JP2003261661A - 生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製法 - Google Patents

生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 粘膜または非経口的に投与して検体の免疫系
細胞に物質を効果的に運搬し、免疫反応を誘導するため
の粒状担体の材料を提供すること。 【解決手段】 少なくとも１種のα−ヒドロシキ酸モノ
マーと、少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸を共重合
することで生分解性及び生体適合性を有するポリマーを
製法する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物活性物質を送
達するための生体内分解性マイクロパーティクル（マイ
クロ粒子）に関し、具体的には、特定の細胞型に対して
標的指向性であるようなマイクロパーティクルを得るた
めの生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製造方
法に関する。
【０００２】本出願は、1996年12月20日提出の係属出願
中の米国特許第08/770,050号の一部継続出願に対応する
ものである。
【０００３】
【従来の技術】長年、ヒトおよび動物を様々な感染症か
ら守るためにワクチンが用いられてきた。このような従
来型のワクチンは、弱毒化病原体（例えば、ポリオウイ
ルス）、不活化病原体（例えば、百日咳菌）、または病
原体の免疫原性成分（例えば、ジフテリアトキソイドお
よびＢ型肝炎表面抗原）から構成される。
【０００４】免疫原性が高く、単独で防御免疫応答を引
き起こすことができる抗原もある。しかし、他の抗原
は、防御免疫応答を誘導できないか、弱い免疫応答しか
誘導しない。抗原をアジュバントと同時投与すると、弱
い免疫原性抗原の免疫応答を著しく促進することができ
る。アジュバントは、抗原の免疫原性を促進するが、そ
れ自体が免疫原性であるとは限らない。アジュバント
は、抗原を投与部位近傍の局所に維持することにより、
免疫システムの細胞に対する、ゆっくりと持続する抗原
の放出を容易にする貯蔵効果を生み出すことができる。
アジュバントは、抗原貯蔵に免疫システムの細胞を引き
つけ、これらの細胞を刺激して免疫応答を引き起こすこ
とができる。アジュバントは、非経口的に送達された抗
原に対する免疫応答を促進することが確認されている。
【０００５】通常、アジュバントは、ワクチン製剤中で
抗原とともに用いられることにより、非経口的免疫感作
（筋肉内または皮下）による全身的免疫誘導が得られ
る。このアプローチは、傷害を受けた皮膚（すなわち、
破傷風）を経由して体に接近する感染性試剤に適してい
るが、この方法で投与される多くのアジュバントの副作
用および関連する毒性に起因して遭遇する問題点があ
る。アルミニウム塩（リン酸アルミニウムまたは水酸化
アルミニウム）から製剤化されたワクチンだけが、ヒト
および家畜の予防接種に日常的に用いられている。しか
し、これらのアジュバントでさえ、すべての抗原ととも
に用いるのに適しているわけではなく、注射部位に刺激
を引き起こすこともある。注射部位において抗原の免疫
原性を安全に促進するアジュバントの開発が必要なこと
は明らかである。
【０００６】用いられる抗原の性質に特有の他の問題が
ある。例えば、従来型の不活化ワクチンの大部分は、効
果的な免疫感作に複数回の投与を必要とする。弱毒生ワ
クチンおよび多くの液状不活化ワクチンは、限定された
保存条件が必要であるという欠点を持ち、不活化を受け
やすい（例えば、熱感受性）。アジュバント不適合性、
pH、緩衝方法および塩の存在に起因して、単一剤形でワ
クチンを混合することに関連する問題もある。
【０００７】粘膜免疫は、主に腸内、気管支または鼻洗
浄液およびその他の外分泌液における分泌型免疫グロブ
リン（sIgA）の誘導により、誘導される。例えば、非経
口のコレラワクチンでは限られた防御作用しか得られな
いが、一方、最近開発された経口型は非常に有効である
ことが分かっている（ref.1−本明細書を通じ、種々の
参考文献を括弧内に引用し、本発明が関わる技術分野の
状況をさらに詳しく説明する。各引用の一覧情報は、本
明細書の末尾に示す。これらの参考文献の開示を、参照
として本明細書中に援用する）。ヒト志願者による研究
から、インフルエンザワクチン経口投与が、鼻粘膜分泌
物における分泌型抗インフルエンザ抗体の誘導に有効で
あることがわかり、このような摂取ワクチンに対しアジ
ュバントとして有効な物質が確認されている。しかし、
これらアジュバントの大部分は、摂取ワクチンに対し免
疫応答を改善することに関しては、比較的無力である。
最近、これらのアジュバントの大部分が、安全で、経口
的胃腸管、鼻咽頭−気道および生殖道を経由または眼窩
内に投与された抗原に対し、ヒトおよび動物において免
疫応答を促進するために有効であることが証明された。
しかし、これらの経路を経由する抗原の投与は、通常、
免疫応答を引き起こすには無効である。前述の例は、こ
れらの免疫感作法の潜在力を示しているが、これらの経
路によって使用するためのワクチン製剤の開発は、様々
な理由から遅々としていた。粘膜表面において免疫感作
することができないことは、通常、次のように考えられ
ているからである。 （ｉ）粘膜表面へ移行する間に存在する酸および／また
はタンパク質分解酵素による抗原の分解、（ii）粘膜上
皮に存在する分泌物による抗原の分解、（iii）粘膜上
皮からの限られた吸収、（iv）免疫応答を誘導するため
に必要な濃度以下に抗原が希釈されること、（ｖ）無効
なアジュバントおよび／または送達システム。
【０００８】非経口ワクチン製剤におけるアジュバント
の使用、および粘膜部位へワクチンを送達するための適
当なシステムの欠如に関連する問題は、様々な経路によ
り投与した場合に有効であって関連する毒性の問題また
は副作用のない新たな手法の必要性を暗示している。時
間とコストを低減し、ヒトの医療において、入手法が制
限される発展途上国では極めて重要である患者のコンプ
ライアンスを増す利点もあることから、ヒトおよび動物
に単一剤形でワクチン送達を可能にすることも望まれ
る。これは、これらの国々の幼児にまさに当てはまるこ
とである。
【０００９】投与された抗原に対する免疫応答を増すた
め、担体を用いて抗原の分解を防ぎ、in vivoにおける
これらの物質の取り込みを変調させることができる。感
受性抗原を捕捉し、破壊、免疫原性の減少または希釈か
ら抗原を守ることができる。担体を製剤化する方法に
は、抗原を高分子マトリックス（単一マトリックス）中
に分散する、または抗原の周りを高分子物質で被覆する
ことにより外部防御壁（コア−シェル）を得ることが含
まれる。製剤プロトコルの操作により、これらの物質の
平均サイズを優先して制御することができる。このこと
は、経口送達を経由する腸管内のパイエル板の特定のＭ
−細胞における微粒子の取り込みに重要であることが分
かった。
【００１０】米国特許第5,151,264号は、Bio Vecteurs
Supra Moleculairs（BVSM）と名付けられたリン脂質／
糖脂質／多糖性質の微粒子担体について記載している。
微粒子担体は、その層の１つに生物活性を有する様々な
分子を運搬することを意図している。しかし、米国特許
第5,151,264号は、免疫感作のための抗原を含む微粒子
担体については記載しておらず、経口的胃腸管、鼻咽頭
−気道および尿生殖道を経由する免疫感作、および眼窩
内またはその他の粘膜部位における免疫感作のための微
粒子担体について具体的に記載していない。
【００１１】Eldridge、他（ref.2および３）は、PLGま
たはPLGAとして知られているポリラクチド・グリコリド
共重合体から製造された生体内分解性マイクロスフェア
からのin vivoにおける抗原の遅延性放出を観察した。
マイクロパーティクルの製剤化に際して抗原をカプセル
充填するために多数の他の高分子が用いられており、こ
れらには、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリカプロ
ラクトン、ポリ酸無水物、ポリオルトエステルおよびポ
リ（α−ヒドロキシ酪酸）が含まれる。
【００１２】米国特許第5,075,109号は、50:50のポリ
（DL−ラクチド・グリコリド）中にトリニトロフェニル
化キーホールリンペットヘモシアニンおよびブドウ球菌
腸管毒Ｂ抗原のカプセル充填について記載している。ポ
リ（グリコリド）、ポリ（DL−ラクチド・グリコリ
ド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ
（ラクチド・カプロラクトン）、ポリ（エステルアミ
ド）、ポリオルトエステル、ポリ（α−ヒドロキシ酪
酸）、およびポリ酸無水物などのカプセル充填用の他の
ポリマーを提案している。カプセル充填された抗原は、
胃内挿管法によりマウスに投与され、唾液および腸管分
泌液および血清中に顕著な抗原特異的IgA抗体の出現を
もたらした。この特許に述べられているように、これと
は対照的に、同量のカプセル充填しない抗原の経口投与
は、試験したいずれの体液中において、いずれのイソタ
イプの特異的抗体の誘導に無効であった。ポリ（DL−ラ
クチド・グリコリド）マイクロカプセルを用いて、非経
口注射によって抗原を投与することもできた。
【００１３】公開されたPCT出願WO91/06282は、多数の
生体付着性マイクロスフェアおよび抗原ワクチン成分を
含む送達運搬体について記載している。マイクロスフェ
アは、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲン
またはアルブミンからなる。この送達運搬体は、鼻粘膜
からのワクチン取り込みを具体的に意図している。この
送達運搬体はさらに吸収促進剤を含有することができ
る。通常、防御性重合物質中に抗原をカプセル充填す
る。
【００１４】米国特許第5,571,531号は、多糖の固体マ
トリックスおよびタンパク性物質を含む微粒子担体につ
いて記載している。生物活性を有する物質の送達のため
に官能基の付いたシリコンポリマーをマトリックスに結
合させている。
【００１５】抗原の遅延性放出は前述の仕事で明らかに
なったが、記載の方法によってマイクロパーティクルを
製造する場合には困難に遭遇した。生物学的物質を用い
る有機溶媒および物理的力に暴露すると変性する可能性
もある。方法をスケールアップすることも困難である。
さらに、親水性の抗原をカプセル充填するのは非能率的
である。
【００１６】このような制限のない改善された担体を提
供することが望ましいであろう。具体的には、マイクロ
パーティクルおよびマイクロスフェアに製剤化でき、抗
原を予め選択された配位子に向けるような標的指向性の
部分を含む重合物質を提供することが望まれる。これ
は、免疫システムの細胞に対する途方もない潜在能力を
持つであろう。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、様々な方法
によってマイクロパーティクルおよびマイクロスフェア
を製造するのに適した性質を有する新規で有用なポリマ
ーの製造を対象とする。本発明において、現在のプロセ
ッシング法の改変は、カプセル充填の効率に著しい改善
をもたらす。本発明は、非経口、経口および鼻内を含む
様々な免疫感作経路による抗原、または抗原とアジュバ
ントのカクテルに有用なワクチン送達システムの製作を
対象とする。
【００１８】
【課題を解決する手段】本発明にかかるポリマーの製造
方法は、少なくとも１種のα−ヒドロシキ酸モノマー
と、少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸を共重合する
工程を有することを特徴とする生分解性及び生体適合性
を有するポリマーの製法である。この方法の好ましい態
様は、エステル化触媒の有機溶媒溶液とともに、少なく
とも１種のα−ヒドロシキ酸モノマーと、少なくとも１
種のアミンの保護基を有する疑似−α−アミノ酸と、の
モノマー混合物を、不活性雰囲気条件下で形成する工程
と、前記モノマーを共重合させる工程と、得られたコポ
リマーを単離する工程と、を有する。
【００１９】前記形成されたコポリマーは、固相触媒で
の還元または酸性触媒作用によって脱保護化することが
できる。また、この脱保護化は、臭化水素の酢酸溶液の
存在下での酸性触媒により行うことができる。前記エス
テル化触媒としては、２−エチルヘキサン酸第一スズを
用いることができる。また、前記有機溶媒としては、無
水クロロホルムを用いることができる。前記の製造方法
は、前記コポリマーをフィルムまたはマイクロパーティ
クルに成形する工程を更に含むことができる。
【００２０】また、前記少なくとも１種のα−ヒドロキ
シ酸として、式：Ｒ1Ｒ2ＣＯＨＣＯ 2Ｈ（該式中、Ｒ1及
びＲ2は水素原子あるいは直鎖状または分岐鎖状アルキ
ル基であり、該アルキル基は式：ＣnH2n+1で表され、ｎ
は１〜１０の整数である）で表されるα−ヒドロキシ酸
の少なくとも１種を用いることができる。
【００２１】また、前記α−ヒドロキシ酸は、α−ヒド
ロキシ酸の混合物として用いることができ、該混合物
は、前記式におけるＲ1及びＲ2が水素であるα−ヒドロ
キシ酸を含む混合物または前記式におけるＲ1がメチル
基であり、Ｒ2が水素であるα−ヒドロキシ酸を含む混
合物とすることができる。
【００２２】一方、前記少なくとも１種の擬似−α−ア
ミノ酸として、式：Ｒ5ＣＨＮＨＲ6ＣＯ2Ｈ（該式中、
Ｒ5はヒドロキシメチル基またはメチルチオール基であ
り、Ｒ 6はアミン保護基である。）で表される化合物の
少なくとも１種を用いることができる。前記アミン保護
基としては、カルボベンジルオキシ基（ＣＢＺまたは
Ｚ）、ベンジル基（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル基
（ＭｅＯＢｎ）、ベンジルオキシメトキシ基（ＢＯ
Ｍ）、tert−ブチルオキシカルボニル基（ｔ−ＢＯＣ）
及び［９−フルオレニルメチルオキシ］カルボニル基
（ＦＭＯＣ）からなる群から選択されたものを挙げるこ
とができる。
【００２３】前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸と
して、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、グリコール酸、ヒドロ
キシ吉草酸及びヒドロキシ酪酸からなる群から選択され
たものを、前記少なくとも１種の擬似−α−アミノ酸と
してセリン由来であるものを用いることができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】本発明の第１の態様により、下記
一般式のバックボーンを有し、約5,000から約40,000の
分子量を有するポリマーを含む、新規な生体内分解性、
生体適合性のポリマーを提供する。
【００２５】
【化１】
【００２６】上式で、R1、R2、R3、R4およびR5は独立
に、Ｈ、直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、R6
は、Ｈ、アミン保護基、スペーサー分枝または生物活性
分子種から選択され、Ｘは、ＯまたはＳ基から選択さ
れ、およびｘおよびｙは、整数で、ポリマーの少なくと
も約95％がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値をと
る。
【００２７】新規なポリマーは、環状ジエステルを含む
少なくとも１つのα−ヒドロキシ酸またはその誘導体、
および少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸を含む、単
量体の共重合によって誘導される。α−ヒドロキシ酸
は、一般式R1R2COHCO2Hを有し、R1およびR2基はＨ、直
鎖または分枝鎖アルキル基である。α−ヒドロキシ酸
は、α−ヒドロキシ酸の混合物、水素であるR1およびR2
基を有するα−ヒドロキシ酸、およびCH3であるR1基お
よびＨであるR2を有するもう１つのα−ヒドロキシ酸の
少なくとも１つの混合物を含むことができる。疑似−α
−アミノ酸は、一般式R5CHNHR6CO2Hを有し、R5基は、ヒ
ドロキシメチルまたはメチルチオール基、およびR6は、
アミン保護基である。
【００２８】アミン保護基は、カルボベンジルオキシ、
ベンジル、パラメトキシベンジル、ベンジルオキシメト
キシ、tert−ブチルオキシカルボニルまたは［９−フル
オレニルメチルオキシ］カルボニルでよい。
【００２９】通常、α−ヒドロキシ酸は、Ｌ−乳酸、D,
L−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒド
ロキシ酪酸から選択される。少なくとも１つの疑似−α
−アミノ酸はセリンでよい。
【００３０】本発明の好ましい態様において、ポリマー
は、ポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−Ｚ−セ
リンエステル（PLGpLS）およびポリ−P,L−ラクチド・
グリコリド・疑似−セリンエステル（PLGpS）である。
【００３１】このポリマーは、直接または側基を介して
ポリマーに共有結合した細胞生体付着性基、マクロファ
ージ刺激物質、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸
および／または保護されたアミノ酸残基などの生物活性
部分を含むことができる。
【００３２】好ましい実施形態において、生物活性置換
基は、アミノ酸部分のアミノ基または適当なスペーサー
分子を介してポリマーと結合する。スペーサー分子は、
R7またはR8基が独立に、Ｈ、直鎖または分枝アルキル単
位から選択され、式R7R8COHCO2Hで表されるα−ヒドロ
キシ酸、およびR9基がヒドロキシメチルまたはメチルチ
オール基であり、R10がアミン保護基である、式R9CHNHR
10CO2Hで表されるα−アミノ酸から選択することができ
る。
【００３３】本発明の別の態様により、本発明は、少な
くとも１つのα−ヒドロキシ酸および少なくとも１つの
疑似−α−アミノ酸を共重合させることを含む生体内の
分解性、生体適合性ポリエステルの製造方法を提供す
る。
【００３４】本発明の別の態様により、不活性雰囲気条
件において少なくとも１つのα−ヒドロキシ酸および少
なくとも１つの疑似−α−アミノ酸のエステル化触媒を
含む有機溶媒溶液を調製し、単量体を共重合させて得ら
れるポリマーを単離することを含む、本明細書中に与え
られた一般式を有する生体内分解性、生体適合性のポリ
マーの製造方法を提供する。用いる触媒は２−エチルヘ
キサン酸第一スズであるのが好ましい。この方法で生成
されるポリマーは、固相触媒還元または別法により酢酸
溶液中の臭化水素を用いる酸触媒により、さらに脱保護
することができる。この方法は、ポリマーをフィルムま
たはマイクロパーティクルに成型することを含む。
【００３５】本発明の別の態様により、下記一般式を有
し、約5,000から約40,000ドルトンの分子量を有するポ
リマーを含み、ポリマーを含む担体である、生物活性物
質を宿主に送達するための微粒子担体を提供する。
【００３６】
【化２】
【００３７】上式で、R1、R2、R3、R4およびR5は独立
に、Ｈ、直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、 R
6は、Ｈ、アミン保護基、スペーサー分子または生物活
性分子種から選択され、 Ｘは、ＯまたはＳ基から選択
され、および ｘおよびｙは、整数で、ポリマーの少な
くとも約95％がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値
をとる。
【００３８】通常、微粒子担体は、約１から10μＭの粒
子径を有する。
【００３９】本発明の別の態様は、少なくとも１つの生
物活性物質を宿主に送達するための微粒子担体製造方法
であり、その方法は、（ａ）α−ヒドロキシ酸ポリマー
または共重合体を含む有機溶媒相を、分散または溶解し
た生物活性物質を含む水性成分と混合し、第１の油中水
型乳剤を生成させるステップ、（ｂ）第１の油中水型乳
剤水性洗浄相に分散し、第２の水中油中水型乳剤を生成
させるステップ、（ｃ）第２の二重エマルションから水
を除去し、マイクロスフェアを生成させるステップ、お
よび（ｄ）マイクロスフェアを集め、その中に生物学的
