ES2901455T3 - Compuestos oligonucleotídicos para el tratamiento de preeclampsia y otros trastornos angiogénicos - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que se une a una región intrónica de un ARNm que codifica para una proteína sFLT1, en el que el compuesto inhibe selectivamente la expresión de la proteína sFLT1 en una célula o un organismo; comprendiendo dicho compuesto un ARNbc que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido de al menos 16 nucleótidos contiguos, en el que una porción de la cadena antisentido es complementaria a una porción de la cadena sentido, en el que la cadena antisentido es completamente complementaria a SEQ ID NO:1; (1) la cadena antisentido comprende 2'-metoxi-ribonucleótidos y 2'-fluoro-ribonucleótidos alternantes; (2) los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 desde el extremo 5' del soporte antisentido no son 2'-metoxi- ribonucleótidos; (3) los nucleótidos de la cadena antisentido están conectados mediante uniones fosfodiéster o fosforotioato; y (4) los nucleótidos en las posiciones 1-6 desde el extremo 3', o en las posiciones 1-7 desde el extremo 3', de la cadena antisentido están conectados a nucleótidos adyacentes mediante uniones fosforotioato; en el que la cadena sentido está unida a una molécula lipófila en el extremo 3' de la cadena sentido.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos oligonucleotídicos para el tratamiento de preeclampsia y otros trastornos angiogénicos Declaración de intereses gubernamentales
Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo el número de concesión OPP1086170 otorgado por la Fundación Nacional de Ciencias. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.
Campo de la invención
Esta divulgación se refiere a novedosas dianas angiogénicas y a novedosos compuestos oligonucleotídicos para el tratamiento de trastornos angiogénicos (por ejemplo, preeclampsia).
Antecedentes
La preeclampsia (PE), que complica el 5-8% de todos los embarazos, es una de las tres principales causas de parto prematuro. Las características más notables de la PE son hipertensión, edema y exceso de proteína en la orina (proteinuria) después de la 20a semana de embarazo. Las consecuencias para el feto pueden ser graves, variando desde primaria infancia siendo pequeño para la edad gestacional a lesión neurológica inducida por hipoxia (por ejemplo, parálisis cerebral infantil) hasta la muerte. Las complicaciones maternas incluyen insuficiencia renal, síndrome de HELLP (hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y recuento bajo de plaquetas), convulsiones, accidente cerebrovascular y muerta. De manera conservadora, se estima que la PE y los trastornos hipertensivos relacionados provocan 76.000 muertes maternas y 500.000 infantiles en todo el mundo cada año. (Véase preeclampsia [dot] org). En los Estados Unidos, la PE es responsable de 100.000 partos prematuros y 10.500 muertes infantiles cada año, con un coste de aproximadamente siete mil millones de dólares (tres mil millones de dólares para incapacidades maternas y cuatro mil millones de dólares relacionados con morbilidad infantil) cada año al sistema sanitario. En todo el mundo, la PE y la eclampsia posterior son los principales contribuyentes para la morbimortalidad materna, fetal y neonatal. Por tanto, la PE representa una necesidad de salud pública insatisfecha altamente significativa.
Aunque las causas fundamentales de la PE aún no se entienden por completo, en la actualidad está bien establecido que los signos y síntomas maternos de hipertensión, edema y proteinuria están provocados por un exceso de proteínas antiangiogénicas en el torrente sanguíneo de la madre. Entre estas, las principales son proteínas tirosina cinasa 1 soluble similar a fms (sFLTI). Las sFLTIs son formas truncadas del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) unido a la membrana, FLT1 (también conocido como VEGFR1). Normalmente funcionan para amortiguar la señalización de VEGF. Sin embargo, cuando las sFLTI son anómalamente altas en el aparato circulatorio de la madre, pueden interferir con la propia capacidad de su cuerpo de responder a VEGF. Entre otras funciones, el VEGF es necesario para el mantenimiento de la vasculatura sinusoidal hepática y otros lechos vasculares fenestrados en el cuerpo (Kamba, T. et al. VEGF-dependent plasticity of fenestrated capillaries in the normal adult microvasculature. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 290, H560-576 (2006)). La rotura de estas estructuras altera la función renal materna, lo que conduce a hipertensión, proteinuria y edema cerebral, que son características clásicas de la PE y eclampsia (Young, B.C., Levine, R.J. y Karumanchi, S.A. Pathogenesis of preeclampsia. Annual review of pathology 5, 173-192 (2010); Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of clinical investigation 111, 707-716 (2003); Eremina, V. et al. VEGF inhibition and renal thrombotic microangiopathy. The New England journal of medicine 358, 1129-1136 (2008)).
Estudios piloto que usan un dispositivo extracorpóreo para retirar la sFLT1 del torrente sanguíneo de mujeres con preeclampsia grave ha demostrado que disminuir la proteína sFLT1 en tan sólo el 30-40% en el plasma materno puede prolongar los embarazos con PE en 2 semanas sin consecuencias adversas para el bebé (Thadhani, R. et al. Pilot study of extracorporeal removal of soluble fms-like tyrosine kinase 1 in preeclampsia. Circulation 124, 940-950 (2011)). Además, estudios en animales respaldan la hipótesis de que seleccionar como diana sFLT1 en PE también puede disminuir el riesgo de problemas respiratorios y displasia broncopulmonar neonatales, las principales complicaciones de la prematuridad (Tang, J.R., Karumanchi, S.A., Seedorf, G., Markham, N. y Abman, S.H. Excess soluble vascular endothelial growth factor receptor-1 in amniotic fluid impairs lung growth in rats: linking preeclampsia with bronchopulmonary dysplasia. American journal of physiology. Lung celular and molecular physiology 302, L36-46 (2012)). Sin embargo, aunque la aféresis (lavado de sangre) es altamente prometedora, es poco probable que sea aplicable a todos los pacientes en todas las situaciones. Especialmente en entornos con bajos recursos, se necesita desesperadamente un enfoque más rentable con menores requisitos de infraestructura generales y médicos. El silenciamiento del ARN mediante iARN es uno de tales enfoques.
Pueden tratarse una amplia gama de enfermedades humanas, incluyendo el cáncer, la infección y la neurodegeneración, mediante el silenciamiento de genes específicos usando oligonucleótidos pequeños. Los ONT (productos terapéuticos oligonucleotídicos) son una nueva clase de fármacos que se distinguen por seleccionar como diana ARN o ADN directamente, interfiriendo de ese modo con un gen causante de enfermedad en su raíz, antes de que pueda producir la proteína responsable del fenotipo de enfermedad. Las ventajas de los ONT sobre los fármacos convencionales incluyen la facilidad de diseño del fármaco basado únicamente en las reglas del apareamiento de bases, la capacidad para acceder a dianas previamente consideradas “no quimiomodulables” y su promesa de especificidad, potencia y duración de efecto sin precedentes. Además, la farmacocinética, la farmacodinamia y la seguridad de los ONT se definen principalmente por modificaciones químicas/formulación y es muy similar entre compuestos que seleccionan como diana genes diferentes, lo que permite un silenciamiento multigénico y fármacos de desarrollo sencillo que seleccionan como diana el mismo tejido (Videira, M., Arranja, A., Rafael, D. y Gaspar, R. Preclinical development of siRNA therapeutics: towards the match between fundamental science and engineered systems. Nanomedicine: nanotechnology, biology, and medicine 10, 689-702 (2014); H. Younis et al. en A Comprehensive Guide to Toxicology in Preclinical Drug Development. (ed. A.S. Faqi) 647-664 (Academic Press, 2013)). Un esfuerzo significativo en la última década dio como resultado el desarrollo de varios tipos de oligonucleótidos, tanto químicamente modificados como formulados, con una clara eficacia clínica (Whitehead, K.A., Langer, R. y Anderson, D.G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature reviews. Drug discovery 8, 129-138 (2009)). Por tanto, los ONT representan un paradigma terapéutico nuevo y potencialmente transformativo. No obstante, su utilidad clínica se ha visto obstaculizada por una distribución tisular limitada. Hasta la fecha, la administración sistémica se ha limitado generalmente a hepatocitos hepáticos, requiriendo otros tejidos la administración local (de Fougerolles, A., Vornlocher, H.P., Maraganore, J. y Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nature reviews. Drug discovery 6, 443-453 (2007)).
Una clase de ONT son los ARNip, oligonucleótidos bicatenarios pequeños que consisten en cadenas pasajera (sentido) y guía (antisentido). Tras la captación celular, la cadena guía se carga en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que puede escindir su ARN diana complementario. La cantidad de RISC cargados por célula suficiente para inducir silenciamiento génico o interferencia por ARN (iARN) eficiente y a largo plazo se estima en aproximadamente 25-100 in vitro (Stalder, L. et al. The rough endoplasmatic reticulum is a central nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing. The EMBO journal 32, 1115-1127 (2013)) y aproximadamente 400 in vivo (Pei, Y. et al. Quantitative evaluation of siRNA delivery in vivo. Rna 16, 2553-2563 (2010)). Normalmente, 10-100 ng/gramo de oligonucleótido administrados a un tejido seleccionado como diana (Overhoff, M., Wunsche, W. y Sczakiel, G. Quantitative detection of siRNA and single-stranded oligonucleotides: relacioneship between uptake and biological activity of siRNA. Nucleic acids research 32, e170 (2004)) es adecuado para generar un número suficiente de complejos RISC activos e inducir silenciamiento. Los RISC cargados tienen una estabilidad que dura semanas, lo que da como resultado un silenciamiento génico prolongado (3-6 semanas) a partir de una única administración (Whitehead, K.A., Langer, R. y Anderson, D.G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature reviews. Drug discovery 8, 129-138 (2009)).
Luo et al. (2013) eL,ife, 2:e00324 describen que la avascularidad de los fotorreceptores se elimina, entre otras cosas, mediante la supresión mediada por iARN de sFLT-1. El documento US 2007/1911273 describe la modulación de la angiogénesis, entre otras cosas, mediante la supresión mediada por iARN de VEGF. El documento CN 101 199858 describe un agente de cóctel de ARN de interferencia pequeño de múltiples puntos diana para tratar una enfermedad oftálmica. El documento WO 2008/154482 describe composiciones de ARNip y métodos de uso en el tratamiento de enfermedades oculares.
Behlke (2008), Oligonucleotides, 18:305-320 describe la modificación química de ARNip para su uso in vivo.
Sumario
La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que las isoformas de ARNm que codifican para proteínas sFLT1 contienen secuencias no halladas en ARNm que codifica para la proteína FLT1 de longitud completa (fl-FLT1) que pueden seleccionarse como diana para su degradación, por ejemplo, para tratar la PE, PE posparto, eclampsia y/o el síndrome de HELLP. En el presente documento se proporcionan novedosas secuencias de oligonucleótidos (por ejemplo, ARN de interferencia pequeños (ARNip)) que se han modificado por ingeniería para disminuir selectivamente los niveles de sFLT1 sin afectar a fl-FLT1 mediante la unión a una o más de las secuencias que no están presentes en fl-FLT1, por ejemplo, una o más regiones intrónicas de ARNm que codifica para una o más proteínas sFLT1. Se descubrió que los novedosos ARNip descritos en el presente documento se administraban preferentemente a los trofoblastos placentarios (el tipo de célula responsable de la producción en exceso de sFLT1) usando suministro sistémico (es decir, intravenoso o subcutáneo) a la madre sin el suministro al feto. También se proporcionan compuestos terapéuticos y métodos para tratar uno o más síntomas de PE y/o PE posparto y/o eclampsia y/o síndrome de HELLP.
En un aspecto, se proporciona un compuesto que se une a una región intrónica de un ARNm que codifica para una proteína sFLT1, en el que el compuesto inhibe selectivamente la expresión de la proteína sFLT1 en una célula o un organismo; comprendiendo dicho compuesto un ARNbc que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido de al menos 16 nucleótidos contiguos,
en el que una porción de la cadena antisentido es complementaria a una porción de la cadena sentido,
en el que la cadena antisentido es completamente complementaria a SEQ ID NO:1;
(1) la cadena antisentido comprende 2'-metoxi-ribonucleótidos y 2'-fluoro-ribonucleótidos alternantes;
(2) los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 desde el extremo 5' del soporte antisentido no son 2'-metoxiribonucleótidos;
(3) los nucleótidos de la cadena antisentido están conectados mediante uniones fosfodiéster o fosforotioato; y (4) los nucleótidos en las posiciones 1-6 desde el extremo 3', o en las posiciones 1-7 desde el extremo 3', de la cadena antisentido están conectados a nucleótidos adyacentes mediante uniones fosforotioato;
en el que la cadena sentido está unida a una molécula hidrófoba en el extremo 3' de la cadena sentido.
También se describe en el presente documento un ARNbc que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en el que la cadena antisentido comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a 5' CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3' (SEQ ID NO:1), 5' CATCATAGCTACCATTTATT 3' (SEQ ID NO:2), 5' ATTGTACCACACAAAGTAAT 3' (SEQ ID NO:3) o 5' GAGCCAAGACAATCATAACA 3' (SEQ ID NO:4). En un ejemplo, la región de complementariedad es complementaria a al menos 15, 16, 17 o 18 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o Se Q ID NO:4. En un ejemplo, la región de complementariedad no contiene más de 3 apareamientos erróneos con SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o s Eq ID NO:4. En un ejemplo, la región de complementariedad es completamente complementaria a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4.
En una realización, el ARNbc tiene extremos romos. En una realización, el ARNbc comprende al menos una proyección de nucleótidos monocatenaria. En una realización, el ARNbc comprende nucleótidos que se producen de manera natural.
También se describe en el presente documento un ARNbc que comprende al menos un nucleótido modificado. En un ejemplo, el nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo. En un ejemplo, el nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2'-amino, nucleótido modificado con 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende bases no naturales. En un ejemplo, el ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, al menos un nucleótido modificado con 2'-fluoro, al menos un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo.
También se describe en el presente documento un ARNbc que tiene un extremo 5', un extremo 3' y complementariedad a una diana, y que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en el que: (1) el primer oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ iD nO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4; (2) una porción del primer oligonucleótido es complementaria a una porción del segundo oligonucleótido; (3) el segundo oligonucleótido comprende 2'-metoxi-ribonucleótidos y 2'-fluororibonucleótidos alternantes; (4) los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 desde el extremo 3' del segundo oligonucleótido son 2'-metoxi-ribonucleótidos; y (5) los nucleótidos del segundo oligonucleótido están conectados mediante uniones fosfodiéster o fosforotioato.
Según la invención, el segundo oligonucleótido está unido a una molécula hidrófoba en el extremo 3' del segundo oligonucleótido, por ejemplo, un ácido graso omega-3. En una realización, la molécula hidrófoba es ácido docosanoico (DCA), ácido docosahexaenoico (DHA), DHA esterificado con lisofosfatidilcolina (g2-DHA, también conocido como PC-DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA).
En una realización, la unión entre el segundo oligonucleótido y la molécula hidrófoba comprende polietilenglicol o trietilenglicol.
En una realización, los nucleótidos en las posiciones 1 y 2 desde el extremo 3' del segundo oligonucleótido están conectados a nucleótidos adyacentes mediante uniones fosforotioato.
En una realización, los nucleótidos en las posiciones 1 y 2 desde el extremo 3' del segundo oligonucleótido y los nucleótidos en las posiciones 1 y 2 desde el extremo 5' del segundo oligonucleótido están conectados a ribonucleótidos adyacentes mediante uniones fosforotioato.
En una realización, la expresión de la proteína sFLT1 en la célula o el organismo se reduce desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 50%. En una realización, la expresión de la proteína sFLT1 en la célula o el organismo se reduce desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 40%.
También se describe en el presente documento que se proporciona un método para inhibir la expresión de una o más proteínas sFLT1 en una célula. El método incluye las etapas de (a) introducir en la célula uno o más compuestos que se unen a una región intrónica de uno o más ARNm que codifican para una o más proteínas sFLT1, y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para inhibir la expresión de la una o más proteínas sFLT1 en la célula.
En un ejemplo, el uno o más compuestos son uno o más ARNbc que median la degradación del uno o más ARNm.
En un ejemplo, un compuesto es un ARNbc que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en el que la cadena antisentido comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a s Eq ID NO:1, SEQ ID NO:2, s Eq ID NO:3 y/o SEQ ID nO:4. En un ejemplo, uno o más ARNbc tienen cada uno entre 15 y 30 pares de bases de longitud.
En una realización, la expresión de una o más proteínas sFLTI se reduce desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 50%. En una realización, la expresión de una o más proteínas sFLTI se reduce desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 40%.
También se describe en el presente documento una molécula de ARN que tiene entre 15 y 30 bases de longitud que comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:1, en la que la molécula de ARN selecciona como diana una o ambas de una región intrónica de sFLT-i13 corta y una región intrónica de sFLT-i13 larga.
En un ejemplo, el ARN es ARNbc que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en el que la cadena antisentido comprende la región de complementariedad.
También se describe en el presente documento una molécula de ARN que tiene entre 15 y 30 bases de longitud que comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:2, en el que la molécula de ARN selecciona como diana una o ambas de una región intrónica de sFLT-i15a (también conocida como sFLT-e15a).
En un ejemplo, el ARN es ARNbc que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en el que la cadena antisentido comprende la región de complementariedad.
En un aspecto, se proporciona un compuesto terapéutico que se une a una región intrónica de uno o más ARNm que codifican para una o más proteínas sFLTI, en el que el compuesto terapéutico reduce selectivamente la expresión de la una o más proteínas sFLTI, y en el que el compuesto terapéutico reduce uno o más síntomas de PE, PE posparto, eclampsia o síndrome de HELLP cuando se administra a un sujeto que lo necesita, en el que el compuesto comprende un ARNbc según la invención.
En una realización, la una o más proteínas sFLTI se seleccionan del grupo que consiste en sFLT1-i13 corta, sFLT1-i13 larga y sFlt1-i15a.
En una realización, el compuesto terapéutico comprende una primera y una segunda secuencia de oligonucleótidos, en el que la primera secuencia de oligonucleótidos se une a una región intrónica de una o ambas de sFLT1-i13 corta y sFLTl-i13 larga y la segunda secuencia de oligonucleótidos se une a una región intrónica de sFlt1-i15a. En una realización, las secuencias de oligonucleótidos primera y segunda son ARN bicatenario (ARNbc).
También se describe en el presente documento un compuesto terapéutico que comprende un primer ARNbc que comprende una primera cadena sentido y una primera cadena antisentido y un segundo ARNbc que comprende una segunda cadena sentido y una segunda cadena antisentido, en el que la primera cadena antisentido comprende una primera región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:1 y la segunda cadena antisentido comprende una segunda región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:2. En un ejemplo, cada ARNbc tiene entre 15 y 30 pares de bases de longitud. En un ejemplo, la primera región de complementariedad es complementaria a al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1 y la segunda región de complementariedad es complementaria a al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:2. En un ejemplo, la primera región de complementariedad no contiene más de 3 apareamientos erróneos con SEQ ID NO:1 y la segunda región de complementariedad no contiene más de 3 apareamientos erróneos con SEQ ID NO:2. En un ejemplo, la primera región de complementariedad es completamente complementaria a SEQ ID NO:1 y la segunda región de complementariedad es completamente complementaria a SEQ ID NO:2.
En una realización, cada ARNbc comprende al menos una proyección de nucleótidos monocatenaria.
En una realización, cada ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado. En una realización, el nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo. En una realización, un nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2'-amino, nucleótido modificado con 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende bases no naturales. En una realización, un ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, al menos un nucleótido modificado con 2'-fluoro, al menos un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo.
En una realización, cada ARNbc comprende un extremo 5', un extremo 3' y complementariedad a una diana, en el que (1) el oligonucleótido comprende 2'-metoxi-ribonucleótidos y 2'-fluoro-ribonucleótidos alternantes; (2) los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 desde el extremo 5' no son 2'-metoxi-ribonucleótidos; (3) los nucleótidos están conectados mediante uniones fosfodiéster o fosforotioato; y (4) los nucleótidos en las posiciones 1-6 desde el extremo 3', o en las posiciones 1-7 desde el extremo 3', están conectados a nucleótidos adyacentes mediante uniones fosforotioato.
En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica. La composición incluye un primer ARNbc según la invención; un segundo ARNbc que comprende una segunda cadena sentido y una segunda cadena antisentido, en el que la segunda cadena antisentido comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:2, y en el que la segunda cadena antisentido selecciona como diana selectivamente una región intrónica de sFLT-i15a; y un portador farmacéuticamente aceptable.
También se describe en el presente documento un método de tratamiento o gestión de PE, eclampsia o síndrome de HELLP que comprende administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento o gestión una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En un ejemplo, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa o subcutánea. En un ejemplo, la expresión de la proteína sFLT1 se reduce en el sujeto en de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%. En un ejemplo, la expresión de la proteína sFLT1 se reduce en el sujeto en de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 40%.
También se describe en el presente documento un método de tratamiento de uno o más síntomas de PE, eclampsia o síndrome de HELLP en un sujeto que lo necesita. El método incluye administrar al sujeto un compuesto terapéutico que se une a una región intrónica de uno o más ARNm que codifican para una o más proteínas sFLT1, en el que el compuesto terapéutico reduce la expresión de la una o más proteínas sFLT1.
En un ejemplo, la una o más proteínas sFLT1 se seleccionan del grupo que consiste en sFLT1-i13 corta, sFLT1-i13 larga y sFlt1-i15a.
En un ejemplo, el compuesto terapéutico comprende una primera y una segunda secuencia de oligonucleótidos, en el que la primera secuencia de oligonucleótidos se une a una región intrónica de una o ambas de sFLT1-i13 corta y sFLT1-i13 larga y la segunda secuencia de oligonucleótidos se une a una región intrónica de sFlt1-i15a. En un ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos primera y segunda son ARNmc o ARNbc.
También se describe en el presente documento un compuesto terapéutico que comprende un primer ARNbc que comprende una primera cadena sentido y una primera cadena antisentido y un segundo ARNbc que comprende una segunda cadena sentido y una segunda cadena antisentido, en el que la primera cadena antisentido comprende una primera región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:1 y la segunda cadena antisentido comprende una segunda región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:2. En una realización, cada ARNbc tiene entre 15 y 30 pares de bases de longitud. En un ejemplo, la primera región de complementariedad es complementaria a al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1 y la segunda región de complementariedad es complementaria a al menos 15 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:2. En un ejemplo, la primera región de complementariedad no contiene más de 3 apareamientos erróneos con SEQ ID NO:1 y la segunda región de complementariedad no contiene más de 3 apareamientos erróneos con SEQ ID NO:2. En un ejemplo, la primera región de complementariedad es completamente complementaria a SEQ ID NO:1 y la segunda región de complementariedad es completamente complementaria a SEQ ID NO:2.
En un ejemplo, cada ARNbc comprende al menos una proyección de nucleótidos monocatenaria.
En un ejemplo, cada ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado. En una realización, el nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo. En un ejemplo, un nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2'-amino, nucleótido modificado con 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende bases no naturales. En un ejemplo, un ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, al menos un nucleótido modificado con 2'-fluoro, al menos un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo.
También se describe en el presente documento una composición farmacéutica. La composición farmacéutica incluye un primer ARNbc que comprende una primera cadena sentido y una primera cadena antisentido, en el que la primera cadena antisentido comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:1, y en el que la primera cadena antisentido selecciona como diana una o ambas de una región intrónica de sFLT-i13 corta y una región intrónica de sFLT-i13 larga, un segundo ARNbc que comprende una segunda cadena sentido y una segunda cadena antisentido, en el que la segunda cadena antisentido comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:2, y en el que la segunda cadena antisentido selecciona como diana una región intrónica de sFLT-i15a, y un portador farmacéuticamente aceptable. También se describe en el presente documento un método de tratamiento o gestión de PE, eclampsia o síndrome de HELLP que comprende administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento o gestión una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica descrita en el presente documento.
En una realización, la composición farmacéutica va a administrarse por vía intravenosa o subcutánea.
En una realización, la expresión de la proteína sFLTI se reduce en el sujeto en de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%. En una realización, la expresión de la proteína sFLT1 se reduce en el sujeto en de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 40%.
También se describe en el presente documento un método de tratamiento de uno o más síntomas de un trastorno angiogénico en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto cualquier compuesto descrito en el presente documento.
También se describe en el presente documento un método de tratamiento de uno o más síntomas de PE, eclampsia o síndrome de HELLP en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto cualquier compuesto descrito en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
Las características y ventajas anteriores y otras de la presente invención se entenderán más completamente a partir de la siguiente descripción detallada de realizaciones ilustrativas tomada junto con los dibujos adjuntos.
Las figuras 1A-C representan un análisis de secuenciación del sitio de poliadenilación (PAS-Seq) de la expresión de isoformas de sFLT1 en placentas preeclámpticas y normales. (A) Representa esquemáticamente la modulación de la señalización del receptor tirosina cinasa (RTK) por señuelos solubles, que pueden generarse mediante poliadenilación en un intrón aguas arriba de los dominios transmembrana (TM) y cinasa. (Adaptado a partir de Vorlova, S. et al. Induction of antagonistic soluble decoy receptor tyrosine kinases by intronic polyA activation. Molecular cell 43, 927-939 (2011)). (B) PAS-Seq identifica sitios de poliadenilación de FLT1 alternativos. (C) Ambas isoformas, i13 e i15, se sobreexpresan en preeclampsia. El ARN total se purificó y analizó mediante PAS-Seq (Heyer, E.E., Ozadam, H., Ricci, E.P., Cenik, C. y Moore, M.J. An optimized kit-free method for making strandspecific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Res 43, e2 (2015)) a partir de cinco placentas humanas normales y seis preeclámpticas. Obsérvese que sFLT1-i14 se refiere a sFLT1-i15a.
La figura 2 representa los resultados de un ensayo basado en ácido nucleico peptídico (PNA) para la detección de sFLT1-i13-2283 en tejidos de ratón. Los tejidos se lisaron, el residuo se separó mediante precipitación, el dúplex PNA-cadena guía se purificó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) (DNAPac P100, el 50% de agua, el 50% de acetonitrilo y el gradiente de sal fue NaClO4 de 0 a 1 M), se realizó un cribado sistemático de ARNiph no formulados que seleccionan como diana ARNm de sFlt1.
Las figuras 3A-D representan la composición estructural/química, la captación y la eficacia de ARNip hidrófobos en citotrofoblastos humanos primarios (CTB). (A) Representa esquemáticamente ARNip hidrófobamente modificados y estabilizados (ARNiph) según determinadas realizaciones. Se añadió ARNiph de sFlt1-i13-2283 y NTC coincidente a los CTB a la concentración mostrada. (B) Se midió el nivel de proteína sFLT1 mediante ELISA (#MVR100, R&D systems) en medio de cultivo acondicionado después de 72 h de tratamiento. (C) Representa los niveles de ARNm de sFlt1-i13 y (D) representa los niveles de ARNm de Flt1-FL que se midieron usando QuantiGene® (Affymetrix) a las 72 horas, (n=3, media /- D.E.). UNT - células no tratadas, NTC - control no dirigido con química coincidente. Las figuras 4A-B representan la eficiencia de suministro de ARNiph al hígado, al riñón ya la placenta. (A) A un ratón preñado silvestre (E15) se le inyectó Cy3-sFLT1-2283-P2 (rojo) (10 mg/kg; i.v. a través de la vena de la cola). Los tejidos se fijaron después de 24 horas, se procesaron y se obtuvieron imágenes a 10x y 63x en un microscopio fluorescente de mosaico Leica; los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). (B) Muestra la distribución tisular de sFLT1-2283 (40 mg/kg) 5 días tras la inyección analizada mediante el ensayo de PNA (n=7, media E.E.M.).
La figura 5 representa la evaluación histológica de la distribución de ARNiph en placenta de ratón. A un ratón preñado silvestre (E15) se le inyectó Cy3-sFLT1-2283-P2 (rojo) (10 mg/kg; i.v. a través de la vena de la cola). Los tejidos se fijaron después de 24 horas, se procesaron y se tiñeron con HE, y después se obtuvieron imágenes a 20X en un microscopio fluorescente Leica. Fm - membrana fetal; m V - vaso materno; L - laberinto; Jz - zona de unión; D - caduca.
Las figuras 6A-C representan la identificación y validación de compuestos de ARNiph funcionales que seleccionan como diana las isoformas de sFlt1 i13 e i15. (A) Representa esquemáticamente la estructura exón-intrón de las isoformas i13 e i15 de sFLT1. (B) Representa las secuencias de ARNm de i13 e i15 de sFLT1. Se indican las ubicaciones de las principales mutaciones de ARNiph (líneas rojas). Los codones de parada se muestran en rojo. (C) Representa la selección como diana por parte de ARNiph de sFLT1-i13 y sFlt1-i15a. Las modificaciones químicas son las siguientes: P - 5'-fosfato; f - 2'-fluoro; m - 2'-O-metilo; # - fosforotioato. Obsérvese que sFLT1-i14 se refiere a sFLT1-i15a.
Las figuras 7A-C representan el suministro a la placenta y el silenciamiento de sFLT1 eficientes en un modelo de embarazo de ratón silvestre. (A) A un ratón preñado silvestre (E15) se le inyectó Cy3-sFLT1-2283-P2 (rojo) (10 mg/kg; i.v. a través de la vena de la cola). Los fetos y sus placentas se fijaron después de 24 horas, se procesaron y se obtuvieron imágenes en un microscopio fluorescente de mosaico Leica; los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). (B) Representa el nivel de expresión de sFlt1-i13 en tejidos de ratón 5 días después de la inyección de sFLT1-2283-P2 (2 X 20 mg/kg). Se midió el ARNm de sFlt1-i13 usando QuantiGene® (Affymetrix), se normalizó con respecto a fl FLT1 y se presentó como porcentaje de control no tratado [n=3 (PBS); n=7 (sFLT1-i13-2283), media ± E.E.M.]. (C) Representa la validación in vivo de sFLT1_2283/2519 (sFLT1-mix, 151111); ratones CD1 mediante i.v. a 20 mg/kg, n = 8).
Las figuras 8A-C representan el impacto de la química de ARNiph y la vía de administración sobre la acumulación y distribución placentaria. (A) A un ratón preñado silvestre (E15) se le inyectó Cy3-sFLT1-2283 (rojo) (10 mg/kg; i.v. a través de la vena de la cola). Las placentas se fijaron después de 24 horas, se procesaron y se obtuvieron imágenes en un microscopio fluorescente de mosaico Leica; los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). (B) Representa la acumulación de sFLT1-i13-2283 (10 mg/kg) después de 24 horas, y se analizó mediante el ensayo de PNA (n=3, media E.E.M.). (C) Representa esquemáticamente diferentes patrones de modificación de ARNiph de sFLT1-i13-2283. P - 5'-fosfato; Chol-teg - ligador colesterol-teg; esferas blancas - ARN; esferas negras - 2'-O-metilo; esferas grises - 2'-fluoro; esferas rojas - fosforotioato. Obsérvese que sFLT1-i14 se refiere a sFLT1-i15a.
Las figuras 9A-B representan la terapia con sFlt1 en ratones. (A) Muestra que la terapia con sFlt1 en ratones induce hipertensión (mediada usando radiotelemetría en ratones conscientes) y endoteliosis glomerular en el riñón (glomérulos hinchados y oclusiones capilares). (B) Representa estudios por ecografía Doppler durante un embarazo normal de ratón en la última etapa de la gestación para evaluar el flujo umbilical. Se obtuvo una forma de onda que muestra la velocidad sistólica máxima (PSV).
La figura 10 representa un diagrama de flujo que muestra las etapas para desarrollar productos terapéuticos (por ejemplo, ARN terapéuticos) para el tratamiento de preeclampsia y/o eclampsia.
La figura 11 representa esquemáticamente factores asociados con la preeclampsia.
Las figuras 12A-C representan el suministro selectivo de ARNiph a la capa de sincitiotrofoblastos del laberinto de la placenta del ratón. (A) Representa un esquema a partir de Maltepe et al. (J Clin Invest. (2010) 120(4):1016-1025. doi:10.1172/JCI41211). (B) Representa la distribución de trofoblastos después de la administración intravenosa de ARNiph (aumento de 63X). (C) Representa la distribución de trofoblastos después de la administración subcutánea de ARNiph (aumento de 63x ).
La figura 13 representa una lista de todas las mutaciones con eficacia en diferentes armazones químicos y secuencias únicas de las isoformas I13 corta, I13 larga e I15a, que se seleccionaron como diana tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
La figura 14 resume perfiles de producto diana aceptables e ideales y comentarios sobre el potencial para abordar estas necesidades según determinadas realizaciones a modo de ejemplo.
La figura 15 representa una evaluación histológica de la distribución de ARNiph en tejidos placentarios de ratón tras la administración subcutánea (s.c.) e intravenosa (i.v.).
Las figuras 16A-E representan el silenciamiento eficiente de sFLT1 por ARNiph en ratones preñados (CD1). (A) Representa un cronograma del experimento. (B) Representa la expresión de ARNm de sFLT1-M3 en hígado, riñón y placenta. (C) Representa los niveles de proteína sFLT1 en función del tiempo. (D) Representa el porcentaje de la dosis inyectada de sFLT1-2283 presente en los tejidos del hígado, el riñón, la placenta, el bazo y el hígado fetal a los cinco días tras la inyección. (E) Representa los |ig/g de sFLT1-2283 presentes en los tejidos del hígado, el riñón, la placenta, el bazo y el hígado fetal a los cinco días tras la inyección.
Las figuras 17A-D representan silenciamiento eficiente de sFLT1 por ARNiph en ratones preñados (CD1). (A) Representa un cronograma del experimento. (B) Representa los niveles de proteína msFlt1-1 detectados en plasma en función de los días de embarazo. (C) Es una tabla de aumentos de peso del ratón madre y datos de los pesos y la mortalidad de las crías. (D) Representa gráficos que muestran los niveles de AST y ALT el día 19.
Las figuras 18A-B representan la estabilidad de ARNiph in vivo. i.v. frente a s.c., sFLT_2283P2 (150403). (A) Representa un cronograma del experimento. (B) Representa los niveles de ARNiph en el hígado tras la administración i.v. y s.c.
La figura 19 representa la estabilidad de ARNiph in vivo. (A) Representa un cronograma del experimento. (B) Representa ARNiph a las dos horas, 24 horas y 120 horas tras la administración i.v. sFLT1_2283P2 (#150624).
La figura 20 representa la distribución tisular en hígado de conjugados DHA-ARNiph y g2DHA-ARNiph. Aumento de 10X. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1_2283P2-g2DHA). Azul, núcleo (DAPI); rojo, ARNiph (Cy3). Ratón E15, inyección i.v. (vena de la cola). Los ARNiph se administraron a 10 mg/kg, 24 horas. LEICA DM5500B.
La figura 21 representa la distribución tisular en hígado de conjugados DHA-ARNiph y g2DHA-ARNiph. Aumento de 63X. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1_2283P2-g2DHA). Azul, núcleo (DAPI); rojo, ARNiph (Cy3). Ratón E15, inyección i.v. (vena de la cola). Los ARNiph se administraron a 10 mg/kg, 24 horas. LEICA DM5500B.
La figura 22 representa la distribución tisular en riñón de conjugados DHA-ARNiph y g2DHA-ARNiph. Aumento de 10X. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1_2283P2-g2DHA). Azul, núcleo (DAPI); rojo, ARNiph (Cy3). Ratón E15, inyección i.v. (vena de la cola). Los ARNiph se administraron a 10 mg/kg, 24 horas. LEICA DM5500B.
La figura 23 representa la distribución tisular en riñón de conjugados DHA-ARNiph y g2DHA-ARNiph. Aumento de 63X. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1_2283P2-g2DHA). Azul, núcleo (DAPI); rojo, ARNiph (Cy3). Ratón E15, inyección i.v. (vena de la cola). Los ARNiph se administraron a 10 mg/kg, 24 horas. LEICA DM5500B.
La figura 24 representa la distribución tisular en placenta de conjugados DHA-ARNiph y g2DHA-ARNiph. Aumento de 10X. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1_2283P2-g2DHA). Azul, núcleo (DAPI); rojo, ARNiph (Cy3). Ratón E15, inyección i.v. (vena de la cola). Los ARNiph se administraron a 10 mg/kg, 24 horas. LEICA DM5500B.
La figura 25 representa la distribución tisular en placenta de conjugados DHA-ARNiph y g2DHA-ARNiph. Aumento de 63X. (sFLT1_2283P2-DHA, sFLT1_2283P2-g2DHA). Azul, núcleo (DAPI); rojo, ARNiph (Cy3). Ratón E15, inyección i.v. (vena de la cola). Los ARNiph se administraron a 10 mg/kg, 24 horas. LEICA DM5500B.
La figura 26 representa el silenciamiento de sFLT1 mediado por DHA-ARNiph en ratones preñados (CD1) que se detectó en los tejidos del hígado, el riñón y la placenta. sFLT1_2283P2-g2DHA (150813).
Las figuras 27A-D representan la validación in vitro de sFLT1_2283/2519 (sFLT1-mix, 1510025). (A) Representa una respuesta a la dosis de ARNip candidatos que seleccionan como diana sFLt1 i13 mostrada por los niveles de expresión de ARNm. (B) Representa una respuesta a la dosis de ARNip candidatos que seleccionan como diana sFLt1 e15a mostrada por los niveles de expresión de ARNm. (C) Representa los niveles de expresión de ARNm de aFLT1 i13 en presencia de 2283 (círculos) o 2283/2519 (cuadrados). (D) Representa los niveles de expresión de ARNm de aFLT1 e15a en presencia de 2519 (círculos) o 2283/2519 (cuadrados).
Las figuras 28A-D representan la validación in vitro de sFLT1_2283/2519 (sFLT1-mix, 151111). (A) Representa una respuesta a la dosis de ARNip candidatos que seleccionan como diana sFLt1 i13 mostrada por los niveles de expresión de ARNm. (B) Representa una respuesta a la dosis de ARNip candidatos que seleccionan como diana sFLt1 e15a mostrada por los niveles de expresión de ARNm. (C) Representa los niveles de expresión de ARNm de aFLT1 i13 en presencia de 2283 (círculos), 2283/2519 LS (cuadrados) o 2283/2519 (rombos). (D) Representa los niveles de expresión de ARNm de aFLT1 e15a en presencia de 2519 (círculos), 2283/2519 LS (cuadrados) o 2283/2519 (rombos).
