DE69720516T2

DE69720516T2 - Verabreichungssystem mit biologisch abbaubaren und zielerrichteten mikropartikeln

Info

Publication number: DE69720516T2
Application number: DE69720516T
Authority: DE
Inventors: K. Kenneth SOKOLL; Pele Chong; H. Michel KLEIN
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2017-12-20
Also published as: US6312732B1; DE69720516D1; DK0946624T3; JP3428972B2; US6228423B1; ATE236207T1; NZ336718A; EP0946624A1; JP2003261661A; US6042820A; CA2275033C; JP2000509428A; AU729305B2; US20050163745A1; ES2196385T3; JP2002138139A; JP3990303B2; WO1998028357A1; JP3242118B2; PT946624E

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch abbaubare Mikroteilchen zur Abgabe eines biologisch aktiven Materials und betrifft insbesondere derartige Mikroteilchen, welche auf besondere Zelltypen lenkbar sind.
Bezugnahme auf verwandte Anmeldung
Diese Anmeldung ist eine Teilfortführung des gleichzeitig anhängigen U.S.-Patentes Nr. 08/770 050, eingereicht am 20. Dezember 1996.
Hintergrund der Erfindung
Impfstoffe sind viele Jahre lang verwendet worden, um Menschen und Tiere gegen eine große Vielzahl von Infektionskrankheiten zu schützen. Solche herkömmlichen Impfstoffe bestehen aus attenuierten Pathogenen (zum Beispiel Polio-Virus), abgetöteten Pathogenen (zum Beispiel Bordetella pertussis) oder immunogenen Komponenten des Pathogens (zum Beispiel Diphtherie-Toxoid und Hepatitis-B-Oberflächenantigen).
Einige Antigene sind hoch immunogen und sind allein in der Lage, schutzgebende Immunantworten hervorzurufen. Andere Antigene versagen jedoch darin, eine schutzgebende Immunantwort zu induzieren, oder induzieren nur eine schwache Immunantwort. Die Immunantwort eines schwach immunogenen Antigens kann signifikant verstärkt werden, wenn die Antigene mit Adjuvantien gemeinsam verabreicht werden. Adjuvantien verstärken die Immunogenität eines Antigens, aber sind nicht notwendigerweise selbst immunogen. Adjuvantien können durch Zurückhalten des Antigens nahe der Stelle der Verabreichung wirken, um einen Depoteffekt hervorzurufen, der eine langsame anhaltende Freisetzung von Antigen an Zellen des Immunsystems erleichtert. Adjuvantien können auch Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot anlocken und solche Zellen stimulieren, Immunantworten auszulösen. Es sind Adjuvantien identifiziert worden, welche die Immunantwort gegen parenteral zugeführte Antigene verstärken.
Adjuvantien werden üblicherweise mit Antigen in Impfstoffformulierungen verwendet, wodurch die Induktion von systemischer Immunität durch parenterale Immunisierung (intramuskulär oder subku tan) erhalten wird. Dieses Vorgehen ist für infektiöse Agentien geeignet, welche Zugang zum Körper über beschädigte Haut gewinnen (d. h. Tetanus), jedoch kommt es zu Problemen aufgrund der Nebenwirkungen und der assoziierten Toxizität von vielen auf diese Weise verabreichten Adjuvantien. Nur die Impfstoffe, welche aus Aluminiumsalzen (Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid) formuliert werden, finden Routine-Verwendung bei Impfungen von Menschen und in der Veterinärmedizin. Allerdings sind sogar diese Adjuvantien nicht geeignet zur Verwendung mit allen Antigenen und können auch eine Reizung an der Stelle der Injektion verursachen. Es besteht ein klarer Bedarf für die Entwicklung von Adjuvantien, welche die Immunogenität von Antigenen an der Stelle der Injektion sicher verstärken.
Es bestehen weitere Probleme, welche spezifisch für die Natur des verwendeten Antigens sind. Zum Beispiel erfordern die meisten herkömmlichen nicht-lebendigen Impfstoffe mehrere Dosen für eine effektive Immunisierung. Lebendige attenuierte Impfstoffe und viele nicht-lebendige flüssige Impfstoffe leiden unter der Notwendigkeit kontrollierter Lagerbedingungen und sind anfällig gegen Inaktivierung (z. B. Wärmeempfindlichkeit). Es gibt auch Probleme, die mit der Kombination von Impfstoffen in Einzeldosierungsformen aufgrund von Adjuvans-Unverträglichkeiten, pH, Puffertyp und der Gegenwart von Salzen assoziiert sind.
Schleimhaut-Immunität wird hauptsächlich durch Induktion von sekretorischem Immunglobulin (sIgA) in Darm-, Bronchien- oder Nasen-Waschungen und anderen externen Sekretionen induziert. Zum Beispiel hat man gezeigt, dass parenterale Cholera-Impfstoffe einen beschränkten Schutz bieten, wohingegen die kürzlicher entwickelte orale Form hoch effektiv ist (Ref.1 – Überall in dieser Beschreibung wird auf verschiedene Bezugstellen in Klammern Bezug genommen, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, welchen diese Erfindung betrifft. Die volle bibliographische Information für jedes Zitat findet sich am Ende der Beschreibung, unmittelbar vorausgehend zu den Ansprüchen. Die Offenbarungen dieser Bezugstellen sind hierin durch den Bezug darauf in der vorliegenden Beschreibung einbezogen). Untersuchungen mit menschlichen Freiwilligen haben gezeigt, dass orale Verabreichung von Influenza-Impfstoff wirksam zur Induktion sekretorischer Anti-Influenza-Antikörper in Nasen-Sekretionen ist, und es sind Substanzen identifiziert worden, welche nützlich als Adjuvantien für derartige aufgenommene bzw. verspeiste Impfstoffe sind. Allerdings weisen die meisten dieser Adjuvantien eine relativ schlechte Verbesserung von Immunantworten gegen verspeiste Antigene auf. Gegenwärtig ist bestimmt worden, dass die meisten dieser Adjuvantien sicher und wirksam bei der Verstärkung von Immunantworten in Menschen und Tieren gegen Antigene sind, welche über die oro-gastrointestinalen, nasopharyngeal-respiratorischen und genitalen Trakte oder in die Augenhöhlen verabreicht werden. Jedoch ist eine Verabreichung von Antigene über diese Wege im all-gemeinen uneffektiv bei der Hervorrufung einer Immunantwort. Obwohl das obenstehende Beispiel das Potential dieser Immunisierungsweisen veranschaulicht, erfolgte die Entwicklung von Impfstoff- Formulierungen zur Verwendung auf diesen Wegen aus verschiedenen Gründen langsam. Die Unfähigkeit, an der Schleimhautoberfläche zu impfen beruht im allgemeinen angenommenermaßen auf:

(i) Antigenabbau durch die Säure und/oder proteolytische Enzyme, welche während des Übergangs zur Schleimhautoberfläche vorhanden sind;
(ii) Antigenabbau durch Sekretionen, die am Schleimhautepithel präsentiert werden;
(iii) begrenzte Adsorption über das Schleimhautepithel;
(iv) die Verdünnung des Antigens auf eine Konzentration, welche unterhalb jener liegt, die erforderlich ist, um Immunantworten zu induzieren; und
(v) ineffektive Adjuvantien und/oder Zuführungssysteme.

Die mit der Verwendung von Adjuvantien in parenteralen Impfstoff-Formulierungen und dem Fehlen von geeigneten Systemen zur Impfstoffabgabe an Schleimhaut-Örtlichkeiten assoziierten Probleme unterstreichen den Bedarf nach neuen Techniken, welche bei Verabreichung auf verschiedenen Wegen wirksam sind und welche inhärent frei von assoziierten Toxizitäts-Bedenken oder Nebenwirkungen sind.
Es wird auch gewünscht, eine Impfstoffabgabe in einer Einzel-Dosisform für sowohl Menschen- als auch Tier-Impfungen vorzusehen, weil dies den Vorteil der Reduzierung von Zeit und Kosten hat und in der Humanmedizin das Einverständnis des Patienten erhöht, was von äußerster Wichtigkeit in Entwicklungsländern ist, wo der Zugang beschränkt ist. Dies gilt insbesondere für Kinder in diesen Ländern.
Um Immunantworten gegen verabreichte Antigene zu erhöhen, kann ein Träger verwendet werden, um das Antigen vor Abbau zu schützen und auch die Aufnahme dieser Materialien in vivo zu modulieren. Empfindliche Antigene können eingeschloßen werden, um sie vor Zerstörung, Verminderung der Immunogenität oder Verdünnung zu schützen. Verfahren zur Formulierung eines Trägers schließen das Dispergieren eines Antigens innerhalb einer polymeren Matrix (monolithischen Matrix) ein oder erfolgen durch das Aufbeschichten eines polymeren Materials um ein Antigen herum, wodurch eine äußere Schutzwand erhalten wird (Kern-Hülle). Die Manipulation des Formulierungsprotokolls kann eine Steuerung über die durchschnittliche Größe dieser Materialien erlauben. Es ist gezeigt worden, dass dies für die Aufnahme von Partikulaten über orale Zuführung an spezialisierte M-Zellen der Peyer-Haufen innerhalb des Darmtrakts wichtig ist.
Das U.S.-Patent Nr. 5 151 264 beschreibt einen partikulären Träger von einer Phospholipid/-Glycolipid/Polysaccharid-Natur, welcher als Bio Vecteurs Supra Moleculairs (BVSM) bezeichnet worden ist. Die partikulären Träger sind dazu gedacht, eine Vielzahl von Molekülen mit biologischer Aktivität in einer der Schichten davon zu transportieren. Allerdings beschreibt das U.S.-Patent Nr. 5 151 264 keine teilchenförmigen Träger, welche Antigene für eine Immunisierung enthalten, und beschreibt insbesondere keine teilchenförmigen Träger für die Immunisierung über die orogastrointestinalen, nasopharyngeal-respiratorischen und urogenitalen Trakte und in die Augenhöhlen oder andere Schleimhaut-Stellen.
Eldridge et al., (Ref. 2 und 3) beobachtete die verzögerte Freisetzung von Antigen in vivo aus biologisch abbaubaren Mikrokügelchen, hergestellt aus Polylactid-co-glycolid-Copolymer, das ebenfalls als PLG oder PLGA bekannt ist. Es sind zahlreiche andere Polymere verwendet worden, um Antigene zur Formulierung in Mikroteilchen einzukapseln, und einige von diesen schließen Pelyglycolid, Poly-lactid, Polycaprolacton, Polyanhydride, Polyorthoester und Poly(α-hydroxybuttersäure) ein.
Das U.S.-Patent Nr. 5 075 109 beschreibt die Einkapselung der Antigene trinitrophenyliertes Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin (Keyhole-Limpet-Hemocyanin) und staphylococcales Enterotoxin B in 50 : 50 Poly(DL-lactid-co-glycolid). Es werden andere Polymere zur Einkapselung vorgeschlagen, wie Poly(glycolid), Poly(DL-lactid-co-glycolid), Copolyoxalate, Polycaprolacton, Poly(lactidco-caprolacton), Poly(esteramide), Polyorthoester und Poly(α-hydroxybuttersäure), und Polyanhydride. Das umhüllte bzw. eingekapselte Antigen wurde an Mäuse über gastrische Intubation verabreicht und führte zum Auftreten signifikanter antigenspezifischer IgA-Antikörper in Speichel und Darmsekretionen und in Seren. Wie in diesem Patent angegeben, war im Gegensatz dazu die orale Verabreichung der gleichen Menge an uneingekapseltem Antigen unwirksam zur Induzierung spezifischer Antikörper jedweden Isotyps in irgendeinem der getesteten Fluide. Poly(DL-lactid-co-glycolid)-Mikrokapseln wurden auch verwendet, um Antigen durch parenterale Injektion zu verabreichen.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 91/06282 beschreibt ein Zuführungsvehikel, umfassend eine Mehrzahl von bioadhäsiven Mikrokügelchen und antigenischen Impfstoffbestandteilen. Die Mikrokügelchen bestanden aus Stärke, Gelatine, Dextran, Kollagen oder Albumin. Dieses Zuführungsvehikel ist insbesondere für die Aufnahme von Impfstoff über die Nasenschleimhaut beabsichtigt. Das Zuführungsvehikel kann zusätzlich einen Absorptions-Verstärker enthalten. Die Antigene sind typischerweise innerhalb von schützenden polymeren Materialien eingekapselt.
Das U.S.-Patent Nr. 5 571 531 beschreibt partikuläre Träger, umfassend eine feste Matrix eines Polysaccharids und eines proteinartigen Materials. Ein funktionalisiertes Silicon-Polymer wird für die Abgabe von Materialien mit biologischer Aktivität an die Matrix gebunden.
Obwohl die zeitverzögerte Freisetzung von Antigen in den obenstehenden Arbeiten gezeigt wurde, kam es zu Schwierigkeiten, wenn Mikroteilchen durch die beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Aussetzen von biologischen Materialien an die organischen Lösungsmittel und die verwendeten physikalischen Kräfte können zu Denaturierung führen. Es kann auch schwierig sein, die Vor gehensweisen in größerem Maßstab durchzuführen. Darüber hinaus können hydrophile Antigene ineffizient eingekapselt werden.
Die EP-A-600161 beschreibt ein Polymer, in welchem eine Aminosäure an einen oligomeren Polyester gebunden ist, welcher aus α-Hydroxycarbonsäureresten besteht. Die Aminosäure ist entweder am Carboxyl-Ende über eine Amidbindung oder am Hydroxyl-Ende über eine Esterbindung gebunden.
Es wäre wünschenswert, verbesserte Träger ohne derartige Einschränkungen bereitzustellen. Es wäre besonders wünschenswert, polymere Materialien vorzusehen, welche zu Mikroteilchen und Mikrokügelchen formuliert werden können und welche Targeting-Einheiten enthalten, um das Antigen zu im voraus gewählten Liganden zu lenken. Dies würde ein erhebliches Potential für Zellen des Immunsystems aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Herstellung eines neuen und nützlichen Polymers, welches Eigenschaften aufweist, die für die Herstellung zu Mikroteilchen und Mikrokügelchen mittels verschiedener Verfahren geeignet sind. In dieser Erfindung führen Modifikationen existierender Verarbeitungsverfahrensweisen zu einer signifikanten Verbesserung der Einkapselungseffizienzen.
Diese Erfindung richtet sich ferner auf die Herstellung nützlicher Impfstoff-Abgabesysteme für Antigene) oder Cocktails aus Antigen und Co-Adjuvans auf verschiedenen Immunisierungswegen, welche den parenteralen, oralen und intranasalen Weg einschließen.
Gemäß eines ersten Aspektes der Erfindung wird ein neues biologisch abbaubares, biokompatibles Polymer vorgesehen, einschließlich solchen mit einem Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 40 000 Dalton, welches eine Hauptkette der allgemeinen Formel:
aufweist, worin:
R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ unabhängig voneinander ausgewählt werden und ausgewählt sind aus H, linearen oder verzweigten Alkylgruppen;
R₆ ausgewählt ist aus H, einer Aminschutzgruppe, einem Abstandhaltermolekül oder einer biologisch aktiven Spezies;
X ausgewählt ist aus einer O- oder S-Gruppe; und
x und y ganze Zahlen sind, einschließlich derartiger Werte, dass mindestens etwa 95% des Polymeren aus α-Hydroxysäureresten zusammengesetzt sind.
Die neuen Polymere werden durch Copolymerisation von Monomeren abgeleitet, welche wenigstens eine α-Hydroxysäure oder ein Derivat davon, einschließlich cyclischen Di-Estern, und wenigstens eine Pseudo-α-Aminosäure umfassen. Die α-Hydroxysäuren weisen im allgemeinen die Formel R₁R₂COHCO₂H auf, worin die R₁- und R₂-Gruppen H, lineare oder verzweigte Alkylgruppen sind. Die α-Hydroxysäuren können eine Mischung von α-Hydroxysäuren umfassen, wobei mindestens eine aus der Mischung der α-Hydroxysäuren R₁- und R₂-Gruppen aufweist, welche Wasserstoff sind, und eine andere α-Hydroxysäure eine R₁-Gruppe, welche CH₃ ist, und R₂, welches H ist, aufweist. Die Pseudo-α-Aminosäuren weisen im allgemeinen die Formel R₅CHNHR₆CO₂H auf, worin die R₅-Gruppe eine Hydroxymethyl- oder Methylthiolgruppe ist und R₆ eine Aminschutzgruppe ist.
Die Aminschutzgruppen können Carbobenzyloxy, Benzyl, para-Methoxybenzyl, Benzyloxymethoxy, tertiär-Butyloxycarbonyl oder [9-Fluorenylmethyloxy]carbonyl sein.
Die α-Hydroxysäuren werden im allgemeinen gewählt aus L-Milchsäure, D,L-Milchsäure, Glycolsäure, Hydroxyvaleriansäure und Hydroxybuttersäure. Die wenigstens eine Pseudo-α-aminosäure kann Serin sein.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung sind die Polymere Poly-D,L-lactid-co-glycolid-copseudo-Z-serinester (PLGpZS) und Poly-P,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-serinester (PLGpS).
Die Polymer können biologisch aktive Einheiten enthalten, wie Zellbioadhäsionsgruppen, Makrophagenstimulatoren, Polyethylenglycol, Polyaminosäuren und/oder geschützte Aminosäurereste, welche an das Polymer auf direkte Weise oder über Seitengruppen kovalent gebunden sind.
In der bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Substituenten an das Polymer über die Aminogruppen auf den Aminosäureeinheiten direkt oder über ein geeignetes Abstandhaltermolekül gebunden. Das Abstandhaltermolekül kann gewählt werden aus α-Hydroxysäuren, repräsentiert durch die Formel R₇R₈COHCO₂H, worin R₇- oder R₈-Gruppen unabhängig gewählt werden aus H, linearen oder verzweigten Alkyleinheiten, und α-Aminosäuren, welche durch die Formel R₉CHNHR₁₀CO₂H dargestellt werden, wobei die R₉-Gruppe eine Hydroxymethyl- oder Methylthiolgruppe ist und R₁₀ eine Aminschutzgruppe ist.
Gemäß eines weiteren Aspektes der Erfindung sieht die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polyesters vor, umfassend das Copolymerisieren wenigstens einer α-Hydroxysäure und wenigstens einer Pseudo-α-aminosäure.
Gemäß eines anderen Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polymers der hierin vorgesehenen allgemeinen Formel vorgesehen, umfassend das Bilden einer Mischung von Monomeren, welche wenigstens eine α-Hydroxysäure und wenigstens eine Pseudo-α-Aminosäure umfassen, mit einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel eines Veresterungskatalysators unter inerten atmosphärischen Bedingungen, das Copolymerisieren der Monomere und das Isolieren des resultierenden Polymers. Der verwendete Katalysator ist vorzugsweise Zinn-2-ethylhexanoat.
Das durch das Verfahren gebildete Polymer kann weiter durch katalytische Reduktion in der festen Phase oder alternativ dazu durch Säurekatalyse unter Verwendung von Bromwasserstoff in einer Essigsäurelösung entschützt werden.
Das Verfahren kann ferner ebenfalls das Formen des Polymers zu einer Folie oder zu Mikroteilchen umfassen.
Gemäß eines anderen Aspektes dieser Erfindung wird ein partikulärer Träger zur Abgabe biologisch aktiver Materialien an einen Wirt vorgesehen, wobei der Träger ein Polymer umfasst, einschließlich denjenigen mit einem Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 40 000 Dalton, mit der allgemeinen
worin;
R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ unabhängig voneinander ausgewählt werden und ausgewählt sind aus H, linearen oder verzweigten Alkylgruppen;
R₆ ausgewählt ist aus H, einer Aminschutzgruppe, einem Abstandhaltermolekül oder einer biologisch aktiven Spezies;
X ausgewählt ist aus einer O- oder S-Gruppe; und
x und y ganze Zahlen sind, einschließlich derartiger Werte, dass mindestens etwa 95% des Polymers aus α-Hydroxysäureresten aufgebaut sind.
Der partikuläre Träger besitzt im allgemeinen eine Teilchengröße von etwa 1 bis 10 μM.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines partikulären Trägers für die Abgabe wenigstens eines biologisch aktiven Materials an einen Wirt vorgesehen, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Mischen einer organischen Lösungsmittelphase, welche ein α-Hydroxysäure-Polymer oder Copolymer der allgemeinen Formel, wie obenstehend beschrieben, umfasst, mit einer wässrigen Zusammensetzung, welche dispergiertes oder gelöstes biologisch aktives Material umfasst, um eine erste Wasser-in-Öl-Emulsion zu bilden;
(b)Dispergieren einer ersten Wasser-in-Öl-Emulsion in einer wässrigen Detergensphase, um eine Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion zu bilden;
(e) Entfernen des Wassers aus der zweiten Doppelemulsion, um Mikrokügelchen zu bilden; und
(d) Sammeln der Mikrokügelchen, wobei das biologische Material darin eingeschlossen ist.

Der partikuläre Träger der vorliegenden Erfindung kann als eine Zusammensetzung verwendet werden, wobei ein biologisch aktives Material damit vermischt oder darin eingeschlossen ist. Die verwendeten biologischen Materialien können aus denjenigen gewählt werden, welche eine Immunantwort hervorrufen. Derartige Materialien können Haemophilus influenzae-Proteine umfassen, wie ein nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, D15, P1, P2 und P6. Das biologisch aktive Material kann mindestens einen Influenza-Virus umfassen, welcher ein multivalenter oder monovalenter Influenzavirus-Impfstoff sein kann, oder Influenzavirus-Protein, wie einen monovalenten Influenzavirus-Protein-Impfstoff. Darüber hinaus kann das biologisch aktive Material mindestens ein Moraxella catarrhalis-Protein, wie das Tbp2-Protein von M. catarrhalis, umfassen. Ein weiteres biologisch aktives Material, welches verwendet werden kann, kann mindestens ein Helicobacter pylori-Protein, wie Urease, sein. Weiteres biologisches Material kann Proteine, Protein-"Mimetica", Bakterien, Bakterienlysate, Viren (z. B. den respiratorischen syncytialen Virus), Virus-infizierte Zelllysate, DNA-Plasmide, Antisinn-RNA, Peptide (z. B. CLTB-36 und M2), Antigene, Antikörper, pharmakologische Mittel, Antibiotika, Kohlenhydrate, Lipide, lipidierte Aminosäuren (z. B. Tripalmitoyl-Cystein), Glycolipide, Haptene und Kombinationen und Mischungen hiervon einschließen.
Die erste Wasser-in-Öl-Emulsion kann zusätzlich mindestens ein in organischem Lösungsmittel lösliches Adjuvans umfassen, welches lipophil sein kann. Ein solches organisches Lösungsmittel-Adjuvans kann gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus [N-(2-Deoxy-2-L-leucylamino-β-Dglucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoylamidhydroacetat (BAY R1-005), Tripalmitoylcystein und [N(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol (DC-Chol). Die Gegenwart einer lipophilen Einheit dient zur Steigerung der Einkapselungseffizienz und zum Schutz des Antigens während der Formulierung und Abgabe und zur Ermöglichung, dass die Teilchen das Antigen dem Immunsystem effizienter präsentieren als eine herkömmliche Formulierung und somit einen wirksameren Impfstoff vorsehen.
Die erste Wasser-in-Öl-Emulsion kann auch zusätzlich mindestens ein wasserlösliches Adjuvans umfassen, welches ein polymeres wasserlösliches Adjuvans sein kann, wie Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazen] (PCPP) oder ein Schleimhaut-Adjuvans, wie Choleratoxin (CT-X) oder eine Untereinheit davon oder (LT) das wärmelabile Enterotoxin von E.coli. Die Gegenwart des wasserlöslichen Adjuvans dient dazu, die Einkapselungseffizienz des Verfahrens zu erhöhen und das Antigen während der Formulierung und Abgabe zu schützen, und präsentiert das Antigen dem Immunsystem wirksamer als eine herkömmliche Mikroteilchenformulierung, wodurch ein wirksamerer Impfstoff vorgesehen wird.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls eine immunogene Zusammensetzung vor, umfassend den hierin vorgesehenen partikulären Träger und einen physiologisch annehmbaren Träger dafür. Die Zusammensetzung kann mukosal oder parenteral verabreicht werden. Die Immunantwort ist eine Antikörperantwort, welche eine lokale oder Serum-Antikörperantwort ist. Gemäß dieses Aspektes der Erfindung werden eine Impfstoffpräparation von gesteuerter oder verzögerter Freisetzung in stabiler partikulärer Form sowie ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Impfstoffpräparation vorgesehen. Die Teilchen sind mikrosphärisch und enthalten eine Matrix aus biologisch abbaubarem Polymer und Antigenen) und/oder Antigen plus Co-Adjuvans enthaltenden Regionen.
Vorteile der Erfindung beinhalten:

(a) eine vollständig biologisch abbaubare und biokompatible Mikroteilchen-Formulierung;
(b) eine erleichterte Antigenpräsentation an die Zellen des Immunsystems, was zu einer verbesserten Antigen-Immunogenität führt;
(c) verbesserte Formulierungsbedingungen, welche die Bioverfügbarkeit des Antigens erhöhen.

