CN107980062B - 用于靶向亨廷汀mRNA的寡核苷酸化合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及新型亨廷汀(huntingtin)靶标。还提供了用于治疗亨廷顿病的新型寡核苷酸。

Description

用于靶向亨廷汀mRNA的寡核苷酸化合物
相关申请
本申请要求于2016年1月31日提交的美国临时专利申请第62/289,274号和2015年4月3日提交的美国临时专利申请第62/142,731号的优先权。将这些申请的全部内容通过引用整体并入本文。
关于联邦赞助的研究或发展的声明
本发明是由国家卫生研究院颁发的资助号NS038194和TR000888的政府赞助下进行的。政府享有本申请的一定权利。
发明领域
本公开涉及新型亨廷汀(huntingtin)靶标和用于治疗亨廷顿病的新型寡核苷酸。
背景
包括亨廷顿病、帕金森病和阿尔茨海默病在内的神经性病症，代表主要未满足的医学需求。在一些情况下，这些疾病为单基因的，使其成为寡核苷酸治疗性干预，例如RNA干扰(RNAi)的理想靶标。RNAi为涉及短的双链RNA片段的基本机制，其可用于重编程细胞机构并根据需要使靶标mRNA沉默和降解。该技术为临床上先进的，并彻底改变了人类功能遗传学领域。
已经探索了既作为疗法又作为功能研究工具的mRNA敲低的许多不同的技术，包括基于病毒的短发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸(ASO)和裸露或略微修饰的siRNA的递送(Sah,D.W.Y.&Aronin,N.Oligonucleotide therapeutic approaches for Huntingtondisease.J.Clin.Invest.121,500–507(2011)；DiFiglia,M等人.Therapeutic silencingof mutant huntingtin with siRNA attenuates striatal and corticalneuropathology and behavioral deficits.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 104,17204–17209(2007))。
ASO也显示为一种有希望的方法。该技术表现出在没有递送媒介物的情况下有效递送至细胞，并且已经被施用于脑部用于治疗亨廷顿病，在啮齿动物和非人类的灵长类动物脑部成功敲低(Mantha,N.,Das,S.K.&Das,N.G.RNAi-based therapies forHuntington's disease:delivery challenges and opportunities.Therapeuticdelivery 3,1061–1076(2012)；Kordasiewicz,H.B等人.Sustained TherapeuticReversal of Huntington's disease by Transient Repression of huntingtinSynthesis.NEURON 74,1031–1044(2012))。不幸的是，目前的研究显示需要两周内施用700μg累积剂量才能看到仅50％的沉默(Kordasiewicz,见上文)。
在过去，未经修饰的siRNA(“裸siRNA”)已经难以递送到较敏感的细胞系和体内组织。虽然可以使用转染试剂，如Lipofectamine(脂质体)，但存在非常窄的如下窗口，在该窗口内，其是有效的和无毒的，并且对于不同批次的神经元，其必须被独立地优化以确定相当水平的沉默所必需的siRNA与脂质的比例(Bell,H.,Kimber,W.L.,Li,M.&Whittle,I.R.Liposomal transfection efficiency and toxicity on glioma cell lines:invitro and in vivo studies.NeuroReport 9,793–798(1998)；Dass,C.R.Cytotoxicityissues pertinent to lipoplex-mediated gene therapy in-vivo.Journal ofPharmacy and Pharmacology 1–9(2010)；Masotti,A等人.Comparison of differentcommercially available cationic liposome–DNA lipoplexes:Parametersinfluencing toxicity and transfection efficiency.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 68,136–144(2009)；Zou,L.L等人.Liposome-mediated NGF genetransfection following neuronal injury:potential therapeuticapplications.Gene Ther 6,994–1005(1999))。疏水性修饰的siRNA也已经被用作细胞和脑部递送的替代物(Sah,见上文；Soutschek,J等人.Therapeutic silencing of anendogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.Nature 432,173–178(2004)；Cheng,K.,Ye,Z.,Guntaka,R.V.&Mahato,R.I.Enhanced hepatic uptake andbioactivity of type alpha1(I)collagen gene promoter-specific triplex-formingoligonucleotides after conjugation with cholesterol.Journal of Pharmacologyand Experimental Therapeutics 317,797–805(2006)；Byrne,M等人.NovelHydrophobically Modified Asymmetric RNAi Compounds(sd-rxRNA)DemonstrateRobust Efficacy in the Eye.Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics29,855–864(2013))，并且这些化合物中的一些甚至已经在临床获得成功，但确保化学稳定性和最低毒性又同时使递送最大化，仍然是困难的任务。目前RNAi技术中的障碍限制了其用于功能基因组学研究和治疗学的能力，从而为将其应用于体外和体内的神经科学领域时改善其设计提供了机会。
概述
因此，本文提供了新型亨廷汀(huntingtin)靶序列。本文还提供了靶向新型亨廷汀靶序列的新型RNA分子(例如，siRNA)。所述新型RNA分子(例如，siRNA)在单次低剂量注射后，在小鼠脑部的体外和体内原代神经元中均显示出功效和效力。
在一个方面，提供了长度为15至30个碱基或者长度为15至35个碱基的RNA分子，其包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的互补性区域。
在某些实施方案中，RNA分子为单链(ss)RNA或双链(ds)RNA。在某些实施方案中，dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的互补性区域。
在某些实施方案中，dsRNA的长度为30至35个碱基对。在某些实施方案中，互补性区域与SEQ ID NO:1的至少10、11、12或13个连续核苷酸互补。在某些实施方案中，互补性区域含有不超过3个与SEQ ID NO:1的错配。在某些实施方案中，互补性区域与SEQ ID NO:1完全互补。
在某些实施方案中，dsRNA为平端的。在某些实施方案中，dsRNA包含至少一个单链核苷酸悬突。在某些实施方案中，dsRNA包含天然存在的核苷酸。
在某些实施方案中，dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸选自：2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基团的核苷酸和与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸选自：2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯的核苷酸和包含非天然碱基的核苷酸。在某些实施方案中，dsRNA包含至少一个2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个包含5'硫代磷酸酯基团的核苷酸。
在某些实施方案中，RNA分子包含5’端、3’端并且具有与靶标的互补性，其中：(1)所述RNA分子包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸；(2)自5’端第2位和第14位的核苷酸不是2’-甲氧基-核糖核苷酸；(3)所述核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接；和(4)自3’端第1-6位的核苷酸或自3’端第1-7位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
在某些实施方案中，dsRNA具有5’端、3’端和与靶标的互补性，并且包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中：(1)所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO:1示出的序列；(2)所述第一寡核苷酸的一部分与所述第二寡核苷酸的一部分互补；(3)所述第二寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸；(4)自所述第二寡核苷酸3’端第2位和第14位的核苷酸为2’-甲氧基-核糖核苷酸；和(5)所述第二寡核苷酸的核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接。
在某些实施方案中，所述第二寡核苷酸以所述第二寡核苷酸的3’端与疏水性分子连接。在某些实施方案中，所述第二寡核苷酸与所述疏水性分子之间的连接包含聚乙二醇或三乙二醇。在某些实施方案中，自所述第二寡核苷酸3’端第1位和第2位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。在某些实施方案中，自所述第二寡核苷酸3’端第1位和第2位的核苷酸以及自所述第二寡核苷酸5’端第1位和第2位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核糖核苷酸连接。
在某些方面，提供了用于抑制生物体中HTT基因表达的药物组合物，其包含dsRNA和药学可接受的载体。dsRNA包含有义链和反义链。dsRNA的长度为15至35个碱基对，并且所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的互补性区域。
在某些实施方案中，dsRNA包含胆固醇部分。
在某些方面，提供了用于抑制细胞中HTT基因表达的方法。所述方法包括以下步骤：向细胞中引入包含有义链和反义链的双链核糖核酸(dsRNA)，所述dsRNA的长度为15至35个碱基对，并且所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的互补性区域，和将步骤(a)中产生的细胞维持足以获得所述HTT基因的mRNA转录本降解的时间，从而抑制所述细胞中HTT基因的表达。
在某些方面，提供了治疗或管理亨廷顿病的方法，其包括向需要此类治疗或管理的患者施用治疗有效量的dsRNA。所述dsRNA包含有义链和反义链，长度为15至35个碱基对，并且所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的互补性区域。
在某些实施方案中，将dsRNA施用于患者的脑部。在某些实施方案中，通过纹状体内、脑室内和/或鞘内输注和/或泵中的任一种施用dsRNA。在某些实施方案中，将dsRNA施用于脑部引起纹状体中HTT基因mRNA的减少。在某些实施方案中，将dsRNA施用于脑部引起皮质中HTT基因mRNA的减少。
在某些方面，提供了用于抑制细胞中HTT基因表达的载体。所述载体包含与核苷酸序列可操作连接的调控序列，所述核苷酸序列编码与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的RNA分子，其中所述RNA分子的长度为15至35个碱基，并且其中所述RNA分子在与表达所述HTT基因的细胞接触后使所述HTT基因的表达抑制至少20％。
在某些实施方案中，所述RNA分子为ssRNA或dsRNA。在某些实施方案中，所述dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的互补性区域。
在某些方面，提供了细胞，其包含用于抑制细胞中HTT基因表达的载体。所述载体包含与核苷酸序列可操作连接的调控序列，所述核苷酸序列编码与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的RNA分子，其中所述RNA分子的长度为15至35个碱基，并且其中所述RNA分子在与表达所述HTT基因的细胞接触后使所述HTT基因的表达抑制至少20％。
在某些实施方案中，所述RNA分子为ssRNA或dsRNA。在某些实施方案中，所述dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)基本上互补的互补性区域。
在一个方面，提供了长度为15至35个碱基的RNA分子，其包含与5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域。
在某些实施方案中，所述RNA分子为单链(ss)RNA或双链(ds)RNA。在某些实施方案中，所述dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQID NO:1)基本上互补的互补性区域。
在某些实施方案中，所述dsRNA的长度为30至35个碱基对。在某些实施方案中，互补性区域与SEQ ID NO:2或3的至少10、11、12或13个连续核苷酸互补。在某些实施方案中，互补性区域含有不超过3个与SEQ ID NO:1的错配。在某些实施方案中，互补性区域与SEQID NO:2或3完全互补。