La figura 29 representa la modulación de la proteína sFLT1 soluble en ratones preñados usando inyecciones únicas de sFLT1 2283/2519 (10 mg/kg cada una). Los niveles de proteína sFLT1 el día 14/día 17 se muestran en el gráfico de la izquierda. Los niveles de proteína sFLT1 en el suero en función de los días de embarazo se muestran en el gráfico de la derecha.
La figura 30 representa un esquema de un modelo de PE de babuino (Papio hamadrysas) para estudiar la eficacia y seguridad de sFLT1_i13_2283P2/sFLT1_e15a_2519P2 usando babuinos silvestre con PE inducida mediante isquemia uteroplacentaria (IUP).
La figura 31 representa la captación pasiva de FM-ARNiphsFLT1 en trofoblastos primarios eficaz para disminuir la expresión de ARNm de sFLT1 i13.
La figura 32 representa el suministro sistémico de FM-ARNiphsFLT1 (dos columnas de la derecha) en relación con ARNiphsFLT1 no completamente modificado (dos columnas de la izquierda) en tejidos del hígado, el riñón y el bazo. La figura 33 representa el suministro sistémico de FM-ARNiph en tejidos del hígado, el riñón, el bazo, la piel y la grasa después de la inyección subcutánea (s.c.).
La figura 34 representa un ensayo basado en PNA para la cuantificación de la cadena guía in vivo.
Las figuras 35A-F representan el suministro y la eficacia robustos de FM-ARNiphsFLT1 en tejidos del hígado, el riñón y el bazo in vivo después de la administración i.v. o s.c. (A) Representa los niveles de ARNiph por tejido en ng/mg tras la administración i.v. de 10 mg/kg a t = 24 horas. (B) Representa los niveles de ARNiph por tejido en ng/mg tras la administración s.c. de 10 mg/kg a t = 24 horas. (C) Representa los niveles de ARNiph por tejido en ng/mg tras la administración i.v. de 2x20 mg/kg a t = 120 horas. (D) Representa los niveles de ARNiph por tejido en ng/mg tras la administración i.v. de 2x15 mg/kg a t = 120 horas. (E) Representa la expresión de ARNm de sFlt1 tras la administración i.v. de 2x20 mg/kg a t = 120 horas. (f ) Representa la expresión de ARNm de sFlt1 tras la administración i.v. de 2x20 mg/kg a t = 120 horas.
La figura 36 representa una mezcla de ARNiph de sFLT_2283/2519 según realizaciones particularmente preferidas de la invención. Las especies representadas en este dibujo pueden ser una sal farmacéuticamente aceptable, ya que el P-OH y P-SH estarían desprotonados.
La figura 37 representa datos a partir de un modelo de PE de babuino que muestran la estabilización de la tensión arterial en el animal.
La figura 38 representa datos a partir de un modelo de PE de babuino que muestran una disminución de la tensión arterial en el animal.
La figura 39 representa ARNbc de sFLT1-2283/2519 a modo de ejemplo conjugados con colesterol. R1=5'-E-VP-mU, C12H18N2O9P2S, peso molecular: 428,29, R2=3'-colesterol, C27H46O, peso molecular: 386,66, conectados mediante un ligador definido como L. R1=A=A-A-U-U-U-G-G-A-G-A-U-C=C=G=A=G=A=G (SEQ ID NO:8), R2-A=U=U-U-A-A-A-C-C-U-C-U-A=G=G (SEQ ID NO:9), R1=A=U-A-A-A-U-G-G-U-A-G-C-U=A=U=G=A=U=G (SEQ ID NO:10), R2-A=U=A-U-U-U-A-C-C-A-U-C-G=A=U (SEQ ID NO:11.
La figura 40 representa ARNbc de sFLT1-2283/2519 a modo de ejemplo conjugados con un derivado de fosfatidilcolina de DHA (PC-DHA). R1=5'-E-VP-mU, C12H18N2O9P2S, peso molecular: 428,29. R2=3'-PC-DHA, C38H66N3O8P+, peso molecular: 723,93, conectados mediante un ligador definido como L. R1=A=A-A-U-U-U-G-G-A-G-A-U-C=C=G=A=G=A=G (SEQ ID NO:12), R2-A=U=U-U-A-A-A-C-C-U-C-U-A=G=G (SEQ ID NO:13), R1=A=U-A-A-A-U-G-G-U-A-G-C-U=A=U=G=A=U=G (SEQ ID NO:14), R2-A=U=A-U-U-U-A-C-C-A-U-C-G=A=U (SEQ ID NO:15). La figura 41 representa ejemplos de uniones internucleotídicas de R3. R3 es un enlace internucleotídico entre los dos primeros nucleótidos en los extremos 5' o 3' de cualquier cadena de oligonucleótido dada que puede estabilizarse con los restos representados en esta figura.
La figura 42 representa ejemplos de uniones internucleotídicas de L2.
La figura 43 representa ejemplos de nucleósidos de X1, X2, X3 y X4.
Descripción detallada
Se describen dianas angiogénicas novedosas (por ejemplo, secuencias diana de PE, por ejemplo, secuencias intrónicas de ARNm de sFLT1). También se proporcionan ARNip novedosos que seleccionan selectivamente como diana regiones intrónicas de ARNm que codifican para dianas angiogénicas (por ejemplo, proteínas sFLT1). También se describen métodos de tratamiento de trastornos angiogénicos, por ejemplo, PE, PE posparto, eclampsia y/o HELLP.
Generalmente, la nomenclatura usada en relación con el cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descrita en el presente documento es la conocida y usada habitualmente en la técnica. Los métodos y las técnicas proporcionados en el presente documento se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se mencionan y comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan según especificaciones del fabricante, tal como se realiza habitualmente en la técnica o tal como se describe en el presente documento. La nomenclatura usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química de síntesis orgánica y química medicinal y farmacéutica descritos en el presente documento es la bien conocida y habitualmente usada en la técnica. Se usan técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.
A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen los significados que entienden habitualmente los expertos habituales en la técnica. En caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en el presente documento tienen prioridad sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca. A menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán los singulares. El uso de “o” significa “y/o” a menos que se mencione lo contrario. El uso del término “que incluye”, así como otras formas, tales como “incluye” e “incluido”, no es limitativo.
Para que la invención pueda entenderse más fácilmente, en primer lugar se definen ciertos términos.
Por “alteración” quiere decirse un cambio (aumento o disminución) en los niveles de expresión de un gen, ARNm o polipéptido tal como se detectan mediante métodos convencionales conocidos en la técnica tales como los descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, un aumento o disminución incluye un cambio del 10% en los niveles de expresión, un cambio del 25%, un cambio del 40% o un cambio del 50% o mayor en los niveles de expresión. En determinadas realizaciones, un aumento o disminución es un cambio en los niveles de expresión de entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 50% o entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 40%. “Alteración” también puede indicar un cambio (aumento o disminución) en la actividad biológica de cualquiera de los ARNm o polipéptidos de la invención (por ejemplo, sFlt1 (por ejemplo, sFlt1-i13 corta, sFlt1-i13 larga y/o sFlt1-i15a (también conocida como sFlt1-e15a)). Los ejemplos de actividad biológica para sFlt-1 incluyen uno o más síntomas clínicos de PE o eclampsia. Tal como se usa en el presente documento, un aumento o disminución incluye un cambio del 10% en la actividad biológica, preferiblemente un cambio del 25%, más preferiblemente un cambio del 40% y lo más preferiblemente un cambio del 50% o mayor en la actividad biológica. En determinadas realizaciones preferidas, un aumento o disminución es un cambio en los niveles de expresión de entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 50% o entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 40%.
Determinadas realizaciones de la invención se refieren a compuestos para su uso en el tratamiento de uno o más trastornos angiogénicos. Por “tratamiento de un trastorno angiogénico” quiere decirse el uso de un oligonucleótido (por ejemplo, un ARNip) de la invención en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades que implican los procesos fisiológicos y patológicos de neovascularización, vasculogénesis y/o angiogénesis. Como tales, estas composiciones farmacéuticas son útiles para tratar enfermedades, estados y trastornos que requieren la inhibición de la neovascularización, vasculogénesis o angiogénesis, incluyendo, pero sin limitarse a, crecimiento y metástasis de tumor canceroso, neoplasia, neovascularización ocular (incluyendo redundancia macular, retinopatía diabética, retinopatía isquémica, retinopatía del prematuro, neovascularización coroidal), artritis reumatoide, osteoartritis, asma crónico, choque séptico, enfermedades inflamatorias, sinovitis, destrucción de huesos y cartílagos, crecimiento de paño, formación de osteofito, osteomielitis, psoriasis, obesidad, hemangioma, sarcoma de Kaposi, aterosclerosis (incluyendo ruptura de placa aterosclerótica), endometriosis, verrugas, crecimiento de exceso de cabello, queloides cicatriciales, edema alérgico, hemorragia uterina disfuncional, quistes foliculares, hiperestimulación ovárica, endometriosis, osteomielitis, procesos inflamatorios e infecciosos (hepatitis, neumonía, glomerulonefritis), asma, pólipos nasales, trasplante, regeneración hepática, leucomalacia, tiroiditis, aumento de tamaño del tiroides, trastornos linfoproliferativos, neoplasias malignas hematológicas, malformaciones vasculares, preeclampsia, eclampsia y/o síndrome de HELLP.
Por “preeclampsia” (“PE”) quiere decirse el trastorno multisistémico que está caracterizado por hipertensión con proteinuria o edema, o ambos, y uno o más de disfunción glomerular, edema cerebral, edema hepático o anomalías de coagulación debido a embarazo o a la influencia de un embarazo reciente. La PE se produce generalmente después de la 20a semana de gestación. La PE se define generalmente como alguna combinación de los siguientes síntomas: (1) una tensión arterial sistólica (TA) > 140 mm de Hg y una TA diastólica > 90 mm de Hg después de 20 semanas gestación (generalmente medida en dos ocasiones, con una separación de 4-168 horas), (2) proteinuria de reciente aparición (1+ mediante tira reactiva en análisis de orina, > 300 mg de proteína en una recogida de orina de 24 horas, o una única muestra de orina aleatoria que tiene una razón de proteína/creatinina > v0,3), y (3) resolución de hipertensión y proteinuria a las 12 semanas tras el parto.
La PE grave se define generalmente como (1) una TA diastólica > 110 mm de Hg (generalmente medida en dos ocasiones, con una separación de 4-168 horas) o (2) proteinuria caracterizada por una medición de 3,5 g o más de proteína en una recogida de orina de 24 horas o dos muestras de orina aleatorias con al menos 3+ de proteína mediante tira reactiva. En PE, generalmente se producen hipertensión y proteinuria dentro del plazo de siete días una con respecto a otra. En PE grave, pueden producirse hipertensión grave, proteinuria grave y síndrome de HELLP (hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y bajo recuento de plaquetas) o eclampsia simultáneamente o sólo un síntoma cada vez.
Ocasionalmente, la PE grave puede conducir al desarrollo de convulsiones. Esta forma grave del síndrome se denomina “eclampsia”. La eclampsia también puede incluir disfunción o daño de varios órganos o tejidos tales como el hígado (por ejemplo, daño hepatocelular, necrosis periportal) y el sistema nervioso central (por ejemplo, edema cerebral y hemorragia cerebral). Se piensa que la etiología de las convulsiones es consecuencia del desarrollo de edema cerebral y espasmo focal de vasos sanguíneos pequeños en el riñón.
Por síndrome de “HELLP” quiere decirse un grupo de síntomas que se producen en mujeres embarazadas caracterizado por hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y bajo recuento de plaquetas. Se piensa que el síndrome de HELLP es una variante de PE, pero puede ser una entidad en sí mismo.
En determinados aspectos, PE incluye PE posparto. La PE posparto es un estado poco frecuente que se produce cuando una mujer tiene una tensión arterial alta y exceso de proteína en la orina tras el parto. La PE posparto se desarrolla normalmente dentro del plazo de 48 horas desde el parto. Sin embargo, algunas veces la PE posparto se desarrolla hasta seis semanas después del parto, lo cual se conoce como PE posparto tardía. Los signos y síntomas de PE posparto y PE posparto tardía son normalmente similares a los de PE que se produce durante el embarazo y pueden incluir uno o cualquier combinación de los siguientes: tensión arterial alta (es decir, 140/90 mm Hg o más; proteinuria; cefaleas intensas; cambios de visión, incluyendo pérdida temporal de visión, visión borrosa o sensibilidad a la luz; hinchamiento de la cara y las articulaciones; dolor de la parte superior del abdomen, habitualmente bajo las costillas en el lado derecho; náuseas o vómitos; y micción reducida; aumento repentino de peso, normalmente más de 2 libras (0,9 kilogramos) por semana.
Por “retraso del crecimiento intrauterino (IUGR)” quiere decirse un síndrome que da como resultado un peso al nacer que es menor del 10 por ciento del peso fetal predicho para la edad gestacional del feto. El criterio actual de la Organización Mundial de la Salud para peso al nacer bajo es un peso de menos de 2.500 gramos (5 lbs y 8 oz) o por debajo del percentil 10 para la edad gestacional según las tablas de los EE.UU. de peso al nacer para la edad gestacional por raza, número de partos y sexo del lactante (Zhang y Bowes, Obstet. Gynecol. 86: 200-208, 1995). Estos bebés con peso bajo al nacer también se denominan “pequeños para la edad gestacional (SGA)”. PE es un estado que se sabe que está asociado con IUGR o SGA.
También se describe en el presente documento el tratamiento de uno o más trastornos renales. Por “tratamiento de un trastorno renal” quiere decirse el uso de un oligonucleótido (por ejemplo, un ARNip) de la invención en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades, estados o trastornos asociados con el riñón. Las enfermedades, estados o trastornos asociados con el riñón incluyen, pero no se limitan a, enfermedad renal crónica (CKD) (estadios 1 - 5, siendo el estadio 1 el más leve y que habitualmente provoca pocos síntomas y siendo el estadio 5 una enfermedad grave con una mala esperanza de vida si no se trata (CKD de estadio 5 se denomina con frecuencia enfermedad renal de estadio terminal, insuficiencia renal de estadio terminal o enfermedad de riñón de estadio terminal, insuficiencia de riñón crónica o insuficiencia renal crónica) e insuficiencia renal aguda (ARF) (provocada por lesión por traumatismo con pérdida de sangre, reducción repentina del flujo sanguíneo a los riñones, daño a los riñones por septicemia, obstrucción del flujo de orina, daño por determinados fármacos o toxinas, complicaciones del embarazo (por ejemplo, eclampsia, PE y/o síndrome de HELLP) y similares).
También se describe en el presente documento el tratamiento de uno o más trastornos hepáticos. Por “tratamiento de un trastorno hepático” quiere decirse el uso de un oligonucleótido (por ejemplo, un ARNip) de la invención en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades, estados o trastornos asociados con el hígado. Las enfermedades, estados o trastornos asociados con el hígado incluyen, pero no se limitan a, fascioliasis, hepatitis (por ejemplo, hepatitis viral, hepatitis alcohólica, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis hereditaria y similares), enfermedad hepática alcohólica (incluyendo enfermedad del hígado graso alcohólica, hepatitis alcohólica y cirrosis alcohólica), enfermedad del hígado graso no alcohólica, esteatohepatitis, cirrosis no alcohólica, cáncer de hígado primario (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, angiosarcoma, hemangiosarcoma y similares), cirrosis biliar primar, enfermedad esclerosante primaria, necrosis centrolobulillar, síndrome de Budd-Chiari, hemocromatosis, enfermedad de Wilson, deficiencia de alfa-1-antitripsina, enfermedad de almacenamiento de glicógeno tipo II, amiloidosis hereditaria relacionada con transtiretina, síndrome de Gilbert, atresia biliar, deficiencia de alfa-1-antitripsina, síndrome de Alagille, colestasis intrahepática familiar progresiva y similares.
Por “cantidad terapéutica” quiere decirse una cantidad que, cuando se administra a un paciente que padece PE o eclampsia, es suficiente para provocar una reducción cualitativa o cuantitativa en los síntomas de PE o eclampsia tal como se describe en el presente documento. Una “cantidad terapéutica” también puede significar una cantidad que, cuando se administra a un paciente o sujeto que padece PE o eclampsia, es suficiente para provocar una reducción en los niveles de expresión de una o más proteínas sFLT1 (por ejemplo, una o más de FLT1-i13 corta, sFLT1-i13 larga y sFlt1-i15a) tal como se mide mediante uno o más de los ensayos descritos en el presente documento.
Por “sujeto” quiere decirse un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, un ser humano o mamífero no humano, tal como primates no humanos u otros animales tales como, por ejemplo, bovinos, equinos, caninos, ovinos, felinos, murinos y similares. En esta definición se incluyen mamíferos preñados, posparto y no preñados.
Por “FLT1 soluble (sFLT1)” (también conocida como sVEGF-R1) quiere decirse una forma soluble del receptor FLT1 que tiene actividad biológica de sFLT1 (por ejemplo, por ejemplo, sFlt1-i13 corta, sFlt1-i13 larga y/o sFlt1-i15a (también conocida como sFlt1-e15a)). La actividad biológica de un polipéptido de sFLT1 puede someterse a ensayo usando cualquier método convencional, por ejemplo, sometiendo a ensayo para detectar uno o más síntomas clínicos de PE, PE posparto, eclampsia y/o HELLP, sometiendo a ensayo niveles de ARNm y/o proteína sFLT1, sometiendo a ensayo la unión de sFLT1 a VEGF y similares. Las proteínas sFLT1 carecen del dominio transmembrana y del dominio de tirosina cinasa citoplasmático del receptor FLT1. Las proteínas sFLT1 pueden unirse a VEGF y PlGF que se unen con alta afinidad, pero no pueden inducir la proliferación o angiogénesis y por tanto son funcionalmente diferentes de los receptores Flt-1 y k Dr . sFLT1 se purificó inicialmente a partir de células endoteliales de cordón umbilical humanas y posteriormente se mostró que se producían por células del trofoblasto in vivo. Tal como se usa en el presente documento, sFlt-1 incluye cualquier isoforma o miembro de la familia de sFlt-1, por ejemplo, sFLT1-i13 (por ejemplo, FLT1-i13 corta y/o sFLT1-i13 larga (sFLT1_v1), sFlt1-i15a (sFLT1_v2), sFLT1-e15a, sFLT1_v3, sFLT1_v4 y similares).
La secuencia de la isoforma sFLT1-i13 corta es:
GTGAGCACTGCAACAAAAAGGCTGTTTTCTCTCGGATCTCCA
AATTT AAAAGC AC AAGGAAT GATT GT ACC AC AC AAAGT AAT GT AAAAC AT TAAAGGACTCATTAAAAAGTAA (SEQ ID NO:5).
La secuencia de la isoforma sFLT1-i13 larga es:
GA AGA A AGA A ATT AC A AT C AG AGGT GAGC ACTGC A AC A A A A AGGC TGTT TTCTCTCGGATCTCCAAATTTAAAAGCACAAGGAATGATTGT ACC ACACA AAGTAATGT AAAAC ATT AAAGGACTCATTAAAAAGTAACAGTTGTCTCAT ATCATCTTGATTTATTGTCACTGTTGCTAACTTTCAGGCTCGGAGGAGATG CTCCTCCCAAAATGAGTTCGGAGATGATAGCAGTAATAATGAGACCCCCG GGCTCCAGCTCTGGGCCCCCCATTCAGGCCGAGGGGGCTGCTCCGGGGGG CCGACTTGGTGCACGTTTGGATTTGGAGGATCCCTGCACTGCCTTCTCTGT GTTTGTTGCTCTTGCTGTTTTCTCCTGCCTGATAAACAACAACTTGGGATG ATCCTTTCCATTTTGATGCCAACCTCTTTTTATTTTTAAGCGGCGCCCTATA GT (SEQ ID NO:6).
La secuencia de la isoforma sFLT1-i15a (también conocida como sFlt1-e15a) es:
AACTGTATACATCAACGTCACCATCGTCATCGTCATCATCACCATTGTCAT CATCATCATCATCGTCATCATCATCATCATCATAGCTATCATCATTATCAT C AT C AT C AT C AT C AT C AT C AT AGCT ACC ATTT ATTGAAA ACT ATT ATGT GT CAACTTCAAAGAACTTATCCTTTAGTTGGAGAGCCAAGACAATCATAACA ATAACAAATGGCCGGGCATGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTG GGAGGCCAAGGCAGGTGGATCATTTGAGGTCAGGAGTCCAAGACCAGCCT GACCAAGATGGTGAAATGCTGTCTCTATTAAAAATACAAAATTAGCCAGG CATGGTGGCTCATGCCTGTAATGCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGACAGGA GAATCACTTGAACCCAGGAGGCAGAGGTTGCAGGGAGCCGAGATCGTGT ACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCGAAACTCCGTCTCAAAAAACAA AT AAAT AAAT AAAT A AAT AAAC AGAC AAAATT C ACTTTTT ATTCT ATT AA ACTTAACATACATGCTAA (SEQ ID NO:7).
Los niveles de proteínas sFLTI pueden medirse midiendo la cantidad de sFLTI libre, unida (es decir, unida a factor de crecimiento) o total (unida libre). Los niveles de VEGF o PlGF se determinan midiendo la cantidad de PlGF libre o VEGF libre (es decir, no unidos a sFLT1). Una métrica a modo de ejemplo es [sFLT1/(VEGF+PlGF)], también denominado índice antiangiogénico de PE (PAAI).
Por “índice antiangiogénico de preeclampsia (PAAI)” quiere decirse la razón de sFLT1 / VEGF PlGF usada como indicador de actividad antiangiogénica. Se considera que un PAAI mayor de 20 es indicativo de PE o riesgo de PE. Por “factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)” quiere decirse un factor de crecimiento de mamífero que es homólogo al factor de crecimiento definido en las patentes estadounidenses n.os 5.332.671; 5.240.848; 5.194.596; y Charnock-Jones et al. (Biol. Reproduction, 48: 1120-1128, 1993), y tiene actividad biológica de VEGF. VEGF existe como homodímero glicosilado e incluye al menos cuatro isoformas diferentes sometidas a corte y empalme de manera alternativa. La actividad biológica de VEGF nativo incluye el fomento del crecimiento selectivo de células endoteliales vasculares o células endoteliales de la vena umbilical y la inducción de angiogénesis. Tal como se usa en el presente documento, VEGF incluye cualquier isoforma o miembro de la familia de VEGF (por ejemplo, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF189, VEGF165 o VEGF121). En determinadas realizaciones, VEGF es la isoforma VEGF121 o VEGF165 (Tischer et al., J. Biol. Chem. 266, 11947-11954, 1991; Neufed et al. Cancer Metastasis 15:153-158, 1996), que se describe en las patentes estadounidenses n.os 6.447.768; 5.219.739 y 5.194.596. También se incluyen formas mutantes de VEGF tales como el VEGF selectivo para KDR y VEGF selectivo para Flt descritos en Gille et al. (J. Biol. Chem. 276: 3222-3230, 2001). VEGF incluye formas humanas y puede incluir formas de otros animales de VEGF (por ejemplo, ratón, rata, perro, pollo o similares).
Por “factor de crecimiento placentario (PlGF)” quiere decirse un factor de crecimiento de mamífero que es homólogo a la proteína definida por el número de registro de GenBank P49763 y que tiene actividad biológica de PlGF. PlGF es un homodímero glicosilado que pertenece a la familia de VEGF y puede encontrarse en dos isoformas distintas mediante mecanismos de corte y empalme alternativos. PlGF se expresa por cito y sincitiotrofoblastos en la placenta y las actividades biológicas de PlGF incluyen la inducción de proliferación, migración y activación de células endoteliales, particularmente células del trofoblasto.
Por “trofoblasto” quiere decirse la capa de células mesectodérmicas que cubre el blastocisto que erosiona la mucosa uterina y a través de la cual el embrión recibe nutrientes a partir de la madre. Las células del trofoblasto contribuyen a la formación de la placenta.
El término “nucleósido” se refiere a una molécula que tiene una base de purina o pirimidina covalentemente unida a un azúcar de ribosa o desoxirribosa. Los nucleósidos a modo de ejemplo incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina y timidina. Los nucleósidos a modo de ejemplo adicionales incluyen inosina, 1-metil-inosina, pseudouridina, 5,6-dihidrouridina, ribotimidina, 2N-metilguanosina y 2,2N,N-dimetilguanosina (también denominados nucleósidos “poco frecuentes”). El término “nucleótido” se refiere a un nucleósido que tiene uno o más grupos fosfato unidos en uniones éster al resto de azúcar. Los nucleótidos a modo de ejemplo incluyen monofosfatos, difosfatos y trifosfatos de nucleósidos. Los términos “polinucleótido” y “molécula de ácido nucleico” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un polímero de nucleótidos unidos entre sí mediante una unión fosfodiéster entre los átomos de carbono 5' y 3'.
El término “ARN” o “molécula de ARN” o “molécula de ácido ribonucleico” se refiere a un polímero de ribonucleótidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, o más ribonucleótidos). El término “Ad N” o “molécula de ADN” o “molécula de ácido desoxirribonucleico” se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos. El ADN y ARN pueden sintetizarse de manera natural (por ejemplo, mediante replicación de ADN o transcripción de ADN, respectivamente). El ARN puede modificarse tras la transcripción. El ADN y ARN también pueden sintetizarse químicamente. El ADN y ARN pueden ser monocatenarios (es decir, ARNmc y ADNmc, respectivamente) o multicatenarios (por ejemplo, bicatenarios, es decir, ARNbc y ADNbc, respectivamente). “ARNm” o “ARN mensajero” es ARN monocatenario que especifica la secuencia de aminoácidos de una o más cadenas de polipéptido. Esta información se traduce durante la síntesis de proteína cuando los ribosomas se unen al ARNm.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ARN de interferencia pequeño” (“ARNip”) (también denominado en la técnica “ARN de interferencia cortos”) se refiere a un ARN (o análogo de ARN) que comprende entre aproximadamente 10-50 nucleótidos (o análogos de nucleótido) que puede dirigir o mediar en la interferencia de ARN. Preferiblemente, un ARNip comprende entre aproximadamente 15-30 nucleótidos o análogos de nucleótido, más preferiblemente entre aproximadamente 16-25 nucleótidos (o análogos de nucleótido), incluso más preferiblemente entre aproximadamente 18-23 nucleótidos (o análogos de nucleótido) e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 19-22 nucleótidos (o análogos de nucleótido) (por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos o análogos de nucleótido). El término ARNip “corto” se refiere a un ARNip que comprende aproximadamente 21 nucleótidos (o análogos de nucleótido), por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos. El término ARNip “largo” se refiere a un ARNip que comprende aproximadamente 24-25 nucleótidos, por ejemplo, 23, 24, 25 o 26 nucleótidos. Los ARNip cortos pueden incluir, en algunos casos, menos de 19 nucleótidos, por ejemplo, 16, 17 o 18 nucleótidos, siempre que el ARNip más corto conserve la capacidad para mediar en iARN. Asimismo, los ARNip largos pueden incluir, en algunos casos, más de 26 nucleótidos, siempre que el ARNip más largo conserve la capacidad para mediar en iARN en ausencia de procesamiento adicional, por ejemplo, procesamiento enzimático, para dar un ARNip corto.
El término “análogo de nucleótido” o “nucleótido alterado” o “nucleótido modificado” se refiere a un nucleótido no convencional, incluyendo ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que no se producen de manera natural. Los análogos de nucleótido a modo de ejemplo están modificados en cualquier posición para alterar determinadas propiedades químicas del nucleótido pero conservar la capacidad del análogo de nucleótido para realizar su función prevista. Los ejemplos de posiciones del nucleótido que pueden derivatizarse incluyen la posición 5, por ejemplo, 5-(2-amino)propií-uridina, 5-bromo-uridina, 5-propino-uridina, 5-propenil-uridina, etc.; la posición 6, por ejemplo, 6-(2-amino)propil-uridina; la posición 8 para adenosina y/o guanosinas, por ejemplo, 8-bromo-guanosina, 8-cloroguanosina, 8-fluoro-guanosina, etc. Los análogos de nucleótido también incluyen nucleótidos desaza, por ejemplo, 7-desaza-adenosina; nucleótidos modificados en O y en N (por ejemplo, alquilados, por ejemplo, N6-metiladenosina, o tal como se conoce de otro modo en la técnica); y otros análogos de nucleótido heterocíclicamente modificados tales como los descritos en Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., agosto de 2000, 10(4): 297­ 310.
Los análogos de nucleótido también pueden comprender modificaciones en la porción de azúcar de los nucleótidos. Por ejemplo, el grupo 2'OH puede sustituirse por grupo seleccionado de H, o R, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOR u OR, en el que R es alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alquenilo, alquinilo, arilo, etc. Otras modificaciones posibles incluyen las descritas en las patentes estadounidenses n.os 5.858.988 y 6.291.438.
El grupo fosfato del nucleótido también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo uno o más de los oxígenos del grupo fosfato con azufre (por ejemplo, fosforotioatos) o realizando otras sustituciones que permiten que el nucleótido realice su función prevista tal como se describe, por ejemplo, en Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., abril de 2000, 10(2): 117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., octubre de 2000, 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., octubre de 2001, 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., abril de 2001, 11(2):77-85, y la patente estadounidense n.° 5.684.143. Algunas de las modificaciones anteriormente mencionadas (por ejemplo, modificaciones del grupo fosfato) reducen preferiblemente la tasa de hidrólisis, por ejemplo, de polinucleótidos que comprenden dichos análogos in vivo o in vitro.
El término “oligonucleótido” se refiere a un polímero corto de nucleótidos y/o análogos de nucleótido. El término “análogo de ARN” se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido químicamente sintetizado) que tiene al menos un nucleótido alterado o modificado en comparación con un ARN no alterado o no modificado correspondiente pero que conserva una naturaleza o función igual o similar al ARN no alterado o no modificado correspondiente. Tal como se comentó anteriormente, los oligonucleótidos pueden estar unidos con uniones que dan como resultado una tasa inferior de hidrólisis del análogo de ARN en comparación con una molécula de a Rn con uniones fosfodiéster. Por ejemplo, los nucleótidos del análogo pueden comprender metilendiol, etilendiol, oximetiltio, oxietiltio, oxicarboniloxilo, fosforodiamidato, fosforoamidato y/o uniones fosforotioato. Los análogos de ARN preferidos incluyen ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos modificados en el azúcar y/o en la estructura principal. Tales alteraciones o modificaciones pueden incluir además la adición de material distinto de nucleótido, tal como en el/los extremo(s) del ARN o de manera interna (en uno o más nucleótidos del ARN). Un análogo de ARN sólo necesita ser lo suficientemente similar a ARN natural de modo que tiene la capacidad para mediar (media) en la interferencia de ARN.
Tal como se usa en el presente documento, el término “interferencia de ARN” (“iARN”) se refiere a una degradación intracelular selectiva de ARN. La iARN se produce en células de manera natural para eliminar ARN foráneos (por ejemplo, ARN virales). La iARN natural avanza mediante fragmentos escindidos a partir de ARNbc libre que dirigen el mecanismo de degradación a otras secuencias de ARN similares. Alternativamente, la iARN puede iniciarse de manera artificial, por ejemplo, para silenciar la expresión de genes diana.
Un agente de iARN, por ejemplo, un agente de silenciamiento de ARN, que tiene una cadena que es una “secuencia lo suficientemente complementaria a una secuencia de ARNm diana como para dirigir la interferencia de ARN (iARN) específica de diana” significa que la cadena tiene una secuencia suficiente como para activar la destrucción del ARNm diana mediante la maquinaria o el proceso de iARN.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ARN aislado” (por ejemplo, “ARNip aislado” o “precursor de ARNip aislado”) se refiere a moléculas de ARN que están sustancialmente libres de otro material celular o medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “silenciamiento de ARN” se refiere a un grupo de mecanismos reguladores específicos de secuencia (por ejemplo, interferencia de ARN (iARN), silenciamiento génico transcripcional (TGS), silenciamiento génico tras la transcripción (PTGS), extinción, cosupresión y represión de la traducción) mediados por moléculas de ARN que dan como resultado la inhibición o el “silenciamiento” de la expresión de un gen que codifica para proteína correspondiente. Se ha observado silenciamiento ARN en muchos tipos de organismos, incluyendo plantas, animales y hongos.
El término “silenciamiento de ARN discriminante” se refiere a la capacidad de una molécula de ARN para inhibir sustancialmente la expresión de una “primera” secuencia de polinucleótido o secuencia de polinucleótido “diana” al tiempo que no inhibe sustancialmente la expresión de una “segunda” secuencia de polinucleótido o “secuencia de polinucleótido no diana”, por ejemplo, cuando ambas secuencias de polinucleótido están presentes en la misma célula. En determinadas realizaciones, la secuencia de polinucleótido diana corresponde a un gen diana, mientras que la secuencia de polinucleótido no diana corresponde a un gen no diana. En otras realizaciones, la secuencia de polinucleótido diana corresponde a un alelo diana, mientras que la secuencia de polinucleótido no diana corresponde a un alelo no diana. En determinadas realizaciones, la secuencia de polinucleótido diana es la secuencia de ADN que codifica para la región regulatoria (por ejemplo, elementos promotores o potenciadores) de un gen diana. En otras realizaciones, la secuencia de polinucleótido diana es un ARNm diana codificado por un gen diana.
El término “in vitro” tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica reactivos o extractos, por ejemplo, extractos celulares, purificados. El término “in vivo” también tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica células vivas, por ejemplo, células inmortalizadas, células primarias, líneas celulares y/o células en un organismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “transgén” se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico, que se inserta de manera artificial en una célula, y pasa a formar parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de la célula. Un transgén de este tipo puede incluir un gen que es parcial o totalmente heterólogo (es decir, foráneo) con respecto al organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo a un gen endógeno del organismo. El término “transgén” también significa una molécula de ácido nucleico que incluye una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas, por ejemplo, ADN, que codifican para uno o más precursores de ARN modificados por ingeniería, que van a expresarse en un organismo transgénico, por ejemplo, animal, que es parcial o totalmente heterólogo, es decir, foráneo, con respecto al animal transgénico, u homólogo con respecto a un gen endógeno del animal transgénico, pero que está diseñado para insertarse en el genoma del animal en una ubicación que difiere de la del gen natural. Un transgén incluye uno o más promotores y cualquier otro ADN, tal como intrones, necesarios para la expresión de la secuencia de ácido nucleico seleccionada, todos operativamente unidos a la secuencia seleccionada, y puede incluir una secuencia de potenciador.
Un gen “implicado” en una enfermedad o trastorno incluye un gen, cuya expresión o función normal o aberrante produce o provoca la enfermedad o trastorno o al menos un síntoma de dicha enfermedad o trastorno.
El término “mutación de ganancia de función” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier mutación en un gen en la que la proteína codificada por dicho gene (es decir, la proteína mutante) adquiere una función no asociada normalmente con la proteína (es decir, la proteína silvestre) que provoca o contribuye a una enfermedad o trastorno. La mutación de ganancia de función puede ser una deleción, adición o sustitución de un nucleótido o nucleótidos en el gen que da lugar al cambio en la función de la proteína codificada. En una realización, la mutación de ganancia de función cambia la función de la proteína mutante (por ejemplo, provoca la producción de una o más proteínas sFLT1) o provoca interacciones con otras proteínas. En otra realización, la mutación de ganancia de función provoca una disminución o eliminación de la proteína silvestre normal, por ejemplo, mediante interacción de la proteína mutante alterada con dicha proteína silvestre normal.
Tal como se usa en el presente documento, el término “gen diana” es un gen cuya expresión tiene que inhibirse o “silenciarse” sustancialmente. Este silenciamiento puede lograrse mediante silenciamiento de ARN, por ejemplo, mediante escisión del ARNm del gen diana o represión de la traducción del gen diana. El término “gen no diana” es un gen cuya expresión no tiene que silenciarse sustancialmente. En una realización, las secuencias de polinucleótido del gen diana y no diana (por ejemplo, ARNm codificado por los genes diana (sFLT1) y no diana (flFLT1)) pueden diferir en uno o más nucleótidos, por ejemplo, en una región intrónica. En otra realización, los genes diana y no diana pueden diferir en uno o más polimorfismos (por ejemplo, polimorfismos de un solo nucleótido o SNP). En otra realización, los genes diana y no diana pueden compartir menos del 100% de identidad de secuencia. En otra realización, el gen no diana puede ser un homólogo (por ejemplo, un ortólogo o parálogo) del gen diana.
Un “alelo diana” es un alelo (por ejemplo, un alelo de SNP) cuya expresión tiene que inhibirse o “silenciarse” selectivamente. Este silenciamiento puede lograrse mediante silenciamiento de ARN, por ejemplo, mediante escisión del ARNm del gen diana o alelo diana mediante un ARNip. El término “alelo no diana” es un alelo cuya expresión no tiene que silenciarse sustancialmente. En determinadas realizaciones, los alelos diana y no diana pueden corresponder al mismo gen diana. En otras realizaciones, el alelo diana corresponde a, o está asociado con, un gen diana, y el alelo no diana corresponde a, o está asociado con, un gen no diana. En una realización, las secuencias de polinucleótido de los alelos diana y no diana pueden diferir en uno o más nucleótidos. En otra realización, los alelos diana y no diana pueden diferir en uno o más polimorfismos alélicos (por ejemplo, uno o más SNP). En otra realización, los alelos diana y no diana pueden compartir menos del 100% de identidad de secuencia.
El término “polimorfismo” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una variación (por ejemplo, una o más deleciones, inserciones o sustituciones) en una secuencia génica que se identifica o detecta cuando se compara la misma secuencia génica de diferentes fuentes o sujetos (pero del mismo organismo). Por ejemplo, puede identificarse un polimorfismo cuando se compara la misma secuencia génica de diferentes sujetos. La identificación de tales polimorfismos es rutinaria en la técnica, siendo las metodologías similares a las usadas para detectar, por ejemplo, mutaciones puntuales de cáncer de mama. La identificación puede realizarse, por ejemplo, a partir de ADN extraído a partir de linfocitos de un sujeto, seguido por amplificación de regiones polimórficas usando cebadores específicos para dicha región polimórfica. Alternativamente, el polimorfismo puede identificarse cuando se comparan dos alelos del mismo gen. En realizaciones particulares, el polimorfismo es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).
