCPP(幾何学的平均=1.07)対照群では抗原とアジュバントをPLGpS微粒子製剤としてカプセル化する明瞭な利点が認められた。
【0214】
データをMann−Whitneyの方法で統計学的に解析し、以下の結論が得られた。PLGpS/rウレアーゼ/DC−CholおよびPLGpS/rウレアーゼ/CT−X製剤は、LT+rウレアーゼ陽性対照群として比較して有意差が認められなかった。PLGpS/rウレアーゼ/PCPP、rウレアーゼ+DC−Cholおよびrウレアーゼ+PCPP群ではこれらの群と比較して有意差が認められ(p<0.01)、PLGpS/rウレアーゼ群ではPLGpS/rウレアーゼ/PCPP、rウレアーゼ+DC−Cholおよびrウレアーゼ+PCPP群と比較して有意差が認められた(p<0.01)。
【0215】
この統計学的解析から、PLGpS/rウレアーゼ/DC−Chol(マウス7/8匹でOD.<0.1)およびPLGpS/rウレアーゼ/CT−X(マウス5/8匹でOD.<0.1)微粒子群では明瞭な防御効果が認められ、一方PLGpS/rウレアーゼ(マウス2/8匹でOD.<0.1)微粒子群およびrウレアーゼ+DC−Chol群(マウス2/10匹でOD.<0.1)群では中等度の防御効果が認められ、PLGpS/rウレアーゼ/PCPP(マウス0/8匹でOD.<0.1)微粒子群およびrウレアーゼ+PCPP群(マウス0/10匹でOD.<0.1)群では防御効果が低いか、全く認められなかった。この傾向は、免疫原性試験(実施例20)で得られたTh2/Th1バランス比と一致した。
【0216】
図21bに示すように、経口免疫投与では、アジュバントを含むPLGpS微粒子を免疫投与したいずれの群のマウスでも完全な防御効果は得られなかった。統計学的順位は、PLGpS/rウレアーゼ/CT−X(幾何学的平均=0.229)>PLGpS/rウレアーゼ/DC−Chol(幾何学的平均=0.403)、PLGpS/rウレアーゼ(幾何学的平均=0.475)、PLGpS/rウレアーゼ/PCPP(幾何学的平均=0.493)であった。この試験では、陽性対照としてLT+rウレアーゼ(経口)群(幾何学的平均=0.136)を用いた。
【0217】
データをMann−Whitneyの方法で統計学的に解析し、以下の結論が得られた。LT+rウレアーゼ陽性対照群ではPLGpS/rウレアーゼ/DC−CholおよびPLGpS/rウレアーゼ/CT−X製剤と比較して有意差が認められた(p<0.01)。PLGpS/rウレアーゼ/DC−CholおよびPLGpS/rウレアーゼ/CT−X製剤では、その他の群と比較して有意差が認められなかった。PLGpS/rウレアーゼおよびPLGpS/rウレアーゼ/PCPPでは、その他の群と比較して有意差が認められなかった。
【0218】
この試験で、PLGpS/rウレアーゼ/CT−X(マウス2/8匹でOD.<0.1)およびPLGpS/rウレアーゼ/DC−Chol(マウス1/8匹でOD.<0.1)微粒子製剤群では部分的な防御効果が認められた。一方rウレアーゼ+LT陽性対照群では完全な防御効果が認められた(マウス7/8匹でOD.<0.1)。
【0219】
実施例14〜16で明らかなように、アジュバントをPLGpS微粒子等の担体とともに免疫系に供給するとアジュバント効果が高くなり、その結果ワクチンの効果も高くなる。特に、この実施例における典型的な対照試験でDC−CholまたはPCPP等のアジュバントと、rウレアーゼの可溶性混合物を皮下免疫投与後の免疫原性および防御効果を測定したところ、防御効果は低いか、中等度であることが確認された。これらの結果から、抗原とアジュバントを微粒子状のマトリックスとともに供給するとかなり効果の高いワクチンが得られるという証拠が得られた。この実施例では、さらにアジュバントの毒性軽減およびこの種のアジュバントの特徴である免疫反応の質的改善等の利点があることが実証された。PLGpS/rウレアーゼ/CT−X製剤微粒子の経口免疫投与後に得られたrウレアーゼに対するIgGサブタイプ抗体反応が非特徴的にIgG2a側(Th1経路)にかたよるということも実験的に実証された。
【0220】
また、co−カプセル化した抗原とCT−X(既知の粘膜アジュバント)を皮下または経口投与した場合、この物質は製剤および貯蔵中に高分子マトリックス内の抗原を安定化させ、HSAまたはBSAの存在下で調製した微粒子と同様な機構(参考文献35)で放出するものと思われる。
【0221】
結論として、この試験で、PLGpS微粒子を利用した全身免疫投与により、マウスモデルでH.pyloriの感染に対して著しい防御効果を誘導する効果のあることが確認された。また、この試験で、PLGpS微粒子を利用した経口免疫投与により、マウスモデルでH.pyloriの感染に対して部分的な防御効果を誘導する効果のあることも確認された。
【0222】
さらに、アジュバント(特にDC−CholまたはCT−X)とともにrウレアーゼをco−カプセル化すると、ワクチン効果の顕著な向上が得られる。
【0223】
【表1】
【0224】
【表2】
【0225】
【表3】
【0226】
【表4】
【0227】
【表5】
【0228】
【表6】
【0229】
【表7】
【0230】
【表8】
【0231】
【表9】