物質を捕捉させるステップを含む。
【００４０】本発明の微粒子担体は、担体と混合または
担体中に捕捉した生物活性物質を有する組成物として用
いることができる。用いる生物学的物質は、免疫応答を
引き起こす物質から選択することができる。このような
物質には、非タンパク質分解性Hin−47類似体、D15、P
1、P2、およびP6などのヘモフィルスインフルエンザタ
ンパク質が含まれる。生物活性物質には、少なくとも１
つのインフルエンザウイルスが含まれ、多価または１価
のインフルエンザウイルスワクチン、またはインフルエ
ンザウイルス１価タンパク質ワクチンなどのインフルエ
ンザウイルスタンパク質が含まれる。さらに、生物活性
物質には、モラクセラカタラーリスのTbp2タンパク質な
どの少なくとも１つのモラクセラカタラーリスタンパク
質が含まれる。さらに、用いる生物活性物質には、ウレ
アーゼなどの少なくとも１つのヘリコバクターピロリタ
ンパク質が含まれる。他の生物物質には、タンパク質、
タンパク質様物質、細菌、細菌溶解物、ウイルス（例え
ば、呼吸器合胞体ウイルス）、ウイルス感染細胞溶解
物、DNAプラスミド、アンチセンスRNA、ペプチド（例え
ば、CLTB−36およびM2）、抗原、抗体、薬理学的試剤、
抗生物質、炭水化物、脂質、脂質化アミノ酸（例えば、
トリパルミトイルシステイン）、糖脂質、ハプテンおよ
びその組合せおよびその混合物が含まれる。
【００４１】第１の油中水型乳剤はさらに、親油性の少
なくとも１つの有機溶媒可溶アジュバントを含むことが
できる。このような有機溶媒アジュバントは、BAY R1−
005、トリパルミトイルシステインおよびDC−cholから
なる群から選択することができる。親油性部分の存在
は、カプセル充填効率を高め、製剤化中の抗原を保護
し、従来の製剤より効率よく免疫システムに抗原が存在
するように粒子を放出することに役立ち、したがってよ
り効果的なワクチンを提供する。
【００４２】さらに、第１の油中水型乳剤は、PCPPなど
の重合性の水溶性アジュバント、CT−Ｘまたはそのサブ
ユニットなどの粘膜アジュバントまたはLTといった少な
くとも１つの水溶性アジュバントを含むことができる。
水溶性アジュバントの存在は、本方法のカプセル充填効
率を高め、製剤化中の抗原を保護し、従来の製剤より効
率よく免疫システムに抗原が存在するように粒子を放出
することに役立ち、それによってより効果的なワクチン
を提供する。
【００４３】本発明は、本明細書中で提供される微粒子
担体および生理学的に許容可能な担体を含む免疫原性組
成物も提供する。この組成物は粘膜または非経口的に投
与できる。免疫応答は、局所の抗体応答または血清抗体
応答である。本発明のこの態様により、安定微粒子型の
制御された、または遅延した放出ワクチン調製物および
そのようなワクチン調製物の製造方法を提供する。粒子
はマイクロスフェア的で、生体内分解性ポリマーおよび
抗原および／または抗原プラス・アジュバント含有の領
域を含む。
【００４４】本発明の利点には、（ａ）完全に生体内分
解性および生体適合性マイクロパーティクル製剤化、
（ｂ）免疫システムの細胞に対する抗原呈示が容易とな
り、改善された抗原免疫原性をもたらす、（ｃ）抗原の
生物学的利用能を増加させる改善された製剤化条件、が
含まれる。
【００４５】本発明の追加の実施形態には、診断測定に
おけるおよび治療戦略に対する粒子担体の用途が含まれ
る。
【００４６】図面を参照しての以下の説明により、本発
明はさらに理解されるであろう。図１に、本発明の好ま
しい態様による、乳酸２量体とグリコール酸２量体およ
びＮ−（カルボベンジルオキシ）−Ｌ−セリンとの開環
重合（ROP）と、続く脱保護を図式的に示す。図２に、
ポリマー中のα−アミノ酸サブユニットの側鎖を介する
生物活性部分のポリマーへの結合を図式的に示す。代表
的な標的基には、水溶性および循環の場合にはポリ−エ
チレングリコール（PEG）、マクロファージ刺激物質お
よび細胞生体付着性基が含まれる。α−ヒドロキシ酸ま
たはα−アミノ酸から誘導されるスペーサー配位子を組
み入れて生物活性配位子の結合を容易にすることができ
る。
【００４７】図３は、本発明の一実施形態によるマイク
ロパーティクル製造のために用いるプロセスの詳細を図
式的に示す。この図において、Hin−47は、ヘモフィル
スインフルエンザに由来する非タンパク質分解性組換え
タンパク質類似体（米国特許第5,506,139号に記載）、F
lu X31は、インフルエンザX31株またはＡ−Texas株、rD
−15は、ヘモフィルスインフルエンザに由来する組換え
タンパク質（WO94/12641に記載）、PVA＝ポリビニルア
ルコールである。Flu（トリ）は３価のflu、Tbp2は、モ
ラクセラカタラーリストランスフェリン結合タンパク質
２、およびrUreaseは、組換えヘリコバクターピロリウ
レアーゼである。ポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・
疑似−（Ｚ）−セリンエステル（PLGpZS）およびポリ−
D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル（P
LGpS）マイクロパーティクルをPBSまたは代表的タンパ
ク質（非タンパク質分解性Hin−47類似体）の存在下で
調製した場合の、レーザー回折測定による代表的サイズ
分布を図４に示す。
【００４８】リン酸緩衝食塩水（PBS）の存在下でポリ
−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−（Ｚ）−セリン
エステル（PLGpZS）およびポリ−D,L−ラクチド・グリ
コリド・疑似−セリンエステル（PLGpS）から調製した
マイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真を図５に
示す。Hin−47/PBSなどの代表的抗原/PBS混合物の存在
下でポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−（Ｚ）
−セリンエステル（PLGpZS）およびポリ−D,L−ラクチ
ド・グリコリド・疑似−セリンエステル（PLGpS）から
調製したマイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真
を図６に示す。
【００４９】PBS（pH＝7.4）中でインキュベートされ37
℃に維持された試料14mg（代表的なコアへの充填量は、
マイクロパーティクルmgあたり2.5から5.7μｇタンパク
質の範囲にある）から得られたPLG、PLGpZSおよびPLGpS
マイクロパーティクル中にカプセル充填された非タンパ
ク質分解性Hin−47類似体の３カ月間のin vitroにおけ
る放出経過を図7Aに示す。PBS（pH＝7.4）中でインキュ
ベートされ37℃に維持された試料〜14mg（代表的なコア
への充填量は、マイクロパーティクルmgあたり2.5から
5.7μｇタンパク質の範囲にある）から得られたPLG、PL
GpZSおよびPLGpSマイクロパーティクル中からの非タン
パク質分解性Hin−47類似体の３カ月間の％累積放出を
図7Bに比較する。
【００５０】種々の免疫感作プロトコルに従ってヘモフ
ィルスインフルエンザから得られた47kDa膜タンパク質
（非タンパク質分解性Hin−47類似体）により皮下（S.
C.）で免疫感作されたマウスにおける血清IgG応答を図8
Aに示す。５匹のマウスからなる群を、PLG、PLGpZSおよ
びPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれた非タンパ
ク質分解性Hin−47類似体0.2または0.6μｇを含むpH7.4
のPBS250μＬにより、１日目および35日目に免疫感作し
た。＋10、＋24、＋35、＋46および＋60日目に採取した
血清について、酵素結合免疫吸着検定（ELISA）により
抗−Hin−47IgG抗体の存在を評価した。種々の免疫感作
プロトコルに従ってヘモフィルスインフルエンザから得
られた47kDa膜タンパク質（非タンパク質分解性Hin−47
類似体）により皮下（S.C.）で免疫感作されたマウスに
おける血清IgG応答を図8Bに示す。５匹のマウスからな
る群を、PLGマイクロパーティクルと物理的に混合した
非タンパク質分解性Hin−47類似体0.8または2.5μｇを
含むpH7.4のPBS250μＬにより、１日目および35日目に
免疫感作した。＋10、＋24、＋35、＋46および＋60日目
に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ELIS
A）により抗−Hin−47IgG抗体の存在を評価した。図8A
および図8Bで説明したように行った試験から＋35および
＋60日目に得られたプール血液について、血清IgG応答
サブタイププロフィールを図8Cに示す。
【００５１】ヘモフィルスインフルエンザから得られた
47kDa膜タンパク質（非タンパク質分解性Hin−47類似
体）により胃内（I.G.）で免疫感作されたマウスにおけ
るIgG血清抗体応答を図9Aに示す。５匹のマウスからな
る群を、PLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティクル
に取り込まれ、またはPLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロ
パーティクルと物理的に混合された非タンパク質分解性
Hin−47類似体４μｇを含むpH7.4のPBS500μＬにより、
１、７、14および57日目に免疫感作した。＋13、＋35、
＋56および＋78日目に採取した血清について、酸素結合
免疫吸着検定（ELISA）により抗−Hin−47IgG抗体の存
在を評価した。図9Aで説明したように行った試験から＋
56および＋78日目に得られたプール血液について、血清
IgG応答サブタイププロフィルを図9Bに示す。図9Aで説
明したように行った試験から＋78日目に得られたプール
血液について、血清IgA応答を図9Cに示す。
【００５２】ヘモフィルスインフルエンザから得られた
47kDa膜タンパク質（非タンパク質分解性Hin−47類似
体）およびヘモフィルスインフルエンザから得られた11
5kDa膜タンパク質（rD−15）の（1:1）カクテルにより
鼻腔内（I.N.）で免疫感作されたマウスにおけるIgG血
清抗体応答を図10Aに示す。５匹のマウスからなる群
を、PLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティクルに取
り込まれ、またはPLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパー
ティクルと物理的に混合された非タンパク質分解性Hin
−47類似体４μｇを含むpH7.4のPBS25μＬにより、１、
７、14および57日目に免疫感作した。＋13、＋35、＋56
および＋78日目に採取した血清について、酵素結合免疫
吸着検定（ELISA）により抗−Hin−47IgG抗体の存在を
評価した。図10Aで説明したように行った試験から＋56
および＋78日目に得られたプール血液について、血清Ig
G応答サブタイプ・プロフィルを図10Bに示す。図10Aで
説明したように行った試験から＋78日目に得た血液につ
いて血清IgA応答を図10Cに示す。図10Aで説明したよう
に行った試験から＋78日目に得た血液について肺潅注法
IgG応答を図10Dに示す。図10Aで説明したように行った
試験から＋78日目に得た血液について肺潅注法sIgA応答
を図10Eに示す。
【００５３】種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu
X31（すなわち、Ａ型インフルエンザウイルスX31株）Ig
G血清抗体応答を図11に示す。６匹のマウスからなる群
を、PLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクルに取
り込まれたHA1.5μｇを含むpH7.4のPBS250μＬにより、
皮下（S.C.）で１日目に免疫感作した。＋21および＋33
日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定
（ELISA）により抗−FluＸ−31IgG抗体の存在を評価し
た。
【００５４】種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu
X31（すなわち、Ａ型インフルエンザウイルスX31株）Ig
G血清抗体応答を図12に示す。６匹のマウスからなる群
を、PLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクルに取
り込まれたHA1.5μｇを含むpH7.4のPBS25μＬにより、
鼻腔内（I.N.）で１および34日目に免疫感作した。＋2
1、＋33、＋57、＋78および＋92日目に採取した血清に
ついて、酵素結合免疫吸着決定（ELISA）により抗−Flu
X31IgG抗体の存在を評価した。
【００５５】単回皮下投与後にプールした血清（＋21お
よび＋42または＋57日目）について血球凝集反応阻害抗
体検定（すなわち、インフルエンザウイルスＡ−Texas
株）応答を図13に示す。６匹のマウスからなる群を、PL
GpSマイクロパーティクルに取り込まれたHA0.35μｇま
たはHA3.5μｇ、PLGpSマイクロパーティクルに取り込ま
れたHA0.35μｇおよびBAY R1−005〜２μｇ、またはHA
3.5μｇおよびBAY R1−005〜20μｇ、PLGpSマイクロパ
ーティクルと物理的に混合されたHA0.35μｇまたはHA3.
5μｇ、PLGpSマイクロパーティクルと物理的に混合され
たHA0.35μｇおよびBAY R1−005 ２μｇ、またはHA3.5
μｇおよびBAY R1−005 20μｇを含むpH7.4のPBS250μ
Ｌにより、皮下（S.C.）で１日目に免疫感作した。＋21
および＋42日目に採取した血清について、赤血球の血球
凝集反応阻害を調べた。
【００５６】種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu
（３価）IgG血清抗体応答（３価ワクチン）中に含まれ
る各インフルエンザウイルス株について;A−Texas（図1
4a）、A/Johannesburg（図14b）およびB/Harbin（図14
C））を図14aからｃに示す。８匹のマウスからなる群
を、PLGpSマイクロパーティクル、またはBAY R1−005、
DC−CholまたはPCPPの存在下で製剤化したPLGpSマイク
ロパーティクル中に取り込んだ合計2.35μｇのHA（各株
から約1/3の特異的HA）を含むpH7.4のPBS250μＬによ
り、皮下（S.C.）で１日目に免疫感作した。＋21、＋42
および＋57日目に採取した血清について、酵素結合免疫
吸着検定（ELISA）を用い、抗−Flu（３価）IgG抗体
（Ａ−Texas、A/JohannesburgおよびB/Harbin）の存在
を評価した。
【００５７】単回皮下投与後の株特異的血球凝集反応阻
害抗体検定（すなわち、Ａ−Texas（図15a）、A/Johann
esburg（図15b）およびB/Harbin（図15c）応答を図15a
からｃに示す。８匹のマウスからなる群を、PLGpSマイ
クロパーティクル中に取り込んだ合計2.35μｇのHA、ま
たはBAY R1−005、DC−CholまたはPCPPを一緒にカプセ
ル充填したPLGpSマイクロパーティクル中に取り込んだ
合計2.35μｇのHAを含むpH7.4のPBS250μＬにより、皮
下（S.C.）で１日目に免疫感作した。＋21、＋42または
＋57日目に採取した血清について、赤血球の血球凝集反
応阻害を評価した。
【００５８】PLGpS/Flu（３価）マイクロパーティク
ル、またはBAY R1−005、DC−CholまたはPCPPを一緒に
カプセル充填したPLGpS/Flu（３価）マイクロパーティ
クルの単回投与により免疫感作したマウスで行った防御
試験の結果を図16に示す。マウスを同族の生ウイルスで
チャレンジし、体重変化および２週間間隔で生存をモニ
ターした。
【００５９】種々の免疫感作プロトコルに従って、モラ
クセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結合
タンパク質により、皮下（S.C.）で免疫感作したマウス
における血清IgG抗体応答を図17aに示す。５匹のマウス
からなる群を、PLGpSマイクロパーティクルに取り込む
か、PLGpSマイクロパーティクルと物理的に混合する
か、またはAlumとともに製剤化したtbp−２ 0.3μｇを
含むpH7.4のPBS250μＬにより、１、28および43日目に
免疫感作した。＋14、＋27、＋42および＋55日目に採取
した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ELISA）を
用い、抗−tbp−2IgG抗体の存在を評価した。図17aで説
明したように行った試験から＋55日目に得られたプール
血液について、血清IgG抗体サブタイプ応答プロフィル
を図17bに示す。
【００６０】モラクセラカタラーリスから得られたトラ
ンスフェリン結合タンパク質（Tbp−２）により、鼻腔
内（I.N.）で免疫感作したマウスにおけるIgG血清抗体
応答を図18に示す。５匹のマウスからなる群を、PLGpS
マイクロパーティクル中に取り込むか、またはPLGpSマ
イクロパーティクルと物理的に混合したTbp−２ ６μｇ
を含むpH7.4のPBS10μＬまたは50μＬにより、１、28お
よび43日目に免疫感作した。＋14、＋27、＋42および＋
55日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定
（ELISA）を用い、抗−Tbp−2IgG抗体の存在を評価し
た。
【００６１】種々の免疫感作プロトコルに従って、モラ
クセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結合
タンパク質（Tbp−２）により、非経口的に免疫感作さ
れたモルモットにおける血清IgG抗体応答を図19に示
す。２匹のモルモットからなる群を、１日目にCFA400μ
Ｌとともに製剤化したTbp−２ ５μｇにより筋肉内で免
疫感作し、続いて、14および28日目にIFA500μＬ中で製
造化したTbp−２ 5.0μｇにより皮下で免疫感作する
か、１、14および28日目にAlum500μＬとともに製剤化
したTbp−２ ５μｇ、または１および28日目にPLGpSマ
イクロパーティクルに取りまれたTbp−２ ５μｇにより
免疫感作した。＋40および＋56日目に採取した血清につ
いて、酵素結合免疫吸着検定（ELISA）を用い、抗−Tbp
−２ IgG抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロト
コルに従って、ヘリコバクターピロリから得られた組換
えタンパク質rUreaseにより、皮下（S.C.）または経口
（I.G.）で免疫感作されたマウスにおける血清IgG抗体
サブタイプ応答を図20に示す。８匹のマウスからなる群
を、PLGpSマイクロパーティクルに取り込まれたrUrease
10.0μｇ（S.C.）または40.0μｇ（I.G.）、またはPLGp
Sマイクロパーティクルに取り込まれたDC−Chol、CT−
Ｘ、PCPPまたはLTの存在下で製剤化されたrUrease10.0
μｇ（S.C.）または40.0μｇ（I.G.）を含むpH7.4のPBS
250μＬにより、１、28および56日目に免疫感作した。
＋85日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検
定（ELISA）を用い、抗−rUreaseIgG抗体の存在を評価
した。
【００６２】図20に記載したマウスについて、85日目の
チャレンジ後１カ月の防御試験の結果を図21aからｂに
示す。rUrease活性（皮下または経口経路で免疫感作さ
れたマウスについて）は、マウスを致死させて24時間後
に胃全体の1/4（幽門洞＋胃体部）で測定した。
【００６３】本発明の新規なポリマーは、生体内に存在
し、細胞生体付着基、マクロファージ刺激物質、ポリア
ミノ酸およびα−ヒドロキシ酸およびα−アミノ酸から
選択される少なくとも１つのスペーサー分子を介してポ