Una variación en la secuencia entre dos alelos del mismo gen dentro de un organismo se denomina en el presente documento “polimorfismo alélico”. En determinadas realizaciones, el polimorfismo alélico corresponde a un alelo de SNP. Por ejemplo, el polimorfismo alélico puede comprender una variación de un solo nucleótido entre los dos alelos de un SNP. El polimorfismo puede estar en un nucleótido dentro de una región codificante pero, debido a la redundancia del código genético, no se codifica ningún cambio en la secuencia de aminoácidos. Alternativamente, las secuencias polimórficas pueden codificar para un aminoácido diferente en una posición particular, pero el cambio en el aminoácido no afecta a la función de la proteína. También pueden encontrarse regiones polimórficas en regiones no codificantes del gen. En realizaciones a modo de ejemplo, el polimorfismo se encuentra en una región codificante del gen o en una región no traducida (por ejemplo, una 5'-UTR o 3'-UTR) del gen.
Tal como se usa en el presente documento, el término “frecuencia alélica” es una medida (por ejemplo, proporción o porcentaje) de la frecuencia relativa de un alelo (por ejemplo, un alelo de SNP) en un único locus en una población de individuos. Por ejemplo, cuando una población de individuos porta n loci de un locus cromosómico particular (y el gen que ocupa el locus) en cada una de sus células somáticas, entonces la frecuencia alélica de un alelo es la fracción o porcentaje de loci que ocupa el alelo dentro de la población. En realizaciones particulares, la frecuencia alélica de un alelo (por ejemplo, un alelo de SNP) es de al menos el 10% (por ejemplo, al menos el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40% o más) en una población de muestra.
Tal como se usa en el presente documento, el término “población de muestra” se refiere a una población de individuos que comprende un número estadísticamente significativo de individuos. Por ejemplo, la población de muestra puede comprender 50, 75, 100, 200, 500, 1000 o más individuos. En realizaciones particulares, la población de muestra puede comprender individuos que comparten al menos un fenotipo de enfermedad común (por ejemplo, un trastorno de ganancia de función) o mutación (por ejemplo, una mutación de ganancia de función).
Tal como se usa en el presente documento, el término “heterocigosis” se refiere a la fracción de individuos dentro de una población que son heterocigóticos (por ejemplo, contienen dos o más alelos diferentes) en un locus particular (por ejemplo, en un SNP). La heterocigosis puede calcularse para una población de muestra usando métodos que conocen bien los expertos en la técnica.
La expresión “examinar la función de un gen en una célula o un organismo” se refiere a examinar o estudiar la expresión, actividad, función o fenotipo que surge a partir del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “agente de silenciamiento de ARN” se refiere a un ARN que puede inhibir o “silenciar” la expresión de un gen diana. En determinadas realizaciones, el agente de silenciamiento de ARN puede prevenir el procesamiento completo (por ejemplo, la traducción y/o expresión completa) de una molécula de ARNm mediante un mecanismo de silenciamiento tras la transcripción. Los agentes de silenciamiento de ARN incluyen moléculas de ARN no codificantes pequeñas (< 50 p.b.), por ejemplo dúplex de ARN que comprenden cadenas emparejadas, así como ARN precursores a partir de los cuales pueden generarse tales ARN no codificantes. Los agentes de silenciamiento de ARN a modo de ejemplo incluyen ARNip, miARN, dúplex de tipo ARNip y oligonucleótidos de función doble así como precursores de los mismos. En una realización, el agente de silenciamiento de ARN puede inducir interferencia de ARN. En otra realización, el agente de silenciamiento de ARN puede mediar en la represión de la traducción.
Tal como se usa en el presente documento, el término “nucleótido poco frecuente” se refiere a un nucleótido que se produce de manera natural que se produce de manera infrecuente, incluyendo desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que se producen de manera natural que se producen de manera infrecuente, por ejemplo, un ribonucleótido que se produce de manera natural que no es guanosina, adenosina, citosina o uridina. Los ejemplos de nucleótidos poco frecuentes incluyen, pero no se limitan a, inosina, 1-metil-inosina, pseudouridina, 5,6-dihidrouridina, ribotimidina, 2N-metilguanosina y 22N,N-dimetilguanosina.
El término “modificado por ingeniería”, como en un precursor de ARN modificado por ingeniería, o una molécula de ácido nucleico modificada por ingeniería, indica que el precursor o la molécula no se encuentra en la naturaleza, dado que la totalidad o una porción de la secuencia de ácido nucleico del precursor o la molécula se crea o selecciona por un ser humano. Una vez creada o seleccionada, la secuencia puede replicarse, traducirse, transcribirse o procesarse de otro modo mediante mecanismos dentro de una célula. Por tanto, un precursor de ARN producido dentro de una célula a partir de un transgén que incluye una molécula de ácido nucleico modificada por ingeniería es un precursor de ARN modificado por ingeniería.
Tal como se usa en el presente documento, el término “microARN” (“miARN”), también denominado en la técnica “ARN temporales pequeños” (“ARNtp”), se refiere a un ARN pequeño (10-50 nucleótidos) que se codifica genéticamente (por ejemplo, por genomas de virus, mamíferos o plantas) y que puede dirigir o mediar en el silenciamiento de ARN. Un “trastorno de miARN” se refiere a una enfermedad o trastorno caracterizado por una expresión o actividad aberrante de un miARN.
Tal como se usa en el presente documento, el término “oligonucleótido de función doble” se refiere a un agente de silenciamiento de ARN que tiene la fórmula T-L-|j, en la que T es un resto de selección como diana de ARNm, L es un resto de unión y j es un resto de reclutamiento de miARN. Tal como se usa en el presente documento, los términos “resto de selección como diana de ARNm”, “resto de selección como diana”, “porción de selección como diana de ARNm” o “porción de selección como diana” se refieren a un dominio, porción o región del oligonucleótido de función doble que tiene un tamaño suficiente y complementariedad suficiente con respecto a una porción o región de un ARNm elegido o seleccionado como diana para el silenciamiento (es decir, el resto tiene una secuencia suficiente como para capturar el ARNm diana). Tal como se usa en el presente documento, el término “resto de unión” o “porción de unión” se refiere a un dominio, porción o región del agente de silenciamiento de ARN que se une o acopla de manera covalente al ARNm.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena antisentido” de un agente de silenciamiento de ARN, por ejemplo, un agente de silenciamiento de ARN o ARNip, se refiere a una cadena que es sustancialmente complementaria a una sección de aproximadamente 10-50 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 15-30, 16­ 25, 18-23 o 19-22 nucleótidos del ARNm del gen seleccionado como diana para el silenciamiento. La cadena antisentido o primera cadena tiene una secuencia suficientemente complementaria a la secuencia de ARNm diana deseado como para dirigir el silenciamiento específico de diana, por ejemplo, complementariedad suficiente como para activar la destrucción del ARNm diana deseado mediante la maquinaria o proceso de iARN (interferencia de iARN) o complementariedad suficiente como para activar la represión de la traducción del ARNm diana deseado. El término “cadena sentido” o “segunda cadena” de un agente de silenciamiento de ARN, por ejemplo, un agente de silenciamiento de ARN o ARNip, se refiere a una cadena que es complementaria a la cadena antisentido o primera cadena. Las cadenas antisentido y sentido también pueden denominarse cadenas primera o segunda, teniendo la cadena primera o segunda complementariedad con respecto a la secuencia diana y teniendo la cadena segunda o primera respectiva complementariedad con respecto a dicha cadena primera o segunda. Los productos intermedios de dúplex de miARN o dúplex de tipo ARNip incluyen una cadena de miARN que tiene complementariedad suficiente con respecto a una sección de aproximadamente 10-50 nucleótidos del ARNm del gen seleccionado como diana para el silenciamiento y una cadena de miARN que tiene complementariedad suficiente para formar un dúplex con la cadena de miARN.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena guía” se refiere a una cadena de un agente de silenciamiento de ARN, por ejemplo, una cadena antisentido de un dúplex de ARNip o secuencia de ARNip, que entra en el complejo de RISC y dirige la escisión del ARNm diana.
Tal como se usa en el presente documento, el término “asimetría”, tal como en la asimetría de la región de dúplex de un agente de silenciamiento de ARN (por ejemplo, el tallo de un ARNhc), se refiere a una desigualdad de fuerza de enlace o fuerza de formación de pares de bases entre los extremos terminales del agente de silenciamiento de ARN (por ejemplo, entre nucleótidos terminales en una primera cadena o porción de tallo y nucleótidos terminales en una segunda cadena o porción de tallo opuesta), de tal manera que el extremo 5' de una cadena del dúplex está de manera más frecuente en un estado no emparejado transitorio, por ejemplo, monocatenario, que el extremo 5' de la cadena complementaria. Esta diferencia estructural determina que una cadena del dúplex se incorpora preferiblemente en un complejo de RISC. La cadena cuyo extremo 5' está emparejado de manera menos estrecha a la cadena complementaria se incorporará preferiblemente en el RISC y mediará en iARN.
Tal como se usa en el presente documento, el término “fuerza de enlace” o “fuerza de pares de bases” se refiere a la fuerza de la interacción entre pares de nucleótidos (o análogos de nucleótido) en cadenas opuestas de un dúplex de oligonucleótidos (por ejemplo, un dúplex de ARNip), debido principalmente a enlaces de H, interacciones de van der Waals y similares entre dichos nucleótidos (o análogos de nucleótido).
Tal como se usa en el presente documento, el “extremo 5'”, tal como en el extremo 5' de una cadena antisentido, se refiere a los nucleótidos terminales en 5', por ejemplo, entre uno y aproximadamente 5 nucleótidos en el extremo terminal 5' de la cadena antisentido. Tal como se usa en el presente documento, el “extremo 3'”, tal como en el extremo 3' de una cadena sentido, se refiere a la región, por ejemplo, una región de entre uno y aproximadamente 5 nucleótidos, que es complementaria a los nucleótidos del extremo 5' de la cadena antisentido complementaria. Tal como se usa en el presente documento, el término “nucleótido desestabilizante” se refiere a un primer nucleótido o análogo de nucleótido que puede formar un par de bases con segundo nucleótido o análogo de nucleótido de tal manera que el par de bases tiene una fuerza de enlace inferior a un par de bases convencional (es decir, par de bases de Watson-Crick). En determinadas realizaciones, el nucleótido desestabilizante puede formar un par de bases con apareamiento erróneo con el segundo nucleótido. En otras realizaciones, el nucleótido desestabilizante puede formar un par de bases oscilante con el segundo nucleótido. En aún otras realizaciones, el nucleótido desestabilizante puede formar un par de bases ambiguo con el segundo nucleótido.
Tal como se usa en el presente documento, el término “par de bases” se refiere a la interacción entre pares de nucleótidos (o análogos de nucleótido) en cadenas opuestas de un dúplex de oligonucleótidos (por ejemplo, un dúplex formado por una cadena de un agente de silenciamiento de ARN y una secuencia de ARNm diana), debido principalmente a enlaces de H, interacciones de van der Waals y similares entre dichos nucleótidos (o análogos de nucleótido). Tal como se usa en el presente documento, el término “fuerza de enlace” o “fuerza de par de bases” se refiere a la fuerza del par de bases.
Tal como se usa en el presente documento, el término “par de bases con apareamiento erróneo” se refiere a un par de bases que consiste en pares de bases no complementarios o no de Watson-Crick, por ejemplo, no pares de bases G:C, A:T o A:U complementarios normales. Tal como se usa en el presente documento, el término “par de bases ambiguo” (también conocido como par de bases no discriminante) se refiere a un par de bases formado por un nucleótido universal.
Tal como se usa en el presente documento, el término “nucleótido universal” (también conocido como “nucleótido neutro”) incluye aquellos nucleótidos (por ejemplo, determinados nucleótidos desestabilizantes) que tienen una base (una “base universal” o “base neutra”) que no distingue significativamente entre bases en un polinucleótido complementario cuando se forma un par de bases. Los nucleótidos universales son de manera predominante moléculas hidrófobas que pueden empaquetarse de manera eficaz para dar ácidos nucleicos en dúplex antiparalelos (por ejemplo, ADN o ARN bicatenario) debido a interacciones de apilamiento. Las porciones de bases de nucleótidos universales comprenden normalmente un resto heterocíclico aromático que contiene nitrógeno.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “complementariedad suficiente” o “grado suficiente de complementariedad” significan que el agente de silenciamiento de ARN tiene una secuencia (por ejemplo, en la cadena antisentido, resto de selección como diana de ARNm o resto de reclutamiento de miARN) que es suficiente para unirse al ARN diana deseado, respectivamente, y para activar el silenciamiento de ARN del ARNm diana. Tal como se usa en el presente documento, el término “represión de la traducción” se refiere a una inhibición selectiva de la traducción de ARNm. La represión de la traducción natural avanza mediante miARN escindidos a partir de precursores de ARNhc. Tanto la iARN como la represión de la traducción están mediadas por RISC. Tanto la iARN como la represión de la traducción se producen de manera natural o pueden iniciarse artificialmente, por ejemplo, para silenciar la expresión de genes diana.
Diversas metodologías de la presente invención incluyen una etapa que implica comparar un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., con un “control adecuado”, denominado de manera intercambiable en el presente documento “control apropiado”. Un “control adecuado” o “control apropiado” es cualquier control o patrón con el que está familiarizado un experto habitual en la técnica útil para fines de comparación. En una realización, un “control adecuado” o “control apropiado” es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., determinado antes de realizar una metodología de iARN, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una tasa de transcripción, nivel de ARNm, tasa de traducción, nivel de proteína, actividad biológica, característica o propiedad celular, genotipo, fenotipo, etc., puede determinarse antes de introducir un agente de silenciamiento de Ar N de la invención en una célula o un organismo. En otra realización, un “control adecuado” o “control apropiado” es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., determinado en una célula o un organismo, por ejemplo, una célula u organismo de control o normal, que muestra, por ejemplo, rasgos normales. En aún otra realización, un “control adecuado” o “control apropiado” es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., predefinido.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, primará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplo sólo son ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.
Los agentes de silenciamiento de ARN de la invención están diseñados para seleccionar como diana regiones intrónicas en moléculas de ARNm que codifican para una o más proteínas sFLT1.
La presente invención selecciona como diana uno o más ARNm de sFLT1 y sus proteínas correspondientes. Una cadena de ARN bicatenario (ARNip) complementa a una secuencia diana dentro del ARNm de sFLT1. Tras la introducción de ARNip en un sujeto o célula, el ARNip se desenrolla parcialmente, se une a una región diana intrónica dentro del ARNm de sFLT1 de una manera específica del sitio y activa una ARNm nucleasa. Esta nucleasa escinde el ARNm de sFLT1, deteniendo de ese modo la traducción de la proteína sFLT1. Las células se desprenden del ARNm parcialmente digerido, excluyendo por tanto la traducción, o las células digieren proteínas parcialmente traducidas. En determinadas realizaciones, se reduce la expresión de la proteína sFLT1 en un sujeto o célula en aproximadamente del 30% al 50%, o en aproximadamente del 30% al 40%.
En el presente documento también se describen agentes de silenciamiento de ARN que pueden seleccionar como diana una o más de las secuencias diana indicadas en la figura 13. En determinados ejemplos, los agentes de silenciamiento de ARN pueden seleccionar como diana una o más de las secuencias diana en una o más secuencias diana indicadas en posiciones de gen seleccionadas del grupo que consiste en 2247, 2252, 2253, 2256, 2279, 2280, 2283, 2284, 2286, 2293, 2294, 2295, 2304, 2313, 2318, 2321, 2322, 2324, 2326, 2332, 2333, 2339, 2343, 2351, 2353, 2362, 2471, 2474, 2477, 2508, 2510, 2513, 2518, 2519, 2525, 2528, 2556, 2561, 2572, 2574, 2576, 2577, 2580, 2582, 2585, 2588 y 2590 del gen fltl humano (tal como se expone en la figura 13 y en la siguiente tabla). Pueden encontrarse secuencias diana particularmente a modo de ejemplo del gen flt1 humano en las posiciones 2283 (5' CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3' (SEQ ID NO: 1)), 2519 (5' CATCATAGCTACCATTTATT 3' (SEQ ID NO: 2)), 2318 (5' ATTGTACCACACAAAGTAAT 3' (SEQ ID NO: 3)) y 2585 (5' GAGCCAAGACAATCATAACA 3' (SEQ ID NO: 4)). (Véanse las figuras 6 y 13). La secuencia genómica para cada secuencia diana puede encontrarse, por ejemplo, en la base de datos disponible para el público mantenida por el NCBI.
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Tabla 1. Coincidencias seleccionadas como diana con eficacia para las isotermas sFLT-i13 corta, sFLT1-i13 larga y sFLT1-i15a.
En las siguientes subsecciones se describen con más detalle diversos aspectos.
I. Diseño de ARNip
En algunos ejemplos, se diseñan ARNip de la siguiente manera. En primer lugar, se selecciona una porción del gen diana (por ejemplo, el gen fltl), por ejemplo, una o más de las secuencias diana expuestas en la figura 6, por ejemplo, una o cualquier combinación de sFLT1-i13-2283, sFlt1-i15a-2519, sFLT1-i13-2318, sFlt1-i15a-2585 de una región intrónica de un gen diana.
La escisión de ARNm en estos sitios debe eliminar la traducción de proteína soluble correspondiente. Se diseñaron cadenas sentido basándose en la secuencia diana. (Véase la figura 13). Preferiblemente, la porción (y cadena sentido correspondiente) incluye aproximadamente de 30 a 35 nucleótidos, por ejemplo, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 nucleótidos. Más preferiblemente, la porción (y cadena sentido correspondiente) incluye 21, 22 o 23 nucleótidos. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará que ARNip que tienen una longitud de menos de 19 nucleótidos o más de 25 nucleótidos también pueden funcionar para mediar en iARN. Por consiguiente, los ARNip de tal longitud también están dentro del alcance de la presente invención siempre que conserven la capacidad para mediar en iARN. Se ha demostrado que agentes de iARN más largos provocan una respuesta de interferón o PKR en determinadas células de mamífero que puede no ser deseable. Preferiblemente, los agentes de iARN de la invención no provocan una respuesta de PKR (es decir, tienen una longitud suficientemente corta). Sin embargo, agentes de iARN más largos pueden ser útiles, por ejemplo, en tipos de células que no pueden generar una respuesta de PRK o en situaciones en las que la respuesta de PKR se ha regulado por disminución o se ha atenuado mediante medios alternativos.
La secuencia de cadena sentido está diseñada de tal manera que la secuencia diana está esencialmente en el centro de la cadena. Mover la secuencia diana a una posición descentrada puede, en algunos casos, reducir la eficacia de la escisión mediante el ARNip. Tales composiciones, es decir, composiciones menos eficaces, pueden ser deseables para su uso si se detecta silenciamiento inespecífico del ARNm silvestre.
La cadena antisentido tiene de manera rutinaria la misma longitud que la cadena sentido e incluye nucleótidos complementarios. En una realización, las cadenas son completamente complementarias, es decir, las cadenas tienen extremos romos cuando se alinean o aparean. En otra realización, las cadenas comprenden alinear o aparear de tal manera que se generan proyecciones de 1, 2 o 3 nucleótidos, es decir, el extremo 3' de la cadena sentido se extiende 1, 2 o 3 nucleótidos más que el extremo 5' de la cadena antisentido y/o el extremo 3' de la cadena antisentido se extiende 1, 2 o 3 nucleótidos más que el extremo 5' de la cadena sentido. Las proyecciones pueden comprender (o consistir en) nucleótidos correspondientes a la secuencia génica diana (o complemento de la misma). Alternativamente, las proyecciones pueden comprender (o consistir en) desoxirribonucleótidos, por ejemplo dT, o análogos de nucleótido, u otro material distinto de nucleótido adecuado.
Para facilitar la entrada de la cadena antisentido en RISC (y por tanto aumentar o mejorar la eficacia de escisión y silenciamiento de diana), puede alterarse la fuerza de par de bases entre el extremo 5' de la cadena sentido y extremo 3' de la cadena antisentido, por ejemplo, disminuirse o reducirse, tal como se describe en detalle en las patentes estadounidenses n.os 7.459.547, 7.772.203 y 7.732.593, titulada “Methods and Compositions for Controlling Efficacy of RNA Silencing” (presentada el 2 de junio de 2003) y las patentes estadounidenses n.os 8.309.704, 7.750.144, 8.304.530, 8.329.892 y 8.309.705, titulada “Methods and Compositions for Enhancing the Efficacy and Specificity of RNAi” (presentada el 2 de junio de 2003). En una realización de estos aspectos de la invención, la fuerza de par de bases es menor debido a menos pares de bases de G:C entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o cadena sentido que entre el extremo 3' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 5' de la segunda cadena o cadena sentido. En otra realización, la fuerza de par de bases es menor debido a al menos un par de bases con apareamiento erróneo entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o cadena sentido. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, el par de bases con apareamiento erróneo se selecciona del grupo que consiste en G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C y U:U. En otra realización, la fuerza de par de bases es menor debido a al menos un par de bases oscilante, por ejemplo, G:U, entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la segunda cadena o cadena sentido. En otra realización, la fuerza de par de bases es menor debido a al menos un par de bases que comprende un nucleótido poco frecuente, por ejemplo, inosina (I). En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, el par de bases se selecciona del grupo que consiste en I:A, I:U e I:C. En aún otra realización, la fuerza de par de bases es menor debido a al menos un par de bases que comprende un nucleótido modificado. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2-amino-G, 2-amino-A, 2,6-diamino-G y 2,6-diamino-A.
El diseño de ARNip adecuados para seleccionar como diana las secuencias diana de sFlt1 expuestas en la figura 6 se describe en detalle a continuación. Pueden diseñarse ARNip según las enseñanzas a modo de ejemplo anteriores para cualquier otra secuencia diana encontrada en el gen fltl. Además, la tecnología es aplicable a la selección como diana de cualquier otra secuencia diana, por ejemplo, secuencias diana que no provocan enfermedad.
Para validar la eficacia mediante la cual los ARNip destruyen los ARNm (por ejemplo, ARNm de sFLT1), puede incubarse el ARNip con ADNc (por ejemplo, ADNc de Flt1) en un sistema de expresión de ARNm in vitro basado en Drosophila. Los ARNm (por ejemplo, ARNm de Flt1) recién sintetizados, radiomarcados con 32P, se detectan mediante autorradiografía en un gel de agarosa. La presencia de ARNm escindido indica la actividad de ARNm nucleasa. Los controles adecuados incluyen omisión de ARNip. Alternativamente, se seleccionan ARNip de control que tienen la misma composición de nucleótidos que el ARNip seleccionado, pero sin complementariedad de secuencia significativa con respecto al gen diana apropiado. Tales controles negativos pueden diseñarse reorganizando al azar la secuencia de nucleótidos del ARNip seleccionado; puede realizarse una búsqueda de homología para garantizar que el control negativo carece de homología con respecto a cualquier otro gen en el genoma apropiado. Además, pueden diseñarse ARNip de control negativo introduciendo uno o más apareamientos erróneos de bases en la secuencia.
Se seleccionan sitios de complementación de ARNip-ARNm que dan como resultado una especificidad de ARNm óptima y una escisión de ARNm máxima.
II. Agentes de iARN
La presente invención incluye moléculas de ARNip diseñadas, por ejemplo, tal como se describió anteriormente. Las moléculas de ARNip de la invención pueden sintetizarse químicamente o pueden transcribirse in vitro a partir de un molde de ADN o in vivo a partir, por ejemplo, de ARNhc, o usando enzima DICER humana recombinante, para escindir moldes de ARNbc transcritos in vitro para dar combinaciones de ARN en dúplex de 20, 21 o 23 pb que median en iARN. Las moléculas de ARNip pueden diseñarse usando cualquier método conocido en la técnica.
En el presente documento también se describe, en vez de ser el agente de iARN un ácido ribonucleico interferente, por ejemplo, un ARNip o ARNhc tal como se describió anteriormente, que el agente de iARN puede codificar para un ácido ribonucleico interferente, por ejemplo, un ARNhc, tal como se describió anteriormente. Dicho de otro modo, el agente de iARN puede ser un molde transcripcional del ácido ribonucleico interferente. Por tanto, los agentes de iARN tal como se describe en el presente documento también pueden incluir ARN de horquilla cortos (ARNhc) y constructos de expresión modificados por ingeniería para expresar ARNhc. La transcripción de ARNhc se inicia en un promotor de polimerasa III (pol III) y se piensa que se termina en la posición 2 de un sitio de terminación de la transcripción de 4-5 timinas. Tras la expresión, se piensa que los ARNhc se pliegan para dar una estructura de tallobucle con proyecciones de UU en 3'; posteriormente, se procesan los extremos de estos ARNhc, convirtiendo los ARNhc en moléculas de tipo ARNip de aproximadamente 21-23 nucleótidos (Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002, citado anteriormente; Miyagishi et al., 2002; Paddison et al., 2002, citado anteriormente; Paul et al., 2002, citado anteriormente; Sui et al., 2002 citado anteriormente; Yu et al., 2002, citado anteriormente. Puede encontrarse más información sobre el diseño de ARNhc y su uso en Internet en las siguientes direcciones: katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf y katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR_strategy1.pdf).
Los constructos de expresión tal como se describe en el presente documento incluyen cualquier constructo adecuado para su uso en el sistema de expresión apropiado e incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, casetes de expresión lineales, plásmidos y vectores virales o derivados de virus, tal como se conoce en la técnica. Tales constructos de expresión pueden incluir uno o más promotores inducibles, sistemas de promotor de ARN Pol III tales como promotores de ARNnp de U6 o promotores de HI ARN polimerasa III, u otros promotores conocidos en la técnica. Los constructos pueden incluir una o ambas cadenas del ARNip. Los constructos de expresión que expresan ambas cadenas también pueden incluir estructuras de bucle que unen ambas cadenas, o cada cadena puede transcribirse por separado a partir de promotores independientes dentro del mismo constructo. Cada cadena también puede transcribirse a partir de un constructo de expresión independiente. (Tuschl, T., 2002, citado anteriormente).
Pueden suministrarse ARNip sintéticos al interior de células mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo transfección por liposoma catiónico y electroporación. Para obtener una supresión a más largo plazo de los genes diana (es decir, genes fltl) y para facilitar el suministro en determinadas circunstancias, pueden expresarse uno o más ARNip dentro de células a partir de constructos de ADN recombinante. Tales métodos para expresar dúplex de ARNip dentro de células a partir de constructos de ADN recombinante para permitir una supresión de genes diana a más largo plazo en células se conocen en la técnica, incluyendo sistemas de promotor de Pol III de mamíferos (por ejemplo, sistemas de promotor de HI o U6/ARNnp (Tuschl, T., 2002, citado anteriormente) que pueden expresar ARNip bicatenarios funcionales; (Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, citado anteriormente; Miyagishi et al., 2002, citado anteriormente; Paul et al., 2002, citado anteriormente; Yu et al., 2002; citado anteriormente; Sui et al., 2002, citado anteriormente). La terminación de la transcripción mediante ARN Pol III se produce en tramos de cuatro residuos de T consecutivos en el molde de ADN, proporcionando un mecanismo para terminar el transcrito de ARNip en una secuencia específica. El ARNip es complementario a la secuencia del gen diana en orientaciones 5'-3' y 3'-5', y las dos cadenas del ARNip pueden expresarse en el mismo constructo o en constructos independientes. Los ARNip de horquilla, impulsados por promotor de HI o U6 ARNnp y expresados en células, pueden inhibir la expresión de gen diana (Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, citado anteriormente; Miyagishi et al., 2002, citado anteriormente; Paul et al., 2002, citado anteriormente; Yu et al., 2002; citado anteriormente; Sui et al., 2002, citado anteriormente). Los constructos que contienen una secuencia de ARNip bajo el control de promotor de T7 también producen ARNip funcionales cuando se transfectan conjuntamente en las células con un vector que expresa ARN polimerasa de T7 (Jacque et al., 2002, citado anteriormente). Un único constructo puede contener múltiples secuencias que codifican para ARNip, tales como múltiples regiones del gen que codifican para sFlt1, que seleccionan como diana el mismo gen o múltiples genes, y pueden impulsarse, por ejemplo, por sitios de promotor de PolIII independientes.
Las células de animales expresan una gama de ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos denominados microARN (miARN) que pueden regular la expresión génica a nivel tras la transcripción o la traducción durante el desarrollo del animal. Una característica común de los miARN es que todos se escinden a partir de un tallo-bucle de ARN precursor de aproximadamente 70 nucleótidos, probablemente mediante una enzima Dicer, de tipo ARNasa III, o un homólogo de la misma. Sustituyendo las secuencias de tallo del precursor de miARN por una secuencia complementaria al ARNm diana, puede usarse un constructo de vector que expresa el precursor modificado por ingeniería para producir ARNip para iniciar la iARN contra dianas de ARNm específicas en células de mamífero (Zeng et al., 2002, citado anteriormente). Cuando se expresan mediante vectores de ADN que contienen promotores de polimerasa III, las horquillas diseñadas por micro-ARN pueden silenciar la expresión génica (McManus et al., 2002, citado anteriormente). Los microARN que seleccionan como diana polimorfismos también pueden ser útiles para bloquear la traducción de proteínas mutantes, en ausencia de silenciamiento génico mediado por ARNip. Tales aplicaciones pueden ser útiles en situaciones, por ejemplo, en las que un ARNip diseñado provocó silenciamiento inespecífico de proteína silvestre.
También pueden usarse mecanismos de suministro mediados por virus para inducir silenciamiento específico de genes seleccionados como diana mediante expresión de ARNip, por ejemplo, generando adenovirus recombinantes que albergan ARNip bajo el control de transcripción del promotor de ARN Pol II (Xia et al., 2002, citado anteriormente). La infección de células HeLa por estos adenovirus recombinantes permite la expresión disminuida de genes diana endógenos. La inyección de los vectores de adenovirus recombinantes en ratones transgénicos que expresan los genes diana del ARNip da como resultado la reducción in vivo de la expresión de genes diana. Id. En un modelo de animal, la electroporación de embriones completos puede suministrar de manera eficaz ARNip sintético al interior de embriones de ratón tras la implantación (Calegari et al., 2002). En ratones adultos, el suministro eficaz de ARNip puede lograrse mediante una técnica de suministro “a alta presión”, una inyección rápida (dentro del plazo de 5 segundos) de un gran volumen de disolución que contiene ARNip al interior del animal a través de la vena de la cola (Liu et al., 1999, citado anteriormente; McCaffrey et al., 2002, citado anteriormente; Lewis et al., 2002). También pueden usarse nanopartículas y liposomas para suministrar ARNip al interior de animales. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, pueden usarse virus adenoasociados recombinantes (rAAV) y sus vectores asociados para suministrar uno o más ARNip al interior de células, por ejemplo, células neuronales (por ejemplo, células cerebrales) (solicitudes de patente estadounidense 2014/0296486, 2010/0186103, 2008/0269149, 2006/0078542 y 2005/0220766).
Las composiciones de ácido nucleico de la invención incluyen tanto ARNip no modificados como ARNip modificados tal como se conoce en la técnica, tales como derivados de ARNip reticulados o derivados que tienen restos distintos de nucleótidos unidos, por ejemplo, a sus extremos 3' o 5'. Modificar derivados de ARNip de esta manera puede mejorar la captación celular o potenciar las actividades de direccionamiento celular del derivado de ARNip resultante en comparación con el ARNip correspondiente, es útil para realizar un seguimiento del derivado de ARNip en la célula o mejora la estabilidad del derivado de ARNip en comparación con el ARNip correspondiente.
Los precursores de ARN modificados por ingeniería, introducidos en células u organismos completos tal como se describe en el presente documento, conducirán a la producción de una molécula de ARNip deseada. Una molécula de ARNip de este tipo se asociará entonces con componentes de proteína endógenos de la ruta de iARN para unirse a, y seleccionar como diana, una secuencia de ARNm específica para la escisión y destrucción. De esta manera, el ARNm que va a seleccionarse como diana mediante el ARNip generado a partir del precursor de ARN modificado por ingeniería se agotará en la célula u organismo, conduciendo a una disminución de la concentración de la proteína codificada por ese ARNm en la célula u organismo. Los precursores de ARN son normalmente moléculas de ácido nucleico que codifican de manera individual para una cadena cualquiera de un ARNbc o que codifican para toda la secuencia de nucleótidos de una estructura de bucle de horquilla de ARN.
Las composiciones de ácido nucleico de la invención pueden no estar conjugadas o pueden estar conjugadas a otro resto, tal como una nanopartícula, para potenciar una propiedad de las composiciones, por ejemplo, un parámetro farmacocinético tal como absorción, eficacia, biodisponibilidad y/o semivida. La conjugación puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando los métodos de Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001) (que describe ácidos nucleicos cargados en nanopartículas de poli(cianoacrilato de alquilo) (pAcA)); Fattal et al., J. Control Release 53(1-3): 137-43 (1998) (que describe ácidos nucleicos unidos a nanopartículas); Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Sup. 4:55-8 (1994) (que describe ácidos nucleicos unidos a agentes de intercalación, grupos hidrófobos, policationes o nanopartículas de PACA); y Godard et al., Eur. J. Biochem.
232(2):404-10 (1995) (que describe ácidos nucleicos unidos a nanopartículas).
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden marcarse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las composiciones de ácido nucleico pueden marcarse con un fluoróforo, por ejemplo, Cy3, fluoresceína o rodamina. El marcaje puede llevarse a cabo usando un kit, por ejemplo, el kit de marcaje de ARNip SILENCER™ (Ambion). Adicionalmente, el ARNip también puede radiomarcarse, por ejemplo, usando 3H, 32P u otro isótopo apropiado.
Además, dado que se cree que iARN avanza a través de al menos un producto intermedio de ARN monocatenario, el experto en la técnica apreciará que también pueden diseñarse (por ejemplo, para síntesis química), generarse (por ejemplo, generarse enzimáticamente) o expresarse (por ejemplo, a partir de un vector o plásmido) ARNip-mc (por ejemplo, la cadena antisentido de un ARNip-bc) tal como se describe en el presente documento y usarse según las metodologías reivindicadas. Además, en invertebrados, la iARN puede impulsarse eficazmente mediante ARNbc largos (por ejemplo, ARNbc con una longitud de aproximadamente 100-1000 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 200-500, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 250, 300, 350, 400 o 450 nucleótidos) que actúan como efectores de iARN. (Brondani et al., Proc Natl Acad Sci USA, 4 de diciembre de 2001; 98(25):14428-33, publicación electrónica, 27 de noviembre de 2001).
III. Agentes de silenciamiento de ARN anti-sFlt1
En el presente documento se describen agentes de silenciamiento de ARN anti-sFlt1 (por ejemplo, ARNip y ARNhc), métodos de producción de dichos agentes de silenciamiento de ARN y métodos (por ejemplo, métodos de investigación y/o terapéuticos) para usar dichos agentes de silenciamiento de ARN mejorados (o porciones de los mismos) para el silenciamiento de ARN de una o más proteínas sFLT-1. Los agentes de silenciamiento de ARN comprenden una cadena antisentido (o porciones de la misma), en los que la cadena antisentido tiene complementariedad suficiente con respecto a un polimorfismo de un solo nucleótido heterocigótico como para mediar en un mecanismo de silenciamiento mediado por ARN (por ejemplo, iARN).
a) Diseño de moléculas de ARNip anti-sFItl
Una molécula de ARNip tal como se describe en el presente documento es un dúplex que consiste en una cadena sentido y cadena antisentido complementaria, teniendo la cadena antisentido complementariedad suficiente con respecto a un ARNm de sFlt1 como para mediar en iARN. Preferiblemente, la molécula de ARNip tiene una longitud de desde aproximadamente 10-50 o más nucleótidos, es decir, cada cadena comprende 10-50 nucleótidos (o análogos de nucleótido). Más preferiblemente, la molécula de ARNip tiene una longitud de desde aproximadamente 16-30, por ejemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos en cada cadena, en la que una de las cadenas es suficientemente complementaria a una región diana. Preferiblemente, las cadenas están alineadas de tal manera que hay al menos 1,2 o 3 bases en el extremo de las cadenas que no están alineadas (es decir, para las que no se produce ninguna base complementaria en la cadena opuesta) de tal manera que se produce una proyección de 1,2 o 3 residuos en uno o ambos extremos del dúplex cuando se aparean las cadenas. Preferiblemente, la molécula de ARNip tiene una longitud de desde aproximadamente 10-50 o más nucleótidos, es decir, cada cadena comprende 10-50 nucleótidos (o análogos de nucleótido). Más preferiblemente, la molécula de ARNip tiene una longitud de desde aproximadamente 16-30, por ejemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos en cada cadena, en la que una de las cadenas es sustancialmente complementaria a una secuencia diana, y la otra cadena es idéntica o sustancialmente idéntica a la primera cadena.
Generalmente, pueden diseñarse ARNip usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, usando el siguiente protocolo:
1. El ARNip debe ser específico para una secuencia diana, por ejemplo, una secuencia diana expuesta en las figuras 6 o 13. En un ejemplo, una secuencia diana se encuentra en un ARNm de Flt1 soluble, pero no en el ARNm de Flt de longitud completa. En otro ejemplo, una secuencia diana se encuentra tanto en un ARNm de Flt1 soluble como en el ARNm de Flt de longitud completa. En otro ejemplo, una secuencia diana se encuentra en el ARNm de Flt de longitud completa. La primera cadena debe ser complementaria a la secuencia diana y la otra cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena. (Véase la figura 6 para cadenas sentido y antisentido a modo de ejemplo). En un ejemplo, la secuencia diana se codifica en una región intrónica de una o más secuencias de ARNm de Flt soluble. Las secuencias diana a modo de ejemplo corresponden a una o más regiones intrónicas de un gen diana. La escisión de ARNm en estos sitios debe eliminar la traducción de proteína soluble correspondiente pero no de la proteína de longitud completa. Secuencias diana de otras regiones del gen flt también son adecuadas para su selección como diana. Una cadena sentido se diseña basándose en la secuencia diana. Además, los ARNip con un contenido inferior en G/C (35-55%) pueden ser más activos que aquellos con un contenido en G/C superior al 55%. Por tanto, en un ejemplo, se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que tienen un contenido en G/C del 35-55%.