在某些实施方案中，所述dsRNA为平端的。在某些实施方案中，所述dsRNA包含至少一个单链核苷酸悬突。在某些实施方案中，所述dsRNA包含天然存在的核苷酸。
在某些实施方案中，所述dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸选自：2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基团的核苷酸和与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸选自：2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯的核苷酸和包含非天然碱基的核苷酸。在某些实施方案中，所述dsRNA包含至少一个2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个包含5'硫代磷酸酯基团的核苷酸。
在某些实施方案中，所述RNA分子包含5’端、3’端并且具有与靶标的互补性，其中：(1)所述RNA分子包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸；(2)自5’端第2位和第14位的核苷酸不是2’-甲氧基-核糖核苷酸；(3)所述核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接；和(4)自3’端第1-6位核苷酸或自3’端第1-7位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
在某些实施方案中，所述dsRNA具有5’端、3’端和与靶标的互补性，并且包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中：(1)所述第一寡核苷酸包含SEQ ID NO:1示出的序列；(2)所述第一寡核苷酸的一部分与所述第二寡核苷酸的一部分互补；(3)所述第二寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸；(4)自所述第二寡核苷酸3’端第2位和第14位的核苷酸为2’-甲氧基-核糖核苷酸；和(5)所述第二寡核苷酸的核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接。
在某些实施方案中，所述第二寡核苷酸以所述第二寡核苷酸的3’端与疏水性分子连接。在某些实施方案中，所述第二寡核苷酸与所述疏水性分子之间的连接包含聚乙二醇或三乙二醇。在某些实施方案中，自所述第二寡核苷酸3’端第1位和第2位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。在某些实施方案中，自所述第二寡核苷酸3’端第1位和第2位的核苷酸以及自所述第二寡核苷酸5’端第1位和第2位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核糖核苷酸连接。
在某些方面，提供了用于抑制生物体中HTT基因表达的药物组合物，其包含dsRNA和药学可接受的载体。dsRNA包含有义链和反义链。dsRNA的长度为15至35个碱基对，并且所述反义链包含与5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU3'(SEQ IDNO:3)基本上互补的互补性区域。
在某些实施方案中，dsRNA包含胆固醇部分。
在某些方面，提供了用于抑制细胞中HTT基因表达的方法。所述方法包括以下步骤：向细胞中引入包含有义链和反义链的双链核糖核酸(dsRNA)，所述dsRNA的长度为15至35个碱基对，并且所述反义链包含与5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域，和将步骤(a)中产生的细胞维持足以获得所述HTT基因的mRNA转录本降解的时间，从而抑制所述细胞中HTT基因的表达。
在某些方面，提供了治疗或管理亨廷顿病的方法，其包括向需要此类治疗或管理的患者施用治疗有效量的dsRNA。所述dsRNA包含有义链和反义链，长度为15至35个碱基对，并且所述反义链包含与5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域。
在某些实施方案中，将dsRNA施用于患者的脑部。在某些实施方案中，通过纹状体内输注施用dsRNA。在某些实施方案中，将dsRNA施用于脑部引起纹状体中HTT基因mRNA的减少。在某些实施方案中，将dsRNA施用于脑部引起皮质中HTT基因mRNA的减少。
在某些方面，提供了用于抑制细胞中HTT基因表达的载体。所述载体包含与核苷酸序列可操作连接的调控序列，所述核苷酸序列编码与5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的RNA分子，其中所述RNA分子的长度为15至35个碱基，并且其中所述RNA分子在与表达所述HTT基因的细胞接触后使所述HTT基因的表达抑制至少20％。
在某些实施方案中，所述RNA分子为ssRNA或dsRNA。在某些实施方案中，所述dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含与5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域。
在某些方面，提供了细胞，其包含用于抑制细胞中HTT基因表达的载体。所述载体包含与核苷酸序列可操作连接的调控序列，所述核苷酸序列编码与5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的RNA分子，其中所述RNA分子的长度为15至35个碱基，并且其中所述RNA分子在与表达所述HTT基因的细胞接触后使所述HTT基因的表达抑制至少20％。
在某些实施方案中，所述RNA分子为ssRNA或dsRNA。在某些实施方案中，所述dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含与5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域。
在某些方面，提供了长度为15至35个碱基的RNA分子。所述RNA分子包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)、5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域，并且所述RNA分子靶向HTT基因短mRNA的3'非翻译区(UTR)。
HTT基因短mRNA的3'UTR如下：
AGCGCCAUGGUGGGAGAGACUGUGAGGCGGCAGCUGGGGCCGGAGCCUUUGGAAGUCUGCGCCCUUGUGCCCUGCCUCCACCGAGCCAGCUUGGUCCCUAUGGGCUUCCGCACAUGCCGCGGGCGGCCAGGCAACGUGCGUGUCUCUGCCAUGUGGCAGAAGUGCUCUUUGUGGCAGUGGCCAGGCAGGGAGUGUCUGCAGUCCUGGUGGGGCUGAGCCUGAGGCCUUCCAGAAAGCAGGAGCAGCUGUGCUGCACCCCAUGUGGGUGACCAGGUCCUUUCUCCUGAUAGUCACCUGCUGGUUGUUGCCAGGUUGCAGCUGCUCUUGCAUCUGGGCCAGAAGUCCUCCCUCCUGCAGGCUGGCUGUUGGCCCCUCUGCUGUCCUGCAGUAGAAGGUGCCGUGAGCAGGCUUUGGGAACACUGGCCUGGGUCUCCCUGGUGGGGUGUGCAUGCCACGCCCCGUGUCUGGAUGCACAGAUGCCAUGGCCUGUGCUGGGCCAGUGGCUGGGGGUGCUAGACACCCGGCACCAUUCUCCCUUCUCUCUUUUCUUCUCAGGAUUUAAAAUUUAAUUAUAUCAGUAAAGAGAUUAAUUUUAACGUAACUCUUUCUAUGCCCGUGUA(SEQ ID NO:4)。
在某些实施方案中，所述RNA分子为ssRNA或dsRNA。在某些实施方案中，所述dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)、5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域。
在某些方面，提供了长度为15至35个碱基的dsRNA分子，其包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)、5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQ ID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域，其中所述RNA分子靶向HTTmRNA并且包含至少一个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸为与磷脂酰胆碱衍生物连接的末端核苷酸。
在某些方面，提供了包含两个RNA分子的双支链RNA化合物，所述RNA分子的长度为15至35个碱基，包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)、5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQID NO:2)或5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3)基本上互补的互补性区域，其中所述两个RNA分子通过一个或多个独立地选自接头、间隔基和分支点的部分彼此连接。
在本文所述的任一方面，RNA分子为反义分子(例如，ASO)或GAPMER分子。在某些实施方案中，所述反义分子增强互补性区域的降解。在某些实施方案中，降解为核酸酶降解(例如，RNase H)。
附图简述
从下述说明性实施方案的详述并结合附图，将更充分地理解本发明的前述和其它特征及优势。本专利或申请文件含有至少一个以彩色完成的附图。应请求并在缴纳必需的费用后，官方将提供具有彩色附图的本专利或专利申请公布的拷贝。
图1A-B描述疏水性siRNA结构和化学组成以及在原代皮质神经元中的有效内化。A)疏水性修饰的和稳定的siRNA(hsiRNA)的示意图，B)将0.5μM Cy3-HTT10150hsiRNA(红色)添加至原代皮质神经元中。在Zeiss共聚焦显微镜上成像(63X)，用赫斯特(Hoechst)染料对细胞核染色(蓝色)。
图2A-C描述以线形图(A)或条形图(B)和(C)来作图的、靶向亨廷汀mRNA的非配制的hsiRNA的系统筛选。将一组94种hsiRNA以1.5μM添加至HeLa细胞中。在72小时，使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量亨廷汀mRNA水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝3，平均值+/-SD)。UNT-未经处理的细胞，NTC-非靶向对照。选择活性化合物(红色)用于进一步分析。
图3A-C描述在被动的(A)和脂质介导的递送(B)中通过HTT10150对亨廷汀mRNA的浓度依赖性沉默。化学修饰使能够进行被动摄取而对siRNA RISC(RNA诱导的沉默复合物)进入没有负面影响。在不存在(A)和存在(B)RNAIMAX下所示的浓度，将HeLa细胞与修饰的(含有疏水性和碱基化学修饰两者)或未经修饰的HTT10150孵育。在72小时，使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量亨廷汀mRNA的水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝3，平均值+/-SD)。UNT-未经处理的细胞。如本文所述计算IC50值。(C)为概述这些结果的表。
图4A-B图形化地描述在原代神经元中，通过HTT10150对亨廷汀mRNA和蛋白的浓度依赖性沉默(被动摄取)。将原代神经元与在所示浓度的HTT10150孵育。使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量亨廷汀mRNA的水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝3，平均值+/-SD)。UNT-未经处理的细胞。A)在原代皮质神经元和原代纹状体神经元中，1周。B)通过蛋白质印迹检测与HTT10150孵育一周之后的亨廷汀(huntingtin)蛋白水平，并归一化至β-微管蛋白。
图5A-H描述单次纹状体内注射的HTT10150在24小时之后，被定位于注射部位同侧的神经元和纤维束中。将1nmol CY3-HTT10150(红色)单侧注射到WT(FVBNj)小鼠的纹状体中。在24小时之后采集脑部，石蜡包埋并切片。(A)脑部冠状切片的平铺图像(16X)。大多数HTT10150在注射部位被定位具有快速的扩散梯度。(B)脑部矢状切片的平铺图像(16X)，注射侧。(C)脑部冠状切片的图像(40X)，非注射侧。(D)脑部冠状切片的图像(40X)，注射侧。(E,G)来自非注射侧的NueN染色的神经元(60X)。(F,H)来自注射侧的NueN染色的神经元(60X)。
图6图形化地描述体内HTT10150功效的评价。将HTT10150(2μl)单侧注射到WT(FVB)小鼠的纹状体中。在120小时处死小鼠。将脑部切成300μm切片，并从同侧和对侧均采集6个2mm纹状体的打孔样品活检(punch biopsies)。使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量亨廷汀mRNA的水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝24，平均值+/-SEM，8只动物，每个区域3个活检)。
图7A-E描述HTT10150在注射部位周围的DARPP-32阳性神经元中未显示毒性。将HTT10150单侧注射到WT(FVB)小鼠的纹状体中。5天之后，采集脑部、固定、切片以及用针对DARPP-32的抗体染色(A-D)。在注射ACSF(人工脑脊液)之后全脑扫描和60X放大率的纹状体代表性图像(A,B)或者在注射12.5μg HTT10150之后全脑扫描和60X放大率的纹状体代表性图像(C,D)。DARPP-32阳性神经元的定量(E)(n＝3只动物，平均值+/-SD)。
图8描述根据某些实施方案的靶序列、修饰的寡核苷酸及其功效。
图9描述在原代皮质神经元中hsiRNA随时间被有效摄取和内化。将0.5μM Cy3-HTT10150hsiRNA(红色)添加到原代皮质神经元中。在Zeiss共聚焦显微镜上成像(63X)，用赫斯特染料对细胞核进行染色(蓝色)。