Weitere Anwendungen der vorliegenden Erfindung schließen die Verwendung des partikulären Trägers in diagnostischen Assays und für therapeutische Strategien ein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird ferner aus der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen verstanden werden, worin:
die 1 ein Schema ist, welches die Ringöffnungspolymerisation (ROP) von Milchsäuredimer und Glycolsäuredimer und N-(Carbobenzyloxy)-L-serinlacton mit anschließender Entschützung gemäß eines bevorzugten Aspektes der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die 2 ist ein Schema, welches die Anheftung von biologisch aktiven Einheiten an das Polymer über die Seitenkette der α-Aminosäure-Untereinheit innerhalb des Polymers zeigt. Repräsentative Targeting-Gruppen schließen Polyethylenglycol (PEG) für Wasserlöslichkeit und Zirkulation, Makrophagenstimulatoren und Zellbioadhäsionsgruppen ein. Abstandhalter-Liganden, abgeleitet aus α-Hydroxysäuren oder α-Aminosäuren, können eingebunden werden, um die Anheftung des biologisch aktiven Liganden zu erleichtern.
Die 3 ist ein Schema, welches das zur Herstellung von Mikroteilchen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung angewandte Verfahren ausführlich schildert. In dieser Figur ist Hin-47 ein nichtproteolytisches rekombinantes Proteinanalog, abgeleitet aus Haemophilus influenzae (wie beschrieben in U.S.-Patent Nr. 5 506 139), Flu X31 ist der Influenza-Stamm X31 oder A-Texas, rD-15 ist ein rekombinantes Protein, abgeleitet aus Haemophilus influenzae (wie beschrieben in WO 94/12641), PVA = Polyvinylalkohol. Flu(tri) ist trivalentes flu, Tbp2 ist Moraxella catarrhalis- Transferrinbindungsprotein 2 und rUrease ist rekombinante Helicobacter pylori-Urease.
Die 4 zeigt eine typische Größenverteilung für Poly-D,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-(Z)serinester(PLGpZS)- und Poly-D,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-serinester (PLGpS)-Mikroteilchen bei Herstellung in Gegenwart von PBS oder eines typischen Proteins (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog), wie bestimmt durch Laser-Beugungsmessungen.
Die 5 zeigt eine Rasterelektronenmikroskop-Abbildung von Mikroteilchen, hergestellt aus Poly-D,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-(Z)-serinester (PLGpZS) und Poly-D,L-lactid-co-glycolid-copseudo-serinester (PLGpS) in Gegenwart von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
Die 6 zeigt eine Rasterelektronenmikroskop-Abbildung von Mikroteilchen, hergestellt aus Poly-D,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-(Z)-serinester (PLGpZS) und Poly-D,L-lactid-co-glycolid-copseudo-serinester (PLGpS) in Gegenwart eines typischen Antigen/PBS-Gemischs, wie Hin-47/PBS.
Die 7A zeigt das in vitro-Freisetzungsprofil für nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, eingekapselt innerhalb von PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, über eine Dauer von drei Monaten, erhalten aus 14-mg-Proben (typischer Kernbeladungsbereich von 2,5 bis 5,7 μg Protein/mg Mikroteilchen), welche in PBS (pH = 7,4) inkubiert und bei 37°C gehalten wurden.
Die 7B vergleicht die% kumulative Freisetzung von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog aus PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen über eine Dauer von drei Monaten, erhalten aus ~ 14 mg-Proben (typischer Kernbeladungsbereich von 2,5 bis 5,7 μg Protein/mg Mikroteilchen), welche in PBS (pH = 7,4) inkubiert und bei 37°C gehalten wurden.
Die 8A zeigt die Serum-IgG Antworten in Mäusen, subkutan (S. C.) immunisiert unter Befolgung verschiedener Immunisierungsprotokolle mit dem 47-kDa-Membranprotein aus Haemophilus influenzae (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog). Gruppen von 5 Mäusen wurden an den Tagen 1 und 35 mit 250 μl PBS, pH 7,4, enthaltend entweder 0,2 oder 0,6 μg nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, eingebracht in PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, immunisiert. Die an den Tagen +10, +24, +35, +46 und +60 erhaltenen Seren wurden auf das Vorliegen von Anti-Hin-47-IgG-Antikörpern unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 8B zeigt die Serum-IgG-Antworten in subkutan (S. C.) immnunisierten Mäusen unter Befolgung verschiedener Immunisierungsprotokolle mit dem 47-kDa-Membranprotein aus Haemophilus influenzae (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog). Gruppen von 5 Mäusen wurden an den Tagen 1 und 35 mit 250 μl PBS, pH 7,4, enthaltend entweder 0,8 oder 2,5 μg nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, physikalisch vermischt mit PLG-Mikroteilchen, immunisiert. Seren, welche an den Tagen +10, +24, +35, +46 und +60 erhalten wurden, wurden hinsichtlich der Gegenwart von Anti-Hin-47-IgG-Antikörpern unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 8C zeigt das Serum-IgG-Antwort-Subtypprofil für vereinigte Blutproben, erhalten an den Tagen +35 und +60, aus der Untersuchung, durchgeführt wie beschrieben in der 8A und 8B.
Die 9A zeigt die IgG-Serum-Antikörperantworten in intragastrisch (I. G.) mit dem 47-kDa-Membranprotein aus Haemophilus influenzae (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog) immnunisierten Mäusen. Gruppen von 5 Mäusen wurden an den Tagen 1, 7, 14 und 57 mit 500 μl PBS, pH 7,4, enthaltend 4 μg Hin-47-Analog, eingebracht in PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen oder physikalisch vermischt mit PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, immunisiert. Die an den Tagen +13, +35, +56 und +78 erhaltenen Seren wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Hin-47-IgG-Antikörpern unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 9B zeigt das Serum-IgG-Antwort-Subtypprofil für vereinigte Blutproben, erhalten an den Tagen +56 und +78, aus der Untersuchung, welche durchgeführt wurde, wie veranschaulicht in der 9A.
Die 9C zeigt die Serum-IgA-Antwort für die Blutprobe, erhalten am Tag +78 aus der Untersuchung, durchgeführt wie veranschaulicht in 9A.
Die 10A zeigt die IgG-Serumantikörper-Antworten in intranasal (I. N.) mit einem (1 : 1)-Cocktail des 47-kDa-Membranproteins aus Haemophilus influenzae (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog) und des 115-kDa-Membranproteins aus Haemophilus influenzae (rD-15) immunisierten Mäusen. Gruppen von 5 Mäusen wurden an den Tagen 1, 7, 14 und 57 mit 25 μl PBS, pH 7,4, enthaltend 4 μg nichtproteolytisches Hin-47-Analog, eingebracht in PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen oder physikalisch vermischt mit PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, immunisiert. An den Tagen +13, +35, +56 und +78 erhaltene Seren wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Hin-47-IgG-Antikörpern unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 10B zeigt das Serum-IgG-Antwort-Untertypprofil für vereinigte Blutproben, erhalten an den Tagen +56 und +78, aus der Untersuchung, durchgeführt wie beschrieben in der 10A.
Die l0C zeigt die Serum-IgA-Antwort für die Blutprobe, erhalten am Tag +78 aus der Untersuchung, durchgeführt wie beschrieben in 10A.
Die l0D zeigt die Lungen-Waschungs-IgG-Antwort, erhalten am Tag +78 aus der Untersuchung, durchgeführt wie beschrieben in 10A.
Die 10E zeigt die Lungen-Waschungs-sIgA-Antwort, erhalten am Tag +78 aus der Untersuchung, durchgeführt wie beschrieben in 10A.
Die 11 zeigt die Anti-Flu X31 (d. h. Influenza-Virus Typ A -Stamm X31)-IgG-Serumantikörper-Antworten im Anschluß an verschiedene Immunisierungsprotokolle. Gruppen von 6 Mäusen wurden subkutan (S. C.) am Tag 1 mit 250 μl PBS, pH 7,4, enthaltend 1,5 μg HA, eingebracht in PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, immunisiert. An den Tagen +21 und +33 erhaltene Seren wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Flu X-31-IgG-Antikörpern unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 12 zeigt die Anti-Flu X31 (d. h. Influenza-Virus Typ A-Stamm X31)-IgG-Serumantikörper-Antworten im Anschluß an verschiedene Immunisierungsprotokolle. Gruppen von 6 Mäusen wurden intranasal (I. N.) am den Tagen 1 und 34 mit 25 μl PBS, pH 7,4, enthaltend 1,5 μg HA, eingebracht in PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, immunisiert. An den Tagen +21, +33, +57, +78 und +92 erhaltene Seren wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Flu X-31-IgG-Antikörpern unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 13 zeigt die Hämagglutinations-Inhibitions-Antikörperassay(d. h. Influenza-Virus Stamm A-Texas)-Antworten für vereinigte Seren (Tage +21 und +42 oder +57) im Anschluß an eine subkutane Verabreichung einer Einzeldosis. Gruppen von 6 Mäusen wurden subkutan (S. C.) am Tag 1 mit 250 μl PBS, pH 7,4, enthaltend entweder 0,35 μg HA oder 3,5 μg HA, eingebracht in PLGpS-Mikroteilchen, oder 0,35 μg HA und ~ 2 μg BAY R1-005 oder 3,5 μg HA und ~ 20 μg BAY R1-005, eingebracht in PLGpS-Mikroteilchen, oder 0,35 μg HA oder 3,5 μg HA, physikalisch vermischt mit PLGpS-Mikroteilchen, oder 0,35 μg HA und 2 μg BAY R1-005 oder 3,5 μg Ha und 20 μg BAY R1-005, physikalisch vermischt mit PLGpS-Mikroteilchen, immunisiert. Die an den Tagen +21 und +42 erhaltenen Seren wurden hinsichtlich der Inhibition der Hämagglutination von Erythrozyten ausgewertet.
Die 14a bis e zeigen die Anti-Flu(trivalent)-IgG-Serumantikörper-Antworten (für jeden in trivalentem Impfstoff enthaltenen Influenza-Virusstamm; A/Texas (14a), A/Johannesburg ( 14b) und B/Harbin (14e)) im Anschluß an verschiedene Immunisierungsprotokolle. Gruppen von 8 Mäusen wurden subkutan (S. C.) am Tag 1 mit 250 μl PBS, pH 7,4, enthaltend 2,35 μg Gesamt-HA (etwa 1/3 spezifisches HA aus jedem Stamm), eingebracht in PLGpS-Mikroteilchen oder PLGpS-Mikroteilchen, formuliert in Gegenwart von BAY R1-005, DC-Chol oder PCPP, immunisiert. An den Tagen +21, +42 und +57 erhaltene Seren wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Flu(trivalent)-IgG-Antikörpern (A/Texas, A/Johannesburg und B/Harbin) unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 15a bis e zeigen die stammspezifischen Hämagglutinations-Inhibitions-Antikörperassay (d. h. A/Texas (15a), A/Johannesburg (15b) und B/Harbin (15c)) -Antworten (Tage +21, +42 und +57) im Anschluß an eine subkutane Verabreichung einer Einzeldosis. Gruppen von 8 Mäusen wurden subkutan (S. C.) am Tag 1 mit 250 μl PBS, pH 7,4, enthaltend entweder 2,35 μg Gesamt-HA, eingebracht in PLGpS-Mikroteilchen, oder 2,35 μg Gesamt-HA in PLGpS-Mikroteilchen, welche BAY R1-005, DC-Chol oder PCPP co-einkapseln, immunisiert. An den Tagen +21, +42 oder +57 erhaltene Seren wurden hinsichtlich der Inhibition der Hämagglutination von Erythrozyten ausgewertet.
Die 16 zeigt die Ergebnisse einer Schutz-Untersuchung, ausgeführt an Mäusen, immunisiert mit einer Einzeldosis von PLGpS/Flu(trivalent)-Mikroteilchen oder PLGpS/Flu(trivalent), gemeinsam eingekapselt mit BAY R1-005, DC-Chol oder PCPP. Die Mäuse wurden mit homologem lebendigem Virus herausgefordert und während einer Dauer von 2 Wochen auf Gewichtsveränderungen und Überleben überwacht.
Die 17a zeigt die Serum-IgG-Antikörperantworten in Mäusen, subkutan (S. C.) immunisiert unter Befolgung verschiedener Immunisierungsprotokolle mit dem Transferrinbindungsprotein aus Moraxella catarrhallis (Tbp-2). Gruppen von 5 Mäusen wurden an den Tagen 1, 28 und 43 mit 250 μl PBS, pH 7,4, enthaltend 0,3 μg Tbp-2, das in PLGpS-Mikroteilchen eingebracht, mit PLGpS-Mikroteilchen physikalisch vermischt oder mit Alum bzw. Alaun formuliert war, immunisiert. An den Tagen +14, +27, +42 und +55 erhaltene Seren wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-tbp-2-IgG-Antikörpern unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 17b zeigt das Serum-IgG-Antikörper-Subtyp-Antwortprofil für vereinigte Blutproben, erhalten am Tag 55 aus der Untersuchung, durchgeführt wie beschrieben in 17a.
Die 18 zeigt die IgG-Serum-Antikörperantworten in intranasal (I. N.) mit dem Transferrinbindungsprotein aus Moraxella catarrhallis (Tbp-2) immunisierten Mäusen. Gruppen von 5 Mäusen wurden an den Tagen 1, 28 und 43 mit entweder 10 μl oder 50 μl PBS, pH 7,4, enthaltend 6 μg Tbp-2, eingebracht in Mikroteilchen oder physikalisch vermischt mit PLGpS-Mikroteilchen, immunisiert. An den Tagen +14, +27, +42 und +55 erhaltene Seren wurden hinsichtlich der Gegenwart von Anti-Tbp-2-IgG-Antikörpern unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 19 zeigt die Serum-IgG-Antikörperantworten in Meerschweinchen, welche parenteral unter Befolgen verschiedener Immunisierungsprotokolle mit dem Transferrinbindungsprotein aus Moraxel-la catarrhallis (Tbp-2) immunisiert wurden. Gruppen von 2 Meerschweinchen wurden intramuskulär mit 5 μg Tbp-2, formuliert mit 400 μl CFA, am Tag 1, gefolgt subkutan mit 5 μg Tbp-2, formuliert in 500 μl IFA an den Tagen 14 und 28, S μg Tbp-2, formuliert mit 500 μl Alum, an den Tagen 1, 14 und 28, oder 5,0 μg Tbp-2, eingebracht in PLGpS-Mikroteilchen, an den Tagen 1 und 28, immunisiert. An den Tagen +40 und +56 erhaltene Seren wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Tbp-2-IgG-Antikörpern unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 20 zeigt die Serum-IgG-Antikörper-Subtypantworten in Mäusen, welche subkutan (S. C.) oder oral (I. G.) unter Befolgung verschiedener Immunisierungsprotokolle mit dem rekombinanten Protein rUrease aus Helicobacter pylori immunisiert wurden. Gruppen von 8 Mäusen wurden an den Tagen 1, 28 und 56 mit 250 μl PBS, pH 7,4, enthaltend 10,0 μg (S. C.) oder 40,0 μg (I. G.) rUrease, eingebracht in PLGpS-Mikroteilchen, oder 10,0 μg (S. C.) oder 40,0 μg (I. G.) rUrease, formuliert in Gegenwart von DC-Chol, CT-X, PCPP oder LT, eingebracht in PLGpS-Mikroteilchen, immunisiert. Seren wurden am Tag +85 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-rUrease-IgG-Antikörpern unter Anwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) ausgewertet.
Die 21a bis b zeigen die Ergebnisse einer Schutz-Untersuchung für die in 20 beschriebenen Mäuse einen Monat nach der Herausforderung am Tag 85. Die rUrease-Aktivität (für die auf subkutanem oder oralem Weg immunisierten Mäuse) wurde in 1/4 eines gesamten Magens (Antrum+Corpus) 24 Stunden, nachdem die Mäuse getötet worden waren, gemessen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die neuen Polymere der vorliegenden Erfindung sind biokompatibel, zu gutartigen Metaboliten, welche im Körper vorhanden sein können, abbaubar und können biologisch aktive Einheiten besitzen, wie Zellbioadhäsionsgruppen, Makrophagenstimulatoren, Polyaminosäuren und Polyethylenglycol, gekoppelt an das Polymer über mindestens ein Abstandhaltermolekül, gewählt aus α-Hydroxysäuren und α-Aminosäuren. Als solches weisen die neuen Polymere Funktionalität auf.
Es werden auch Verfahren für die Synthese von Polymeren mit vorteilhaften Eigenschaften zur Verarbeitung zu Mikroteilchen beschrieben, welche biologisch aktive Materialien enthalten und für welche eine chemische Modifikation mit biologisch aktiven Targeting-Gruppen möglich ist.
In den bevorzugten Ausführungsformen werden die Copolymere durch die Polymerisation von α-Hydroxysäuren mit Pseudo-α-Aminosäuren und Terpolymere durch die Polymerisation von zwei α-Hydroxysäuren mit Pseudo-α-Aminosäuren hergestellt. Das Copolymer oder Terpolymer kann dann mit biologisch aktiven Targeting-Liganden über die Aminosäure-Untereinheit durch kovalentes Koppeln mit der freien Aminogruppe direkt oder anschließend an weitere Derivatisierung mit einem geeigneten Abstandhalter-Ligand, derivatisiert werden.
Aminosäure-Monomersynthese
Im allgemeinen wird ein N-geschütztes Serin (oder Cystein) über eine Mitsunobu-Reaktion (Ref. 5) cyclisiert, um ein viergliedrigres Lacton (oder Thiolacton) zu ergeben.
Diese Transformation führt zur Entstehung einer Ester-(oder Thioester-)Bindung. Es ist wichtig, einen Schutz auf dem Aminteil des Aminosäurevorläufers zu haben, welcher mit den Reaktionsbedingungen kompatibel ist. Vorzugsweise wird die Carbobenzyloxy(CBZ oder Z)-Gruppe verwendet, obwohl andere geeignete Funktionalitäten, wie Benzyl (Bn), para-Methoxybenzyl (MeOBn), Benzyloxymethoxy (BOM), tert-Butyloxycarbonyl (t-BOC) oder [9-(Fluorenylmethyl)oxy]carbonyl (FMOC), verwendet werden können.
Die Synthese des N-Z-L-Serin-β-lacton-Monomers basierte auf einer modifizierten Vorgehensweise aus der Literatur (Ref. 6).
Copolymerisation von α-Hydroxysäure- und Aminosäure-enthaltenden Monomeren und Funktionalisierung von Aminosäureseitenketten
Es sind zwei Verfahren für die Copolymerisation von α-Hydroxysäuremonomeren anwendbar. Die Polymerisation über Polykondensation oder aus der Schmelze (Masse-Polymerisation) sind mögliche Alternativen.
Es ist seit langem bekannt gewesen, dass Kondensationspolymerisationen problematisch sind, da Materialien mit relativ niedrigem Molekulargewicht häufig zu konkurrierenden Nebenreaktionen führen, welche im allgemeinen zur Entstehung unerwünschter Nebenprodukte führen (Refs. 7 und 8).
Allerdings wurde gezeigt, dass die Ringöffnungspolymerisation (ROP) der cyclischen Dimere von α-Hydroxysäuren, wie Glycolid und Lactid, aus der Massenphase in Gegenwart einer Vielzahl von Katalysatoren ohne weiteres voranschreitet, um Polymere von hohen Molekulargewichten zu ergeben, wobei Zinnoctoat bevorzugt wird (Ref. 9 bis 15).
Es gibt zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Poly(aminosäuren) (Refs. 16, 17 und 18) oder Pseudopoly(aminosäuren) (Refs. 6 und 19).
Die erkannten biologisch abbaubaren Eigenschaften von Poly-α-hydroxysäuren (insbesondere denjenigen von 50 : 50 D,L-Lactid und Glycolid) und Poly(aminosäuren) haben zu vermehrten Bemühungen zur Entwicklung von Verfahren zur Einbringung von Aminosäuren in die Hauptkette bzw. das Grundgerüst von α-Hydroxysäure-Polymeren geführt (Ref. 20 bis 25).
Es sind Fortschritte bei der Herstellung von Copolyesteramiden gemacht worden, welche α-Hydroxysäure-Untereinheiten, wie Lactid oder Glycolid, und α-Aminosäure-Untereinheiten, wie Glycin oder Lysin, enthalten (Ref. 22, 23 und 26).
Die Abbaurate des biologisch abbaubaren Polymers und die Freisetzungsraten von eingekapselten Materialien aus Homopolymeren von Glycolid, Lactid oder aus Copolymeren dieser Materialien, ist gezeigtermaßen stark beeinflußt von ihrem Molekulargewicht und ihrer Struktur, wie dem Grad der Kristallinität und der relativen Hydrophobizität oder Hydrophilizität. Spezifisch, werden Mikrokügelchen, formuliert aus Polymeren von höherem Molekulargewicht, abgeleitet aus α-Hydroxysäuren, über längere Zeitdauern hin abgebaut als Analoge von geringerem Molekulargewicht. In ähnlicher Weise erfolgt die Zersetzung von hochkristallinen Materialien bei viel langsameren Raten als bei amorphen Analogen. Dies steht im Zusammenhang mit der Zugänglichkeit von Wasser zu den hydrolytisch unstabilen Esterbindungen (Ref. 27).
Es ist festgestellt worden, dass statistische amorphe Copolymere, zusammengesetzt aus 50% D,L-Lactid und 50% Glycolid, die am stärksten fortgeschrittenen Abbaugeschwindigkeiten (Ref. 2 und 3) aufzeigen, wobei 50 Gew.% nach ungefähr 6 Wochen bei Eintauchen in PBS-Puffer (pH = 7,4) zurückbleiben.
Die obenstehend beschriebenen Copolyesteramide sind semikristalline Materialien, welche unter einer längeren Zurückhaltung an der Stelle der Verabreichung leiden, lange nachdem die eingekapselten Materialien vollständig freigesetzt sind.
Da es vorteilhaft wäre, ein Polymer zu haben, welches an oder nahe dem Punkt abgebaut wird, wenn das eingekapselte Material vollständig freigesetzt worden ist, entwickelten wir Verfahren zum statistischen Einbringen gleicher Mengen an D,L-Lactid und Glycolid in ein Terpolymer, welches auch Pseudo-α-aminosäuren-Untereinheiten enthielt. Ein Terpolymer von verhältnismäßig moderatem Molekulargewicht wurde verwendet, um zu gewährleisten, dass das amorphe Terpolymer eine ausreichende mechanische Festigkeit zur Verarbeitung zu Folien und Mikroteilchen beibehalten würde, wobei es dennoch zufriedenstellende Polymer-Abbau- und Freisetzungs-Raten für eingeschlossene Materialien aufzeigen wird.
Das N-geschützte-L-Serinlacton enthält eine Esterbindung, welche mittels Umesterungskatalysatoren polymerisiert werden kann (Ref. 6). Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass sechsgliedrige Ring-Lactone, wie Lactid und Glycolid, mit viergliedrigen Ring-Propiolactonen durch die Verwendung von Katalysatoren/Initiatoren vom Insertions/Koordinations-Typ copolymerisiert werden können (Ref. 13). Es wurde erwartet, dass effiziente Umesterungskatalysatoren, wie die aus Sn-Reagenzien abgeleiteten, erfordert werden würden, wenn eine relativ ausreichende Reaktivität aller Monomereinheiten erzielt werden sollte.
Wir verwendeten die Copolymerisation von Glycolid, D,L-Lactid und N-Z-L-Serinlacton, vermittelt durch Zinnoctoat. Das Entschützen der CBZ-Gruppe des Copolymers oder Terpolymers kann durch verschiedene Verfahren erzielt werden. Katalytische Festphasen-Reduktion oder Säurekatalyse (Ref. 27) sind zwei Möglichkeiten (1).
Das resultierende Copolymer oder Terpolymer kann ferner mit Targeting-Einheiten, wie Zelladhäsionsepitopen, Polyethylenglycol(PEG)-Liganden für die Zirkulation, Makrophagenstimulatoren und Polyaminosäure-Pfropfungen, wie abgebildet in der 2, ausgearbeitet werden. Eine Abstandhaltereinheit kann eingebunden werden, zum Beispiel eine α-Hydroxysäure oder eine Pseudo-α-Aminosäure-Einheit, und kann ohne weiteres mit den passenden Targeting-Einheiten derivatisiert werden. Das so gebildete Polymer besitzt ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 40 000 Dalton.
Mikroteilchen-Bildung
Der Ausdruck "Mikroteilchen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jedweden partikulären Träger, größer als 1 Mikrometer Größe, welcher für die Abgabe von biologisch aktiven Materialien verwendet wird. Der Begriff "Mikrokügelchen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Mikroteilchen, enthaltend ein oder mehrere aktive Bestandteile (z. B. Antigene, Adjuvantien, Plasmid-DNA).
Ein Flußdiagramm, welches das Verfahren der Mikroteilchenbildung, wie hierin beschrieben, veranschaulicht, wird in der 3 gezeigt. Im allgemeinen wird das Copolymer (PLG, PLGpZS oder PLGpS) allein oder mit zusätzlichen, in einem kompatiblen Lösungsmittel, wie Dichlormethan, Ethylacetat, Aceton oder Mischungen hiervon, vorhandenen Trägern solubilisiert. In der Formulierung eingeschlossene Träger, wie Saccharose, Mannose, Trehalose oder Gelatine, dienen als Kälteschutzmittel oder Gefriertrocknungsschutzmittel. Andere Materialien, welche bekannte Adjuvanseigenschaften besitzen, wie BAY R1-005 (BAY) (Ref. 29) oder Tripalmitoylcystein (TPC) (Ref. 30) oder 3b[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol (DC-Chol) (Ref. 31), können während der Formulierung eingeschlossen werden.
Eine 1%ige bis 2%ige Copolymerlösung eines Gesamtvolumens von 12 ml wird bevorzugt hergestellt. Zu dieser Lösung werden 800 μl Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder 800 μl Antigen-Lösung (Konzentration typischerweise 1 bis 2 mg/ml) in PBS oder anderen stabilisierenden Puffern, welche zusätzliche Träger enthalten können, zugesetzt. Weiteres Material, welches bekannte Adjuvanseigenschaften besitzt, wie Poly[di(carboxylatophenoxy)-phosphazen]-natriumsalz (Virus Research Institute, Cambridge MA) (PCPP) oder Choleratoxin oder Untereinheiten hiervon, kann während der Formulierung eingeschlossen werden. Diese Mischung wird dann homogenisiert, um eine Wasser-in-Öl-Emulsion zu bilden. Nach der Bildung wird diese Mischung in 100 ml einer 0,5%igen bis 10,0%igen wäßrigen Lösung dispergiert, enthaltend nicht-ionische Emulsionsstabilisatoren, wie Polyvinylalkohol (PVA), Methylcellulose oder α-[4-(1,1,3,3-Tetramethyl(butyl)phenyl]-omegahydroxypoly(oxy-l,3-ethandiyl) (Triton X-100). Diese Mischung wird unmittelbar homogenisiert, um eine Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion zu bilden. Die durchschnittliche Größe und Polydispersität der resultierenden Tröpfchen kann zweckmäßig gemessen werden durch die Verwendung des Coulter LS-100-Lichtstreuungs-Detektors. Typische Größenverteilungen, wenn PBS- oder Antigen/PBS-Mischungen eingekapselt werden, liegen im Bereich von 1 bis 20 Mikrometern (wobei die Mehrheit weniger als 10 Mikrometer Größe aufweist). Das Lösungsmittel wird dann langsam durch Verdampfen bei sanfter Erwärmung entfernt, um die entstehenden Mikrokügelchen zu härten. Nachdem das Lösungsmittel entfernt ist, wird die Mischung zentrifugiert, um die Mikrokügelchen abzusammeln, und wiederholt mit entionisiertem Wasser gewaschen, um die vollständige Entfernung von restlichen Emulsionsstabilisatoren sicherzustellen. Die Mikrokügelchen werden dann in einem Trockeneis/Aceton-Bad gefroren und über Nacht lyophilisiert, wodurch man ein weißes rieselfähiges Pulver von Mikrokügelchen erhält (typischerweise mit einer Größe von 1,0 bis 12 Mikrometer, wie bestimmt durch Lichtstreuungs-Messungen und direkt bestätigt durch Rasterelektronenmikrographie).
Das Partikulat umfasst im allgemeinen eine polymere Matrix mit einer Teilchengröße von etwa 1 bis etwa 50 μM, welche ein Polymer umfasst, in dem das biologisch aktive Material innen eingeschlossen ist, mit oder ohne gemeinsamen Einschluß eines Adjuvans darin. Die Menge an biologisch aktivem Material und Adjuvans, welche in die polymere Matrix eingebracht werden können, kann in breitem Maße variieren und kann bis zu etwa 50 Gew.-% der Gesamtpartikelmasse umfassen.
Für den Fachmann ist es deutlich offensichtlich, dass die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung viele Anwendungen auf den Gebieten der Medizin und insbesondere der Impfung, Diagnose und Behandlung von Infektionen mit Pathogenen, einschließlich Bakterien und Viren, besitzen können. Eine weitere nicht-einschränkende Erörterung derartiger Anwendungen wird nachstehend dargestellt.
Impfstoffherstellung
In einer Ausführungsform können immunogene Zusammensetzungen, geeignet zur Verwendung beispielsweise als Impfstoffe, aus Mikroteilchen, wie hierin offenbart, hergestellt werden. Die immunogene Zusammensetzung, enthaltend ein biologisch aktives immunogenes Material, kann eine Immunantwort durch den Wirt hervorrufen, an welchen sie verabreicht worden ist, einschließlich der Herstellung von Antikörpern durch den Wirt.
Die immunogene Zusammensetzung kann als injizierbare Form, als flüssige Lösungen oder Emulsionen, hergestellt werden. Die Mikroteilchen können mit physiologisch annehmbaren Trägern gemischt werden, welche mit den Mikroteilchen kompatibel sind. Diese können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombinationen hiervon einschließen. Der Impfstoff kann ferner zusätzliche Substanzen enthalten, wie Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, pH-puffernde Mittel oder Adjuvantien, um die Wirksamkeit der Impfstoffe weiter zu verstärken. Impfstoffe können parenteral, durch subkutane oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden.
Alternativ dazu können die immunogenen Zusammensetzungen, umfassend gemäß der vorliegenden Erfindung gebildete Mikroteilchen, auf eine Weise abgegeben werden, um eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorzurufen. So kann die immunogene Zusammensetzung an Schleimhautoberflächen auf nasalen, oralen (intragastrischen), buccalen oder rektalen Wegen verabreicht werden. Orale Formulierungen können normalerweise verwendete Träger bzw. Inzipienten, wie pharmazeutische Reinheitsklassen von Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat, einschließen.
Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen von verzögerter Freisetzung oder Pulvern einnehmen. Um die Mikroteilchen und das innerhalb des Kerns des Mikroteilchens eingekapselte Material, oder ein solches, welches physikalisch mit den Mikroteilchen vermischt ist, bei Verabreichung auf dem oralen Weg vor der gastrischen Azidität zu schützen, wird vorteilhafterweise eine Azidität-neutralisierende Präparation (wie eine Natriumbicarbonat-Präparation) vor, einhergehend mit oder direkt nach der Verabreichung der Mikroteilchen verabreicht.
Die Impfstoffe werden auf eine Weise verabreicht, kompatibel mit der Dosierungsformulierung, und in einer derartigen Menge, dass sie therapeutisch wirksam, schutzgebend und immunogen sind. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, einschließlich beispielsweise der Fähigkeit des Immunsystems des Subjekts, Antikörper zu synthetisieren, und falls benötigt, eine zellvermittelte Immunantwort zu erzeugen. Die genauen Mengen an Mikroteilchen und Material mit biologischer Aktivität, welche zur Verabreichung erforderlich sind, hängen von der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Allerdings sind geeignete Dosierungsbereiche vom Fachmann ohne weiteres bestimmbar und können in der Größenordnung von Mikrogramm zu Milligramm liegen. Geeignete Dosierungsschemen für die anfängliche Verabreichung und Booster-Dosierungen sind ebenfalls variabel, können aber eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Verabreichungen einschließen. Die Dosierung des Impfstoffs kann auch von dem Verabreichungsweg abhängen und somit von einem Wirt zum anderen variieren.
Die Polymere der vorliegenden Erfindung, wie angewandt auf Impfstoffformulierungen, sind auch für neue Impfstoffstrategien nützlich, wie bei der Verwendung von DNA oder Antisinn-RNA. Als Mikroteilchen-Träger können die Polymere der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, um DNA zu enthalten, codierend für ein Gen oder Gene für einen antigenischen Bereich eines Virus, wie das Kernprotein oder das Hüllprotein. Wenn die DNA aus dem Träger freigegeben wird, nehmen die Wirtszellen die Fremd-DNA auf, exprimieren das Gen von Interesse und erzeugen das entsprechende virale Protein innerhalb der Zelle. Vorteilhafterweise tritt das virale Protein in den Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex-Weg der Zelle ein, welcher zellvermittelte Immunität hervorruft. Standardimpfstoff-Antigene werden, im Vergleich dazu, in Zellen aufgenommen und durch das MHC-Klasse II-System, welches Antikörperantworten stimuliert, verarbeitet.
Die DNA kann in der Form von nackter DNA vorliegen, welche frei von allen assoziierten Proteinen ist und welche kein komplexes Vektorsystem erfordert. Das gewünschte Gen kann in einen Vektor, wie ein Plasmid, eingekapselt innerhalb der hierin beschriebenen Mikroteilchen inseriert und in die Gewebe eines Säugetieres injiziert werden, welches das Genprodukt exprimiert und eine Immunantwort hervorbringt.
Antisinn-Oligonukleotide können ebenfalls in Zusammenhang mit den Polymeren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Nukleinsäuresequenzen können entworfen werden, um an eine spezifische entsprechende mRNA-Sequenz für ein bekanntes Protein zu binden, um die Herstellung des Pro teins zu inhibieren. Die hierin beschriebenen Mikroteilchen können verwendet werden, um derartige Antisinn-Nukleotide (Oligonukleotide oder exprimierte Nukleotide) als eine therapeutische Strategie zur Behandlung von verschiedenen immunologischen Erkrankungen sowie Bluthochdruck bzw. Hypertension, kardiovaskulärer Erkrankung und Krebs abzugeben.
Die Charakteristik der langsamen Freisetzung der hierin entwickelten Polymermikroteilchen findet auch Verwendung auf dem Gebiet der Pharmakologie, wo die Mikroteilchen verwendet werden können, um pharmakologische Mittel auf eine langsame und kontinuierliche Weise abzugeben. Ein großer Bereich an Arzneimitteln, wie Antihypertensiva, Analgetika, Steroide und Antibiotika, können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Arzneimittelabgabesystem mit langsamer Freisetzung vorzusehen.
Das Polymer in der Form einer Folie, bei welcher ein biologisches Mittel eingeschlossen oder physikalisch damit vermischt ist, kann ebenfalls Verwendung als eine Beschichtung für chirurgische Implantate und Vorrichtungen finden. Zum Beispiel kann das Polymer als eine Folie bzw. ein Film mit darin eingebrachtem Antibiotikum verwendet werden, um chirurgisch implantierte Katheter zu beschichten, um eine kontinuierliche langsame Freisetzung von Antibiotika zur Bekämpfung von Infektion vorzusehen.
Der Mikroteilchen-Träger kann auch als ein diagnostisches Mittel nützlich sein. Zusammen mit dem passenden Antikörper können Bilderzeugungsmittel mit den Mikroteilchen eingebracht bzw. damit vermengt werden. Auf diese Weise können erkrankte Gewebe angezielt und abgebildet werden, um den klinischen Verlauf einer Krankheit zu identifizieren oder zu überwachen.
Die Polymere, wie Mikroteilchen, finden auch Verwendung in Diagnosekits, wenn sie im Zusammenhang mit geeigneten Antikörpern verwendet werden.
Beispiele
Die obenstehende Beschreibung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein vollständigeres Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele gewonnen werden. Diese Beispiele sind lediglich aus Zwecken der Veranschaulichung beschrieben und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu beschränken. Veränderungen in der Form und Substitution von Äquivalenten werden in Betracht gezogen, wie es die Umstände nahelegen oder zweckdienlich erscheinen lassen können. Obwohl hierin spezifische Ausdrücke verwendet worden sind, werden solche Ausdrücke in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken von Einschränkungen beabsichtigt.
Verfahren der Chemie, organischen Chemie, Polymerchemie, Proteinbiochemie und Immunologie, welche angewandt jedoch nicht explizit in dieser Beschreibung und diesen Beispielen beschrieben werden, sind umfassend in der wissenschaftlichen Literatur berichtet und liegen durchaus innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns auf dem Gebiet.
Beispiel 1:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von N-Z-L-Serin-β-lacton.
Die Herstellung dieses cyclischen N-geschützten Aminosäurelactons basierte auf einer modifizierten Vorgehensweise, in welcher eine N-geschützte α-Aminosäure umgesetzt wird, um cyclisiertes Pseudo-α-Aminosäure-Monomer zu erhalten (Ref. 6). Alle Glaswaren wurden über Nacht in einem auf 120°C eingestellten Ofen vorgetrocknet. Vor der Verwendung wurden sie in einem Vakuum-Exsikkator gekühlt und unter einem Strom von trockenem Stickstoff 10 Minuten lang gespült.
In einen 1 Liter großen Dreihalsrundkolben wurde unter Stickstoff Triphenylphosphin (TPP; Aldrich; 7,87 ml; 50 mmol; FW: 174,16) gegeben. Hierzu wurden 200 ml einer Lösung aus wasserfreiem Acetonitril (CH₃CN; Aldrich): wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF; Aldrich) (Volumenverhältnis 85 : 15) mittels einer Spritze zugesetzt, und es wurde gerührt, bis das feste TPP aufgelöst war. Zu dieser Lösung wurde Diethylazodicarboxylat (DEAD; Aldrich; 7,87 ml; 50 mmol; FW: 262,29) über eine Spritze zugesetzt, und die Lösung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde dann durch Eintauchen des Reaktionsgefäßes in ein Acetonitril/Trockeneis-Bad auf etwa –45°C bis –48°C gekühlt. Sobald die Innentemperatur der Lösung etwa –45°C erreichte, wurde eine Lösung von N-Carbobenzyloxy-L-serin (N-CBZ-L-Serin; Sigma; 11,94 g; 49,8 mmol; FW: 239,2) in 200 ml wasserfreiem CH₃CN : THF (Volumenverhältnis 85 : 15) langsam über einen Tropftrichter über eine Dauer von 1 Stunde zugesetzt. Die Temperatur der Lösung wurde während der Zugabe bei etwa –45°C gehalten und, sobald die Zugabe vollständig war, bei kontinuierlichem Rühren über Nacht langsam auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen. Diese Reaktion führt zur Bildung einer Esterbindung zwischen der Serin-Hydroxylseitenkette und der Carbonsäure in Gegenwart der CBZ-geschützten α-Aminogruppe. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Lösungsmittel durch Verdampfung (35°C bis 45°C) entfernt. Dies ergibt eine gelbe Öl/Aufschlämmung (~35 g). Zu dieser Aufschlämmung wurden 50 ml einer Lösung aus Dichlormethan : Ethylacetat (Volumenverhältnis 85 : 15) zugesetzt, was zur Ausfällung des Nebenprodukts 1,2-Dicarbethoxyhydrazin führt. Dieses Material wurde durch Filtration unter Vakuum entfernt, gefolgt von Lösungsmittelentfernung durch Verdampfen. Die obenstehende Vorgehensweise kann wiederholt werden, um restliche Nebenprodukte weiter zu entfernen. Das wachsartige feste Rohmaterial wurde dann durch Silicagel-Säulenchromatographie mit dem Elutionsmittel 85 : 15 Dichlormethan : Ethylacetat als Lösungsmittel gereinigt. Das Produkt Serinlacton kann durch Dünnschichtchromatographie identifiziert werden, da dieses Material einen R_f von 0,75 auf Silicaplatten, eluiert mit 85 : 15 Dichlormethan : Ethylacetat, bei Färbung mit einer 1M H₂SO₄-Lösung aufweist und auch UV-sichtbar ist. Das Produkt wurde aus Ethylacetat : Hexan (~ 1 Liter) umkristallisiert, filtriert und im Vakuum getrocknet.
Nach der Umkristallisierung wird ein sauberer weißer Feststoff bei 40% Ausbeute erhalten, mit einem Schmelzpunkt (Tm = 133–134°C) und allen anderen physikalischen Parametern (NMR, IR, Massenspektroskopie, Elementanalyse), welche mit denjenigen konform sind, welche früher gezeigt wurden (Ref. 6).
Beispiel 2:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung des Copolymers Poly-D,L-lactid-co-glycolid-copseudo-Z-serinester (PLGpZS), wie gezeigt in der 1.
Glaswaren wurden über Nacht vorgetrocknet. Vor der Verwendung wurden sie in einem Vakuum-Exsikkator gekühlt. Zusätzlich muß das Polymerisationsgefäß (Glasampulle) siliconisiert werden (SurfaSil; Pierce; 2% Lösung in Toluol), und alle Transfeneaktionen und Zugaben von Reagenzien und Monomeren in das Polymerisationsgefäß müssen in einer Handschuhbox, die unter einer trockenen Stickstoff-Umgebung gehalten wird, durchgeführt werden.
Vor der Polymerisation wurden das D,L-Lactid (2,6-Dimethyl-l,4-dioxan-2,5-dion; Aldrich; FW: 144,13) und Glycolid (Boehringer Ingelheim; FW: 116,096) aus wasserfreiem Ethylacetat in der Handschuhbox umkristallisiert und etwa 2 Tage lang im Vakuum getrocknet. Nach vollständiger Trocknung können die Monomere in der Handschuhbox aufbewahrt werden, wobei das frisch umkristallisierte Serinlacton (aufbewahrt bei 0°C) von Beispiel 1 direkt in die Handschuhbox eingebracht wird. Alle Monomeren und Katalysatoren/Initiatoren wurden abgewogen und in Glasampullen innerhalb der Handschuhbox überführt.
Die gesamte vereinigte Masse von in die Ampulle überführtem Monomer liegt typischerweise im Bereich von 1 g bis 5 g, wobei das Molverhältnis von D,L-Lactid : Glycolid : Serinlacton im Bereich von 42,5 : 42,5 : 15,0 bis 49,0 : 49,0 : 2,0 liegt. Ein Molverhältnis von D,L-Lactid : Glycolid : Serinlacton von 47,5 : 47,5 : 5,0 wurde in der bevorzugten Ausführungsform angewandt. Eine Stammlösung von Katalysator (Zinn-2-ethylhexanoat (Sn(Oct)₂); Sigma; FW 405,1, 1,25 g/ml) in wasserfreinem Chloroform (Aldrich) wurde in der Handschuhbox hergestellt und über eine Mikrospritze in die Glasampulle gegeben (Molverhältnis von Katalysator zu Monomer = 1/1000). Ein Rührstab wurde ebenfalls in die Ampulle eingebracht. Ein eingefettetes Schliffglasstopfen-Ventil wurde auf die Ampulle gesetzt, um die inerte Umgebung während des Entnehmens aus der Handschuhbox beizubehalten. Die Ampulle wurde dann direkt an eine Vakuumleitung unter langsamer Entfernung von Chloroform durch Verdampfen angeschlossen. Die Ampullen wurden dann in ein Ölbad bei ca. 120°C gebracht, um alle Reagenzien zur Schmelze zu bringen, gefolgt von Flammen-Verschließen und Einbringen in einen thermoregulierten Ofen bei 120°C während 28 Stunden. Nach der Reaktion werden die Ampul-len durch Einbringen in flüssigen Stickstoff abgeschreckt und bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt. Die Ampulle wurde zerbrochen und das Rohpolymer wurde durch Lösen in Chloroform zurückgewonnen. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfung entfernt und das Rohpolymer wurde im Vakuum getrocknet, wodurch man ein bernsteinfarbenes kristallines Material erhielt (Ausbeute 80% bis 90%).
Das Polymer wurde durch Lösen in Chloroform, Abfiltrieren von unlöslichem Material und Fällen in Hexan (Aldrich) gereinigt. Das Polymer wurde durch Filtration gewonnen, und diese Vorgehensweise wurde wiederholt, um die vollständige Entfernung von nicht-umgesetztem Monomer sicherzustellen. Das Polymer wurde etwa 2 Tage lang im Vakuum getrocknet, wodurch man ein sauberes weißes Pul-ver in 30% bis 35% Gesamtausbeute nach der zweiten Fällung erhielt. Das Molekulargewicht dieses Materials war abhängig von der Reaktionszeit bei typischen Werten von Mw = 17000 – 22000, Mn = 6500 – 8000. Eine Differentialscanningkalorimetrie(DSC)-Analyse zeigt einen einzigen Übergang an, was kennzeichnend für ein statistisches amorphes Polymer ist. Glasübergänge (Tg) liegen im Bereich von 39°C bis 43°C abhängig vom Molekulargewicht des erhaltenen Materials. Der Seringehalt des Polymers wurde durch Aminosäureanalyse (AAA), diagnostisch für das Phenylthioisocyanat-Serinderivat, erhalten durch Hydrolyse des Polymers, ¹H-NMR (Integration von aromatischen Resten der CBZ-Schutzgruppe auf Serin relativ zu den Glycolid- und D,L-Lactid-Untereinheiten) und Elementanalyse (Stickstoff ist lediglich in der Seitenkette von Serin vorhanden) bestimmt. Die AAA-Analyse zeigte typischerweise 1,7% bis 2,1% Seringehalt an, wobei die ¹H-NMR-Analyse 2,0% bis 2,5% anzeigte bzw. die Elementanalyse 2,4% bis 3,4% Serin anzeigte. Eine IR-Analyse des Polymers war diagnostisch für das Vorliegen von Ester-, Carbamat- und Hydroxylgruppen.
Die ¹H-NMR ermöglichte auch die Bestimmung der relativen Einbaueffizienzen aller Monomerkomponenten unter den angegebenen Reaktionsbedingungen. Typische Verhältnisse von D,L-Lactid : Glycolid : Z-Serin, gefunden im gereinigten Polymer, belaufen sich reproduzierbar auf 52,0 bis 54,0% D,L-Lactid, 41,0% bis 43,5% Glycolid bzw. 2.0% bis 2,5% Z-Serin.
Die ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Signalintensitäten für Resonanzen, die für Glycolid oder D,L-Lactid einzigartig sind, sind gut voneinander aufgelöst und empfindlich gegenüber Sequenzeffekten. Die beobachteten Muster unterstützen eine statistische Sequenzverteilung.
Beispiel 3:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung des Copolymers Poly-D,L-lactid-co-gycolid-copseudo-serinester (PLGpS), wie gezeigt in der 1.
Sämtliche Glaswaren wurden über Nacht vorgetrocknet. Vor der Verwendung wurden sie in einem Vakuumexsikkator gekühlt und unter einem Strom von trockenem Stickstoff 10 Minuten lang gespült. Alle Reaktionen wurden unter einer inerten Atmosphäre aus trockenem Stickstoff durchgeführt.
In einen 100 ml großen Zweihalsrundkolben, ausgestattet mit einem Rührstab, wurden 400 mg Polymer (PLGpZS) eingebracht. Hierzu wurden 10 ml einer Lösung von 30% Bromwasserstoff in Essigsäure (Aldrich; FW: 80,92) zugesetzt, was für die Bildung einer Aufschlämmung ausreichend war. Die Aufschlämmung wurde 30 bis 45 Minuten lang gerührt und durch tropfenweise Zugabe von wasserfreiem Diethylether (Aldrich), gefolgt von wasserfreiem Methanol (Aldrich), abgeschreckt. Dies führt zur Polymerfällung, welches dann durch Vakuumfiltration isoliert wurde. Das Rohpolymer-Präzipitat wurde mit Diethylether gewaschen und erneut aus Chloroform : Hexan gefällt. Das gereinigte Polymer wurde im Vakuum etwa 2 Tage lang getrocknet, wodurch man ein sauberes weißes Pulver bei 50% bis 60% Gesamtausbeute erhielt. Das Molekulargewicht lag im Bereich von Mw = 15000-18000, Mn = 5000 – 6500. Die Rate der Entschützung der CBZ-Gruppe ist schneller als die kompetitive Spaltung des Estergrundgerüsts mit HBr/Essigsäure. Jedoch besteht unter diesen Bedingungen eine Verbreiterung der Molekulargewichtsverteilung und eine Verringerung des Molekulargewichts des Produktes als Folge der Verwendung dieses Reagenzes. Dieser Trend kann durch Ausführen der Reaktion während kürzeren Zeitintervallen verringert werden, oder durch Entfernen der Schutzgruppe durch Hydrierung unter Verwendung von Wasserstoff in Gegenwart von Palladium-auf-Aktivkohle eliminiert werden. Eine DSC-Analyse zeigt einen einzelnen Übergang, kennzeichnend für ein statistisches amorphes Polymer. Glasübergänge (Tg) lagen im Bereich von 42°C bis 45°C, abhängig vom Molekulargewicht des erhaltenen Materials. Der Seringehalt des Polymers wurde durch Aminosäureanalyse (AAA), diagnostisch für das Phenylthioisocyanat-Serinderivat, erhalten durch Hydrolyse des Polymers, und Elementanalyse (Stickstoff ist lediglich vorhanden in der Seitenkette von Serin) bestimmt. Die AAA-Analyse zeigte typischerweise 1,4% bis 1,7% Seringehalt, bzw. die Elementanalyse zeigte 2,0% bis 2,7% Serin. Eine IR-Analyse des Polymers war diagnostisch für das Vorliegen von Ester-, Amin- und Hydroxylgruppen.
Eine ¹H-NMR für restliches geschütztes Polymer zeigte, dass mehr als 90% der N-Carbobenzyloxygruppen erfolgreich entfernt wurden. Bei kürzeren Reaktionszeiten wird das Ausmaß der Entschützung einhergehend verringert. Typische Verhältnisse von D,L-Lactid : Glycolid : Z-Serin : Serin, welche im gereinigten Polymer gefunden werden, betragen reproduzierbar 53,0% bis 55,0% D,L-Lactid, 40,0% bis 43,0% Glycolid, 0,15% bis 0,25% Z-Serin bzw. 1,7% bis 2,1% Serin.
Beispiel 4:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer Folie aus den in Beispiel 2 und 3 synthetisierten Copolymeren.
Um die Folie herzustellen, wurden 50 mg Poly-D,L-lactid-co-glycolid (PLG) (Mw = 31000) (Vergleichsbeispiel), Poly-D,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-Z-serinester (PLGpZS) (Mw = 20000) oder Poly-D,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-serinester (PLGpS) (Mw = 19000) abgewogen und in einen 10 ml großen Becher eingebracht. Wasserfreies Chloroform (1 ml) wurde zugesetzt, um das Copolymer aufzulösen. Diese Lösung wurde filtriert und tropfenweise auf einen Mikroskopobjektträger, welcher in einer Petrischale eingebracht war, gegeben. Die Petrischale wurde dann mit einem 250 ml großen Becherglas abgedeckt, um eine langsame Verdampfung über 48 Stunden hinweg zu gewährleisten. Die resultierenden Filme bzw. Folien waren durchscheinend, und Kontaktwinkelmessungen, durchgeführt unter Verwendung eines Goniometers, ergaben durchschnittliche Werte von 75° für PLG, 75° für PLGpZS bzw. 68,2° für PLGpS. Somit sind die PLG- und PLGpZS-Copolymere von vergleichbarer Hydrophobizität zu dem PLGpS-Copolymer, welches sich als geringfügig hydrophiler erwies und eine höhere Oberflächenenergie aufwies.
Beispiel 5:
Dieses Beispiel veranschaulicht das Verfahren der Mikroteilchen-Bildung unter Einkapselung von PBS oder Antigen/PBS (Mikrokügelchen-Bildung).
Ein Flußdiagramm, welches das Verfahren der Mikroteilchenbildung veranschaulicht, wie hierin beschrieben, wird in der 3 gezeigt.
Spezifisch wurden 100 mg Copolymer zu 12 ml Dichlormethan gegeben. Hierzu wurden 800 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder 800 μl nicht-proteolytisches Hin-47-Analog (Konzentration typischerweise 1 bis 2 mg/ml) in PBS zugesetzt. Diese Mischung wurde dann homogenisiert (20 Sekunden bei 6000 U/min). Nach ihrer Bildung wurde diese Mischung in 100 ml einer 1,0%igen wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol (PVA) dispergiert und unmittelbar homogenisiert (40 Sekunden bei 8000 U/min), um eine Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion zu formen. Typische Größenverteilungen, wenn PBS oder ein typisches Antigen (Hin-47/PBS) als eingekapselter Stoff verwendet werden, sind in der 4 abgebildet. Polydisperse Mikroteilchen (mit einer Mehrheit von einer Größe von weniger als 10 Mikrometern) wurden unter diesen Bedingungen gebildet. Das Lösungsmittel wurde dann langsam durch Verdampfung entfernt, und die Mikrokügelchen durch Zentrifugation gesammelt. Die Teilchen wurden (5x) mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann in einem Trockeneis/Aceton-Bad gefroren und über Nacht lyophilisiert, wodurch man ein weißes rieselfähiges Pulver von Mikrokügelchen erhielt (typischerweise mit 1,5 bis 10 Mikrometern Größe, wie bestimmt durch Lichtstreuungs-Messungen und direkt bestätigt durch Rasterelektronenmikroskopie-Aufnahmen). Ein repräsentatives rasterelektronenmikroskopisches Bild für PLGpZS- oder PLGpS-Mikrokügelchen, welche PBS einkapseln, ist in der 5 gezeigt. Ein repräsentatives Rasterelektronen mikroskop-Bild für PLGpZS- oder PLGpS-Mikrokügelchen, welche ein typisches Antigen (nichtproteolytisches Hin-47-Analog) in PBS einkapseln, ist in der 6 gezeigt.
Durch das obenstehend angegebene Verfahren sind Mikroteilchen, enthaltend mehrere unterschiedliche Antigene) und/oder Antigene) + Adjuvans, hergestellt worden (siehe Tabellen 1 und 5).
Beispiel 6:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Mikroteilchen-Kernbeladungseffizienz und Antigenepitop-Zurückgewinnung aus derartigen Mikroteilchen.
Es wurden zwei Variationen des gleichen Verfahrens angewandt, um den Antigengehalt oder die "Kernbeladung" der isolierten Mikroteilchen zu bestimmen. Eine Aminosäureanalyse wurde an den Hydrolysaten von Mikroteilchen durchgeführt, erhalten entweder durch Säurehydrolyse (6M HCl) der festen Teilchen oder durch Basen/SDS-Hydrolyse (0,1 N NaOH/1% SDS), gefolgt von Neutralisation mit 0,1 N HCl. Alternativ dazu können die festen Mikrokügelchen in DMSO, einem kompatiblen Lösungsmittel, welches sowohl Polymer als auch Protein solubilisiert, gelöst werden, und eine Aminosäureanalyse wird direkt an der lyophilisierten Probe durchgeführt. Die durch Säure oder Base vermittelte Hydrolyse erwies sich als das bevorzugte Verfahren, welches die am besten reproduzierbaren Ergebnisse (+/- 5%) ergab. Wo verfügbar, wurde ein stichhaltiger Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) als polyklonaler Assay an den Hydrolysaten durchgeführt, um die Epitop-Äquivalenz zu bestimmen.
Spezifisch gesagt, wurde für die Quantifizierung von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog-Antigen durch ELISA das nicht-proteolytische Hin-47-Analog-Antigen auf mit affinitätsgereinigten Meerschweinchen-Anti-Hin-47 beschichteten Mikrotitervertiefungen eingefangen (man gibt 50 μl einer 2 μg/ml Lösung von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog-Antigen pro Vertiefung zu), welche mit 5% Magermilch in PBS blockiert worden sind. Das vorhandene Antigen wurde durch einen Affinitätsgereinigten Kaninchen-Anti-Hin-47, gefolgt von Meerrettichperoxidase-F(abs)2-Esel-Anti-Kaninchen-IgG, nachgewiesen. Um die Farbe dieser Reaktion zu entwickeln, wurden 100 μl des Substrats H₂O₂ (9 Teile) in Gegenwart von Tetramethylbenzidin (TMB) (1 Teil) zugesetzt, und der Reaktionsfortschritt durch Zusetzen von 50 μl einer 2 M Schwefelsäurelösung in jede Vertiefung beendet. Die Intensität der Farbe (abgelesen bei 450 nm) war direkt proportional zur Menge an nichtproteolytischem Hin-47-Analog in der Vertiefung. Die Konzentration von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog in jeder Testprobe wurde durch Extrapolation auf einer Eichkurve abgeleitet, welche durch Mehrfach-Verdünnungen einer Referenzprobe erhalten wurde. Alle Proben wurden in doppelter Ausfertigung analysiert.
Die Aminosäureanalyse für Kernbeladung und Hin-47-spezifische polyklonale ELISA-Analyse der Epitop-Zurückgewinnung für Mikroteilchen, welche nicht-proteolytisches Hin-47-Analog oder nichtproteolytisches Hin-47-Analog plus BAY R1-005 innerhalb von PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Copolymeren einkapselten, ist in der Tabelle 2 gezeigt. Die Kernbeladungen für Mikroteilchen, hergestellt lediglich aus Hin-47, liegen im Bereich von 20% bis 43%, wobei 10% bis 31% des Epitops während der Formulierung beibehalten wurden. Die Kernbeladungen für Mikroteilchen, hergestellt aus nicht-proteolytischem Hin-47-Analog in Gegenwart von BAY R1-005, liegen im Bereich von 26 % bis 59% (ein absoluter Zuwachs von 6% bis 16%), wobei 20% bis 39% (ein absoluter Zuwachs von 4% bis 18%) des Epitops während der Formulierung behalten werden. Somit erhöht die Formulierung in Gegenwart von BAY R1-005 gleichzeitig die Beladungseffizienz und dient dazu, das Epitop zu schützen.
Die Aminosäureanalyse der Kernbeladung für Mikroteilchen, welche rD-15 innerhalb von PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Copolymeren einkapseln, ist in Tabelle 3 gezeigt. Es wurden Kernbeladungen im Bereich von 39% bis 44% erhalten. Dieses Protein war Membran-abgeleitet und somit hydrophober als das nicht-proteolytische Hin-47-Analog des vorausgehenden Beispiels. Erhöhte Einkapselungseffizienzen im Verhältnis zum nicht-proteolytischen Hin-47-Analog von Beispiel 10 wurden routinemäßig bei der Verwendung dieses Antigens beobachtet.
Die Aminosäureanalyse für Kernbeladung und Epitop-Zurückgewinnung für Mikroteilchen, welche einen Cocktail von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog und rD-15 (1 : 1-Cocktail) innerhalb von PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Copolymeren einkapselten, ist in der Tabelle 3 gezeigt. Es wurde erwartet, dass die gemeinsame Einkapselung von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog in Gegenwart von rD-15 zu höheren Gesamt-Beladungseffizienzen führen würde. Kernbeladungen im Bereich von 35% bis 62% wurden erhalten, wobei 8% bis 26% des nicht-proteolytischen Hin-47-Analog-Epitops während der Formulierung beibehalten wurden. Die Gesamtbeladungseffizienz der hydrophileren Komponente (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog) wurde durch Co-Einkapselung mit rD-15 bei Formulierung mit PLGpZS- oder PLGpS-Copolymeren erhöht. Dieser Effekt wurde nicht beobachtet, wenn PLG verwendet wurde. Ungeachtet der Copolymer-Formulierung wurde eine ähnliche Epitop-Zurückgewinnung des nicht-proteolytischen Hin-47-Analogs im Vergleich zu Beispiel 10 erhalten.
Die Aminosäureanalyse der Kernbeladung für Mikroteilchen, welche Flu X-31 oder Flu X-31 und BAY R1-005 innerhalb von PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Copolymeren einkapselten, wird in der Tabelle 4 gezeigt. Kernbeladungen im Bereich von 26% bis 40% wurden mit Flu X-31 erhalten, und für Flu X-31 in Gegenwart von BAY R1-005 wurden Kernbeladungen im Verhältnis von 31% bis 53% erhalten. Somit wurde ein absoluter Zuwachs von 5% bis 13% erhalten, wenn in Gegenwart von BAY R1-005 formuliert wurde. Die einzige Ausnahme war die Formulierung von Flu X-31 mit BAY R1-005 und PLGpS, wo eine absolute Verringerung von 9% beobachtet wurde.
Es wurde eine Kernbeladung von 21% für PLGpS-Mikroteilchen, welche Flu A-Texas einkapselten, erhalten. Für PLGpS-Mikroteilchen, welche Flu A-Texas in Gegenwart von BAY R1-005 einkapselten, wurde eine Kernbeladung von 32% erhalten.
Als ein verschiedenartiger Stamm von Flu (A-Texas) mit BAY R1-005 und PLGpS-Copolymer eingesetzt wurde, wurde noch einmal die Neigung zur Erhöhung der Einkapselungseffizienz beobachtet. Bei Formulierung von PLGpS mit Flu A-Texas in Gegenwart von BAY R1-005 wurde ein absoluter Zuwachs von 11% erhalten. Dies legt nahe, dass die Formulierung für PLGpS und Proteine in Gegenwart von BAY R1-005 in jedem Fall optimiert sein muß. Wie im Beispiel 10 hat die Zugabe des Coadjuvans BAY R1-005 zu höheren Beladungseffizienzen geführt.
Die Aminosäureanalyse der Kernbeladung für Mikroteilchen, welche Flu(trivalent)-Impfstoff oder Flu(trivalent)-Impfstoff und BAY R1-005, DC-Chol oder PCPP innerhalb von PLGpS-Copolymeren einkapseln, wird in der Tabelle 6 gezeigt. Es wurden hervorragende Kernbeladungseffizienzen im Bereich von 72% bis 104% unter Anwendung des Vorgehens von Beispiel 5 erhalten. Die Verbesserung der Einkapselungseffizienzen ist ein allgemeines Ergebnis, das beobachtet wird, wenn die Optimalkonzentration an Protein verwendet wird, um die primäre Emulsion zu bilden. In diesem Fall wurde experimentell bestimmt, dass die Optimum-Konzentration etwa 0,5 mg/ml beträgt.