2. Se diseña la cadena sentido del ARNip basándose en la secuencia del sitio diana seleccionado. Preferiblemente, la cadena sentido incluye aproximadamente de 19 a 25 nucleótidos, por ejemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos. Más preferiblemente, la cadena sentido incluye 21,22 o 23 nucleótidos. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará que los ARNip que tienen una longitud de menos de 19 nucleótidos o más de 25 nucleótidos también pueden funcionar para mediar en iARN. Por consiguiente, también se dan a conocer ARNip de tal longitud, siempre que conserven la capacidad de mediar en iARN. Se ha demostrado que agentes de silenciamiento de ARN más largos provocan una respuesta de interferón o proteína cinasa R (PKR) en determinadas células de mamífero que puede no ser deseable. Preferiblemente, los agentes de silenciamiento de ARN de la invención no provocan una respuesta de PKR (es decir, tienen una longitud suficientemente corta). Sin embargo, agentes de silenciamiento de ARN más largos pueden ser útiles, por ejemplo, en tipos de células que no pueden generar una respuesta de PRK o en situaciones en las que la respuesta de PKR se ha regulado por disminución o se ha atenuado mediante medios alternativos.
Las moléculas de ARNip descritas en el presente documento tienen complementariedad suficiente con respecto a la secuencia diana de tal manera que el ARNip puede mediar en iARN. En general, se prefieren ARNip que contienen secuencias de nucleótidos suficientemente idénticas a una porción de secuencia diana del gen diana para producir escisión mediada por RISC del gen diana. Por consiguiente, en un ejemplo preferido, la cadena sentido del ARNip se diseña para tener una secuencia suficientemente idéntica a una porción de la diana. Por ejemplo, la cadena sentido puede tener una identidad del 100% con respecto al sitio diana. Sin embargo, no se requiere la identidad del 100%. Se prefiere una identidad de más del 80%, por ejemplo, una identidad del 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso el 100%, entre la cadena sentido y la secuencia de ARN diana. También se describe en el presente documento la ventaja de poder tolerar determinadas variaciones de secuencia para potenciar la eficacia y especificidad de iARN. En un ejemplo, la cadena sentido tiene 4, 3, 2, 1 o 0 nucleótidos con apareamiento erróneo con una región diana, tal como una región diana que difiere en al menos un par de bases entre un alelo de flt1 soluble y uno de flt1 de longitud completa, por ejemplo, una región diana que comprende la mutación de ganancia de función, y la otra cadena es idéntica o sustancialmente idéntica a la primera cadena. Además, secuencias de ARNip con pequeñas inserciones o deleciones de 1 o 2 nucleótidos también pueden ser eficaces para mediar en iARN. Alternativamente, secuencias de ARNip con sustituciones o inserciones de análogos de nucleótido pueden ser eficaces para la inhibición.
La identidad de secuencia puede determinarse mediante algoritmos de alineación y comparación de secuencias conocidos en la técnica. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico (o de dos secuencias de aminoácidos), se alinean las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la primera secuencia o la segunda secuencia para una alineación óptima). Después se comparan los nucleótidos (o residuos de aminoácido) en posiciones de nucleótido (o aminoácido) correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = número de posiciones idénticas / número total de posiciones x 100), penalizando opcionalmente la puntuación por el número de huecos introducidos y/o la longitud de huecos introducidos.
La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. En una realización, la alineación generada a lo largo de una determinada porción de la secuencia alineada que tiene identidad suficiente pero no a lo largo de porciones que tienen un bajo grado de identidad (es decir, una alineación local). Un ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo de alineación local usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas BLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
En otra realización, la alineación se optimiza introduciendo huecos apropiados y el porcentaje de identidad se determina a lo largo de la longitud de las secuencias alineadas (es decir, una alineación con huecos). Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, puede usarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. En otra realización, se optimiza la alineación introduciendo huecos apropiados y se determina el porcentaje de identidad a lo largo de toda la longitud de las secuencias alineadas (es decir, una alineación global). Un ejemplo preferido, no limitativo, de un algoritmo matemático usado para la comparación global de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Un algoritmo de este tipo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias de GCG. Cuando se usa el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de residuos ponderados PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.
3. La cadena antisentido o guía del ARNip tiene de manera rutinaria la misma longitud que la cadena sentido e incluye nucleótidos complementarios. En una realización, las cadenas guía y sentido son completamente complementarias, es decir, las cadenas tienen extremos romos cuando se alinean o aparean. En otra realización, las cadenas del ARNip pueden emparejarse de tal manera que tienen una proyección en 3' de 1 a 4, por ejemplo, de 2, nucleótidos. Las proyecciones pueden comprender (o consistir en) nucleótidos correspondientes a la secuencia génica diana (o complemento de la misma). Alternativamente, las proyecciones pueden comprender (o consistir en) desoxirribonucleótidos, por ejemplo dT, o análogos de nucleótido, u otro material distinto de nucleótido adecuado. Por tanto, en otra realización, las moléculas de ácido nucleico pueden tener una proyección en 3' de 2 nucleótidos, tal como TT. Los nucleótidos en proyección pueden ser o bien ARN o bien ADN. Tal como se indicó anteriormente, es deseable elegir una región diana en la que el apareamiento erróneo de mutante:silvestre es un apareamiento erróneo de purina:purina.
4. Usando cualquier método conocido en la técnica, se comparan las posibles dianas con la base de datos de genoma apropiada (humano, de ratón, de rata, etc.) y se elimina de la consideración cualquier secuencia diana con homología significativa a otras secuencias codificantes. Un método de este tipo para tales búsquedas de homología de secuencias se conoce como BLAST, que está disponible en el sitio web del Centro nacional para información biotecnológica.
5. Se seleccionan una o más secuencias que cumplen los criterios para la evaluación.
Puede encontrarse información general adicional sobre el diseño y uso de ARNip en “The siRNA User Guide”, disponible en el sitio web de The Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemie.
Alternativamente, el ARNip puede definirse funcionalmente como una secuencia de nucleótidos (o secuencia de oligonucleótidos) que puede hibridarse con la secuencia diana (por ejemplo, NaCl 400 mM, PIPES 40 mM, pH 6,4, EDTA 1 mM, hibridación a 50°C o 70°C durante 12-16 horas; seguido de lavado). Las condiciones de hibridación preferidas adicionales incluyen hibridación a 70°C en 1xSSC o 50°C en 1xSSC, formamida al 50% seguido de lavado a 70°C en 0,3xSSC o hibridación a 70°C en 4xSSC o 50°C en 4xSSC, formamida al 50% seguido de lavado a 67°C en 1xSSC. La temperatura de hibridación para híbridos que se prevé que tienen una longitud de menos de 50 pares de bases debe ser 5-10°C menor que la temperatura de fusión (Tf) del híbrido, en la que Tf se determina según las siguientes ecuaciones. Para híbridos con una longitud de menos de 18 pares de bases, Tf(°C)=2(n.° de bases de A+T)+4(n.° de bases de G+C). Para híbridos con una longitud de entre 18 y 49 pares de bases, Tf(°C)=81,5+16,6(log 10[Na+])+0,41(% de G+C)-(600/N), en la que N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones sodio en el tampón de hibridación ([Na+] para 1xSSC=0,165 M). En Sambrook, J., E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4 se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para hibridación de polinucleótidos.
Los ARNip de control negativo deben tener la misma composición de nucleótidos que el ARNip seleccionado, pero sin complementariedad de secuencia significativa con respecto al genoma apropiado. Tales controles negativos pueden diseñarse reorganizando al azar la secuencia de nucleótidos del ARNip seleccionado. Puede realizarse una búsqueda de homología para garantizar que el control negativo carece de homología con respecto a cualquier otro gen en el genoma apropiado. Además, pueden diseñarse ARNip de control negativo introduciendo uno o más apareamientos erróneos de bases en la secuencia.
6. Para validar la eficacia mediante la cual los ARNip destruyen los ARNm diana (por ejemplo, ARNm de sFlt1 correspondiente a FLT1 soluble), puede incubarse el ARNip con ADNc diana (por ejemplo, ADNc de flt1) en un sistema de expresión de ARNm in vitro basado en Drosophila. Los ARNm (por ejemplo, ARNm de sFlt1) recién sintetizados, radiomarcados con 32P, se detectan mediante autorradiografía en un gel de agarosa. La presencia de ARNm diana escindido indica actividad nucleasa del ARNm. Los controles adecuados incluyen omisión de ARNip y uso de ADNc no diana. Alternativamente, se seleccionan ARNip de control que tienen la misma composición de nucleótidos que el ARNip seleccionado, pero sin complementariedad de secuencia significativa con respecto al gen diana apropiado. Tales controles negativos pueden diseñarse reorganizando al azar la secuencia de nucleótidos del ARNip seleccionado. Puede realizarse una búsqueda de homología para garantizar que el control negativo carece de homología con respecto a cualquier otro gen en el genoma apropiado. Además, pueden diseñarse ARNip de control negativo introduciendo uno o más apareamientos erróneos de bases en la secuencia.
Pueden diseñarse ARNip anti-sflt1 para seleccionar como diana cualquiera de las secuencias diana descritas anteriormente. Dichos ARNip comprenden una cadena antisentido que es lo suficientemente complementaria a la secuencia diana como para mediar en el silenciamiento de la secuencia diana. En determinadas realizaciones, el agente de silenciamiento de ARN es un ARNip.
En determinados ejemplos, el ARNip comprende una cadena sentido que comprende una secuencia expuesta en la figura 6 y una cadena antisentido que comprende una secuencia expuesta en la figura 6.
Se seleccionan sitios de complementación de ARNip-ARNm que dan como resultado una especificidad de ARNm óptima y una escisión de ARNm máxima.
b) Moléculas de tipo ARNip
Las moléculas de tipo ARNip tal como se describen en el presente documento tienen una secuencia (es decir, tienen una cadena que tiene una secuencia) que es “suficientemente complementaria” a una secuencia diana de un ARNm de sflt1 como para dirigir el silenciamiento génico o bien mediante iARN o bien mediante represión de la traducción. Las moléculas de tipo ARNip se diseñan de la misma manera que las moléculas de ARNip, pero el grado de identidad de secuencia entre la cadena sentido y el ARN diana se aproxima al observado entre un miARN y su diana. En general, a medida que disminuye el grado de identidad de secuencia entre una secuencia de miARN y la secuencia génica diana correspondiente, aumenta la tendencia a mediar en el silenciamiento génico tras la transcripción mediante represión de la traducción en vez de iARN. Por tanto, en un ejemplo alternativo, cuando se desea silenciamiento génico tras la transcripción mediante represión de la traducción del gen diana, la secuencia de miARN tiene complementariedad parcial con respecto a la secuencia génica diana. En determinados ejemplos, la secuencia de miARN tiene complementariedad parcial con respecto a una o más secuencias cortas (sitios de complementariedad) dispersadas dentro del ARNm diana (por ejemplo, dentro de la 3'-UTR del ARNm diana) (Hutvagner y Zamore, Science, 2002; Zeng et al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al., ARN, 2003; Doench et al., Genes & Dev., 2003). Dado que el mecanismo de represión de la traducción es cooperativo, en determinadas realizaciones pueden seleccionarse como diana múltiples sitios de complementariedad (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6).
La capacidad de un dúplex de tipo ARNip para mediar en iARN o en la represión de la traducción puede predecirse mediante la distribución de nucleótidos no idénticos entre la secuencia génica diana y la secuencia de nucleótidos del agente de silenciamiento en el sitio de complementariedad. En un ejemplo, cuando se desea silenciamiento génico mediante represión de la traducción, al menos un nucleótido no idéntico está presente en la porción central del sitio de complementariedad de modo que el dúplex formado por la cadena guía de miARN y el ARNm diana contiene una “protuberancia” central (Doench J G et al., Genes & Dev., 2003). En otro ejemplo se introducen 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos no idénticos contiguos o no contiguos. El nucleótido no idéntico puede seleccionarse de tal manera que forma un par de bases oscilante (por ejemplo, G:U) o un par de bases con apareamiento erróneo (G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C, U:U). En un ejemplo preferido adicional, la “protuberancia” está centrada en las posiciones de nucleótido 12 y 13 desde el extremo 5' de la molécula de miARN.
c) Moléculas de ARN de horquilla corto (ARNhc)
En determinadas realizaciones presentadas, la presente invención proporciona ARNhc que pueden mediar en el silenciamiento de ARN de una secuencia diana de sFlt1 con selectividad potenciada. En contraposición a los ARNip, los ARNhc imitan a los precursores naturales de microARN (miARN) y entran en la parte superior de la ruta de silenciamiento génico. Por este motivo, se cree que los ARNhc median en el silenciamiento génico de manera más eficaz al alimentarse a través de toda la ruta de silenciamiento génico natural.
Los miARN son ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos que pueden regular la expresión génica a nivel tras la transcripción o la traducción durante el desarrollo de plantas y animales. Una característica común de los miARN es que todos ellos se escinden a partir de un tallo-bucle de ARN precursor de aproximadamente 70 nucleótidos denominado pre-miARN, probablemente mediante Dicer, una enzima de tipo ARNasa III, o un homólogo de la misma. Los precursores de miARN que se producen de manera natural (pre-miARN) tienen una única cadena que forma un tallo de dúplex que incluye dos porciones que son generalmente complementarias, y un bucle, que conecta las dos porciones del tallo. En pre-miARN típicos, el tallo incluye una o más protuberancias, por ejemplo, nucleótidos adicionales que crean un único “bucle” de nucleótidos en una porción del tallo, y/o uno o más nucleótidos no emparejados que crean un hueco en la hibridación de las dos porciones del tallo entre sí. Los ARN de horquilla cortos, o precursores de ARN modificados por ingeniería, de la invención son constructos artificiales basados en estos pre-miARN que se producen de manera natural, pero que se modifican por ingeniería para suministrar agentes de silenciamiento de ARN deseados (por ejemplo, ARNip de la invención). Sustituyendo las secuencias de tallo del pre-miARN por secuencia complementaria al ARNm diana, se forma un ARNhc. El ARNhc se procesa por toda la ruta de silenciamiento génico de la célula, mediando de ese modo eficazmente en iARN.
Los elementos requeridos de una molécula de ARNhc incluyen una primera porción y una segunda porción, que tienen complementariedad suficiente como para aparearse e hibridarse para formar un dúplex o una porción de tallo bicatenaria. No es necesario que las dos porciones sean total o perfectamente complementarias. Las porciones de “tallo” primera y segunda están conectadas por una porción que tiene una secuencia que tiene una complementariedad de secuencia insuficiente como para aparearse o hibridarse a otras porciones del ARNhc. Esta última porción se denomina porción de “bucle” en la molécula de ARNhc. Las moléculas de ARNhc se procesan para generar los ARNip. Los ARNhc también pueden incluir una o más protuberancias, es decir, nucleótidos adicionales que crean un “bucle” de nucleótidos pequeño en una porción del tallo, por ejemplo un bucle de uno, dos o tres nucleótidos. Las porciones de tallo pueden tener la misma longitud, o una porción puede incluir una proyección de, por ejemplo, 1-5 nucleótidos. Los nucleótidos en proyección pueden incluir, por ejemplo, uracilos (U), por ejemplo, todos U. Tales U están codificados de manera notable por timidinas (T) en el a Dn que codifica para ARNhc que señalizan la terminación de la transcripción.
En los ARNhc (o ARN precursores modificados por ingeniería) de la presente invención, una porción del tallo de dúplex es una secuencia de ácido nucleico que es complementaria (o antisentido) a la secuencia diana de sFlt1. Preferiblemente, una cadena de la porción de tallo del ARNhc es lo suficientemente complementaria (por ejemplo, antisentido) a una secuencia de ARN diana (por ejemplo, ARNm) como para mediar en la degradación o escisión de dicho ARN diana mediante interferencia de ARN (iARN). Por tanto, los precursores de ARN modificados por ingeniería incluyen un tallo de dúplex con dos porciones y un bucle que conecta las dos porciones de tallo. La porción antisentido puede estar en el extremo 5' o 3' del tallo. Preferiblemente, las porciones de tallo de un ARNhc tienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, las dos porciones de tallo tienen de aproximadamente 18 o 19 a aproximadamente 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 37, 38, 39 o 40 o más nucleótidos de longitud. En realizaciones preferidas, la longitud de las porciones de tallo debe ser de 21 nucleótidos o mayor. Cuando se usan en células de mamífero, la longitud de las porciones de tallo debe ser de menos de aproximadamente 30 nucleótidos para evitar provocar respuestas inespecíficas tales como la ruta de interferón. En células distintas de mamífero, el tallo puede tener más de 30 nucleótidos de longitud. De hecho, el tallo puede incluir secciones mucho más grandes complementarias al ARNm diana (hasta, e incluyendo, todo el ARNm). De hecho, una porción de tallo puede incluir secciones mucho más grandes complementarias al ARNm diana (hasta, e incluyendo, todo el ARNm).
Las dos porciones del tallo de dúplex deben ser lo suficientemente complementarias como para hibridarse para formar el tallo de dúplex. Por tanto, las dos porciones pueden ser, pero no es necesario que sean, total o perfectamente complementarias. Además, las dos porciones de tallo pueden tener la misma longitud, o una porción puede incluir una proyección de 1, 2, 3 o 4 nucleótidos. Los nucleótidos en proyección pueden incluir, por ejemplo, uracilos (U), por ejemplo, todos U. El bucle en los ARNhc o precursores de ARN modificados por ingeniería puede diferir de secuencias de pre-miARN naturales mediante modificación de la secuencia de bucle para aumentar o disminuir el número de nucleótidos emparejados, o sustitución de la totalidad o parte de la secuencia de bucle por un tetrabucle u otras secuencias de bucle. Por tanto, el bucle en los ARNhc o precursores de ARN modificados por ingeniería puede tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más, por ejemplo, 15o 20, o más nucleótidos de longitud.
El bucle en los ARNhc o precursores de ARN modificados por ingeniería puede diferir de secuencias de pre-miARN naturales mediante modificación de la secuencia de bucle para aumentar o disminuir el número de nucleótidos emparejados, o sustitución de la totalidad o parte de la secuencia de bucle por un tetrabucle u otras secuencias de bucle. Por tanto, la porción de bucle en el ARNhc puede tener de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, es decir, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más, por ejemplo, 15 o 20, o más nucleótidos de longitud. Un bucle preferido consiste en, o comprende, una secuencia de “tetrabucle”. Las secuencias de tetrabucle a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, las secuencias GNRA, en las que N es cualquier nucleótido y R es un nucleótido de purina, GGGG y UUUU.
En determinadas realizaciones, los ARNhc de la invención incluyen las secuencias de una molécula de ARNip deseada descrita anteriormente. En otras realizaciones, la secuencia de la porción antisentido de un ARNhc puede diseñarse esencialmente tal como se describió anteriormente o seleccionando de manera general una secuencia de 18, 19, 20, 21 nucleótidos, o más larga, a partir del interior del ARN diana (por ejemplo, ARNm de sflt1), por ejemplo, a partir de una región de 100 a 200 o 300 nucleótidos en el sentido de 5' o en el sentido de 3' desde el inicio de la traducción. En general, la secuencia puede seleccionarse a partir de cualquier porción del ARN diana (por ejemplo, ARNm), incluyendo una región intrónica, la 5' UTR (región no traducida), secuencia codificante o 3' UTR, siempre que dicha porción esté distante del sitio de la mutación de ganancia de función. Opcionalmente, esta secuencia puede seguir inmediatamente después de una región del gen diana que contiene dos nucleótidos AA adyacentes. Los dos últimos nucleótidos de la secuencia de nucleótidos pueden seleccionarse para ser UU. Esta secuencia de unos 21 nucleótidos se usa para crear una porción de un tallo de dúplex en el ARNhc. Esta secuencia puede sustituir a una porción de tallo de una secuencia de pre-miARN silvestre, por ejemplo, de manera enzimática, o se incluye en una secuencia completa que se sintetiza. Por ejemplo, pueden sintetizarse oligonucleótidos de ADN que codifican para todo el precursor de ARN modificado por ingeniería de tallo-bucle, o que codifican tan sólo para la porción que va a insertarse en el tallo de dúplex del precursor, y usando enzimas de restricción para construir el constructo de precursor de ARN modificado por ingeniería, por ejemplo, a partir de un pre-miARN silvestre.
Los precursores de ARN modificados por ingeniería incluyen en el tallo de dúplex las secuencias de unos 21­ 22 nucleótidos del ARNip o dúplex de tipo ARNip que se desea producir in vivo. Por tanto, la porción de tallo del precursor de ARN modificado por ingeniería incluye al menos 18 o 19 pares de nucleótidos correspondientes a la secuencia de una porción exónica del gen cuya expresión tiene que reducirse o inhibirse. Los dos nucleótidos en 3' que flanquean esta región del tallo se eligen para maximizar la producción del ARNip a partir del precursor de ARN modificado por ingeniería y para maximizar la eficacia del ARNip resultante en la selección como diana del ARNm correspondiente para la represión de la traducción o destrucción mediante iARN in vivo e in vitro.
En determinadas realizaciones, los ARNhc de la invención incluyen secuencias de miARN, opcionalmente secuencias de miARN modificadas en el extremo, para potenciar la entrada en RISC. La secuencia de miARN puede ser similar o idéntica a la de cualquier miARN que se produce de manera natural (véase, por ejemplo, The miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004). Hasta ahora se han identificado más de mil miARN naturales y se piensa que juntos comprenden aproximadamente el 1% de todos los genes predichos en el genoma. Muchos miARN naturales están agrupados juntos en los intrones de pre-ARNm y pueden identificarse in silico usando búsquedas basadas en homología (Pasquinelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee y Ambros, 2001) o algoritmos informáticos (por ejemplo, MiRScan, MiRSeeker) que predicen la capacidad de un gen de miARN candidato para formar la estructura de tallo-bucle de un pri-ARNm (Grad et al., Mol. Cell., 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003; Lai E C et al., Genome Bio., 2003). Un registro en línea proporciona una base de datos en la que puede buscarse de todas las secuencias de miARN publicadas (The miRNA Registry en el sitio web del instituto Sanger; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004). Los miARN naturales a modo de ejemplo incluyen lin-4, let-7, miR-10, mirR-15, miR-16, miR-168, miR-175, miR-196 y sus homólogos, así como otros miARN naturales de seres humanos y determinados organismos modelo incluyendo Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, pez cebra, Arabidopsis thalania, Mus musculus y Rattus norvegicus tal como se describe en la publicación de PCT internacional n.° WO 03/029459.
Los miARN que se producen de manera natural se expresan mediante genes endógenos in vivo y se procesan a partir de un precursor de horquilla o de tallo-bucle (pre-miARN o pri-miARN) mediante Dicer u otras ARNasas (Lagos-Quintana et al., Science, 2001; Lau et al., Science, 2001; Lee y Ambros, Science, 2001; Lagos-Quintana et al., Curr. Biol., 2002; Mourelatos et al., Genes Dev., 2002; Reinhart et al., Science, 2002; Ambros et al., Curr. Biol., 2003; Brennecke et al., 2003; Lagos-Quintana et al., RNA, 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003). Los miARN pueden existir de manera transitoria in vivo como un dúplex bicatenario, pero sólo se capta una cadena por el complejo RISC para dirigir el silenciamiento génico. Determinados miARN, por ejemplo, miARN de plantas, tienen una complementariedad perfecta o casi perfecta con respecto a sus ARNm diana y, por tanto, dirigen la escisión de los ARNm diana. Otros miARN tienen una complementariedad inferior a la perfecta con respecto a sus ARNm diana y, por tanto, dirigen la represión de la traducción de los ARNm diana. Se cree que el grado de complementariedad entre un miARN y su ARNm diana determina su mecanismo de acción. Por ejemplo, una complementariedad perfecta o casi perfecta entre un miARN y su ARNm diana es predictiva de un mecanismo de escisión (Yekta et al., Science, 2004), mientras que una complementariedad inferior a la perfecta es predictiva de un mecanismo de represión de la traducción. En realizaciones particulares, la secuencia de miARN es la de una secuencia de miARN que se produce de manera natural, cuya expresión o actividad aberrante está correlacionada con un trastorno de miARN.
d) Anclajes de oligonucleótidos de función doble
En otras realizaciones, los agentes de silenciamiento de ARN de la presente invención incluyen anclajes de oligonucleótidos de función doble útiles para el reclutamiento intercelular de un miARN. Las células de animales expresan una gama de miARN, ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos que pueden regular la expresión génica a nivel tras la transcripción o la traducción. Mediante unión a un miARN unido a RISC y su reclutamiento en un ARNm diana, un anclaje de oligonucleótido de función doble puede reprimir la expresión de genes implicados, por ejemplo, en el proceso arteriosclerótico. El uso de anclajes de oligonucleótidos ofrece varias ventajas con respecto a técnicas existentes para reprimir la expresión de un gen particular. En primer lugar, los métodos descritos en el presente documento permiten que una molécula endógena (con frecuencia presente en abundancia), un miARN, medie en el silenciamiento de a Rn . Por consiguiente, los métodos descritos en el presente documento eliminan la necesidad de introducir moléculas foráneas (por ejemplo, ARNip) para mediar en el silenciamiento de ARN. En segundo lugar, puede hacerse que los agentes de silenciamiento de ARN y, en particular, el resto de unión (por ejemplo, oligonucleótidos tales como el 2'-O-metil-oligonucleótido), sean estables y resistentes a la actividad nucleasa. Como resultado, los anclajes de la presente invención pueden diseñarse para su suministro directo, eliminando la necesidad de suministro indirecto (por ejemplo, viral) de una molécula o plásmido precursor diseñado para hacer que el agente deseado entre dentro de la célula. En tercer lugar, pueden diseñarse anclajes y sus restos respectivos para adaptarse a sitios de ARNm específicos y a miARN específicos. Los diseños pueden ser específicos de célula y de producto génico. En cuarto lugar, los métodos dados a conocer en el presente documento dejan el ARNm intacto, permitiendo que un experto en la técnica bloquee la síntesis de proteína en impulsos cortos usando la maquinaria de la propia célula. Como resultado, estos métodos de silenciamiento de ARN son altamente regulables.
Los anclajes de oligonucleótidos de función doble (“anclajes”) de la invención están diseñados de tal manera que reclutan miARN (por ejemplo, miARN celulares endógenos) en un ARNm diana para inducir la modulación de un gen de interés. En realizaciones preferidas, los anclajes tienen la fórmula T-L-|i, en la que T es un resto de direccionamiento de ARNm, L es un resto de unión y |i es un resto de reclutamiento de miARN. Uno o más restos cualesquiera pueden ser bicatenarios. Sin embargo, preferiblemente cada resto es monocatenario.
Los restos dentro de los anclajes pueden estar dispuestos o unidos (en el sentido de 5' a 3') tal como se representa en la fórmula T-L-|i (es decir, el extremo 3' del resto de direccionamiento unido al extremo 5' del resto de unión y el extremo 3' del resto de unión unido al extremo 5' del resto de reclutamiento de miARN). Alternativamente, los restos pueden estar dispuestos o unidos en el anclaje de la siguiente manera: |i-T-L (es decir, el extremo 3' del resto de reclutamiento de miARN unido al extremo 5' del resto de unión y el extremo 3' del resto de unión unido al extremo 5' del resto de direccionamiento).
El resto de direccionamiento de ARNm, tal como se describió anteriormente, puede capturar un ARNm diana específico. Según la invención, la expresión del ARNm diana no es deseable y, por tanto, se desea la represión de la traducción del ARNm. El resto de direccionamiento de ARNm debe tener un tamaño suficiente como para unirse eficazmente al ARNm diana. La longitud del resto de direccionamiento variará en gran medida dependiendo, en parte, de la longitud del ARNm diana y del grado de complementariedad entre el ARNm diana y el resto de direccionamiento. En diversas realizaciones, el resto de direccionamiento tiene menos de aproximadamente 200, 100, 50, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 nucleótidos de longitud. En una realización particular, el resto de direccionamiento tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.
El resto de reclutamiento de miARN, tal como se describió anteriormente, puede asociarse con un miARN. Según la invención, el miARN puede ser cualquier miARN que puede reprimir el ARNm diana (por ejemplo, uno o más ARNm de sflt1). Se notifica que los mamíferos tienen más de 250 miARN endógenos (Lagos-Quintana et al. (2002) Current Biol. 12:735-739; Lagos-Quintana et al. (2001) Science 294:858-862; y Lim et al. (2003) Science 299:1540). En diversas realizaciones, el miARN puede ser cualquier miARN reconocido en la técnica.
El resto de unión es cualquier agente que puede unirse a los restos de direccionamiento de tal manera que se mantiene la actividad de los restos de direccionamiento. Los restos de unión son preferiblemente restos de oligonucleótidos que comprenden un número suficiente de nucleótidos de tal manera que los agentes de direccionamiento pueden interaccionar de manera suficiente con sus dianas respectivas. Los restos de unión tienen poca o ninguna homología de secuencia con secuencias de miARN o ARNm celular. Los restos de unión a modo de ejemplo incluyen uno o más 2'-O-metil-nucleótidos, por ejemplo, 2'-p-metiladenosina, 2'-O-metiltimidina, 2'-O-metilguanosina o 2'-O-metiluridina.
e) Oligonucleótidos de silenciamiento génico
En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, la expresión génica (es decir, expresión del gen sfltl) puede modularse usando compuestos basados en oligonucleótidos que comprenden dos o más oligonucleótidos antisentido monocatenarios que están unidos a través de sus extremos 5' que permiten la presencia de dos o más extremos 3' accesibles para inhibir o reducir eficazmente la expresión del gen sfltl. Tales oligonucleótidos unidos también se conocen como oligonucleótidos de silenciamiento génico (GSO). (Véase, por ejemplo, el documento US 8.431.544 cedido a Idera Pharmaceuticals, Inc.).
La unión en los extremos 5' de los GSO es independiente de las otras uniones de oligonucleótidos y puede ser directamente mediante grupos 5', 3' o 2'-hidroxilo, o indirectamente mediante un grupo de unión distinto de nucleótido o un nucleósido, usando cualquiera de las posiciones 2' o 3'-hidroxilo del nucleósido. Las uniones también pueden usar una base nitrogenada o un azúcar funcionalizado de un nucleótido 5'-terminal.
Los GSO pueden comprender dos secuencias idénticas o diferentes conjugadas en sus extremos 5'-5' a través de un grupo de unión fosfodiéster, fosforotioato o distinto de nucleósido. Tales compuestos pueden comprender de 15 a 27 nucleótidos que son complementarios a porciones específicas de dianas de ARNm de interés para la regulación por disminución antisentido de un producto génico. Los GSO que comprenden secuencias idénticas pueden unirse a un ARNm específico mediante interacciones de formación de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick e inhibir la expresión de proteína. Los GSO que comprenden secuencias diferentes pueden unirse a dos o más regiones diferentes de una o más dianas de ARNm e inhibir la expresión de proteína. Tales compuestos están compuestos por secuencias de heteronucleótidos complementarias a ARNm diana y forman estructuras de dúplex estables mediante formación de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick. En determinadas condiciones, los GSO que contienen dos extremos 3' libres (antisentido unido en 5'-5') pueden ser inhibidores más potentes de la expresión génica que los que contienen un único extremo 3' libre o ningún extremo 3' libre.
En algunas realizaciones, el grupo de unión distinto de nucleótido es glicerol o un homólogo de glicerol de la fórmula HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH, en la que o y p son independientemente números enteros de desde 1 hasta aproximadamente 6, desde 1 hasta aproximadamente 4 o desde 1 hasta aproximadamente 3. En algunas otras realizaciones, el grupo de unión distinto de nucleótido es un derivado de 1,3-diamino-2-hidroxipropano. Algunos de tales derivados tienen la fórmula HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH, en la que m es un número entero de desde 0 hasta aproximadamente 10, desde 0 hasta aproximadamente 6, desde 2 hasta aproximadamente 6 o desde 2 hasta aproximadamente 4.
Algunos grupos de unión distintos de nucleótido permiten la unión de más de dos componentes de GSO. Por ejemplo, el grupo de unión distinto de nucleótido glicerol tiene tres grupos hidroxilo a los que pueden unirse de manera covalente componentes de GSO. Por tanto, algunos compuestos basados en oligonucleótidos de la invención comprenden dos o más oligonucleótidos unidos a un nucleótido o a un grupo de unión distinto de nucleótido. Tales oligonucleótidos según la invención se denominan “ramificados”.
En determinadas realizaciones, los GSO tienen al menos 14 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, los GSO tienen de 15 a 40 nucleótidos de longitud o de 20 a 30 nucleótidos de longitud. Por tanto, los oligonucleótidos componentes de los GSO pueden tener independientemente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos de longitud.
Estos oligonucleótidos pueden prepararse mediante los métodos reconocidos en la técnica tales como química de fosforamidato o H-fosfonato que pueden llevarse a cabo manualmente o mediante un sintetizador automatizado. Estos oligonucleótidos también pueden modificarse de varias maneras sin comprometer su capacidad para hibridarse a ARNm. Tales modificaciones pueden incluir al menos una unión internucleotídica del oligonucleótido que es un alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, éster de fosfato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, hdroxifosfato, acetamidato o éster carboximetílico, o una combinación de estas y otras uniones internucleotídicas entre el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido en las que la unión fosfodiéster del nucleótido en 5' se ha sustituido por cualquiera de varios grupos químicos.
IV. Agentes de silenciamiento de ARN anti-sFlt1 modificados
En determinados aspectos de la invención, un agente de silenciamiento de ARN (o cualquier porción del mismo) de la invención tal como se describió anteriormente puede modificarse de tal manera que se mejora adicionalmente la actividad del agente. Por ejemplo, los agentes de silenciamiento de ARN descritos en el presente documento pueden modificarse con cualquiera de las modificaciones descritas a continuación. Las modificaciones pueden servir, en parte, para potenciar adicionalmente la distinción de diana, para potenciar la estabilidad del agente (por ejemplo, para prevenir la degradación), para fomentar la captación celular, para potenciar la eficacia de diana, para mejorar la eficacia de unión (por ejemplo, a las dianas), para mejorar la tolerancia del paciente al agente y/o para reducir la toxicidad.
En determinadas realizaciones, se proporcionan compuestos de ARNip que tienen una o cualquier combinación de las siguientes propiedades: (1) completamente estabilizado de manera química (es decir, sin residuos 2'-OH no modificados); (2) asimetría; (3) dúplex de 11-16 pares de bases; (4) patrón alternante de nucleótidos químicamente modificados (por ejemplo, modificaciones de 2'-fluoro y 2'-metoxilo); y (5) colas monocatenarias, completamente fosforotioadas, de 5-8 bases. El número de modificaciones de fosforotioato es crítico. Este número se hace variar desde 6 hasta 17 en total en diferentes realizaciones.
En determinadas realizaciones, los compuestos de ARNip descritos en el presente documento pueden conjugarse con una variedad de agentes de direccionamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, colesterol, DHA, feniltropanos, cortisol, vitamina A, vitamina D, GalNac y gangliósidos. La versión modificada con colesterol mostró una mejora de 5-10 veces en la eficacia in vitro frente a patrones de estabilización química anteriormente usados (por ejemplo, en los que todas las purinas pero no las purimidinas están modificadas) en una amplia gama de tipos de células (por ejemplo, HeLa, neuronas, hepatocitos, trofoblastos).
Determinados compuestos de la invención que tienen las propiedades estructurales descritas anteriormente y en el presente documento pueden denominarse “ARNiph-PEA” (ARN de interferencia pequeño, modificado de manera hidrófoba, que presenta un patrón de estabilización avanzado). Además, este patrón de ARNiph-PEA mostró una distribución drásticamente mejorada a través del cerebro, la médula espinal, suministro al hígado, la placenta, el riñón, el bazo y varios otros tejidos, haciendo que estén accesibles para intervención terapéutica.
En el hígado, ARNiph-PEA se suministra específicamente a células endoteliales y de Kupffer, pero no a hepatocitos, haciendo que este patrón de modificación química sea una tecnología complementaria en vez de competitiva con respecto a conjugados de GalNac.
En un aspecto, la invención se refiere a un compuesto que se une a una región intrónica de un ARNm que codifica para una proteína sFLT1, en el que el compuesto inhibe selectivamente la expresión de la proteína sFLT1 en una célula o un organismo; comprendiendo dicho compuesto un ARNbc que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido de al menos 16 nucleótidos contiguos,
en el que una porción de la cadena antisentido es complementaria a una porción de la cadena sentido,
en el que la cadena antisentido es completamente complementaria a SEQ ID NO: 1;
(1) la cadena antisentido comprende 2'-metoxi-ribonucleótidos y 2'-fluoro-ribonucleótidos alternantes;
(2) los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 desde el extremo 5' del soporte antisentido no son 2'-metoxiribonucleótidos;
(3) los nucleótidos de la cadena antisentido están conectados mediante uniones fosfodiéster o fosforotioato; y (4) los nucleótidos en las posiciones 1-6 desde el extremo 3', o en las posiciones 1-7 desde el extremo 3', de la cadena antisentido están conectados a nucleótidos adyacentes mediante uniones fosforotioato;
en el que la cadena sentido está unida a una molécula hidrófoba en el extremo 3' de la cadena sentido.
También se describe en el presente documento un oligonucleótido de al menos 16 nucleótidos contiguos, teniendo dicho oligonucleótido un extremo 5', un extremo 3' y complementariedad con respecto a una diana, en el que: (1) el oligonucleótido comprende 2'-metoxi-ribonucleótidos y 2'-fluoro-ribonucleótidos alternantes; (2) los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 desde el extremo 5' no son 2'-metoxi-ribonucleótidos; (3) los nucleótidos están conectados mediante uniones fosfodiéster o fosforotioato; y (4) los nucleótidos en las posiciones 1-6 desde el extremo 3', o en las posiciones 1-7 desde el extremo 3', están conectados a nucleótidos adyacentes mediante uniones fosforotioato. También se describe en el presente documento un ácido nucleico bicatenario, químicamente modificado, que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en el que: (1) el primer oligonucleótido es un oligonucleótido descrito en el presente documento (por ejemplo, que comprende las SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4); (2) una porción del primer oligonucleótido es complementaria a una porción del segundo oligonucleótido; (3) el segundo oligonucleótido comprende 2'-metoxi-ribonucleótidos y 2'-fluoro-ribonucleótidos alternantes; (4) los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 desde el extremo 3' del segundo oligonucleótido son 2'-metoxi-ribonucleótidos; y (5) los nucleótidos del segundo oligonucleótido están conectados mediante uniones fosfodiéster o fosforotioato.