图10A-B图形化地描述在HeLa细胞中通过HTT10150对亨廷汀mRNA的浓度依赖性沉默。在72小时，使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量亨廷汀mRNA的水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝3，平均值+/-SD)。UNT-未经处理的细胞，NTC-非靶向对照。A)16个活性序列在被动摄取(无制剂)中的剂量反应。B)8个选定的序列在脂质介导的摄取(使用Invitrogen LIPOFECTAMINE RNAIMAX转染试剂)中的剂量反应。使用GraphPad Prism 6.03，拟合剂量反应数据。
图11A-B图形化地描述亨廷汀mRNA水平。A)在将HTT10150和NTC与原代皮质神经元孵育72小时和1周之后，使用ALAMAR BLUE(Life Technologies)测试细胞活力。B)将原代皮质神经元与在所示浓度的三种HTT hsiRNA序列，即HTT10150、HTT10146和HTT1215孵育。使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量亨廷汀mRNA的水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝3，平均值+/-SD)。UNT-未经处理的细胞。
图12A-B图形化地描述在原代神经元中通过HTT10150对亨廷汀mRNA的浓度依赖性沉默(被动摄取)。将原代神经元与在所示浓度的HTT10150孵育。使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量亨廷汀mRNA的水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝3，平均值+/-SD)。UNT-未经处理的细胞。A)持续72小时和1周。B)持续1周、2周和3周。
图13图形化地描述在原代皮质神经元中针对亲环蛋白B(PPIB)的hsiRNA的功效。将原代神经元与在所示浓度的靶向PPIB的hsiRNA孵育。使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量PPIB mRNA的水平，归一化至管家基因HTT，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝3，平均值+/-SD)。UNT-未经处理的细胞，持续1周。
图14描述在原代皮质神经元中Htt减少的代表性蛋白质印迹。从5只单独的幼崽(#1-5)培养原代皮质神经元，并将其与在所示浓度的HTT10150孵育一周。使用抗体AB1通过蛋白质印迹检测亨廷汀蛋白水平。
图15A-B图形化地描述体内HTT10150功效的评价。A)将HTT10150(2μl)单侧注射到WT(FVB)小鼠的纹状体中。在120小时处死小鼠。将脑部切成300μm切片，并从同侧和对侧均采集6个2mm纹状体的打孔样品活检。使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量亨廷汀mRNA的水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝8只动物，平均值+/-SD)。B)通过蛋白质印迹定量亨廷汀蛋白沉默。
图16图形化地描述体内HTT10150细胞毒性的评价。DARPP32神经元标志物受HTT10150注射的影响最小，表明对神经元健康无重大影响。将HTT10150以所示剂量单侧注射到野生型(FVB)小鼠的纹状体中。在120小时处死小鼠。将脑部切成300μm切片，并从同侧和对侧均采集6个纹状体的打孔样品活检(2mm)。使用QUANTIGENE(Affymetrix)测量DARPP32mRNA表达的水平，归一化至管家基因PPIB(亲环蛋白B)，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝24,平均值+/-SD)。
图17A-C描述HTT10150显示在注射部位小胶质细胞活化增加两倍。将HTT10150单侧注射到WT(FVB)小鼠的纹状体中。在6小时(b)和5天(a和c)之后，采集脑部、固定、切片并用针对IBA-1的抗体染色。(A)在注射1nmol HTT10150和ACSF后5天，激活的(黑色箭头)和静息的(空心箭头)代表性图像。40X放大率。(B)在注射ACSF(n＝6)和1nmol HTT10150(n＝3)后6小时，激活的和静息的小胶质细胞的定量。(c)在注射ACSF(n＝4)和1nmol HTT10150(n＝3)后5天，激活的和静息的小胶质细胞的定量。
图18A-C描述25μg剂量的HTT10150在注射部位显示有限的毒性。将HTT10150单侧注射到WT(FVB)小鼠的纹状体中。在5天之后采集脑部、固定、切片并用针对DARPP-32的抗体染色。在注射25μg之后，全脑扫描(A)，在注射部位10X放大率(B)，在注射部位20X放大率(C)，以及60X放大率的纹状体代表性图像。
图19描述较低浓度的HTT10150对Darpp32阳性神经元未显示出毒性。将HTT10150单侧注射到WT(FVB)小鼠的纹状体中。在5天之后采集脑部、固定、切片并用针对DARPP-32的抗体染色。在注射25μg HTT10150、12.5μg HTT10150和ACSF之后，注射部位的同侧和对侧的纹状体的代表性图像(20X放大率)。
图20A-B描述HTT10150在注射后5天引起总静息小胶质细胞的轻微增加。将HTT10150单侧注射到WT(FVB)小鼠的纹状体中。在6小时和5天之后，采集脑部、固定、切片并用针对IBA-1的抗体染色。在注射ACSF(n＝6,A)(n＝4,B)和12.5μg HTT10150(n＝3,A,B)之后6小时(A)和5天(B)，总小胶质细胞的定量。
图21描述根据本发明的某些实施方案的另外的靶序列以及化学修饰和结构支架。
图22描述在一周之后，使用QUANTIGENE和ALAMAR BLUE测量的原代皮质神经元(细胞活力)中的hsiRNAHTT功效。NTC＝非靶向对照。
图23描述在一周之后，使用QUANTIGENE测量的野生型原代纹状体神经元和原代皮质神经元中的HTT hsiRNA功效。NTC＝非靶向对照。
图24描述经由被动摄取从治疗后一周至三周，原代神经元(效果持续时间)中的HTT hsiRNA功效。将HTT表达归一化至PPIB。数据显示为非靶向对照的大致百分数。UNT＝未经处理的。
图25图形化地描述在72小时之后，使用QUANTIGENE，hsiRNAHTT而非LNA-GAPMER在皮质神经元中表现出沉默平台期。N＝3。
图26显示使用RNA-SCOPE，htt和ppib在原代皮质神经元中的细胞内定位。HttmRNA，红色；ppib mRNA，绿色；细胞核(DAPI)，蓝色。
图27在神经元中验证了htt检测探针组，确认了特异性。
图28在神经元中验证了htt检测探针组，显示信号不是内含子特异的(验证内含子60-61)。
图29描述htt mRNA细胞核定位仅对神经元具有特异性。左图描述原代神经元；ppib mRNA，绿色；htt mRNA，红色，细胞核，蓝色。
图30描述皮质神经元的hsiRNAHTT处理优先除去细胞质的htt mRNA。Ppib mRNA，绿色；htt mRNA，红色；细胞核，蓝色。上图：未经处理的。下图：用1.5μM hsiRNAHTT处理三天。
图31图形化地描述皮质神经元的hsiRNAHTT处理优先除去细胞质的htt mRNA。
图32描述野生型原代皮质神经元中显示HTT蛋白沉默的蛋白质印迹。hsiRNA htt-10150；NTC＝非靶向对照，1周。
图33图形化地描述HTT10150直接注射的结果。没有观察到对神经元活力的影响。
图34描述在胆固醇-hsiRNA施用之后与注射部位相邻的毒性。
图35A-C显示部分修饰的hsiRNA表现出短的作用持续时间并且未表现出全身暴露。
图36A-C描述hsiRNA的完全代谢稳定性。
图37A-C显示完全代谢稳定性不干扰hsiRNA的RISC进入。
图38A-38E描述局部递送和分布的完全代谢稳定的hsiRNA(FM-hsiRNA)增强。
图39A-B描述由FM-hsiRNA介导的增强的效力和作用持续时间。
图40表征具有神经活性的天然存在的脂质作为hsiRNA生物缀合物。
图41描述hsiRNA疏水性与脑部分布和保留直接相关。纹状体内注射，12.5μg(0.5mg/kg)，t＝24小时，FVB/NJ小鼠(n＝2)。
图42描述二十二碳六烯酸(DHA)hsiRNA合成。
图43描述DHA-hsiRNA和chol-hsiRNA至原代皮质神经元的内化。摄取：0.5μM Cy3-DHA-hsiRNA(红色)，DAPI(蓝色)。
图44描述DHA-hsiRNA与神经元和星形胶质细胞的共定位。纹状体内注射，12.5μg(0.5mg/kg)，t＝24小时，FVB/NJ小鼠(n＝2)。
图45描述DHA-hsiRNA定位于纹状体神经元中的核周区域，而chol-hsiRNA是检测不到的。纹状体内注射，12.5μg(0.5mg/kg)，t＝24小时，FVB/NJ小鼠(n＝2)。
图46描述在单次纹状体内注射后，DHA-hsiRNA与神经元和星形胶质细胞共定位于皮质中。纹状体内注射,12.5μg(0.5mg/kg),t＝24小时，FVB/NJ小鼠(n＝2)。
图47描述DHA-hsiRNA定位于皮质神经元中的核周区域，而chol-hsiRNA是检测不到的。
图48描述DHA-hsiRNA在纹状体和皮质中的稳健沉默效率。纹状体内注射，6-25μg(0.25-1mg/kg)，t＝5天，FVB/NJ小鼠(n＝8)。
图49描述在单次纹状体内给药DHA-hsiRNA之后，其在纹状体中的作用持续时间和恢复。
图50描述初步安全性研究，显示DHA-siRNA在大于有效剂量的20倍以上不影响纹状体神经元完整性。
图51描述初步安全性研究，显示DHA-siRNA在大于有效剂量的20倍以上引起最低的纹状体小胶质细胞活化。
图52描述由寡核苷酸化学引起的核周定位。
图53描述由寡核苷酸化学引起的细胞核内病灶分布。
图54显示htt mRNA纹状体沉默的程度由寡核苷酸细胞定位实现。
图55描述靶向胶质递送。
图56描述靶向神经元递送。
图57显示DHA-hsiRNA有效地分布遍及脑部，并使纹状体和皮质中的基因沉默。纹状体内注射，12.5μg(0.5mg/kg)，t＝24小时，FVB/NJ小鼠(n＝2)。
图58显示hsiRNA在野生型原代海马神经元和Q140原代海马神经元中的功效。16％的凝胶。
图59图形化地描述hsiRNA在野生型原代海马神经元和Q140原代海马神经元中的功效。
图60显示hsiRNA在野生型原代海马神经元和Q140原代海马神经元中的功效。7.5％的凝胶。
图61显示各PC-DHA-hsiRNA和chol-hsiRNA沉默突变和野生型htt mRNA。
图62描述三类hsiRNA化学物质：DHA-hsiRNA、PC-DHA-hsiRNA和chol-hsiRNA。
图63A-B图形化地描述相对于DHA-hsiRNA，PC-DHA-hsiRNA在原代皮质神经元中增强的效力。1周，通过QUANTIGENE分析，将数据归一化至PPIB。
图64示出相对于PC-DHA-hsiRNA和DHA-hsiRNA，chol-hsiRNA对于原代皮质神经元中的基因调节具有更有效的化学作用。1周，通过QUANTIGENE分析，将数据归一化至PPIB。
图65显示PC-DHA-hsiRNA显示出比DHA-hsiRNA更好的脑部保留和更广泛的分布。以2或10nmol纹状体内注射，N＝2，在48小时采集脑部。
图66显示在单次IS注射PC-DHA-hsiRNA之后，小鼠纹状体中大约80％的沉默。
图67显示在单次IS注射PC-DHA-hsiRNA之后，小鼠皮质中大约60％的沉默。
图68描述在CSF(脑脊液)弹丸注射(250μg)48小时之后的di-hsiRNA脑部分布。
图69描述在单次IS注射之后di-hsiRNA的分布。
图70描述分支对脑部分布的影响。
图71描述在单次IS注射di-hsiRNA之后，分析体内基因沉默的研究设计。
图72描述di-hsiRNA的神经元递送。
图73描述di-hsiRNA在纹状体和皮质中的功效。IS注射，2nmol di-hsiRNA，1周，QuantiGene 2.0。
图74描述di-hsiRNA的均匀脊髓分布。
图75描述在施用di-hsiRNAHTT弹丸剂之后，htt mRNA在脊髓中的沉默。IT，3nmol，一周，QuantiGene。
图76描述在HeLa细胞和原代皮质神经元中，di-hsiRNA-介导的体内沉默。
图77描述di-hsiRNA的生物分布。纹状体内注射2nmol Di-siRNA oligo(4nmol相应的反义链)。N＝每种缀合物2只小鼠。48小时后采集脑部，并用DAPI(细胞核，蓝色)和NeuN(神经元标志物，绿色)染色。图像为代表性的。红色-oligo。
图78描述di-hsiRNA的生物分布。纹状体内注射2nmol Di-siRNA oligo(4nmol相应的反义链)。N＝每种缀合物2只小鼠。48小时后采集脑部，并用DAPI(细胞核，蓝色)和NeuN(神经元标志物，绿色)染色。图像为代表性的。红色-oligo。
图79描述在48小时之后di-hsiRNA、TEG-叠氮化物、TEG和维生素D的脑部分布。IS注射，2nmole，N＝每种缀合物2只小鼠，48小时后采集脑部。
图80描述维生素D合成对htt mRNA表达的功效。
图81描述本文提供的化合物的化学式。
图82描述R3的核苷酸间连接的实例。
图83描述图81的化学式的实施方案。
图84描述本文提供的化合物的化学式。
图85描述本文提供的化合物的化学式。
图86描述图84或图85的Y部分的实施方案。
图87描述本文提供的化合物的化学式。
图88描述图87的化学式的实施方案。
图89描述本文提供的化合物的化学式。
图90描述图89的化学式的实施方案。
图91A-D描述完全代谢稳定的hsiRNA(FM-hsiRNA)的发展。(A)部分和完全修饰的hsiRNA的示意图。(B)hsiRNA和FM-hsiRNA具有相同的进入RISC的能力(HeLa，72小时)。(C)代谢稳定的5’-E-VP与5’-P一样活跃。(D)5’-E-VP能够持续递送到远端组织(注射后7天，PNA分析)。
图92描述在弹丸CSF(ICV)输注之后，使hsiRNA能够在小鼠脑部中广泛分布的化学物质的进展。在用250μg Cy3-标记的hsiRNA变体(右图)进行ICV注射之后48小时的矢状切片图像(左图)。在10×和在相同激光强度下，用Leica瓦片阵列显微镜拍摄的图像。细胞核(蓝色)；Cy3-hsiRNA(红色)。Chol-hsiRNA主要停留在注射脑室周围，其中边缘分布至脑部的远侧。DHA-hsiRNA显示较好的分布。PC-DHA和Di-hsiRNA显示大部分扩散分布，明显递送至皮质、纹状体，甚至小脑。比例尺＝900μm。