Die Aminosäureanalyse für Kernbeladung und die rUrease-spezifische polyklonale ELISA-Analyse der Epitop-Gewinnung für Mikroteilchen, welche rUrease oder rUrease plus DC-Chol, PCPP oder CT-X innerhalb von Copolymeren einkapseln, ist in der Tabelle 7 gezeigt. Die Epitop-Zurückgewinnung ist definiert als der Unterschied zwischen dem durch Aminosäureanalyse erhaltenen Gesamtprotein und dem Gesamtprotein, erhalten durch polyklonalen ELISA, ausgedrückt als ein Prozentsatz. Die Kernbeladungen für Mikroteilchen, welche lediglich aus rUrease hergestellt sind, belaufen sich auf etwa 46%, wobei etwa 72% des Epitops während der Formulierung zurückgewonnen werden. In ähnlicher Weise betragen die Kernbeladungen für Mikroteilchen, hergestellt aus rUrease in Gegenwart DC-Chol, etwa 44%, wobei etwa 69% Epitop zurückgewonnen werden. Ein geringfügig höheres Gesamtprotein wurde für Mikroteilchen bestimmt, welche aus rUrease in Gegenwart von PCPP hergestellt wurden. Eine Kernbeladung von 67% und eine Epitop-Zurückgewinnung von etwa 55% wurden für diese Kombination festgestellt. Für die rUrease/CT-X-Kombination konnte die Gesamtkernbeladung für rUrease nicht durch Aminosäureanalyse eingeschätzt werden, da sowohl rUrease als auch CT-X zu diesem Wert beitragen. Ein polyklonaler ELISA-Assay für CT-X wurde entwickelt, und Mikroteilchen-Hydrolysate wurden separat hinsichtlich Gesamt-rUrease und CT-X getestet. Es wurde eine Epitop-Zurückgewinnung von 53% für rUrease bzw. von 59% für CT-X festgestellt. SDS-PAGE und Western-Blots, durchgeführt an diesen Mikroteilchen-Hydrolysaten, bestätigten das Vorliegen von nicht-abgebauter rUrease und CT-X.
Es wurden geeignete Kontrollen durchgeführt, um zu gewährleisten, dass der polyklonale ELISA-Assay für rUrease von Zusatzstoffen, wie DC-Chol und PCPP, unbeeinflußt war. Im Falle von PCPP war der Assay häufig problematisch und schwankend. Es wurde kein ähnliches Problem festgestellt, wenn rUrease in Gegenwart von DC-Chol geassayt wurde.
Beispiel 7:
Dieses Beispiel veranschaulicht die in vitro-Freisetzungsraten und die gesamte kumulative prozentuale Zurückgewinnung von Protein für ein Modellantigen (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog), eingekapselt innerhalb von PLG (verwendet als Kontrolle zu Vergleichszwecken) und den synthetisierten Copolymeren PLGpZS und PLGpS.
Von dem zu antigenhaltigen Mikrokügelchen formulierten PLG wurde bestimmt, ein Molekulargewicht Mw = 26000 bei einem Verhältnis von 50 : 50 von D,L-lactid : Glycolid aufzuweisen. Dieses Material ist von ähnlicher Konstitution und Molekulargewicht zu demjenigen, erhalten für die Copolymere PLGpZS und PLGpS der Beispiele 2 und 3. In einem typischen Experiment wurden 14 mg Mikrokügelchen (Kernbeladung an nicht-proteolytischem Hin-47-Analog für PLG = 2,8 μg/mg, PLGpZS = 5,7 μg/mg und PLGpS = 2,5 μg/mg, wie bestimmt durch Aminosäureanalyse der Mikrosphärenhydrolysate) in ein 2 ml großes Eppendorf-Röhrchen eingebracht, in welches 1,0 ml PBS (pH = 7,4) zugesetzt wurden. Das Röhrchen wurde dann in einen thermoregulierten, bei 37°C gehaltenen, Ofen ohne Bewegung eingebracht. Zu verschiedenen Zeitintervallen wurde die PBS-Lösung extrahiert und hinsichtlich Gesamtprotein mittels Aminosäureanalyse analysiert. Nach jeder Extraktion wurde die PBS-Lösung ersetzt, bei fortgesetzter Probennahme bis zu einem Maximum von 90 Tagen. In Kontrollexperimenten wurde die Mehrheit der Mikrokügelchen (> 80 Gew. %), hergestellt aus PLG- oder PLGpS-Copolymeren, bis zum Tag 45 aufgebraucht. Der Abbau der aus PLGpZS-Copolymeren formulierten Mikrokügelchen war beobachtetermaßen etwas langsamer, wobei er 60 Tage benötigte, um eine Zersetzung zu im wesentlichen dem gleichen Ausmaß aufzuzeigen.
Ähnliche Antigen-Freisetzungstrends wurden bei jeder Gruppe von Mikroteilchen beobachtet, wobei kleine Mengen an Protein über die ersten wenigen Tage hinweg freigegeben wurden. Dies verringerte sich bis zu fast nicht-nachweisbaren Grenzen bis zum Tag 14, wonach die Proteinfreisetzungsrate stetig bis zu einem Maximum etwa bei Tag 30 anstieg. Anschließend an diesen Zeitpunkt fiel die Freisetzung von Protein wiederum auf Spiegel, welche sich der Nachweisgrenze annäherten. Die insgesamte, prozentuale kumulative Zurückgewinnung von Protein aus diesen Proben lag im Bereich von 40% bis 65% relativ zu den jeweiligen Kernbeladungen jeder Gruppe von Mikrokügelchen.
Die 7A veranschaulicht die Freisetzungsrate zu spezifischen Zeitpunkten für jede Probe, und die 7B zeigt die prozentuale kumulative Freisetzung für jede untersuchte Probe. Es ist offensichtlich, dass unter diesen Bedingungen die beste Zurückgewinnung von Protein aus Mikrokügelchen der Reihenfolge PLGpS>PLG>PLGpZS folgt, obwohl die Kernbeladung für die PLGpZS-Mikroteilchen ungefähr das zweifache von derjenigen der PLG- oder PLGpS-Analoge war, und dies die Freisetzungsrate beeinflussen kann. Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass diese Matrix bei einer langsameren Rate zersetzt wird, und daher kann es zurückbleibendes Material innerhalb der Mikroteilchen geben. Beweise hierfür können in der 7B ersehen werden, wobei ein marginaler Anstieg der Protein-Zurückgewinnung von Tag 60 bis zum Tag 90 für PLGpZS-Mikroteilchen beobachtet wurde. Über dieses gleiche Zeitintervall hinweg war aus PLG- oder PLGpS-Mikroteilchen zurückgewonnenes Protein im wesentlichen nicht-existent.
In Kontrollexperimenten wurden Überstandlösungen von PBS, erhalten aus periodischen Extraktionen von PBS-beladenen PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, welche bei 37°C inkubiert worden waren, hinsichtlich pH-Veränderungen überwacht. Es ist bekannt, dass der Erosionsvorgang für PLGA-Matrizes von Veränderungen in der pH-Mikroumgebung innerhalb des Mikroteilchens begleitet wird (Ref. 36). Dies kann einen ernsten Effekt auf die Proteinstabilität haben, da pH-induzierte Konformationsänderungen als Konsequenz dieser Änderungen folgen können. Ein Hinweis auf die Größe dieser Änderungen kann durch Verfolgen des pH-Wertes des umgebenden Mediums erhalten werden. Wir haben festgestellt, dass die Einbindung kleiner Prozentsätze von Aminosäure-Untereinheiten innerhalb des Copolymers diesen Vorgang verlangsamen kann. Dies kann während der Freisetzungsphase für gegenüber saurem pH empfindliche Proteine von Bedeutung sein. Spezifisch gesagt, wurden bei Inkubieren von ~10 mg Mikroteilchen in 1,2 ml PBS-Puffer (pH = 7,4) ungefähr 16 Tage benötigt, damit die Überstandextraktionen von PLG (Mw = 26000 Dalton) unter pH 5,0 fielen. In Analogie dazu wurde bestimmt, dass der pH der Überstandextraktionen, erhalten aus PLGpZS (Mw = 20000 Dalton, ungefähr 2,0% Serin eingebaut) bzw. PLGpS (Mw = 18000 Dalton, ungefähr 1,7% Serin eingebaut), sich jeweils ungefähr auf 5,5 bis 6,2 belief. Die Abbauraten für PLG und PLGpS, welche in dieser Untersuchung untersucht wurden, waren ähnlich (wie gemessen durch den Massenverlust der Matrix), wohingegen die PLGpS-Matrix sich bei einer verringerten Rate zersetzte.
Somit zeigt die in vitro-Freisetzungsuntersuchung, dass ein Abgabesystem mit verzögerter Freisetzung einer Einzeldosis durch Verwenden von polymeren Mikroteilchen, formuliert aus PLGpZS- oder PLGpS-Copolymeren, erzielt werden kann. Da pH-Änderungen bei Matrixerosion einen nachteiligen Effekt auf die Proteinstabilität aufweisen können, kann es darüber hinaus vorteilhaft sein, aus Pseudoserinester abgeleitete Matrizes, wie PLGpZS oder PLGpS, zu verwenden, wobei eine gewisse Pufferkapazität für diese Änderungen während der Proteinfreisetzungsphase existiert.
Beispiel 8:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog, eingekapselt oder physikalisch vermischt mit Mikroteilchen, in Mäusen, welche subkutan immunisiert wurden.
Um die Immunogenität von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog, eingeschlossen in PLG-, PLGpZSund PLGpS-Mikroteilchen, gebildet gemäß der vorliegenden Erfindung, zu untersuchen, wurden fünf 6 bis 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) subkutan (S. C.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 250 μl PBS (pH 7,4) an den Tagen 1 und 35 immunisiert: PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 0,2 μg oder 0,6 μg nicht-proteolytisches Hin-47-Analog (8A); und PLG-Mikroteilchen, hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 5, physikalisch vermischt mit 0,8 μg oder 2,5 μg nicht-proteolytischem Hin-47-Analog (8B).
Die Mäuse zeigten keine großen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach Erhalten von Mikroteilchen, welche eingekapseltes nicht-proteolytisches Hin-47-Analog enthielten, oder Mikroteilchen, welche physikalisch mit nicht-proteolytischem Hin-47-Analog vermischt waren. Seren wurden an den Tagen +10, +24, +35, +45 und +60 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Hin-47-IgG-Antikörpern durch antigenspezifischen ELISA ausgewertet. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung analysiert. Mikrotiterplatten-Vertiefungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 μl 0,2 μg/ml nicht-proteolytischem Hin-47-Analog in 0,05 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,0) inkubiert. Die Platten wurden mit PBS + 0,05% Tween 20 (operationell definiert als Waschpuffer) gewaschen. Die Vertiefungen wurden mit 200 μl 5%iger Magermilch (operationell definiert als Blocking-Puffer) inkubiert. Nach Waschen mit PBS + 0,05% Tween 20 wurden die Platten 1 Stunde lang bei 37°C mit 100 μl Probe inkubiert, von welcher eine Verdünnungsreihe in Blocking-Puffer angefertigt worden war. Die Vertiefungen wurden mit PBS + 0,05% Tween 20 gewaschen, und 100 μl HRP-konjugierter Antikörper (Ziege-Anti-Maus-IgG (H + L) (Jackson), Schaf-Anti-Maus-IgG1 (Serotec), Ziege-Anti-Maus-IgG2a (Caltag) oder Ziege-Anti-Maus-IgG2b (Caltag) in Blocking-Puffer wurden in jede Vertiefung zugesetzt. Nach 1stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Vertiefungen fünfmal mit PBS + 0,05% Tween 20 gewaschen, und 100 μl frisch hergestelltes Färbesubstrat [H₂O₂ (9 Teile) und TMB (1 Teil)] werden in jede Vertiefung zugesetzt. Nach 5 Minuten Inkubation im Dunklen bei Raumtemperatur wird die Reaktion durch Zusetzen von 50 μl einer 2M H₂SO₄-Lösung angehalten, und die optische Dichte des Fluids in jeder Vertiefung wurde bei 450 nm unter Verwendung einer Mikroplatten-Ableseeinrichtung bestimmt. Ein normaler Mausserum-Pool wurde verwendet, um die Grundlinien-Werte der optischen Dichte in dem Assay festzulegen. Hyperimmun-Maus-Hin-47-Antiserum wurde als eine Positivkontrolle verwendet. Prä-Immunseren wurden als Negativkontrolle verwendet.
Für die Serum-IgA-Analyse wurde das obenstehende Vorgehen mit der folgenden Abwandlung durchgeführt. Mikrotiterplatten-Vertiefungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 μl 1,3 μg/ml nicht-proteolytischem Hin-47-Analog in 0,05M Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH = 9,0) inkubiert, und 100 μl HRP-konjugiertes Kaninchen-Anti-Maus-IgA (ZYMED, CA) bei 0,06 μg/ml wurden in jede Vertiefung zugesetzt.
Für die sekretorische IgA-Analyse wurde das obenstehende Vorgehen mit der folgenden Modifikation ausgeführt. 100 μl HRP-konjugiertes Ratten-Anti-Maus-IgA (Biotin-Pharmigen) bei 0,06 μg/ml wurden in jede Vertiefung zugesetzt.
Die Serum-Antikörpertiter im Anschluß an die Immunisierung sind in den 8A und 8B gezeigt. Die Ergebnisse der Immunisierungen zeigen an, dass dem Immunsystem präsentiertes Antigen, eingeschlossen in PLG-, PLGpZS oder PLGpS-Mikroteilchen (8A), wesentlich stärker immunogen als lösliches Antigen bei Dosierungen war, welche suboptimal gegenüber denjenigen waren, welche mit löslichem Antigen allein erforderlich sind. Darüber hinaus wurde mit eingekapseltem nichtproteolytischem Hin-47-Analog einer Dosis von 0,2 μg oder 0,6 μg keine Dosisabhängigkeit beobachtet, wohingegen ein marginaler Anstieg des Titers mit löslichem nicht-proteolytischem Hin-47-Analog einer Dosis von 0,8 μg bzw. 2,5 μg festgestellt wurde.
Die Ergebnisse der Immunisierungen zeigen, dass dem Immunsystem präsentiertes Antigen, bei physikalischer Vermischung mit PLG-Mikroteilchen (8B) marginal besser immunogen ist als lösliches Antigen bei einer ähnlichen Dosis zu derjenigen, welche mit löslichem Antigen allein gegeben wird (0,8 μg oder 2,5 μg). Allerdings ruft die Verabreichung von Antigen in löslicher Form oder vermischt mit Mikroteilchen eine Antwort hervor, welche um einige Größenordnung kleiner ist als jene, die für innerhalb der Mikroteilchen eingekapseltes Antigen beobachtet wird, was die Vorteile der Einkapselung gegenüber löslichem oder physikalischem Vermischen allein zeigt.
Interessanterweise zeigt das IgG-Subtyp-Profil (8C) für vereinigtes Serum, erhalten aus den Blutproben am Tag 35 und 60 für Mikroteilchen-eingekapseltes nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, Mikroteilchen in physikalischer Mischung mit nicht-proteolytischem Hin-47-Analog oder lösliches nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, dass am Tag 35 IgG1 der dominante Subtyp war, wobei etwas IgG2b ungeachtet der Formulierung nachgewiesen wird. Am Tag 60 war es offensichtlich, dass die IgG-Subtypen, induziert durch nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, eingekapselt innerhalb von Mikroteilchen, einer Klassen-Umschaltung unterlegen waren, so dass IgG1, IgG2a und IgG2b noch gleichrangiger repräsentiert sind. Die IgG-Subtypen, induziert durch nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, physikalisch vermischt mit Teilchen oder in löslicher Form, waren am Tag 60 nominell die gleichen, wie diejenigen, welche für den Tag 35 bestimmt wurden, wobei der IgG1-Subtyp dominant war.
Somit kann gefolgert werden, dass die qualitative Natur der Immunantwort, vermittelt durch Mikroteilchen, welche Antigen einkapseln, im wesentlichen verschieden ist von derjenigen, erhalten durch physikalisches Vermischen mit Mikroteilchen oder durch lösliches Antigen allein. Das Vorliegen von IgG2a-Subtyp im BALB/c-Mausmodell wird im allgemeinen als kennzeichnend für einen TH₁-Weg, und IgG1 als kennzeichnend für einen TH₂-Weg angenommen. Es ist offensichtlich, dass über die subkutane Route der TH₂-Weg für lösliches Antigen oder für mit Mikroteilchen physikalisch vermischtes Antigen begünstigt wird, wohingegen bei innerhalb von Mikroteilchen eingekapseltem Antigen eine ausgeglichenere TH₁/TH₂-Antwort erreichbar ist.
Beispiel 9:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog, eingeschlossen in PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, gebildet in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, in intragastrisch immunisierten Mäusen.
Gruppen von fünf 6 bis 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden intragastrisch (I. G.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 250 μl 0,15 M NaHCO₃ (pH 9,0) an den Tagen 1, 7, 14 und 57 geimpft: PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 4,0 μg nicht-proteolytisches Hin-47-Analog; und PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, physikalisch vermischt mit 4,0 μg nicht-proteolytischem Hin-47-Analog (9A).
Die Mäuse zeigten keine großen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach Erhalten von Mikroteilchen, welche eingekapseltes nicht-proteolytisches Hin-47-Analog enthielten, oder Mikroteilchen, welche physikalisch mit nicht-proteolytischem Hin-47-Analog vermischt waren. Seren wurden an den Tagen +13, +35, +56 und +78 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Hin-47-IgGund IgA-Antikörpern durch antigenspezifischen ELISA, ausgewertet, wie beschrieben in Beispiel 8.
Seren und Darm-Waschungen wurden hinsichtlich des Vorliegens von Hin-47-spezifischen Antikörpern untersucht. Um Anti-Hin-47-IgG und -sIgA im Darmlumen nachzuweisen und zu quantifizieren, wurden die Mäuse durch Genickbruch getötet, ihr Dünndarm wurde entnommen und auf das Vorliegen von antigenspezifischen Antikörpern hin untersucht. Individuelle Dünndärme wurden vom Pylorus-Sphinkter bis zum Caecum abgelöst und über Kapillarröhren umgestülpt. Die umgestülpten Därme wurden in 5 ml eiskalter Enzyminhibitor-Lösung (0,15 M NaCl, 0,01 M Na₂HPO₄, 0,005 M EDTA, 0,002 M PMSF, 0,05 U/ml Aprotinin und 0,02% v/v NaN₃) 4 Stunden lang inkubiert. Die Därme wurden entnommen und die Überstände durch Zentrifugation (1000 × g, 20 Minuten) geklärt und bei 0°C bis zum Assay aufbewahrt. Anti-Hin-47-IgG- und sIgA-Titer in den Proben wurden durch Hin- 47-spezifischen ELISA, wie obenstehend beschrieben, bestimmt, jedoch wurde ein Ziege-Anti-Maus-IgA-Antiserum anstelle des Ziege-Anti-Maus-IgG-Antiserums verwendet.
Die Hin-47-spezifischen Serum-IgG-Antikörpertiter im Anschluß an I. G.-Immunisierung sind in der 9A gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Antigen (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog), eingebracht in PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, wesentlich immunogener war als lösliches Antigen von ähnlicher Dosis (4 μg) und besser war als Antigen, welches physikalisch mit den Mikroteilchen vermischt war, wenn die Zuführung auf dem intragastrischen Weg erfolgte. Es wurde experimentell bestimmt, dass eine Dosis an löslichem Antigen (20 μg), welche das fünffache von derjenigen war, welche innerhalb von Mikroteilchen eingekapselt verabreicht wurde (4 μg), erforderlich war, um eine im wesentlichen äquivalente Antwort hervorzurufen. Dieses Ergebnis ist für die meisten Proteine untypisch, da es viele Beispiele gibt, wo über 100 μg Antigen erfordert werden, um irgendeine signifikante Serum-IgG-Antikörperantwort auf dem intragastrischen Weg hervorzurufen.
Das IgG-Subtyp-Profil (9B) für vereinigtes Serum, erhalten aus den Blutproben am Tag 56 und 78 für Mikroteilchen-eingekapseltes nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, Mikroteilchen in physikalischer Vermischung mit nicht-proteolytischem Hin-47-Analog oder lösliches nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, zeigt einen ähnlichen Trend wie denjenigen, welcher in Beispiel 8 beobachtet wurde. Der IgG1-Subtyp war dominant, als Antigen in löslicher Form oder bei physikalischer Vermischung mit Mikroteilchen zugeführt wurde. Innerhalb von Mikroteilchen eingekapseltes nicht-proteolytisches Hin-47-Analog zeigt ein ausgeglicheneres Profil, bei welchem IgG1 und IgG2a noch gleichrangiger vertreten sind. Somit war über den intragastrischen Weg mit innerhalb von Mikroteilchen eingekapseltem Antigen eine ausgewogenere TH₁/TH₂-Antwort eneichbar.
Die 9C zeigt die Ergebnisse für Anti-Hin-47-IgA-Antikörperantworten, erhalten aus Blutproben an Tag 78. Mit löslichem Antigen bei 4 μg pro Dosis wurde kein nachweisbares Serum-IgA gefunden, jedoch bei 20 μg pro Dosis wurden einige wenige Antworter bzw. Responder beobachtet. Eine einzige signifikante Antwort wurde bei innerhalb von PLG-Mikroteilchen eingekapseltem Antigen beobachtet, und mäßige Antworten wurden für innerhalb von PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen eingekapseltes Antigen beobachtet. Eine ähnlich mäßige Antwort war für Antigen ersichtlich, welches physikalisch mit PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen vermischt war. Die höchsten durchschnittlichen Spiegel an Serum-IgA wurden für Antigen erhalten, welches innerhalb von PLGpS-Mikroteilchen eingekapselt war.
Die an Tag 78 durchgeführte Darm-Waschung enthüllte minimale Spiegel von IgG oder sIgA, spezifisch für Hin-47-Analog, in den Schleimhautsekretionen, erhalten von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog, eingekapselt innerhalb von PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen. Dies beruht wahr scheinlich auf den sehr niedrigen Spiegeln an eingekapseltem Antigen, welche in diesem Experiment verabreicht wurden (4 μg pro Dosis), da orale Dosen von Antigen im Bereich von 30 μg bis 100 μg normalerweise erforderlich sind, um eine signifikante mukosale Antwort in Abwesenheit von irgendwelchen anderen mukosalen Adjuvantien hervorzurufen.
Beispiel 10:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von nicht-proteolytischem Hin-47-Analog, eingeschlossen in PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, gebildet gemäß der vorliegenden Erfindung, in intranasal immunisierten Mäusen.
Gruppen von fünf 6 bis 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden intranasal (I. N.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 25 μl PBS (pH 7,4) an den Tagen 1, 7, 14 und 57 immunisiert: PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 4,0 μg nicht-proteolytisches Hin-47-Analog; und PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, physikalisch vermischt mit 4,0 μg nicht-proteolytischem Hin-47-Analog (10A).
Die Mäuse zeigten keine großen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach Erhalten der Mikroteilchen, welche eingekapseltes nicht-proteolytisches Hin-47-Analog enthielten, oder von Mikroteilchen, welche physikalisch mit nicht-proteolytischem Hin-47-Analog vermischt waren. Seren wurden an den Tagen +13, +35, +56 und +78 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Hin-47-IgGund IgA-Antikörpern durch antigenspezifischen ELISA ausgewertet, wie beschrieben in Beispiel B.
Seren und Lungenspülungs-Waschflüssigkeiten wurden hinsichtlich der Gegenwart von Hin-47-spezifischen Antikörpern untersucht. Um Anti-Hin-47-IgG und -sIgA im respiratorischen Trakt nachzuweisen und zu quantifizieren, wurden die Mäuse durch Genickbruch getötet, ein schmaler Einschnitt wurde in die Luftröhre angefertigt und ein Schlauch wurde durch die Luftröhre in die Lungen eingeführt, in welche 400 μl einer Enzyminhibitor-Lösung (0,15 M NaCl, 0,01 M Na₂HPO₄, 0,005 M EDTA, 0,002 M PMSF, 0,05 U/ml Aprotinin und 0,02% v/v NaN₃) injiziert wurden. Diese Lösung wurde dann abgezogen, auf Eis gebracht und die Überstände wurden durch Zentrifugation (1000 × g, 20 Minuten) geklärt und bei 0°C bis zum Assay aufbewahrt. Die Anti-Hin-47-IgG- und -sIgA-Titer in den Proben wurden durch Hin-47-spezifischen ELISA, wie beschrieben in Beispiel 8, bestimmt.
Die Hin-47-spezifischen Serum-IgG-Antikörpertiter im Anschluß an in. Immunisierung sind in der 10A gezeigt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein Antigen (nicht-proteolytisches Hin-47-Analog), eingebracht in oder physikalisch vermischt mit PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, immunogener war als lösliches Antigen von ähnlicher Dosis (4 μg). Eine im wesentlichen äquivalente Antwort wurde für Antigen, welches eingekapselt oder physikalisch mit Mikroteilchen vermischt war, auf dem intranasalen Weg erhalten.
Das IgG-Subtyp-Profil (10B) für vereinigtes Serum, erhalten aus den Blutproben am Tag 56 und 78, für Mikroteilchen-eingekapseltes nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, Mikroteilchen in physikalischer Mischung mit nicht-proteolytischem Hin-47-Analog oder lösliches nicht-proteolytisches Hin-47-Analog, veranschaulichte einen Trend, der unterschiedlich zu demjenigen war, welcher in Beispiel 8 oder Beispiel 9 gezeigt wird. Innerhalb von Mikroteilchen eingekapseltes nicht-proteolytisches Hin-47-Analog zeigte ein ausgewogeneres Profil, wobei IgG1, IgG2a und IgG2b an jedem von beiden Zeitpunkten (Tag 56 oder Tag 78) im wesentlichen gleich vertreten waren. Für in löslicher Form oder bei physikalischer Vermischung mit Mikroteilchen zugeführtes Antigen wurde ein ähnliches Profil am Tag 78 gesehen, worin auch signifikante Spiegel an IgG2a ersehen werden können.
Somit war die TH₁/TH₂-Antwort, über den intranasalen Weg im wesentlichen die gleiche, ungeachtet davon, ob Antigen innerhalb von Mikroteilchen eingekapselt war, physikalisch mit Mikroteilchen vermischt war, oder in löslicher Form vorlag.
Die l0C zeigt die Ergebnisse für Anti-Hin-47-IgA-Antikörper-Antworten, welche aus Blutproben an Tag 78 erhalten wurden. Bei löslichem Antigen wurde kein nachweisbares Serum-IgA gefunden. Allerdings war eine signifikante Antwort für Antigen ersichtlich, welches eingekapselt oder physikalisch mit Mikroteilchen vermischt ist. Die höchsten Spiegel wurden für Antigen erhalten, das entweder eingekapselt oder physikalisch vermischt war mit PLGpS-Mikroteilchen.
Die am Tag 78 ausgeführte Lungenwaschung enthüllt wesentliche Unterschiede hinsichtlich aus Sekretionen nachgewiesenem IgG und sIgA. Die Anti-Hin-47-IgG-Antikörperantwort (10D) von löslichem Antigen war vernachlässigbar, jedoch rief Antigen, eingekapselt innerhalb von Mikroteilchen oder physikalisch vermischt mit PLG-Mikroteilchen, signifikante Spiegel an IgG bei der Hälfte jeder untersuchten Gruppe hervor. Die am besten reproduzierbare Antwort für IgG wurde mit Antigen gefunden, das physikalisch mit aus PLGpZS oder PLGpS abgeleiteten Mikroteilchen vermischt war, wobei die meisten oder alle untersuchten Mäuse signifikante Spiegel an IgG besaßen.
Die Anti-Hin-47-sIgA-Antikörperantwort (10E) war ähnlich zu derjenigen, welche für IgG in der Figur 10D erhalten wurde. Die lösliche Antigen-Antwort war vernachlässigbar, während innerhalb von Mikroteilchen eingekapseltes oder mit PLG-Mikroteilchen physikalisch vermischtes Antigen eine gewisse Antwort zeigte. Die signifikanteste Antwort für sIgA wurde mit Antigen in physikalischer Vermischung mit aus PLGpZS oder PLGpS abgeleiteten Mikroteilchen gefunden, wobei die meisten Mäuse mäßige Spiegel an sIgA aufwiesen.
Die Induktion von örtlichem Schutz an Schleimhautoberflächen ist oft mit dem Vorhandensein von IgG und sIGA in örtlichen Sekretionen assoziiert. Obgleich es nicht festgestellt werden kann, dass die intranasale Immunisierung nicht auch zur Immunisierung des oberen respiratorischen Traktes führte, ist es klar, dass für eine Serum-IgG-Antikörperantwort mit Mikroteilchen eingekapseltes oder physikalisch vermischtes Antigen effektiv ist. Um lokale Sekretionen von IgG und sIgA zu induzieren, scheint das physikalische Vermischen von Antigen mit Mikroteilchen und, genauer gesagt, entweder aus PLGpZS oder PLGpS formulierten Mikroteilchen das unter diesen Umständen besser geeignete Verfahren zu sein.
Beispiel 11:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von Flu X-31 oder Flu X-31 plus einem Co-Adjuvans BAY R1-005, eingeschlossen in PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, gebildet gemäß der vorliegenden Erfindung, in subkutan immunisierten Mäusen.
Gruppen von sechs, 6 bis 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden subkutan (S. C.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 250 μl PBS (pH 7,4) am Tag 1 immunisiert: PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 5,0 μg Flu X-31 (1,5 μg HA) oder 5,0 μg Flu X-31 (1,5 μg HA) und 50 μg BAY R1-005, bei Verabreichung in löslicher Form, oder ungefähr 20 μg BAY R1-005 bei gemeinsamer Einkapselung (11).
Die Mäuse zeigten keine grossen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach Empfangen der Mikroteilchen, welche eingekapseltes Flu X-31 oder Flu X-31 mit BAY R1-005 enthielten. Seren wurden an den Tagen +21 und +33 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Flu-X31-IgG-Antikörpern mittels antigenspezifischem ELISA ausgewertet. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung analysiert.