También se describe en el presente documento un oligonucleótido que tiene la estructura:
Figure imgf000031_0001
en la que: X es un grupo 5'-fosfato; A, para cada caso, es independientemente un 2'-metoxi-ribonucleótido; B, para cada caso, es independientemente un 2'-fluoro-ribonucleótido; L, para cada caso, es independientemente un grupo de unión fosfodiéster o fosforotioato; S es un grupo de unión fosforotioato; y R se selecciona de hidrógeno y un grupo de ocupación de centros reactivos (por ejemplo, un acilo tal como acetilo); j es 4, 5, 6 o 7; r es 2 o 3; y t es 0 o 1.
También se describe en el presente documento un ácido nucleico bicatenario, químicamente modificado, que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en el que: (1) el primer oligonucleótido se selecciona de los oligonucleótidos del tercer aspecto; (2) una porción del primer oligonucleótido es complementaria a una porción del segundo oligonucleótido; y (3) el segundo oligonucleótido tiene la estructura:
Figure imgf000031_0002
en la que: C es una molécula hidrófoba; A, para cada caso, es independientemente un 2'-metoxi-ribonucleótido; B, para cada caso, es independientemente un 2'-fluoro-ribonucleótido; L es un grupo de unión que comprende uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en: 0-4 unidades de repetición de etilenglicol, un fosfodiéster y un fosforotioato; S es un grupo de unión fosforotioato; P es un grupo de unión fosfodiéster; R se selecciona de hidrógeno y un grupo de ocupación de centros reactivos (por ejemplo, un acilo tal como acetilo); m' es 0 o 1; n' es 4, 5 o 6; q' es 0 o 1; r' es 0 o 1; y t' es 0 o 1.
1) Modificaciones para potenciar la distinción de diana
En determinadas realizaciones, los agentes de silenciamiento de ARN de la invención pueden estar sustituidos con un nucleótido desestabilizante para potenciar la distinción de diana de un solo nucleótido (véase la solicitud estadounidense con n.° de serie 11/698.689, presentada el 25 de enero de 2007, y la solicitud provisional estadounidense n.° 60/762.225, presentada en 25 de enero de 2006). Una modificación de este tipo puede ser suficiente para eliminar la especificidad del agente de silenciamiento de ARN para un ARNm no diana (por ejemplo, ARNm silvestre), sin afectar de manera apreciable a la especificidad del agente de silenciamiento de ARN para un ARNm diana (por ejemplo, ARNm mutante de ganancia de función).
En realizaciones preferidas, los agentes de silenciamiento de ARN de la invención se modifican mediante la introducción de al menos un nucleótido universal en la cadena antisentido de los mismos. Los nucleótidos universales comprenden porciones de bases que pueden formar pares de bases de manera indistinta con cualquiera de las cuatro bases de nucleótidos convencionales (por ejemplo, A, G, C, U). Se prefiere un nucleótido universal porque tiene un efecto relativamente minoritario sobre la estabilidad del dúplex de ARN o el dúplex formado por la cadena guía del agente de silenciamiento de ARN y el ARNm diana. Los nucleótidos universales a modo de ejemplo incluyen los que tienen una porción de base de inosina o una porción de base de análogo de inosina seleccionada del grupo que consiste en desoxiinosina (por ejemplo, 2'-desoxiinosina), 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2'-aza-2'-desoxiinosina, PNA-inosina, morfolino-inosina, LNA-inosina, fosforamidato-inosina, 2'-O-metoxietil-inosina y 2'-OMeinosina. En realizaciones particularmente preferidas, el nucleótido universal es un residuo de inosina o un análogo que se produce de manera natural del mismo.
En determinadas realizaciones, los agentes de silenciamiento de ARN de la invención se modifican mediante la introducción de al menos un nucleótido desestabilizante dentro de 5 nucleótidos desde un nucleótido determinante de la especificidad (es decir, el nucleótido que reconoce el polimorfismo relacionado con la enfermedad). Por ejemplo, el nucleótido desestabilizante puede introducirse en una posición que está dentro de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos desde un nucleótido determinante de la especificidad. En realizaciones a modo de ejemplo, el nucleótido desestabilizante se introduce en una posición que está a 3 nucleótidos desde el nucleótido determinante de la especificidad (es decir, de tal manera que hay 2 nucleótidos estabilizantes entre el nucleótido desestabilizante y el nucleótido determinante de la especificidad). En agentes de silenciamiento de ARN que tienen dos cadenas o porciones de cadena (por ejemplo, ARNip y ARNhc), el nucleótido desestabilizante puede introducirse en la cadena o porción de cadena que no contiene el nucleótido determinante de la especificidad. En realizaciones preferidas, el nucleótido desestabilizante se introduce en la misma cadena o porción de cadena que contiene el nucleótido determinante de la especificidad.
2) Modificaciones para potenciar la eficacia y especificidad
En determinadas realizaciones, los agentes de silenciamiento de ARN de la invención pueden alterarse para facilitar una eficacia y especificidad potenciadas en la mediación en iARN según reglas de diseño de asimetría (véanse las patentes estadounidenses n.os 8.309.704, 7.750.144, 8.304.530, 8.329.892 y 8.309.705). Tales alteraciones facilitan la entrada de la cadena antisentido del ARNip (por ejemplo, un ARNip diseñado usando los métodos de la invención o un ARNip producido a partir de un ARNhc) en RlSc en favor de la cadena sentido, de tal manera que la cadena antisentido guía de manera preferente la escisión o represión de la traducción de un ARNm diana y, por tanto, aumenta o mejora la eficacia de escisión y silenciamiento de diana. Preferiblemente, la asimetría de un agente de silenciamiento de ARN se potencia reduciendo la fuerza de par de bases entre el extremo 5' de cadena antisentido (AS 5') y el extremo 3' de cadena sentido (S 3') del agente de silenciamiento de ARN en relación con la fuerza de enlace o fuerza de par de bases entre el extremo 3' de cadena antisentido (AS 3') y el extremo 5' de cadena sentido (S 5') de dicho agente de silenciamiento de ARN.
En una realización, la asimetría de un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede potenciarse de tal manera que hay menos pares de bases de G:C entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la porción de cadena sentido que entre el extremo 3' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 5' de la porción de cadena sentido. En otra realización, la asimetría de un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede potenciarse de tal manera que hay al menos un par de bases con apareamiento erróneo entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la porción de cadena sentido. Preferiblemente, el par de bases con apareamiento erróneo se selecciona del grupo que consiste en G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C y U:U. En otra realización, la asimetría de un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede potenciarse de tal manera que hay al menos un par de bases oscilante, por ejemplo, G:U, entre el extremo 5' de la primera cadena o cadena antisentido y el extremo 3' de la porción de cadena sentido. En otra realización, la asimetría de un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede potenciarse de tal manera que hay al menos un par de bases que comprende un nucleótido poco frecuente, por ejemplo, inosina (I). Preferiblemente, el par de bases se selecciona del grupo que consiste en I:A, I:U e I:C. En aún otra realización, la asimetría de un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede potenciarse de tal manera que hay al menos un par de bases que comprende un nucleótido modificado. En realizaciones preferidas, el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2-amino-G, 2-amino-A, 2,6-diamino-G y 2,6-diamino-A.
3) Agentes de silenciamiento de ARN con estabilidad potenciada
Los agentes de silenciamiento de ARN de la presente invención pueden modificarse para mejorar la estabilidad en suero o en medio de crecimiento para cultivos celulares. Con el fin de potenciar la estabilidad, los residuos en 3' pueden estabilizarse frente a la degradación, por ejemplo, pueden seleccionarse de tal manera que consisten en nucleótidos de purina, particularmente nucleótidos de adenosina o guanosina. Alternativamente, la sustitución de nucleótidos de pirimidina por análogos modificados, por ejemplo, sustitución de uridina por 2'-desoxitimidina, se tolera y no afecta a la eficacia de la interferencia de ARN.
La invención presenta agentes de silenciamiento de ARN que incluyen cadenas primera y segunda en los que la segunda cadena y la primera cadena están modificadas mediante la sustitución de nucleótidos internos por nucleótidos modificados, de tal manera que se potencia la estabilidad in vivo en comparación con un agente de silenciamiento de ARN no modificado correspondiente. Tal como se define en el presente documento, un nucleótido “interno” es uno que se produce en cualquier posición distinta del extremo 5' o el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico, polinucleótido u oligonucleótido. Un nucleótido interno puede estar dentro de una molécula monocatenaria o dentro de una cadena de un dúplex o una molécula bicatenaria. En una realización, la cadena sentido y/o la cadena antisentido están modificadas mediante la sustitución de al menos un nucleótido interno. En otra realización, la cadena sentido y/o la cadena antisentido están modificadas mediante la sustitución de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos internos. En otra realización, la cadena sentido y/o la cadena antisentido están modificadas mediante la sustitución de al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de los nucleótidos internos. En aún otra realización, la cadena sentido y/o la cadena antisentido están modificadas mediante la sustitución de todos los nucleótidos internos.
Los agentes de silenciamiento de ARN de la invención contienen al menos un análogo de nucleótido modificado. El uno o más análogos de nucleótido pueden estar ubicados en posiciones en las que la actividad de silenciamiento específica de diana, por ejemplo, la actividad de mediación en iARN o actividad de represión de la traducción, no se ve sustancialmente afectada, por ejemplo, en una región en el extremo 5' y/o el extremo 3' de la molécula de ARNip. Particularmente, los extremos pueden estabilizarse incorporando análogos de nucleótido modificados.
Los análogos de nucleótido a modo de ejemplo incluyen ribonucleótidos modificados en el azúcar y/o en la estructura principal (es decir, incluyen modificaciones en la estructura principal de fosfato-azúcar). Por ejemplo, las uniones fosfodiéster de ARN natural pueden modificarse para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre. En ribonucleótidos modificados en la estructura principal a modo de ejemplo, el grupo fosfoéster que se conecta a ribonucleótidos adyacentes se sustituye por un grupo modificado, por ejemplo, por un grupo fosfotioato. En ribonucleótidos modificados en el azúcar a modo de ejemplo, el grupo 2'-OH se sustituye por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 u ON, en los que R es alquilo C1-C6, alquenilo o alquinilo y halo es F, Cl, Br o I.
En realizaciones particulares, las modificaciones son modificaciones de 2'-fluoro, 2'-amino y/o 2'-tio. Las modificaciones particularmente preferidas incluyen 2'-fluoro-citidina, 2'-fluoro-uridina, 2'-fluoro-adenosina, 2'-fluoroguanosina, 2'-aminocitidina, 2'-amino-uridina, 2'-amino-adenosina, 2'-amino-guanosina, 2,6-diaminopurina, 4-tiouridina y/o 5-amino-alil-uridina. En una realización particular, los 2'-fluoro-ribonucleótidos son todos uridina y citidina. Las modificaciones a modo de ejemplo adicionales incluyen 5-bromo-uridina, 5-yodo-uridina, 5-metil-citidina, ribotimidina, 2-aminopurina, 2'-amino-butiril-pireno-uridina, 5-fluoro-citidina y 5-fluoro-uridina. También pueden usarse 2'-desoxi-nucleótidos y 2'-OMe-nucleótidos dentro de los restos de agentes de silenciamiento de ARN modificados de la presente invención. Los residuos modificados adicionales incluyen un resto desoxi-abásico, inosina, N3-metiluridina, N6,N6-dimetil-adenosina, pseudouridina, ribonucleósido de purina y ribavirina. En una realización particularmente preferida, el resto en 2' es un grupo metilo de tal manera que el resto de unión es un 2'-O-metiloligonucleótido.
En una realización a modo de ejemplo, el agente de silenciamiento de ARN de la invención comprende ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Los LNA comprenden nucleótidos modificados en el azúcar que resisten a las actividades nucleasa (son altamente estables) y presentan distinción de un solo nucleótido para ARNm (Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol 21:74-81). Estas moléculas tienen ácidos nucleicos con puentes de 2'-O,4'-C-etileno, con modificaciones posibles tales como 2'-desoxi-2”-fluorouridina. Además, los LNA aumentan la especificidad de oligonucleótidos restringiendo el resto de azúcar a la conformación 3'-endo, organizando previamente de ese modo el nucleótido para la formación de pares de bases y aumentando la temperatura de fusión del oligonucleótido en hasta 10°C por base.
En otra realización a modo de ejemplo, el agente de silenciamiento de ARN de la invención comprende ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Los PNA comprenden nucleótidos modificados en los que la porción de azúcar-fosfato del nucleótido se sustituye por un resto 2-amino-etilglicina neutro que puede formar una estructura principal de poliamida que es altamente resistente a la digestión por nucleasa y confiere una especificidad de unión mejorada a la molécula (Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500).
También se prefieren ribonucleótidos modificados en la base nitrogenada, es decir, ribonucleótidos que contienen al menos una base nitrogenada que no se produce de manera natural en vez de una base nitrogenada que se produce de manera natural. Las bases pueden modificarse para bloquear la actividad de adenosina desaminasa. Las bases nitrogenadas modificadas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, uridina y/o citidina modificadas en la posición 5, por ejemplo, 5-(2-amino)propil-uridina, 5-bromo-uridina; adenosina y/o guanosinas modificadas en la posición 8, por ejemplo, 8-bromo-guanosina; desazanucleótidos, por ejemplo, 7-desaza-adenosina; nucleótidos alquilados en O y N, por ejemplo, N6-metil-adenosina, que son adecuadas. Debe observarse que las modificaciones anteriores pueden combinarse.
En otras realizaciones, puede emplearse reticulación para alterar la farmacocinética del agente de silenciamiento de ARN, por ejemplo, para aumentar la semivida en el organismo. Por tanto, la invención incluye agentes de silenciamiento de ARN que tienen dos cadenas de ácido nucleico complementarias, en los que las dos cadenas están reticuladas. La invención también incluye agentes de silenciamiento de ARN que están conjugados o no conjugados (por ejemplo, en su extremo 3'-terminal) a otro resto (por ejemplo, un resto distinto de ácido nucleico tal como un péptido), un compuesto orgánico (por ejemplo, un colorante) o similares. Modificar derivados de ARNip de esta manera puede mejorar la captación celular o potenciar actividades de direccionamiento celular del derivado de ARNip resultante en comparación con el ARNip correspondiente, que son útiles para realizar un seguimiento del derivado de ARNip en la célula, o mejorar la estabilidad del derivado de ARNip en comparación con el ARNip correspondiente.
Otras modificaciones a modo de ejemplo incluyen: (a) modificación en 2', por ejemplo, proporcionar un resto 2'-OMe en un U en una cadena sentido o antisentido, pero especialmente en una cadena sentido, y/o un resto 2'-F en un U en una cadena sentido o antisentido, pero especialmente en una cadena sentido, y/o un resto 2'-OMe en una proyección en 3', por ejemplo, en el extremo 3'-terminal (extremo 3'-terminal significa en el átomo en 3' de la molécula o en el resto más en 3', por ejemplo, la posición más en 2' o 3' P, tal como se indica mediante el contexto) y/o un resto 2'-F; (b) modificación de la estructura principal, por ejemplo, con la sustitución de un O por un S, en la estructura principal de fosfato, por ejemplo, proporcionar una modificación de fosforotioato, en U o A o ambos, especialmente en una cadena antisentido; por ejemplo, con la sustitución de un P por un S; (c) sustitución de U por un grupo de unión amino en C5; (d) sustitución de A por G (se prefiere que los cambios de secuencia estén ubicados en la cadena sentido y no en la cadena antisentido); y (d) modificación en la posición 2', 6', 7' u 8'. Realizaciones a modo de ejemplo son aquellas en las que una o más de estas modificaciones están presentes en la cadena sentido pero no en la antisentido, o realizaciones en las que la cadena antisentido tiene menos de tales modificaciones. Aún otras modificaciones a modo de ejemplo incluyen el uso de un P metilado en una proyección en 3', por ejemplo, en el extremo 3'-terminal; una combinación de una modificación en 2', por ejemplo, proporcionar un resto 2'-OMe, y una modificación de la estructura principal, por ejemplo, con la sustitución de un P por un S, por ejemplo, proporcionar una modificación de fosforotioato, o el uso de un P metilado, en una proyección en 3', por ejemplo, en el extremo 3'-terminal; modificación con un alquilo en 3'; modificación con una pirrolidona abásica en una proyección en 3', por ejemplo, en el extremo 3'-terminal; modificación con naproxeno, ibuprofeno u otros restos que inhiben la degradación en el extremo 3'-terminal.
4) Modificaciones para potenciar la captación celular
En otras realizaciones, pueden modificarse agentes de silenciamiento de ARN con restos químicos, por ejemplo, para potenciar la captación celular por parte de células diana (por ejemplo, células neuronales). Por tanto, la invención incluye agentes de silenciamiento de ARN que están conjugados o no conjugados (por ejemplo, en su extremo 3'-terminal) a otro resto (por ejemplo, un resto distinto de ácido nucleico tal como un péptido), un compuesto orgánico (por ejemplo, un colorante) o similares. La conjugación puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando los métodos de Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001) (describe ácidos nucleicos cargados en nanopartículas de poli(cianoacrilato de alquilo) (PACA)); Fattal et al., J. Control Release 53(1-3): 137-43 (1998) (describe ácidos nucleicos unidos a nanopartículas); Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Sup. 4:55-8 (1994) (describe ácidos nucleicos unidos a agentes de intercalación, grupos hidrófobos, policationes o nanopartículas de PACA); y Godard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (describe ácidos nucleicos unidos a nanopartículas).
Según la invención, un agente de silenciamiento de ARN de la invención está conjugado a un resto lipófilo. En una realización, el resto lipófilo es un ligando que incluye un grupo catiónico. En otra realización, el resto lipófilo está unido a una o ambas cadenas de un ARNip. En una realización a modo de ejemplo, el resto lipófilo está unido a un extremo de la cadena sentido del ARNip. En otra realización a modo de ejemplo, el resto lipófilo está unido al extremo 3' de la cadena sentido. En determinadas realizaciones, el resto lipófilo se selecciona del grupo que consiste en colesterol, vitamina E, vitamina K, vitamina A, ácido fólico o un colorante catiónico (por ejemplo, Cy3). En una realización a modo de ejemplo, el resto lipófilo es un colesterol. Otros restos lipófilos incluyen ácido cólico, ácido adamantano-acético, ácido 1-pireno-butírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina.
5) Ligandos anclados
Pueden anclarse otras entidades a un agente de silenciamiento de ARN de la invención. Por ejemplo, un ligando anclado a un agente de silenciamiento de ARN para mejorar la estabilidad, termodinámica de hibridación con un ácido nucleico diana, direccionamiento a un tipo de tejido o célula particular o permeabilidad celular, por ejemplo, mediante un mecanismo dependiente o independiente de la endocitosis. Los ligandos y las modificaciones asociadas también pueden aumentar la especificidad de secuencia y, por consiguiente, disminuir el direccionamiento inespecífico. Un ligando anclado puede incluir una o más bases o azúcares modificados que pueden funcionar como agentes de intercalación. Estos están preferiblemente ubicados en una región interna, tal como en una protuberancia de dúplex de agente de silenciamiento de ARN/diana. El agente de intercalación puede ser un compuesto aromático, por ejemplo, aromático policíclico o aromático heterocíclico. Un agente de intercalación policíclico puede tener capacidades de apilamiento y puede incluir sistemas con 2, 3 o 4 anillos condensados. Las bases universales descritas en el presente documento pueden incluirse en un ligando. En una realización, el ligando puede incluir un grupo de escisión que contribuye a la inhibición de genes diana mediante escisión del ácido nucleico diana. El grupo de escisión puede ser, por ejemplo, una bleomicina (por ejemplo, bleomicina-A5, bleomicina-A2 o bleomicina-B2), pireno, fenantrolina (por ejemplo, O-fenantrolina), una poliamina, un tripéptido (por ejemplo, tripéptido Lys-Tyr-Lys) o grupo quelante de iones metálicos. El grupo quelante de iones metálicos puede incluir, por ejemplo, un complejo macrocíclico de Lu(III) o Eu(III), un derivado de 2,9-dimetilfenantrolina de Zn(II), una terpiridina de Cu(II) o acridina, que puede fomentar la escisión selectiva de ARN diana en el sitio de la protuberancia mediante iones metálicos libres, tales como Lu(III). En algunas realizaciones, un ligando peptídico puede anclarse a un agente de silenciamiento de ARN para fomentar la escisión del ARN diana, por ejemplo, en la región de protuberancia. Por ejemplo, puede conjugarse 1,8-dimetil-1,3,6,8,10,13-hexaazaciclotetradecano (cyclam) a un péptido (por ejemplo, mediante un derivado de aminoácido) para fomentar la escisión de ARN diana. Un ligando anclado puede ser un ligando de aminoglicósido, que puede hacer que un agente de silenciamiento de ARN tenga propiedades de hibridación mejoradas o especificidad de secuencia mejorada. Los aminoglicósidos a modo de ejemplo incluyen polilisina glicosilada, polilisina galactosilada, neomicina B, tobramicina, kanamicina A y conjugados de acridina de aminoglicósidos, tales como Neo-N-acridina, Neo-S-acridina, Neo-C-acridina, Tobra-N-acridina y KanaA-N-acridina. El uso de un análogo de acridina puede aumentar la especificidad de secuencia. Por ejemplo, la neomicina B tiene una alta afinidad por ARN en comparación con ADN, pero una baja especificidad de secuencia. Un análogo de acridina, la neo-5-acridina, tiene una afinidad aumentada por el elemento de respuesta a Rev (RRE) del VIH. En algunas realizaciones, se ancla el análogo de guanidina (el guanidinoglicósido) de un ligando de aminoglicósido a un agente de silenciamiento de ARN. En un guanidinoglicósido, el grupo amina en el aminoácido se intercambia por un grupo guanidino. La unión de un análogo de guanidina puede potenciar la permeabilidad celular de un agente de silenciamiento de ARN. Un ligando anclado puede ser un péptido de poli-arginina, un peptoide o un agente peptidomimético, que puede potenciar la captación celular de un agente de oligonucleótido.
Los ligandos a modo de ejemplo están acoplados, preferiblemente de manera covalente, o bien directamente o bien indirectamente a través de un anclaje intermedio, a un portador conjugado con ligando. En realizaciones a modo de ejemplo, el ligando está unido al portador a través de un anclaje intermedio. En realizaciones a modo de ejemplo, un ligando altera la distribución, el direccionamiento o la vida útil de un agente de silenciamiento de ARN en el que se incorpora. En realizaciones a modo de ejemplo, un ligando proporciona una afinidad potenciada para una diana seleccionada, por ejemplo, molécula, célula o tipo de célula, compartimento, por ejemplo, un compartimento celular u orgánico, tejido, órgano o región del organismo, en comparación con, por ejemplo, una especie que no presenta un ligando de este tipo.
Los ligandos a modo de ejemplo pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación y especificidad y también pueden mejorar la resistencia a nucleasa del agente de silenciamiento de ARN natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descritos en el presente documento y/o ribonucleótidos naturales o modificados. Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo, para potenciar la captación; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores, por ejemplo, para monitorizar la distribución; agentes de reticulación; restos que confieren resistencia a nucleasa; y bases nitrogenadas naturales o no habituales. Los ejemplos generales incluyen grupos lipófilos, lípidos, esteroides (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivatizado con epifriedelanol), vitaminas (por ejemplo, ácido fólico, vitamina A, biotina, piridoxal), hidratos de carbono, proteínas, agentes de unión a proteína, moléculas de direccionamiento de integrina, grupos policatiónicos, péptidos, poliaminas y agentes peptidomiméticos. Los ligandos pueden incluir una sustancia que se produce de manera natural (por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL) o globulina); un hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); un aminoácido o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen un poliaminoácido que es una polilisina (PLL), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, dendrímero de poliamina, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido de hélice alfa.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, por ejemplo, un agente de direccionamiento de célula o tejido, por ejemplo, una lectina, una glicoproteína, un lípido o una proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico tal como una célula placentaria, una célula renal y/o una célula hepática. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensioactiva A, hidrato de carbono de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetilglucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina o un péptido de RGD o agente peptidomimético de RGD. Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes de intercalación (por ejemplo, acridinas y acridinas sustituidas), agentes de reticulación (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina, fenantrolina, pirenos), tripéptido Lys-Tyr-Lys, aminoglicósidos, aminoglicósidos de guanidio, endonucleasas artificiales (por ejemplo, EDTA), moléculas lipófilas, por ejemplo, colesterol (y análogos de tiolados del mismo), ácido cólico, ácido colánico, ácido litocólico, ácido adamantano-acético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, glicerol (por ejemplo, ésteres (por ejemplo, mono, bis o tris-ésteres de ácidos grasos, por ejemplo, ácidos grasos C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 o C20) y ésteres de los mismos, por ejemplo, alquilo C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 o C20; por ejemplo, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, 1,3-bis-O(octadecil)glicerol), grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido esteárico (por ejemplo, diestearato de glicerilo), ácido oleico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido de Antennapedia, péptido de Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), agentes que facilitan el transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, naproxeno, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agrupaciones de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complejos de Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenilo, HRP o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas, o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un tipo de célula especificado tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, hidratos de carbono, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de p38 MAP cinasa o un activador de NF- k B.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de silenciamiento de ARN al interior de la célula, por ejemplo, alterando el citoesqueleto de la célula, por ejemplo, alterando los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina. El ligando puede aumentar la captación del agente de silenciamiento de ARN al interior de la célula activando una respuesta inflamatoria, por ejemplo. Los ligandos a modo de ejemplo que tendrán un efecto de este tipo incluyen factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), interleucina-1 beta o gamma-interferón. En un aspecto, el ligando es un lípido o una molécula basada en lípido. Un lípido o una molécula basada en lípido de este tipo se une preferiblemente a una proteína sérica, por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, el tejido diana puede ser la placenta, los riñones o el hígado. Otras moléculas que pueden unirse a HSA también pueden usarse como ligandos. Por ejemplo, puede usarse neproxina o aspirina. Un lípido o ligando basado en lípido puede (a) aumentar la resistencia frente a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o transporte al interior de una célula o membrana celular diana, y/o (c) usarse para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo, HSA. Un ligando basado en lípido puede usarse para modular, por ejemplo, controlar la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un lípido o ligando basado en lípido que se une a HSA más fuertemente será menos probable que se dirija a la placenta, el hígado y/o el riñón y, por tanto, menos probable que se aclare del organismo. Un lípido o ligando basado en lípido que se une a HSA menos fuertemente puede usarse para dirigir el conjugado a la placenta, el hígado y/o el riñón. Pueden usarse otros restos que seleccionan como diana células de la placenta, el hígado y/o el riñón en lugar o además del ligando basado en lípido.
En otro aspecto, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina, que se capta por una célula diana, por ejemplo, una célula en proliferación. Estas son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación celular no deseada, por ejemplo, del tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Las vitaminas a modo de ejemplo incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas a modo de ejemplo incluidas son vitamina B, por ejemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes captados por células cancerosas. También se incluyen HSA y lipoproteína de baja densidad (LDL).
En otro aspecto, el ligando es un agente de penetración celular, preferiblemente un agente de penetración celular helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente a modo de ejemplo es un péptido tal como de tat o Antennopedia. Si el agente es un péptido, puede estar modificado, incluyendo un agente peptidilmimético, invertómeros, uniones no peptídicas o seudopeptídicas y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferiblemente un agente de hélice alfa, que tiene preferiblemente una fase lipófila y una lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o agente peptidomimético. Un agente peptidomimético (también denominado en el presente documento agente oligopeptidomimético) es una molécula que puede plegarse para dar una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. La unión del péptido y agentes peptidomiméticos a agentes oligonucleotídicos puede afectar a la distribución farmacocinética del agente de silenciamiento de ARN, tal como potenciando el reconocimiento y la absorción celulares. El resto peptídico o peptidomimético puede tener aproximadamente 5-50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud. Un péptido o agente peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de penetración celular, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (por ejemplo, que consiste principalmente en Tyr, Trp o Phe). El resto peptídico puede ser un dendrímero de péptido, péptido restringido o péptido reticulado. El resto peptídico puede ser un L-péptido o D-péptido. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana (MTS) hidrófoba. Un péptido o agente peptidomimético puede codificarse por una secuencia de ADN aleatoria, tal como un péptido identificado a partir de una biblioteca de presentación en fago, o biblioteca combinatoria de una perla-un compuesto (OBOC) (Lam et al., Nature 354:82-84, 1991). En realizaciones a modo de ejemplo, el péptido o agente peptidomimético anclado a un agente de silenciamiento de ARN a través de una unidad de monómero incorporada es un péptido de direccionamiento de célula tal como un péptido de argininaglicina-ácido aspártico (RGD) o un agente mimético de RGD. La longitud de un resto peptídico puede oscilar entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos peptídicos pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar la estabilidad o dirigir propiedades conformacionales. Puede usarse cualquiera de las modificaciones estructurales descritas a continuación.
6) Combinaciones
También se describe en el presente documento una combinación que comprende:
un oligonucleótido de fórmula (I):
(5-3') R1R3X1[(L2)(X1)]i7R3X1 (I);
un oligonucleótido de fórmula (II):
(3’-57) R2LX2R3X2[(L2)(X2)]i2R3X2 (II):
un oligonucleótido de fórmula (III):
(5’-3’) R1R3X3[(L2)(X3)]i7R3X3 (III);
un oligonucleótido de fórmula (IV):
(5-3’) R2LX4R3X4[(L2)(X4)]i2R3X4 (IV);
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos,
en la que
la secuencia de oligonucleótidos de fórmula (I) es diferente de la secuencia de oligonucleótidos de fórmula (III); la secuencia de oligonucleótidos de fórmula (II) es diferente de la secuencia de oligonucleótidos de fórmula (IV); R1 se selecciona independientemente en cada caso del grupo que consiste en
Figure imgf000038_0001
R2 se selecciona del grupo que consiste en una cadena de alquilo (por ejemplo, C1-6, C1-10, C1-20, C1-30 o C1-40), una vitamina, un ligando, un péptido, un conjugado bioactivo (incluyendo, pero sin limitarse a, glicoesfingolípidos, ácidos grasos poliinsaturados, secoesteroides, hormonas esteroideas o lípidos de esterol),
Figure imgf000039_0001
R3 se selecciona independientemente en cada caso del grupo que consiste en un grupo de unión intemudeotídico tal como se muestra en la figura 41;
L es un grupo de unión que conecta dos restos, en el que el grupo de unión se selecciona del grupo que consiste en una cadena de etilenglicol, una cadena de alquilo, un péptido, un ARN, un ADN,
Figure imgf000040_0001
y combinaciones de los mismos;
L2 se selecciona independientemente en cada caso del grupo que consiste en uniones intemudeotídicas tal como se muestran en la figura 42; y
X1, X2, X3 y X4 se seleccionan cada uno independientemente en cada caso del grupo que consiste en nucleósidos tal como se muestran en la figura 43, en los que la base de nucleósido se selecciona del grupo que consiste en adenina, guanina, uracilo, citosina, 5-metilcitosina, hipoxantina y timina, en los que la base de nucleósido está opcionalmente modificada adicionalmente con uno o más restos hidrófobos adicionales seleccionados de naftilo o isobutilo.
En un ejemplo, R1 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000040_0002
En otro ejemplo, R1 es
Figure imgf000040_0003
En otro ejemplo, R2 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
En otro ejemplo, R3 es un grupo de unión intemucleotídico seleccionado independientemente en cada caso del grupo que consiste en un fosforotioato, un fosforoditioato, un metilfosfonato, un metilenfosfonato, un fosfotriéster y un boranofosfato.
En otro ejemplo, R3 es un grupo de unión internucleotídico seleccionado independientemente en cada caso del grupo que consiste en un fosforotioato, un fosforoditioato y un boranofosfato.
En otro ejemplo, R3 es un fosforotioato.
En otro ejemplo, L se selecciona del grupo que consiste en una cadena de etilenglicol, una cadena de alquilo y un péptido.
En otro ejemplo, L se selecciona de una cadena de etilenglicol o un péptido.
En aún otro ejemplo, L es
Figure imgf000042_0002
En todavía otro ejemplo, L es
Figure imgf000042_0003
En un ejemplo, L2 se selecciona independientemente en cada caso de un fosfodiéster y un fosforotioato.
En un ejemplo, X1, X2, X3 y X4 se seleccionan cada uno independientemente en cada caso del grupo que consiste en nucleósidos tal como se muestran en la figura 43, en los que la base de nucleósido se selecciona del grupo que consiste en adenina, guanina, uracilo, citosina, 5-metilcitosina, hipoxantina y timina.
En un ejemplo, X1, X2, X3 y X4 se seleccionan cada uno independientemente en cada caso de
Figure imgf000043_0001
en los que la base de nucleósido se selecciona del grupo que consiste en adenina, guanina, uracilo, citosina, 5-metilcitosina, hipoxantina y timina.
En un ejemplo, la combinación es una combinación mostrada en la figura 39 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
En un ejemplo, la combinación es una combinación mostrada en la figura 39 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la que
R1 es
Figure imgf000043_0002
R2 es
Figure imgf000043_0003
En otro ejemplo, la combinación es una combinación mostrada en la figura 39 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la que
R1 es
Figure imgf000043_0004
R2 es
Figure imgf000044_0001
aceptable
de la misma.
En un ejemplo, la combinación es una combinación mostrada en la figura 40 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la que
R1 es
Figure imgf000044_0002
R2 es
Figure imgf000044_0003
En otro ejemplo, la combinación es una combinación mostrada en la figura 40 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la que
R1 es
Figure imgf000044_0004
R2 es
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V. Métodos de introducción de ácidos nucleicos, vectores y células huésped
Los agentes de silenciamiento de ARN de la invención pueden introducirse directamente en la célula (por ejemplo, una célula neuronal) (es decir, de manera intracelular); o introducirse de manera extracelular en una cavidad, un espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducirse por vía oral, o pueden introducirse sumergiendo una célula o un organismo en una disolución que contiene el ácido nucleico. La circulación vascular o extravascular, el sistema sanguíneo o linfático y el líquido cefalorraquídeo son sitios en los que puede introducirse el ácido nucleico.
Los agentes de silenciamiento de ARN de la invención pueden introducirse usando métodos de suministro de ácido nucleico conocidos en la técnica, incluyendo inyección de una disolución que contiene el ácido nucleico, bombardeo mediante partículas recubiertas por el ácido nucleico, inmersión de la célula o el organismo en una disolución del ácido nucleico o electroporación de membranas celulares en presencia del ácido nucleico. Pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos en células, tales como transporte de portador mediado por lípidos, transporte mediado por productos químicos y transfección de liposomas catiónicos tales como fosfato de calcio, y similares. El ácido nucleico puede introducirse junto con otros componentes que realizan una o más de las siguientes actividades: potenciar la captación de ácido nucleico por parte de la célula o aumentar de otro modo la inhibición del gen diana.
Los métodos físicos de introducción de ácidos nucleicos incluyen inyección de una disolución que contiene el ARN, bombardeo mediante partículas recubiertas por el ARN, inmersión de la célula o el organismo en una disolución del ARN o electroporación de membranas celulares en presencia del ARN. Un constructo viral empaquetado en una partícula viral logrará tanto una introducción eficaz de un constructo de expresión en la célula como la transcripción de ARN codificado por el constructo de expresión. Pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos en células, tales como transporte de portador mediado por lípidos, transporte mediado por productos químicos, tales como fosfato de calcio, y similares. Por tanto, el ARN puede introducirse junto con componentes que realizan una o más de las siguientes actividades: potenciar la captación de ARN por parte de la célula, inhibir el apareamiento de cadenas sencillas, estabilizar las cadenas sencillas o aumentar de otro modo la inhibición del gen diana.
El ARN puede introducirse directamente en la célula (es decir, de manera intracelular); o introducirse de manera extracelular en una cavidad, un espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducirse por vía oral, o puede introducirse sumergiendo una célula o un organismo en una disolución que contiene el ARN. La circulación vascular o extravascular, el sistema sanguíneo o linfático y el líquido cefalorraquídeo son sitios en los que puede introducirse el ARN.
La célula que tiene el gen diana puede proceder de la línea germinal o ser somática, totipotente o pluripotente, estar en división o no en división, ser del parénquima o epitelio, estar inmortalizada o transformada, o similares. La célula puede ser una célula madre o una célula diferenciada. Los tipos de células que están diferenciadas incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, epitelio, neuronas, glía, células sanguíneas, megacariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos y células de las glándulas endocrinas o exocrinas.
Dependiendo del gen diana particular y la dosis de material de ARN bicatenario suministrada, este procedimiento puede proporcionar una pérdida parcial o completa de función para el gen diana. Una reducción o pérdida de expresión génica en al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 99% o más de las células seleccionadas como diana es a modo de ejemplo. La inhibición de expresión génica se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel de producto de proteína y/o ARNm a partir de un gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir el gen diana sin efectos manifiestos sobre otros genes de la célula. Las consecuencias de la inhibición pueden confirmarse mediante examen de las propiedades aparentes de la célula o el organismo (tal como se presenta a continuación en los ejemplos) o mediante técnicas bioquímicas tales como hibridación en disolución de ARN, protección frente a nucleasa, hibridación de tipo Northern, transcripción inversa, monitorización de la expresión génica con una micromatríz, unión a anticuerpo, ensayo de inmunoadsorción asociado a enzimas (ELISA), inmunotransferencia de tipo Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Para la inhibición mediada por ARN en una línea celular u organismo completo, la expresión génica se somete a ensayo de manera conveniente mediante el uso de un gen indicador o de farmacorresistencia cuyo producto de proteína se somete fácilmente a ensayo. Tales genes indicadores incluyen acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucoronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), peroxidasa del rábano (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopino sintasa (OCS) y derivados de las mismas. Hay múltiples marcadores seleccionables disponibles que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Dependiendo del ensayo, la cuantificación de la cantidad de expresión génica permite determinar un grado de inhibición que es mayor del 10%, 33%, 50%, 90%, 95% o 99% en comparación con una célula no tratada según la presente invención. Dosis inferiores de material inyectado y tiempos más largos tras la administración del agente de iARN pueden dar como resultado la inhibición en una fracción más pequeña de células (por ejemplo, al menos el 10%, 20%, 50%, 75%, 90% o 95% de células seleccionadas como diana). La cuantificación de la expresión génica en una célula puede mostrar cantidades similares de inhibición a nivel de acumulación de ARNm diana o traducción de proteína diana. Como ejemplo, la eficacia de inhibición puede determinarse evaluando la cantidad de producto génico en la célula; puede detectarse ARNm con una sonda de hibridación que tiene una secuencia de nucleótidos fuera de la región usada para el ARN bicatenario inhibidor o puede detectarse polipéptido traducido con un anticuerpo producido contra la secuencia de polipéptido de esa región.