图93描述PC-DHA-官能化固体支持物的合成方案。
图94描述DI-官能化固体支持物的合成方案。
图95A-C描述di-hsiRNA的发现。(A)来自钙化醇-hsiRNA合成的四种双产物的化学组成(粗合成的分析性HPLC)。(B)双产物在HeLa细胞中的功效，72小时，
Figure BDA0001487578630000191
所有化合物具有相等的活性。(C)单次单侧纹状体内注射(25μg)各Cy3-hsiRNA双产物，48小时。仅di-hsiRNA显示具有优先神经元摄取的广泛分布。
图96描述被设计成与hsiRNA反义链种子区域完全互补的携带高亲和力修饰(LNA)的hsiANTIDOTE反义寡核苷酸。
图97描述胆固醇和内吞肽(质子海绵)缀合的hsiRNA。
图98描述GM1-缀合的hsiRNA的液相合成方案。
图99描述DHA-缀合物(g1DHA)和PC-DHA hsiRNA缀合物(g2DHA)的化学结构。
图100描述PC-DHA hsiRNA缀合物的固相合成方案。
图101描述PC-DHA hsiRNA缀合物的液相合成方案。
图102A-D描述完全代谢稳定性对于缀合物介导的siRNA递送和体内作用持续时间是必不可少的。(A,B)与hsiRNA(A)相比，FM-hsiRNA(B)在静脉内(IV)和CSF(ICV)施用之后于组织中显示出显著增强的分布和保留。用10mg/kg IV或60μg,ICV注射野生型孕鼠(E15)。将组织以相同激光强度在Leica瓦片荧光显微镜上以10×成像。HsiRNA(红色)；细胞核(蓝色)。比例尺＝900μm。(C)在IV注射之后5天，定量组织中的完整引导链(n＝3，平均值±SEM)。(D)FM-hsiRNA在注射(12μg，纹状体内)之后使小鼠纹状体中的Htt mRNA沉默一个月。部分修饰的hsiRNA沉默不到两周。
图103A-C描述PC-DHA-hsiRNA在小鼠脑部的体内功效和安全性。(A)在注射25或50μg DHA-hsiRNA之后1周，Htt mRNA在纹状体和皮质中的水平。相对于aCSF和NTC，***P<0.0001。(B)在比有效剂量高20倍的剂量水平，没有发生可检测到的先天免疫活化(数据显示针对DHA-hsiRNA的总小胶质细胞)。(C)基于DARP32水平的正常神经元活力。注意chol-hsiRNA的毒性剂量(红色柱)。
图104A-C显示di-hsiRNA在小鼠脑部表现出广泛的分布和功效。(A)Cy3-Di-hsiRNA在视觉和组织学上遍及脑部的稳健且均匀的分布，在ICV注射(250μg，CSF，两侧)之后48小时具有明显的神经元摄取，比例尺＝100μm。(B)在单次纹状体内注射(25μg)之后7天，Htt mRNA在皮质和纹状体中的沉默。(C)在注射之后7天，hsiRNA在组织中积累(PNA分析)。
图105A-B显示在弹丸腰椎鞘内注射之后，di-hsiRNA在小鼠脊髓中表现出广泛的分布和功效。(A)Chol-hsiRNA显示从脊髓外侧至内侧的急剧的扩散梯度，但Di-hsiRNA广泛地分布遍及脊髓。用75μg Cy3-Chol-hsiRNA或Cy3-Di-hsiRNA鞘内注射动物。比例尺＝100μm。(B)在脊髓的所有区域中观察到稳健的Htt mRNA沉默(注射后7天，n＝6)。
图106描述用于检测小鼠组织中的hsiRNA引导链的基于PNA(肽核酸)的分析。将组织裂解，通过沉淀分离碎片，并通过HPLC(DNAPac P100，50％水，50％乙腈，盐梯度0-1MNaClO4)纯化PNA-引导链双链体。
图107描述通过PC-DHA-hsiRNA靶向肾脏。
图108描述GM1-hsiRNA内化和GM1-hsiRNA-介导的htt mRNA沉默。
图109描述GM1-hsiRNA脑部分布。
图110A-G显示全身施用的完全修饰的(FM)hsiRNA，在体内表现出显著增强的组织分布和功效。(a)Cy3-hsiRNA和Cy3-FM-hsiRNAsFLT1(红色)(10mg/kg IV注射)的组织分布。用DAPI对细胞核进行染色(蓝色)。在相同背景获得所有图像。(b-e)在(b)10mg/kg，IV，24小时，(c)10mg/kg，SC，24小时，(d)2x20mg/kg,IV，120小时(n＝7)，(e)2x15mg/kg，IV，120小时(n＝12)下，通过基于PNA杂交的分析进行引导链定量。(f,g)在(f)2x20mg/kg，C57B6小鼠，(n＝3，PBS；n＝7，FM-hsiRNAsFLT)，(g)2x15mg/kg，CD1小鼠，(n＝12，PBS；n＝6，NTC；n＝12，FM-hsiRNAsFLT1)之后，进行sFLT1mRNA沉默的定量。在注射之后120小时，用
Figure BDA0001487578630000211
(Affymetrix)分析测量mRNA水平，归一化至管家基因FLT1，并呈现为经PBS处理的对照的百分数。所有误差条代表平均值±SD。***，P<0.001；****，P<0.0001。
图111A-G显示完全修饰的hsiRNA广泛分布遍及脑部，并在局部施用后显示较高的沉默效力和较长的沉默持续时间。将hsiRNAHTT(a)和FM-hsiRNAHTT(b、c、d、e)进行ICV注射，示出了48小时之后通过脑部矢状切片的分布。用DAPI对细胞核进行染色(蓝色)。Cy3-hsiRNA(红色)。(f,g)将hsiRNAHTT和FM-hsiRNAHTT单侧注射到纹状体中，在(f)5天或(g)7、14和28天之后，使用
Figure BDA0001487578630000212
(Affymetrix)测量HTT mRNA的水平，归一化至管家基因PPIB，并呈现为未经处理的对照的百分数(n＝8只小鼠，平均值±SD)。NTC＝非靶向对照；CSF＝人工脑脊液。所有误差条代表平均值±SD。**，P<0.01；***，P<0.001；****,P<0.0001。
某些示例性实施方案的详述
提供了新型亨廷汀靶序列。还提供了靶向本发明的新型亨廷汀靶序列的新型siRNA。
通常，所用的与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语为本领域众所周知和常用的。除非另外指明，否则通常根据本领域众所周知的常规方法，以及如在整个本说明书中引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所述，进行本文提供的方法和技术。如本领域通常实现的或如本文所述，按照制造商的说明书进行酶反应和纯化技术。所用的与本文所述的分析化学、合成有机化学、以及药用和药物化学有关的术语，以及本文所述的分析化学、合成有机化学、以及药用和药物化学的实验室程序和技术，为本领域众所周知和常用的。标准技术用于化学合成，化学分析，药物的制剂、配制和递送，以及患者的治疗。
除非本文另有定义，否则本文中使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。除非另有规定，使用的“或”意为“和/或”。使用的术语“包括(including)”以及其它形式，如“包括(includes)”和“包括(included)”不是限制性的。
为使可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。
术语“核苷”是指具有与核糖或脱氧核糖共价连接的嘌呤或嘧啶碱基的分子。示例性核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷和胸苷。另外的示例性核苷包括肌苷、1-甲基肌苷、假尿苷、5,6-二氢尿苷、核糖胸苷、2N-甲基鸟苷和2,2N,N-二甲基鸟苷(也被称为“罕见的”核苷)。术语“核苷酸”是指具有与糖部分以酯键连接的一个或多个磷酸基团的核苷。示例性核苷酸包括核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。术语“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，并且是指通过5'与3'碳原子之间的磷酸二酯键或硫代磷酸酯连接在一起的核苷酸聚合物。
术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”，是指核糖核苷酸(例如，2、3、4、5、10、15、20、25、30或更多个核糖核苷酸)的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”，是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。可以天然合成DNA和RNA(例如，分别通过DNA复制或DNA转录)。可以在转录后修饰RNA。也可以化学合成DNA和RNA。DNA和RNA可以为单链的(即，分别为ssRNA和ssDNA)或多链的(例如，双链的，即分别为dsRNA和dsDNA)。“mRNA”或“信使RNA”为指定一条或多条多肽链的氨基酸序列的单链RNA。在蛋白质合成期间，当核糖体结合mRNA时，翻译该信息。
如本文所用，术语“小干扰RNA”(“siRNA”)(在本领域中也被称为“短干扰RNA”)，是指能够指导或介导RNA干扰的包含约10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA(或RNA类似物)。优选地，siRNA包含约15-30个核苷酸或核苷酸类似物，更优选约16-25个核苷酸(或核苷酸类似物)，甚至更优选约18-23个核苷酸(或核苷酸类似物)，以及甚至更优选约19-22个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)。术语“短”siRNA是指包含约21个核苷酸(或核苷酸类似物)，例如，19、20、21或22个核苷酸的siRNA。术语“长”siRNA是指包含约24-25个核苷酸，例如，23、24、25或26个核苷酸的siRNA。在一些情况下，短siRNA可以包括少于19个核苷酸，例如，16、17或18个核苷酸，条件是较短的siRNA保留介导RNAi的能力。同样地，在一些情况下，长siRNA可以包括超过26个核苷酸，条件是较长的siRNA在不存在进一步处理(例如，酶促处理)成短siRNA的情况下保留介导RNAi的能力。
术语“核苷酸类似物”或“改变的核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指非标准核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。示例性核苷酸类似物在任何位置被修饰，以改变核苷酸的某些化学特性，但保留核苷酸类似物执行其预期功能的能力。可以被衍生化的核苷酸位置的实例包括：5位，例如，5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷、5-丙炔尿苷、5-丙烯基尿苷等；6位，例如，6-(2-氨基)丙基尿苷；腺苷和/或鸟苷的8位，例如，8-溴鸟苷、8-氯鸟苷、8-氟鸟苷等。核苷酸类似物还包括脱氮核苷酸，例如，7-脱氮-腺苷；O-和N-修饰的(例如，烷基化的，例如，N6-甲基腺苷，或本领域在其它方面已知的)核苷酸；和其它杂环(heterocyclically)修饰的核苷酸类似物，如Herdewijn,Antisense Nucleic Acid DrugDev.,2000年8月.10(4):297-310中所述的。
核苷酸类似物还可以包含对核苷酸的糖部分的修饰。例如2'OH-基团可以被选自以下的基团代替：H、OR、R、F、Cl、Br、I、SH、SR、NH2、NHR、NR2、COOR或OR，其中R为取代或未取代的C1-C6烷基、烯基、炔基、芳基等。其它可能的修饰包括美国专利第5,858,988号和第6,291,438号中所述的那些。
也可以修饰核苷酸的磷酸基团，例如，通过用硫取代磷酸基团中的一个或多个氧(例如，硫代磷酸酯)，或者通过进行允许核苷酸执行其预期功能的其它取代，如，例如，Eckstein,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2000年4月.10(2):117-21,Rusckowski等人.Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2000年10月.10(5):333-45,Stein,AntisenseNucleic Acid Drug Dev.2001年10月.11(5):317-25,Vorobjev等人，Antisense NucleicAcid Drug Dev.2001年4月.11(2):77-85和美国专利第5,684,143号中所述。某些上文提及的修饰(例如，磷酸基团修饰)，优选降低例如，包含所述类似物的多核苷酸的体内或体外水解速率。
术语“寡核苷酸”是指核苷酸和/或核苷酸类似物的短聚合物。术语“RNA类似物”是指这样的多核苷酸(例如，化学合成的多核苷酸)，与相应的未改变或未经修饰的RNA相比，其具有至少一个改变或修饰的核苷酸但保留与相应的未改变或未经修饰的RNA相同或类似的性质或功能。如上文所论述的，与具有磷酸二酯键的RNA分子相比，寡核苷酸可以与导致RNA类似物的较低水解速率的键连接。例如，类似物的核苷酸可以包括亚甲基二醇、亚乙基二醇、氧基甲硫基、氧基乙硫基、氧基羰基氧基、二氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、和/或硫代磷酸酯键。优选的RNA类似物包括糖-修饰的和/或骨架-修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。此类改变或修饰还可以包括将非核苷酸材料添加到如RNA的末端或内部(RNA中的一个或多个核苷酸)。RNA类似物仅需要与具有介导RNA干扰能力的天然RNA足够相似。
如本文所用，术语“RNA干扰”(“RNAi”)是指RNA的选择性细胞内降解。RNAi天然存在于细胞中以去除外来RNA(例如，病毒RNA)。天然RNAi经由从游离dsRNA切割的片段进行，所述片段将降解机制引导至其它相似的RNA序列。可选地，可以由人工引发RNAi，例如，以使靶基因的表达沉默。
RNAi剂，例如，RNA沉默剂具有“与靶mRNA序列足够互补的序列以引导靶特异性RNA干扰(RNAi)”的链，意为该链具有足以引发通过RNAi机构或过程破坏靶mRNA的序列。
如本文所用，术语“分离的RNA”(例如，“分离的siRNA”或“分离的siRNA前体”)是指这样的RNA分子，当通过重组技术产生时其基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时其基本上不含化学前体或其它化学物质。
如本文所用，术语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的导致编码相应蛋白的基因的表达得以抑制或“沉默”的一组序列特异性调控机制(例如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制、共抑制和翻译阻遏)。已经在许多类型的生物体，包括植物、动物和真菌中观察到RNA沉默。