Mikrotiterplatten-Vertiefungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 500 μl 4,0 μg/ml Flu X-31 in 0,05 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH = 9,6) inkubiert. Die Proben wurden mit PBS + 0,05% Tween 20 (operationell definiert als Waschpuffer) gewaschen. Die Vertiefungen wurden mit 200 μl 5%iger Magermilch (operationell definiert als Blocking-Puffer) inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS + 0,05% Tween 20 wurden die Platten eine Stunde lang bei 37°C mit 100 μl Probe inkubiert, von der eine Verdünnungsreihe in Blocking-Puffer angefertigt worden war. Die Vertiefungen wurden mit PBS + 0,05% Tween 20 gewaschen, und 100 μl HRP-konjugierter Antikörper (Ziege-Anti-Maus-IgG(H + L), IgG1, IgG2a oder IgG2b) in Blocking-Puffer wurden in jede Vertiefung zugegeben. Nach 1 Stunde langer Inkubation bei 37°C wurden die Vertiefungen 5 × mit PBS + 0,05% Tween 20 gewaschen und 100 μl frisch hergestelltes Färbesubstrat [H₂O₂ (9 Teile) und TMB (1 Teil)] werden in jede Vertiefung zugegeben. Nach 5 Minuten langer Inkubation im Dunklen bei Raumtemperatur wird die Reaktion durch Zugeben von 50 μl einer 2 M H₂SO₄-Lösung angehalten und die optische Dichte des Fluids in jeder Vertiefung wurde bei 450 nm unter Anwendung einer Mikroplatten-Ableseeinrichtung bestimmt. Ein normaler Maus-Serum-Pool wurde verwendet, um die Grundlinienwerte der optischen Dichte in dem Assay festzustellen. Hyperimmun-Maus-FluX31-Antiserum wurde als Positivkontrolle verwendet. Vorimmun-Serum wird als Negativkontrolle verwendet.
Die Serum-Antikörpertiter im Anschluß an Immunisierungen werden in der 11 gezeigt. Die Ergebnisse einer einzelnen Immunisierung (Tag 1) zeigen an, dass dem Immunsystem präsentiertes Antigen, eingeschlossen in PLG-, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen, immunogener war als lösliches Antigen allein. Die relevantesten Ergebnisse wurden mit Flu X-31 oder Flu X-31 plus BAY R1-005, eingekapselt innerhalb von PLGpZS-Mikroteilchen, erhalten. Obwohl eine suboptimale Dosis von BAY R1-005 innerhalb aller untersuchten Mikroteilchen eingekapselt wurde, erwies sich die immunogene Antwort mit den PLGpZS-Mikroteilchen ebenfalls als signifikant höher als diejenige, welche mit löslichem Flu X-31 und BAY R1-005 allein erhalten wurde.
Die in diesem Beispiel präsentierten Untersuchungen zeigen, dass virale Antigene aus Influenza-Virus immunogener gemacht werden können, und hohe Spiegel an Serum-IgG-Antikörpern hervorrufen, wenn die Antigene in Mikroteilchen eingeschlossen werden, die gemäß der vorliegenden Erfindung geformt wurden. Darüber hinaus zeigt die signifikant höhere Immunogenität, welche von den Mikroteilchen-Systemen nach einer einzelnen Immunisierung aufgezeigt wird, das Potential dieser Materialien zur Entwicklung als Einzeldosis-Impfstoffe.
Beispiel 12:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von Flu X-31 oder Flu X-31 plus einem Co-Adjuvans BAY R1-005, eingeschlossen in PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, gebildet gemäß der vorliegenden Erfindung, in intranasal immunisierten Mäusen.
Gruppen von sechs, 6 bis 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden intranasal (I. N.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 25 μl PBS (pH 7,4) an den Tagen 1 und 34 immunisiert: PLG-, PLGpZS- und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 5,0 μg Flu X-31 (1,5 μg HA) oder 5,0 μg Flu X-31 (1,5 μg HA) und 50 μg BAY R1-005, bei Verabreichung in löslicher Form, oder ungefähr 20 μg BAY R1-005 bei gemeinsamer Einkapselung (12).
Die Mäuse zeigten keine grossen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach Empfangen der Mikroteilchen, welche eingekapseltes Flu X-31 oder Flu X-31 mit BAY R1-005 enthielten. Seren wurden an den Tagen +21, +33 und +92 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Flu-X31-IgG-Antikörpern mittels antigenspezifischem ELISA, wie beschrieben in Beispiel 10, ausgewertet. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung analysiert.
Mäuse, welche I. N. mit löslichem Antigen, löslichem Antigen plus Co-Adjuvans oder eingekapseltem Antigen immunisiert wurden, zeigten eine ähnliche Anti-Flu X-31-IgG-Antikörperantwort. Interessanterweise wurde eine (wahrscheinlich aufgrund verzögerter Freisetzung) reduzierte immunogene Antwort für eingekapseltes Antigen plus Co-Adjuvans, im Verhältnis zu löslichem Antigen, Antigen plus Adjuvans oder eingekapseltem Antigen, am Tag +21 und +33 aufgezeigt, als die Verabreichung über den nasalen Weg erfolgte. Nach der zweiten Immunisierung (Tag 34) jedoch wurde ein signifikanter Anstieg in der Antwort bei diesen Gruppen beobacht, welcher zu im wesentlichen ähnlicher Immunogenität am Tag + 92 für alle Gruppen, ungeachtet des verwendeten Adjuvans, führte.
Die Ergebnisse der in diesem Beispiel beschriebenen I. N.-Immunisierungen zeigen, dass die Immunogenität eines Antigens oder Antigens plus Co-Adjuvans nicht signifikant durch Einschließen in Mikroteilchen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurden, erhöht werden kann.
Beispiel 13:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von Flu A-Texas oder Flu A-Texas plus BAY R1-005, eingekapselt in oder physikalisch vermischt mit Mikroteilchen, in subkutan immunisierten Mäusen.
Es ist bekannt, dass die meisten nicht-replizierenden viralen Impfstoffe mehrere Dosen erfordern, damit ausreichende Serum-Antikörperfiter vorliegen, um schutzgebend zu sein. Somit ist es stark erwünscht, dies durch Verabreichen einer Einzeldosis von Antigen zu erzielen.
Wir bemühten uns, die Immunogenität von Flu A-Texas oder Flu A-Texas plus einem Co-Adjuvans BAY R1-005, welches in PLGpS-Mikroteilchen eingeschlossen oder physikalisch mit Mikroteilchen vermischt war, verabreicht als Einzeldosis, gebildet gemäß der vorliegenden Erfindung, zu untersuchen. Gruppen von sechs, 6 bis 8 Wochen alten weiblichen DBA2-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden subkutan (S. C.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 250 μl PBS (pH 7,4) am Tag 1 immunisiert: PLGpS, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 1,0 μg Flu A-Texas (0,35 μg HA) oder 10,0 μg Flu A-Texas (3,5 μg HA) oder 1,0 μg Flu A-Texas (0,35 μg HA) und ungefähr 2,0 μg BAY R1-005 oder 10,0 μg Flu A-Texas (3,5 μg HA) und ungefähr 20 μg BAY R1-005, oder Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, physikalisch vermischt mit 1,0 μg Flu A-Texas (0,35 μg HA) und 20 μg BAY R1-005 oder 10,0 μg Flu A-Texas (3,5 μg HA) und 20 μg BAY R1-005 (13).
Die Kernbeladung von PLGpS-Mikroteilchen, enthaltend Flu A-Texas und BAY R1-005, wurde mittels Aminosäure-Analyse bestimmt (Tabelle 1). Die Masse der verabreichten Mikroteilchen wurde so eingestellt, dass die erforderliche Dosis von Flu A-Texas (1,0 μg Flu A-Texas (0,35 μg HA) für die Niedrigdosis-Gruppen oder 10,0 μg Flu A-Texas (3,5 μg HA) für die Hochdosis-Gruppen) zugeführt wurde. Somit war die Dosis an BAY R1-005, welche für die Hochdosis-Gruppen zugeführt wurde, zehnmal größer als die der untersuchten Niedrigdosis-Gruppen. Es wird erwartet, dass die Formulierungsbedingungen so eingestellt werden können, dass die Menge an BAY R1-005, welche coeingekapselt wird, vergleichbar ist.
Die Mäuse zeigten keine grossen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach Empfangen der Mikroteilchen, welche eingekapseltes Flu A-Texas oder Flu A-Texas mit BAY R1-005 enthielten. Seren wurden an den Tagen +21 und +42 oder +57 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von funktionalem Antikörper durch den Hämagglutinations-Inhibitions-Antikörper-Assay (HAI) ausgewertet. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung analysiert.
Der Influenza-Hämagglutinations-Inhibitions-Antikörper-Assay wurde mit hitzeinaktiviertem Mausserum durchgeführt, welches 30 Minuten lang mit 10% roten Blutzellen vom Huhn inkubiert worden war, um nicht-spezifische Inhibitoren zu entfernen. Zweifache Verdünnungen von Seren wurden in eine 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte gegeben, und 8 HA-Einheiten Virussuspension in einem gleichen Volumen wurden in jede Vertiefung zugesetzt, und es wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Eine 1,0%ige Suspension von roten Hühnerblutzellen wurde in jede Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Positiv- und Negativ-Referenzseren wurden in dem Test eingeschlossen, um Spezifität und Empfindlichkeit des Tests zu bestätigen. Die Positivseren stammten aus mit Influenzavirus immunisierten Tieren. Negativseren stammten aus mit PBS immunisierten Tieren, wobei der Titer kleiner oder gleich zu 15 sollte. Die HAI-Titer werden als der Kehrwert der höchsten Verdünnung ausgedrückt, welche die Hämagglutination von Erythrozyten vollständig inhibiert.
Die Ergebnisse einer Einzel-Immunisierung (Tag 1), wie gezeigt in 13, deuten darauf hin, dass am Tag +42 dem Immunsystem in löslicher Form oder eingekapselt in PLGpS-Mikroteilchen präsentiertes Antigen (13) vernachlässigbar oder wenig funktionellen Antikörper hervorruft. Für Flu (10 μg), welches dem Immunsystem als eine physikalische Mischung mit BAY R1-005 präsentiert wird, war die ausgelöste HAI-Antwort achtmal höher als die, welche mit löslichem Antigen einer ähnlichen Dosis beobachtet wird, und sechsmal höher als die, welche mit PLGpS/Flu-Mikroteilchen von einer der beiden Dosen erhalten wird. Die relevantesten Ergebnisse wurden für mit PLGpS/Flu (A-Texas)/BAY R1-005 formulierte Mikroteilchen erhalten, wobei der HAI-Titer der Niedrigdosisgruppe (1 μg) das achtfache desjenigen von löslichem Antigen betrug, und bei der Hochdosisgruppe (10 μg) das 32fache desjenigen von löslichem Antigen betrug. Ein mäßiger Anstieg des HAI-Titers wurde für zusätzliche Kontrollgruppen gefunden, bei denen physikalische Mischungen von Flu mit PLGpS-Mikroteilchen oder physikalische Mischungen von Flu, PLGpS-Mikroteilchen und BAY R1-005 untersucht wurden. Die mit physikalisch vermischtem Flu und PLGpS-Mikroteilchen hervorgerufenen HAI-Antworten waren festgestelltermaßen für die Niedrigdosisgruppe viermal höher und für die Hochdosisgruppe achtmal höher als diejenigen, welche mit löslichem Antigen von ähnlicher Dosis erhalten wurden. Die für physikalische Mischungen von Flu mit PLGpS-Mikroteilchen und BAY R1-005 hervorgerufenen HAI-Antworten waren festgestelltermaßen viermal höher als diejenigen, welche mit löslichem Antigen erhalten wurden, ungeachtet der Dosis.
Die in diesem vorgestellten Untersuchungen zeigen, dass virale Antigen aus Influenzavirus hohe Spiegel an funktionellen Antikörpern hervorrufen, wenn die Antigene in gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten Mikroteilchen in Gegenwart eines zusätzlichen Adjuvans eingeschlossen werden (wie bestimmt durch HAI-Titer). Es wird eine Dosis-Abhängigkeit beobachtet, und darüber hinaus zeigt der signifikant höhere funktionelle Antikörper (eine Korrelat für den Schutz), der von den gemeinsam eingekapselten Antigen- und Adjuvans-Mikroteilchen-Systemen nach einer einzigen Immunisierung aufgezeigt wird, weiterhin das Potential dieser Materialien für eine Entwicklung als Einzel-Dosis-Impfstoffe.
Beispiel 14:
Dieses Beispiel untersucht die Effekte von Formulierungsbedingungen, welche typischerweise für die Mikroeinkapselung bei individuellen Komponenten von Flu(trivalent)-Impfstoff eingesetzt werden.
Flu(trivalent)-Impfstoff enthält drei homologe HA-Stämme (A/Texas, A/Johannesburg und B/Harbin) bei ungefähr gleichen Mengen. Die Quantifizierung jeder spezifischen HA-Komponente ist durch "Single Radial Diffusion Assay" (SRID) bestimmt worden (Ref.32). Der SRID-Assay verwendet polyklonale Seren zum Nachweis jeder HA-Komponente und ist ein effektiver Indikator für Konformationsänderungen. Die mit diesem Assay nachweisbare Minimal-Konzentration für jede Komponente beläuft sich auf ungefähr 10 μg/ml. Eine Reihe von Proben, enthaltend 2,0 ml Flu(trivalent)-Impfstoff (Konzentration = 265 μg/ml), wurde hergestellt. Für jede dieser Proben wurde die Konzentration von A/Texas-spezifischem HA = 20,25 μg/ml, A/Johannesburg-spezifischem HA = 20,60 μg/ml bzw. B/Harbin-spezifischem HA = 21,42 μg/ml jeweilig durch SRID bestimmt.
Die Effekte von typischerweise in Mikroeinkapselungs-Verfahrensweisen verwendeten Lösungsmitteln, wie Dichlormethan (DCM) oder Ethylacetat (EtOAc), wurden unter Bedingungen ausgewertet, welche das Homogenisierungs-Vorgehen simulieren. Kurze Ultraschallbehandlungszeiten (30 Sekunden) wurden eingesetzt, um dies modellhaft auszuführen. Darüber hinaus wurden kleine Mengen an Zusatzstoffen, wie BAY (ein Glycolipopeptid) und DC-Chol (ein kationisches Lipid), untersucht, um zu bestimmen, ob eine verbesserte Zurückgewinnung von Antigen bestätigt werden kann.
Der Maßstab der Reaktion war ausgelegt, um die Vorgehensweisen, wie beschrieben in Beispiel 5, nachzuahmen. Das organische Lösungsmittel wurde aus jeder Mischung vor der SRID-Analyse verdampft, und geeignete Kontrollen wurden untersucht, um zu bestimmen, ob das organische Lösungsmittel, das Homogenisierungs-Verfahren oder die Zugabe von BAY oder DC-Chol die Ergebnisse in irgendeiner Weise störten.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der Tabelle 8 gezeigt. Die Effekte der Ultraschallbehandlung auf die Probe waren minimal, wie gezeigt durch Vergleich der Einträge 1 und 2. Die Einträge 3 und 4 zeigen, dass die Zurückgewinnung von Antigen durch Ultraschallbehandlung in organischen Lösungsmitteln, wie EtOAc oder DCM, beeinflußt wurde. Wenn EtOAc verwendet wird, werden 75 % A/Texas-spezifisches HA und 78% A/Johannesburg-spezifisches HA zurückgewonnen. Es war keine B/Harbin-spezifische HA-Komponente mit diesem Verfahren nach Behandlung mit EtOAc nachweisbar. Dieses Ergebnis zeigt, dass weniger als 50% dieser Komponente tatsächlich zurückgewonnen wurde, da die untere Nachweisgrenze etwa 10 μg/ml beträgt. Als DCM als Lösungsmittel verwendet wurde, wurden 85% A/Texas-spezifische HA-, 96% A/Johannesburg-spezifische HAbzw. weniger als 50% B/Harbin-spezifische HA-Komponente zurückgewonnen.
Die Einträge 5 und 6 untersuchen den Einfluß von BAY oder DC-Chol als Zusatzstoff in der organischen Phase mit EtOAc als Lösungsmittel. Für diese Kombination waren alle Komponenten nachweisbar (bei Spiegeln > 50%), wobei 65% (BAY) oder 82% (DC-Chol) A/Texas-spezifisches HA zurückgewonnen wurden, 82% (BAY) oder 70% (DC-Chol) B/Harbin-spezifisches HA zurückgewonnen wurden, bzw. 87% (BAY) oder 88% (DC-Chol) A/Johannesburg-spezifisches HA zurückgewonnen wurden. Die Einträge 7 und 8 untersuchen BAY oder DC-Chol als einen Zusatzstoff in der organischen Phase mit DCM als Lösungsmittel. Der Assay zeigt, dass einige Komponenten nicht voll-ständig zurückgewonnen wurden, oder dass der Assay auf irgendeine Weise beeinflußt wird. Genau gesagt, werden 91% (BAY) oder 92% (DC-Chol) A/Texas-spezifisches HA zurückgewonnen. In jedem Fall wurden weniger als 50% B/Harbin-spezifisches HA zurückgewonnen. Die Ergebnisse für A/Johannesburg-spezifisches HA sind wegen Abweichungen von der Linearität bei diesen Kombinationen nicht aussagekräftig. Dies trat nur auf, wenn DCM als Lösungsmittel verwendet wurde.
Die Maximum-Rückgewinnung aller Komponenten wurde für Formulierungen erhalten, welche Flu(trivalent)-Impfstoff in EtOAc mit BAY oder DC-Chol als Additiv verwendeten. Dieses Beispiel zeigt, dass Materialien mit lipophilen Eigenschaften, wie BAY oder DC-Chol, verwendet werden können, um Impfstoff-Formulierungen, enthaltend empfindliche Komponenten, zu stabilisieren. Materialien mit diesen Eigenschaften können an Grenzflächen so wirken, dass Proteine vor der hydropho ben Luft/Wasser-Oberfläche während der Homogenisierung geschützt werden. Die Proteinkonformation ist besonders empfindlich gegenüber diesen Effekten. Die in diesem Beispiel berichteten SRID-Assay-Ergebnisse unterstützen diese Schlussfolgerungen.
Beispiel 15:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Einzeldosis-Inununogenität von Flu(trivalent) oder Flu(trivalent) + Adjuvans-Cocktails, co-eingekapselt innerhalb von PLGpS-Mikroteilchen, in subkutan immunisierten Mäusen.
Flu(trivalent)-Impfstoff enthält drei homologe HA-Stämme (A/Texas, A/Johannesburg und B/Harbin) in ungefähr gleichen Mengen. Der Gesamt-HA-Gehalt in 10,0 μg Flu(trivalent)-Impfstoff beträgt 2,35 μg. Jede spezifische HA-Komponente ist durch "Single Radial Diffusion Assay" (SRID) (Ref.32) als 0,76 μg A/Texas, 0,81 μg A/Johannesburg bzw. 0,78 μg B/Harbin bestimmt worden.
In dieser Untersuchung war die Dosis von für jeden Komponenten-Stamm verabreichtem HA signifikant geringer als jene, welche im Beispiel 13 verwendet wurde. Zum Vergleich enthielt der in Beispiel 13 verwendete monovalente Impfstoff ungefähr 3,25 μg A/Texas-spezifisches HA.
Mäuse wurden auf dem subkutanen Weg in Gegenwart von Adjuvantien, ausgewählt auf Grundlage des Th₂/Th₁-Profils; DC-Chol (ein kationisches Lipid) und BAY R1-005 (Glykolipopeptid mit ausgewogenerem Th₂/Th₁), PCPP (Poly[di(carboxylatphenoxy)-phosphazen]-Natriumsalz (Virus Research Institute, Cambridge, MA), vorwiegend Th₂), immunisiert. Es wurde gezeigt, dass PLGpS-Mikroteilchen ein ausgewogeneres Th₂/Th₁-Profil induzieren, wie beschrieben in Beispiel 8.
Gruppen von acht, 6 bis 8 Wochen alten weiblichen DBA-2-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden subkutan (S. C.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 250 μl PBS (pH 7,4) am Tag 1 immunisiert: PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 10,0 μg Flu(trivalent – 2,35 μg HA) oder 10,0 μg Flu(trivalent – 2,35 μg HA) und BAY R1-005, DC-Chol oder PCPP (Tabelle 5).
Die Kernbeladung von PLGpS-Mikroteilchen, enthaltend Flu(trivalent), wurde mittels Aminosäure-Analyse bestimmt (Tabelle 6). Eine hervorragende Zurückgewinnung von Antigen wurde für alle PLGpS-Mikroteilchen-Formulierungen festgestellt (> 70%). Dieses Ergebnis ist konsistent mit unseren Feststellungen, dass die anfängliche Konzentration der Proteinlösung die Einkapselungs-Effizienzen dramatisch beeinflußen kann.
Die Masse der verabreichten Mikroteilchen wurde so eingestellt, dass die erforderliche Dosis von 10,0 μg Flu(trivalent – 2,35 μg Gesamt-HA) zugeführt wurde. Es wurde kein Versuch unternommen, die Dosis an co-verabreichtem Adjuvans zu optimieren, obwohl es erwartet wird, dass dies eine Funktion von Formulierungsbedingungen sein würde.
Die Mäuse zeigten keine grossen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach der Immunisierung mit PLGpS-Mikroteilchen, welche eingekapselten Flu(trivalent)-Impfstoff oder Flu(trivalent)-Impfstoff-und-Adjuvans-Cocktails enthielten. Seren wurden an den Tagen 21, 42 und 57 erhalten und wurden hinsichtlich des Gesamt-IgG, IgG1, IgG2a und hinsichtlich des Vorliegens von funktionellem Antikörper mittels des Hämagglutinations-Inhibitions-Antikörper-Assays (HAI) ausgewertet. Jeder Stamm (A/Texas, A/Johannesburg und B/Harbin) wurde untersucht, um die Effekte von Einkapselung und Freisetzung auf die Immunogenität und den funktionellen Antikörper in einem Multikomponentensystem auszuwerten. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung analysiert. Die Antikörper-ELISA's wurden durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 13.
Die 14a bis c zeigen die spezifischen IgG-Antikörperantworten, hervorgerufen durch PLGpS/Flu(trivalent)-Mikroteilchen-Formulierungen, gegen jeden Stamm, der innerhalb des Flu(trivalent)-Impfstoffs enthalten ist.
Am Tag 57 wurden die höchsten Gesamt-IgG-Titer für PLGpS/Flu(trivalent)/DC-Chol-Mikroteilchen-Formulierungen gefunden. Dieses Ergebnis war für jeden untersuchten Stamm gültig (A/Texas – 32 × Antwort der löslichen Flu-Kontrolle, A/Johannesburg – 64 × Antwort der löslichen Flu-Kontrolle, B/Harbin – 64 × Antwort der löslichen Flu-Kontrolle).
Am Tag 57 wurden geringfügig höhere IgG-Antikörperantworten, wie gezeigt durch den Titer, gegen A/Texas (2 × Antwort der löslichen Flu-Kontrolle) und A/Johannesburg (4 × Antwort der löslichen Flu-Kontrolle) für PLGpS/Flu(trivalent)/PCPP-Mikroteilchen-Formulierungen gefunden.
Am Tag 57 wurden im wesentlichen identische insgesamte spezifische IgG-Antikörperantworten (ungeachtet des Stamms), wie gezeigt durch den Titer, für die Mikroteilchen-Formulierungen PLGpS/-Flu(trivalent), PLGpS/Flu(trivalent)/BAY und die lösliche Flu(trivalent)-Impfstoff-Kontrollgruppe hervorgerufen. Dies ist konsistent mit den in Beispiel 13 mit monovalentem Impfstoff erhaltenen Ergebnissen, worin ähnliche Ergebnis für diese drei Systeme beobachtet wurden.
Um den Influenza-Hämagglutinations-Inhibitions-Antikörper-Assay (HAI) für jeden HA-Stamm zu bestimmen, wurden Serumproben 30 Minuten lang bei 56°C erwärmt, um das Komplement zu inaktivieren, und wurden mit Trypsin (0,1 ml von 8 mg/ml)/Periodat (12,5 μl – 0,001 M) vorbehandelt, um endogene Inhibitoren der Hämagglutination zu zerstören. Antiserum-Verdünnungsreihen wurden in zweifacher Ausfertigung hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, die Agglutination von 1% roten Hühner-Blutzellen durch 4 HAU von A/Texas-, A/Johannesburg- bzw. B/Harbin-Virus in einem Standard-HAI-Assay zu inhibieren (Ref. 33).
Die 15a bis c zeigen die spezifischen HAI-Titer, hervorgerufen gegen jeden HA-Stamm, der innerhalb des trivalenten Impfstoffs enthalten war. Am Tag 57 wurden die höchsten anhaltenden HAI-Titer für PLGpS-Mikroteilchen, formuliert mit Flu(trivalent)-Impfstoff in Gegenwart von DC-Chol, gefunden (HAI-Titer; 240 gegen HA, spezifisch A/Texas (8 × lösliche Flu(trivalent)-Kontrolle), 240 gegen HA, spezifisch A/Johannesburg (16 × lösliche Flu(trivalent)-Kontrolle), und 60 gegen HA, spezifisch B/Harbin (8 × lösliche Flu(trivalent)-Kontrolle)). Merklich höhere Titer wurden auch für PLGpS-Mikroteilchen gefunden, formuliert mit Flu(trivalent) in Gegenwart von BAY (HAI-Titer; 60 gegen HA, spezifisch A/Texas (2 × lösliche Flu(trivalent)-Kontrolle), 60 gegen HA, spezifisch A/Johannesburg (4 × lösliche Flu(trivalent)-Kontrolle), und 15 gegen HA, spezifisch B/Harbin (gleich zur löslichen Flu(trivalent)-Kontrolle)). Die für BAY-Formulierungen mit Flu(trivalent)-Impfstoff in diesem Beispiel gefundenen HAI-Titer sind vergleichbar zu denen, welche erhalten wurden für die Niedrigdosis-Gruppen im Beispiel 13, worin 1 μg Flu(monovalent)-Impfstoff – 0,325 μg A/Texasspezifisches HA, verabreicht wurden. PLGpS/Flu(trivalent)/PCPP-Mikroteilchen-Formulierungen versagten darin, irgendeine nachweisbare funktionelle Antikörperantwort hervorzurufen.
Ein Experiment wurde durchgeführt, in dem eine höhere Dosis an PLGpS/Flu(triv)/DC-Cholformulierten Mikroteilchen untersucht wurde. Diese Gruppe von Mäusen wurde am Tag 1 mit ungefähr der zweifachen Dosis an Flu(triv)-Impfstoff, die an die anderen Gruppen verabreicht wurde, immunisiert (Dosis – Flu(triv) = 21,2 μg, Gesamt-HA = 5,00 μg). Die für diese hohe Dosis erhaltenen Ergebnisse sind in den 15a bis e eingeschlossen. Die HAI-Titer, hervorgerufen für eine Kontrollgruppe, immunisiert mit löslichem Flu(triv)-Impfstoff bei dieser Dosis, waren marginal und im wesentlichen äquivalent zu der untersuchten Niedrigdosis-Gruppe (Ergebnisse nicht gezeigt). Am Tag 57 rief diese Formulierung signifikant höhere spezifische HAI-Titer hervor als die Niedrigdosis-Gruppe (HAI-Titer; 480 gegen HA, spezifisch A/Texas (5 × lösliche Flu(trivalent)-Kontrolle), 480 gegen HA, spezifisch A/Johannesburg (5 × lösliche Flu(trivalent)-Kontrolle), und 120 gegen HA, spezifisch B/Harbin (3 × lösliche Flu(trivalent)-Kontrolle)). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die hervorgerufenen HAI-Titer andauernd waren, wobei sie von Tag 21 bis 57 auf diesen Spiegeln aufrecht erhalten wurden.
Zusatzstoffe, wie BAY oder DC-Chol, wurden in die organische Phase, enthaltend Polymer und organisches Lösungsmittel, eingebracht, worin sie an der Grenzfläche wirken können, um Antigen während Formulierungs-Verfahrensweisen zu schützen (siehe Beispiel 13, Tabelle 8). Dies dient dazu, die Zurückgewinnung von antigenem Material zu erhöhen.
Darüber hinaus haben in vitro-Freisetzungsuntersuchungen gezeigt, dass eine bemeßbare Menge der eingekapselten Komponenten innerhalb der ersten drei Tage freigesetzt wird. Es ist experimentell bestimmt worden, dass etwa 5 bis 15% des eingekapselten Antigens in dieser Stufe der Freisetzung nachweisbar sind (Antigen, das auf den Mikroteilchen an der Oberfläche lokalisiert ist). Die einleitende Immunisierung wurde durch die Co-Freisetzung von Adjuvantien signifikant verstärkt. Dies ist wahrscheinlich das Ergebnis davon, dass selbige während der anfänglichen Freisetzungsphase in nächster Nähe zu dem Antigen lokalisiert sind.
Es ist bemerkenswert, dass PLGpS-Mikroteilchenformulierungen, bei denen Antigene mit Adjuvantien, wie PCPP, gemeinsam eingekapselt sind, nicht zu Formulierungen mit verbesserter Impfstoffwirksam keit führten. Dieses Material wurde zur wäßrigen Phase der primären Emulsion zugesetzt und besitzt nicht die lipophilen Eigenschaften von DC-Chol oder BAY. Es ist gezeigt worden, dass PCPP starke Adjuvans-Eigenschaften in anderen Systemen besitzt, jedoch wird in diesem Beispiel eine marginale Verbesserung der Einkapselungs-Effizienz oder Adjuvans-Wirkung der Mikroteilchenformulierung beobachtet.
Die in diesem Beispiel präsentierten Untersuchungen zeigen, dass virale Antigene aus Influenza-Virus in einem Multi-Komponenten-System hohe Spiegel an Gesamt-IgG-Antikörper und funktionellen Antikörpern (HAI) hervorrufen können, wenn die Flu-Antigene in Mikroteilchen in Gegenwart eines zusätzlichen co-eingekapselten Adjuvans, wie BAY oder DC-Chol, eingeschlossen werden.
Beispiel 16:
Dieses Beispiel wertet die Infektionsrate und den Schutz nach subkutaner Einzeldosis-Immunisierung mit PLGpS-Mikroteilchenformulierungen im Mausmodell aus.
A/Taiwan/1/86 (HIN1) als lebendige Influenza-Viren in aus Eiern stammender Allantois-Flüssigkeit, maus-adaptierter A/Taiwan/1/86 und kommerzieller monovalenter A/Taiwan/1/86-Untereinheit-Impfstoff (Fluzone®) wurden von Pasteur Mérieux, Connaught, USA (Swiftwater, PA) erhalten.
Gruppen von 8 weiblichen DBA-2-Mäusen mit einem Alter von 6 bis 8 Wochen (beschrieben in Beispiel 14) wurden an Tag 1 subkutan mit Flu(trivalent)-Impfstoff immunisiert, enthaltend A/Texas-, A/Johannesburg- und B/Harbin-Stämme (2,35 μg Gesamt-HA in 0,25 ml PBS). Kontrollmäuse erhielten entweder PBS allein oder 400 Hämagglutinations-Einheiten (HAU) lebendiges A/Texas-Virus als Allantois-Flüssigkeit. Vierzehn Tage später wurden Mäuse unter Betäubung intranasal mit 50 μl lebendigem maus-adaptiertem A/Taiwan/1/86 (5 LD50) in Allantois-Flüssigkeit herausgefordert. Der Schutz wurde durch Überwachen der Mortalität jeden Tag und der Morbidität (Gewichtsänderung) alle zwei Tage, bis zu 14 Tagen nach der Herausforderung, eingeschätzt.
Die 16 zeigt die Ergebnisse der Herausforderung. Wie erwartet, erlitten alle Mäuse, welche mit homologem lebendigem (A/Texas)-Virus immunisiert worden waren, einen minmalen Gewichtsverlust und erholten sich innerhalb von zwei Wochen nach der Herausforderung vollständig, wie gemessen durch die prozentuale Gewichtsänderung von der Grundlinie. Ebenfalls wie erwartet, erlitten Mäuse, welche mit PBS immunisiert worden waren, einen jähen Abfall des Gewichts, welches am Tag 10 unter 30% der Grundlinie sank. Es überlebten keine Mäuse in dieser Kontrollgruppe nach 10 Tagen.
Mit PLGpS/Flu(trivalent)/DC-Chol-Mikroteilchenformulierungen immunisierte Mäuse wurden erfolgreich infiziert, wie angezeigt durch den durchschnittlichen 8%igen Abfall des Gewichts innerhalb von 4 Tagen nach der Herausforderung. Von den untersuchten PLGpS-formulierten Gruppen zeigten diese Mäuse die schnellste Erholung, wobei sie 100% der Grundlinie nach 2 Wochen erreichten. Die gesamte Gruppe erholte sich, was anzeigt, das ein schutzgebender Titer in jeder Maus herangezogen wurde.
Mit PLGpS/Flu(trivalent)/BAY-Mikroteilchenformulierungen immunisierte Mäuse wurden ebenfalls erfolgreich infiziert, wie angezeigt durch den durchschnittlichen 10%igen Abfall des Gewichts am Tag 10. Diese Mäuse erholten sich langsamer, wobei sie 95% der Grundlinie nach 2 Wochen erreichten. Die gesamte Gruppe erholte sich, was anzeigt, dass ein schutzgebender Titer in allen dieser Mäuse herangezogen wurde, obwohl der Rate der Erholung zeigt, dass der Spiegel des Schutzes geringer war als jener, der für die DC-Chol-Gruppe bei dieser Dosis ersichtlich war. Dies steht in Übereinstimmung mit den in Beispiel 15 für diese zwei Gruppen bestimmten HAI-Werten.