リマーと結合するポリエチレングリコールなどの生物活
性部分を有する良性代謝物に対して生体適合性、分解性
である。このように、新規ポリマーは、官能基を有す
る。生物活性物質を含むマイクロパーティクルへのプロ
セッシングに有利な性質を有するポリマーの合成方法も
説明するが、生物活性標的基による化学的修飾も可能で
ある。
【００６４】好ましい実施形態において、共重合体は、
α−ヒドロキシ酸と疑似−α−アミノ酸の重合によって
製造し、およびターポリマー（terpolymer）は、２つの
α−ヒドロキシ酸と疑似−α−アミノ酸との重合によっ
て製造する。次いで、この共重合体またはターポリマー
は、遊離アミノ基との直接の共有結合によるアミノ酸サ
ブユニットを介して生物活性標的配位子により誘導体と
され、さらに適当なスペーサー配位子で誘導化すること
ができる。
【００６５】アミノ酸単量体合成 通常、Ｎ−保護セリン（またはシステイン）は光延反応
（ref.5）により環化され、４員環ラクトン（またはチ
オラクトン）が得られる。この変換は、エステル（また
はチオエステル）結合を生じる。反応条件に適合するア
ミノ酸前駆体のアミン部分上の保護が重要である。カル
ボベンジルオキシ（CBZまたはＺ）基を用いることが好
ましいが、ベンジル（Bn）、パラ−メトキシベンジル
（MeOBn）、ベンジルオキシメトキシ（BOM）、tert−ブ
チルオキシカルボニル（ｔ−BOC）または［９−フルオ
レニルメチル）オキシ］カルボニル（FMOC）などの他の
適当な官能基を用いてもよい。
【００６６】Ｎ−Ｚ−Ｌ−セリンβ−ラクトン単量体の
合成は、文献（ref.6）の改良法に基づいた。
【００６７】単量体を含むα−ヒドロキシ酸およびアミ
ノ酸の共重合、およびアミノ酸側鎖の官能基化 α−ヒドロキシ酸単量体の共重合には２つの方法が利用
できる。重縮合を介する重合、または溶解（バルク重
合）による重合を選択することが可能である。比較的低
分子量の物質では、しばしば競争的副反応が伴い、好ま
しくない副生成物が生じるため、縮合重合には問題のあ
ることが長く知られていた（ref.7および８）。しか
し、グリコリドおよびラクチドなどの環状２量体のバル
ク相からの開環重合（ROP）が、様々な触媒の存在下で
容易に進行し、好ましくは、オクタン酸第一スズにより
高分子量のポリマーを与えることが分かった（ref.9か
ら15）。
【００６８】ポリ（アミノ酸）（ref.16、17および18）
または疑似ポリ（アミノ酸）（ref.6および19）の調製
には多くの方法がある。ポリ−α−ヒドロキシ酸（特
に、50:50 D,L−ラクチドおよびグリコリドのポリマ
ー）およびポリ（アミノ酸）のよく知られた生体内分解
性の性質は、α−ヒドロキシ酸ポリマーのバックボーン
にアミノ酸を取り込む方法を開発しようとする努力の増
加をもたらした（ref.20から25）。ラクチドまたはグリ
コシドなどのα−ヒドロキシ酸サブユニット、およびグ
リシンまたはリジンなどのα−アミノ酸サブユニットを
含む共重合エステルアミドの製造に進歩が見られた（re
f.22,23および26）。
【００６９】生体内分解性ポリマーの分解速度、および
グリコリド、ラクチドのホモポリマーまたはこれらの物
質の共重合体からのカプセル充填された物質の放出速度
は、結晶性の程度、および相対的な疎水性または親水性
の程度などといったそれらの分子量および構造に強く影
響を受けることが分かった。具体的には、α−ヒドロキ
シ酸から誘導された高分子量のポリマーから製剤化され
たマイクロスフェアは、低分子量の類似体に比べ長時間
かかって分解する。同様に、高結晶性物質は、無定形類
似体に比べかなりゆっくりした速度で崩壊する。このこ
とは、加水分解に不安定なエステル結合への水の近づき
やすさに関連している（ref.27）。50％のD,L−ラクチ
ドおよび50％のグリコリドからなるランダム無定形共重
合体は、最も進んだ分解速度を示すことが証明されてお
り（ref.2および３）、PBS緩衝液（pH＝7.4）中に浸け
た場合、約６週間後に50重量％が残存する。
【００７０】前述の共重合エステルアミドは半結晶物質
であり、カプセル充填された物質が完全に放出された後
にも長い間投与部位に滞留する心配もある。カプセル充
填された物質が完全に放出された時点または近い時点で
分解するポリマーを手にすることは利点であると考え、
疑似−α−アミノ酸サブユニットも含むターポリマーに
等量のD,L−ラクチドおよびグリコリドをランダムに取
り込む方法を開発した。無定形のターポリマーはフィル
ムおよびマイクロパーティクルへの加工に十分な機械的
強度を保持する一方で、満足のいくポリマー分解速度お
よび捕捉物質の放出速度を示すのではないかということ
を確かめるために、相対的に中程度の分子量のターポリ
マーを用いた。
【００７１】Ｎ−保護−Ｌ−セリンラクトンは、エステ
ル結合を含み、エステル交換反応触媒を介して重合させ
ることができる（ref.6）。さらに、ラクチドおよびグ
リコリドなどの６員環ラクトンは、挿入／配位型触媒／
開始剤を用いることにより４員環プロピオラクトンと共
重合させることができる（ref.13）。すべての単量体単
位に比較的十分な反応性が達成されるようであれば、Sn
試薬から誘導される触媒などの効率的エステル交換反応
触媒が必要となることが予想された。
【００７２】オクタン酸第一スズが介在するグリコリ
ド、D,L−ラクチドおよびＮ−Ｚ−Ｌ−セリンラクトン
の共重合を用いた。共重合体またはターポリマーのCBZ
基の脱保護は、様々な方法で行うことができる。固相触
媒還元または酸触媒（ref.27）が、２つの可能性である
（図１）。
【００７３】得られた共重合体またはターポリマーは、
図２に示すように、細胞付着性エピトープ、体循環のた
めのポリエチレングリコール（PEG）配位子、マクロフ
ァージ刺激物質およびポリアミノ酸グラフトなどの標的
部分を付け加えることができる。例えば、α−ヒドロキ
シ酸または疑似−α−アミノ酸ユニットなどのスペーサ
ーユニットを導入し、適当な標的ユニットで誘導化でき
る。このようにして生成されたポリマーは、約5,000か
ら約40,000ダルトンの分子量を有する。
【００７４】マイクロパーティクルの形成 本明細書中で用いるように、「マイクロパーティクル」
という用語は、大きさが１ミクロンより大きく生物活性
物質の送達に用いる任意の粒子担体を意味する。本明細
書中で用いるように、「マイクロスフェア」という用語
は、１つまたは複数の活性成分（例えば、抗原、アジュ
バント、プラスミドDNA）を含むマイクロパーティクル
を意味する。
【００７５】本明細書中に記載するマイクロパーティク
ル生成方法を例示する流れ図を図３に示す。通常、共重
合体（PLG、PLGpZSまたはPLGpS）は、ジクロロメタン、
酢酸エチル、アセトンまたはその混合物などの適合する
溶媒中に単独で溶けるか、追加の賦形剤で可溶である。
ショ糖、マンノース、トレハロースまたはゼラチンなど
の製剤化に含まれる賦形剤は、凍結防止剤（cryoprotec
tant）または水解防止剤（lyoprotectant）として役立
つ。BAY R1−005（BAY）（ref.29）またはトリパルミト
イルシステイン（TPC）（ref.30）または3b［Ｎ−
（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイ
ル］コレステロール（DC−Chol）（ref.31）などの既知
のアジュバント性を有する他の物質を製剤中に用いても
よい。
【００７６】全量12mLの１％から２％の共重合体溶液を
調製するのが好ましい。この溶液に、リン酸緩衝食塩水
（PBS）800μＬ、またはPBSまたは追加の賦形剤を含む
ことができる他の安定化緩衝液中の抗原溶液（通常１か
ら2mg/mLの濃度）800μＬを加える。ポリ［ジ（カルボ
キシラートフェノキシ）−ホスファゼン］ナトリウム
塩、（Virs Research Institute、Cambridge MA）（PCP
P）またはコレラトキシンまたはそのサブユニットなど
の既知のアジュバント性を有する他の物質を製剤中に用
いてもよい。次いで、この混合物を均質化して、油中水
型乳剤を生成する。生成したら直ちに、この混合物を、
0.5％から10.0％のポリビニルアルコール（PVA）、メチ
ルセルロースまたはTriton Ｘ−100などの非イオン性乳
剤安定化剤を含む水溶液100mLに分散させる。この混合
物を均質化すると、水中油中水型二重乳剤が生成する。
得られた小滴の平均サイズおよび多分散性（polydisper
sity）は、Coulter LS−100光散乱検出器を用いること
によって容易に測定することができる。PBSまたは抗原/
PBS混合物をカプセル充填するときの代表的なサイズ分
布は、１から20ミクロンの範囲にある（大部分が10ミク
ロン未満のサイズ）。次いで、緩やかに温め、蒸発によ
ってゆっくりと溶媒を除去すると、始めのマイクロスフ
ェアが固化する。溶媒を除去したら直ちに、混合物を遠
心分離してマイクロスフェアを集め、脱イオン水で繰り
返し洗浄して、残存する乳剤安定化剤を完全に除去す
る。次いで、マイクロスフェアをドライアイス／アセト
ン中で凍結し、一昼夜凍結乾燥すると、白色で自由に流
動する粉末としてマイクロスフェアが得られる（光散乱
測定法による測定および走査型電子顕微鏡写真法によっ
て直接確認したサイズは通常1.0から12ミクロン）。
【００７７】通常、この粒子は、約１から約50μＭの粒
子径を有する重合性マトリックスを含み、その中には、
捕捉された生物活性物質、および場合によって一緒に捕
捉されたアジュバントを有するポリマーを含む。重合性
マトリックスに導入される生物活性物質およびアジュバ
ントの量は、大きく異なり、全粒子塊の50重量％まで含
むことができる。
【００７８】本発明の様々な実施形態は、医療の分野お
よび特に、ワクチン接種、細菌およびウイルスを含む病
原体による感染症の診断および治療の分野で多くの応用
が可能であることは、当業者には明らかである。そのよ
うな使用についての限定的でない説明を以下に行う。
【００７９】ワクチン調製 ある実施形態において、例えば、ワクチンとして用いる
のに適当な免疫原性組成物は、本明細書中に開示するマ
イクロパーティクルから調製することができる。生物活
性免疫原性物質を含む免疫原性組成物は、宿主による抗
体の産生を含む、投与された宿主による免疫応答を引き
起こす。
【００８０】免疫原性組成物は、液体水剤または乳剤な
どの注射液として調製することができる。マイクロパー
ティクルは、マイクロパーティクルと適合する生理学的
に許容可能な賦形剤と混合することができる。賦形剤に
は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタ
ノールおよびその組合せが含まれる。さらに、ワクチン
は、ワクチンの有効性を促進するために湿潤剤または乳
化剤、pH緩衝剤、またはアジュバントなどの追加の物質
を含んでもよい。ワクチンは、非経口で、皮下注射また
は筋肉内注射により投与することができる。
【００８１】あるいは、本発明により生成されたマイク
ロパーティクルを含む免疫原性組成物は、粘膜表面で免
疫応答を引き起こすような方法で送達することができ
る。したがって、免疫原性組成物は、鼻内、経口（胃
内）、頬側または直腸経路により、粘膜表面に投与する
ことができる。経口製剤には、医薬等級のサッカリン、
セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常用いられ
る賦形剤が含まれる。
【００８２】これらの組成物は、水剤、懸濁剤、錠剤、
丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形をとるこ
とができる。経口経路で投与された場合に、マイクロパ
ーティクルおよびマイクロパーティクルのコア中に含ま
れる、またはマイクロパーティクルと物理的に混合され
てカプセル充填された物質を胃の酸性から守るために、
マイクロパーティクルの投与前、投与と同時、または投
与直後に酸中和調製物（重炭酸ナトリウム調製物など）
を投与すると有利である。
【００８３】ワクチンは、剤形に適合した方法で、治療
上有効で、防御的および免疫原性となるような量で投与
する。投与される量は、治療を受ける対象、例えば、抗
体を合成し、必要ならば、細胞媒介性の免疫応答を生み
出すという対象の免疫システムの能力によって決まる。
投与する必要のある生物活性を有するマイクロパーティ
クルおよび物質の正確な量は、専門家の判断によって決
まる。しかし、適当な投与量範囲は当業者によって容易
に決定可能であり、数マイクログラムから数ミリグラム
程度でよい。初回投与および追加免疫投与の適当な処方
も変化するが、初回投与と、それに続く投与を含むこと
ができる。ワクチンの用法は投与経路で決まるが、ある
宿主から他の宿主へと変化する。
【００８４】ワクチン製剤化に応用される本発明のポリ
マーは、DNAまたはアンチセンスRNAなどを用いるワクチ
ン戦略にとっても有用である。マイクロパーティクル担
体として、本発明のポリマーは、コアタンパク質または
エンベロープタンパク質などのウイルスの抗原部分のあ
る遺伝子または複数の遺伝子をコードするDNAを含むよ
うに調製することができる。DNAが担体から放出される
にしたがって、宿主細胞は異種DNAを取り込み、問題の
遺伝子を発現し、細胞内で対応するウイルスタンパク質
を合成する。有利には、ウイルスタンパク質は、細胞媒
介性免疫を引き起こす細胞の主要組織適合性複合体経路
に入る。これに比べ、標準的なワクチン抗原は、細胞に
取り込まれ、抗体応答を刺激するMHC IIクラスシステム
によって処理される。
【００８５】DNAは、すべての関連タンパク質を持た
ず、複合体ベクターシステムを必要としない裸のDNAの
形でよい。所望の遺伝子は、本命書中に記載のマイクロ
パーティクル中にカプセル充填されたプラスミドなどの
ベクターに挿入され、哺乳動物の組織中に注射されて遺
伝子産生を発現し、免疫応答を引き起こすことができ
る。
【００８６】本発明のポリマーと組合せてアンチセンス
オリゴヌクレオチドを用いることもできる。核酸配列
は、タンパク質の産生を阻害する既知のタンパク質に具
体的に対応するmRNA配列に結合するようにデザインする
ことができる。本明細書中に記載するマイクロパーティ
クルを用い、様々な免疫学的疾患ならびに高血圧、心血
管疾患およびガンの治療に対する医療戦略としてこのよ
うなアンチセンスヌクレオチド（オリゴヌクレオチドま
たは発現したヌクレオチド）を送達することができる。
【００８７】本明細書中で開発したポリマー・マイクロ
パーティクルの徐放性の特徴は、マイクロパーティクル
を用いて薬理学的試剤をゆっくりと連続的に送達するよ
うな薬理学の分野における用途も有する。血圧降下剤、
鎮痛剤、ステロイド剤および抗生物質などの広範な薬物
を本発明によって使用し、徐放薬物送達システムを得る
ことができる。
【００８８】捕捉または物理的に混合された生物学的試
剤を有するフィルム型のポリマーには、外科的移植組織
および器具のコーティングとしての用途を持つ。例え
ば、マイクロパーティクルに取り込まれた抗生物質を有
するフィルム状のポリマーを用いて外科的に埋め込まれ
たカテーテルを被覆し、感染と闘う抗生物質を継続的に
徐放することができる。
【００８９】マイクロパーティクル担体は、診断試薬と
しても有用である。適当な抗体とともに、イメージング
試薬をマイクロパーティクルに導入することができる。
このようにして、患者の臨床的経過を確認またはモニタ
ーするために罹患組織を標的とし、これをイメージする
ことができる。
【００９０】マイクロパーティクルとしてのポリマー
は、適当な抗体と組み合わせて用いれば診断キットとし
ての用途も持つ。
【００９１】実施例 前述の開示は本発明を一般的に説明するものである。以
下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な
理解を得ることができる。これらの実施例は、単に例示
目的で記載するものであり、本発明の範囲を限定するこ
とを意図していない。付随的な事柄が手段を示唆あるい
は伝えることもあるため、変形形態および等価形態の置
き換えを企図している。本明細書中で特定の用語を用い
たが、このような用語は、説明を意図したもので、限定
を目的としたものではない。
【００９２】本開示中で用いるが明確に説明していない
化学、有機化学、ポリマー化学、タンパク質生化学およ
び免疫学の方法、およびこれらの実施例は、科学文献に
詳しく報告されており、当業者の能力に含まれるもので
ある。
【００９３】実施例１:この実施例は、Ｎ−Ｚ−Ｌ−セ
リンβ−ラクトンの調製を例示する。
【００９４】このＮ−保護アミノ酸ラクトンの調製は、
改良法に基づくもので、Ｎ−保護−α−アミノ酸を反応
させて、環化した疑似−α−アミノ酸単量体を得る（re
f.6）。すべてのガラス器具は、120℃に設定したオーブ
ン中で一昼夜予備乾燥する。使用に先立って、真空デシ
ケータ中で冷却し、乾燥窒素流中10分間通気する。
【００９５】1Lの３頸丸底フラスコに、窒素中でトリフ
ェニルホスフィン（TPP;Aldrich;7.87mL;50mmol;FW:17
4.16）を加えた。これに、無水アセトニトリル（CH3CN;
Aldrich）および無水テトラヒドロフラン（THF;Aldric
h）溶液（体積比85:15）200mLを注射器で加え、固体TPP
が溶けるまで撹拌した。この溶液に、アゾジカルボン酸
ジエチル（DEAD;Aldrich;7.87mL;50mmol;FW:262.29）を
注射器で加え、溶液を室温で30分間撹拌した。反応溶液
をアセトニトリル／ドライアイス浴に浸けて溶液を約−
45℃から−48℃まで冷却した。溶液の内温が約−45℃に
達したら直ちに、Ｎ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−セリ
ン（Ｎ−CBZ−Ｌ−セリン;Sigma;11.94g;49.8mmol;FW:2
39.2）の無水CH3CN:THF（体積比85:15）200mL溶液を注
射器により１時間以上かけてゆっくり滴下した。添加中
は溶液の温度を約−45℃に維持し、添加が終了すると同
時に室温までゆっくりと温め、一昼夜撹拌を継続した。
この反応で、CBZ保護α−アミノ基の存在下に、セリン
ヒドロキシ側鎖とカルボン酸の間にエステル結合の生成
が起きる。反応完了後、蒸発により溶媒を除去した（35
℃から45℃）。黄色の油／スラリ（〜35g）が得られ
る。このスラリに、ジクロロメタン：酢酸エチル（体積
比85:15）溶液50mLを加えると、副生成物の1,2−ジカル
ベトキシヒドラジンの沈殿が生じる。この物質を減圧ろ
過により除去し、続いて、蒸発により溶媒を除去した。
前記手順を繰り返し、残存する副生成物をさらに除去す
ることができる。次いで、ろう状固体の粗生成物を、溶
離液として85:15ジクロロメタン：酢酸エチルを用いて
シリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。生成物
のセリンラクトンは、薄層クロマトグラフィにより、1M
H2SO4溶液による発色およびUV検出した場合に、この物
質が85:15ジクロロメタン：酢酸エチルで展開するシリ
カゲルプレート上で0.75のRfを有することが確認でき
る。この生成物を酢酸エチル：ヘキサン（〜1L）で再結
晶し、ろ過して真空乾燥した。
【００９６】再結晶後、融点（Tm＝133〜134℃）の純粋
な白色の固体が40％の収率で得られ、他のすべての物理
パラメータ（NMR、IR、質量分析法、元素分析）は従来
明らかにされたものと一致する（ref.6）。
【００９７】実施例２:本実施例は、図１に示すポリ−
D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−Ｚ−セリンエステ
ル（PLGpZS）共重合体の調製を例示する。ガラス製器具
は一昼夜予備乾燥した。使用に先立って、真空デシケー
タ中で冷却した。さらに、重合容器（ガラスアンプル）
はシリコン被覆（SurfaSil;Pierce;2％トルエン溶液）
されなければならず、すべての転移反応および重合容器
への試薬類および単量体の添加は、乾燥窒素環境に保持
されたグローブ・ボックス中で行わなければならない。
【００９８】重合に先立ち、D,L−ラクチド（2,6−ジメ
チル−1,4−ジオキサン−2,5−ジオン;Aldrich;FW:144.
13）およびグリコリド（Boehringer Ingelheim;FW:116.