术语“差别性RNA沉默”是指例如，当两种多核苷酸序列均存在于相同细胞中时，RNA分子能够基本上抑制“第一”或“靶”多核苷酸序列的表达，而基本上不会抑制“第二”或“非靶”多核苷酸序列的表达。在某些实施方案中，靶多核苷酸序列对应于靶基因，而非靶多核苷酸序列对应于非靶基因。在其它实施方案中，靶多核苷酸序列对应于靶等位基因，而非靶多核苷酸序列对应于非靶等位基因。在某些实施方案中，靶多核苷酸序列为编码靶基因的调控区(例如启动子或增强子元件)的DNA序列。在其它实施方案中，靶多核苷酸序列为靶基因编码的靶mRNA。
术语“在体外”具有本领域公认的含义，例如，涉及纯化的试剂或提取物，例如，细胞提取物。术语“在体内”也具有本领域公认的含义，例如，涉及生物体中的活细胞，例如，永生化细胞、原代细胞、细胞系、和/或细胞。
如本文所用，术语“转基因”是指通过技术(artifice)插入到细胞中，并且成为从细胞发育的生物体的基因组一部分的任何核酸分子。此类转基因可以包括与转基因生物体部分或完全异源的(即，外来的)基因，或者可以代表与生物体的内源性基因同源的基因。术语“转基因”还意为包含编码待在转基因生物体(如动物)中表达的一个或多个工程化的RNA前体的一个或多个选定的核酸序列(如DNA)的核酸分子，其与转基因动物部分或完全异源的(即外来的)，或与转基因动物的内源性基因部分或完全同源的，但被设计为在不同于天然基因的位置插入到该动物的基因组中。转基因包括一个或多个启动子和选定的核酸序列的表达所必需的任何其它DNA如内含子，全部可操作连接到选定的序列，并且可以包括增强子序列。
疾病或病症中“涉及的”基因包括这样的基因，其正常或异常表达或其功能产生或引起疾病或病症或者所述疾病或病症中的至少一种症状。
如本文所用，术语“获得性功能突变”是指这样的基因中的任何突变，其中由所述基因编码的蛋白(即，突变蛋白)获得与该蛋白(即，野生型蛋白)通常不相关的功能，引起或促成疾病或病症。获得性功能突变可以为引起所编码的蛋白功能变化的基因中的一个或多个核苷酸的缺失、添加或取代。在一个实施方案中，获得性功能突变改变了突变蛋白的功能或引起与其它蛋白的相互作用。在另一实施方案中，获得性功能突变例如，通过改变的突变蛋白与所述正常野生型蛋白的相互作用，引起正常野生型蛋白的降低或去除。
如本文所用，术语“靶基因”是其表达被基本上抑制或“沉默”的基因。该沉默可以通过RNA沉默，例如通过切割靶基因的mRNA或靶基因的翻译阻遏来实现。术语“非靶基因”是其表达基本上未被沉默的基因。在一个实施方案中，靶基因和非靶基因的多核苷酸序列(例如由靶基因和非靶基因编码的mRNA)可以相差一个或多个核苷酸。在另一实施方案中，靶基因和非靶基因可以相差一个或多个多态性(例如，单核苷酸多态性或SNP)。在另一实施方案中，靶基因和非靶基因可以共有小于100％的序列同一性。在另一实施方案中，非靶基因可以为靶基因的同源物(例如直系同源物(orthologue)或旁系同源物(paralogue))。
“靶等位基因”是其表达被选择性抑制或“沉默的”等位基因(例如，SNP等位基因)。该沉默可以通过RNA沉默，例如通过用siRNA切割靶基因或靶等位基因的mRNA来实现。术语“非靶等位基因”是其表达基本上不被沉默的等位基因。在某些实施方案中，靶等位基因和非靶等位基因可以对应于同一靶基因。在其它实施方案中，靶等位基因对应于靶基因或与其相关，非靶等位基因对应于非靶基因或与其相关。在一个实施方案中，靶等位基因和非靶等位基因的多核苷酸序列可以相差一个或多个核苷酸。在另一实施方案中，靶等位基因和非靶等位基因可以相差一个或多个等位基因多态性(例如，一个或多个SNP)。在另一实施方案中，靶等位基因和非靶等位基因可以共有小于100％的序列同一性。
如本文所用，术语“多态性”是指当比较来自不同来源或对象(但来自相同生物体)的相同基因序列时，所鉴定的或检测到的基因序列中的变异(例如，一个或多个缺失、插入或取代)。例如，当比较来自不同对象的相同基因序列时，可以鉴定多态性。此类多态性的鉴定为本领域常规的，方法类似于用于检测，例如，乳腺癌点突变的那些方法。可以例如由从对象的淋巴细胞提取的DNA进行鉴定，随后使用对多态性区域具有特异性的引物扩增所述多态性区域。可选地，当比较同一基因的两个等位基因时，可以鉴定多态性。在具体实施方案中，多态性为单核苷酸多态性(SNP)。
生物体中同一基因的两个等位基因之间的序列变异，在本文被称为“等位基因多态性”。在某些实施方案中，等位基因多态性对应于SNP等位基因。例如，等位基因多态性可以包括SNP的两个等位基因之间的单核苷酸变异。多态性可以在编码区内的核苷酸处，但由于遗传密码的简并性，编码的氨基酸序列没有改变。可选地，多肽序列可以编码在特定位置的不同氨基酸，但氨基酸的变化不影响蛋白质功能。多态性区域也可见于基因的非编码区。在示例性实施方案中，多态性见于基因的编码区或基因的非翻译区(例如，5'UTR或3'UTR)。
如本文所用，术语“等位基因频率”为在个体的群体中单个基因座处等位基因(例如，SNP等位基因)的相对频率的量度(例如，比例或百分数)。例如，个体的群体在其体细胞的每一个中携带特定染色体基因座(以及占据该基因座的基因)的n个基因座，则等位基因的等位基因频率为该群体中等位基因占据的基因座的分数或百分数。在具体实施方案中，等位基因(例如，SNP等位基因)的等位基因频率为样品群体的至少10％(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多)。
如本文所用，术语“样品群体”是指包含在统计学上显著的个体数目的个体群体。例如，样品群体可以包含50、75、100、200、500、1000或更多个个体。在具体实施方案中，样品群体可以包含共有至少一种常见疾病表型(例如，获得功能病症)或突变(例如，获得性功能突变)的个体。
如本文所用，术语“杂合性”是指群体内在特定基因座(例如，在SNP处)为杂合的(例如，含有两个或更多个不同的等位基因)个体的分数(fraction)。可以使用本领域众所周知的方法来计算样品群体的杂合性。
如本文所用，术语“聚谷氨酰胺结构域”是指由通过肽键连接的连续谷氨酰胺残基组成的蛋白的区段或结构域。在一个实施方案中，连续区域包括至少5个谷氨酰胺残基。
如本文所用，术语“扩展的聚谷氨酰胺结构域”或“扩展的聚谷氨酰胺区段”，是指包括通过肽键连接的至少35个连续谷氨酰胺残基的蛋白的区段或结构域。此类扩展的区段见于患有本文所述的聚谷氨酰胺病症的对象中，无论对象是否显示出症状。
如本文所用，术语“三核苷酸重复”或“三核苷酸重复区域”，是指例如由特定三核苷酸序列的连续重复组成的核酸序列的区段。在一个实施方案中，三核苷酸重复包括至少5个连续三核苷酸序列。示例性的三核苷酸序列包括但不限于：CAG、CGG、GCC、GAA、CTG和/或CGG。
如本文所用，术语“三核苷酸重复疾病”是指以位于基因内的扩展的三核苷酸重复区域为特征的任何疾病或病症，所述扩展的三核苷酸重复区域为疾病或病症的原因。三核苷酸重复疾病的实例包括但不限于：脊髓小脑共济失调12型、脊髓小脑共济失调8型、脆性X综合征、脆性XE精神发育迟缓、弗里德赖希(Friedreich)共济失调和肌强直性营养不良。根据本发明进行治疗的示例性三核苷酸重复疾病，是以在基因的编码区5'端的扩展的三核苷酸重复区域为特征或由其引起的那些疾病，所述基因编码引起疾病或病症或是所述疾病或病症的原因的突变蛋白。在突变与编码区无关的情况下，某些三核苷酸疾病如脆性X综合征可能不适合根据本发明方法进行治疗，因为不存在被RNAi靶向的合适mRNA。相比之下，诸如弗里德赖希共济失调的疾病，可能适合根据本发明的方法进行治疗，因为虽然致病突变不在编码区内(即，位于内含子内)，但突变可在例如mRNA前体内(例如，预剪接的mRNA前体)。
如本文所用，术语“聚谷氨酰胺病症”是指以在编码区5'端扩展的(CAG)n重复为特征(因此编码在所编码的蛋白中的扩展的聚谷氨酰胺区域)的任何疾病或病症。在一个实施方案中，聚谷氨酰胺病症的特征在于神经细胞的进行性变性。聚谷氨酰胺病症的实例包括但不限于：亨廷顿病、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型(也被称为马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease))、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型和齿状核红核苍白球路易体萎缩。
短语“检查细胞或生物体中的基因的功能”，是指检查或研究由其产生的表达、活性、功能或表型。
如本文所用，术语“RNA沉默剂”是指能够抑制或“沉默”靶基因表达的RNA。在某些实施方案中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制来防止mRNA分子的完全加工(例如，完全翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括小的(<50b.p.)非编码RNA分子，例如，包含配对链的RNA双链体，以及可产生此类小的非编码RNA的前体RNA。示例性的RNA沉默剂包括：siRNA、miRNA、siRNA样双链体、反义寡核苷酸、GAPMER分子和双功能寡核苷酸及其前体。在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译阻遏。
如本文所用，术语“稀有核苷酸”是指天然存在的不经常出现的核苷酸，包括天然存在的不经常出现的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如，天然存在的不是鸟苷、腺苷、胞嘧啶或尿苷的核糖核苷酸。稀有核苷酸的实例包括但不限于：肌苷、1-甲基肌苷、假尿苷、5,6-二氢尿苷、核糖胸苷、2N-甲基鸟苷和2,2N,N-二甲基鸟苷。
如在工程化的RNA前体、或工程化的核酸分子中的术语“工程化的”，其表明该前体或分子在自然界中不存在，因为该前体或分子的核酸序列的全部或一部分由人类创建或选择。一旦被创建或选择，可以通过细胞内的机制来复制、翻译、转录、或在其它方面加工的序列。因此，在来自包含工程化的核酸分子的转基因的细胞内所产生的RNA前体为工程化的RNA前体。
如本文所用，术语“微RNA”(“miRNA”)在本领域中也被称为“小时序RNA”(“stRNA”)，是指基因编码的(例如，由病毒基因组、哺乳动物基因组、或植物基因组)并且能够指导或介导RNA沉默的小(10-50个核苷酸)RNA。“miRNA病症”应指以miRNA的异常表达或活性为特征的疾病或病症。
如本文所用，术语“双功能寡核苷酸”是指具有式T-L-μ的RNA沉默剂，其中T为mRNA靶向部分，L为连接部分，以及μ为miRNA募集部分。如本文所用，术语“mRNA靶向部分(mRNAtargeting moiety)”、“靶向部分(targeting moiety)”、“mRNA靶向部分(mRNA targetingportion)”或“靶向部分(targeting portion)”，是指具有足够的大小和与所选择或靶向用于沉默的mRNA的部分或区域具有足够的互补性(即，该部分具有足以捕获靶mRNA的序列)的双功能寡核苷酸的结构域、部分或区域。如本文所用，术语“连接部分(linking moiety)”或“连接部分(linking portion)”，是指共价结合或连接mRNA的RNA沉默剂的结构域、部分或区域。
如本文所用，术语RNA沉默剂，例如，siRNA或RNA沉默剂的“反义链”，是指与靶向沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸的部分(例如，约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸)基本上互补的链。反义链或第一链具有与期望的靶mRNA序列足够互补的序列以指导靶特异性沉默，例如，足以通过RNAi机构或过程(RNAi干扰)引发破坏期望的靶mRNA的互补性，或足以引发期望的靶mRNA的翻译阻遏的互补性。
术语RNA沉默剂，例如，siRNA或RNA沉默剂的“有义链”或“第二链”，是指与反义链或第一链互补的链。反义链和有义链也可以被称为第一链或第二链，所述第一链或第二链与靶序列具有互补性，并且相应的第二链或第一链与所述第一链或第二链具有互补性。miRNA双链体中间体或siRNA样双链体，包括与靶向沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸的部分具有足够互补性的miRNA链和具有足够的互补性以与miRNA链形成双链体的miRNA*链。
如本文所用，术语“引导链”是指进入RISC复合物并指导切割靶mRNA的RNA沉默剂的链，例如，siRNA双链体或siRNA序列的反义链。
如本文所用，如在RNA沉默剂的双链体区域的不对称(例如，shRNA的茎)中，术语“不对称”是指RNA沉默剂的末端之间(例如，在第一链或茎部分的末端核苷酸与相对的第二链或茎部分的末端核苷酸之间)的键强度或碱基配对强度的不均等，使得双链体一条链的5'端比互补链的5'端更频繁地处于短暂不配对(如单链)的状态。该结构差异确定双链体的一条链优先并入RISC复合物中。5'端与互补链不太紧密配对的链，会优先并入RISC中并介导RNAi。
如本文所用，术语“键强度”或“碱基对强度”，是指在寡核苷酸双链体(例如，siRNA双链体)的相对链中，所述核苷酸(或核苷酸类似物)对之间相互作用的强度，其主要是由于所述核苷酸(或核苷酸类似物)之间的氢键、范德华力相互作用等而产生的。
如本文所用，如在反义链的5’端中的“5’端”，是指在反义链的5'末端的5'末端核苷酸，例如，1至约5个核苷酸。如本文所用，如在有义链的3’端中的“3’端”，是指与互补反义链的5’端的核苷酸互补的区域，例如，1至约5个核苷酸的区域。
如本文所用，术语“去稳定的核苷酸(destabilizing nucleotide)”，是指这样的第一核苷酸或核苷酸类似物，其能够与第二核苷酸或核苷酸类似物形成碱基对，使得该碱基对具有比常规碱基对(即，沃森-克里克碱基对)低的键强度。在某些实施方案中，去稳定的核苷酸能够与第二核苷酸形成错配碱基对。在其它实施方案中，去稳定的核苷酸能够与第二核苷酸形成摇摆碱基对。在其它实施方案中，去稳定的核苷酸能够与第二核苷酸形成模糊的碱基对。
如本文所用，术语“碱基对”是指在寡核苷酸双链体(例如，由RNA沉默剂的链和靶mRNA序列形成的双链体)的相对链中，核苷酸(或核苷酸类似物)对之间的相互作用，其主要是由于所述核苷酸(或核苷酸类似物)之间的氢键、范德华力相互作用等而产生的。如本文所用，术语“键强度”或“碱基对强度”是指碱基对的强度。
如本文所用，术语“错配的碱基对”是指由非互补的或非-沃森-克里克碱基对，例如，非正常互补的G:C、A:T或A:U碱基对组成的碱基对。如本文所用，术语“模糊的碱基对”(也被称为无差别性碱基对)是指由通用核苷酸形成的碱基对。