El ARN puede introducirse en una cantidad que permite el suministro de al menos una copia por célula. Dosis superiores (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por célula) de material pueden producir una inhibición más eficaz; dosis inferiores también pueden ser útiles para aplicaciones específicas.
En un aspecto a modo de ejemplo, la eficacia de un agente de iARN de la invención (por ejemplo, un ARNip que selecciona como diana una secuencia diana intrónica de flt1) se somete a prueba para determinar su capacidad para degradar específicamente ARNm mutante (por ejemplo, ARNm de sflt1 y/o la producción de proteína sFlt1) en células, en particular, en células placentarias (por ejemplo, células del laberinto, trofoblastos (por ejemplo, sincitiotrofoblastos y/o citotrofoblastos), células mesenquimatosas, macrófagos derivados de células mesenquimatosas (células de Hofbauer), fibroblastos, células vasculares fetales (por ejemplo, células de músculo liso, células perivasculares (pericitos) y células endoteliales)), células del hígado y/o células del riñón. También son adecuadas para ensayos de validación basados en células otras células fácilmente transfectables, por ejemplo, células del trofoblasto, células HeLa o células COS. Las células se transfectan con ADNc humanos silvestres o mutantes (por ejemplo, ADNc de flt1 humano silvestre o secretado). Se transfectan conjuntamente ARNip convencional, ARNip modificado o vectores que pueden producir ARNip a partir de ARNm en bucle de U. Se mide la reducción selectiva de ARNm diana (por ejemplo, ARNm de sflt1) y/o proteína diana (por ejemplo, proteína sFlt1). Puede compararse la reducción de ARNm o proteína diana con niveles de ARNm o proteína diana en ausencia de un agente de iARN o en presencia de un agente de iARN que no selecciona como diana ARNm de sFlt1. Puede someterse a ensayo ARNm o proteína introducido de manera exógena (o ARNm o proteína endógeno) con fines de comparación. Cuando se usan células neuronales, que se sabe que son algo resistentes a técnicas de transfección convencionales, puede ser deseable introducir agentes de iARN (por ejemplo, ARNip) mediante captación pasiva.
6) Virus adenoasociados recombinantes y vectores
En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, pueden usarse virus adenoasociados recombinantes (rAAV) y sus vectores asociados para suministrar uno o más ARNip al interior de células, por ejemplo, células placentarias, células del riñón y/o células del hígado. El AAV puede infectar muchos tipos de células diferentes, aunque la eficacia de infección varía basándose en el serotipo, que se determina por la secuencia de la proteína de la cápside. Se han identificado varios serotipos de AAV nativos, usándose lo más habitualmente los serotipos 1-9 para AAV recombinante. AAV-2 es el serotipo mejor estudiado y publicado. El sistema de AAV-DJ incluye los serotipos AAV-DJ y AAV-DJ/8. Estos serotipos se crearon mediante intercambio de ADN de múltiples serotipos de AAV para producir AAV con cápsides híbridas que tienen eficiencias de transducción mejoradas in vitro (AAV-DJ) e in vivo (AAV-DJ/8) en una variedad de células y tejidos.
En realizaciones particulares, puede lograrse un suministro extendido al sistema nervioso central (SNC) mediante suministro intravascular de virus adenoasociado recombinante 7 (rAAV7), rAAV9 y rAAV10, u otros rAAV adecuados (Zhang et al. (2011) Mol. Ther. 19(8):1440-8. doi: 10.1038/mt.2011.98, publicación electrónica el 24 de mayo de 2011). Los rAAV y sus vectores asociados se conocen bien en la técnica y se describen en las solicitudes de patente estadounidense 2014/0296486, 2010/0186103, 2008/0269149, 2006/0078542 y 2005/0220766.
Los rAAV pueden administrarse a un sujeto en composiciones según cualquier método apropiado conocido en la técnica. Un rAAV puede suspenderse en un portador fisiológicamente compatible (es decir, en una composición), y puede administrarse a un sujeto, es decir, un animal huésped, tal como un ser humano, ratón, rata, gato, perro, oveja, conejo, caballo, vaca, cabra, cerdo, cobaya, hámster, pollo, pavo, un primate no humano (por ejemplo, babuino) o similares. En determinadas realizaciones, un animal huésped es un animal huésped no humano.
El suministro de uno o más rAAV a un sujeto mamífero puede realizarse, por ejemplo, mediante inyección intramuscular o mediante administración al torrente sanguíneo del sujeto mamífero. La administración al torrente sanguíneo puede ser mediante inyección en una vena, una arteria o cualquier otro conducto vascular. En determinadas realizaciones, se administran uno o más rAAV en el torrente sanguíneo mediante perfusión en extremidad aislada, una técnica bien conocida en las técnicas quirúrgicas, permitiendo el método esencialmente al experto aislar una extremidad con respecto a la circulación sistémica antes de la administración de los viriones de rAAV. El experto en la técnica también puede emplear una variante de la técnica de perfusión en extremidad aislada, descrita en la patente estadounidense n.° 6.177.403, para administrar viriones a la vasculatura de una extremidad aislada para potenciar posiblemente la transducción al interior de tejido o células musculares. Además, en determinados casos, puede ser deseable suministrar viriones a la placenta, hígado y/o riñones de un sujeto. Los AAV recombinantes pueden suministrarse directamente a la placenta, el hígado y/o el riñón con una aguja, un catéter o un dispositivo relacionado, usando técnicas de neurocirugía conocidas en la técnica, tal como mediante inyección esterotáctica (véase, por ejemplo, Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000).
Las composiciones de la invención pueden comprender un rAAV solo o en combinación con uno o más de otros virus (por ejemplo, un segundo rAAV que codifica para, que tiene, uno o más transgenes diferentes). En determinadas realizaciones, una composición comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más rAAV diferentes que tienen, cada uno, uno o más transgenes diferentes.
Una cantidad eficaz de un rAAV es una cantidad suficiente para seleccionar como diana e infectar a un animal, seleccionar como diana un tejido deseado. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un rAAV es una cantidad suficiente para producir un modelo de animal transgénico somático estable. La cantidad eficaz dependerá principalmente de factores tales como la especie, la edad, el peso, la salud del sujeto y el tejido que va a seleccionarse como diana, y, por tanto, puede variar entre animales y tejidos. Por ejemplo, una cantidad eficaz de uno o más rAAV está generalmente en el intervalo de desde aproximadamente 1 ml hasta aproximadamente 100 ml de disolución que contiene desde aproximadamente 109 hasta 1016 copias de genoma. En algunos casos, una dosificación de entre aproximadamente 1011 y 1012 copias de genoma de rAAV es apropiada. En determinadas realizaciones, 1012 copias de genoma de rAAV resultan eficaces para seleccionar como diana tejidos del corazón, hígado y páncreas. En algunos casos, se producen animales transgénicos estables mediante múltiples dosis de un rAAV.
En algunas realizaciones, se formulan composiciones de rAAV para reducir la agregación de partículas de AAV en la composición, particularmente cuando están presentes altas concentraciones de rAAV (por ejemplo, aproximadamente 1013 copias de genoma/ml o más). En la técnica se conocen bien métodos para reducir la agregación de rAAV e incluyen, por ejemplo, la adición de tensioactivos, ajuste del pH, ajuste de la concentración de sal, etc. (Véase, por ejemplo, Wright et al. (2005) Molecular Therapy 12:171-178).
Los “vectores de AAV recombinantes (rAAV)” comprenden, como mínimo, un transgén y sus secuencias regulatorias, y repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV en 5' y 3'. Es este vector de AAV recombinante el que se empaqueta en una proteína de la cápside y se suministra a una célula diana seleccionada. En algunas realizaciones, el transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga con respecto a las secuencias de vector, que codifica para un polipéptido, una proteína, una molécula de ARN funcional (por ejemplo, ARNip) u otro producto génico, de interés. La secuencia codificante de ácido nucleico está operativamente unida a componentes regulatorios de una manera que permite la transcripción, traducción y/o expresión del transgén en una célula de un tejido diana.
Las secuencias de AAV del vector comprenden normalmente las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) en 5' y 3' que actúan en cis (véase, por ejemplo, B. J. Carter, en “Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, págs. 155-168 (1990)). Habitualmente, las secuencias de ITR tienen aproximadamente 145 pares de bases de longitud. En determinadas realizaciones, se usan sustancialmente las secuencias completas que codifican para las ITR en la molécula, aunque es permisible cierto grado de modificación minoritaria de estas secuencias. La capacidad para modificar estas secuencias de ITR está dentro de las habilidades de la técnica. (Véanse, por ejemplo, textos tales como Sambrook et al, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989); y K. Fisher et al., J Virol., 70:520532 (1996)). Un ejemplo de una molécula de este tipo empleada en la presente invención es un plásmido “que actúa en cis” que contiene el transgén, en el que la secuencia de transgén seleccionada y los elementos regulatorios asociados están flanqueados por las secuencias de ITR de AAV en 5' y 3'. Las secuencias de ITR de AAV pueden obtenerse a partir de cualquier AAV conocido, incluyendo tipos de AAV de mamífero descritos adicionalmente en el presente documento.
VI. Métodos de tratamiento
También se describen en el presente documento métodos de tratamiento tanto profilácticos como terapéuticos de un sujeto en riesgo de (o propenso a) una enfermedad o un trastorno provocado, en su totalidad o en parte, por proteína Flt1 secretada. En un ejemplo, la enfermedad o el trastorno es una enfermedad o un trastorno hepático. En otro ejemplo, la enfermedad o el trastorno es una enfermedad o un trastorno renal. En un ejemplo, la enfermedad o el trastorno es una enfermedad o un trastorno placentario. En un ejemplo, la enfermedad o el trastorno es una enfermedad o un trastorno relacionado con el embarazo. En un ejemplo preferido, la enfermedad o el trastorno es un trastorno asociado con la expresión de proteína Flt1 soluble y en el que la expresión amplificada de la proteína Flt1 soluble conduce a manifestaciones clínicas de PE, PE posparto, eclampsia y/o HELLP.
“Tratamiento”, o “tratar”, tal como se usa en el presente documento, se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de ARN o vector o transgén que codifica para el mismo) a un paciente, o aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido o línea celular aislado a partir de un paciente, que tiene la enfermedad o el trastorno, un síntoma de la enfermedad o el trastorno o una predisposición hacia una enfermedad o un trastorno, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a la enfermedad o el trastorno, los síntomas de la enfermedad o el trastorno o la predisposición hacia la enfermedad.
También se describe en el presente documento un método para prevenir, en un sujeto, una enfermedad o un trastorno tal como se describió anteriormente, mediante la administración al sujeto de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de iARN o vector o transgén que codifica para el mismo). Los sujetos en riesgo de la enfermedad pueden identificarse, por ejemplo, mediante cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico tal como se describen en el presente documento. La administración de un agente profiláctico puede realizarse antes de la manifestación de síntomas característicos de la enfermedad o el trastorno, de tal manera que se previene la enfermedad o el trastorno o, alternativamente, se retrasa su progresión.
También se describen en el presente documento métodos de tratamiento de sujetos de manera terapéutica, es decir, alteración de la aparición de síntomas de la enfermedad o el trastorno. En un ejemplo, el método modulador implica poner en contacto una célula que expresa un mutante de ganancia de función con un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de iARN o vector o transgén que codifica para el mismo) que es específico para una o más secuencias diana dentro del gen (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 o cualquier combinación de las mismas), de tal manera que se logra una interferencia específica de secuencia con el gen. Estos métodos pueden realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto).
Con respecto a métodos de tratamiento tanto profilácticos como terapéuticos, tales tratamientos pueden ajustarse a medida o modificarse específicamente, basándose en el conocimiento obtenido a partir del campo de la farmacogenómica. “Farmacogenómica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la aplicación de tecnologías genómicas tales como secuenciación génica, genética estadística y análisis de la expresión génica a fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta a un fármaco (por ejemplo, el “fenotipo de respuesta a fármaco” o el “genotipo de respuesta a fármaco” de un paciente). Por tanto, también se describen en el presente documento métodos para ajustar a medida el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo o bien con las moléculas de gen diana tal como se describen en el presente documento o bien con moduladores de gen diana según el genotipo de respuesta a fármaco de ese individuo. La farmacogenómica permite que un médico o doctor ajuste a medida los tratamientos profilácticos o terapéuticos a pacientes que se beneficiarán más del tratamiento y evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios tóxicos relacionados con el fármaco.
Pueden someterse a prueba agentes terapéuticos en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, puede usarse un agente de iARN (o vector de expresión o transgén que codifica para el mismo) tal como se describe en el presente documento en un modelo animal para determinar la eficacia, la toxicidad o los efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Alternativamente, puede usarse un agente terapéutico en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de un agente de este tipo. Por ejemplo, puede usarse un agente en un modelo animal para determinar la eficacia, la toxicidad o los efectos secundarios del tratamiento con un agente de este tipo. Alternativamente, puede usarse un agente en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de un agente de este tipo.
Una composición farmacéutica que contiene un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede administrarse a cualquier paciente diagnosticado como que tiene o corre el riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con el embarazo, hígado y/o riñón, tal como PE y/o eclampsia. En una realización, al paciente se le diagnostica que tiene PE y/o eclampsia, y por lo demás el paciente tiene buena salud general. Por ejemplo, el paciente no tiene enfermedad terminal y es probable que el paciente viva al menos 2, 3, 5 o más años tras el diagnóstico. El paciente puede tratarse inmediatamente tras el diagnóstico o el tratamiento puede retrasarse hasta que el paciente experimenta más síntomas debilitantes, tales como dos o más síntomas de PE o uno o más síntomas de eclampsia. En otra realización, el paciente no ha alcanzado un estadio avanzado de la enfermedad. Un agente de silenciamiento de ARN modificado para potenciar la captación al interior de células neuronales puede administrarse a una dosis unitaria de menos de aproximadamente 1,4 mg por kg de peso corporal, o menos de 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 o 0,00001 mg por kg de peso corporal, y menos de 200 nmol de agente de ARN (por ejemplo, aproximadamente 4,4 x 1016 copias) por kg de peso corporal, o menos de 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075, 0,00015 nmol de agente de silenciamiento de ARN por kg de peso corporal. La dosis unitaria puede administrarse, por ejemplo, mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o intramuscular, intratecal o directamente al interior del cerebro), una dosis inhalada o una aplicación tópica. Las dosificaciones particularmente preferidas son de menos de 2, 1o 0,1 mg/kg de peso corporal.
La administración de un agente de silenciamiento de ARN directamente a un órgano (por ejemplo, directamente a la placenta, el hígado y/o los riñones) puede realizarse a una dosificación del orden de aproximadamente 0,00001 mg a aproximadamente 3 mg por órgano, o preferiblemente de aproximadamente 0,0001-0,001 mg por órgano, aproximadamente 0,03-3,0 mg por órgano, aproximadamente 0,1-3,0 mg por ojo o aproximadamente 0,3-3,0 mg por órgano. La dosificación puede ser una cantidad eficaz para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno relacionado con el hígado, riñón o embarazo, por ejemplo, PE, PE posparto, eclampsia y/o HELLP. En una realización, la dosis unitaria se administra con menor frecuencia que una vez al día, por ejemplo, menos de cada 2, 4, 8 o 30 días. En otra realización, la dosis unitaria no se administra con una frecuencia (por ejemplo, no con una frecuencia regular). Por ejemplo, la dosis unitaria puede administrarse una única vez. En una realización, la dosis eficaz se administra con otras modalidades terapéuticas tradicionales.
En una realización, a un sujeto se le va a administrar una dosis inicial y una o más dosis de mantenimiento de un agente de silenciamiento de ARN. La dosis o las dosis de mantenimiento son generalmente inferiores a la dosis inicial, por ejemplo, la mitad de la dosis inicial. Un régimen de mantenimiento puede incluir tratamiento del sujeto con una dosis o con dosis que oscilan entre 0,01 |ig y 1,4 mg/kg de peso corporal al día, por ejemplo, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 o 0,00001 mg por kg de peso corporal al día. Las dosis de mantenimiento se administran preferiblemente no más de una vez cada 5, 10 o 30 días. Además, el régimen de tratamiento puede durar un periodo de tiempo que variará dependiendo de la naturaleza de la enfermedad particular, su gravedad y el estado global del paciente. En realizaciones preferidas, la dosificación puede administrarse no más de una vez al día, por ejemplo, no más de una vez cada 24, 36, 48 o más horas, por ejemplo, no más de una vez cada 5 u 8 días. Tras el tratamiento, puede monitorizarse al paciente para detectar cambios en su estado y para detectar el alivio de los síntomas del estado patológico. La dosificación del compuesto puede o bien aumentarse en caso de que el paciente no responda significativamente a los niveles de dosificación actuales o bien puede reducirse la dosis si se observa un alivio de los síntomas del estado patológico, si se ha eliminado el estado patológico o si se observan efectos secundarios no deseados.
La dosis eficaz puede administrarse en una única dosis o en dos o más dosis, según se desee o se considere apropiado en las circunstancias específicas. Si se desea facilitar las infusiones repetidas o frecuentes, puede ser recomendable la implantación de un dispositivo de administración, por ejemplo, una bomba, una endoprótesis semipermanente (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular) o un depósito. En una realización, una composición farmacéutica incluye una pluralidad de especies de agente de silenciamiento de ARN. En otra realización, la especie de agente de silenciamiento de ARN tiene secuencias que no son solapantes y no son adyacentes a otra especie con respecto a una secuencia diana que se produce de manera natural. En otra realización, la pluralidad de especies de agente de silenciamiento de ARN es específica para diferentes genes diana que se producen de manera natural. En otra realización, el agente de silenciamiento de ARN es específico de alelo. En otra realización, la pluralidad de especies de agente de silenciamiento de ARN seleccionan como diana dos o más secuencias diana (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más secuencias diana).
Tras el tratamiento satisfactorio, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para prevenir la recidiva del estado patológico, en el que el compuesto de la invención se administra en dosis de mantenimiento que oscilan entre 0,01 |ig y 100 g por kg de peso corporal (véase la patente estadounidense n.° 6.107.094).
La concentración de la composición de agente de silenciamiento de ARN es una cantidad suficiente como para ser eficaz en el tratamiento o la prevención de un trastorno o para regular un estado fisiológico en seres humanos. La concentración o cantidad de agente de silenciamiento de ARN administrada dependerá de los parámetros determinados para el agente y del método de administración, por ejemplo, nasal, bucal o pulmonar. Por ejemplo, las formulaciones nasales tienden a requerir concentraciones muy inferiores de algunos componentes con el fin de evitar la irritación o el escozor de los conductos nasales. Algunas veces es deseable diluir una formulación oral hasta 10-100 veces con el fin de proporcionar una formulación nasal adecuada.
Determinados factores pueden influir en la dosificación requerida para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o el trastorno, tratamientos anteriores, la salud general y/o edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de silenciamiento de ARN puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. También se apreciará que la dosificación eficaz de un agente de silenciamiento de ARN para el tratamiento puede aumentar o disminuir a lo largo del transcurso de un tratamiento particular. Pueden producirse como resultado cambios en la dosificación y resultar evidentes a partir de los resultados de ensayos de diagnóstico tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, puede monitorizarse al sujeto tras administrar una composición de agente de silenciamiento de ARN. Basándose en la información a partir de la monitorización, puede administrarse una cantidad adicional de la composición de agente de silenciamiento de ARN.
La dosificación depende de la gravedad y del grado de respuesta del estado patológico que va a tratarse, durando el transcurso del tratamiento desde varios días hasta varios meses, o hasta que se produzca una cura o se logre una disminución del estado patológico. Pueden calcularse calendarios de dosificación óptimos a partir de mediciones de acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos habituales pueden determinar fácilmente dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de compuestos individuales y pueden estimarse generalmente basándose en las CE50 que se encuentra que son eficaces en modelos animales in vivo e in vitro. En algunas realizaciones, los modelos animales incluyen animales transgénicos que expresan un gen humano, por ejemplo, un gen que produce un ARN diana, por ejemplo, un ARN expresado en una célula del hígado, el riñón y/o la placenta. El animal transgénico puede ser deficiente para el ARN endógeno correspondiente. En otra realización, la composición para someter a prueba incluye un agente de silenciamiento de ARN que es complementario, al menos en una región interna, a una secuencia que se conserva entre el ARN diana en el modelo animal y el ARN diana en un ser humano.
VII. Composiciones farmacéuticas y métodos de administración
La invención se refiere a los agentes anteriormente descritos para su uso profiláctico y/o terapéutico tal como se describe a continuación. Por consiguiente, los moduladores (por ejemplo, agentes de iARN) de la presente invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Tales composiciones comprenden normalmente la molécula de ácido nucleico, la proteína, el anticuerpo o el compuesto modulador y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” incluya todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa (i.v.), intradérmica, subcutánea (s.c.), intraperitoneal, intramuscular, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica) y transmucosa. Las disoluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis fabricados de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de una dispersión o disoluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los componentes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío y secado por congelación, que produce un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración de los mismos.
Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse para dar comprimidos. Con el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, pastillas para chupar o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un portador fluido para su uso como colutorio, en las que el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se sorbe y se expectora o traga. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, las píldoras, las cápsulas, las pastillas para chupar y similares pueden contener cualquier de los siguientes componentes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta piperita, salicilato de metilo o aroma a naranja.
Para la administración mediante inhalación, los compuestos han de suministrarse en forma de una pulverización de aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera que va a permearse. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas tal como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para el suministro rectal. Los agentes de silenciamiento de ARN también pueden administrarse mediante transfección o infección usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los métodos descritos en McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (transfección hidrodinámica); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (suministro mediado por virus); o Putnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2), 151-160, fe de erratas en Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996).
Los agentes de silenciamiento de ARN también pueden administrarse mediante cualquier método adecuado para la administración de agentes de ácido nucleico, tal como una vacuna de ADN. Estos métodos incluyen cañones de genes, bioinyectores y parches cutáneos, así como métodos sin aguja tales como la tecnología de vacuna de ADN de micropartículas dada a conocer en la patente estadounidense n.° 6.194.389, y la vacunación sin aguja transdérmica de mamíferos con una vacuna en forma de polvo tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 6.168.587. Adicionalmente, es posible el suministro intranasal, tal como se describe en, entre otros, Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10. También pueden usarse liposomas (por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.472.375) y microencapsulación. También pueden usarse sistemas de suministro de micropartículas dirigibles biodegradables (por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.471.996).
En una realización, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la rápida eliminación del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de tales formulaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) como portadores farmacéuticamente aceptables. Estas pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en una forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. Forma unitaria de dosificación, tal como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente independientes adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención se rige por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que va a conseguirse, y las limitaciones inherentes en la técnica de formulación magistral de un compuesto activo de este tipo para el tratamiento de individuos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que muestran índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado a la hora de diseñar un sistema de suministro que dirija tales compuestos al sitio de tejido afectado con el fin de minimizar el posible daño a células no afectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CE50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue una respuesta semimáxima) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con más precisión dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones opcionales para su administración.
Tal como se define en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de silenciamiento de ARN (es decir, una dosificación eficaz) depende del agente de silenciamiento de ARN seleccionado. Por ejemplo, si se selecciona un plásmido que codifica para ARNhc, pueden administrarse cantidades de dosis única en el intervalo de aproximadamente 1 |ig a 1000 mg; en algunas realizaciones, pueden administrarse 10, 30, 100 o 1000 |ig. En algunas realizaciones, pueden administrarse 1-5 g de las composiciones. Las composiciones pueden administrarse desde una o más veces al día hasta una o más veces a la semana; incluyendo una vez cada dos días. El experto en la técnica apreciará que determinados factores pueden influir en la dosificación y programación temporal requeridas para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o el trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, un polipéptido o un anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden insertarse en constructos de expresión, por ejemplo, vectores virales, vectores retrovirales, casetes de expresión o vectores virales plasmídicos, por ejemplo, usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en Xia et al., (2002), citado anteriormente. Los constructos de expresión pueden suministrarse a un sujeto, por ejemplo, mediante inhalación, por vía oral, inyección intravenosa, administración local (véase la patente estadounidense n.° 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de suministro puede incluir el vector en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se incrusta el vehículo de suministro. Alternativamente, cuando el vector de suministro completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro génico.
También se describen en el presente documento ARN de horquilla corta (ARNhc) y constructos de expresión modificados por ingeniería para expresar los ARNhc. La transcripción de los ARNhc se inicia en un promotor de polimerasa III (pol III), y se cree que se termina en la posición 2 de un sitio de terminación de transcripción 4-5-timina. Tras la expresión, se cree que los ARNhc se pliegan para dar una estructura de tallo-bucle con proyecciones UU en 3'; posteriormente, se procesan los extremos de estos ARNhc, convirtiendo los ARNhc en moléculas de tipo ARNip de aproximadamente 21 nucleótidos. Brummelkamp et al. (2002), Science, 296, 550-553; Lee et al, (2002). citado anteriormente; Miyagishi y Taira (2002), Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison et al. (2002), citado anteriormente; Paul (2002), citado anteriormente; Sui (2002) citado anteriormente; Yu et al. (2002), citado anteriormente.
Los constructos de expresión pueden ser cualquier constructo adecuado para su uso en el sistema de expresión apropiado e incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, casetes de expresión lineales, plásmidos y vectores virales o derivados de virus, tal como se conocen en la técnica. Tales constructos de expresión pueden incluir uno o más promotores inducibles, sistemas promotores de Pol III de ARN tales como promotores de ARNnp U6 o promotores de polimerasa III de ARN HI, u otros promotores conocidos en la técnica. Los constructos pueden incluir una o ambas cadenas del ARNip. Los constructos de expresión que expresan ambas cadenas también pueden incluir estructuras de bucle que unen ambas cadenas, o cada cadena puede transcribirse por separado a partir de promotores independientes dentro del mismo constructo. Cada cadena también puede transcribirse a partir de un constructo de expresión independiente, Tuschl (2002), citado anteriormente.
La vía de suministro puede depender del trastorno del paciente. En determinadas realizaciones a modo de ejemplo, a un sujeto diagnosticado con PE, PE posparto, eclampsia y/o HELLP puede administrársele un agente de silenciamiento de ARN anti-sFltl de la invención mediante administración i.v. o s.c. Además de un agente de silenciamiento de ARN de la invención, a un paciente puede administrársele una segunda terapia, por ejemplo, una terapia paliativa y/o terapia específica de enfermedad. La terapia secundaria puede ser, por ejemplo, sintomática (por ejemplo, para aliviar los síntomas), protectora (por ejemplo, para ralentizar o detener la progresión de la enfermedad) o reconstituyente (por ejemplo, para revertir el proceso de la enfermedad). Para el tratamiento de PE, PE posparto, eclampsia y/o HELLP, por ejemplo, las terapias sintomáticas pueden incluir además los fármacos atenolol, hidralazina, labetalol, sulfato de magnesio, metildopa, nicardipina, nifedipina, nitroprusiato de sodio y similares.
En general, un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede administrarse mediante cualquier método adecuado. Tal como se usa en el presente documento, suministro tópico puede referirse a la aplicación directa de un agente de silenciamiento de ARN a cualquier superficie del cuerpo, incluyendo el ojo, una membrana mucosa, superficies de una cavidad corporal o a cualquier superficie interna. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, pulverizaciones y líquidos. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos, bases acuosas, de polvo u oleosas, espesantes y similares convencionales. La administración tópica también puede usarse como medio para suministrar selectivamente el agente de silenciamiento de ARN a la epidermis o dermis de un sujeto, o a estratos específicos de las mismas, o a un tejido subyacente.
Las composiciones para administración intratecal o intraventricular pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Las composiciones para administración intratecal o intraventricular no incluyen preferiblemente ningún reactivo de transfección ni ningún resto lipófilo adicional además de, por ejemplo, el resto lipófilo unido al agente de silenciamiento de ARN.
Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. La inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un reservorio. Para el uso intravenoso, la concentración total de solutos debe controlarse para hacer que la preparación sea isotónica.
Un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede administrarse a un sujeto mediante suministro pulmonar. Las composiciones para suministro pulmonar pueden suministrarse mediante inhalación de una dispersión de modo que la composición dentro de la dispersión pueda llegar al pulmón donde puede absorberse fácilmente a través de la región alveolar directamente hacia la circulación sanguínea. El suministro pulmonar puede ser eficaz tanto para el suministro sistémico como para el suministro localizado para tratar enfermedades de los pulmones.
El suministro pulmonar puede conseguirse mediante diferentes enfoques, incluyendo el uso de formulaciones nebulizadas, aerosolizadas, micelulares y a base de polvo seco. El suministro puede conseguirse con nebulizadores líquidos, inhaladores basados en aerosol y dispositivos de dispersión de polvo seco. Se prefieren los dispositivos dosificadores. Uno de los beneficios de usar un atomizador o inhalador es que se minimiza la posible contaminación porque los dispositivos son independientes. Los dispositivos de dispersión de polvo seco, por ejemplo, suministran fármacos que pueden formularse fácilmente como polvos secos. Una composición de agente de silenciamiento de ARN puede almacenarse de manera estable como polvos liofilizados o secados por pulverización por sí misma o en combinación con portadores de polvo adecuados. El suministro de una composición para inhalación puede medirse mediante un elemento de programación de la administración de dosis que puede incluir un temporizador, un contador de dosis, un dispositivo de medición del tiempo o un indicador de tiempo que, cuando se incorporan en el dispositivo, permite el seguimiento de la dosis, la monitorización del cumplimiento y/o la activación de la dosis a un paciente durante la administración del medicamento de aerosol.
Los tipos de excipientes farmacéuticos que son útiles como portadores incluyen estabilizadores tales como albúmina sérica humana (HSA), agentes de carga tales como hidratos de carbono, aminoácidos y polipéptidos; reguladores del pH o tampones; sales tales como cloruro de sodio; y similares. Estos portadores pueden estar en forma cristalina o amorfa, o pueden ser una mezcla de las dos.
Los agentes de carga que son particularmente valiosos incluyen hidratos de carbono, polipéptidos, aminoácidos o combinaciones de los mismos compatibles. Los hidratos de carbono adecuados incluyen monosacáridos tales como galactosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos tales como lactosa, trehalosa y similares; ciclodextrinas tales como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina; y polisacáridos tales como rafinosa, maltodextrinas, dextranos y similares; alditoles tales como manitol, xilitol y similares. Un grupo preferido de hidratos de carbono incluye lactosa, trehalosa, rafinosa maltodextrinas y manitol. Los polipéptidos adecuados incluyen aspartamo. Los aminoácidos incluyen alanina y glicina, prefiriéndose la glicina.
Los reguladores del pH o tampones adecuados incluyen sales orgánicas preparadas a partir de ácidos y bases orgánicos, tales como citrato de sodio, ascorbato de sodio y similares; se prefiere el citrato de sodio.
Un agente de silenciamiento de ARN de la invención puede administrarse mediante suministro oral y nasal. Por ejemplo, los fármacos administrados a través de estas membranas tienen un inicio de acción rápido, proporcionan niveles terapéuticos en plasma, evitan el efecto de primer paso del metabolismo hepático y evitan la exposición del fármaco al entorno gastrointestinal (GI) hostil. Las ventajas adicionales incluyen el fácil acceso a los sitios de membrana, de modo que el fármaco puede aplicarse, localizarse y retirarse fácilmente. En una realización, un agente de silenciamiento de ARN administrado mediante suministro oral o nasal se ha modificado para poder atravesar la barrera hematoencefálica.
En una realización, se dispensan dosis unitarias o dosis medidas de una composición que incluye agentes de silenciamiento de ARN mediante un dispositivo implantado. El dispositivo puede incluir un sensor que monitoriza un parámetro dentro de un sujeto. Por ejemplo, el dispositivo puede incluir una bomba, tal como una bomba osmótica, y, opcionalmente, electrónica asociada.
Un agente de silenciamiento de ARN puede empaquetarse en una cápside natural viral o en una cápside artificial producida química o enzimáticamente, o una estructura derivada a partir de las mismas.
VIII. Kits
También se describen en el presente documento kits que incluyen un recipiente adecuado que contiene una formulación farmacéutica de un agente de silenciamiento de ARN, por ejemplo, un agente de silenciamiento de ARN bicatenario, o un agente de ARNp, (por ejemplo, un precursor, por ejemplo, un agente de silenciamiento de ARN más grande que pueden procesarse para dar un agente de ARNp, o un ADN que codifica para un agente de silenciamiento de ARN, por ejemplo, un agente de silenciamiento de ARN bicatenario, o un agente de ARNp, o un precursor de los mismos). En determinados ejemplos, los componentes individuales de la formulación farmacéutica pueden proporcionarse en un recipiente. Alternativamente, puede ser deseable proporcionar los componentes de la formulación farmacéutica por separado en dos o más recipientes, por ejemplo, un recipiente para una preparación de agente de silenciamiento de ARN y al menos otro para un compuesto portador. El kit puede envasarse en varias configuraciones diferentes, tales como uno o más recipientes en una única caja. Los diferentes componentes pueden combinarse, por ejemplo, según las instrucciones proporcionadas con el kit. Los componentes pueden combinarse según un método descrito en el presente documento, por ejemplo, para preparar y administrar una composición farmacéutica. El kit también puede incluir un dispositivo de suministro.
Ejemplos
Ejemplo 1. Antecedentes y significación de la preeclampsia (PE)
Las abrumadoras evidencias a partir de estudios epidemiológicos y experimentales ahora indican que la PE está provocada por niveles elevados de proteínas “señuelo solubles” (FLT1 soluble (sFLT1)) del gen Flt1 (VEGFR1) en el torrente sanguíneo de la madre (Young, B.C., Levine, R.J. y Karumanchi, S.A. Pathogenesis of preeclampsia. Annual review of pathology 5, 173-192 (2010); Maynard, S.E. et al. Excess placental soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endothelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia. The Journal of clinical investigation 111, 649-658 (2003); Levine, R.J. et al. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia. The New England journal of medicine 350, 672-683 (2004); Heydarian, M. et al. Novel splice variants of sFlt1 are upregulated in preeclampsia. Placenta 30, 250-255 (2009)). FLT1 es un receptor tirosina cinasa (RTK) expresado predominantemente en la placenta. Un mecanismo general para la modulación de RTK es la producción de formas secretadas truncadas del receptor que actúan como reguladores negativos dominantes de la ruta de señalización global (figura 1A). El secuestro de ligando por tales señuelos solubles inhibe la señalización intracelular mediante el receptor de longitud completa, desensibilizando de ese modo el sistema a la concentración de ligando (Vorlova, S. et al. Induction of antagonistic soluble decoy receptor tyrosine kinases by intronic polyA activation. Molecular cell 43, 927-939 (2011).). En el caso de FLT1, los señuelos solubles se expresan a partir de ARNm truncados generados mediante poliadenilación dentro de dos intrones (i13 e i15) aguas arriba de los exones que codifican para los dominios transmembrana (TM) y cinasa de fl-FLT1 (figura 1B).
En mamíferos, FLT1 se expresa predominantemente en la placenta, siendo los niveles de ARNm de FLt1 placentaria humana 10-100 veces superiores a los observados en otros tejidos adultos (Cerdeira, A.S. y Karumanchi, S.A. Angiogenic factors in preeclampsia y related disorders. Cold Spring Harbor perspectives in medicine 2 (2012)). Mientras que la isoforma de longitud completa predomina en todos los tejidos en mujeres adultas no embarazadas (Id.), la expresión placentaria está dominada por tres isoformas truncadas, sFLT1-i13 corta, sFLT1-i13 larga y sFlt1-i15a, que codifican todas ellas para proteínas sFLT1 (figura 1B). Este mismo patrón de alto contenido de FLt1 en la placenta y baja expresión en otros tejidos de adultas no embarazadas se observa en roedores. Sin embargo, dado que los roedores carecen del sitio de poliadenilación del intrón 14, sólo expresan una única forma de señuelo soluble: sFlt1-i13. En PE, tanto los ARNm de FLt1 de longitud completa (fl-Flt1) como los truncados se acumulan a mayores niveles en la placenta que en embarazos normales, siendo las isoformas truncadas incluso más pronunciadas (figura 1B). Estos cambios a nivel de ARNm probablemente explican el aumento significativo de las proteínas sFLT1 en el torrente sanguíneo materno durante la PE.
1.1 Aplicabilidad de los ARNip para el tratamiento de PE
Se diseñaron productos terapéuticos basados en ARNip para el tratamiento de PE. Los datos tanto preclínicos como clínicos respaldan la disminución de sFLT1 como una estrategia terapéutica válida para prolongar los embarazos con PE (Thadhani, R. et al. Pilot study of extracorporeal removal of soluble fms-like tyrosine kinase 1 in preeclampsia. Circulation 124, 940-950 (2011)). Además, la única región específica para cada proteína sFLT1 es muy pequeña, con tan sólo algunos aminoácidos únicos añadidos a cada extremo C-terminal. Este pequeño tamaño de la diana dificulta el desarrollo de fármacos convencionales (por ejemplo, moléculas pequeñas y anticuerpos) que seleccionan como diana únicamente sFLTI y no fl-FLT1. Por otro lado, la ventana diana a nivel de ARN es mucho más grande, teniendo las isotermas de ARNm i13 e i15 435 y 567 bases únicas, respectivamente, no estando presente ninguna de ellas en el ARNm de fl-Flt1. Dado que la iARN requiere un tamaño de diana de tan sólo 19-22 nucleótidos, se determinó que este era un espacio nucleotídico más que suficiente en el que diseñar múltiples ARNip selectivos de isoforma. Desde una perspectiva clínica, la posibilidad de que una única dosis administrada por vía subcutánea sea suficiente para prevenir la expresión descontrolada de sFLT1 durante varias semanas podría hacer que el tratamiento sea sencillo y asequible.