096）を、グローブ・ボックス中で無水酢酸エチルから
再結晶し、約２日間真空で乾燥した。十分乾燥したら直
ちに、直接グローブ・ボックスに入れた実施例１の新た
に再結晶したセリンラクトン（０℃で保存）とともに単
量体をグローブ・ボックス中に保存できる。すべての単
量体および触媒／開始剤を秤量し、グローブ・ボックス
中のガラスアンプルに移す。
【００９９】アンプルに移す単量体の総量は1gから5gの
範囲であり、D,L−ラクチド：グリコリド：セリンラク
トンのモル比は42.5:42.5:15.0から49.0:49.0:2.0の範
囲である。好ましい実施形態においては、D,L−ラクチ
ド：グリコリド：セリンラクトンのモル比、47.5:47.5:
5.0を用いた。触媒（２−エチルヘキサン酸第一スズ（S
n（Oct）2;Sigma;FW:405.1、1.25g/mL）の無水クロロホ
ルム（Aldrich）保存溶液をグローブ・ボックス中で調
製し、マイクロシリンジでガラスアンプルに加えた（触
媒の単量体に対するモル比＝1/1000）。アンプル中に撹
拌棒を置いた。グリースを付けたすりガラスのジョイン
トバルブをアンプル上に置き、グローブ・ボックスから
取り出している間の不活性環境を維持した。次いで、ア
ンプルを直接真空ラインにつなげ、蒸発によりクロロホ
ルムをゆっくりと除去した。次いで、アンプルを約120
℃の油浴中においてすべての試薬を溶融状態とし、続い
て、火炎密封して、120℃に温度制御されたオーブン中
に28時間置いた。反応後、アンプルを液体窒素中に入れ
てクエンチし、さらに処理するまで−20℃で保存する。
アンプルにひびを入れ、粗製ポリマーをクロロホルムに
溶かして回収した。溶媒を蒸発により除去し、新製ポリ
マーを真空乾燥すると、黄褐色の結晶性物質が得られた
（収率は80％から90％）。
【０１００】このポリマーをクロロホルムに溶かし、不
溶の物質をろ過により除き、ヘキサン（Aldrich）で沈
殿させることにより精製した。ポリマーをろ過して回収
し、この手順を繰り返して、未反応単量体が完全に除去
されたことを確認した。２回の沈殿操作の後、ポリマー
を約２日間真空乾燥すると、全収率30％から35％で純粋
な白色の粉末が得られた。この物質の分子量は、反応時
間に左右されたが、代表的な値はMw＝17,000〜22,000、
Mn＝6,500〜8,000であった。示差走査熱量計（DSC）分
析は、ランダム無定形ポリマーを示す単一の転移を移
す。ガラス転移（Tg）は得られた物質の分子量により39
℃から43℃の範囲にある。ポリマーのセリン含有量は、
ポリマーの加水分解によって得られたフェニルチオイソ
シアネートセリン誘導体の測定に役立つアミノ酸分析
（AAA）、1H NMR（グリコリドおよびD,L−ラクチドサブ
ユニットに対するセリンCBZ保護基の芳香族残基の積
算）、および元素分析（セリンの側鎖にのみ存在する窒
素）により決定した。AAA分析は、通常1.7％から2.1％
セリン含有量を示し、1H NMRは、2.0％から2.5％、元素
分析は、2.4％から3.4％のセリンをそれぞれ示した。ポ
リマーのIR分析は、エステル、カーバメートおよびヒド
ロキシ基の存在を調べるのに役立った。
【０１０１】1H NMRは、記載した反応条件下におけるす
べての単量体成分の相対的取り込み効率の決定を可能に
した。精製ポリマーで測定されたD,L−ラクチド：グリ
コリド:Z−セリンの代表的な比は、再現性よく、それぞ
れD,L−ラクチド52.0％から54.0％、グリコリド41.0％
から43.5％、Ｚ−セリン2.0％から2.5％であった。
【０１０２】グリコリドまたはD,L−ラクチドに独特の
共鳴1H NMRおよび13C NMRシグナル強度は、互いと良く
分離し、配列効果にも感度がよかった。観測されたパタ
ーンから、ランダム配列分布が支持された。
【０１０３】実施例３:本実施例は、図１に示すポリ−
D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル（P
LGpS）共重合体の調製を例示する。すべてのガラス製器
具は、一昼夜予備乾燥した。使用に先立って、真空デシ
ケータ中で冷却し、乾燥窒素流で10分間通気した。すべ
ての反応は乾燥窒素の不活性雰囲気中で行った。撹拌棒
を備えた２頸の100mL丸底フラスコにポリマー（PLGpZ
S）400mgを入れた。これに、臭化水素の30％酢酸溶液
（Aldrich;FW:80.92）10mLを加え、十分にスラリを生成
させた。このスラリを30から45分間撹拌し、無水ジエチ
ルエーテル（Aldrich）と、続いて、無水メタノール（A
ldrich）を滴下してクエンチした。その結果、ポリマー
沈殿が生じ、次いで、真空ろ過により単離した。粗製の
ポリマー沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、クロロホル
ム：ヘキサンから再沈殿させた。精製ポリマーを２日間
真空乾燥すると、全収率50％から60％で純粋な白色の粉
末が得られた。分子量は、Mw＝15,000〜18,000、Mn＝5,
000〜6,500の範囲にあった。CBZ基の脱保護速度は、HBr
/酢酸によるエステルバックボーンの競争的開裂より速
かった。しかし、これらの条件の下では、この試薬を用
いた結果として、分子量分布の広がり、および生成物の
分子量の減少がある。この傾向は、より短時間で反応を
行うことによって低減され、またはパラジウム炭素の存
在下、水素を用いる水素添加による保護基の除去により
この傾向を無くすことができる。DSC分析は、ランダム
無定形ポリマーを示す単一転移を示す。ガラス転移（T
g）は得られた物質の分子量により42℃から45℃の範囲
にある。ポリマーのセリン含有量は、ポリマーの加水分
解によって得られたフェニルチオイソシアネートセリン
誘導体の検出に役立つアミノ酸分析（AAA）および元素
分析（セリンの側鎖にのみ存在する窒素）により決定し
た。AAA分析は、通常1.4％から1.7％のセリン含有量を
示し、元素分析は、2.0％から2.7％のセリンをそれぞれ
示した。ポリマーのIR分析は、エステル、アミンおよび
ヒドロキシル基の存在を検出するのに役立った。
【０１０４】残存する保護ポリマーについての1H NMR
は、90％以上のＮ−カルボベンジルオキシ基がうまく除
去されたことを示した。より短い反応時間では、脱保護
の含有量は並行して減少する。精製ポリマーで測定され
たD,L−ラクチド：グリコリド:Z−セリン：セリンの代
表的な比は、再現性よく、それぞれD,L−ラクチド53.0
％から55.0％、グリコリド40.0％から43.0％、Ｚ−セリ
ン0.15％から0.25％およびセリン1.7％から2.1％であっ
た。
【０１０５】実施例４:本実施例は、実施例２および３
において合成されたコポリマーからのフィルムの生成を
説明する。フィルムを生成するために、50mgのポリ−D,
L−ラクチド−コ−グリコリド（PLG）（分子量＝31,00
0）、ポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド−コ−シュ
ード−Ｚ−セリンエステル（PLGpZS）（分子量＝20,00
0）、ポリ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド−コ−シュ
ード−セリンエステル（PLGpS）（分子量＝19,000）を
秤量し、10mLビーカー中に置いた。無水クロロホルム
（1mL）を添加して、コポリマーを溶解した。この溶液
を濾過し、ペトリディシュ中に置いた顕微鏡スライドに
滴下して添加した。次いで、ペトリディッシュを250mL
ビーカーで覆い、48時間にわたり、ゆっくりと確実にエ
バポレーションさせた。得られたフィルムは半透明であ
り、そして角度測定器を用いて行った接触角の測定はそ
れぞれ、PLGについて75゜、PLGpZSについて75゜、PLGpS
について68.2゜の平均値を与えた。従って、PLGおよびP
LGpZSコポリマーは疎水性が同等であるが、PLGpsコポリ
マーはわずかに親水性が高く、表面エネルギーも高いこ
とが判明した。
【０１０６】実施例５:本実施例は、PBSまたは抗原/PBS
をカプセル化する粒子形成のプロセスを説明する（ミク
ロスフェア形成）。
【０１０７】本明細書中に記載される微粒子形成のプロ
セスを説明する流れ図を図３に示す。具体的には、100m
gのコポリマーを、12mLのジクロロメタンに添加した。
これに、800μＬのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）溶液
または800μＬの、PBS中の非タンパク質分解性Hin−47
アナログ（典型的に、１〜2mg/mLの濃度）を添加した。
次いで、この混合物をホモナイズした（6,000rpmで20秒
間）。この混合物を、形成後、100mLのポリビニルアル
コール（PVA）の1.0％水溶液中に分散し、そして即座に
ホモジナイズして（8,000rpmで40秒間）、水中油中水の
二重乳濁液を形成した。PBSまたは典型的な抗原（Hin−
47/PBS）をカプセル化物として使用する場合の典型的な
サイズ分布を、図４を示す。多分散系の微粒子（部分
が、10ミクロン未満の大きさ）が、これらの条件下で形
成された。次いで、エバポレーションにより溶媒をゆっ
くりと除去し、ミクロスフェアを遠心分離によって回収
した。粒子を脱イオン水で洗浄し（５×）、次いでドラ
イアイス／アセトン浴中で凍結し、そして一晩凍結乾燥
して、ミクロスフェアの白色の自由に流動する粉末を得
た（光走査測定によって決定され、走査電子顕微鏡検査
によって直接的に確認されるように、典型的には、1.5
〜10ミクロンのサイズ）。PLGpZSまたはPLGpSミクロス
フェアについての代表的な走査電子顕微鏡写真を、図５
に示す。PBS中の典型的な抗原（非タンパク質分解性のH
in−47アナログ）をカプセル化する、PLGpZSまたはPLGp
Sミクロスフェアについての代表的な走査電子顕微鏡写
真を、図６に示す。
【０１０８】上記の方法によって、いくつかの異なる抗
原および／または抗原＋アジュバントを含む微粒子が調
製された（表１および５を参照のこと）。 実施例６:この実施例は、微粒子コアローティング効
率、およびこのような微粒子からの抗原エピトープの回
復を説明する。同じ方法の２つの改変を用いて、単離さ
れた微粒子の抗原含量または「コアローディング」を測
定した。アミノ酸解析を、固体粒子の酸加水分解（6M H
Cl）によるか、または塩基/SDS加水分解（0.1N NaOH/1
％SDS）のいずれかによって、次いで0.1N HClでの中和
化によって、得られた微粒子の加水分解物に対して行っ
た。あるいは、固体のミクロスフェアは、DMSO（ポリマ
ーおよびタンパク質の両方を可溶化する相溶性の溶媒）
中に溶解することができ、アミノ酸解析を、凍結乾燥さ
れたサンプルに対して直接行うことができる。酸または
塩基媒介性の加水分解は、最も再現可能な結果（＋／−
5％）を与える好ましい方法であることを証明した。利
用可能な場合、有効な固相酵素免疫検定法（ELISA）ポ
リクローナルアッセイが加水分解物に対して行われ、エ
ピトープ当量を決定した。
【０１０９】具体的には、ELISAによる非タンパク質分
解性Hin−47アナログの定量について、非タンパク質分
解性Hin−47アナログ抗原を、アフィニティー精製した
モルモット抗Hin−47が被覆されたマイクロタイターウ
ェル上に捕獲し（ウエル当たり非タンパク質分解性Hin
−47アナログ抗原の２μg/mL溶液の50μＬを添加し
た）、これをPBS中の５％スキムミルクでブロックし
た。抗原の呈示を、アフィニティー精製したウサギ抗Hi
n−47、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼＦ（abs）
２、ロバ抗ウサギIgGによって検出した。テトラメチル
ベンジジン（TMB）（割合１）の存在下の基質H2O2（割
合９）を100μＬ添加して、この反応を呈色し、そして2
M硫酸溶液を各ウエルに添加することによって、反応の
進行を終結した。色の強度（450nmでの読取り）は、ウ
エルにおける非タンパク質分解性Hin−47アナログの量
に正比例した。各試験サンプルにおける非タンパク質分
解性Hin−47アナログの濃度は、参照サンプルの倍数希
釈によって得られる標準曲線からの外挿によって得られ
た、全てのサンプルを、二連で分析した。
【０１１０】PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内に
非タンパク質分解性Hin−47アナログまたは非タンパク
質分解性Hin−47アナログ＋BAY R1−005をカプセル化す
る微粒子に対するエピトープ回復の、コアローディング
についてのアミノ酸解析、およびHin−47特異的ポリク
ローナルELISA分析を、表２に示す。Hin−47から単独で
調製された微粒子についてのコアローディングは、20％
〜43％の範囲であり、10％〜31％のエピトープが、処方
の間に保存された。BAY R1−005の存在下で非タンパク
質分解性Hin−47アナログから調製された微粒子につい
てのコアローディングは、26％〜59％の範囲（６％〜16
％の絶対増加）であり、20％〜39％（４％〜18％の絶対
増加）のエピトープが、処方の間に保存された。従っ
て、BAY R1−005の存在下での処方は、付随して、ロー
ディング効率を増加し、エピトープを保護するために作
用する。
【０１１１】PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内に
rD−15をカプセル化する微粒子についてのコアローディ
ングのアミノ酸解析を、表３に示す。39％〜44％の範囲
のコアローディングが得られた。このタンパク質は、膜
由来であり、従って、以前の実施例の非タンパク質分解
性Hin−47アナログよりも疎水性である。この抗原を使
用する場合、実施例10の非タンパク質分解性Hin−47ア
ナログに対して増加されたカプセル化効率が、常に観察
された。
【０１１２】PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内
に、非タンパク質分解性Hin−47アナログとrD−15との
カクテル（1:1のカクテル）をカプセル化する微粒子に
対する、コアローディングについてのアミノ酸解析、お
よびエピトープ回復を、表３に示す。rD−15の存在下で
の非タンパク質分解性Hin−47アナログの同時カプセル
化は、より高い全体のローディング効率を生じることが
予測された。35％〜62％の範囲のコアローディングが得
られ、８％〜26％の、非タンパク質分解性Hin−47アナ
ログを使用たエピトープが、処方の間保存された。PLGp
ZSまたはPLGpSコポリマーで処方される場合、より親水
性の成分（非タンパク質分解性Hin−47アナログ）の全
体のローディング効率は、rD−15との同時カプセル化に
よって増加された。PLGを使用した場合、この効果は観
察されなかった。コポリマー処方に関係なく、実施例10
と比較して、類似の非タンパク質分解性Hin−47アナロ
グのエピトープ回復が得られた。
【０１１３】PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリ−マー内
に、Flu X−31またはFlu X−31＋BAY R1−005をカプセ
ル化する微粒子についての、コアローディングのアミノ
酸解析を、表４に示す。26％〜40％の範囲のコアローデ
ィングが、Flu X−31で得られ、そしてBAY R1−005の存
在下のFlu X−31については、31％〜953％の範囲のコア
ローディングが得られた。従って、５％〜13％の絶対増
加が、BAY R1−005の存在下で処方した場合に得られ
た。唯一の例外は、BAY R1−005およびPLGpSとのFlu X
−31の処方であり、ここでは９％の絶対減少を観察し
た。
【０１１４】Flu A−Texasをカプセル化するPLGpS微粒
子についての21％コアローディングが得られた。BAY R1
−005の存在下でFlu A−Texasをカプセル化するPLGps微
粒子について、32％のコアローディングが得られた。
【０１１５】Fluの異なる系統（Ａ−Texas）を、BAY R1
−005およびPLGpSコポリマーとともに用いた場合、カプ
セル化効率を増加する傾向がまた観察された。BAY R1−
005の存在下でFlu A−TexasとともにPLGpSを処方する場
合、11％の絶対増加が得られた。これは、BAY R1−005
の存在下でのPLGpSおよびタンパク質についての処方
は、各場合において最適化されなくてはならなことを示
唆する。実施例10におけるように、コアジュバントのBA
Y R1−005の添加は、より高いローディング効率を生じ
た。
【０１１６】PLGpsコポリマー内にFlu（３価）ワクチン
またはFlu（３価）ワクチンと、BAYR1−005、DC−Cho
l、またはPCPPとをカプセル化する微粒子についての、
コアローディングのアミノ酸解析を、表６に示す。72％
〜104％の範囲の非常に優れたコアローディング効率
は、実施例５の手順を使用して得られた。カプセル化率
における改良は、至適な濃度のタンパク質が使用されて
主な乳濁液が形成される場合に視察される、一般的な結
果である。この場合において、至適な濃度は約0.5mg/mL
であることが、実験的に決定された。
【０１１７】コポリマー内に、rUrease、またはrUrease
＋DC−Chol、PCPP、もしくはCT−Ｘをカプセル化する微
粒子に対するエピトープ回復の、コアローディングにつ
いてのアミノ酸解析、およびrUrease特異的ポリクロー
ナルELISA分析を、表７に示す。エピトープ回復は、ア
ミノ酸解析によって得られる全タンパク質と、ポリクロ
ーナルELISAによって得られる全タンパク質との差とし
て規定され、パーセントで表現される。rUreaseから単
独で調製された微粒子についてのコアローディングは約
46％であり、約72％のエピトープが、処方の間に回復さ
れた。同様に、DC−Cholの存在下でrUreaseから調製さ
れる微粒子についてのコアローディングは約44％であ
り、約69％のエピトープが回復された。わずかに高い全
タンパク質が、PCPPの存在下でrUreaseから調製された
微粒子について確定された。67％のコアローディングお
よび約55％のエピトープ回復が、この組み合わせについ
て観察された。rUreaseおよびCT−Ｘの両方がこの値に
寄与するので、rUrease/CT−Ｘの組合せに関しては、rU
reaseについての全体のコアローディングは、アミノ酸
解析によって評価することができなかった。CT−Ｘにつ
いてのポリクローナルELISAアッセイを創出し、微粒子
加水分解物を、全体のrUreaseおよびCT−Ｘのそれぞれ
について、アッセイした。rUreaseについて53％の、お
よびCT−Ｘについて59％のエピトープ回復が、それぞれ
見出された。これらの微粒子加水分解物に対して行われ
たSDS−PAGEおよびウェスタンブロットによって、非分
解のrUreaseおよびCT−Ｘの存在が確認された。
【０１１８】rUreaseについてのポリクローナルELISAア
ッセイが、DC−CholおよびPCPPのような付加物によって
影響されなかったことを確認するために、適切なコント
ロール試験を行った。PCPPの場合、アッセイは、しばし
ば問題があり、一定ではなかった。DC−Cholの存在下で
rUreaseをアッセイした場合は、同様な問題はなにも見
出されなかった。
【０１１９】実施例７:この実施例は、PLG（比較の目的
のためにコントロールとして使用した）および合成され
たコポリマーPLGpZSおよびPLGps内にカプセル化され
た、モデル抗原（非タンパク質分解性Hin−47アナロ
グ）についてのインビトロ放出速度、およびタンパク質
の全体の累積回復％を説明する。
【０１２０】抗原を含有するミクロスフェア内に処方さ
れたPLGは、分子量＝26,000であり、50:50の割合のD,L
−ラクチド：グリコリドを有することが確定された。こ
の物質は、実施例２および３のコポリマーPLGpZSおよび
PLGpSについて得られたものに、構成および分子量が類
似する。典型的な実験において、14mgのミクロスフェア
（ミクロスフェア加水分解物のアミノ酸分析によって確
定されるように、非タンパク質分解性Hin−47アナログ
のコアローディングは、PLGについて2.8μg/mg、PLGpZS
について5.7μg/mg、およびPLGpSについて2.5μg/mg）
を、2mLのエッペンドルフチューブ中に置き、これに1.0
mLのPBS（pH＝7.4）を添加した。次いで、37℃に維持し
た熱調節化オーブンに、攪拌しないでチューブを置い
た。種々の時間間隔で、PBS溶液を抽出して、そしてア
ミノ酸解析により、全タンパク質について分析した。各
抽出後、PBS溶液は、最大90日まで、連続してサンプリ
ングと置き換えられた。コントロール実験において、PL
GまたはPLGpSコポリマーから調製された大部分のミクロ
スフェア（80重量％を超える）が、45日目までに消滅し
た。PLGpZSコポリマーから処方された、ミクロスフェア
の分解は、いくらか遅延され、本質的に同じ程度まで侵
食されるまでに60日を要した。
【０１２１】各群の微粒子で同様の抗原放出傾向が観察
され、ここでは少量のタンパク質が、最初の数日にわた
って放出された。これは、14日目までに、抽出できない
限界近くまで減少し、これ以後、タンパク質放出速度
は、約30日目での最大値まで、着実に増加した。この時
点以後、タンパク質の放出は、再び検出の限界に近接す
るレベルになった。これらのサンプルからのタンパク質
の全体の累積回復％は、各群のミクロスフェアのそれぞ
れのコアローディングに関して、40％〜65％の範囲であ
った。
【０１２２】図7Aは、各サンプルについての特定の時点
での放出速度を説明し、および図7Bは、試験した各サン
プルについての累積放出％を示す。これらの条件下で、
ミクロスフェアからのタンパク質の最も良好な回復は、
PLGpS/PLG/PLGpZSの順であるが、PLGpZS微粒子のコアロ
ーディングは、PLGまたはPLGpSアナログのコアローディ
ングの約２倍であり、これは放出速度を影響し得る。さ
らに、このマトリクスは、より遅延された速度で分解さ
れることが示され、従って、微粒子内に残留物質が存在
し得る。このことについての証拠は、図7Bにおいて見る
ことができ、これによってタンパク質回復の限界増加
が、PLGpZS微粒子について、60日目〜90日目に観察され
た。この同じ時間間隔にわたって、PLGまたはPLGpS微粒
子から回復されたタンパク質は、本質的に存在しなかっ
た。
【０１２３】コントロール実験において、37℃でインキ
ュベートされた、PLG、PLGpZS、またはPLGpS微粒子を負
荷されたPBSの定期的な抽出物から得られたPBSの上清溶
液を、pH変化についてモニターした。PLGAマトリクスに
ついての侵食プロセスには、微粒子内のpH微環境の変化
が伴うことが知られている（参考文献36）。これらの変
化の結果として、pH誘導性の構造変化が生じ得るので、
これはタンパク質の安定性に対して重大な影響を有し得
る。これらの変化の大きさの指標は、周囲の媒体のpHを
モニターすることによって得ることができる。本発明者
らは、コポリマー内の小さなパーセントのアミノ酸サブ
ユニットの取込みが、このプロセスを遅延し得ることを
見出した。このことは、酸性pHに感受性であるタンパク
質の放出期に重要である。具体的には、1.2mLのPBS緩衝
液（pH＝7.4）中の〜10mgの微粒子をインキュベートす
る場合、PLG（分子＝26,000ダルトン）の上清抽出物
が、pH5.0以下になるために、約16日間を必要とする。
類似して、PLGpZS（分子量＝20,000ダルトン、約2,0％
のセリンを混入）、またはPLGpS（分子量＝18,000ダル
トン、約1.7％のセリンを混入）から得られた上清抽出
物のpHは、それぞれ、約5.5〜6.2であると確定された。
この研究において試験されたPLGおよびPLGpSについての
分解速度は同様であったが（マトリクスの質量損失によ
って測定される）、PLGpSマトリクスの分解速度は減少
した。
【０１２４】従って、インビトロ放出研究は、単一用量
の遅延された放出送達系が、PLGpZSまたはPLGpSコポリ
マーから処方されたポリマーの微粒子の使用により達成
され得ることを実証する。さらに、マトリクス侵食を伴
うpH変化は、タンパク質安定性に対する有害な影響を有
し得るので、偽生理食塩水エステル（例えば、PLGpZSま
たはPLGpS）に由来するマトリクス（ここではタンパク
質放出期のこれらの変化について、いくらかの緩衝能力
が存在する）を使用することが有利である。
【０１２５】実施例８:本実施例では、微粒子でカプセ
ル化または微粒子と物理的に混合した非蛋白分解性Hin
−47類似体をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性
を説明する。本発明にしたがって形成させたPLG、PLGpZ
SおよびPLGpS微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Hin−47
類似体を試験するために、以下の量の抗原をPBS（pH7.