Die lösliche Flu(trivalent)-Impfstoff-Kontrollgruppe und die PLGpS/Flu(trivalent)- oder PLGpS/-Flu(trivalent)/PCPP-Mikroteilchenformulierungen waren weniger erfolgreich. Diese Gruppen erfuhren einen durchschnittlichen 23- bis 29%igen Gewichtsabfall an den Tagen 8–10 nach der Herausforderung. Die Erholungsrate war für diese Mäuse am langsamsten, wobei 86 bis 92% der Grundlinie nach 2 Wochen erreicht wurden. Darüber hinaus überlebten nicht alle Mäuse in diesen Gruppen. Sechs von acht Mäusen aus der PLGpS/Flu(trivalent)-Mikroteilchen-formulierten Gruppe überlebten. Sieben von acht aus der PLGpS/Flu(trivalent)/PCPP-formulierten Gruppe überlebten, und sechs von acht aus der löslichen Flu(trivalent)-Kontrollgruppe überlebten. In jedem dieser Fälle wird kein oder ein geringer Schutz beobachtet.
In Beispiel 14 haben wir die Effekte von Mikroeinkapselungs-Formulierungs-Bedingungen auf den Flu(trivalent)-Impfstoff ausgewertet. Eine stammspezifische (A/Texas, A/Johannesburg und B/- Harbin) Analyse der Antigen-Zurückgewinnung durch SRID legte nahe, dass ein minimaler Verlust der antigenischen Aktivität für alle drei Stämme in diesem Multi-Komponentensystem erwartet werden konnte, wenn DC-Chol oder BAY in der organischen Phase mit PLPpS-Polymer und EtOAc als Lösungsmittel verwendet wurde.
In Beispiel 15 zeigte der höhere funktionale Antikörper (ein Korrelat für Schutz), der durch einzelne subkutane Verabreichung von PLGpS/Flu(trivalent)-Impfstoff, formuliert in Gegenwart von DC-Chol oder BAY, hervorgerufen wurde, die Nützlichkeit dieser Formulierungen im Mausmodell. Die Ergebnisse der Herausforderung/Schutz-Untersuchung, die in Beispiel 16 beschrieben ist, stehen in Übereinstimmung mit der Einstufung bzw. Rangordnung für den Schutz, wie nahegelegt durch die funktionellen Antikörper-Untersuchungen.
Die Zuführung von Antigen und Adjuvans innerhalb eines biologisch abbaubaren Mikroteilchens kann zu einer wirksameren Präsentation an das Immunsystem führen. Die für lösliche Mischungen von DC-Chol oder BAY mit Antigenen) festgestellte Adjuvanseigenschaft kann durch Anwenden dieser Formulierungsstrategie signifikant verstärkt werden. Die Möglichkeit für weniger und niedrigere (Antigen/Adjuvans)-Dosis-Zeitpläne wird durch diese Ergebnisse angezeigt. Spezifisch gesagt, legt dieses Ergebnis in starkem Maße das Potential dieser neuen Mikroteilchen-basierenden Formulierungen für die Entwicklung als wirksame Einzel-Dosierungsform nahe.
Beispiel 17:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von Transferrinbindungsprotein (Tbp-2), abgeleitet aus Moraxella catarrhalis (wie beschrieben in WO 97/13785, zugewiesen an den Patentinhaber hiervon, wobei die Offenbarung davon hierin durch Bezug darauf einbezogen ist), welches in PLGpS-Mikroteilchen eingekapselt ist, Tbp-2, welches physikalisch mit PLGpS-Mikroteilchen vermischt ist, oder Tbp-2, welches mit Alum formuliert ist, in subkutan immunisierten Mäusen.
Gruppen von fünf 6 bis 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden subkutan (S. C.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 250 μl PBS (pH 7,4) an den Tagen 1, 28 und 43 immunisiert: PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 0,3 μg Tbp-2; PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie in Beispiel 5, physikalisch vermischt mit 0,3 μg Tbp-2; und Alum (1,5 mg/Dosis), formuliert mit 0,3 μg Tbp-2 (Tabelle 5).
Die Mäuse zeigten keine großen Pathologien oder Verhaltensänderungen, nachdem sie Mikroteilchen, welche eingekapseltes Tbp-2 enthielten, Mikroteilchen, physikalisch vermischt mit Tbp-2, oder Alum, physikalisch vermischt mit Tbp-2, erhalten hatten. Die Seren wurden an den Tagen +14, +27, +42 und +55 gesammelt und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Tbp-2-IgG-Antikörpern durch antigenspezifischen ELISA, wie beschrieben in Beispiel 8, ausgewertet. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung analysiert.
Die Kernbeladung von PLGpS-Mikroteilchen, enthaltend Tbp-2, wurde mittels Aminosäureanalyse (4,0 μg/mg (32,8%)), wie beschrieben in Beispiel 6, bestimmt.
Die Ergebnisse der Immunisierungen (17a) zeigen, dass dem Immunsystem präsentiertes, in PLGpS-Mikroteilchen eingeschlossenes Antigen einen wesentlich höheren Titer, als denjenigen, der für lösliches Antigen oder für Antigen in physikalischer Mischung mit PLGpS-Mikroteilchen allein erhalten wurde, hervorrief. Darüber hinaus zeigt diese Untersuchung, dass mikroeingekapselte Formulierungen so immunogen wie die herkömmlichen Alum-adjuvantierten Systeme waren. Es wurde festgestellt, dass die Kinetik der Immunantwort für beide Formulierungen ähnlich waren.
Das IgG-Subtyp-Profil (17b) für die am Tag 55 erhaltenen Blutproben enthüllte Unterschiede in den Immunantworten, hervorgerufen für Tbp-2, eingekapselt in PLGpS-Mikroteilchen, und Tbp-2, das physikalisch mit PLGpS-Mikroteilchen vermischt oder mit Alum formuliert war. IgG1 ist der vorherrschende nachgewiesene Subtyp (mit etwas IgG2b), wenn Antigen in löslicher Form oder als eine physikalische Mischung mit PLGpS-Mikroteilchen, oder formuliert mit Alum, verabreicht wurde.
In diesem Beispiel rufen die IgG-Subtypen, welche durch innerhalb von PLGpS-Mikroteilchen eingekapseltes Tbp-2 induziert wurden, vergleichsweise mehr IgG2a hervor. Dieser Trend ist ein ähnlicher Trend zu demjenigen, welcher für Hin-47 im Beispiel 8 beobachtet worden war.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Mechanismen der durch Immunisieren mit eingekapselten Antigenen induzierten Immunantwort unterschiedlich von denjenigen sind, welche mit Alum erzeugt werden. Ein ausgeglicheneres Th2/Th1-Profil (wie angezeigt durch das IgG2a : IgG1-Verhältnis) wird aufgewiesen, wenn Antigen innerhalb von Mikroteilchen eingekapselt verabreicht wird.
Wie aus den hierin beschriebenen Ergebnissen ersehen werden kann, ist die Qualität der Immunantwort, vermittelt durch PLGpS-Mikroteilchen, welche Antigen einkapseln, im wesentlichen unterschiedlich von derjenigen, erhalten durch physikalisches Mischen mit PLGpS-Mikroteilchen, Formulieren mit Alum oder durch Verabreichen von löslichem Antigen allein. Darüber hinaus ist die Größenordnung der durch Alum in Antigen/Alum-Formulierungen induzierten Immunantwort vergleichbar zu derjenigen, welche durch Mikroteilchen, enthaltend eingekapseltes Antigen, vorgesehen wird.
Beispiel 18:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von Tbp-2, eingekapselt in PLGpS-Mikroteilchen, und Tbp-2, physikalisch vermischt mit PLGpS-Mikroteilchen, in intranasal immunisierten Mäusen.
Gruppen von fünf 6 bis 8 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden intranasal (I. N.) mit den folgenden Mengen an Antigen in entweder 10 μl oder 50 μl PBS (pH 7,4) an den Tagen 1, 28 und 43 immunisiert: PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 6,0 μg Tbp-2; und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie in Beispiel 5, physikalisch vermischt mit 6,0 μg Tbp-2; (Tabelle 5).
Die Mäuse zeigten keine großen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach der Immunisierung mit PLGpS-Mikroteilchen, welche eingekapseltes Tbp-2 enthielten, oder PLGpS-Mikroteilchen, welche physikalisch mit Tbp-2 vermischt waren. Seren wurden an den Tagen 14, 27, 42 und 55 erhalten und wurden auf das Vorliegen von Anti-Tbp-2-IgG-Antikörpern durch antigenspezifischen ELISA, wie beschrieben in Beispiel 8, ausgewertet. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung analysiert.
Die Kernbeladung von PLGpS-Mikroteilchen, enthaltend Tbp-2, wurde mittels Aminosäureanalyse bestimmt (4,0 μg/mg (32,8%)), wie beschrieben im Beispiel 6.
Die Tbp-2-spezifischen Serum-IgG-Antikörpertiter im Anschluß an I. N. Immunisierung sind in der 18 gezeigt. Wenn das Volumen der verabreichten Dosis gering war (10 μl), zeigen diese Ergebnisse an, dass ein Antigen (Tbp-2), eingebracht in oder physikalisch vermischt mit PLGpS-Mikroteilchen, weniger immunogen als lösliches Antigen von einer ähnlichen Dosis (6,0 μg) ist.
Als das Volumen der Dosis erhöht wurde (50 μl), waren die Gesamttiter für alle Gruppen signifikant höher. Diese Ergebnisse zeigen an, dass ein Antigen (Tbp-2), physikalisch vermischt mit PLGpS-Mikroteilchen, wesentlich immunogener ist als in Mikroteilchen eingekapseltes Antigen oder lösliches Antigen von einer ähnlichen Dosis (6,0 μg), was in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen steht, welche für die intranasale Immunisierung von Hin-47 angestellt wurden (Beispiel 10).
In unserer anfänglichen Untersuchung mit intranasalen Hin-47-Immunisierungen, Beispiel 10, wurde festgestellt, dass eine starke humorale Antwort und eine robuste sekretorische Antwort durch Verabreichen von Hin-47, physikalisch vermischt mit Mikroteilchen, erhalten wurden. Diese Untersuchung mit Tbp-2 hat die früheren Beobachtungen bestätigt. Darüber hinaus haben wird belegt, dass das Volumen der verabreichten Dosis eine signifikante Rolle im Typ und der Stärke der hervorgerufenen Immunantwort spielt.
Beispiel 19:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Freisetzung von Antigen aus den Mikroteilchen.
Nachdem belegt ist, dass innerhalb von PLGpS-Mikroteilchen eingekapseltes Antigen so immunogen wie Alum-Formulierungen ist, strebten wir als nächstes danach, zu untersuchen, ob der Anfangs- und verzögerte Freisetzungs-Charakter von innerhalb dieser polymeren Matrizes eingekapselten Antigenen so ausgenutzt werden kann, dass weniger Immunisierungen benötigt werden.
In diesem Beispiel untersuchten wir die Immunogenität von Tbp-2, eingekapselt in PLGpS-Mikroteilchen, physikalisch vermischt mit PLGpS-Mikroteilchen oder formuliert mit Alum oder CFA/IFA in subkutan immunisierten Meerschweinchen.
Gruppen von zwei, 6 bis 8 Wochen alten weiblichen Meerschweinchen (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) wurden subkutan (S. C.) mit den folgenden Mengen an Antigen immunisiert: PLGpS-Mikroteilchen, einkapselnd 5,0 μg Tbp-2, suspendiert in 500 μl PBS (pH 7,4) an den Tagen 1 und 28, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5; vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA), formuliert in PBS (pH 7,4) mit 5,0 μg Tbp-2 am Tag 1, gefolgt von intramuskulär (I. M.) unvollständigem Freund'schem Adjuvans (IFA), formuliert in PBS (pH 7,4) mit 5,0 μg Tbp-2 an den Tagen 14 und 28; oder Alum, formuliert in PBS (pH 7,4) mit 5,0 μg Tbp-2, an den Tagen 1, 14 und 28 (Tabelle 5).
Die Meerschweinchen zeigten keine großen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach der Immunisierung mit PLGpS-Mikroteilchen, welche eingekapseltes Tbp-2 enthielten, PLGpS-Mikroteilchen, physikalisch vermischt mit Tbp-2, CFA/IFA-formuliertem Tbp-2 oder Alum-formuliertem Tbp-2. Seren wurden an den Tagen 40 und 56 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-Tbp-2-IgG-Antikörpern durch antigenspezifischen ELISA ausgewertet. Alle Proben wurden in zweifacher Ausfertigung analysiert. Die Antikörper-ELISA's sind im Beispiel 8 beschrieben.
Die Kernbeladung von Tbp-2 enthaltenden PLGpS-Mikroteilchen wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt (4,0 μg/mg (32,8%)), wie beschrieben im Beispiel 6.
Die in der 19 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass zwei Dosen von PLGpS-mikroeingekapseltem Tbp-2 ähnliche Anti-Tbp-2-Antikörperantworten hervorriefen wie drei Dosen von Tbp-2, formuliert entweder in CFA/IFA oder mit Alum.
Die vorliegenden Ergebnisse legen in starkem Maße nahe, dass mikroeingekapseltes Tbp-2 als ein Kandidaten-Impfstoff für Zwei-Dosis-Zeitschemen ausgenutzt werden kann.
Beispiel 20:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunogenität von rUrease oder rUrease/Adjuvans-Cocktails, eingekapselt innerhalb von PLGpS-Mikroteilchen, in subkutan oder intragastrisch immunisierten Mäusen.
Gruppen von acht, 6 bis 8 Wochen alten weiblichen Auszucht-Swiss-Mäusen (Janvier, Frankreich) wurden subkutan (S. C.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 300 μl PBS (pH 7,4) an den Tagen 1 und 28 und 56 immunisiert: PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel s, enthaltend 10,0 μg rUrease; und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, coeinkapselnd 10,0 μg rUrease und DC-Chol, PCPP oder CT-X; 10,0 μg rUrease plus lösliches DC-Chol (65 μg/Dosis) oder PCPP (100 μg/Dosis) als Kontrollen; oder intragastrisch (I. G.) mit den folgenden Mengen an Antigen in 300 μl 0,15 M NaHCO₃ (pH 9,0) an den Tagen 1, 28 und 56: PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, enthaltend 40,0 μg rUrease; und PLGpS-Mikroteilchen, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 5, co-einkapselnd 40,0 μg rUrease und DC-Chol, PCPP oder CT-X (Tabelle 5).
Die Kernbeladung von rUrease enthaltenden PLGpS-Mikroteilchen wurde durch Aminosäureanalyse oder polyklonalen rUrease-spezifischen ELISA (Tabelle 7) bestimmt, wie beschrieben in Beispiel 6. Der polyklonale ELISA-Assay, durchgeführt an PLGpS-Mikroteilchenextrakten, liefert typischerweise ein Maß des eingekapselten Gesamtprodeins (zurückgewonnenes Epitop). Kontrollexperimente haben uns ermöglicht, das Ausmaß zu quantifizieren, zu welchem das Lösungsmittel/Base(SDS)-Extraktionsvorgehen die Unversehrtheit des Antigens beinflusst. Unter den eingesetzten Bedingungen haben wir geschätzt, dass durch diesen Assay etwa 65 bis 75 % des extrahierten Proteins vollständig nachweisbar bleiben. Somit wird diese Bestimmung niedriger sein als die Messung von zurückgewonnenem Gesamtprotein mittels Aminosäureanalyse (AAA). Es wurden geeignete Kontrollen eingeschlossen, um sicherzustellen, dass die Gegenwart der Adjuvantien (DC-Chol, CT-X oder PCPP) nicht die erhaltenen Ergebnisse beeinträchtigt. Das Vorliegen von DC-Chol schien den Assay nicht zu beinflussen, jedoch ergab PCPP abnorme Werte, welche uncharakteristisch höher waren, als sie mit dem Gesamtprotein mittels AAA in einigen Analysen verglichen wurden. Im Falle von CT-X wurde ein separater polyklonaler ELISA-Assay entwickelt, um die Menge an co-eingekapseltem CT-X zu quantifizieren.
Die Masse an verabreichten Mikroteilchen wurde so eingestellt, dass die erforderliche Dosis von 10,0 μg rUrease (subkutan) oder 40,0 μg rUrease (oral) zugeführt wurde.
Die Mäuse zeigten keine großen Pathologien oder Verhaltensänderungen nach Immunisierung mit PLGpS-Mikroteilchen, welche entweder eingekapselte rUrease oder co-eingekapselte Mischungen von rUrease und Adjuvans enthielten. Die Seren wurden am Tag 85 erhalten und wurden hinsichtlich des Vorliegens von Anti-rUrease-IgG1- und -IgG2a-Antikörpern mittels antigenspezifischem ELISA ausgewertet. Alle Proben wurden in zweifacher Ausführung analysiert.
Die ELISA's wurden gemäß Standardprotokollen durchgeführt (biotinylierte Konjugate, Streptavidin-Peroxidase-Komplex waren von Amersham, und o-Phenylendiamindihydrochlorid(OPD)-Substrat stammte von Sigma). Die Platten wurden über Nacht bei 4°C mit H. pylori-Extrakten (5 μg/ml) in 0,05 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) beschichtet. Nach Sättigung mit BSA (Sigma) wurden die Platten mit Serum (1,5 Stunden), biotinyliertem Konjugat (1,5 Stunden), Streptavidin-Peroxidase-Komplex (1 Stunde) und Substrat (OPD – 10 Minuten) inkubiert. Ein gegen H. pylori-Extrakt gerichtetes polyklonales Mausserum diente als eine Kontrolle in jedem Experiment. Die Titer wurden als der Kehrwert der Verdünnung ausgedrückt, welche 50% des maximalen Extinktionswerts bei 492 nm ergab. Prä-Immun-Seren werden als Negativkontrolle verwendet.
Mäuse wurden auf dem subkutanen oder intragastrischen Weg in Gegenwart von Adjuvantien immunisiert, ausgewählt basierend auf dem Th₂/Th₁-Profil (DC-Chol – ausgewogeneres Th₂/Th₁, PCPP – vorwiegend Th₂) oder hinsichtlich bekannter Schleimhaut-Adjuvanseigenschaft (Choleratoxin (CT-X) oder wärmelabiles Enterotoxin aus E. coli (LT)). PLGpS-Mikroteilchen induzieren gezeigtermaßen ein ausgewogeneres Th₂/Th₁-Profil im Verhältnis zu anderen typischen Adjuvantien, wie Alum.
Das IgG-Subtyp-Profil für vereinigte Blutproben, erhalten am Tag 85 nach subkutanen Immunisierungen, wird in der 20 gezeigt. In allen Fällen war die IgG1-Antwort höher als die IgG2a-Antwort (IgG2a : IgG1-Verhältnis liegt im Bereich von 0,08 bis 0,33), als PLGpS/rUrease-Mikroteilchenformulierungen subkutan verabreicht wurden. Die Gesamt-IgG1-Antwort für die löslichen Kontrollgruppen (rUrease + DC-Chol oder PCPP) lag im gleichen absoluten Bereich. Es werden Unterschiede für die IgG2a-Antworten zwischen Adjuvans-Systemen bemerkt, welche entwender mit Antigen coeingekapselt wurden oder als eine physikalische Mischung mit Antigen verabreicht wurden.
Für PLGpS/rUrease-Mikroteilchen (IgG2a : IgG1 = 0,33), PLGpS/rUrease/CT-X (IgG2a : IgG1 = 0,30) und PLGpS/rUrease/DC-Chol (IgG2a : IgG1 = 0,20) wurde eine ausgeglichenere IgG2a : IgG1-Antikörperantwort (hindeutend auf Th₂/Th₁-Verhältnis) erhalten. Zum Vergleich war bei der Kontrollgruppe mit rUrease + DC-Chol das IgG2a : IgG1 = 0,03.
Für PLGpS/rUrease/PCPP-Mikroteilchenformulierungen wird hauptsächlich eine Th₂-Antwort bei einem IgG2a : IgG1-Verhältnis = 0,08 bemerkt. Die analoge lösliche Mischung von rUrease + PCPP zeigt eine starke Neigung hin zu Th₂ bei einem sehr niedrigen IgG2a : IgG 1-Verhältnis = 0,003.
Im allgemeinen neigt die Co-Einkapselung von Antigen in Gegenwart dieser Adjuvantien dazu, dass typische immunologische Profil in Richtung auf eine ausgewogenere Th₂/Th₁-Antwort zu verschieben.
Die Immunisierung über den intragastrischen Weg rief in den meisten Fällen keine nachweisbare systemische Antwort hervor. Bemerkenswerte Ausnahmen hiervon sind die Positivkontrolle mit LT, aufweisend eine mäßige systemische Antwort (IgG2a : IgG1-Verhältnis = 0,1), und für rUrease/PLGpS-Mikroteilchen, welche CT-X co-einkapseln (IgG2a : IgG1-Verhältnis = 2,1). Interessanterweise induziert, bei oralen Immunisierungen, eingekapseltes Antigen plus Schleimhaut-Adjuvans eine deutlich unterschiedliche systemische Antikörperantwort. Das Verhältnis von IgG2a : IgG1 begünstigt nun stark das IgG2a, was auf den Th₁-Weg deutet. Eine Untersuchung der Literatur ergibt, dass CT-X, welches oral gemeinsam mit Antigen verabreicht wird, typischerweise eine Immunantwort induziert, welche ähnlich zu derjenigen ist, die durch LT hervorgerufen wird. Hauptsächlich wird ein IgG1- oder TH₂-Typ der Antwort berichtet (Ref. 34). Diese Untersuchung veranschaulicht, dass die Qualität der Immunantwort als Folge der Co-Einkapselung in PLGpS-Mikroteilchen verändert werden kann.
Beispiel 21:
Dieses Beispiel wertet die Infektionsrate und den Schutz nach subkutanen oder oralen Immunisierungen mit PLGpS-Mikroteilchen/rUrease-Formulierungen im Mausmodell aus.
Mäuse wurden 6 Wochen nach der zweiten Booster-Dosis (Tag 85) durch gastrische Verabreichung von 300 μl einer Susbension von H. pylori-Bakterien (3 × 10⁶ cfu) herausgefordert. Auf der Grundlage von in vitro-Freisetzungsstudien (Beispiel 7) benötigt die Antigenfreisetzung aus Mikroteilchen ungefähr 4 Wochen, weshalb die Herausforderung 2 Wochen nach diesem Zeitpunkt geplant wurde.
Vier Wochen nach der Herausforderung wurden die Mäuse getötet, und Mägen wurden zur Auswertung der Urease-Aktivität (Jatrox-Test, Procter and Gamble) in einer sterilen Abzugshaube entnommen. Die Urease-Aktivität wurde 24 Stunden nach dem Tod durch Messen der Extinktion bei 550 nm geprüft. Das Prinzip des Tests besteht darin, dass der im Testmedium vorliegende Harnstoff durch Helicobacter pylori-Urease gespalten wird. Der Anstieg des pH-Wertes verursacht eine Farbänderung im Indikator, der gleichermaßen im Testmedium vorhanden ist (Phenolrot), von gelb zu rosarot.
Mäuse wurden mit einem streptomycinresistenten Maus-adaptierten Stamm (X43-2AN) von H. pylori infiziert. Die Infektionsrate war reproduzierbar; 100 % der Mäuse wurden in allen Experimenten infiziert, wie beurteilt durch Urease-Aktivität, welche im Magen gemessen wurde (Jatrox-Test). Es ist zu bemerken, dass die Streptomycin-Resistenz des herausfordernden Stamms selbigem gestattet, auf einem hochselektiven Medium zu wachsen, was diesen Test sehr empfindlich macht (keine Kontaminanten, welche aus der normalen Flora kommen).
Dieser Stamm wurde bei –70°C in Brucella-Nährlösung (BB) (Biomerieux) aufbewahrt, supplementiert mit 20% v/v Glycerol und 10% v/v fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone). Die Herausforderungs-Suspension wurde wie folgend hergestellt: für die Vorkultur wurde H. pylori auf Mueller-Hinton-Agar (MHA; Difco), enthaltend 5% v/v Schafblut (Biomerieux) und Antibiotika: Thrimethoprim (5 μg/ml), Vancomycin (10 μg/ml), Polymixin B-Sulfat (5 μg/ml), Amphotericin (5 μg/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) als selektive Marker des H. pylori-Stamms X43-2AN (TVPAS), herangezogen. Alle Antibiotika wurden von Sigma bezogen. MHA-TVPAS-Platten wurden drei Tage lang bei 37°C unter mikroaeroben Bedingungen inkubiert. Die Vorkultur wurde verwendet, um eine 75 cm² große belüftete Flasche (Costar), enthaltend 50 ml BB, ergänzt mit 5% v/v FBS und allen Antibiotika (TVPAS), anzuimpfen. Die Flasche wurde 24 Stunden lang unter mikroaeroben Bedingungen bei sanften Schütteln gehalten. Die Suspension wurde durch Gram-Färbung, Urease-Aktivität (Harnstoff-Indol-Medium, Diagnostic Pasteur), Katalase- (H₂O₂, 3% v/v) und Oxidase-Aktivität (Biomerieux-Scheiben) charakterisiert. Die Lebensfähigkeit und Beweglichkeit wurden durch Phasenkontrast-Mikroskopie überprüft. Die Suspension wurde in BB auf eine O. D. 550 nm = 0,1 (was äquivalent zu 1 × 10⁷ CFU/ml war) verdünnt.
In dieser Untersuchung wurden Mäuse, für welche eine O. D. < 0,1 erhalten wurde oder welche mindestens weniger als 10³ bis 10⁴ Bakterien/Magen (verglichen zu 10⁵ bis 10⁶ in Kontrollen) aufwiesen, als geschützt erachtet. Gruppen von Mäusen, welche unimmunisierte/infizierte und unimmunisierte/uninfizierte Kontrollen repräsentierten, wurden ebenfalls in der Untersuchung eingeschlossen (Ergebnisse nicht gezeigt).
Die 21a zeigt, dass der Schutz (über den subkutanen Weg), wie beurteilt durch den obenstehnd beschriebenen Assay, der Rangordnung bzw. Einstufung PLGpS/rUrease/DC-Chol (geometrisches Mittel = 0,092) > PLGpS/rUrease/CT-X (geometrisches Mittel = 0,105), PLGpS/rUrease (geometrisches Mittel = 0,163) und PLGpS/rUrease/PCPP (geometrisches Mittel = 0,269) folgt. Die Positivkontrollgruppe mit LT + rUrease (oral) (geometrisches Mittel = 0,136) ist der Standard für den Schutz in dieser Untersuchung. Interessanterweise zeigen typische Ergebnisse mit den Kontrollgruppen rUrease plus lösliches DC-Chol (geometrisches Mittel = 0,600) oder rUrease plus PCPP (geometrisches Mittel = 1,07) deutlich die Vorteile der gemeinsamen Einkapselung von Antigen und Adjuvans als eine PLGpS-Mikroteilchenformulierung.
Eine statistische Mann-Whitney-Analyse der Daten präsentiert die folgenden Schlussfolgerungen. Die Formulierungen PLGpS/rUrease/DC-Chol und PLGpS/rUrease/CT-X waren nicht signifikant unterschiedlich von der Positivkontrollgruppe LT + rUrease. Die Gruppen PLGpS/rUrease/PCPP, rUrease + DC-Chol und rUrease + PCPP waren signifikant unterschiedlich zu diesen Gruppen (p < 0,01), und die PLGpS/rUrease-Gruppe war signifikant unterschiedlich von den Gruppen PLGpS/rUrease/PCPP, rUrease + DC-Chol und rUrease + PCPP (p < 0,01).
Bei dieser Analyse zeigten die Mikroteilchen-Gruppen PLGpS/rUrease/DC-Chol (7/8 Mäusen haben OD. < 0,1) und PLGpS/rUrease/CT-X (5/8 Mäuse haben OD. < 0,1) einen soliden Schutz, wohingegen die Mikroteilchen-Gruppe PLGpS/rUrease (2/8 Mäuse weisen OD. < 0,1 auf) und die Gruppe rUrease + DC-Chol (2/10 OD. < 0,1) einen mäßigen Schutz aufzeigten, und die Mikroteilchen-Gruppe PLGpS/rUrease/PCPP (0/8 haben OD. < 0,1) bzw. die Gruppen rUrease + PCPP (0/ 10 OD. < 0,1) einen niedrigen bzw. gar keinen Schutz aufzeigten. Diese Rangordnung neigt dazu, den ausgeglicheneren Th₂/Th₁-Verhältnissen zu folgen, wie aus Immunogenitäts-Untersuchungen (Beispiel 20) bestimmt wurde.
Die 21b zeigt, dass kein vollständiger Schutz über den oralen Weg für alle Gruppen von Mäusen beobachtet wurde, welche durch zusätzliche Adjuvantien enthaltende PLGpS-Mikroteilchen immunisiert wurden.
Die statistische Rangordnung folgt der Reihenfolge PLGpS/rUrease/CT-X (geometrisches Mittel = 0,229) > PLGpS/rUrease/DC-Chol (geometrisches Mittel = 0,403), PLGpS/rUrease (geometrisches Mittel = 0,475) und PLGpS/rUrease/PCPP (geometrisches Mittel = 0,493). Die Gruppe LT + rUrease (oral) (geometrisches Mittel = 0,136) ist die Positivkontrolle für die Untersuchung.
Die statistische Mann-Whitney-Analyse der Daten präsentiert die folgenden Schlussfolgerungen. Die LT+rUrease-Positivkontrollgruppe war signifikant unterschiedlich als die Formulierungen PLGpS / rUrease/DC-Chol und PLGpS/rUrease/CT-X (p < 0,01). Die Formulierungen PLGpS/rUrease/DC-Chol und PLGpS/rUrease/CT-X waren nicht signifikant voneinander verschieden. Die Formulierungen PLGpS/rUrease und PLGpS/rUrease/PCPP waren nicht signifikant voneinander verschieden.
In dieser Untersuchung zeigten die Mikroteilchenformulierungen PLGpS/rUrease/CT-X (2/8 Mäuse wiesen OD. < 0,1 auf) und PLGpS/rUrease/DC-Chol (1/8 Mäuse wiesen OD. < 0,1 auf) einen teilweisen Schutz. Vergleichweise zeigte die Positivkontrollgruppe von rUrease plus LT einen soliden Schutz auf (7/8 Mäuse weisen eine OD. < 0,1 auf).
Es wurde in den Beispielen 14 bis 16 nahe gelegt, dass die Präsentation von Adjuvans an das Immunsystem durch Assoziation mit Zuführungsvehikeln, wie PLGpS-Mikroteilchen, die Wirksamkeit des Adjuvans erhöht, was zu einem wirksameren Impfstoff führt.
Bemerkenswerterweise haben typische Kontrolluntersuchungen in diesen Beispiel die Immunogenität und den Schutz nach Immunisierungen mit löslichen Mischungen von Adjuvantien, wie DC-Chol oder PCPP und rUrease, auf dem subkutanten Weg untersucht, und es wurde festgestellt, dass der Schutz gering bis mäßig war. Diese Ergebnisse stellen zusätzliche Beweise dar, dass die Präsentation von Antigen und Adjuvans in Form einer teilchenförmigen Matrix zu wesentlich wirksameren Impfstoffen führen kann.
Zusätzliche Vorteile, wie verringerte Adjuvans-Toxizität und die Möglichkeit der Modulierung der Qualität der Immunantwort, welche charakteristisch für das verwendete Adjuvans ist, sind in diesem Beispiel aufgezeigt worden. Es wurde experimentell festgestellt, dass die IgG-Subtyp-Antikörperantworten auf rUrease, erhalten nach oraler Immunisierung mit PLGpS/rUrease/CT-X-formulierten Mikroteilchen, in uncharakteristischer Weise IgG2a (Th₁-Weg) begünstigte.
Im Falle von subkutan oder oral verabreichten, gemeinsam eingekapseltem Antigen und CT-X (einem bekannten Schleimhaut-Adjuvans), ist es auch wahrscheinlich, dass dieses Material das Antigen innerhalb der polymeren Matrix wärend der Formulierung, Aufbewahrung und Freisetzung durch einen Mechanismus, ähnlich zu demjenigen, beobachtet für Mikroteilchen, hergestellt in Gegenwart von HSA oder BSA (Ref. 35), stabilisiert.
Als Schlussfolgerung zeigt diese Untersuchung die Durchfuhrbarkeit und Wirksamkeit von PLGpS-Mikroteilchen-basierender systemischer Immunisierung, um einen signifikanten Schutz gegen H. pylori-Infektion im Mausmodell zu induzieren. Diese Untersuchung zeigt auch die Durchführbarkeit von PLGpS-Mikroteilchen-basierender oraler Immunisierung, um einen teilweisen Schutz gegen H. pylori-Infektion im Mausmodell zu induzieren.
Weiterhin kann die Co-Einkapselung von rUrease in Gegenwart von zusätzlichen Adjuvantien (spezifisch DC-Chol oder CT-X) zu einer merklichen Verbesserung der Impfstoffwirksamkeit führen.
Zusammenfassung der Beschreibung