如本文所用，术语“通用核苷酸”(也被称为“中性核苷酸”)包括具有这样的碱基(“通用碱基”或“中性碱基”)的那些核苷酸(例如某些去稳定的核苷酸)，所述碱基在形成碱基对时不显著区分互补多核苷酸中的碱基。通用核苷酸主要为疏水性分子，由于堆积相互作用其能够有效地挤入反向平行的双链体核酸(例如，双链DNA或RNA)中。通用核苷酸的碱基部分通常包括含氮的芳族杂环部分。
如本文所用，术语“足够的互补性”或“足够程度的互补性”，意为RNA沉默剂具有分别足以结合期望的靶RNA并且引发靶mRNA的RNA沉默的序列(例如在反义链、mRNA靶向部分或miRNA募集部分中)。
如本文所用，术语“翻译阻遏”是指mRNA翻译的选择性抑制。经由从shRNA前体切割的miRNA来进行天然的翻译阻遏。RNAi和翻译阻遏均由RISC介导。RNAi和翻译阻遏均可自然发生，或者可以由人工引发，例如，以使靶基因的表达沉默。
本发明的各种方法包括这样的步骤，其涉及将数值、水平、特征、特性、性质等与“合适的对照”(在本文可以互换地被称为“适当的对照”)进行比较。“合适的对照”或“适当的对照”为本领域普通技术人员熟悉的用于比较目的的任何对照或标准。在一个实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”为在进行本文所述的RNAi方法之前测定的数值、水平、特征、特性、性质等。例如，转录速率、mRNA水平、翻译速率、蛋白质水平、生物活性、细胞特性或性质、基因型、表型等，可以在将本发明的RNA沉默剂引入细胞或生物体之前测定。在另一实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”为在细胞或生物体(例如表现出例如正常特征的对照或正常细胞或生物体)中测定的数值、水平、特征、特性、性质等。在另一实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”为预定义的数值、水平、特征、特性、性质等。
除非另有限定，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同。尽管可以将与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料用于实践或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。将本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。如发生矛盾，则本专利说明书包括定义，将占据主导地位。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非旨在限制。
在下述小节中进一步详细描述本发明的各个方面。
I.聚谷氨酰胺病症
聚谷氨酰胺病症为一类以常见的基因突变为特征的疾病或病症。具体地，所述疾病或病症的特征在于扩展的三核苷酸CAG的重复，其在编码的蛋白中产生扩展的谷氨酰胺残基的延伸。聚谷氨酰胺病症为相似的，因为该疾病的特征在于神经细胞的进行性变性。尽管聚谷氨酰胺病症具有相似性，但它们发生在不同的染色体上，因此发生在完全不同的DNA区段中。聚谷氨酰胺病症的实例包括：亨廷顿病、齿状核红核苍白球路易体萎缩、脊延髓肌萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调6型和脊髓小脑共济失调7型。
本发明的聚谷氨酰胺病症的特征在于例如，具有约30至35个谷氨酰胺残基、约35至40个谷氨酰胺残基、约40至45个谷氨酰胺残基、或具有约45或更多个谷氨酰胺残基的结构域。聚谷氨酰胺结构域通常含有连续的谷氨酰胺残基(Q n>36)。
II.亨廷顿病
在一些实施方案中，本发明的RNA沉默剂被设计为靶向突变的人类亨廷汀蛋白(htt)中的多态性(例如单核苷酸多态性)，以用于亨廷顿病的治疗。
作为常染色体显性疾病遗传的亨廷顿病，导致受损的认知和运动疾病。在饥饿或感染而过早死亡之前，患者可以生存超过十年并伴随着严重衰弱。在大多数情况下，疾病开始于四十岁或五十岁，但一个亚组的患者在十几岁就显示出疾病。亨廷顿病的基因突变为亨廷汀(huntingtin)基因中延长的CAG重复。正常个体中CAG重复的数目从8至35变化(Kremer等人,1994)。基因突变，例如CAG重复的长度从正常状态的增加(在亨廷汀基因中小于36个至在疾病中大于36个)，与突变的亨廷汀蛋白的合成相关，所述突变的亨廷汀蛋白具有大于36个聚谷氨酰胺(Aronin等人,1995)。通常，具有36或更多个CAG重复的个体会发展亨廷顿病。对于具有延长的CAG作为潜在突变的多达二十种其它疾病的原型而言，亨廷顿病仍没有有效的治疗。多种干预，如中断凋亡途径、添加试剂以促进线粒体效率和阻断NMDA受体，已经在亨廷顿病的细胞培养物和小鼠模型中显示出希望。然而，这些方法最多显示细胞或动物存活的短暂延长。
亨廷顿病符合遗传学的中心法则：突变基因作为产生突变的mRNA的模板；然后，突变的mRNA指导突变蛋白的合成(Aronin等人,1995；DiFiglia等人,1997)。不希望受科学理论的束缚，认为突变的亨廷汀蛋白在纹状体和皮质的选择性神经元中积累，破坏当前确定的细胞活性并引起神经元功能障碍和死亡(Aronin等人,1999；Laforet等人,2001)。因为突变基因的单拷贝足以引起亨廷顿病，所以最简化的治疗会使得突变基因无效。理论方法可包括停止突变的亨廷汀的基因转录、破坏突变的mRNA和阻断翻译。每种具有相同的结果：失去突变的亨廷汀。
III.亨廷汀基因
与亨廷顿病相关的疾病基因被称为亨廷汀(huntingtin)或(htt)。亨廷汀基因座很大，横跨180kb并且由67个外显子组成。亨廷汀基因广泛表达，是正常发育所必需的。其表达为2种可选择的聚腺苷酸化形式，在各种胎儿和成人组织中显示不同的相对丰度。较大的转录本大约为13.7kb，并且主要在成人和胎儿脑部表达，然而大约10.3kb的较小转录本的表达更广泛。两个转录本在其3'非翻译区方面有所不同(Lin等人,1993)。预测这两种信息编码含有3144个氨基酸的348千道尔顿蛋白质。导致亨廷顿病的基因缺陷，被认为赋予mRNA新的性质或改变蛋白质的功能。
本发明使用RNA干扰靶向亨廷汀(例如，野生型和/或突变的亨廷汀)(Hutvagner等人,2002)。双链RNA(siRNA)的一条链与亨廷汀mRNA中的靶序列互补。在将siRNA引入神经元之后，siRNA部分解开，以位点特异性方式结合亨廷汀mRNA中的多态性区域，并激活mRNA核酸酶。该核酸酶切割亨廷汀mRNA，从而停止亨廷汀(例如，野生型和/或突变的亨廷汀)的翻译。细胞自身去除被部分消化的mRNA，从而妨碍翻译，或细胞消化被部分翻译的蛋白质。在某些实施方案中，神经元靠来自正常等位基因的野生型亨廷汀存活，通过除去突变的亨廷汀的产生来防止其肆虐。
在本发明的实施方案中，本发明的RNA沉默剂能够靶向图8中列出的一个或多个靶序列。在某些示例性实施方案中，本发明的RNA沉默剂能够靶向在基因位置列出的一个或多个靶序列中的一个或多个靶序列，所述基因位置选自：人htt基因的1214、1218、1219、1257、1894、1907、2866、4041、4049、5301、6016、6579、8603、10125、10146、10150、424、456、522、527、878、879、908、1024、1165、1207、1212、1217、1220、1223、1227、1229、1260、1403、1470、1901、1903、2411、2412、2865、3801、4040、4048、4052、4055、4083、4275、4372、4374、4376、4425、4562、4692、4721、5200、5443、5515、8609、10130、10134、10142、10169、10182、10186、10809、11116、11129、11134、11147、11412、11426、11443、11659、11666、11677、11863、11890、11927、11947、12163、12218、12223、12235、12279、12282、12297、12309、12313、12331、13136、13398、13403、13423、13428(如图8示出的)。在某些示例性实施方案中，本发明的RNA沉默剂能够靶向在基因位置列出的一个或多个靶序列中的一个或多个靶序列，所述基因位置选自：人htt基因的5301、10125、10146、10150、424、878、879、4083、4275、4562、4721、5200、10130、10134、10142、11116、11129、11134、11147、11412、11426、11443、11659、11666、11677、11863、11890、11927、11947、12163、12218、12223、12235、12279、12282、12297、12331、13136、13423和13428(如图8示出的)。人htt基因的具体示例性靶序列可以见于10150位(5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1))、10146位(5'AUAUCAGUAAAGAGA 3'(SEQID NO:2))和10125位(5'CUCAGGAUUUAAAAU 3'(SEQ ID NO:3))。每个靶序列的基因组序列可以见于，例如，由NCBI维护的可公开获得的数据库。
在某些示例性实施方案中，本发明的能够靶向一个或多个靶序列中的一个或多个靶序列的RNA沉默剂，示于下文表1和图21中(其也包括示例性修改)。
Figure BDA0001487578630000361
Figure BDA0001487578630000371
表1.根据本发明的某些实施方案的另外的靶序列
IV.siRNA设计
在一些实施方案中，如下设计siRNA。首先，选择靶基因(例如，htt基因)的一部分，例如，图8示出的一个或多个靶序列，例如，来自靶基因的5'非翻译区的10150、10146和/或10125。在这些位点进行mRNA的切割会消除相应突变蛋白的翻译。基于靶序列设计有义链(参见图8)。优选地，该部分(和相应的有义链)包括约19至25个核苷酸，例如，19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。更优选地，该部分(和相应的有义链)包括21、22或23个核苷酸。然而，本领域技术人员会理解，具有小于19个核苷酸或大于25个核苷酸的长度的siRNA，也可以发挥功能来介导RNAi。因此，此类长度的siRNA也在本发明的范围内，条件是它们保留介导RNAi的能力。已经证明较长的RNAi剂在某些哺乳动物细胞中引起干扰素或PKR应答，这可能是不期望的。优选地，本发明的RNAi剂不会引起PKR应答(即，具有足够短的长度)。然而，较长的RNAi剂可用于，例如不能产生PRK应答的细胞类型中，或其中PKR应答已经被替代性手段下调或抑制的情况。
有义链序列被设计成使得靶序列基本上在链的中间。在一些情况下，将靶序列移动到偏离中心的位置可以降低siRNA切割的效率。如果检测到野生型mRNA停止沉默(off-silencing)，则可能期望使用此类组成，即，效率较低的组成。
反义链通常与有义链的长度相同，并且包括互补核苷酸。在一个实施方案中，所述链是完全互补的，即，当对齐或退火时，所述链是平端的。在另一实施方案中，所述链包括对齐或退火，使得产生1-、2-、3-、4-、5-、6-或7-个核苷酸悬突，即，有义链的3’端比反义链的5’端更远地延伸1、2、3、4、5、6或7个核苷酸，和/或反义链的3’端比有义链的5’端更远地延伸1、2、3、4、5、6或7个核苷酸。悬突可以包括对应于靶基因序列(或其互补物)的核苷酸(或由其组成)。可选择地，悬突可以包括脱氧核糖核苷酸，例如dT、或核苷酸类似物、或其它合适的非核苷酸材料(或由其组成)。
为促进反义链进入RISC(并因此增加或改善靶向切割和沉默的效率)，可以改变(例如减弱或减小)有义链的5’端与反义链的3’端之间的碱基对强度，如名称为“用于控制RNA沉默功效的方法和组合物(Methods and Compositions for Controlling Efficacyof RNA Silencing)”的美国专利第7,459,547号、第7,772,203号和第7,732,593号(2003年6月2日提交的)，以及名称为“用于增强RNAi的功效和特异性的方法和组合物(Methods andCompositions for Enhancing the Efficacy and Specificity of RNAi)”的美国专利第8,309,704号、第7,750,144号、第8,304,530号、第8,329,892号和第8,309,705号(2003年6月2日提交的)中详细描述的，将其内容通过引用整体并入本文。在本发明这些方面的一个实施方案中，由于第一链或反义链的5’端与第二链或有义链的3’端之间的G:C碱基对少于第一链或反义链的3’端与第二链或有义链的5’端的G:C碱基对，碱基对强度较小。在另一实施方案中，由于第一链或反义链的5’端与第二链或有义链的3’端之间具有至少一个错配的碱基对，碱基对强度较小。在某些示例性实施方案中，错配的碱基对选自：G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C和U:U。在另一实施方案中，由于第一链或反义链的5’端与第二链或有义链的3’端之间具有至少一个摇摆碱基对，例如G:U，碱基对强度较小。在另一实施方案中，由于至少一个碱基对包含稀有核苷酸，例如肌苷(I)，碱基对强度较小。在某些示例性实施方案中，碱基对选自：I:A、I:U和I:C。在另一实施方案中，由于至少一个碱基对包含修饰的核苷酸，碱基对强度较小。在某些示例性实施方案中，修饰的核苷酸选自：2-氨基-G、2-氨基-A、2,6-二氨基-G和2,6-二氨基-A。
下文详细描述了适合于靶向图8示出的htt靶序列的siRNA设计。根据上述示例性教导，可以针对htt基因中存在的任何其它靶序列来设计siRNA。此外，该技术适用于靶向任何其它靶序列，例如，非致病性靶序列。
为了验证siRNA破坏mRNA(例如，亨廷汀mRNA)的有效性，可以将siRNA与基于果蝇的体外mRNA表达系统中的cDNA(例如，亨廷汀cDNA)一起孵育。在琼脂糖凝胶上放射自显影地检测用32P放射性标记的新合成的mRNA(例如，亨廷汀mRNA)。切割的mRNA的存在表明了mRNA核酸酶活性。合适的对照包括省略siRNA。可选地，选择具有与所选siRNA相同的核苷酸组成，但与适当的靶基因无显著的序列互补性的对照siRNA。可以通过随机扰乱选定的siRNA的核苷酸序列来设计此类阴性对照；可以进行同源性检索，以确保阴性对照与适当基因组中的任何其它基因缺乏同源性。此外，可以通过将一个或多个碱基错配引入序列中来设计阴性对照siRNA。
选择siRNA-mRNA互补位点，其导致最佳的mRNA特异性和最大的mRNA切割。