4）250μＬに溶解させ、試験１日および試験35日目に６
〜８週齢のBALB/c系マウス（Charles River Breeding L
aboraTories,Wilmington,MA）雌１群５匹に皮下（S.
C.）免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、非蛋
白分解性Hin−47類似体0.2μｇまたは0.6μｇを含むPL
G、PLGpZSおよびPLGpS微粒子（図8A）、および実施例５
にしたがって調製し、非蛋白分解性Hin−47類似体0.8μ
ｇまたは2.5μｇと物理的に混合したPLG微粒子（図8
B）。
【０１２６】カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似
体を含む微粒子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物
理的に混合した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病
理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋1
0、＋24、＋35、＋45および＋60日に血清を採取し、抗
原特異性ELISAを用い、抗Hin−47IgG抗体の有無を評価
した。試料は、全て２回分析した。0.2μg/mLの非蛋白
分解性Hin−47類似体を含む0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝
液（pH9.0）100μＬをミクロタイタープレートのウエル
に添加し、室温で１夜インキュベーションした。PBS＋
0.05％Tween20（機能上、洗浄緩衝液と定義する）でプ
レートを洗浄した。ウエルに５％スキムミルク200μＬ
（機能上、ブロッキング緩衝液と定義する）を加えて、
インキュベーションした。PBS＋0.05％Tween20で洗浄し
た後、ブロッキング緩衝液で逐次希釈した試料100μＬ
をウェルに添加し、37℃で１時間インキュベーションし
た。ウェルをPBS＋0.05％Tween20で洗浄し、HRP−共役
抗体（ヤギ抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）（Jackson）、ヒツジ
抗マウスIgG1（Serotec），ヤギ抗マウスIgG2a（Calta
g）またはヤギ抗マウスIgG2b（Caltag））を加えたブロ
ッキング緩衝液100μＬを各ウエルに添加した。37℃で
１時間インキュベーションした後、PBS＋0.05％Tween20
でウエルを５回洗浄した、新たに調製した発色用基質
〔H2O2 9部およびTMB1部〕を各ウエルに添加した。暗
黒下の室温で５分間インキュベーションした後、2M H2S
O4溶液50μＬを添加して反応を停止させ、ミクロプレー
トリーダーを用いて各ウェル中の液体の吸光度を450nm
で測定した。正常なマウスのプール血清を用いて、分析
における吸光度のベースラインを確定した。陽性対照と
して、高度免疫性マウスのHin−47抗血清を用いた。陰
性対照として、免疫投与前血清を用いた。
【０１２７】血清IgAの分析は、上記の方法を以下のよ
うに改良して行った。1.3μg/mLの非蛋白分解Hin−47類
似体を含む0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH＝9.0）10
0μＬをミクロタイタープレートのウェルに注入して、
室温で１夜インキュベーションし、0.06μg/mLのウサギ
のH R B接合抗マウスIgA（ZYMED、CA）100μＬを各ウェ
ルに添加した。
【０１２８】分泌型IgAの分析は、上記の方法を以下の
ように改良して行った。0.06μg/mLのラットのHRP共役
抗マウスIgA（Biotin−Pharmigen）100μＬを各ウエル
に添加した。免疫投与後の血清抗体の力価を図8Aおよび
8Bに示す。免疫投与の結果から、PLGまたはPLGpS微粒子
（図8A）に捕捉させた抗原を免疫システムに提供する
と、可溶性抗原単独の場合に要求される最適用量以下
で、可溶性抗原に比較して免疫原性が高くなることが認
められた。さらに、投与量0.2μｇまたは0.6μｇのカプ
セル化非蛋白分解性Hin−47類似体では、投与量依存性
は認められなかったが、投与量0.8μｇまたは2.5μｇの
可溶性非蛋白分解性Hin−47の場合には、わずかながら
力価の増大が認められた。
【０１２９】免疫投与の結果から、抗原をPLG微粒子と
物理的に混合して免疫システムに提供すると（図8B）、
可溶性抗原単独の場合と同じ用量（0.8μｇまたは2.5μ
ｇ）で、可溶性抗原に比較して免疫原性がわずかに高く
なることが認められた。しかし、溶解状態または微粒子
と混合した形態で投与すると、微粒子でカプセル化した
抗原よりも数桁小さい反応が誘導されたに過ぎなかった
ことから、カプセル化すると溶解状態または物理的混合
よりも利点のあることが立証された。
【０１３０】興味あることに、非蛋白分解性Hin−47類
似体をカプセル化させた微粒子、非蛋白分解性Hin−47
類似体を物理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分
解性Hin−47類似体を投与し、試験35日および試験60日
目に採取した血液プールのIgGサブタイプのプロフィー
ル（図8C）から、試験35日目までは、製剤に関係なく、
IgG1が優勢なサブタイプであり、ほかに少量のIgG2bが
検出された。試験60日目には、微粒子でカプセル化した
非蛋白分解性Hin−47類似体で誘導されるIgGサブタイプ
にクラススイッチがみられ、IgG1、IgG2aおよびIgG2bに
量的な差は認められなくなった。微粒子と物理的に混合
させた非蛋白分解性Hin−47類似体は、また溶解させた
同類似体によって産生されるIgGサブタイプの種類は、
試験35日目に測定した場合と実質的に同じで、IgG1サブ
タイプが優勢であった。
【０１３１】以上のように、微粒子カプセル化抗原によ
ってもたらされる免疫反応には、物理的に混合した微粒
子または可溶性抗原のみの場合とは質的にかなり異なる
と結論される。BABLB/c系マウスにおけるIgG2aサブタイ
プの存在はTH1経路を示唆し、IgG1の存在はTH2経路を示
唆していると一般的に考えられている。皮下免疫投与の
場合、可溶性抗原または微粒子と物理的に混合した抗原
ではTH2経路が優勢であり、一方微粒子でカプセル化し
た抗原では比較的バランスのとれたTH1/TH2反応が得ら
れる。
【０１３２】実施例９:本実施例では、本発明にしたが
って形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉さ
せた非蛋白分解性Hin−47類似体をマウスに胃内免疫投
与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗原を0.
15M NaHCO3（pH9.0）250μＬに溶解させ、試験１、７、
14および57日目に６〜８週齢のBALB/c系マウス（Charle
s RiverBreeding Laboratories,Wilmington,MA）雌１群
５匹に胃内（I.G.）免疫投与した：実施例５にしたがっ
て調製し、非蛋白分解性Hin−47類似体4.0μｇを含むPL
G、PLGpZSおよびPLGpS微粒子、および実施例５にしたが
って調製し、非蛋白分解性Hin−47類似体4.0μｇと物理
的に混合したPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子（図9A）。
カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体を含む微粒
子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合し
た微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または
行動の変化は認められなかった。試験、＋13、＋35、＋
65および＋78日に血清を採取し、実施例８に示す抗原特
異性ELISAを用い、抗Hin−47IgGおよびIgA抗体の有無を
評価した。
【０１３３】血清および腸内洗浄液について、Hin−47
特異性抗体の有無を調べた。腸管内の抗Hin−47IgGおよ
びsIgAを検出し定量するために、頚椎脱臼法によりマウ
スを屠殺し、小腸を摘出し、抗原特異性抗体の有無を調
べた。各小腸を幽門括約筋から盲腸の間で摘出し、毛細
管を挿入して反転させた。水冷した酵素阻害剤溶液（0.
15M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.005M EDTA、0.002M PMS
F、0.05U/mLアプロチニンおよび0.02％v/v NaN3）5mLに
反転させた腸管を浸漬し、４時間インキュベーションし
た。小腸を除去し、遠心分離（1000×ｇ、20分間）によ
り上清を分取し、分析するまで０℃で保存した。上記の
Hin−47特異性ELISAを用い、試料中の抗Hin−47IgGおよ
びsIgA力価を測定した。ただし、ヤギ抗マウスIgG抗血
清の代わりにヤギ抗マウスIgA抗血清を使用した。
【０１３４】I.G.免疫投与後の血清IgG Hin−47特異性
抗体の力価を図9Aに示す。これらの結果から、腸内投与
の場合、PLG、PLGpZSまたはPLGpS微粒子に結合した抗原
（非蛋白分解性Hin−47類似体）は、同量（４μｇ）の
可溶性抗原に比較してかなり高い免疫原性を示し、微粒
子と物理的に混合した抗体よりも優れていることが認め
られた。可溶性抗原から本質的に同等の反応を誘導させ
るためには、微粒子でカプセル化して投与した抗体（４
μｇ）の５倍の用量（20μｇ）が必要であることを実験
的に確認した。腸内投与によって血清IgG抗体の顕著な
反応を誘導するためには、100μｇを超える抗原を必要
とする例が多いので、ほとんどすべての蛋白質につい
て、この結果は例外的である。
【０１３５】非蛋白分解性Hin−47類似体をカプセル化
た微粒子、非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合
した微粒子または可溶性非蛋白分解性Hin−47類似体を
投与して、試験56日および試験78日目に採取した血液か
ら得られた血清のIgGサブタイプのプロフィール（図9
B）では、実施例８で確認した傾向と似た傾向が認めら
れた。抗原を溶解状態または微粒子と混合した形態で投
与すると、IgG1サブタイプが優勢である。微粒子でカプ
セル化した非蛋白分解性Hin−47類似体の場合は、IgG1
およびIgG2aがほぼ等しく生成し、バランスのとれたプ
ロフィールが認められた。このように、微粒子でカプセ
ル化した抗原の胃経由投与により、比較的バランスのと
れたTH1/TH2反応が得られた。
【０１３６】試験78日目の採血から得られた抗Hin−47I
GA抗体反応の結果を図9Cに示す。１回量が４μｇの可溶
性抗原の場合は、検出可能な血清IgAを確認することが
できなかった。しかし、１回量が20μｇでは、反応を示
す例が少数認められた。顕著な反応が認められたのは、
PLG微粒子でカプセル化した抗原の場合であり、PLGpZS
またはPLGpS微粒子でカプセル化した抗原に対しては、
中程度の反応が認められた。PLG、PLGpZSまたはPLGpS微
粒子と物理的に混合した抗原については、同様に穏やか
な反応が認められた。PLGpS微粒子でカプセル化した抗
原の場合に、血清IgAの平均濃度が最も高かった。
【０１３７】PLG、PLGpZSまたはPLGpS微粒子でカプセル
化した非蛋白分解性Hin−47類似体に特異的なIgGまたは
sIgAの濃度が最も低かったのは、試験78日目に行った腸
管洗浄の場合であった。これは、恐らくこの実験に供し
たカプセル化抗原の濃度が非常に低かった（１回量４μ
ｇ）ためである。経口投与の場合、他の粘膜アジュバン
トが存在しない状態で粘膜の顕著な反応を誘導するため
には、通常30〜100μｇの範囲の抗原が必要である。
【０１３８】実施例10:本実施例では、本発明にしたが
って形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉さ
せた非蛋白分解性Hin−47類似体の、マウスに鼻腔内免
疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗原
をPBS（pH7.4）25μＬに溶解させ、試験１、７、14およ
び57日目に６〜８週齢のBALB/c系マウス（Charles Rive
r Breeding Laboratories,Wilmington,MA）雌１群５匹
に鼻腔内（I.N.）免疫投与した：実施例５にしたがって
調製し、非蛋白分解性Hin−47類自体4.0μｇを含むPL
G、PLGpZSおよびPLGpS微粒子、および実施例５にしたが
って調製し、非蛋白性Hin−47類似体4.0μｇと物理的に
混合したPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子（図10A）。
【０１３９】カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似
体を含む微粒子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物
理的に混合した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病
理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋1
3、＋35、＋56および＋78日に血清を採取し、実施例８
に示す抗原特異性ELISAを用い、抗Hin−47IgGおよびIgA
抗体の有無を評価した。血清および肺洗浄液についてHi
n−47特異性抗体の有無を調べた。気道中の抗Hin−47Ig
GおよびsIgAを検出し定量するために、頚椎脱臼法によ
りマウスを屠殺し、気管に小さな切り口を作り、チュー
ブを気管から肺に挿入し、400μＬの酵素阻害剤溶液
（0.15M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.005M EDATA、0.002M
PMSF、0.05U/mLアプロチニンおよび0.2％v/v NaN3）を
肺に注入した。次いでこの溶液を抜き取り、氷上に置
き、遠心分離（1000×ｇ、20分間）により上清を分取
し、分析するまで０℃で保存した。実施例８に示すHin
−47特異性ELISAを用い、試料中の抗Hin−47IgGおよびs
IgA力価を測定した。
【０１４０】I.N.免疫投与後の血清IgG Hin−47特異性
抗体の力価を図10Aに示す。これらの結果から、PLG、PL
GpZSまたはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原（非蛋
白分解性Hin−47類自体）は、同程度の用量（４μｇ）
の可溶性抗原に比較して高い免疫原性を有することが認
められた。鼻腔経由で投与した場合、カプセル化した抗
原および微粒子と物理的に混合した抗原では、本質的に
同程度の反応が得られた。
【０１４１】非蛋白分解性Hin−47類似体をカプセル化
した微粒子、非蛋白分解性Hin−47類似体を物理的に混
合した微粒子または可溶性非蛋白分解性Hin−47類似体
を投与し、試験56日および試験78日目に採取したプール
血液のIgGサブタイプのプロフィール（図10B）からは、
実施例８または実施例９に示した傾向とは異なった傾向
が認められた。微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Hi
n−47類似体の場合、いずれの検査時期（試験56日目ま
たは試験78日目）にもIgG1、IgG2aおよびIgG2bが本質的
に同程度存在し、他に比較してバランスの取れたプロフ
ィールが認められた。溶解状態または微粒子と物理的に
混合した形態で投与した抗原に関しては、試験78日まで
に類似のプロフィールが認められ、顕著な濃度のIgG2a
も確認することができた。
【０１４２】このように、鼻腔経由で投与した場合、抗
原が微粒子内にカプセル化されているか、微粒子と物理
的に混合されているか、溶解した形態であるにかかわら
ず、TH1/TH2反応は本質的に同じであった。試験78日目
の採血から得られた抗Hin−47IgA抗体についての結果を
図10Cに示す。可溶性抗原に関しては、血清IgGは検出で
きなかった。しかし、微粒子でカプセル化または微粒子
と物理的に混合した抗原の場合には、顕著な反応が認め
られた。PLGpS微粒子でカプセル化した抗原、またはPLG
pS微粒子と物理的に混合した抗原の場合に、最も高い濃
度が得られた。
【０１４３】試験78日目に行った肺洗浄では、分泌物か
ら検出したIgGおよびsIgAに関してかなりの差が認めら
れた。可溶性抗原からの抗Hin−47IgG抗体反応（図10
D）は、無視できる程度であったが、微粒子でカプセル
化またはPLG微粒子と物理的に混合した抗原では、検査
した各群の半数の動物から顕著な濃度のIgGが確認され
た。PLGpZSまたはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原
では最も再現性の高いIgG反応が認められ、検査したほ
とんどまたは全てのマウスで顕著な濃度のIgGが認めら
れた。
【０１４４】抗Hin−47sIgA抗体反応（図10E）は、図10
Dに示すIgGで得られた反応と類似していた。可溶性抗原
の反応は無視できる程度であり、PLG微粒子でカプセル
化またはPLG微粒子と物理的に混合した抗原ではある程
度の反応が認められた。PLGpZSまたはPLGpS微粒子と物
理的に混合した抗原では最も顕著なsIgA反応が認めら
れ、大部分のマウスでかなりの濃度のsIgAが検出され
た。
【０１４５】粘膜表面に局部的な防護を誘導すると、し
ばしば局部分泌物中にIgGおよびsIgAが検出される。鼻
腔免疫投与しても上気道に免疫を誘導しないという可能
性を否定することはできないが、微粒子でカプセル化ま
たは微粒子と混合した抗原は血清IgG抗体反応を誘導す
ることは明らかである。IgGおよびsIgAを局部的に誘導
するためには、微粒子、特にPLGpZSまたはPLGpS微粒子
と抗原を物理的に混合することがこれらの条件下で比較
的適した方法であると思われる。
【０１４６】実施例11:本実施例では、本発明にしたが
って形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉さ
せたFlu Ｘ−31またはFlu Ｘ−31＋co−アジュバントBA
Y R1−005をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性
を説明する。
【０１４７】以下の量の抗原をPBS（pH7.4）250μＬに
溶解させ、試験１日目に６〜８週齢のBALB/c系マウス
（Charles River Breeding Laboratories,Wilminton,M
A）雌１群６匹に皮下（S.C.）免疫投与した：実施例５
にしたがって調製し、5.0μｇのFlu Ｘ−31（HA 1.5μ