Als Zusammenfassung dieser Beschreibung sieht die vorliegende Erfindung einen partikulären Träger für ein Mittel, insbesondere ein solches mit biologischer Aktiviät, vor, umfassend eine Matrix aus Polymer und biologisch aktivem Material. Die partikulären Träger in der Form von Mikroteilchen sind in der Lage, Mittel im Anschluss an mukosale oder parenterale Verabreichung effizient an die Zellen des Immunsystems eines Subjektes zuzuführen, um eine Immunantwort zu erzeugen. Modifikationen sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung möglich. Tabelle 1

Antigen(e), welche in PLG, PLGpZS- oder PLGpS-Mikroteilchen eingeschlossen sind	Antigen-Präparation
Hin-47 (1,55 mg/ml) + BAY (5,0 mg/ml)	800 μl Hin-47 in wässriger interner Phase plus 40,0 mg BAY in der organischen Phase
rD-15 (2,05 mg/ml)	800 μl rD-15.
Hin-47 (1,95 mg/ml) + rD-15 (1,95 mg/ml)	400 μl Hin-47 plus 400 μl rD-15.
Flu X-31 (2,0 mg/ml) Flu A-Texas (1,48 mg/ml)	800 μl Flu X-31 oder 800 μl Flu A-Texas
Flu (2,0 mg/ml) + BAY (5,0 mg/ml) Flu A-Texas (1,48 mg/ml) + BAY (5,0 mg/ml)	800 μl Flu X-31 oder 800 μl Flu A-Texas in wässriger interner Phase plus 40,0 mg BAY in der organischen Phase