Los novedosos oligonucleótidos químicamente modificados conocidos como ARNip hidrófobamente modificados (ARNiph) de autoadministración (figura 2A) podrían proporcionar la ventaja más significativa para un producto terapéutico rentable. Aunque su coste real de síntesis química ($200 por gramo, con aproximadamente $20 por dosis a niveles de dosis de 1 mg/kg) es relativamente alto, se espera que el precio disminuya drásticamente (10-50 veces) con un aumento de escala a nivel de kg. Además, los ARNiph pueden sintetizarse completamente usando química de soporte sólido en menos de 10 horas. Al igual que otros oligonucleótidos, los ARNiph secos son altamente estables, pueden almacenarse durante mucho tiempo (es decir, años) a temperatura ambiental y pueden disolverse justo antes de la inyección. Además, la semivida de los ARNiph in vivo tiene una duración suficiente para que una única dosis intravenosa sea adecuada para una inhibición de dos a seis semanas de la producción de sFLt1.
Los ONT que neutralizan a sFlt1 descritos en el presente documento son la primera novedosa terapia contra la preeclampsia basada en una comprensión del mecanismo de la enfermedad, y podría administrarse de manera rentable y fácil en todo el mundo.
1.2 Perfil de dianas de producto piloto para el tratamiento de PE basado en iARN.
La tabla en la figura 14 resume la visión actual sobre los perfiles de productos diana aceptables e ideales según realizaciones preferidas. A continuación se comentan consideraciones especiales para desarrollar un tratamiento basado en iARN para la PE.
1.3 Múltiples isoformas de ARNm de sFlt1
Al realizar la secuenciación del sitio de poliadenilación (PAS-Seq (Heyer, E.E., Ozadam, H., Ricci, E.P., Cenik, C. y Moore, M.J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Res 43, e2 (2015))) en ARN total a partir de múltiples placentas normales y con PE, se determinó que las placentas con PE sobreexpresan las variantes de sFLT1 i13 e i15, siendo i15 la responsable del 55% de las lecturas e i13 la responsable de aproximadamente el 45% de las lecturas (figura 1C). Sin pretender restringirse a una teoría científica, la variabilidad intrínseca en las razones de isoformas en muestras diferentes indica que seleccionar como diana ambas isoformas podría ser la mejor opción para cubrir la mayoría de los pacientes con PE. Por tanto, el producto farmacológico candidato se definió como una mezcla equimolar de dos ARNiph: uno que selecciona como diana sFLT1-i13, tanto corta como larga, y otro que selecciona como diana sFlt1-i15a (figura 3). La FDA ya ha permitido que una mezcla de ARNip se defina como una entidad farmacológica individual cuando los ARNip componentes se formulan o modifican químicamente de manera idéntica y sus perfiles de PK/PD son muy similares (por ejemplo, formulaciones de múltiples ARNip que seleccionan como diana VEGF-A/KSP (Tabernero, J. et al. First-in-humans trial of an RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement. Cancer discovery 3, 406-417 (2013)); VHB (Wooddell, C.I. et al. Hepatocyte-targeted RNAi Therapeutics for the Treatment of Chronic Hepatitis B Virus Infection. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 973-985 (2013)), Arrowhead, etc.). Aunque el uso de una mezcla añade complejidad a la CMC (Química, Fabricación y Controles), esto se ve compensado por la ventaja de que la mezcla permitirá el tratamiento de poblaciones con PE más amplias independientemente de las razones de sobreexpresión de las variantes de isoforma. En determinadas realizaciones, una mezcla de dos candidatos se administra por vía subcutánea (s.c.) en solución salina como excipiente.
En determinadas realizaciones, el nivel deseado de silenciamiento de sFLT1 es sólo del 30-40%, ya que un mayor grado de silenciamiento podría ser desventajoso. Los datos preliminares indicaron que una dosis de 10-20 mg/kg produjo un silenciamiento > 50% en ratones, por lo que puede lograrse un menor silenciamiento simplemente con una administración de dosis menor. Dado que el perfil de producto deseado es una única inyección, sin embargo, podrían requerirse mayores dosis para prolongar la duración del efecto. Por tanto, en determinadas realizaciones, i13 o i15 puede usarse sola como candidato clínico.
1.4 Consideraciones globales de seguridad y toxicidad.
La toxicidad relacionada con ONT puede deberse a los efectos específicos de la diana (por ejemplo, demasiado silenciamiento de las isoformas de sFlt1), efectos independientes de la diana (es decir, silenciamiento accidental de ARNm que no son diana) o acontecimientos específicos de la química relacionados con la clase. La capacidad para seleccionar como diana las variantes i13 e i15 por separado reduce drásticamente las posibilidades de cualquier toxicidad importante relacionada con la diana. Además, las variantes i13 e i15 son específicas de la placenta y del embarazo, con una expresión baja o no detectable en otros tejidos adultos. Por tanto, la toxicidad clínicamente limitante probablemente sea independiente de la diana. Estos tipos de efectos incluyen el direccionamiento inespecífico del ARNip, la inducción basada en ARN de la respuesta inmunitaria innata y la toxicidad general relacionada con el modo de suministro elegido (por ejemplo, modificaciones hidrófobas en combinación con fosforotioatos). Se empleó la bioinformática más avanzada por adelantado para optimizar el diseño de oligonucleótidos para minimizar posibles acontecimientos inespecíficos (Uchida, S. et al. An integrated approach for the systematic identification and characterization of heart-enriched genes with unknown functions. BMC genomics 10, 100 (2009)). Además, todas las ribosas en la secuencia líder (es decir, los nucleótidos 2-8 de la cadena guía) estaban modificadas con 2'-F y 2'-O-metilo, modificaciones que por sí mismas están bien establecidas para minimizar los acontecimientos inespecíficos (Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduce “off-target” transcript silencing. Rna 12, 1197-1205 (2006)). Aunque la evaluación de las firmas de direccionamiento inespecífico podría establecerse in vitro y en muestras de ratón usando perfilado de microalineamientos (Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduce “off-target” transcript silencing. Rna 12, 1197-1205 (2006); Anderson, E., Boese, Q., Khvorova, A. y Karpilow, J. Identifying siRNA-induced off-targets by microarray analysis. Methods in molecular biology 442, 45-63 (2008); Anderson, E.M. et al. Experimental validation ofthe importance of seed complement frequency to siRNA specificity. Rna 14, 853-861 (2008); Birmingham, A. et al. 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Métodos 3, 199-204 (2006); Fedorov, Y. et al. Off-target effects by siRNA can induce toxic fenotype. Rna 12, 1188­ 1196 (2006)), debido a que la superposición entre firmas de direccionamiento inespecífico de ARNip en seres humanos y modelos de cultivo tisular/animales es generalmente mínima (Burchard, J. et al. MicroRNA-like off-target transcript regulation by siRNAs is species specific. Rna 15, 308-315 (2009)), el valor de tales estudios es cuestionable. Para cada isoforma de sFLT1, se seleccionaron dos secuencias diferentes para la evaluación in vivo (una líder y una de apoyo) (figura 3). Si la líder falla debido a toxicidad inducida por direccionamiento inespecífico, la segunda secuencia se usará como apoyo (Jackson, A.L. y Linsley, P.S. Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application. Nature reviews. Drug discovery 9, 57-67 (2010)). Como actualmente no existe ninguna guía formal específica para los productos terapéuticos de ARNip, se seguirá la recomendación convencional para el desarrollo de NCE (nuevas entidades químicas), incluyendo la demostración de la seguridad en dos modelos animales (Hughes M, I.J., Kurtz A, et al. (ed. C.N. Sittampalam GS, Nelson H, et al., editores) (Eli Lilly & Company y Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, Bethesda (MD); 2012)).
Los compuestos líder se modificaron químicamente por completo (lo que significa que no quedaba ribosas sin modificar) usando un patrón alternante de 2'-O-metilo/2'-F. Se sabe que la combinación 2'-OMe/2'-F bloquea la activación de la respuesta inmunitaria innata (Nair, J.K. et al. Multivalent N-Acetylgalactosamine-Conjugated siRNA Localizes in Hepatocytes and Elicits Robust RNAi-Mediated Gene Silencing. Journal of the American Chemical Society (2014)). La ausencia de activación de la ruta del interferón se confirma con un ensayo de activación de citocinas en sangre completa humana in vitro que analiza IL-1 p, IL-1RA, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12(p70), IP-10, G-CSF, IFN-y, MCP-1, MIP-1a, MIP-1 p y TNF-a (Bio-Plex Pro Magnetic Cytokine Assay; BioRad Laboratories) e in vivo (después de la inyección en ratones) que analiza G-CSF, TNF, iL-6, IP-10, KC y MCP-1 (Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel; Millipore) (Kumar, V. et al. Shielding of Lipid Nanoparticles for siRNA Delivery: Impact on Physicochemical Properties, Cytokine Induction, and Efficacy. Molecular therapy. Nucleic Acids 3, e210 (2014)).
Sin pretender restringirse a una teoría científica, basándose en los datos a partir de otras químicas de oligonucleótidos (Wooddell, C.I. et al. Hepatocyte-targeted RNAi Therapeutics for the Treatment of Chronic Hepatitis B Virus Infection. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 973-985 (2013); Coelho, T. et al. Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretin amyloidosis. The New England journal of medicine 369, 819-829 (2013)), la toxicidad limitante de la dosis probablemente estará relacionada con la función hepática. Los estudios preliminares determinaron que hasta el 50% de la dosis inyectada del ARNiph se acumulaba en el hígado, siendo el suministro específico para células endoteliales, de Kupffer y estrelladas, no para hepatocitos (figura 4A). Con otros oligonucleótidos que contienen fosforotioato, como efectos secundarios se han observado una ligera elevación reversible de las enzimas hepáticas y leves reacciones secundarias reversibles a la inyección (Frazier, K.S. Antisense Oligonucleotide Therapies: The Promise and the Challenges from a Toxicologic Pathologist's Perspective. Toxicologic pathology 43, 78-89 (2015)), pero habitualmente esta elevación de enzimas hepáticas sólo se observa después de una administración de dosis continua a largo plazo con altos niveles de dosis. Debido a que este tratamiento es necesariamente a corto plazo (sólo una o dos inyecciones a lo largo de un periodo de uno a dos meses) y no selecciona como diana los hepatocitos, la toxicidad hepática puede no ser un problema. No obstante, estas preocupaciones se estudiarán con detalle.
El desarrollo de cualquier producto terapéutico dirigido a mujeres embarazadas tiene consideraciones de seguridad adicionales. Una preocupación importante es la posible transferencia de ARNiph al feto y cualquier posible toxicidad que pueda provocar. En los estudios preliminares no se observó ninguna transferencia de oligonucleótidos detectable al feto usando microscopía fluorescente (figura 6A) o usando un ensayo cuantitativo basado en PNA (ácido nucleico peptídico) altamente sensible (figura 4B). Tampoco se observó ningún efecto sobre el crecimiento del feto, el número de abortos espontáneos, la histología placentaria u otros efectos teratogénicos.
1.5 Sistemas de ensayo establecidos para evaluar compuestos líder.
Los ensayos y modelos desarrollados hasta ahora son los siguientes.
Evaluación mediante microscopía de fluorescencia de la distribución tisular in situ
Se sintetizaron variantes de ARNiph con un colorante Cy3 o Cy5.5 (menor autofluorescencia) unido a través de un ligador no degradable al extremo 5' de la cadena sentido (pasajera). Este compuesto era biológicamente estable sin escisión de Cy3 detectable en el plazo de 24 horas. Se administró la cadena sentido fluorescente hibridada con su cadena guía complementaria (formando de ese modo un ARNiph bicatenario) a los animales y se examinaron los perfiles de distribución de oligonucleótidos en secciones de tejido de 4 |im también teñidas con DAPI o/y anticuerpos selectivos para el tipo de célula. Las secciones paralelas pudieron teñirse con marcadores histológicos convencionales, lo que permitió un mapeo histológico detallado. Dado que los ARNiph ya están muy hidrófobamente modificados, la adición de colorante tiene poco efecto sobre la hidrofobicidad global y, por tanto, un impacto mínimo sobre la distribución de oligonucleótidos. Este ensayo permitió una rápida evaluación de la distribución tisular y de los tipos de célula y se complementó mediante un ensayo cuantitativo basado en PNA para la detección directa de la cadena guía.
Hibridación de PNA para la detección cuantitativa de la cadena guía en lisados tisulares
Para permitir la cuantificación directa del soporte guía intacto en tejidos, se desarrolló e implementó un novedoso ensayo en el que la cadena guía se hibridó con un oligonucleótido de PNA (ácido nucleico peptídico) marcado con Cy3 completamente complementario, y el dúplex correspondiente se separó del PNA monocatenario en exceso mediante HPLC (figura 2). Puesto que el PNA no está cargado y tiene una unión extremadamente estrecha a la cadena guía, supera tanto a la cadena sentido del ARNiph como a cualquier secuencia diana endógena. La detección por fluorescencia del híbrido Cy3-PNA:guía proporcionó una medida directa de la abundancia de cadena guía en lisados tisulares. Junto con un inyector automático de HPLC, este ensayo permitió la cuantificación de la cadena guía en cientos de muestras durante la noche. El ensayo también fue altamente sensible, con un límite de detección inferior a 10 fmol/gramo, y los híbridos que contienen cadena guía de longitud completa, parcialmente degradada, 5'-fosforilada y 5'-desfosforilada pueden cuantificarse todos ellos como picos u hombros separados en el registro gráfico de HPLC. Dado que este ensayo pudo detectar tanto compuestos marcados como no marcados, puede pasar directamente a futuras CRO para el análisis de muestras clínicas.
Ensayo QuantiGene® (Affymetrix) para la detección directa de variantes de ARNm de Flt1 en células y tejidos QuantiGene® es un ensayo basado en 96 pocillos altamente sensible en el que el ARNm se detecta directamente a través de la amplificación de señales directamente a partir de lisados tisulares y/o celulares. Al acoplar este ensayo de detección directa a un dispositivo TissueLyser automático de 192 pocillos, se desarrolló una versión de alto rendimiento que permitió el procesamiento de docenas de muestras por animal. Por tanto, se generaron datos cuantitativos sobre la expresión de genes seleccionados como diana y de mantenimiento en muchos animales a la vez. En estudios piloto, n=8 fue suficiente para detectar una modulación del 40% de la expresión de isoformas de ARNm de sFlt1 con una confianza del 80%. Los ensayos bDNA se describen en Coles et al. Nucleic Acid Ther. (2015) 23 de noviembre. PMID: 26595721.
ELISA (#MVR100, R&D systems) para la detección de proteínas sFLT1 en sangre y medios acondicionados Este ensayo basado en 96 pocillos requirió sólo 10 |il de líquido biológico por muestra. Este ensayo se ha optimizado a lo largo de muchos años tanto para estudios in vitro como in vivo. Es clínicamente compatible y permite la evaluación de niveles de proteína sFLT1 circulante sin el sacrificio del animal, y será particularmente útil para estudios en primates no humanos.
Modelo de embarazo de ratón normal
Las variantes sFlt1-i13 se expresan durante el embarazo del ratón, aumentando los niveles de i13 exponencialmente a partir de los días 14-19. La perfecta homología entre el compuesto sFLT1-i13-2283 y la variante de ratón i13 permite tanto el estudio de la eficacia como de la seguridad en este modelo de roedor sencillo.
Modelos de preeclampsia
Se usan el modelo de presión de perfusión uterina reducida (PPUR) de isquemia placentaria y el modelo de hipoxia de preeclampsia tal como se describe más adelante.
Modelo de embarazo de babuino silvestre
La variante sFlt1-i15a no se expresa en roedores durante el embarazo, por tanto se evaluarán la eficacia y seguridad de combinación global en babuinos preñados silvestres usando ELISA, un ensayo no invasivo como lectura de la eficacia.
Datos preliminares
Se desarrolló un producto terapéutico para la PE sencillo y rentable usando iARN para limitar la expresión placentaria en exceso de proteínas sFLT1. Para este trabajo, se lograron los siguientes objetivos: (1) se identificaron sitios de direccionamiento de ARNip apropiados en ARNm de sFlt1; (2) se determinó si era posible el silenciamiento de ARN en la placenta usando suministro generalizado (es decir, intravenoso o subcutáneo); y (3) se desarrollaron novedosas químicas de ARNip que permitirían el suministro preferencial a trofoblastos placentarios, el tipo de célula responsable de la producción de sFLT1 en exceso.
Usando datos de RNA-Seq específico de tejido disponibles del Atlas de proteínas humanas (véase proteinatlas [dot] org) y datos de PAS-Seq de múltiples placentas humanas normales y con PE (figuras 1B-C), se determinó que, aunque la isoforma de longitud completa (fl) predomina en todos los tejidos en humanas adultas no preñadas, la expresión placentaria está dominada por tres isoformas truncadas, sFlt1-i13-corta, sFlt1-i13-larga y sFlt1-i15a, generadas mediante poliadenilación dentro de los intrones 13 y 15, respectivamente. Seleccionar como diana las regiones intrónicas con ARNiph permitió el silenciamiento selectivo de las isoformas truncadas sin interferir con la abundancia de ARNm de fl-Flt1.
Se desarrolló un novedoso tipo de química de ARNip que permitió el suministro eficiente a células endoteliales y demostró un tráfico selectivo a la región del laberinto de la placenta (es decir, a los trofoblastos, el tipo de célula responsable de la expresión de sFLT1). Sin ninguna formulación adicional, hasta el 12% de la dosis inyectada se acumuló en la placenta sin trasferencia al feto detectable. Esta tecnología es la primera demostración de selección como diana selectiva del laberinto mediante cualquier ONT, lo que permite el silenciamiento de la proteína sFLT1 en su sitio principal de expresión (figura 6A).
Se diseñaron y examinaron más de 50 variantes de ARNip (véase la figura 13). Se identificaron ARNiph hiperfuncionales, modificados químicamente por completo, que seleccionaron como diana selectivamente las isoformas i13 e i15 sin interferir con la expresión de fl-FLT1 (figura 3). Usando estos ARNiph, se demostró el silenciamiento eficiente de i13 e i15 en trofoblastos humanos primarios sin formulación activa (es decir, internalización/captación químicamente no asistida sin la necesidad de lípido) (figura 2B). Se seleccionó una combinación de ARNiph de sFLT1-i13-2283 y sFLT-i15a-2519 como candidato líder para el tratamiento de PE (figura 3).
Se determinó que las concentraciones de compuesto en tejido en ratones preñados podían alcanzar 100 ^g/gramo con una única inyección subcutánea (s.c.) o intravenosa (i.v.), produciendo una reducción de más del 50-80% en el ARNm de sFlt1-i13 (figuras 6 y 4, respectivamente). Sin pretender restringirse a una teoría científica, con este nivel de suministro, se espera que el silenciamiento persista durante semanas en seres humanos y, por tanto, que sea necesario un número limitado de inyecciones. De hecho, sólo una inyección s.c. podría ser suficiente para silenciar sFLT1 durante varias semanas, dando como resultado una extensión significativa del embarazo con PE, posiblemente incluso hasta término.
Ejemplo 2. ARNip hidrófobamente modificados (ARNiph): híbridos ARNip modificado químicamente por completo/antisentido
Se consideraron un panel de químicas y formulaciones como posibles enfoques para el suministro a la placenta. Estas incluyeron LNA antisentido, LNP, chol-conjugados/DPC GalNac y ARNiph. Los ARNiph superaron con creces otras químicas en el suministro a la placenta (comentado adicionalmente más adelante) y se seleccionaron para su investigación adicional. Se evaluó la eficiencia de la captación de ARNiph en trofoblastos primarios. Se observó una captación eficiente por parte de todas las células tras la adición de compuesto marcado con Cy3 a los medios (figura 2B). Los ARNiph son compuestos asimétricos, con una región corta de dúplex (15 pares de bases) y una cola completamente fosforotioada monocatenaria, en la que todas las bases están completamente modificadas usando un patrón alternante de 2'-F/2'-O-metilo (que proporciona estabilización y evitación de la respuesta de PKR), y el extremo 3' de la cadena pasajera está conjugado con TEG-colesterol (figura 3A). El colesterol permitió una rápida asociación a la membrana, mientras que la cola fosforotioada monocatenaria era esencial para la internalización celular mediante un mecanismo similar al usado por los oligonucleótidos antisentido convencionales (D. M. Navaroli, J.C., L. Pandarinathan, K. Fogarty, C., Standley, L.L., K. Bellve, M. Prot, A. Khvorova y Corvera, S. Self-delivering therapeutic siRNA internalization through a distinct class of early endosomes. PNAS, en revisión, segunda nueva presentación (2015)). La adición de ARNiph marcado con Cy3 a cualquier tipo de célula cultivada muestra una internalización rápida y eficiente a través de una parte relacionada con EE1 de la ruta de endocitosis. Una versión previa de esta tecnología (Byrne, M. et al. Novel Hydrophobically Modified Asymmetric RNAi Compounds (sd-rxRNA) Demonstrate Robust Efficacy in the Eye. Journal of ocular pharmacology and therapeutics: the official journal ofthe Association for Ocular Pharmacology and Therapeutics (2013)), en la que únicamente el 50% de las bases están modificadas con 2'F/2'-O-metilo, se encuentra en ensayos clínicos de fase II para la fibrosis dérmica.
Se desarrolló un patrón de modificaciones químicas que no interfiere con la entrada primaria de RISC. Se generó una amplia gama de variaciones químicas y se identificó un patrón alternante de 2'F/2'-O-metilo que configura de manera óptima la cadena guía para adoptar una geometría que imita de cerca la de una cadena individual en un dúplex de ARN con forma de A. El complejo RISC reconoce al dúplex de ARN con forma de A y respalda el posicionamiento apropiado del ARNm diana dentro del sitio de escisión (Ameres, S.L., Martinez, J. y Schroeder, R. Molecular basis for target RNA recognition and cleavage by human RISC. Cell 130, 101-112 (2007); Schirle, N.T., Sheu-Gruttadauria, J. y MacRae, I.J. Gene regulation. Structural basis for microRNA targeting. Science 346, 608-613 (2014)). Al comenzar el patrón alternante con una 2'-O-metil-ribosa fosforilada en 5' (es necesario un fosfato en 5' para la interacción con el dominio PIWI), las modificaciones 2'-F se situaron en las posiciones de número par 2-14. Previamente se demostró que las posiciones 2 y 14 eran intolerantes a modificaciones de 2'-ribosa más voluminosas (Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces “off-target” transcript silencing. Rna 12, 1197-1205 (2006); Kenski, D.M. et al. siRNA-optimized Modifications for Enhanced In vivo Activity. Molecular therapy. Nucleic acids 1, e5 (2012)).
Estos compuestos estabilizados químicamente por completo fueron al menos tanto o más eficaces que el ARNip desnudo en la entrada de RISC y representan el primer patrón de modificaciones químicas completo sin ningún impacto negativo sobre la función de RISC. Este descubrimiento fue transformador para el proyecto de PE, ya que la estabilización química completa es absolutamente esencial para la acumulación de tejido tras la administración sistémica. La figura 8 muestra que no pudo detectarse ningún compuesto de longitud completa en placentas de ratón 24 horas tras la administración de una versión en la que el 40% de las ribosas aún tenían 2'-OH (química P0). En comparación, ambas versiones completamente modificadas con 2'-F/2'-O-metilo (químicas P1 y P2) se acumularon a niveles por encima de los terapéuticamente eficaces (figura 8). Otro beneficio de los ARNip que no contienen ARN es la facilidad de fabricación; su química similar a la del ADN sin la necesidad de protección ortogonal de la ribosa acorta los procedimientos de desprotección y aumenta las eficiencias de acoplamiento. Finalmente, la completa eliminación de todos los grupos 2'-Oh ayuda a evitar la respuesta inmunitaria innata, que se basa principalmente en interacciones de 2'-OH (Alexopoulou, L., Holt, A.C., Medzhitov, R. y Flavell, R.A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature 413, 732-738 (2001); Choe, J., Kelker, M.S. y Wilson, I.A. Crystal structure of human toll-like receptor 3 (TLR3) ectodomain. Science 309, 581-585 (2005)).
Se determinó que los FM-ARNiph eran más potentes en la captación pasiva que los ARNiph no completamente modificados en trofoblastos primarios (figura 31). Se determinó que la estabilización metabólica completa era esencial para el suministro sistémico tras la administración intravenosa (figura 32). También se determinó que los FM-ARNiph eran esenciales para el suministro sistémico tras la administración subcutánea (figura 33).
Se desarrolló un ensayo basado en PNA para cuantificar la distribución de la cadena guía in vivo (figura 34). Usando este ensayo, se observaron un suministro y una eficacia robustos para los tejidos del hígado y el riñón in vivo después de la administración de FM-ARNiph (figuras 35A-35F).
Se sometió a ensayo la estabilidad in vivo en tejidos del hígado después de la administración i.v. o s.c. a las 120 horas tras la administración i.v. y s.c. (figuras 18A-B). Se sometieron a ensayo los niveles de ARNiph in vivo a las dos horas, 24 horas y 120 horas tras la administración i.v. (figura 19).
Ejemplo 3. Los ARNiph permitieron el suministro selectivo a trofoblastos del laberinto placentario sin transferencia al feto detectable
Para evaluar la distribución de ARNiph in vivo, a ratones preñados normales (día 15) se les inyectó ARNiph de sFlti13-2283 marcado con Cy3 y se examinó la distribución mediante dos ensayos independientes. La microscopía de fluorescencia de tejidos gruesos reveló que la mayoría de los oligonucleótidos se acumularon en tres tejidos: el endotelio del hígado, el endotelio del riñón y el laberinto placentario (figura 4). Sin pretender restringirse a una teoría científica, lo más probablemente es que este perfil de distribución se definiera por una combinación de flujo sanguíneo/tasa de filtración y la concentración de receptor de colesterol en las superficies celulares. Usando el novedoso ensayo de hibridación de PNA conforme a la FDA descrito anteriormente, se demostró que la concentración global de fármaco en la placenta superó los niveles eficaces (aproximadamente 100 ng/gramo) en órdenes de magnitud tras una única inyección de 10 mg/kg (figura 8). Este nivel de suministro al tejido fue más o menos el mismo que para la administración i.v. y s.c., distribuyéndose aproximadamente el 50%, el 10% y el 12% del compuesto al hígado, el riñón y la placenta, respectivamente, 24 horas tras la inyección (figura 4). Curiosamente, sólo se aclaró del hígado la mitad de este (ligeramente más en el riñón) después de cinco días, lo que indica que una única administración puede ser suficiente para inducir silenciamiento a largo plazo.
La figura 7A muestra la distribución de oligonucleótidos en una sección sagital de 4 |iM cortada a través de un feto y su placenta adherida. Fue asombroso y altamente satisfactorio observar un suministro eficiente al laberinto placentario sin esencialmente ninguna transferencia de oligonucleótidos detectable al feto, incluyendo el hígado fetal. Estos datos se confirmaron independientemente mediante el ensayo de PNA que no pudo detectar ARNiph en el hígado fetal (figura 4B) (la sensibilidad del ensayo era de aproximadamente 10 fmol/gramo). La figura 5 representa el análisis histológico de la placenta y confirmó el suministro específico de ARNiph a trofoblastos del laberinto placentario, el principal tipo de célula responsable de la expresión de sFLT1. De manera notable, Cy3 prácticamente no fue detectable en otras capas (por ejemplo, de unión y caduca), lo que respalda además la especificidad de este novedoso patrón de modificaciones químicas para el suministro a los trofoblastos del laberinto. Además de comparar el impacto de una modificación completa con 2'-F/2'-O-metilo sobre la PK (farmacocinética), se alteró ligeramente el contenido de fosforotioato (PS). Aunque la química P1 tenía uniones PS en los extremos 3' de ambas cadenas (un total de 8), la química P2 incorporaba otros dos PS en el extremo 5' de cada cadena (un total de 12). Las uniones PS terminales proporcionaban una defensa contra las exonucleasas y, por tanto, son esenciales para la estabilidad a largo plazo en entornos de nucleasas extremamente agresivos. En general, estas dos químicas eran comparables en niveles de suministro de oligonucleótidos a las 24 horas (figura 8), pero pueden tener perfiles de degradación diferentes después de la exposición al tejido a largo plazo, lo que afecta a la duración del efecto de silenciamiento. También tienen razones de distribución hígado:placenta ligeramente diferentes, que también pueden verse algo afectadas por la vía de administración (figura 8).
3.1 Selección e identificación de candidato líder: mezcla de i13/i15 y eficacia en trofoblastos primarios
Las isoformas de ARNm de FLt1 i13 e i15 contenían 435 y 567 nucleótidos únicos, respectivamente, no presentes en el ARNm de fl-Flt1. Desafortunadamente, la mayor parte de este espacio de secuencia estaba dominado por repeticiones homopoliméricas y regiones con alto contenido de GC, ninguna de las cuales puede seleccionarse como diana mediante iARN. Sin inmutarse, se diseñó un panel de más de 50 ARNiph contra cualquier secuencia que pueda seleccionarse como diana viable usando parámetros de diseño de ARNip convencionales (Birmingham, A. et al. A protocol for designing siRNas with high functionality and specificity. Nature protocols 2, 2068-2078 (2007)), incluyendo la evaluación del contenido de GC, la especificidad y la baja frecuencia de cumplimentación de semilla (Anderson, E.M. et al. Experimental validation ofthe importance of seed complement frequency to siRNA specificity. Rna 14, 853-861 (2008)), la eliminación de secuencias que contienen semillas de miARN y el examen de sesgo termodinámico (Khvorova, A., Reynolds, A. y Jayasena, S.D. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115, 209-216 (2003); Schwarz, D.S. et al. Asymmetry in the assembly ofthe RNAi enzyme complex. Cell 115, 199­ 208 (2003)). La figura 6B muestra las posiciones de direccionamiento de los ARNiph identificados como altamente funcionales.
En los criterios de diseño, se favorecieron los sitios de direccionamiento con homología perfecta en otros primates para simplificar tanto los estudios formales de toxicología y eficacia en primates no humanos como el modelo de PE de babuino descrito a continuación. El ratón expresa únicamente la variante i13. Afortunadamente, el ARNiph más eficaz, sFLT1-i13-2283, resultó tener una complementariedad perfecta con la isoforma i13 de ratón, lo que permitió la evaluación directa de la eficacia y la toxicidad in vivo de este compuesto tanto en modelos de embarazo de ratón normal como con PE. La figura 6C muestra una tabla con los sitios de direccionamiento y los valores de CI50 de los mejores compuestos identificados para silenciar de manera eficiente las isoformas i13 e i15. Los valores de CI50 para compuestos eficaces oscilaron entre 40-100 nM tanto en células HeLa como en trofoblastos humanos primarios. La figura 3C muestra un ejemplo de la respuesta a la dosis de sFLT1-i13-2283 en trofoblastos humanos primarios usada para el cálculo de los valores de CI50. Es importante enfatizar que el silenciamiento con ARNiph se logró tras la adición de compuesto no formulado a los medios de trofoblastos. El nivel de atenuación génica del ARNm se determinó a las 72 horas usando el ensayo QuantiGene anteriormente descrito. Para controlar cualquier posible efecto inespecífico, los niveles de i13 o i15 se normalizaron siempre con respecto a un gen de mantenimiento. Se usó un control no dirigido (NTC) de química idéntica en todos los experimentos para controlar los efectos de clase química. Los niveles de ARNm de Flt1 de longitud completa no se vieron afectados (figura 3D). Para evaluar el silenciamiento a nivel de proteína, se midió la concentración de sFLT1 en medio acondicionado usando ELISA (Quantikine® FLT1, MVR100, R&D systems) (figura 3B).
Para avanzar, se seleccionaron dos pares de ARNiph: sFLT1-i13-2283 (5' CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3') (SEQ ID NO:1)/sFLT-il5a-2519 (5' CATCATAGCTACCATTTATT 3') (SEQ ID NO:2) y sFLT1-i13-2318 (5' ATTGTACCACACAAAGTAAT 3') (SEQ ID NO:3)/sFLT-i15a-2585 (5' GAGCCAAGACAATCATAACA 3) (SEQ ID NO:4) (figura 3C). El primer par fue el candidato farmacológico líder y se usó en todos los estudios. El segundo par fue un apoyo. Aunque es poco probable que la toxicidad específica de secuencia sea un problema, se deseaba una combinación de compuestos de apoyo que ya estaba disponible en el caso de que apareciera cualquier toxicidad dependiente de secuencia. En resumen, se identificaron ARNip hidrófobamente modificados funcionales que seleccionaron como diana selectivamente las isoformas sFlt1-i13 y sFlt1-i15a. La internalización y el silenciamiento eficientes de las dianas correspondientes en trofoblastos humanos primarios se determinó tanto a nivel de ARNm como de proteína.
La validación in vitro de sFLT1_2283/2519 (sFLT1-mix; 151005 o 151111) mostró respuestas a la dosis para la selección como diana de sFLT1 i13 y sFLT1 e15a (figuras 27A-D y 28A-D).
3.2 Silenciamiento de la variante sFLT1-i13 in vivo tras la administración sistémica a ratones preñados normales La figura 7B muestra datos piloto que demuestran el silenciamiento eficiente de ARNm de sFlt1 en riñón, hígado y placenta posterior a dos inyecciones i.v. de 20 mg/kg. A 12 ratones preñados se les administró una dosis de 20 mg/kg de compuesto sFLT-13-2283 i.v. diariamente durante dos días, y se determinó el nivel de expresión de sFlt1-i13 (normalizado tanto con respecto a un gen de mantenimiento como con respecto a fl-FLT1) 5 días más tarde en el hígado, el riñón y la placenta maternos, así como en los hígados fetales. Se logró un silenciamiento estadísticamente significativo (50-60%) en todos los tejidos maternos y la placenta, aunque los niveles de expresión de sFLT1 en el hígado fetal no cambiaron. La ausencia de silenciamiento en el hígado fetal fue coherente con la ausencia de oligonucleótido detectable en este tejido (figura 4B). La concentración placentaria de ARNiph fue de aproximadamente 20-40 |ig/gramo. Esta supera con creces la concentración necesaria para un silenciamiento productivo, que se observa habitualmente con concentraciones de compuesto tan bajas como de 100 ng/gramo. Por tanto, la dosis usada fue claramente mucho mayor de la necesaria. Se estudiaron con detalle la respuesta a la dosis y la duración del efecto, y se definieron los niveles de dosis NOEAL y DMT para este compuesto. Además, se monitorizaron el peso materno, el peso placentario y el número y peso de los fetos, y se determinó que ninguno de ellos se vio afectado con la inyección de 10 mg/kg y cada uno de ellos se vio ligeramente afectado (promedio de 6 frente a 7 fetos/madre) a los niveles de inyección de 20 mg/kg sin otros cambios observables. Fue tranquilizador que, incluso a esta dosis excesivamente alta, no se observó transferencia de ARNiph al feto. Basándose en las concentraciones de fármaco logradas en la placenta, la dosis eficaz debe ser al menos un orden de magnitud más baja.
Se realizó la evaluación histológica de la distribución de ARNiph en tejidos placentarios de ratón (figura 15). Se observó un silenciamiento eficiente de sFLT1 por parte del ARNiph en los tejidos del hígado, el riñón y la placenta de ratones CD1 preñados (figuras 16A-16E, figuras 17A-D).
La modulación de proteína sFLT1 soluble se detectó en el suero de ratones preñados después de una única inyección i.v. (10 mg/kg) de sFLT1_2283/2519 en los días 14, 15, 17 y 19 (figura 29). No hubo ningún efecto negativo observable, ni tampoco hubo ninguna desviación observable en el peso, los valores de ALT, los valores de AST ni el número de crías por ratón preñado.
En resumen, estos datos indican que se ha desarrollado una novedosa química de ARNip que ha permitido el suministro eficiente a trofoblastos placentarios, el principal sitio de sobreexpresión de sFLT1 durante la PE, y ha permitido un potente silenciamiento de sFLT1 circulantes tras la administración sistémica.
Ejemplo 4. Química y administración de dosis óptima, PK/PD piloto y duración del efecto de 2283 en un modelo de ratón preñado silvestre
4.1 Optimización de la química
Aunque los patrones de modificación mostraron un suministro eficiente a los citotrofoblastos dentro del laberinto placentario (figuras 4, 5, 7 y 8), se abordarán dos problemas químicos adicionales: 1) la optimización adicional del contenido de fosforotioato (PS) y 2) la estabilización adicional del fosfato 5'-terminal de la cadena guía.
Contenido de fosforotioato (PS)
Aunque las uniones PS generalmente confieren una mayor estabilidad de ARNip in vivo, una extensa fosforotioación puede inducir una mayor toxicidad específica de clase (aunque sólo tras la administración prolongada a alta dosis) (Frazier, K.S. Antisense Oligonucleotide Therapies: The Promise and the Challenges from a Toxicologic Pathologist's Perspective. Toxicologic pathology 43, 78-89 (2015)). Aunque se espera que la química P2 (figura 8) sea mucho más estable durante largos periodos de tiempo (es decir, semanas, tal como se ha demostrado para conjugados de GalNac) (Nair, J.K. et al. Multivalent N-Acetylgalactosamine-Conjugated siRNA Localizes in Hepatocytes and Elicits Robust RNAi-Mediated Gene Silencing. Journal of the American Chemical Society (2014)) que la de P1, los estudios piloto no mostraron ninguna diferencia significativa entre sFLT1-2283-P2 y sFLT1-2283-P1 con respecto a la acumulación placentaria a las 24 horas (figura 8). Por tanto, se sospechó que el contenido de PS óptimo (suficiente para mantener la estabilidad y la eficacia pero minimizar la toxicidad) se encuentra en algún lugar entre P1 y P2. Está prevista la síntesis de varias variantes adicionales. Se determinarán las concentraciones de especies de longitud completa en placentas 24 horas y 5 días tras la administración y las distribuciones relativas en el sitio de inyección y en el hígado, el riñón y la placenta, y se establecerá la dosis máxima tolerada (DMT) tras una única administración. Basándose en estos datos, se seleccionará y usará un patrón de PS para todos los estudios posteriores.