ｇ）または5.0μｇのFlu Ｘ−31（HA 1.5μｇ）＋50μ
ｇのBAY R1−005（溶液投与）または約20μｇのBAY R1
−005（co−カプセル投与）を含むPLG、PLGpZSおよびPL
GpS微粒子（図11）。
【０１４８】カプセル化したFlu Ｘ−31またはFlu Ｘ−
31＋BAY R1−005を含む微粒子を投与しても、マウスに
肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。
試験＋21および＋33日に血清を採取し、実施例８に示す
抗原特異性ELISAを用い、抗Flu Ｘ−31IgG抗体の有無を
評価した。試料は、全て２回分析した。4.0μg/mLのFlu
Ｘ−31を含む0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH9.6）5
00μＬをミクロタイタープレートのウェルに添加し、室
温で１夜インキュベートした。PBS＋0.05％Tween20（機
能上、洗浄緩衝液と定義する）でプレートを洗浄した。
ウェルに５％スキムミルク200μＬ（機能上、ブロッキ
ング緩衝液と定義する）を添加して、インキュベーショ
ンした。PBS＋0.05％Tween20で洗浄した後、ブロッキン
グ緩衝液で逐次希釈した試料100μＬをウェルに添加
し、37℃で１時間インキュベーションした。ウェルをPB
S＋0.05％Tween20で洗浄し、HRP−共役抗体（ヤギ抗マ
ウスIGG（Ｈ＋Ｌ）、IgG1、IgG2aまたはIgG2b）を加え
たブロッキング緩衝液100μＬを各ウェルに添加した。3
7℃で１時間インキュベーションした後、PBS＋0.05％Tw
een20でウェルを５回洗浄し、新たに調製した発色用基
質〔H2O2 9部およびTMB1部〕を各ウェルに添加した。
暗黒下の室温で５分間インキュベーションした後、2M H
2SO4溶液50μＬを添加して反応を停止させ、ミクロプレ
ートリーダーを用いてウェル中の液体の吸光度を40nmで
測定した。正常なマウスの血液プールを用いて、分析に
おける吸光度のベースラインを確定した。陽性対照とし
て、高度免疫性マウスのFlu Ｘ−31抗血清を用いた。陰
性対照として、免疫投与前血清を用いた。
【０１４９】免疫投与後の血清抗体の力価を図11に示
す。１回の免疫投与（試験１日目）の結果から、抗原を
PLGまたはPLGpS微粒子に捕捉させて免疫システムに提供
すると、可溶性抗原単独の場合に比較して免疫原性が高
くなることが認められた。PLGpZS微粒子でカプセル化し
たFlu Ｘ−31またはFlu Ｘ−31＋BAY Rl−005で、最も
顕著な結果が得られた。試験した全ての微粒子で最適用
量以下の用量のBAY R1−005をカプセル化したが、PLGpZ
S微粒子では可溶性Flu Ｘ−31およびBAY R1−005単独の
場合に比較して免疫原性反応が顕著に高くなることが認
められた。本実施例に示した試験によって、本発明にた
がって調製した微粒子に抗原を捕捉させると、インフル
エンザビールスから得られたビールス性抗原の免疫原性
が高く、高濃度の血清IgG抗体を産生した、さらに、微
粒子システムを一回だけ免疫投与した場合でも、免疫原
性が他の場合に比較して顕著に増進したことから、これ
らの材料で単回投与ワクチンを開発することができると
考えられる。
【０１５０】実施例12:実施例では、本発明にしたがっ
て形成させたPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させ
たFlu−Ｘ−31またはFlu−Ｘ−31＋co−アジュバントの
マウスに鼻腔内免疫投与したときの免疫原性を説明す
る。
【０１５１】以下の量の抗原をPBS（pH7.4）25μＬに溶
解させ、試験１日および試験34日目に６〜８週齢のBALB
/c系マウス（Charles River Breeding Laboratories,Wi
lmington,MA）雌１群６匹に鼻腔内（I.N.）免疫投与し
た：実施例５にしたがって調製し、5.0μｇのFlu−Ｘ−
31（HA 1.5μｇ）または5.0μｇのFlu−Ｘ−31（HA 1.5
μｇ）＋50μｇのBAY R1−005（溶液投与）または約20
μｇのBAY R1−005（co−カプセル投与）を含むPLG、PL
GpZSおよびPLGpS微粒子（図12）。カプセル化したFlu−
Ｘ−31またはFlu−Ｘ−31＋BAY R1−005を含む微粒子を
投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化
は認められなかった。試験＋21、＋33および＋92日に血
清を採取し、実施例10に示す抗原特異性ELISAを用い、
抗Flu−Ｘ−31IgG抗体の有無を評価した。試料は、全て
２回分析した。可溶性抗原、可溶性抗原＋co−アジュバ
ントまたはカプセル化抗原を鼻腔内免疫投与したマウス
で、同程度の抗Flu−Ｘ−31IgG抗体反応が認められた。
興味あることに、カプセル化抗原＋co−アジュバントで
は、鼻腔経由で投与した場合、試験＋21日および＋33日
に可溶性抗原、可溶性抗原＋アジュバントまたはカプセ
ル化抗原と比較して免疫反応の低下（放出遅延によるも
のと思われる）が認められた。しかし、２回目の免疫投
与後（試験34日）には、これらの群でも顕著な反応の上
昇が認められ、試験＋92日には用いたアジュバントには
関係なく、基本的に同じ程度の免疫原性が認められた。
【０１５２】本実施例で記載した鼻腔内免疫投与の結果
から、本発明に係わる微粒子に捕捉させても、抗原また
は抗原＋CO−アジュバントの免疫原性には顕著な増進が
認められなかった。
【０１５３】実施例13:本実施例では、微粒子でカプセ
ル化または物理的に微粒子と混合したFlu−Ａ−Texasま
たはFlu−Ａ−Texas＋BAY R1−005をマウスに皮下免疫
投与したときの免疫原性を説明する。ほとんどの非複製
ウイルスワクチンは、防御効果のある十分な血清抗体力
価を得るために反復投与が必要であることは公知であ
る。したがって、抗原を単回投与することによって同様
な効果を上げることが強く望まれている。
【０１５４】我々は、本発明にしたがって形成されたPL
GpS微粒子に捕捉させ、または微粒子と物理的に混合し
たFlu−Ａ−TexasまたはFlu−Ａ−Texas＋co−アジュバ
ントを単回投与したときの免疫原性を検討した。以下の
量の抗原をPBS（pH7.4）250μＬに溶解させ、試験１日
目に６〜８週齢のDBA2系マウス（Charles River Breedi
ng Laboratorise,Wilmington,MA）雌１群６匹に皮下免
疫投与した：実施例５にしたがって調製し、1.0μｇのF
lu−Ａ−Texas（HA 0.35μｇ）または10.0μｇのFlu−
Ａ−Texas（HA 3.5μｇ）＋約2.0μｇのBAY R1−005ま
たは約10.0μｇのFlu−Ａ−Texas（HA 3.5μｇ）＋約20
μｇのBAY R1−005を含むPLGpZS、または実施例５にし
たがって調製し、1.0μｇのFlu−Ａ−Texas（HA 0.35μ
ｇ）＋約20μｇのBAY R1−005または10.0μｇのFlu−Ａ
−Texas（HA 3.5μｇ）＋20μｇのBAY R1−005と物理的
に混合した微粒子（図13）。
【０１５５】Flu−Ａ−Texas−BAY R1−005を含むPLGpS
微粒子のコア負荷量は、アミノ酸分析によって測定した
（表１）。投与した微粒子の質量は、低用量群にはFlu
−Ａ−Texasとして1.0μｇ（HA 0.35μｇ）になるよう
に、高用量群にはFlu−Ａ−Texasとして10.0μｇ（HA
3.5μｇ）になるように調整した。したがって、高用量
群に投与したBAY R1−005の用量は、低用量群に投与し
たBAY R1−005よりも10倍高かった。co−カプセル化す
るBAY R1−005の量がほぼ等しくなるように製剤条件は
調整できるものと期待される。
【０１５６】カプセル化されたFlu−Ａ−TexasまたはFl
u−Ａ−Texas＋BAY R1−005を含む微粒子を投与したマ
ウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められな
かった。試験＋21および＋42日または＋57日に血清を採
取し、赤血球凝集抗体試験（HAI）で機能抗体の有無を
評価した。試料は、全て２回分析した。
【０１５７】非特異的阻害剤を除去するために10％ニワ
トリ赤血球細胞とともに30分間インキュベーションした
熱不活性化マウス血清を用い、インフルエンザHAI試験
を行った。２倍に希釈した血清を96穴マイクロタイター
プレートに添加し、等量のウイルス懸濁液（8HA単位）
を各ウエルに添加し、室温で30分間インキュベーション
した。10％ニワトリ赤血球細胞懸濁液を各ウエルに添加
し、室温で30分間インキュベーションした。試験には陽
性血清および陰性血清を含め、試験の特異性および感受
性を確認した。陽性血清はインフルエンザウイルスを免
疫投与した動物から得た。陰性血清はPBSを免疫投与し
た動物から得、力価は15またはそれ以下とした。HAI力
価は、赤血球の凝集を完全に阻害する最高希釈率の逆数
で表示される。
【０１５８】図13に示す単回免疫投与（試験１日）の結
果から、溶液の形状またはPLGpS微粒子に捕捉された状
態で免疫系に投与した抗原（図13）は試験＋42日までに
無視できる程度またはきわめて低い機能的抗体を発現し
たに過ぎなかった。BAY R1−005と物理的に混合した形
態で免疫系に投与したFlu（10μｇ）では、発現したHAI
反応が可溶性抗原を同じ用量で投与した場合と比較して
８倍高く、PLGpS/Flu微粒子をいずれかの用量で投与し
た場合と比較して６倍高かった。最も顕著な結果が得ら
れたのはPLGpS/Flu（Ａ−Texas）/BAY R1−005微粒子製
剤であり、低用量（１μｇ）でもHAI力価は可溶性抗原
の８倍、高用量（10μｇ）では可溶性抗原の32倍であっ
た。Flu＋PLGpS微粒子またはFlu＋PLGpS微粒子＋BAY R1
−005の物理的混合物を投与した対照群でも、HAI力価の
中等度の増加が認められた。Flu＋PLGpS微粒子の物理的
混合物で表現されたHAI反応は、可溶性抗原を同じ用量
で投与した場合と比較して低用量では４倍、高用量では
８倍高かった。Flu＋PLGpS微粒子＋BAY R1−005の物理
的混合物で表現されたHAI反応は、可溶性抗原を対応す
る用量で投与した場合と比較して４倍高かった。本実施
例に示した試験で、インフルエンザウイルスから得たウ
イルス抗原は抗原を本発明にしたがって形成させた微粒
子に追加アジュバントの存在下で捕捉させた場合、高レ
ベルの機能的抗体を表現することが確認された（HAI力
価で測定）。単回免疫投与後に微粒子抗原＋アジュバン
トco−カプセル化系で用量依存性が認められたこと、さ
らに著しく高い機能的抗体（防御作用と相関がある）が
表現されたことから、さらにこれらの材料を用いて単回
投与剤型を開発することができる可能性を示唆してい
る。
【０１５９】実施例14:本実施例では、マイクロカプセ
ル化に典型的に用いた製剤条件のFle（三価）ワクチン
の各成分に対する影響を検査する。Flu（三価）ワクチ
ンは、３種類の相同HAストレイン（A/Texas、A/Johanne
sburg、B/Harbin）をほぼ等量含む。各特異的HA成分の
定量は、単一放射免疫拡散法（SRID）で行った（参考文
献32）。SRID法では、各HA成分の検出にポリクロナール
血清を用い、この血清は配座の変化に感受性が高い。こ
の検定法で検出される各成分の最低濃度は、約10μg/mL
である。Flu（三価）ワクチン2.0mL（濃度＝265μg/m
L）を含む一連の試料を調製した。これらの各試料につ
いて、SRIDでA/Texas特異性HA＝20.25μg/mL、A/Johann
esburg特異性HA＝20.60μg/mL、B/Harbin特異性HA＝21.
42μg/mLを測定した。
【０１６０】マイクロカプセル化手順に典型的に用いた
溶媒、例えばジクロロメタン（DCM）または酢酸エチル
（EtOAc）の影響を、ホモジナイズ手順と同様の条件下
で評価した。ホモジナイズ手順のモデルとして、短時間
（30秒間）の超音波処理を用いた。さらに、少量の添加
物、例えばBAY（糖脂質ペプチド）およびDC−Chol（カ
チオン性脂質）を用い、抗原の回収率が向上するか否か
検討した。反応のスケールは、実施例５で記載した手順
と同様になるように設計した。SRID分析を行う前に各混
合液の有機溶媒を留去し、適当な対照を検査し、有機溶
媒、ホモジナイズの方法またはBAYまたはDC−Cholの添
加が結果に影響を及ぼしたか否か検討した。
【０１６１】この試験の結果を表８に示す。エントリー
１と２を比較して明らかなように、超音波処理の影響は
きわめてわずかであった。エントリー３と４から、EtOA
cまたはDCM等の有機溶媒中で超音波処理すると、抗原の
回収率に影響が認められた。EtOAcを用いた場合、A/Tex
as特異性HAおよびA/Johannesburg異性体HAの回収率はそ
れぞれ75％および78％であった。EtOAc処理後には、こ
の方法でB/Harin特異性HA成分は検出されなかった。こ
の成分の検出限界は低く、約10μg/mLであったことか
ら、この成分の実際の回収率は50％以下であったと考え
られる。溶媒としてDCMを用いた場合、A/Texas特異性HA
およびA/Johannesburg特異性HAの回収率はそれぞれ85％
および96％で、B/Harbin特異性HAの回収率は50％以下で
あった。
【０１６２】エントリー５および６では、溶媒としてEt
OAcを用いたときの有機相に対する添加物BAYおよびDC−
Cholの影響を検討した。この組合せでは全ての成分が検
出され（検出限界＞50％）、回収率はA/Texas特異性HA
で65％（BAY）および82％（DC−Chol）、B/Harbin特異
性HAで82％（BAY）および70％（DC−Chol）およびA/Joh
annesburg特異性HAで87％（BAY）および88％（DC−Cho
l）であった。エントリー７および８では、溶媒としてD
CMを用いたときの有機相に対する添加物BAYおよびDC−C
holの影響を検討した。分析の結果、一部の成分は完全
には回収されず、分析にある程度の影響が認められた。
特に、A/Texas特異性HAは91％（BAY）および92％（DC−
Chol）が回収された。B/Harbin特異性HAの回収率は、い
ずれの場合も50％以下であった。A/Johannesburg特異性
HAでは、これらの組合せで直線性からのかけ離れがあっ
たため、明瞭な結果が得られなかった。これは、溶媒と
してDCMを用いた場合にのみ認められた。
【０１６３】EtOAcに溶解させたFlu（三価）ワクチンお
よび添加物としてBAYまたはDC−Cholを用いた製剤で
は、いずれの成分でも最高の回収率が得られた。この実
施例から、BAYまたはDC−Chol等の親油性物質は感受性
成分を含む製剤の安定化に使用できると考えられる。こ
のような性質を有する物質はインターフェースとして作
用し、ホモジナイズの過程で蛋白が空気／水疎水性表面
に接触するのを防止する。蛋白構造は、これらの作用に
特に感受性が高い。この実施例で報告したSRID分析結果
は、この結論を裏づけている。
【０１６４】実施例15:本実施例では、PLGpS微粒子でco
−カプセル化したFlu（三価）またはFlu（三価）＋アジ
ュバントカクテルをマウスに皮下免疫投与したときの免
疫原性について説明する。
【０１６５】Flu（三価）ワクチンは、３種類の相同HA
ストレイン（A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbin）を
ほぼ等量含む。Flu（三価）ワクチン10.0μｇ中の総HA
含有量は、2.35μｇである。単一放射免疫拡散法（SRI
D）（参考文献32）で各特異性HA成分を測定したとこ
ろ、A/Texasで0.76μｇ、A/Johannesburgで0.81μｇ、B
/Harbinで0.78μｇであった。
【０１６６】この試験では、各成分のHA投与量が実施例
13と比較して著しく低かった。すなわち、実施例13で用
いた単価ワクチンは、約3.25μｇのA/Texas特異性HAを
含んでいた。
【０１６７】Th2/Th1プロファイルに基づいて選抜した
アジュバント、DC−Chol（カチオン性脂質）、BAY R1−
005（Th2/Th1のバランスのとれた糖脂質ペプチド）、主
要Th 2のPCPP（ポリ［ジ（カルボキシラートヘノキシ）
−ホスファゼン］ナトリウム塩）（Virus Research Ins
titute,Cambridge MA）の存在下で、マウスに皮下免疫
投与した。PLGpS微粒子は、実施例８と同様にバランス
のとれたTh2/Th1プロファイルを誘導することが認めら
れた。
【０１６８】６〜８週齢のDBA−２系マウス（Charles R
iver Breeding Laboratories、Wilmington、MA）雌１群
８匹に、PBS（pH7.4）250μＬに溶解させた抗原を試験
１日目に以下の用量で免疫投与した。実施例５で調製
し、Flu（三価、HAとして2.35μｇ）10.0μｇまたはFlu
（三価、HAとして2.35μｇ）10.0μｇ＋BAY R1−005、D
C−CholまたはPCPPを含むPLGpS微粒子（表５）。
【０１６９】Flu（三価）を含むPLGpS微粒子のコア負荷
量は、アミノ酸分析によって測定した（表６）。いずれ
のPLGpS微粒子製剤でも、抗原の回収率は良好であった
（＞70％）。この結果は、蛋白溶液の初期濃度がカプセ
ル化効率に顕著な影響を及ぼすという我々の知見と一致
した。
【０１７０】投与した微粒子の質量は、Fluとして10.0
μｇ（三価、総HA 2.35μｇ）の必要容量になるように
調整した。共投与したアジュバントの用量を最適化する
努力は行わなかったが、これは製剤条件によって決まる
と期待される。
【０１７１】カプセル化したFlu（三価）ワクチンまた
はFlu（三価）ワクチン＋アジュバントカクテルを含むP
LGpS微粒子を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変化ま
たは行動の変化は認められなかった。試験21、42および
57日に血清を採取し、総IgG、IgG1、IgG2aを評価し、赤
血球凝集抗体試験（HAI）で機体抗体の有無を評価し
た。各ストレイン（A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbi
n）について検査を行い、カプセル化および放出のマル
チコンポーネント系における免疫原性および機能抗体に
対する影響を検討した。試料は、全て２回分析した。抗
体ELISAは、実施例13と同様に行った。
【０１７２】図14a〜ｃに示すように、PLGpS/Flu（三
価）微粒子製剤によってFlu（三価）ワクチンに含まれ
る各ストレインに特異的なIgG抗体反応が誘導された。
試験57日までに総IgG力価が最も高かったのは、PLGpS/F
lu（三価）/DC−Chol微粒子製剤であった。この結果
は、検査したいずれのストレインにも該当した（A/Texa
s＝可溶性Flu対照の32倍、A/Johannesburg＝可溶性Flu