【0232】
【表10】
【0233】
【表11】
【0234】
【発明の効果】
本発明によれば、様々な方法によってマイクロパーティクルおよびマイクロスフェアを製造するのに適した性質を有するポリマーの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】開環重合と脱保護の工程を示す図である。
【図2】ポリマー中の生物活性部分のポリマーへの結合を示す図である。
【図3】マイクロパーティクルの製造工程を示す図である。
【図4】レーザー回折測定の代表的サイズ分布を示す図である。
【図5】マイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図6】マイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図7A】in vivoにおける放出過程を示す図である。
【図7B】3ヶ月間の%累積放出を示す図である。
【図8A】免疫感作されたマウスにおける血清IgG応答を示す図である。
【図8B】免疫感作されたマウスにおける血清IgG応答を示す図である。
【図8C】血清IgG応答サブタイププロフィルを示す図である。
【図9A】試験の概要を示す図である。
【図9B】血清IgG応答サブタイププロフィルを示す図である。
【図9C】血清IgG応答サブタイププロフィルを示す図である。
【図10A】血清IgG応答サブタイププロフィルを示す図である。
【図10B】血清IgG応答サブタイププロフィルを示す図である。
【図10C】血清IgA応答を示す図である。
【図10D】IgG応答を示す図である。
【図10E】IgG応答を示す図である。
【図11】IgG血清抗体応答を示す図である。
【図12】IgG血清抗体応答を示す図である。
【図13】血球凝集反応阻害抗体検定での応答を示す図である。
【図14A】IgG抗体の存在を評価に関する図である。
【図14B】IgG抗体の存在を評価に関する図である。
【図14C】IgG抗体の存在を評価に関する図である。
【図15A】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定における結果を示す図である。
【図15B】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定における結果を示す図である。
【図15C】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定における結果を示す図である。
【図16】防御試験の結果を示す図である。
【図17A】血清IgG抗体応答を示す図である。
【図17B】血清IgG抗体サブタイプ応答プロフィルを示す図である。
【図18】抗体の存在の評価に関する図である。
【図19】血清IgG抗体応答を示す図である。
【図20】IgG抗体応答を示す図である。
【図21A】防御試験の結果を示す図である。
【図21B】防御試験の結果を示す図である。
Claims (11)
- 少なくとも1種のα−ヒドロシキ酸モノマーと、少なくとも1種の疑似−α−アミノ酸を共重合する工程を有し、
前記少なくとも1種のα−ヒドロシキ酸モノマーが、ラクチドとグリコリドであり、
前記疑似−α−アミノ酸がセリン由来のものである
ことを特徴とする生分解性及び生体適合性を有するコポリマーの製法。 - 不活性雰囲気条件において、モノマーとしての、ラクチドと、グリコリドと、少なくとも1種の疑似−α−アミノ酸と、エステル化触媒と、を含む有機溶媒溶液を調製する工程と、
これらのモノマーを共重合させる工程と、
得られたコポリマーを単離する工程と、
を有する請求項1に記載の製法。 - 前記エステル化触媒が、2−エチルヘキサン酸第一スズである請求項2に記載の製法。
- 前記有機溶媒が、無水クロロホルムである請求項2または3に記載の製法。
- 前記コポリマーをフィルムまたはマイクロパーティクルに成形する工程を更に含む請求項2〜4のいずれかに記載の製法。
- 前記ラクチドがD,L−ラクチドである請求項1〜5のいずれかに記載の製法。
- 前記セリン由来の疑似−α−アミノ酸がアミン保護基を有する請求項1〜6のいずれかに記載の製法。
- 前記アミン保護基を有するセリン由来の疑似−α−アミノ酸が、式:R5CHNHR6CO2H(該式中、R5はヒドロキシメチル基であり、R6はアミン保護基である。)で表される請求項7に記載の製法。
- 前記アミン保護基が、カルボベンジルオキシ基(CBZまたはZ)、ベンジル基(Bn)、p−メトキシベンジル基(MeOBn)、ベンジルオキシメトキシ基(BOM)、tert−ブチルオキシカルボニル基(t−BOC)及び[9−フルオレニルメチルオキシ]カルボニル基(FMOC)からなる群から選択されたものである請求項7または8に記載の製法。
- 前記形成されたコポリマーが、固相触媒での還元または臭化水素の酢酸溶液の存在下での酸性触媒作用によって脱保護化される請求項7〜9のいずれかに記載の製法。
- 前記セリン由来の疑似−α−アミノ酸がラクトン化されている請求項1〜10のいずれかに記載の製法。
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