Estabilización del fosfato 5’-terminal
El segundo problema es cómo optimizar mejor la estabilización del fosfato 5'-terminal de la cadena guía, cadena que es necesaria para la carga de RISC. El ensayo de hibridación basado en PNA que se usó permitió la separación eficiente de cadenas guía fosforiladas y desfosforiladas, ha revelado que más del 70% de la cadena guía de sFLT1-2283-P2 detectable en el hígado 5 días tras la inyección está desfosforilada. Sin pretender restringirse a una teoría científica, es probable que la introducción de 5'-(E)-vinilfosfonato (5'-VP) metabólicamente estable (Lima, W.F. et al. Single-stranded siRNAs activate RNAi in animals. Cell 150, 883-894 (2012)) o 5'(R)Me-P, ambas químicas con conformación y propiedades estereoelectrónicas similares al fosfato natural, en lugar de 5'fosfato, podría reducir posiblemente la dosis eficaz (y, por tanto, el coste del fármaco y cualquier clase de toxicidad limitante) en más de tres veces. Se sintetizará sFLT1-2283 con un 5'-VP y 5'(R)Me-P en la cadena guía (realizado de manera rutinaria en el laboratorio de la Dra. Khvorova) y se evaluará su impacto sobre la eficacia del oligonucleótido, el suministro a la placenta y la seguridad. Los perfiles de toxicidad de 2'-O-metilo, 2'-fluoro, colesterol y PS se entienden bien. La completitud de este análisis debe finalizar la configuración química (PX) de los oligonucleótidos candidatos preclínicos para el tratamiento de PE.
4.2 Síntesis de oligonucleótidos a escala media
Usando la química seleccionada en el objetivo 1.1, se sintetizará sFLT-i13-2283-PX, se purificará mediante HPLC y se realizará el control de calidad (QC) mediante espectrometría de masas. Para todos los estudios in vivo, los compuestos se desalinizarán, se complejarán con un contraión de sodio y se comprobarán para garantizar que los niveles de endotoxina son aceptables. Los oligonucleótidos se sintetizaron previamente usando los sistemas Expedite y Mermaid 8 y se purificaron mediante HPLC a escala media de Agilent. La capacidad de síntesis real es de 40 |imol de compuesto/semana, lo que da como resultado 0,2 gramos después de la purificación mediante HPLC. Este intervalo es suficiente para realizar todos los estudios previstos en ratones (como referencia, una dosis de 10mg/kg corresponde a 0,4 mg/ratón/inyección para animales preñados de 40 gramos). En previsión de la necesidad de una mayor capacidad de síntesis para estudios en primates no humanos, se utilizarán un sintetizador OligoPilot de escala media y CL-EM de alta resolución, lo que también disminuirá los costes de la síntesis de oligonucleótidos.
4.3 Mediciones de farmacocinética (PK) piloto, farmacodinamia (PD), concentración sin efectos adversos observados (NOAEL) y dosis máxima tolerada (DMT) para sFLT-i13-2283
Todos los estudios en animales se realizarán según los protocolos del IACUC. En el diseño de todos los experimentos, se seguirán las normas recomendadas por Landis (Landis, S.C. et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature 490, 187-191 (2012)), incluyendo la aleatorización de grupos, el enmascaramiento y la potencia del estudio apropiados. El desarrollo del ensayo cromatográfico basado en PNA permite la capacidad de evaluar cuantitativamente la distribución de oligonucleótido y definir la PK piloto. Para los estudios de PK piloto, n-3 es suficiente. Para los estudios de eficacia y duración del efecto en los que la lectura es la reducción de los niveles de proteína y ARNm de las variantes de sFLT1, es necesario como mínimo n-8 para potenciar el estudio para la detección de una modulación del 40% con una confianza del 80%.
Para el análisis de la PK piloto, se explorará la dinamia de la concentración sanguínea. Se extraerán muestras de sangre de 20 |il a los 5, 30 y 60 min, a las 4, 12, 24, 48, 72 y 96 horas tras la inyección. Se obtendrán puntos de tiempo cortos mediante sondaje de la vena yugular, eliminando la preocupación del IACUC con respecto a las repetitivas extracciones de sangre durante cortos periodos de tiempo y minimizando el número de animales requeridos para obtener datos precisos. Basándose en estudios PK previos con compuestos relacionados, se espera observar una cinética de aclaramiento bifásica, completándose la fase rápida en 1 y 4-6 horas para la administración i.v. y s.c., respectivamente. Basándose en los estudios piloto que muestran que > 50% de la dosis originalmente suministrada persistió en los tejidos incluso 5 días tras la inyección, el completo aclaramiento farmacológico puede tardar un mes, pero un estudio de una semana de duración sería suficiente para generar datos piloto que permitan la estimación del perfil de aclaramiento.
Además, se establecerán la NOAEL y DMT para el compuesto líder. Hasta ahora, la administración de 10 mg/kg y 20 mg/kg de sFLT1-2283-P2 a ratones preñados no había tenido ningún impacto negativo observable aparte de una ligera disminución en el número de fetos a 40 mg/kg. Dado que aproximadamente el 50% de la dosis inyectada (figura 4B) se dirigió al endotelio del hígado y a células de Kupffer, es razonable esperar una modulación de las enzimas hepáticas con ALT y AST usadas como lectura patrón. Se medirán los niveles de ALT/AST (ensayos establecidos como parte del núcleo de cuidado animal) a diferentes concentraciones de sFLT1-2283-PX y a diferentes tiempos después de la inyección. Este ensayo puede combinarse fácilmente con estudios de eficacia de respuesta a la dosis ya que no es invasivo y requiere únicamente 10 |il de sangre.
Se establecerá la DMT tanto en ratones preñados como no preñados. En ratones no preñados, los estudios piloto indicaron que se esperaba que el intervalo de DMT de sFLT1-2283-P2 fuera mayor de 100 mg/kg. En ratones preñados, sin embargo, el nivel de dosis de NOAEL puede ser inferior. Se espera que la dosis de NOAEL sea mucho mayor que la dosis eficaz esperada de 1 mg/kg basándose en los niveles de fármaco que pueden lograrse en la placenta. 1 mg/kg está en línea con las concentraciones usadas para el compuesto ALN-TTR2 en ensayos clínicos de fase II.
La toxicidad relacionada con el oligonucleótido puede deberse a efectos específicos de la diana (relacionados con sFlt1) o efectos independientes de la diana (relacionados con la formulación o secuencia de ARNip). Los efectos específicos de la diana se evaluarán en ratones a los que se les administra el compuesto líder durante el 3er trimestre evaluando el número, el peso y el crecimiento de fetos así como la frecuencia de abortos espontáneos. La histología placentaria evaluará la densidad de trofoblastos y vascular. Los flujos sanguíneos de la arteria uterina y la arteria umbilical se evaluarán usando estudios Doppler no invasivos (Zhang, J.H. y Croy, B.A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med 59, 527­ 533 (2009)). Además, a los ratones tratados con la dosis de NOAEL y DMT se les permitirá parir y se realizará un seguimiento de las crías durante dos generaciones para evaluar el posible impacto sobre la salud general y la función reproductora.
Para los estudios de PD, se realizará un estudio de respuesta a la dosis con dosis que oscilan entre 0,5 y 10 mg/kg. Se medirán los niveles de proteína sFLT1 con ELISA (cinética sanguínea) y se medirán los niveles de ARNm de sFlt1 y fl-Flt1 con QuantiGene en placenta, hígado y riñón. Los estudios preliminares mostraron que una única administración de sFLT1-i13-2283-P2 fue suficiente para inducir el silenciamiento de sFLT1 en todos los tejidos seleccionados como diana (figura 7B) sin ningún efecto en los hígados de los embriones. La validación in vivo de sFLT1_2283/2519 se muestra en la figura 7C. Se analizará la duración del efecto tanto a la dosis NOAEL más alta como a la dosis eficaz más baja. Desafortunadamente, puede que los ratones no sean un modelo óptimo para estos estudios, ya que sFLTI apenas se expresa en ratones no preñados y los ratones preñados no permiten la evaluación de la PD a tiempos superiores a las 2 semanas. Para evaluar el potencial de los estudios de mayor duración, se utilizarán ARNiph que comparten exactamente la misma química que seleccionan como diana el ARNm de la tirosina cinasa TEK (Tie2), una diana específica endotelial. Se examinará el silenciamiento de Tie2 en el endotelio del hígado 1, 2, 3, 4 semanas después de una única administración. Si el silenciamiento no persiste durante más de 3 semanas, se analizará la administración de múltiples dosis para abordar el problema. Aunque el comportamiento PK/PD de secuencias diferentes no es idéntico, es similar (H. Younis et al. en A Comprehensive Guide to Toxicology in Preclinical Drug Development. (ed. A.S. Faqi) 647-664 (Academic Press, 2013)), y los datos de duración del efecto con compuestos de Tie2 podrían ser informativos para el diseño de estudios de eficacia de NHP.
Este estudio dará como resultado la finalización de la configuración química y establecerá la respuesta a la dosis, la PK piloto, la NOAEL y la DMT para sFLT1-2283 en ratones no preñados y preñados normales. Esta información será crítica para la planificación adicional de estudios de toxicología que permiten solicitar el IND.
4.4 Seguridad y toxicidad piloto de la combinación i13/i15
El presente candidato preclínico se define como una mezcla de ARNiph que selecciona como diana todas las variantes i13 e i15. Ambos compuestos pueden volver a sintetizarse basándose en la composición química más óptima identificada anteriormente. Si los compuestos vuelven a sintetizarse, será esencial demostrar que la mezcla de i13/i15 tiene un perfil de seguridad similar a la selección como diana de la variante i13 sola. Los experimentos para determinar la NOAEL y la DMT para la mezcla de compuestos se repetirán usando lecturas de AST/ALT como medidas de toxicidad. Además, la similitud en el comportamiento Pk se confirmará para compuestos que seleccionan como diana i15 y i13 usando sondas basadas en PNA que seleccionan como diana i13 e i15. Es imposible evaluar la PD de i15 en el modelo de ratón ya que las variantes i15 no se expresan en el mismo. Sin pretender restringirse a una teoría científica, se cree que tener una eficacia in vitro (es decir, en trofoblastos) similar en combinación con perfiles PK similares será suficiente para predecir una eficacia similar. Esto se confirmará en un modelo de embarazo de babuino en el que se expresan ambas variantes i13 e i15.
4.5 Evaluación cuantitativa de la transferencia de ARNiph (si la hay) al feto
La principal preocupación de seguridad en el desarrollo de cualquier producto terapéutico para el tratamiento de mujeres embarazadas es la seguridad fetal y el posible efecto negativo sobre el desarrollo del embrión. En los datos preliminares presentados en el presente documento, no se observó ninguna transferencia detectable de sFLT1-2283-P2 al feto (figuras 6A y 4B) ni por microscopía fluorescente ni por hibridación de PNA. Tampoco se observó ningún cambio en la expresión de sFLT1 fetal en un grupo de animales tratados con fármaco. A dosis de hasta 20 mg/kg, no se observó ningún impacto sobre el peso o los números de fetos, y no se observó ningún impacto sobre la histología placentaria global. Se observó una ligera disminución en los números de fetos (desde un promedio de 7 hasta 6) a una dosis máxima de 40 mg/kg. A pesar de estos datos alentadores que hacen que este proyecto sea tan prometedor, es importante analizar cuantitativamente con detalle cualquier posible transferencia de fármaco e impacto sobre la placenta y el feto. Para hacer eso, se usará un ensayo de hibridación de PNA para detectar oligonucleótidos en los diferentes tejidos del embrión. Tal como se mencionó anteriormente, la sensibilidad del ensayo es de aproximadamente 10 fmol/gramo, más baja que las concentraciones biológicamente eficaces. Se medirá el nivel de posible transferencia de oligonucleótido después de la administración de diferentes concentraciones de oligonucleótido hasta la DMT. Estos experimentos también se repetirán usando modelos de PE, ya que la integridad y la salud de la placenta podrían tener un impacto sobre la capacidad de barrera.
Una preocupación particular de los productos terapéuticos de ARNip es la posibilidad de que incluso una pequeña cantidad de oligonucleótido transferido interfiera con la homeostasis de miARN. Los perfiles de miARN cambian rápidamente durante el desarrollo del embrión y son esenciales para la ejecución apropiada del programa de desarrollo. Previamente, se observaron perfiles de miARN alterados únicamente después de meses de sobreexpresión basada en virus de un ARNip particular (Grimm, D. et al. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 441, 537-541 (2006)). Las firmas de miARN específicas de células son altamente dinámicas durante el desarrollo embrionario, por tanto posiblemente más sensibles que los tejidos adultos a sustratos externos de carga de RISC. Para examinar esta posibilidad, se purificará el ARN a partir de fetos completos, cerebro fetal e hígado fetal de ratones preñados no tratados y administrados con la dosis DMT y se realizará RNA-Seq pequeña. Esto permitirá: (1) la evaluación del número de lecturas correspondientes a los ARNiph en estos tejidos y (2) la evaluación del impacto (si lo hay) sobre los perfiles de miARN endógenos.
Ejemplo 5. Modelos de PE adicionales
5.1 Demonstración de la eficacia del oligonucleótido de sFLT1 en dos modelos de preeclampsia
Aunque la reducción de los niveles de sFLT1 respalda la eficacia mecanicista del compuesto líder, sería deseable demostrar que la reducción de sLFT1 tiene un impacto sobre el fenotipo “similar a preeclampsia”. Aunque existen descripciones de varios modelos animales de preeclampsia en la bibliografía, no existe un único modelo que recapitula todos los aspectos del síndrome clínico y ninguno de ellos modela con precisión la progresión de la enfermedad desde la preeclampsia a complicaciones más graves tales como síndrome de HELLP o eclampsia (Aubuchon, M., Schulz, L.C. y Schust, D.J. Preeclampsia: animal models for a human cure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 1197-1198 (2011)). Por tanto, todavía no existe un modelo perfecto para la enfermedad humana. Dado que los ratones y las ratas tienen una placentación relativamente poco profunda, los modelos de roedores no son óptimos para estudiar las causas previas de una escasa invasión de trofoblastos. Por otro lado, esta característica los hace ideales para evaluar la fisiopatología y la etiología posteriores de la respuesta materna a la placentación poco profunda, un impulsor establecido de preeclampsia humana (Powe, C.E., Levine, R.J. y Karumanchi, S.A. Preeclampsia, a disease of the maternal endothelium: the role of anti-angiogenic factors and implications for later cardiovascular disease. Circulation 123, 2856-2869 (2011)). Puesto que el objetivo general de esta invención es la atenuación génica de sFlt1 en embarazos humanos, se eligieron los modelos de ratón (isquemia uterina e isquemia de animal completo) que se ha notificado que tienen una sFlt1 circulante elevada. Se ha notificado que ambas de hipoxia e isquemia relativas inducen la producción de sFlt1 en cultivos placentarios humanos in vitro y en diversos modelos animales (Nagamatsu, T. et al. Cytotrophoblasts up-regulate soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression under reduced oxygen: an implication for the placental vascular development and the pathophysiology of preeclampsia. Endocrinology 145, 4838-4845 (2004); Makris, A. et al. Uteroplacental ischemia results in proteinuric hypertension and elevated sFLT-1. Kidney international 71, 977-984 (2007); Gilbert, J.S., Babcock, S.A. y Granger, J.P. Hypertension produced by reduced uterine perfusion in pregnant rats is associated with increased soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression. Hypertension 50, 1142­ 1147 (2007)).
5.2 Cirugía por telemetría
Se adquirirán ratones preñados CD1 hembra con un peso de 20-25 gramos de Charles River Laboratories. El advenimiento de sondas de radiotelemetría miniaturizadas, quirúrgicamente implantables, adecuadas para la monitorización hemodinámica crónica de animales de experimentación pequeños ha supuesto un avance significativo en la investigación fisiológica y es importante en la investigación de la preeclampsia, ya que la técnica permite medir la tensión arterial durante toda la gestación (Burke, S.D. et al. Spiral arterial remodeling is not essential for normal blood pressure regulation in pregnant mice. Hypertension 55, 729-737 (2010)). En resumen, se anestesiarán ratones CD-1 hembra con un peso superior a 20 g usando isoflurano inhalado. Se realiza una incisión de 1 cm en la línea media en la superficie ventral desde la parte superior de la horquilla esternal. Se aísla la arteria carótida común izquierda y se ocluye usando suturas. Se realiza una incisión en la arteria con una aguja de calibre 26 y se hace avanzar el catéter de telemetría (DSI, St. Paul, MI) hacia el interior de la arteria; se coloca la punta justo dentro del cayado aórtico. Se sutura el catéter en su sitio, ocluyendo de manera permanente la arteria. Se coloca el cuerpo del transmisor en una bolsa subcutánea en el costado derecho del ratón. Se sutura la herida y se monitoriza el ratón hasta su recuperación. A los animales se les proporcionará analgesia durante 48 horas tras la operación y se monitorizarán durante 1 semana. Dos semanas después de la recuperación, los animales se aparearán con ratones sementales macho del mismo origen para estudiar los fenotipos de embarazo tal como se describe a continuación.
5.3 Modelo de presión de perfusión uterina reducida (PPUR) de isquemia placentaria
Se usará el modelo de PPUR de isquemia placentaria en ratones CD1 preñados que usó por primera vez el laboratorio de Barbara Alexander en la Universidad de Mississippi (Intapad, S. et al. Reduced uterine perfusion pressure induces hypertension in the pregnant mouse. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology 307, R1353-1357 (2014)). Este modelo animal de preeclampsia implica la colocación de pinzas de constricción de plata en la aorta abdominal y por encima de las arterias uterinas para reducir la presión de perfusión uterina el día 14 de gestación, creando una insuficiencia placentaria. A los animales se les administrará o bien fármaco de oligonucleótido de sFLT1 (usando el nivel de dosis y la vía de administración definidos anteriormente) o bien control (PBS o/y NTC) el día 16 de gestación a través de inyección en la vena de la cola. Se medirán las tensiones arteriales de forma continua usando telemetría a partir del día 15-19 de gestación y se sacrificarán los animales el día 19 de gestación. Además, se recogerán muestras de orina colocando a los ratones en jaulas metabólicas durante 12 horas antes del sacrificio.
5.4 Modelo de hipoxia de preeclampsia
También se usará el modelo de hipoxia que usó por primera vez el laboratorio de Surendra Sharma en la Universidad de Brown. Id. En este modelo, se expondrá a hipoxia (oxígeno al 9,5%, expuestos durante 10 días) ratones CD1 preñados a los que se les ha implantado un telémetro en una cámara hipobárica a partir del día 9-19 de gestación. A los animales se les administrará o bien oligonucleótido de sFLT1 terapéutico disuelto en PBS (2 dosis) o bien vehículo (PBS) el día 16 de gestación a través de inyección en la vena de la cola. Se medirán las tensiones arteriales de forma continua usando telemetría a partir del día 15-19 de gestación y se sacrificarán los animales el día 19 de gestación. Se recogerán muestras de orina tal como se describió anteriormente.
Fenotipos de preeclampsia
Se realizarán mediciones de las tensiones arteriales en ratones conscientes usando una sonda de telemetría implantada en la arteria carótida (DSL, St. Paul, MN). (Véanse los estudios piloto en la figura 9A). Se examinará histológicamente el tejido renal para la cuantificación de endoteliosis glomerular tal como se describió (Li, Z. et al. Recombinant vascular endothelial growth factor 121 attenuates hypertension and improves kidney damage in a rat model of preeclampsia. Hypertension 50, 686-692 (2007)). Se fijará el tejido en formalina tamponada al 10%, se incrustará en parafina, se le realizarán secciones y se teñirán con H&E, PAS y tinte tricrómico de Masson. Se medirán la creatinina en suero y orina (medida mediante calorimetría con ácido pícrico) y la proteína en orina (medida mediante ELISA) durante el embarazo (día 18-19 de gestación) para evaluar la proteinuria. Además, se medirán el hematocrito y el recuento de plaquetas el día 18-19 de gestación. Se realizarán frotis periféricos usando sangre completa obtenida de estas ratas para buscar evidencia de hemólisis. Se medirán la AST y la ALT en suero mediante un método UV cinético (Infinity Liquid, Thermo Electron Corp). Se midieran los niveles de sFlt1 en plasma mediante ELISA comercialmente disponible (R&D Systems, MN).
Estudios placentarios/fetales
Se usará ecografía Doppler para evaluar los flujos uterinos y umbilicales el día 18-19 de gestación tal como se describe en otra parte (Khankin, E.V., Hacker, M.R., Zelop, C.M., Karumanchi, S.A. y Rana, S. Intravital highfrequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy. Pregnancy hypertension 2, 84-92 (2012)). Se anestesiarán los ratones usando una mezcla de isoflurano/Ü2 administrada con un vaporizador de precisión. Se colocarán los ratones en decúbito supino sobre una platina calentada del ecógrafo Vevo 2100 (Visual Sonics Inc. Toronto, Ontario, CA) y se insertará una sonda rectal de temperatura para monitorizar la temperatura central durante todo el procedimiento. Se examinarán los órganos abdominales y se identificará la arteria uterina. Una vez verificada la posición, se usará Doppler de onda de pulso para visualizar el patrón de flujo sanguíneo y medir la velocidad de flujo en la arteria uterina. Se realizará la evaluación mediante ecografía en al menos 4 embriones por animal: dos en cada cuerno. Las mediciones que se tomarán incluyen frecuencia cardiaca fetal (FCF), Doppler de la arteria umbilical (Doppler de la AU), Doppler de la arteria uterina (Doppler de la AUt) y circunferencia abdominal (CA) (figura 9B). Se puntuarán los tamaños de camada y las resorciones cuando se sacrifiquen los animales en día 19 de gestación. Se registrarán los pesos al nacer para evidenciar la restricción del crecimiento fetal. Se fijarán los sitios de implantación con placentas en paraformaldehído al 4% y se examinarán histopatológicamente para evidenciar la remodelación anómala de las arterias espirales, una característica de placentación anómala (Cui, Y. et al. Role of corin in trophoblast invasion and uterine spiral artery remodelling in pregnancy. Nature 484, 246-250 (2012)).
Tamaño de muestra y comparaciones estadísticas
Para cada uno de los estudios propuestos, se usarán aproximadamente 10 animales por grupo: control, oligonucleótido de sFlt1 a dosis baja y oligonucleótido a dosis alta. Se realizarán análisis estadísticos convencionales en todos los datos de animales. Se recopilarán valores individuales como medias /- S.E.M. Se realizarán comparación entre los múltiples grupos mediante un análisis inicial de la varianza y se usará la prueba de la t de Student para evaluar las diferencias entre grupos individuales. Se analizarán los datos hemodinámicos usando medias de 24 horas a partir de datos de animales individuales, que se compararán usando ANOVA de medidas repetidas bilateral. Cuando se indiquen diferencias significativas (p<0,05), se usará la prueba a posteriori de Bonferroni para evaluar las diferencias entre grupos individuales.
5.5 Interpretación, errores y alternativas
Sin pretender restringirse a una teoría científica, se espera que la terapia con oligonucleótido de sFLT1 conduzca a una reducción de aproximadamente el 50% en los niveles de sFLT1 circulante, que se asociará con la mejora en los fenotipos de preeclampsia tales como la resolución de la hipertensión y la mejora de la patología renal.
No se espera que haya consecuencias adversas para la placentación ni el crecimiento fetal. Los estudios de atenuación génica del grupo de Rossant han sugerido que la sFlt1 placentaria no es crítica para el mantenimiento del embarazo (Hirashima, M., Lu, Y., Byers, L. y Rossant, J. Trophoblast expression of fms-like tyrosine kinase 1 is not required for the establishment of the maternal-fetal interface in the mouse placenta. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 15637-15642 (2003)). Sin embargo, puesto que sFlt1 se atenuará génicamente por vía sistémica, es posible que pueda haber consecuencias adversas, tales como disminuciones en el crecimiento fetal relacionadas con una caída significativa en las tensiones arteriales. Si no se observa una caída en las presiones arteriales mayor de 20 mm, se repetirán estos estudios de eficacia con una dosis más baja del oligonucleótido de sFLT1. Además, con ecografía Doppler no invasiva, pueden registrarse incluso cambios sutiles en el flujo sanguíneo hacia el feto. Si no se observa una expresión robusta de los niveles de sFlt1 endógena en respuesta a la hipoxia durante el 3er trimestre, podrían repetirse los estudios en ratones deficientes en IL-10 que, como se ha demostrado por el grupo de Sharma, regulan por incremento sFlt1 durante el tercer trimestre de manera bastante drástica (Intapad, S. et al. Reduced uterine perfusion pressure induces hypertension in the pregnant mouse. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology 307, R1353-1357 (2014)). La completitud de este objetivo evaluará la eficacia y la seguridad de la reducción de sFLT1 basada en iARN en dos modelos de PE.
Ejemplo 6. Evaluación de PK y eficacia y seguridad en babuinos preñados durante la última etapa de gestación en un estudio piloto
6.1 Fundamento
Dado que los ratones sólo expresan una de las isotermas de sFlt1, es importante evaluar la eficacia in vivo de oligonucleótido(s) de sFlt1 en primates no humanos que expresan todas las isotermas de sFlt1 (Makris, A. et al. Uteroplacental ischemia results in proteinuric hypertension and elevated sFLT-1. Kidney international 71, 977-984 (2007); Thomas, C.P. et al. A recently evolved novel trophoblast-enriched secreted form of fms-like tyrosine kinase-1 variant is up-regulated in hypoxia and preeclampsia. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 94, 2524­ 2530 (2009)). Se han elegido babuinos sobre otros primates no humanos debido al acceso a un modelo bien caracterizado de preeclampsia que ha usado por primera vez la Dra. Annemarie Hennessy (Makris, A. et al. Uteroplacental ischemia results in proteinuric hypertension and elevated sFLT-1. Kidney international 71, 977-984 (2007)).
6.2 Modelo de embarazo de babuino
Debido a las restricciones éticas para minimizar el número de sujetos animales, se usarán seis babuinos preñados (2 grupos x 3 animales). A las 20 semanas de gestación, (equivalentes al tiempo de gestación en el que se produce la PE humana), los seis animales se someterán a cirugía por telemetría para medir la tensión arterial intraarterial tal como se describió previamente. Id. En resumen, se realiza una incisión inguinal en la piel para exponer la femoral profunda, una pequeña rama de la arteria principal que irriga la pierna, mediante disección roma. Se inserta el componente de catéter del telémetro (Data Sciences Ltd, Minnesota, EE.UU.) en un afluente de la arteria femoral en el lado seleccionado y se coloca a una distancia determinada en la aorta abdominal media y se fija al vaso. Se evalúa la recuperación posquirúrgica puntuando el número de diferentes signos físicos y conductuales, y se lleva a cabo y se registra diariamente durante tres días antes del comienzo de los registros de la tensión arterial. Para la anestesia, a los animals se les proporcionará oxígeno mediante una mascarilla y se les anestesiará mediante infusión de ketamina, y metoclopramida para prevenir el vómito. A las 22 semanas de gestación, a los animales se les inyectará por vía intravenosa 4 mg/kg de peso corporal de una única dosis de oligonucleótido de sFLT1 en solución salina tamponada con fosfato (N=3) o solución salina tamponada con fosfato sola (N=3) bajo anestesia. Se desarrolló un modelo de PE de babuino (figura 30). Se usará el modelo de PE de babuino para someter a prueba la eficacia (PK) y la seguridad general de la administración de ARNiph que selecciona como diana sFLT1. Se realizará una evaluación piloto de la inyección de dosis única de ARNiph que selecciona como diana sFLT1-i13/e15a en los niveles de sFLT1 en sangre y en los niveles de ARNm de sFlt1 en los tejidos del riñón y la placenta. Se insertará un telémetro el día 143. Se inducirá isquemia placentaria y se inyectará ARNiph el día 150. La retirada del telémetro tendrá lugar el día 164.
Al primer babuino se le inyectó el día uno 20 mg/kg de ARNiphFLTÍm. No se detectaron efectos tóxicos ni adversos observables durante las primeras dos semanas. Los niveles de ALT/AST y los niveles de citocina iniciales fueron normales, y se normalizaron las tensiones arteriales. Se observó la estabilización de la tensión arterial (TA) después de la inyección de ARNiph (estudio de 2 semanas) (figura 37). Se observó una dinamia positiva para la TA y la FC tanto para condiciones despiertas como dormidas. Se observó una disminución de la TA después de una única inyección i.v. de ARNiph (estudio de 2 semanas) (figura 38).
Los babuinos dos y tres están programados para la inyección de uno a dos meses después de que se inyectara inicialmente el primer babuino.
6.3 Niveles de sFlt1 en plasma y otros parámetros fisiológicos
Se obtendrán los niveles iniciales de sFlt1 a partir de plasma recogido el día de la inserción del telémetro y semanalmente, hasta el parto a las 26 semanas. También se recogerán muestras de orina los mismos días que se extrae la sangre. Se registrará continuación la tensión arterial inicial mediante telemetría a partir de la semana 21 de gestación hasta el parto. Se monitorizarán los animales usando ecografías fetales (instrumento HDI 3000 y sonda C7-4, o similar) semanalmente para determinar los flujos sanguíneos uterinos y umbilicales, la salud fetal (frecuencia cardiaca fetal) y mediciones del crecimiento (circunferencia de la cabeza, diámetro biparietal, circunferencia abdominal, longitud del fémur) hasta el parto. En el parto, se extraerá sangre del cordón umbilical para evaluar la transferencia de oligonucleótido de sFLT1 al feto. En el parto, se realizarán evaluaciones del crecimiento mediante mediciones de la circunferencia de la cabeza y el tórax, el perímetro abdominal, las longitudes cefalocaudal y del fémur. Estas mediciones se compararán con las obtenidas a partir de recién nacidos de animales tratados con solución salina.
6.4 Interpretación, errores y alternativas
En estos estudios piloto, el objetivo no es encontrar la dosis terapéutica óptima para el tratamiento de preeclampsia, sino simplemente para confirmar que la terapia con oligonucleótido de sFLT1 inhibe otras isoformas de sFLT1 que no se expresan en ratones. Sin pretender restringirse a una teoría científica, se espera que una única dosis i.v. de oligonucleótido de sFLT1 disminuya sFLT1 circulante en un 50% en el plazo de una semana y que los efectos duren 2 semanas o más. Se espera que las disminuciones en sFLT1 circulante estén asociadas con una reducción moderada de la tensión arterial. Sin embargo, esto no alterará el flujo sanguíneo arterial uterino. Si se observan disminuciones en el crecimiento fetal, puede considerarse la reducción de la dosis de la terapia con oligonucleótido de sFLTI. Alternativamente, puede considerarse el suministro de la terapia como una única dosis s.c. (que puede provocar menos efectos agudos sobre el flujo sanguíneo arterial uterino). Si se recopilan datos alentadores a partir de estudios en ratones y PK iniciales en babuinos, se realizarán estudios de eficacia formales de prueba de concepto in vivo en un modelo de babuino de preeclampsia que ha caracterizado la Dra. Annemarie Hennessy en Australia (Makris, A. et al. Uteroplacental ischemia results in proteinuric hypertension and elevated sFLT-1. Kidney international 71, 977-984 (2007)). En este estudio, se evaluarán específicamente diferentes dosis y múltiples dosis de terapia con oligonucleótido de sFlt1 necesarias y suficientes para mejorar los signos y síntomas de la preeclampsia. Aunque los ensayos ELISA de sFlt1 humana reaccionan de manera cruzada con sFlt1 de babuino, no existen ensayos para PlGF y v Eg F de babuino. En la actualidad están evaluándose inmunoensayos que reaccionan con PlGF/VEGF de babuino y, si tienen éxito, las concentraciones libres de niveles de PlGF y VEGF en sangre y orina que pueden aumentar a medida que disminuyen los niveles de sFlt1 circulante se medirán como sustituto de la eficacia biológica.
6.5 Sumario
Las composiciones y los métodos descritos en el presente documento conducirán al desarrollo de un novedoso y rentable tratamiento para la preeclampsia a través de la modulación de los niveles de sFLT1. Además, con ocurre con los ONT, la tecnología desarrollada en este caso debe ser aplicable para el silenciamiento de otros genes placentarios, lo que permite una amplia gama de novedosos estudios genómicos funcionales in vivo para otras enfermedades relacionadas con el embarazo.
Ejemplo 6.6. Conjugados de DHA-ARNiph y conjugados de g2DHA-ARNiph
El DHA es un ácido graso omega-3 que es un componente primario del cerebro humano (70%) que atraviesa la barrera hematoencefálica (BHE) y lo internalizan activamente las neuronas y otros tipos de células. El g2DHA (también denominado en el presente documento PC-DHA) es un análogo metabólicamente activo del DHA.
Se sintetizaron ácido docosahexaenoico (DHA)-ARNiph y g2DHA-ARNiph (también denominado en el presente documento PC-DHA-ARNiph). Se determinó la distribución tisular de DHA-ARNiph y g2DHA-ARNiph tras la administración i.v. (a través de las venas de la cola de los ratones) en tejidos del hígado (figuras 20 y 21), el riñón (figuras 22 y 23) y la placenta (figuras 24 y 25).
Se observó el silenciamiento de sFLT1 por g2DHA-ARNiph en ratones preñados usando 15 mg/kg de sFLT1_2283P2-g2DHA (150813) administrado por vía i.v. en los tejidos del hígado, el riñón y la placenta (figura 26). En la figura 36 se muestra una mezcla de sFLT_2283/2519 particularmente preferida.

Claims (11)

    REIVINDICACIONESi . Un compuesto que se une a una región intrónica de un ARNm que codifica para una proteína sFLTI, en el que el compuesto inhibe selectivamente la expresión de la proteína sFLT1 en una célula o un organismo; comprendiendo dicho compuesto un ARNbc que tiene una cadena sentido y una cadena antisentido de al menos 16 nucleótidos contiguos,en el que una porción de la cadena antisentido es complementaria a una porción de la cadena sentido, en el que la cadena antisentido es completamente complementaria a SEQ ID NO:1;
  1. (1) la cadena antisentido comprende 2'-metoxi-ribonucleótidos y 2'-fluoro-ribonucleótidos alternantes;
    (2) los nucleótidos en las posiciones 2 y 14 desde el extremo 5' del soporte antisentido no son 2'-metoxiribonucleótidos;
    (3) los nucleótidos de la cadena antisentido están conectados mediante uniones fosfodiéster o fosforotioato; y
    (4) los nucleótidos en las posiciones 1-6 desde el extremo 3', o en las posiciones 1-7 desde el extremo 3', de la cadena antisentido están conectados a nucleótidos adyacentes mediante uniones fosforotioato; en el que la cadena sentido está unida a una molécula lipófila en el extremo 3' de la cadena sentido.
  2. 2. El compuesto según la reivindicación 1, en el que dicho ARNbc se caracteriza además porque:
    tiene extremos romos;
    comprende al menos una proyección de nucleótidos monocatenaria;
    comprende nucleótidos que se producen de manera natural;
    reduce la expresión de la proteína sFLT1 en la célula o el organismo desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 50%; o
    reduce la expresión de la proteína sFLT1 en la célula o el organismo desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 40%.
  3. 3. El compuesto según la reivindicación 1, en el que dicho ARNbc comprende un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo.
  4. 4. Un compuesto terapéutico que se une a una región intrónica de un ARNm que codifica para una proteína sFLT1, en el que el compuesto terapéutico reduce selectivamente la expresión de la proteína sFLT1, y en el que el compuesto terapéutico reduce uno o más síntomas de preeclampsia (PE), PE posparto, eclampsia o síndrome de hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y recuento bajo de plaquetas (HELLP) cuando se administra a un sujeto que lo necesita, en el que la proteína sFLT1 se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en una o cualquier combinación de sFLT1-i13 corta, sFLT1-i13 larga y sFlt1-i15a, comprendiendo dicho compuesto un ARNbc según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5. El compuesto terapéutico según la reivindicación 4, que comprende un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, en el que el primer oligonucleótido se une a una región intrónica de una o ambas de sFLT1-i13 corta y sFLT1-i13 larga, y el segundo oligonucleótido se une a una región intrónica de sFlt1-i15a, y en el que el primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido son ARN bicatenario (ARNbc).
  6. 6. El compuesto terapéutico según la reivindicación 4, que comprende un primer ARNbc que comprende una primera cadena sentido y una primera cadena antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un segundo ARNbc que comprende una segunda cadena sentido y una segunda cadena antisentido, en el que la segunda cadena antisentido comprende una segunda región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:2, opcionalmente en el que:
    cada ARNbc tiene entre 15 y 35 pares de bases de longitud;
    dicha segunda región de complementariedad es complementaria a al menos 15, 16, 17 o 18 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:2;
    dicha segunda región de complementariedad no contiene más de 3 apareamientos erróneos con SEQ ID NO:2;
    dicha segunda región de complementariedad es completamente complementaria a SEQ ID NO:2; cada ARNbc comprende al menos una proyección de nucleótidos monocatenaria; y/o
    cada ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado, preferiblemente en el que:
    dicho nucleótido modificado se elige del grupo que consiste en: un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo;
    dicho nucleótido modificado se elige del grupo que consiste en: un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, nucleótido modificado con 2'-amino, nucleótido modificado con 2'-alquilo, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende bases no naturales; y/o
    cada ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, al menos un nucleótido modificado con 2'-fluoro, al menos un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo.
  7. 7. Una composición farmacéutica, que comprende:
    un primer ARNbc que comprende una primera cadena sentido y una primera cadena antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;
    un segundo ARNbc que comprende una segunda cadena sentido y una segunda cadena antisentido, en el que la segunda cadena antisentido comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a SEQ ID NO:2, y en el que la segunda cadena antisentido selecciona como diana selectivamente una región intrónica de sFLT-i15a; y
    un portador farmacéuticamente aceptable.
  8. 8. La composición farmacéutica según la reivindicación 7, para su uso en el tratamiento o la gestión de PE, PE posparto, eclampsia o síndrome de HELLP.
  9. 9. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 8, en la que la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa o subcutánea, opcionalmente en la que:
    la expresión de la proteína sFLT1 se reduce en el sujeto en de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%; o
    la expresión de la proteína sFLT1 se reduce en el sujeto en de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 40%.
  10. 10. El compuesto terapéutico según la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de PE, PE posparto, eclampsia o síndrome de HELLP.
  11. 11. El compuesto según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de un trastorno angiogénico, opcionalmente un trastorno angiogénico seleccionado del grupo que consiste en PE, PE posparto, eclampsia y síndrome de HELLP.
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