対照の64倍、B/Harbin＝可溶性Flu対照の64倍）。試験5
7日までにPLGpS/Flu（三価）/PCPP微粒子製剤で比較的
高いIgG抗体反応（力価に基づく）が認められたもの
は、A/Texas（可溶性Flu対照の２倍）、A/Johannesburg
（可溶性Flu対照の４倍）であった。PLGpS/Flu（三
価）、PLGpS/Flu（三価）/BAY微粒子製剤および可溶性F
lu（三価）ワクチン対照では、試験57日までに誘導され
た総特異性IgG抗体反応に基本的に差がなかった。これ
は、単価ワクチンを用いた実施例13の結果（これら３種
類の系で結果に差が認められなかった）と一致した。
【０１７３】各HAストレインについてインフルエンザHA
I試験を行うために血清試料を56℃で30分間加熱して補
体を不活性化し、トリプシン（8mg/mLを0.1mL）／過ヨ
ウ素酸塩（0.001Mを12.5μＬ）で前処理を行って内在血
球凝集阻害物質を破壊した。連続希釈した抗血清につい
て、標準的なHAI法（参考文献33）を用い、それぞれ4HA
UのA/Texas、A/JohannesburgまたはB/Harbinウイルスに
よる１％ニワトリ赤血球細胞の凝集阻害能を２連で測定
した。
【０１７４】図15a〜ｃに示すように、三価ワクチンに
含まれる各HAストレインに対して特異的なHAI力価が誘
導された。Flu（三価）ワクチン＋DC−Cholを含むPLGpS
微粒子製剤では、試験57日までに最も高く持続性のある
HAI力価が認められた（HA特異性A/TexasではHAI力価240
（可溶性Flu（三価）対照の８倍）、HA特異性A/Johanne
sburgでは240（可溶性Flu（三価）対照の16倍）、HA特
異性B/Harbinでは60（可溶性Flu（三価）対照の８
倍））。Flu（三価）＋BAYを含むPLGpS微粒子製剤で
も、特に高いHAI力価が認められた（HA特異性A/Texasで
はHAI力価60（可溶性Flu（三価）対照の２倍）、HA特異
性A/Johannesburgでは60（可溶性Flu（三価）対照の４
倍）、HA特異性B/Harbinでは15（可溶性Flu（三価）対
照と同等））。この実施例でFlu（三価）ワクチンを含
むBAY製剤で認められたHAI力価は、実施例13の低用量
（Flu（単価）ワクチン１μｇ−A/Texas特異性HAとして
0.325μｇを投与）と同等であった。PLGpS/Flu（三価）
/PCPP微粒子製剤では、検出されるほどの機能抗体反応
の誘導は認められなかった。
【０１７５】高用量のPLGpS/Flu（三価）/DC−Chol製剤
微粒子を投与した実験を行った。この群のマウスには、
試験１日目に別の群に投与したFlu（三価）ワクチンの
約２倍を免疫投与した（投与量:Flu（三価）＝21.2μ
ｇ、総HA＝5.00μｇ）。この高用量で得られた結果は、
図15a〜ｃに示す。可溶性Flu（三価）ワクチンをこの用
量で免疫投与した対照群で誘導されたHAI力価はわずか
であり、検査した低用量群と基本的に同等であった（結
果は表示せず）。試験57日までに、この製剤では低用量
群と比較して著しく高い特異性HAI力価の誘導が認めら
れた（HAI力価:HA特異性A/Texasで480（可溶性Flu（三
価）対照の５倍）、HA特異性A/Johannesburgで480（可
溶性Flu（三価）対照の５倍）、HA特異性B/Harbinで120
（可溶性Flu（三価）対照の３倍））。さらに、誘導さ
れたHAI力価は持続性があり、試験21日から57日まで同
じレベルに保たれることが確認された。BAYまたはDC−C
hol等の添加物はポリマーおよび有機溶媒を含む有機相
に導入され、インターフェースとして作用し、製剤の過
程で抗原を防御する（実施例13、表８参照）。それによ
って、抗原物質の回収率が高くなる。
【０１７６】さらに、in ivtroで行った放出試験で、３
日以内にカプセル封入成分のかなりの量が放出されるこ
とが確認された。カプセル封入抗原の約５〜15％が、こ
の段階で検出されることが実験的に確認された（微粒子
の表面に局在している抗原）。初回免疫は、アジュバン
トの共放出によって著しく増強される。これは、初期放
出段階で抗原の周囲に局在していることによるものと思
われる。PCPP等のアジュバントと抗原をco−カプセル化
したPLGpS微粒子製剤では、ワクチン効果の改善が得ら
れないことは注目に値する。この物質は一次乳化液の水
相に添加したが、DC−CholまたはBAYの親油性を保持し
ていない、PCPPは別の系で強いアジュバント特性を有す
ることが知られているが、この実施例ではカプセル化効
果または微粒子製剤の抗原性補強効果にはきわめてわず
かな改善が認められたに過ぎなかった。
【０１７７】この実施例に示す試験で、多成分系インフ
ルエンザウイルスのウイルス抗原はFlu抗原をco−カプ
セル化したBAYまたはDC−Chol等の存在下で微粒子に捕
捉させると高レベルの総IgG抗体および機能抗体（HAI）
を誘導することが確認された。
【０１７８】実施例16:本実施例では、PLGpS微粒子製剤
をマウスモデルに単回皮下免疫投与したときの感染率お
よび防御率を評価した結果を説明する。卵由来尿膜腔液
中の生インフルエンザウイルスA/台湾/1/86（H1N1）、
マウス適応A/台湾/1/86および市販のA/台湾/1/86単価サ
ブユニットワクチン（FluzoneR）を、Pasteur Merieu
x、Connaught、米国（Swiftwater、PA）から入手した。
A/Texas、A/JohannesburgおよびB/Harbinストレイン（P
BS0.25mL中総HA2.35μｇ）を含むFlu（三価）ワクチン
を、試験１日目に６〜８週齢のDBA−２系マウス雌（実
施例14に記載）１群８匹に皮下免疫投与した。対照群の
マウスには、PBSのみまたは尿膜腔液として生A/Texasウ
イルスを400血球凝集単位（HAU）で投与した。14日後に
麻酔下のマウスに尿膜腔液中のマウス適応生A/台湾/1/8
6ワクチン50μＬを鼻腔内攻撃投与した（LD50の５
倍）。攻撃投与後14日間にわたって、毎日死亡率を測定
し、２日に１回罹病率（体重変化）を測定して防御率を
評価した。
【０１７９】攻撃投与の結果を図16に示す。期待したよ
うに、相同性生（A/Texas）ウイルスを免疫投与した全
てのマウスで認められた体重の減少は最小限で、ベース
ラインからの体重変化率に基づいて判断したところ、攻
撃投与後２週間以内に完全に回復した。また、PBSを免
疫投与したマウスでは期待したように急激な体重の減少
が認められ、試験10日までにベースラインの30％以下に
減少した。この対照群では、10日までに全ての動物が死
亡した。
【０１８０】PLGpS/Flu（三価）/DC−Chol微粒子製剤を
免疫投与したマウスでは攻撃投与後４日以内に体重の平
均減少率が８％であったことから、感染が起こったと考
えられた。検査したPLGpS製剤群の動物のうちこれらの
マウスでは急速な回復が認められ、２週間後にはベース
ラインの100％に達した。群全体の動物が回復し、各マ
ウスで防御力価が上昇したものと考えられた。
【０１８１】PLGpS/Flu（三価）/BAY微粒子製剤を免疫
投与したマウスでは攻撃投与後10日以内に体重の平均減
少率が10％であったことから、感染が認められた。これ
らのマウスでは緩慢な回復が認められ、２週間後にはベ
ースラインの95％に達した。群全体の動物が回復し、こ
れらの各マウスで防御力価の上昇が認められたが、回復
速度から防御レベルは同じ用量を投与したDC−Chol群よ
りも低かったものと考えられる。これは、実施例15で測
定したこれら２群のHAI値と一致する。
【０１８２】可溶性Flu（三価）ワクチン対照群およびP
LGpS/Flu（三価）またはPLGpS/Flu（三価）/PCPP微粒子
製剤群では、効果が低かった。これらの群では、攻撃投
与後８〜10日までに23〜29％の平均体重が減少が認めら
れた。これらのマウスでは回復速度が最も遅く、２週間
後にベースラインの86〜92％に回復した。さらに、これ
らの群では数匹の死亡例がみられた。PLGpS/Flu（三
価）微粒子製剤群では、８匹中６匹が生存した。PLGpS/
Flu（三価）/PCPP製剤群では８匹中７匹、Flu（三価）
対照群では８匹中６匹が生存した。これらの例では、防
御が認められないか、認められても低かった。
【０１８３】実施例14で、我々はマイクロカプセル化条
件のFlu（三価）ワクチンに対する影響を評価した。SRI
D法で抗原回復のストレイン特異性（A/Texas、A/Johann
esburg、B/Harbin）分析を行ったところ、PLGpSポリマ
ーおよびEtOAcを溶媒とし、有機相にCholまたはBAYを用
いた場合、この多成分系の３ストレイン全てで抗原活性
をの低下がきわめてわずかであることが認められた。実
施例15で、DC−CholまたはBAYの存在下で製剤したPLGpS
/Flu（三価）ワクチンの単回皮下投与で高い機能抗体
（防御に関連がある）が誘導されたことから、これらの
製剤はマウスモデルに利用できることが確認された。実
施例16で記載した攻撃／防御試験の結果は、機能抗体試
験で得られた防御効果の順位とよく一致した。
【０１８４】抗原およびアジュバントを生分解性微粒子
に捕捉させて投与すると、さらに効果的に免疫系に提供
することができる。DC−CholまたはBAYと抗原の可溶性
混合物で認められた免疫増強効果は、これを製剤に利用
することによって免疫活性がさらに向上することを示唆
している。これらの結果は、使用回数および用量（抗原
／アジュバント）を軽減できることを示唆している。特
に、この実施例はこれら新規微粒子製剤を単回投与で有
効な製剤の開発に利用できることを強く示唆している。
【０１８５】実施例17:本実施例では、PLGpS微粒子中に
カプセル化したMoraxella catarrhalis由来トランスフ
ェリン結合蛋白（Tbp2）（WO 97/13785、本出願人、参
考例としてここに引用する）、PLGpS微粒子と物理的に
混合したTbp−２または明礬で製剤したTbp−２をマウス
に皮下免疫投与したときの免疫原性について説明する。
６〜８週齢のBALB/c系マウス（Charles River Breeding
Laboratories、Wilmington,MA）雌１群５匹に、PBS（p
H7.4）250μＬに溶解させた抗原を試験１、28および43
日目に以下の用量で皮下免疫投与した：実施例５にした
がって調整し、0.3μｇのTbp−２を含むPLGpS微粒子、
実施例５にしたがって調製し、0.3μｇのTbp−２と物理
的に混合したPLGpS微粒子、および0.3μｇのTbp−２と
製剤した明礬（1.5mg/回）（表５）。
【０１８６】カプセル化したTbp−２を含む微粒子、Tbp
−２を物理的に混合した微粒子またはTbp−２を物理的
に混合した明礬を投与したマウスで、肉眼的病理変化ま
たは行動の変化は認められなかった。試験＋14、＋27、
＋42および＋55日で血清を採取し、実施例８と同様に抗
原特異性ELISAで抗Tbp−2 IgG抗体の有無を評価した。
試料は、全て２回分析した。Tbp−２を含むPLGpS微粒子
のコア負荷量は、実施例６と同様にアミノ酸分析によっ
て測定した（4.0μg/mg（32.8％））。
【０１８７】免疫投与の結果（図17a）から明らかなよ
うに、PLGpS微粒子に捕捉させて免疫系に投与した抗原
は可溶性抗原またはPLGpS微粒子のみと物理的に混合し
た抗原と比較してかなり高い力価を誘導した。さらに、
この試験でマイクロカプセル化製剤は従来の明礬アジュ
バント化システムと同様に免疫原性を有するものと思わ
れる。免疫反応のカイネティックスは、両製剤で差がな
かった。
【０１８８】試験55日に採取した血液のIgGサブタイプ
プロファイル（図17b）で、PLGpS微粒子でカプセル化し
たTbp−２とPLGpS微粒子に物理的に混合したTbp−２ま
たは明礬で製剤したTbp−２で誘導される免疫反応に差
が認められた。抗原を可溶性の形態またはPLGpS微粒子
と物理的に混合し、または明礬で製剤して投与した場
合、検出された優勢なサブタイプはIgG1であった（IgG2
もある程度認められた）。
【０１８９】この実施例で、PLGpS微粒子でカプセル化
したTbp−２で誘導されるIgGサブタイプはさらに高いIg
G2aを誘導した。この傾向は、実施例８でHin−47で認め
られた傾向と同様であった。
【０１９０】これらの結果から、カプセル化抗原の免疫
投与で誘導される免疫の機構は明礬で誘導されるものと
は異なるものと思われる。抗原を微粒子でカプセル化し
て投与すると、さらにバランスのとれたTh2/Th1プロフ
ァイル（IgG2a:IgG1の比）が認められた。
【０１９１】ここに示した結果から明らかなように、PL
GpS微粒子でカプセル化した抗原で仲介される免疫反応
は、PLGpS微粒子と物理的に混合した抗原、明礬で製剤
した抗原または可溶性抗原として投与したもので得られ
る免疫反応とは質的にかなり異なる。さらに、抗原／明
礬製剤で明礬により誘導される免疫反応の程度はカプセ
ル化した抗原を含む微粒子の免疫反応とほぼ同じであっ
た。
【０１９２】実施例18:本実施例では、PLGpS微粒子でカ
プセル化したTbp−２およびPLGpS微粒子と物理的に混合
したTbp−２を鼻腔内免疫投与したマウスにおける免疫
原性を説明する。６〜８週齢のBALB/c系マウス（Charle
s River Breeding Laboratories、Wilmington、MA）雌
１群５匹に、PBS（pH7.4）10または50μＬに溶解させた
抗原を試験１、28および43日目に以下の用量で鼻腔内免
疫投与した：実施例５にしたがって調製し、6.0μｇのT
bp−２を含むPLGpS微粒子、および実施例５にしたがっ
て調製し、6.0μｇのTbp−２と物理的に混合したPLGpS
微粒子（表５）。
【０１９３】カプセル化したTbp−２を含むPLGpS微粒子
またはTbp−２を物理的に混合したPLGpS微粒子を投与し
たマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認めら
れなかった。試験14、27、42および55日で血清を採取
し、実施例８と同様に抗原特異性ELISAで抗Tbp−2 IgG
抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。Tb
p−２を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実施例６と同
様にアミノ酸分析によって測定した（4.0μg/mg（32.8
％））。鼻腔内免疫投与後の血清IgG Tbp−２特異性抗
体力価を図18に示す。これらの結果から、投与容量が少
ない（10μＬ）と、PLGpS微粒子に取り込まれた抗原（T
bp−２）またはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原は
同じ用量（6.0μｇ）の可溶性抗原と比較して免疫原性
が低い。
【０１９４】投与用量を高くする（50μＬ）と、いずれ
の群でも全体的な力価が著しく増加した。これらの結果
から、PLGpS微粒子と物理的に混合した抗原（Tbp−２）
は、さきにHin−47の鼻腔内免疫投与（実施例10）で認
められた結果と同様に同じ用量（6.0μＬ）の微粒子カ
プセル化抗原または可溶性抗原と比較して免疫原性がか
なり高かった。さきに行ったHin−47の鼻腔内免疫投与
試験（実施例10）で、微粒子と物理的に混合したHin−4
7を投与すると強い体液反応および分泌反応が認められ
た。Tbp−２を用いたこの試験でも、同様な反応が認め
られた。さらに、投与容量によって、発現する免疫反応
の種類および強さが異なることを確認した。
【０１９５】実施例19:本実施例では、微粒子による抗
原の放出を説明する。PLGpS微粒子でカプセル化した抗
原は明礬製剤と同様に免疫原性を有することが確認され
たことから、これら高分子マトリックスでカプセル化し
た抗原の初期放出および徐放特性が免疫投与量の軽減に
利用できるか否か検討した。
【０１９６】この実施例では、PLGpS微粒子でカプセル
化したTbp−２、PLGpS微粒子と物理的に混合したTbp−
２、および明礬またはCFA/IFAで製剤したTbp−２をモル
モットに皮下免疫投与して免疫原性を検査した。６〜８
週齢のモルモット（CharlesRiver Breeding Laboratori
es、Wilmington、MA）雌１群２匹に、抗原を以下の用量
で皮内免疫投与した：試験１および28日に実施例５にし
たがって調製し、PBS（pH7.4）500μＬに懸濁させた5.0
μｇのTbp−２をカプセル化したPLGpS微粒子、および試
験１日に5.0μｇのTbp−２を含むPBS（pH7.4）を混合し
たフロイントの完全アジュバント（CFA）、ついで試験1
4および28日に5.0μｇのTbp−２を含むPBS（pH7.4）を
混合したフロイントの不完全アジュバント（IFA）、ま
たは試験１、14および28日に5.0μｇのTbp−２を含むPB
S（pH7.4）を混合した明礬（表５）。
【０１９７】カプセル化したTbp−２を含むPLGpS微粒
子、Tbp−２を物理的に混合したPLGpS微粒子、Tbp−２
のCFA/IFA製剤またはTbp−２明礬製剤を免疫投与したモ
ルモットで、肉眼的病理変化または行動の変化は認めら
れなかった。試験40および56日で血清を採取し、抗原特
異性ELISAで抗Tbp−2 IgG抗体の有無を検査した。試料
は、全て２回分析した。抗体ELISA法は、実施例８と同
様である。Tbp−２を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、
実施例６と同様にアミノ酸分析によって測定した（4.0
μg/mg（32.8％））。
【０１９８】図19に示す結果から明らかなように、PLGp
Sでマイクロカプセル化したTbp−２を２回投与すると、
CFA/IFAまたは明礬で製剤したTbp−２を３回投与した場
合と同程度の抗Tbp−２抗体反応を誘発した。これらの
結果から、マイクロカプセル化したTbp−２は２回投与
用のワクチンとして開発する価値があると思われる。
【０１９９】実施例20:本実施例では、PLGpS微粒子でカ
プセル化したｒウレアーゼまたはｒウレアーゼ／アジュ
バントカクテルをマウスに皮下または胃内免疫投与した
ときの免疫原性を説明する。
【０２００】６〜８週齢の非近交系Swissマウス（Janvi
er、フランス）１群８匹に、PBS（pH7.4）300μＬに溶
解させた抗原を以下の用量で試験１、28および56日に皮
下（S.C.）免疫投与した：実施例５にしたがって調製
し、10.0μｇのｒウレアーゼを含むPLGpS微粒子、実施
例５にしたがって調製し、10.0μｇのｒウレアーゼ＋DC
−Chol、PCPPまたはCT−Ｘをco−カプセル化したPLGpS
微粒子、対照として10.0μｇのｒウレアーゼ＋可溶性の
DC−Chol（65μg/回）またはPCPP（100μg/回）、また
は試験１、28および56日に0.15M NaHCO3（pH9.0）300μ
Ｌに溶解させた抗原を以下の用量で胃内免疫投与した：
実施例５にしたがって調製し、40.0μｇのｒウレアーゼ
を含むPLGpS微粒子、実施例５にしたがって調製し、40.