Tabelle 2 Zusammenfassung der Mikroteilchen-Kernbeladung und Einkapselungs-Effizienzen (Hin-47, Hin-47 + BAY R1-005)
Tabelle 3 Zusammenfassung der Mikroteilchen-Kernbeladung und Einkapselungs-Effizienzen (rD-15, rD-15 + Hin-47)
Tabelle 4 Zusammenfassung der Mikroteilchen-Kernbeladungen und Einkapselungs-Effizienzen für Flu X-31 + BAY R1-005 und Flu A-Texas + BAY R1-005

Tabelle 5 Zusammenfassung der Mikroteilchen-Formulierungsverfahrensweisen

Antigen(e)/Adjuvantien, eingeschlossen in PLG 5-Mikroteilchen	Antigen-Präparation
tbp-2 (2,88 mg/ml)	800 μl tbp-2 (verdünnt auf 1,44 mg/ml) in wässriger Phase mit PBS
Flu(trivalent) (0,533 mg/ml)	800 1 Flu(trivalent) in wässriger innerer Phase
Flu(trivalent) (0,533 mg/ml) + BAY (3,3 m ml)	800 μl Flu(trivalent) in wässriger innerer Phase 40,0 mg BAY in der organischen Phase
Flu(trivalent) (0,533 mg/ml) + DC-Chol (3,3 mg/ml)	800 μl Flu(trivalent) in wässriger innerer Phase 40,0 mg DC-Chol in der organischen Phase
Flu(trivalent) (0,533 mg/ml) + PCPP (1,25 mg/ml)	800 μl vereinigte Lösung in wässriger innerer Phase
rUrease (1,00 m ml)	800 1 rUrease in wässriger innerer Phase
rUrease (1,00 mg/ml) + CT-X (0,5 mg/ml)	800 1 vereinigte Lösung in wässriger innerer Phase
rUrease (1,00 mg/ml) + DC-Chol (3,3 mg/ml)	800 μl rUrease in wässriger innerer Phase 40,0 m DC-Chol in der organischen Phase
rUrease (1,00 m ml) + PCPP (1,25 m ml)	800 1 vereinigte Lösung in wässriger innerer Phase

Tabelle 6 Zusammenfassung der Mikroteilchen-Kernbeladungen und Einkapselungs-Effizienzen für Flu(trivalent) und Flu(trivalent) + Adjuvantien
Tabelle 7 Zusammenfassung der Mikroteilchen-Kernbeladungen und Einkapselungseffizienzen für rUrease und rUrease +Adjuvantien
Tabelle 8 FIu(trivalent)-Formulierungen, untersucht durch SRID's

N/D: = nicht bestimmt (unter Nachweisgrenze von 10 μg/ml).
N/L: = Test war fehlgeschlagen oder war unter experimentellen Bedingungen nicht reproduzierbar.

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33. Palmer, D. F., Coleman, M. T., Dowdle, W. R. und Schild, G. C.; "Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis", immunology series no. 6, US Dept. Health, Education and Welfare. Washington DC.; 1975, 51–52..
34. Ruedl, C., Rieser, C., Kofler, N., Wick, G. und Wolf, H.; Vaccine, 1996, 14, 792–798.
35. Lu, W. und Park, T. G.; Journal of Pharmaceutical Technology, 1995, 49, 13–19.
36. Gopferich, A.; Biomaterials; 17, 1996, 103.

Claims

Ein biologisch abbaubares, biokompatibles Polymer mit einer Hauptkette der allgemeinen Formel:
worin: R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ unabhängig voneinander ausgewählt werden und ausgewählt sind aus N, linearen oder verzweigten Alkylgruppen; R₆ ausgewählt ist aus H, einer Aminschutzgruppe, einem Abstandhaltermolekül oder einer biologisch aktiven Spezies; X ausgewählt ist aus einer O- oder S-Gruppe; und x und y ganze Zahlen sind.
Das Polymer, welches in Anspruch 1 beansprucht ist, wobei x und y ganze Zahlen mit derartigen Werten sind, dass das Polymer aus wenigstens 95% α-Hydroxysäureresten zusammengesetzt ist.
Das Polymer, das in Anspruch 1 oder 2 beansprucht ist, welches durch Copolymerisation von Monomeren entstanden ist, welche wenigstens eine α-Hydroxysäure und wenigstens eine Pseudo-α-Aminosäure umfassen.
Das Polymer, das in Anspruch 3 beansprucht ist, wobei die wenigstens eine α-Hydroxysäure die Formel R₁R₂COHCO₂H aufweist, worin die R₁- und R₂-Gruppen N, lineare oder verzweigte Alkyleinheiten sind, wobei die Alkyleinheit durch die Formel C_nN_2n+1 dargestellt wird, wobei n = eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.
Das Polymer, das in Anspruch 4 beansprucht ist, wobei die α-Hydroxysäuren eine Mischung von α-Hydroxysäuren umfassen, wobei eine aus der Mischung der α-Hydroxysäuren R₁- und R₂-Gruppen aufweist, welche Wasserstoff sind, und die andere aus der Mischung der α-Hydroxysäuren eine R_l-Gruppe, welche CH₃ ist, und eine R₂-Gruppe, welche H ist, aufweist.
Das Polymer, das in irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5 beansprucht ist, wobei die wenigstens eine Pseudo-α-Aminosäure die Formel R₅CHNHR₆CO₂H aufweist, worin die R₅-Gruppe eine Hydroxymethyl- oder Methylthiolgruppe ist und R₆ eine Aminschutrgruppe ist.
Das Polymer, das in Anspruch 6 beansprucht ist, wobei die Aminschutrgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Carbobenzyloxy (CBZ oder Z), Benzyl (Bn), para-Methoxybenzyl (MeOBn), Benzyloxymethoxy (BOM), tertiär-Butyloxycarbonyl (t-BOC) und [9-Fluorenylmethyloxy]carbonyl (FMOC).
Das Polymer, das in Anspruch 3 beansprucht ist, wobei die wenigstens eine α-Hydroxysäure ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus L-Milchsäure, D,L-Milchsäure, Glycolsäure, Hydroxyvaleriansäure und Hydroxybuttersäure.
Das Polymer, das in Anspruch 3 oder 8 beansprucht ist, wobei die wenigstens eine Pseudo-α-Aminosäure von Serin abgeleitet ist.
Das Polymer, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht ist, wobei das Polymer Poly-D,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-Z-serinester (PLGpZS) ist.
Das Polymer, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht ist, wobei das Polymer Poly-p,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-serinester (PLGpS) ist.
Das Polymer, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht ist, wobei R₆ wenigstens eine biologisch aktive Spezies ist.
Das Polymer, das in Anspruch 12 beansprucht ist, wobei R₆ wenigstens ein Abstandhaltermolekül ist, an welches wenigstens eine biologisch aktive Spezies gekoppelt ist.
Das Polymer, das in Anspruch 13 beansprucht ist, wobei das Abstandhaltermolekül ausgewählt ist aus α-Hydroxysäuren, welche durch die Formel R₇R₈COHCO₂H dargestellt werden, worin die R₇- oder R₈-Gruppen unabhängig voneinander N, lineare oder verzweigte Alkyleinheiten sind, und Pseudo-α-Aminosäuren, welche durch die Formel R₉CHNHR₁₀CO₂H dargestellt werden, wobei die R₉-Gruppe eine Hydroxymethyl- oder Methylthiolgruppe ist und R₁₀ eine Aminschutzgruppe ist.
Das Polymer, das in irgendeinem der Ansprüche 12 bis 14 beansprucht ist, wobei die wenigstens eine biologisch aktive Spezies ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Zellbioadhäsionsgruppen, Makrophagenstimulatoren, Polyaminosäuren und Polyethylenglycol.
Das Polymer, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 beansprucht ist, mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 40.000 Dalton.
Ein Verfahren zur Erzeugung eines biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polyesters, welches das Copolymerisieren wenigstens eines α-Hydroxysäuremonomers und wenigstens eines Pseudo-α-Aminosäuremonomers umfasst.
Ein Verfahren zur Erzeugung eines biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polymers der Formel, welche in Anspruch 1 gezeigt wird, welches umfasst: – Bilden einer Mischung von Monomeren, welche wenigstens eine α-Hydroxysäure und wenigstens eine Pseudo-α-Aminosäure mit einer Aminschutzgruppe umfassen, mit einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel eines Veresterungskatalysators unter inerten atmosphärischen Bedingungen; – Copolymerisieren der Monomere; und – Isolieren des resultierenden Polymers.
Das Verfahren, das in Anspruch 18 beansprucht ist, wobei das gebildete Polymer durch katalytische Reduktion in der festen Phase oder Säurekatalyse entschützt wird.
Das Verfahren, das in Anspruch 19 beansprucht ist, wobei die Entschützung durch Säurekatalyse in Gegenwart von Bromwasserstoff in einer Essigsäurelösung stattfindet.
Das Verfahren, das in Anspruch 20 beansprucht ist, wobei der Katalysator Zinn-2-ethylhexanoat ist.
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 18 bis 21 beansprucht ist, wobei die Polymerisation bei einer Temperatur von 120°C für 28 Stunden durchgeführt wird.
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 18 bis 22 beansprucht ist, wobei das organische Lösungsmittel wasserfreies Chloroform ist.
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 18 bis 23 beansprucht ist, wobei das Verfahren weiterhin umfasst: (a) Formen des Polymers zu einer Folie; oder (b) Formen des Polymers zu Mikroteilchen.
Ein partikulärer Träger zur Abgabe biologisch aktiver Materialien an einen Wirt, wobei der Träger ein Polymer mit einer Hauptkette der allgemeinen Formel:
umfasst, worin: R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ unabhängig voneinander ausgewählt werden und ausgewählt sind aus N, linearen oder verzweigten Alkylgruppen; R₆ ausgewählt ist aus N, einer Aminschutzgruppe, einem Abstandhaltermolekül oder einer biologisch aktiven Spezies; X ausgewählt ist aus einer O- oder S-Gruppe; und x und y ganze Zahlen sind.
Der partikuläre Träger, der in Anspruch 25 beansprucht ist, wobei der Träger eine Teilchengröße von 1 bis 50 μm aufweist.
Der partikuläre Träger, der in Anspruch 25 oder 26 beansprucht ist, wobei das Polymer ein Molekulargewicht von 5.000 bis 40.000 Dalton aufweist.
Der partikuläre Träger, der in irgendeinem der Ansprüche 25 bis 27 beansprucht ist, wobei wenigstens 95% des Polymers aus α-Hydroxysäureresten zusammengesetzt sind.
Eine immunogene Zusammensetzung, umfassend den partikulären Träger, der in irgendeinem der Ansprüche 25 bis 28 beansprucht ist, ein Immunogen und einen physiologisch verträglichen Träger für dieses.
Eine Zusammensetzung, welche den partikulären Träger, der in irgendeinem der Ansprüche 25 bis 28 beansprucht ist, und wenigstens ein biologisch aktives Material, das darin eingeschlossen ist oder physikalisch damit gemischt ist, umfasst.
Die Zusammensetzung, die in Anspruch 30 beansprucht ist, wobei das wenigstens eine biologisch aktive Material in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen.
Die Zusammensetzung, die in Anspruch 31 beansprucht ist, wobei das wenigstens eine biologisch aktive Material wenigstens ein Haemophilus influenzae-Protein; wenigstens ein Influenzavirus oder ein Influenzavirusprotein; wenigstens ein Moraxella catarrhalis-Protein; und/oder wenigstens ein Helicobacter pylori-Protein umfasst.
Die Zusammensetzung, die in Anspruch 32 beansprucht ist, wobei das Haemophilus influenzae-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem nichtproteolytischen Hin-47-Analog, D15, P1, P2, P6 und Mischungen von diesen.
Die Zusammensetzung, die in Anspruch 32 beansprucht ist, wobei das Influenzavirus einen multivalenten Influenzavirus-Impfstoff; einen monovalenten Influenzaevirus-Impfstoff; und/oder einen monovalenten Proteinimpfstoff eines Influenzae-Virus umfasst.
Die Zusammensetzung, die in Anspruch 32 beansprucht ist, wobei das wenigstens eine M. catarrhalis-Protein ein Tbp2-Protein von M. catarrhalis ist.
Die Zusammensetzung, die in Anspruch 31 beanspruch ist, wobei das H. pylori-Protein Unease umfasst.
Die Zusammensetzung, die in irgendeinem der Ansprüche 30 bis 36 beansprucht ist, welche weiterhin wenigstens ein Adjuvans umfasst, das darin eingeschlossen ist oder damit gemischt ist.
Die Zusammensetzung, die in Anspruch 37 beansprucht ist, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N-(2-Deoxy-2-L-leucylaminobeta-D-glucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoylamidhydroacetat, Tripalmitoylcystein, [N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol, Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazen], Choleratoxin (A- oder B-Untereinheit) oder wärmelabilem Enterotoxin von E. coli
Ein Verfahren zur Erzeugung eines partikulären Trägers für die Abgabe wenigstens eines biologisch aktiven Materials an einen Wirt, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Mischen einer organischen Lösungsmittelphase, welche ein α-Hydroxysäurepolymer, wie in Anspruch 1 beansprucht, umfasst, mit einer wässrigen Zusammensetzung, welche dispergiertes oder gelöstes biologisch aktives Material umfasst, um eine erste Wasser-in-Öl-Emulsion zu bilden; (b) Dispergieren der ersten Wasser-in-Öl-Emulsion in einer wässrigen Detergenzphase, um eine zweite Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion zu bilden; (c) Entfernen des Wassers aus der zweiten Doppelemulsion, um Mikrokügelchen zu bilden; und (d) Sammeln der Mikrokügelchen, wobei das biologische Material darin eingeschlossen ist.
Das Verfahren, das in Anspruch 39 beansprucht ist, wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Poly-D,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-Zserinester (PLGpZS) und Poly-P,L-lactid-co-glycolid-co-pseudo-serinester (PLGpS).
Das Verfahren, das in Anspruch 39 oder 40 beansprucht ist, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dichlormethan, Ethylacetat, Aceton und Mischungen von diesen.
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 39 bis 41 beansprucht ist, wobei die wässrige Detergenzphase wenigstens einen nichtionischen Emulsionsstabilisator umfasst.
Das Verfahren, das in Anspruch 42 beansprucht ist, wobei der wenigstens eine nichtionische Emulsionsstabilisator ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Polyvinylalkohol, Methylcellulose und alpha-[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl]omega-hydroxypoly(oxy-l,3-ethandiyl).
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 39 bis 43 beansprucht ist, wobei die erste Wasser-in-Öl-Emulsion zusätzlich wenigstens ein in einem organischen Lösungsmittel lösliches oder wasserlösliches Adjuvans umfasst.
Das Verfahren, das in Anspruch 44 beansprucht ist, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N-(2-Deoxy-2-L-leucylamino-beta-Dglucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoylamidhydroacetat, Tripalmitoylcystein, [N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol, Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazen], Choleratoxin (A- oder B-Untereinheit) und wärmelabilem Enterotoxin von E. coli
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 38 bis 45 beansprucht ist, wobei die erste Wasser-in-Öl-Emulsion zusätzlich wenigstens ein Tensid umfasst.
Das Verfahren, das in Anspruch 46 beansprucht ist, wobei das Tensid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Sucrose, Mannose, Trehalose und Gelatine.