虽然本发明主要以靶向与扩展的CAG区域突变不同的基因(例如，在htt中)的特定靶序列为特征，但本领域技术人员会理解，靶向突变区在某些情况下可具有作为治疗策略的适用性。可以使用与串联的CAG互补的siRNA来实现靶向突变区。siRNAcag会利用CAG互补来结合mRNA，但其可以被预期具有更大的机会结合扩展的CAG系列。多个siRNAcag会结合突变的亨廷汀mRNA(与较少的siRNAcag会结合野生型亨廷汀mRNA相比)；因此，突变的亨廷汀mRNA更可能被切割。使用该方法成功地使mRNA失活，也会除去正常或野生型亨廷汀mRNA。另外，至少在某种程度上被灭活的可以为也具有CAG重复的其它正常基因(大约70个)，其中它们的mRNA能够与siRNA相互作用。因此，这种方法将依赖于消耗策略—相比野生型亨廷汀mRNA或其它大约69条编码聚谷氨酰胺的mRNA，更多突变的亨廷汀mRNA会被破坏。
V.RNAi剂
本发明包括，例如，如上文所述设计的siRNA分子。本发明的siRNA分子可以为化学合成的，或可以由DNA模板体外转录或来自体内的，例如shRNA，或通过使用重组的人DICER酶以将体外转录的dsRNA模板切割成介导RNAi的20-、21-或23-bp双链体RNA的库。可以使用本领域已知的任何方法来设计siRNA分子。
在一个方面，代替RNAi剂作为干扰核糖核酸，例如，如上文所述的siRNA或shRNA，RNAi剂可以编码干扰核糖核酸，例如，如上文所述的shRNA。换言之，RNAi剂可以为干扰核糖核酸的转录模板。因此，本发明的RNAi剂还可以包括小发夹RNA(shRNA)，和被工程化以表达shRNA的表达构建体。shRNA的转录起始于聚合酶III(pol III)启动子，并且被认为在4-5-胸腺嘧啶转录终止位点的2位终止。在表达时，shRNA被认为折叠成具有3'UU-悬突的茎环结构；随后，处理这些shRNA的末端，将所述shRNA转化成约21-23个核苷酸的siRNA样分子(Brummelkamp等人，2002；Lee等人，2002，见上文；Miyagishi等人，2002；Paddison等人，2002，见上文；Paul等人，2002，见上文；Sui等人，2002，见上文；Yu等人，2002，见上文)。关于shRNA设计和使用的更多信息，可以见于下述地址的互联网：katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf和katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR_strategy1.pdf)。
本发明的表达构建体包括适用于适当表达系统的任何构建体，并且包括但不限于本领域已知的逆转录病毒载体、线性表达盒、质粒和病毒或病毒来源的载体。此类表达构建体可以包括诱导型启动子，RNA Pol III启动子系统，如U6snRNA启动子或H1RNA聚合酶III启动子或本领域已知的其它启动子中的一种或多种。所述构建体可以包括siRNA的一条或两条链。表达两条链的表达构建体还可以包括连接两条链的环结构，或者每条链可以在同一构建体中从单独的启动子分别转录。每条链也可以从单独的表达构建体转录(Tuschl,T.,2002,见上文)。
可以通过本领域已知的方法，包括阳离子脂质体转染和电穿孔，将合成的siRNA递送到细胞中。为在某些情况下获得较长期抑制靶基因(即，htt基因)和促进递送，可以在细胞中由重组DNA构建体表达一种或多种siRNA。此类在细胞中由重组DNA构建体表达siRNA双链体以允许细胞中较长期的靶基因抑制的方法为本领域已知的，包括哺乳动物Pol III启动子系统(例如，H1或U6/snRNA启动子系统(Tuschl,T.,2002,见上文)，其能够表达功能性双链siRNA；(Bagella等人,1998；Lee等人,2002,见上文；Miyagishi等人,2002,见上文；Paul等人,2002,见上文；Yu等人,2002),见上文；Sui等人,2002,见上文)。RNA Pol III的转录终止在DNA模板中四个连续T残基的运行中发生，提供在特定序列结束siRNA转录本的机制。siRNA与以5'-3'和3'-5'取向的靶基因的序列互补，并且siRNA的两条链可以在同一构建体或单独的构建体中表达。由H1或U6snRNA启动子驱动并且在细胞中表达的发夹siRNA，可以抑制靶基因表达(Bagella等人,1998；Lee等人,2002,见上文；Miyagishi等人,2002,见上文；Paul等人,2002,见上文；Yu等人,2002),见上文；Sui等人,2002,见上文)。当将含有受T7启动子控制的siRNA序列的构建体与表达T7RNA聚合酶的载体共转染到细胞中时，也能产生功能性siRNA(Jacque等人,2002,见上文)。单个构建体可以含有编码siRNA的多个序列，如编码htt的基因的多个区域，靶向相同基因或多个基因的多个序列，并且可以由例如单独的PolIII启动子位点驱动。
动物细胞表达一系列大约22个核苷酸的非编码RNA，其被称为微RNA(miRNA)，可以在动物发育期间调控转录后或翻译水平的基因表达。miRNA的一种共同特征为它们全部可能由Dicer、RNase III型酶或其同源物从大约70个核苷酸前体RNA茎环中切除。通过用与靶mRNA互补的序列取代miRNA前体的茎序列，表达工程化前体的载体构建体可以用于产生siRNA，以在哺乳动物细胞中引发针对特异性mRNA靶标的RNAi(Zeng等人,2002,见上文)。当由含有聚合酶III启动子的DNA载体表达时，微RNA设计的发夹可以沉默基因表达(McManus等人,2002,见上文)。在不存在siRNA-介导的基因沉默下，微RNA靶向多态性也可以用于阻断突变蛋白的翻译。此类应用可用于例如，其中设计的siRNA引起野生型蛋白的脱靶沉默的情况。
通过siRNA的表达，例如，通过产生具有受RNA Pol II启动子转录控制的siRNA的重组腺病毒，病毒介导的递送机制也可以用于诱导靶基因的特异性沉默(Xia等人,2002,见上文)。通过这些重组腺病毒感染HeLa细胞，可允许降低的内源性靶基因表达。将重组腺病毒载体注射到表达siRNA的靶基因的转基因小鼠中，导致体内靶基因表达降低。Id。在动物模型中，全胚胎电穿孔可以将合成的siRNA有效地递送到植入后的小鼠胚胎中(Calegari等人,2002)。在成年小鼠中，siRNA的有效递送可以经由尾静脉通过“高压”递送技术，即将大体积的含有siRNA的溶液快速注射(5秒内)到动物中来实现(Liu等人,1999,见上文；McCaffrey等人,2002,见上文；Lewis等人,2002)。纳米颗粒和脂质体也可以用于将siRNA递送到动物中。在某些示例性实施方案中，重组腺相关病毒(rAAV)及其相关载体可以用于将一种或多种siRNA递送到细胞，例如，神经细胞(例如，脑细胞)中(美国专利申请2014/0296486、2010/0186103、2008/0269149、2006/0078542和2005/0220766)。
本发明的核酸组合物包括本领域已知的未经修饰的siRNA和修饰的siRNA，如交联的siRNA衍生物或具有例如与其3'或5’端连接的非核苷酸部分的衍生物。以这种方式修饰siRNA衍生物，与相应siRNA相比可以改善所得siRNA衍生物的细胞摄取或增强其细胞靶向活性，可用于追踪细胞中的siRNA衍生物，或与相应siRNA相比改善siRNA衍生物的稳定性。
如本文所述引入细胞或整个生物体的工程化RNA前体，将导致产生期望的siRNA分子。然后，此类siRNA分子与RNAi途径的内源性蛋白质组分缔合，以结合并靶向特异性mRNA序列用于切割和破坏。以这种方式，待由工程化RNA前体产生的siRNA靶向的mRNA，将从细胞或生物体中耗尽，导致细胞或生物体中由该mRNA编码的蛋白质的浓度降低。RNA前体通常为单独编码dsRNA的任一条链或编码RNA发夹环结构的整个核苷酸序列的核酸分子。
本发明的核酸组合物可以是未缀合的，或可以与另一部分如纳米颗粒缀合，以增强所述组合物的性质，例如，药代动力学参数如吸收、功效、生物利用度和/或半衰期。缀合可以通过本领域已知的方法，例如，使用以下文献中的方法来实现：Lambert等人,DrugDeliv.Rev.:47(1),99-112(2001)(描述了装载至聚氰基丙烯酸烷基酯(PACA)纳米颗粒的核酸)；Fattal等人,J.Control Release 53(1-3):137-43(1998)(描述了与纳米颗粒结合的核酸)；Schwab等人,Ann.Oncol.5Suppl.4:55-8(1994)(描述了与嵌入剂、疏水性基团、聚阳离子或PACA纳米颗粒连接的核酸)；和Godard等人,Eur.J.Biochem.232(2):404-10(1995)(描述了与纳米颗粒连接的核酸)。
也可以使用本领域已知的任何方法来标记本发明的核酸分子。例如，可以用荧光团例如Cy3、荧光素或罗丹明来标记所述核酸组合物。可以使用试剂盒，例如，SILENCERTMsiRNA标记试剂盒(Ambion)进行标记。此外，可以，例如，使用3H、32P或其它适当的同位素来放射性标记siRNA。
此外，因为认为RNAi经由至少一个单链RNA中间体进行，所以技术人员会理解，也可以如本文所述设计(例如，用于化学合成)、产生(例如，酶促产生的)或表达(例如，来自载体或质粒)，以及根据本文要求保护的方法来利用ss-siRNA(例如，ds-siRNA的反义链)。此外，在无脊椎动物中，可以通过充当RNAi效应物的长dsRNA(例如，长度为约100-1000个核苷酸，优选长度为约200-500，例如约250、300、350、400或450个核苷酸的dsRNA)来有效地引发RNAi(Brondani等人,Proc Natl Acad Sci USA.2001年12月.4；98(25):14428-33.Epub2001Nov.27.)。
VI.抗-Htt RNA沉默剂
本发明的特征在于：抗-亨廷汀RNA沉默剂(例如，siRNA和shRNA)，制备所述RNA沉默剂的方法，以及使用所述改善的RNA沉默剂(或其部分)用于亨廷汀蛋白(例如，突变的亨廷汀蛋白)的RNA沉默的方法(例如，研究和/或治疗方法)。所述RNA沉默剂包含反义链(或其部分)，其中所述反义链与杂合的单核苷酸多态性具有足够的互补性，以介导RNA介导的沉默机制(例如RNAi)。
在某些实施方案中，提供具有下述性质中的一种或任何组合的siRNA化合物：(1)完全化学稳定的(即，经修饰的2’-OH残基)；(2)不对称；(3)11-16个碱基对双链体；(4)化学修饰的核苷酸的交替模式(例如，2’-氟和2’-甲氧基修饰)；和(5)5-8个碱基的单链的、完全硫代磷酸化尾部。硫代磷酸酯修饰的数量是关键的。在不同的实施方案中，该数目总共从6至17变化。
在某些实施方案中，本文所述的siRNA化合物可以与多种靶向剂缀合，所述靶向剂包括但不限于：胆固醇、DHA、苯基托品烷(phenyltropane)、皮质醇、维生素A、维生素D、GalNac和神经节苷脂。在宽范围的细胞类型(例如，HeLa、神经元、肝细胞、滋养层细胞)中，胆固醇修饰的形式相对于先前使用的化学稳定性模式(例如，其中所有嘌呤而非嘧啶被修饰)，显示出5-10倍的体外功效的改善。
具有上文和本文所述的结构性质的本发明的某些化合物，可以被称为“hsiRNA-ASP”(疏水性修饰的小干扰RNA，特征为高级稳定模式)。此外，该hsiRNA-ASP模式显示通过脑、脊髓递送至肝脏、胎盘、肾脏、脾脏和其它几个组织显著改善了分布，使得其可用于治疗性干预。
在肝脏中hsiRNA-ASP特异性递送至内皮细胞和kupper细胞而非肝细胞，使得该化学修饰模式成为与GalNac缀合物互补的而非竞争性的技术。
本发明的化合物可以在下述方面和实施方案中描述。
在第一方面，本文提供了至少16个连续核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有5’端、3’端和与靶标的互补性，其中：(1)所述寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸；(2)自5’端第2位和14位的核苷酸不是2’-甲氧基-核糖核苷酸；(3)所述核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接；和(4)自3’端第1-6位的核苷酸或自3’端第1-7位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
在第二方面，本文提供了双链化学修饰的核酸，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中：(1)所述第一寡核苷酸为本文所述的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID No:1、2、3或4)；(2)所述第一寡核苷酸的一部分与所述第二寡核苷酸的一部分互补；(3)所述第二寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸；(4)自所述第二寡核苷酸3’端第2位和第14位的核苷酸为2’-甲氧基-核糖核苷酸；和(5)所述第二寡核苷酸的核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接。
在第三方面，本文提供了具有以下结构的寡核苷酸：
X-A(-L-B-L-A)j(-S-B-S-A)r(-S-B)t-OR
其中：X为5’磷酸基团；每次出现时，A独立地为2’-甲氧基-核糖核苷酸；每次出现时，B独立地为2’-氟-核糖核苷酸；每次出现时，L独立地为磷酸二酯或硫代磷酸酯接头；S为硫代磷酸酯接头；以及R选自氢和封端基团(例如，酰基如乙酰基)；j为4、5、6或7；r为2或3；以及t为0或1。
在第四方面，本文提供了双链化学修饰的核酸，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中：(1)所述第一寡核苷酸选自第三方面所述的寡核苷酸；(2)所述第一寡核苷酸的一部分与所述第二寡核苷酸的一部分互补；和(3)所述第二寡核苷酸具有以下结构：
C-L-B(-S-A-S-B)m’(-P-A-P-B)n’(-P-A-S-B)q’(-S-A)r’(-S-B)t’-OR
其中：C为疏水性分子；每次出现时，A独立地为2’-甲氧基-核糖核苷酸；每次出现时，B独立地为2’-氟-核糖核苷酸；L为包含选自以下的一个或多个部分的接头：0-4个重复单元的乙二醇、磷酸二酯和硫代磷酸酯；S为硫代磷酸酯接头；P为磷酸二酯接头；R选自氢和封端基团(例如，酰基如乙酰基)；m’为0或1；n’为4、5或6；q’为0或1；r’为0或1；以及t’为0或1。
a)抗-Htt siRNA分子的设计