0μｇのｒウレアーゼ＋DC−Chol、PCPPまたはCT−Ｘをc
o−カプセル化したPLGpS微粒子（表５）。
【０２０１】ｒウレアーゼを含むPLGpS微粒子のコア負
荷量は、実施例６と同様にアミノ酸分析またはポリクロ
ナールｒウレアーゼ特異性ELISAによって測定した（表
７）。PLGpS微粒子抽出物についてポリクロナールELISA
分析を行うと、典型的にカプセル化した総蛋白量（回収
されたエピトープ）が得られる。対照実験で、抗原の完
全性に対する溶媒／塩基（SDS）の影響を定量すること
ができる。用いた条件下で、抽出された蛋白の約65〜75
％がこの検定法で完全に検出される形態で残っていたと
推定される。したがって、この測定法で得られた値は、
アミノ酸分析（AAA）で得られた値よりも低い。アジュ
バント（DC−Chol、CT−ＸまたはPCPP）が存在していて
も測定値を妨害しないことを確認するため、適当な対照
を実験に含めた。DC−Cholが存在していても分析には影
響がないと思われたが、PCPPが存在すると異常値が得ら
れ、AAA法による分析値と比較して非特徴的に高かっ
た。CT−Ｘの場合は、co−カプセル化されたCT−Ｘの量
を定量するために別のポリクロナールELISA法を開発し
た。
【０２０２】微粒子の投与質量は、ｒウレアーゼの投与
量が10.0μｇ（皮下投与）または40.0μｇ（経口投与）
になるように調整した。
【０２０３】カプセル化したｒウレアーゼまたはco−カ
プセル化したｒウレアーゼとアジュバントの混合物を含
むPLGpS微粒子を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変
化または行動の変化は認められなかった。試験85日に血
清を採取し、抗原特異性ELISAで抗ｒウレアーゼIgG1お
よびIgG2aの抗体の有無を評価した。いずれの試料も２
回分析した。
【０２０４】ELISAは標準的なプロトコール（ビオチン
抱合体、ストレプタビジン、ペルオキシダーゼ複合体は
Amershamから、ｏ−フェニレンジアミン 二塩酸塩（OP
D）基質はSigmaから入手した）。0.05M炭酸−重炭酸緩
衝液（pH9.6）に懸濁させたH.pylori抽出物（５μg/m
L）で、プレートを一夜コーティングした（４℃）。BSA
（Sigma）で飽和させた後、プレートを血清（1.5時
間）、ビチオン抱合体（1.5時間）、ストレプタビジン
ペルオキシダーゼ複合体（１時間）および基質（OPD−1
0分間）とともにインキュベートした。対照として、各
実験にH.pylori抽出物に対するポリクロナールマウス血
清を設けた。力価は、492nmにおける最大吸収の50％を
与える希釈率の逆数で表示した。陰性対照として、免疫
投与前の血清を用いた。
【０２０５】マウスに、Th2/Th1プロファイルに基づい
て選んだアジュバント（DC−Chol−バランスのとれたTh
2/Th1、PCPP−一次Th2）または既知の粘膜アジュバント
活性に基づいて選んだアジュバント（コレラ毒素（CT−
Ｘ）またはE.coliの熱不安定エンテロトキシン（LT））
の存在下で皮下または胃内免疫投与した。PLGpS微粒子
は、その他の典型的なアジュバント、例えば明礬と比較
して一層バランスのとれたTh2/Th1プロファイルを誘導
することが認められている。
【０２０６】皮下免疫投与後試験85日に得たプール血液
のIgGサブタイプを図20に示す。PLGpS/rウレアーゼ微粒
子製剤を皮下投与した場合は、いずれもIgG1反応がIgG2
a反応と比較して高かった（IgG2a:IgG1比は0.08〜0.33
の範囲にあった）。可溶性対照群（ｒウレアーゼ＋DC−
CholまたはPCPP）の総IgG1反応は、同じ絶対値の範囲に
あった。抗原とco−カプセル化した場合も、抗原と物理
的に混合して投与した場合にも、アジュバントシステム
間でIgG2aに差が認められた。PLGpS/rウレアーゼ微粒子
（IgG2a:IgG1＝0.33）、PLGpS/rウレアーゼ微粒子/CT−
Ｘ（IgG2a:IgG1＝0.30）およびPLGpS/rウレアーゼ微粒
子/DC−Chol（IgG2a:IgG1＝0.20）では、バランスのと
れたIgG2a:IgG1抗体反応（Th2/Th1で評価）が得られ
た。一方、ｒウレアーゼ＋DC−Chol対照群では、IgG2a:
IgG1＝0.03であった。PLGpS/rウレアーゼ/PCPP微粒子製
剤では、主としてTH2反応が認められ、IgG2a:IgG1比は
0.08であった。ｒウレアーゼ＋PCPPの相同可溶性混合物
ではTh2が強く、IgG2a:IgG1比はきわめて低く、0.003で
あった。
【０２０７】一般に、これらのアジュバントの存在下で
抗原をco−カプセル化すると、典型的な免疫プロファイ
ルがバランスのとれたTh2/Th1反応の方向にシフトする
傾向が認められた。
【０２０８】胃内免疫投与すると、ほとんどの場合検出
可能な浸透反応が認められなかった。特記すべき例外
は、中等度の浸透反応が認められたLT陽性対照（IgG2a:
IgG1比＝0.1）およびCT−Ｘとco−カプセル化したｒウ
レアーゼ/PLGpS微粒子（IgG2a:IgG1比＝2.1）であっ
た。興味あることに、経口免疫投与では、抗原＋粘膜ア
ジュバントをカプセル化するときわめて異なった浸透抗
体反応が認められた。この場合、IgG2a:IgG1比がIgG2a
に片寄り、TH1経路を示唆していた。文献調査で、CT−
Ｘを抗原と経口共投与すると典型的にLTで認められたよ
うな免疫反応を誘導するという報告があった。主とし
て、IgG1またはTh2型の反応が報告されている（参考文
献34）。この試験は、PLGpS微粒子でco−カプセル化す
ると免疫反応が質的に変化することを示唆している。
【０２０９】実施例21:本実施例では、PLGpS微粒子/rウ
レアーゼ製剤をマウスモデルに皮下または経口免疫投与
したときの感染率および防御率を評価する。マウスを用
い、２回目の追加免疫投与６週間後（試験85日）に、H.
pylori細菌（3x106cfu）懸濁液300μＬを胃内に強制攻
撃投与した。In vitroの放出試験（実施例７）から微粒
子からの抗原の放出には約４週間を要すると考えられた
ので、この時から２週間後に攻撃投与を計画した。
【０２１０】攻撃投与４週間後にマウスを屠殺し、ウレ
アーゼ活性（Jatroxテスト、Procter ＆ Gamble）を評
価するために無菌層流フード内で胃を採取した。ウレア
ーゼ活性は、屠殺24時間後に550nmにおける吸収を測定
することにより評価した。このテストの原理は、Helico
bacter pyloriのウレアーゼによって反応液中の尿素を
分解させ、pHの上昇による反応液中のpH指示薬（フェノ
ール レッド）の黄色から淡赤色への色の変化を測定す
るものである。
【０２１１】マウスは、H.pyloriのストレプトマイシン
耐性マウス適応株（X43−2AN）を感染させた。胃におけ
るウレアーゼ活性の測定値（Jatroxテスト）に基づいて
判定したところ、感染率には再現性があり、全ての実験
で100％のマウスが感染した。攻撃投与に用いた菌株は
ストレプトマイシン耐性であったため、選択性の高い培
地でも生育することができ、したがってこのテストの感
度はきわめて高かった（正常な細菌相による汚染はみら
れなかった）。
【０２１２】この菌株は20％v/vグリセロールおよび10
％v/v牛胎仔血清（FBS）（Hyclone）添加Brucellaブロ
ス（BB）（Biomerieux）中−70℃で保存した。攻撃投与
用懸濁液は、以下のように調整した：前培養は、５％v/
vヒツジ血液（Biomerieux）およびH.pylori X43−2AN株
の選択マーカー抗生物質（スリメトプリム（５μg/m
L）、バンコマイシン（10μg/mL）、ポリミキシンＢ硫
酸塩（５μg/mL）、アンホテリシン（５μg/mL）、およ
びストレプトマイシン（50μg/mL））（TVPAS）を含むM
ueller−Hinton寒天（MHA;Difco）上でH.pyloriを培養
した。抗生物質は、全てSigmaから購入した。MHA−TVPA
Sプレートを好気的条件下、37℃で３日間培養した。前
培養した菌株を用い、５％v/v FBSおよびすべての抗生
物質（TVPAS）を添加したBB50mLを含む75cm2の通気口付
きフラスコ（Costar）に接種した。フラスコを、好気的
条件下で24時間ゆっくりと振とうした。グラム染色、ウ
レアーゼ活性（尿素インドール培地、Diagnostic Paste
ur）、カタラーゼ（H2O2、３％v/v）およびオキシダー
ゼ活性（Biomerieuxディスク）を測定し、懸濁液の特性
を検討した。位相差顕微鏡下で、生存率および運動性を
検査した。550nmにおけるO.D.が0.1になるようにBBで懸
濁液を希釈した（1x107CFU/mL）。この試験では、OD.＜
0.1または細菌数が少なくとも103〜104/胃（対照では10
5〜106）のマウスは防御能を有すると考えた。この試験
では、非免疫投与／感染および非免疫投与／非感染対照
群のマウスも設けた（結果は表示せず）。
【０２１３】図21aから明らかなように、上記の検定法
で判断した防御効果（皮下投与による）の順位は、PLGp
S/rウレアーゼ/DC−Chol（幾何学的平均＝0.092）＞PLG
pS/rウレアーゼ/CT−Ｘ（幾何学的平均＝0.105）、PLGp
S/rウレアーゼ（幾何学的平均＝0.163）、PLGpS/rウレ
アーゼ/PCPP（幾何学的平均＝0.269）であった。この試
験では、防御の標準としてLT＋ｒウレアーゼ（経口）陽
性対照（幾何学的平均＝0.136）を用いた。興味あるこ
とに、ｒウレアーゼ＋可溶性DC−Chol（幾何学的平均＝
0.600）またはｒウレアーゼ＋PCPP（幾何学的平均＝1.0
7）対照群では抗原とアジュバントをPLGpS微粒子製剤と
してカプセル化する明瞭な利点が認められた。
【０２１４】データをMann−Whitneyの方法で統計学的
に解析し、以下の結論が得られた。PLGpS/rウレアーゼ/
DC−CholおよびPLGpS/rウレアーゼ/CT−Ｘ製剤は、LT＋
ｒウレアーゼ陽性対照群として比較して有意差が認めら
れなかった。PLGpS/rウレアーゼ/PCPP、ｒウレアーゼ＋
DC−Cholおよびｒウレアーゼ＋PCPP群ではこれらの群と
比較して有意差が認められ（ｐ＜0.01）、PLGpS/rウレ
アーゼ群ではPLGpS/rウレアーゼ/PCPP、ｒウレアーゼ＋
DC−Cholおよびｒウレアーゼ＋PCPP群と比較して有意差
が認められた（ｐ＜0.01）。
【０２１５】この統計学的解析から、PLGpS/rウレアー
ゼ/DC−Chol（マウス7/8匹でOD.＜0.1）およびPLGpS/r
ウレアーゼ/CT−Ｘ（マウス5/8匹でOD.＜0.1）微粒子群
では明瞭な防御効果が認められ、一方PLGpS/rウレアー
ゼ（マウス2/8匹でOD.＜0.1）微粒子群およびｒウレア
ーゼ＋DC−Chol群（マウス2/10匹でOD.＜0.1）群では中
等度の防御効果が認められ、PLGpS/rウレアーゼ/PCPP
（マウス0/8匹でOD.＜0.1）微粒子群およびｒウレアー
ゼ＋PCPP群（マウス0/10匹でOD.＜0.1）群では防御効果
が低いか、全く認められなかった。この傾向は、免疫原
性試験（実施例20）で得られたTh2/Th1バランス比と一
致した。
【０２１６】図21bに示すように、経口免疫投与では、
アジュバントを含むPLGpS微粒子を免疫投与したいずれ
の群のマウスでも完全な防御効果は得られなかった。統
計学的順位は、PLGpS/rウレアーゼ/CT−Ｘ（幾何学的平
均＝0.229）＞PLGpS/rウレアーゼ/DC−Chol（幾何学的
平均＝0.403）、PLGpS/rウレアーゼ（幾何学的平均＝0.
475）、PLGpS/rウレアーゼ/PCPP（幾何学的平均＝0.49
3）であった。この試験では、陽性対照としてLT＋ｒウ
レアーゼ（経口）群（幾何学的平均＝0.136）を用い
た。
【０２１７】データをMann−Whitneyの方法で統計学的
に解析し、以下の結論が得られた。LT＋ｒウレアーゼ陽
性対照群ではPLGpS/rウレアーゼ/DC−CholおよびPLGpS/
rウレアーゼ/CT−Ｘ製剤と比較して有意差が認められた
（ｐ＜0.01）。PLGpS/rウレアーゼ/DC−CholおよびPLGp
S/rウレアーゼ/CT−Ｘ製剤では、その他の群と比較して
有意差が認められなかった。PLGpS/rウレアーゼおよびP
LGpS/rウレアーゼ/PCPPでは、その他の群と比較して有
意差が認められなかった。
【０２１８】この試験で、PLGpS/rウレアーゼ/CT−Ｘ
（マウス2/8匹でOD.＜0.1）およびPLGpS/rウレアーゼ/D
C−Chol（マウス1/8匹でOD.＜0.1）微粒子製剤群では部
分的な防御効果が認められた。一方ｒウレアーゼ＋LT陽
性対照群では完全な防御効果が認められた（マウス7/8
匹でOD.＜0.1）。
【０２１９】実施例14〜16で明らかなように、アジュバ
ントをPLGpS微粒子等の担体とともに免疫系に供給する
とアジュバント効果が高くなり、その結果ワクチンの効
果も高くなる。特に、この実施例における典型的な対照
試験でDC−CholまたはPCPP等のアジュバントと、ｒウレ
アーゼの可溶性混合物を皮下免疫投与後の免疫原性およ
び防御効果を測定したところ、防御効果は低いか、中等
度であることが確認された。これらの結果から、抗原と
アジュバントを微粒子状のマトリックスとともに供給す
るとかなり効果の高いワクチンが得られるという証拠が
得られた。この実施例では、さらにアジュバントの毒性
軽減およびこの種のアジュバントの特徴である免疫反応
の質的改善等の利点があることが実証された。PLGpS/r
ウレアーゼ/CT−Ｘ製剤微粒子の経口免疫投与後に得ら
れたｒウレアーゼに対するIgGサブタイプ抗体反応が非
特徴的にIgG2a側（Th1経路）にかたよるということも実
験的に実証された。
【０２２０】また、co−カプセル化した抗原とCT−Ｘ
（既知の粘膜アジュバント）を皮下または経口投与した
場合、この物質は製剤および貯蔵中に高分子マトリック
ス内の抗原を安定化させ、HSAまたはBSAの存在下で調製
した微粒子と同様な機構（参考文献35）で放出するもの
と思われる。
【０２２１】結論として、この試験で、PLGpS微粒子を
利用した全身免疫投与により、マウスモデルでH.pylori
の感染に対して著しい防御効果を誘導する効果のあるこ
とが確認された。また、この試験で、PLGpS微粒子を利
用した経口免疫投与により、マウスモデルでH.pyloriの
感染に対して部分的な防御効果を誘導する効果のあるこ
とも確認された。
【０２２２】さらに、アジュバント（特にDC−Cholまた
はCT−Ｘ）とともにｒウレアーゼをco−カプセル化する
と、ワクチン効果の顕著な向上が得られる。
【０２２３】
【表１】
【０２２４】
【表２】
【０２２５】
【表３】
【０２２６】
【表４】
【０２２７】
【表５】
【０２２８】
【表６】
【０２２９】
【表７】
【０２３０】
【表８】
【０２３１】
【表９】
【０２３２】
【表１０】
【０２３３】
【表１１】
【０２３４】
【発明の効果】本発明によれば、様々な方法によってマ
イクロパーティクルおよびマイクロスフェアを製造する
のに適した性質を有するポリマーの製造方法を提供する
ことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】開環重合と脱保護の工程を示す図である。
【図２】ポリマー中の生物活性部分のポリマーへの結合
を示す図である。
【図３】マイクロパーティクルの製造工程を示す図であ
る。
【図４】レーザー回折測定の代表的サイズ分布を示す図
である。
【図５】マイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真
を示す図である。
【図６】マイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真
を示す図である。
【図７Ａ】ｉｎ ｖｉｖｏにおける放出過程を示す図で
ある。
【図７Ｂ】３ヶ月間の％累積放出を示す図である。
【図８Ａ】免疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧ応
答を示す図である。
【図８Ｂ】免疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧ応
答を示す図である。
【図８Ｃ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示す
図である。
【図９Ａ】試験の概要を示す図である。
【図９Ｂ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示す
図である。
【図９Ｃ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示す
図である。
【図１０Ａ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示
す図である。
【図１０Ｂ】血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを示
す図である。
【図１０Ｃ】血清ＩｇＡ応答を示す図である。
【図１０Ｄ】ＩｇＧ応答を示す図である。
【図１０Ｅ】ＩｇＧ応答を示す図である。
【図１１】ＩｇＧ血清抗体応答を示す図である。
【図１２】ＩｇＧ血清抗体応答を示す図である。
【図１３】血球凝集反応阻害抗体検定での応答を示す図
である。
【図１４Ａ】ＩｇＧ抗体の存在を評価に関する図であ
る。
【図１４Ｂ】ＩｇＧ抗体の存在を評価に関する図であ
る。
【図１４Ｃ】ＩｇＧ抗体の存在を評価に関する図であ
る。
【図１５Ａ】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定におけ
る結果を示す図である。
【図１５Ｂ】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定におけ
る結果を示す図である。
【図１５Ｃ】株特異的血球凝集反応阻害抗体検定におけ
る結果を示す図である。
【図１６】防御試験の結果を示す図である。
【図１７Ａ】血清ＩｇＧ抗体応答を示す図である。
【図１７Ｂ】血清ＩｇＧ抗体サブタイプ応答プロフィル
を示す図である。
【図１８】抗体の存在の評価に関する図である。
【図１９】血清ＩｇＧ抗体応答を示す図である。
【図２０】ＩｇＧ抗体応答を示す図である。
【図２１Ａ】防御試験の結果を示す図である。
【図２１Ｂ】防御試験の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０８Ｌ 101/16 Ｃ０８Ｌ 101/16 (72)発明者 チャング、 ペレ カナダ国 エル４シー ０ビー６ オンタ リオ州 リッチモンドヒル エストリル ストリート 32 (72)発明者 クライン、 マイケル、 エイチ. カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウィロウダール マンロウ ブー ルヴァード 16 Ｆターム(参考） 4C076 AA53 BB01 CC06 EE20H FF21 GG21 4C085 AA38 BA01 EE06 FF11 FF17 GG08 GG10 4J029 AA02 AD01 AE06 CH01 DA02 EA00 JB171 JF371 KA00 4J200 AA01 BA12 DA22 EA03 EA11

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１種のα−ヒドロシキ酸モノ
    マーと、少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸を共重合
    する工程を有することを特徴とする生分解性及び生体適
    合性を有するポリマーの製法。
  2. 【請求項２】 エステル化触媒の有機溶媒溶液ととも
    に、少なくとも１種のα−ヒドロシキ酸モノマーと、少
    なくとも１種のアミンの保護基を有する疑似−α−アミ
    ノ酸と、のモノマー混合物を、不活性雰囲気条件下で形
    成する工程と、前記モノマーを共重合させる工程と、 得られたコポリマーを単離する工程と、を有する請求項
    １に記載の製法。
  3. 【請求項３】 前記形成されたコポリマーが、固相触媒
    での還元または酸性触媒作用によって脱保護化される請
    求項２に記載の製法。
  4. 【請求項４】 前記脱保護化が、臭化水素の酢酸溶液の
    存在下での酸性触媒により行なわれる請求項３に記載の
    製法。
  5. 【請求項５】 前記エステル化触媒が、２−エチルヘキ
    サン酸第一スズである請求項２〜４に記載の製法。
  6. 【請求項６】 前記有機溶媒が、無水クロロホルムであ
    る請求項２〜５のいずれかに記載の製法。
  7. 【請求項７】 前記コポリマーをフィルムまたはマイク
    ロパーティクルに成形する工程を更に含む請求項２〜６
    のいずれかに記載の製法。
  8. 【請求項８】 前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸
    が式：Ｒ1Ｒ2ＣＯＨＣＯ2Ｈ（該式中、Ｒ1及びＲ2は水
    素原子あるいは直鎖状または分岐鎖状アルキル基であ
    り、該アルキル基は式：ＣnH2n+1で表され、ｎは１〜１
    ０の整数である）で表される請求項１〜７のいずれかに
    記載の製法。
  9. 【請求項９】 前記α−ヒドロキシ酸が、α−ヒドロキ
    シ酸の混合物からなり、該混合物は、前記式におけるＲ
    1及びＲ2が水素であるα−ヒドロキシ酸を含む混合物ま
    たは前記式におけるＲ1がメチル基であり、Ｒ2が水素で
    あるα−ヒドロキシ酸を含む混合物である請求項８に記
    載の製法。
  10. 【請求項１０】 前記少なくとも１種の擬似−α−アミ
    ノ酸が式：Ｒ5ＣＨＮＨＲ6ＣＯ2Ｈ（該式中、Ｒ5はヒド
    ロキシメチル基またはメチルチオール基であり、Ｒ6は
    アミン保護基である。）で表される請求項７〜９のいず
    れかに記載の製法。
  11. 【請求項１１】 前記アミン保護基が、カルボベンジル
    オキシ基（ＣＢＺまたはＺ）、ベンジル基（Ｂｎ）、ｐ
    −メトキシベンジル基（ＭｅＯＢｎ）、ベンジルオキシ
    メトキシ基（ＢＯＭ）、tert−ブチルオキシカルボニル
    基（ｔ−ＢＯＣ）及び［９−フルオレニルメチルオキ
    シ］カルボニル基（ＦＭＯＣ）からなる群から選択され
    たものである請求項１０に記載の製法。
  12. 【請求項１２】 前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ
    酸が、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、グリコール酸、ヒドロ
    キシ吉草酸及びヒドロキシ酪酸からなる群から選択され
    たものであり、前記少なくとも１種の擬似−α−アミノ
    酸がセリン由来である請求項３に記載の製法。
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