本发明的siRNA分子为由有义链和互补的反义链组成的双链体，所述反义链与httmRNA具有足够的互补性以介导RNAi。优选地，所述siRNA分子具有长度为约10-50或更多个核苷酸，即，每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。更优选地，所述siRNA分子在每条链中具有长度为约16-30，例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶区域足够互补。优选地，将链对齐，使得在未对齐的链(即，在相对链中没有互补碱基)的末端存在至少1、2或3个碱基，使得当将链退火时，1、2或3个残基的悬突出现在双链体的两端。优选地，所述siRNA分子具有长度为约10-50或更多个核苷酸，即，每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。更优选地，所述siRNA分子在每条链中具有长度为约16-30，例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶序列基本互补，并且另一条链与所述第一链相同或基本相同。
通常，可以通过使用本领域已知的任何方法，例如，通过使用下述方案来设计siRNA：
1.siRNA应对靶序列，例如图8示出的靶序列具有特异性。在一个实施方案中，靶序列存在于突变的亨廷汀(htt)等位基因中，而非野生型亨廷汀等位基因中。在另一实施方案中，靶序列存在于突变的亨廷汀(htt)等位基因和野生型亨廷汀等位基因中。在另一实施方案中，靶序列存在于野生型亨廷汀等位基因中。第一链应与靶序列互补，并且另一链与第一链基本互补(对于示例性有义链和反义链，参见图8)。在一个实施方案中，靶序列在突变的亨廷汀(htt)等位基因的扩展的CAG重复之外。在另一实施方案中，靶序列在靶基因的编码区之外。示例性的靶序列选自靶基因的5'非翻译区(5'-UTR)。在这些位点切割mRNA应消除相应突变蛋白的翻译。来自htt基因其它区域的靶序列也适于靶向。基于靶序列来设计有义链。此外，具有较低G/C含量(35-55％)的siRNA，可比具有高于55％的G/C含量的siRNA更具有活性。因此，在一个实施方案中，本发明包括具有35-55％G/C含量的核酸分子。
2.基于选定的靶位点的序列来设计siRNA的有义链。优选地，有义链包括约19至25个核苷酸，例如，19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。更优选地，有义链包括21、22或23个核苷酸。然而，技术人员会理解，具有小于19个核苷酸或大于25个核苷酸的长度的siRNA也可以发挥功能来介导RNAi。因此，此类长度的siRNA也在本发明的范围内，条件是它们保留介导RNAi的能力。已经证明较长的RNA沉默剂在某些哺乳动物细胞中引起可能不期望的干扰素或蛋白激酶R(PKR)应答。优选地，本发明的RNA沉默剂不引起PKR应答(即，其具有足够短的长度)。然而，较长的RNA沉默剂可用于，例如不能产生PRK应答的细胞类型中，或其中PKR应答已经通过替代性手段下调或抑制的情况。
本发明的siRNA分子与靶序列具有足够的互补性，使得siRNA可以介导RNAi。通常，优选含有与靶基因的靶序列部分足够同一的核苷酸序列的siRNA，以实现RISC-介导的靶基因切割。因此，在优选的实施方案中，siRNA的有义链被设计成具有与靶标一部分足够同一的序列。例如，有义链可以与靶位点具有100％的同一性。然而，100％的同一性不是必需的。优选有义链与靶标RNA序列之间大于80％的同一性，例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的同一性。本发明具有能够耐受某些序列变异的优势，以增强RNAi的效率和特异性。在一个实施方案中，有义链与靶区域(如在野生型与突变的等位基因之间相差至少一个碱基对的靶区域)，例如包含获得性功能突变的靶区域，具有4、3、2、1或0个错配的核苷酸，并且另一条链与第一链相同或基本相同。此外，具有1或2个核苷酸的小插入或缺失的siRNA序列，也可以有效介导RNAi。可选地，具有核苷酸类似物取代或插入的siRNA序列可以有效用于抑制。
可以通过本领域已知的序列比较和比对算法来测定序列同一性。为测定两个核酸序列(或两个氨基酸序列)的同一性百分比，将所述序列进行比对以用于最佳比较目的(例如，为了最佳对齐，可以将空位引入第一序列或第二序列)。然后将在对应核苷酸(或氨基酸)位置的核苷酸(或氨基酸残基)进行比较。当在第一序列中的位置被与在第二序列相应位置的相同残基占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/总的位置数目x100)，任选地对引入的空位的数目和/或引入的空位的长度进行罚分。
可以使用数学算法来实现序列的比较和两个序列之间同一性百分比的测定。在一个实施方案中，在某些部分的具有足够同一性的对齐序列中而不在具有低程度同一性的部分中产生比对(即，局部比对)。用于序列比较的局部比对算法，优选的非限制性实例为Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77中改进的算法。将此类算法并入Altschul,等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST程序(版本2.0)中。
在另一实施方案中，通过引入适当的空位来优化比对，并且在比对的序列的长度上确定同一性百分比(即，空位比对)。为获得空位比对以便比较，可以利用Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的Gapped BLAST。在另一实施方案中，通过引入适当的空位来优化比对，并且在比对的序列的整个长度上确定同一性百分比(即，全局比对)。用于序列的全局比较的数学算法，优选的非限制性实例为Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法。将此类算法并入ALIGN程序(版本2.0)，其为GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分为12，并且空位罚分为4。
3.siRNA的反义链或引导链通常与有义链的长度相同，并且包括互补的核苷酸。在一个实施方案中，引导链和有义链为完全互补的，即，当对齐或退火时，所述链为平端的。在另一实施方案中，siRNA的链可以以这样的方式配对，以具有1至7(例如2、3、4、5、6或7)，或1至4(例如2、3或4)个核苷酸的3’悬突。悬突可以包括对应于靶基因序列(或其互补物)的核苷酸(或由其组成)。可选择地，悬突可以包括脱氧核糖核苷酸(例如dT)或核苷酸类似物、或其它合适的非核苷酸材料(或由其组成)。因此，在另一实施方案中，核酸分子可以具有2个核苷酸(如TT)的3'悬突。悬突的核苷酸可以为RNA或DNA。如上所述，期望选择这样的靶区域，其中突变型：野生型的错配为，嘌呤：嘌呤的错配。
4.使用本领域已知的任何方法，将潜在靶标与适当的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，并出于考虑除去与其它编码序列具有显著同源性的任何靶序列。此类序列同源性检索的一种此类方法被称为BLAST，其可在国家生物技术信息中心的网站获得。
5.选择满足评价标准的一个或多个序列。
关于siRNA的设计和使用的其他一般信息，可以见于在Max-Plank-Institut furBiophysikalishe Chemie网站可获得的“The siRNA User Guide”。
可选地，siRNA可以在功能上被定义为能够与靶序列杂交的核苷酸序列(或寡核苷酸序列)(例如，400mM NaCl,40mM PIPES pH 6.4,1mM EDTA,50℃或70℃杂交12-16小时；随后洗涤)。另外的优选杂交条件包括：于1xSSC中在70℃杂交，或于1xSSC、50％甲酰胺中在50℃杂交，随后于0.3xSSC中在70℃洗涤，或者于4xSSC中在70℃杂交，或于4xSSC、50％甲酰胺中在50℃杂交，随后于1xSSC中在67℃洗涤。预期长度小于50个碱基对的杂交物的杂交温度，应比杂交物的解链温度(Tm)低5-10℃，其中根据下述等式确定法Tm。对于长度小于18个碱基对的杂交物，Tm(℃)＝2(A+T碱基的#)+4(G+C碱基的#)。对于长度为18至49个碱基对的杂交物，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交物中碱基的数目，以及[Na+]为杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1xSSC，[Na+]＝0.165M)。多核苷酸杂交的严紧条件的其他实例提供于Sambrook,J.,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,chapters 9and 11,以及Current Protocols in MolecularBiology,1995,F.M.Ausubel等人,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,sections 2.10and 6.3-6.4，将其通过引用并入本文。
阴性对照siRNA应与选定的siRNA具有相同的核苷酸组成，但与适当的基因组没有显著的序列互补性。可以通过随机扰乱选定的siRNA的核苷酸序列来设计此类阴性对照。可以进行同源性检索，以确保阴性对照与适当基因组中任何其它基因缺乏同源性。此外，可以通过将一个或多个碱基错配引入到序列中来设计阴性对照siRNA。
6.为了验证siRNA破坏靶mRNA(例如，野生型或突变的亨廷汀mRNA)的有效性，可以将siRNA与靶cDNA(例如，亨廷汀cDNA)在基于果蝇的体外mRNA表达系统中孵育。在琼脂糖凝胶上通过放射自显影检测用32P放射性标记的、新合成的靶mRNA(例如，亨廷汀mRNA)。切割的靶mRNA的存在表明了mRNA核酸酶的活性。合适的对照包括省略siRNA和使用非靶cDNA。可选地，选择与选定的siRNA具有相同的核苷酸组成，但与适当的靶基因没有显著的序列互补性的对照siRNA。可以通过随机扰乱选定的siRNA的核苷酸序列来设计此类阴性对照。可以进行同源性检索，以确保阴性对照与适当基因组中任何其它基因缺乏同源性。此外，可以通过将一个或多个碱基错配引入到序列中来设计阴性对照siRNA。
可以将抗-htt siRNA设计成靶向上文所述的任何靶序列。所述siRNA包含与靶序列足够互补的反义链以介导靶序列的沉默。在某些实施方案中，RNA沉默剂为siRNA。
在某些实施方案中，siRNA包含含有图8示出的序列的有义链，以及含有图8示出的序列的反义链。
选择导致最佳的mRNA特异性和最大的mRNA切割的siRNA-mRNA互补位点。
b)siRNA样分子
本发明的siRNA样分子具有这样的序列(即，具有含有这样的序列的链)：其与httmRNA的靶序列“足够互补的”，以通过RNAi或翻译阻遏来指导基因沉默。以与siRNA分子相同的方式设计siRNA样分子，但有义链与靶RNA之间的序列同一性程度近似于miRNA与其靶标之间观察到的序列同一性程度。通常，随着miRNA序列与相应靶基因序列之间序列同一性程度降低，通过翻译阻遏而非RNAi来介导转录后基因沉默的倾向性增加。因此，在期望通过靶基因的翻译阻遏来使转录后基因沉默的替代实施方案中，miRNA序列与靶基因序列具有部分互补性。在某些实施方案中，miRNA序列与分散在靶mRNA中(例如靶mRNA的3'-UTR中)的一个或多个短序列(互补位点)具有部分互补性(Hutvagner和Zamore,Science,2002；Zeng等人,Mol.Cell,2002；Zeng等人,RNA,2003；Doench等人,Genes&Dev.,2003)。由于翻译阻遏的机制是协同的，在某些实施方案中可以靶向多个互补位点(例如，2、3、4、5或6个)。
siRNA样双链体介导RNAi或翻译阻遏的能力，可以通过靶基因序列与沉默剂的核苷酸序列之间在互补位点的不同核苷酸的分布来预测。在期望通过翻译阻遏来使基因沉默的一个实施方案中，至少一个不同核苷酸存在于互补位点的中心部位，使得通过miRNA引导链和靶mRNA形成的双链体含有中心“凸起”(Doench J G等人,Genes&Dev.,2003)。在另一实施方案中，引入2、3、4、5或6个连续或不连续的不同核苷酸。可以选择不同核苷酸，使得其形成摇摆碱基对(例如，G:U)或错配的碱基对(G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C、U:U)。在另外优选的实施方案中，所述“凸起”集中在miRNA分子5’端的12位和13位核苷酸。
c)短发夹RNA(shRNA)分子
在某些特定的实施方案中，本发明提供能够以增强的选择性来介导htt靶序列的RNA沉默的shRNA。与siRNA形成对比，shRNA模拟微RNA(miRNA)的天然前体，并进入基因沉默途径的上部。为此，认为shRNA通过连通整个天然基因沉默途径而更有效地介导基因沉默。
miRNA为大约22个核苷酸的非编码RNA，其可以在植物和动物发育期间调控转录后或翻译水平的基因表达。miRNA的一种共同特征为它们全部可能由Dicer、RNase III型酶或其同源物从被称为pre-miRNA的大约70个核苷酸的前体RNA茎环中切除。天然存在的miRNA前体(pre-miRNA)具有单链，其形成包括通常互补的两个部分的双链茎，以及连接两个茎部分的环。在典型的pre-miRNA中，茎包括一个或多个凸起，例如，在一部分茎中产生单个核苷酸“环”的额外核苷酸，和/或一个或多个未配对的核苷酸，其在茎的两部分彼此杂交中产生空位。本发明的短发夹RNA或工程化RNA前体为基于这些天然存在的pre-miRNA的人工构建体，但其被工程化以递送期望的RNA沉默剂(例如，本发明的siRNA)。通过用与靶mRNA互补的序列取代pre-miRNA的茎序列，形成shRNA。shRNA通过细胞的整个基因沉默途径进行处理，从而有效地介导RNAi。
shRNA分子的必需元件包括第一部分和第二部分，其在退火或杂交时具有足够的互补性以形成双链体或双链茎部分。这两部分不需要充分或完全互补。第一和第二“茎”部分通过具有在退火或杂交时与shRNA的其它部分具有不足的序列互补性的序列的部分连接。在shRNA分子中，后一部分被称为“环”部分。处理shRNA分子以产生siRNA。shRNA还可以包括一个或多个凸起，即，在一部分茎中产生小核苷酸“环”的额外核苷酸，例如一个、两个或三个核苷酸环。茎部分可以具有相同长度，或者一部分可以包括例如，1-5个核苷酸的悬突。突出的核苷酸可以包括，例如，尿嘧啶(U)，例如，全部为U。此类U特别地由编码shRNA的DNA中的胸苷(T)编码，其发出转录终止的信号。
在本发明的shRNA(或工程化前体RNA)中，双链茎的一部分为与htt靶序列互补(或反义)的核酸序列。优选地，shRNA的茎部分一条链与靶RNA(例如，mRNA)序列足够互补(例如，反义)，以经由RNA干扰(RNAi)介导所述靶RNA的降解或切割。因此，工程化RNA前体包括具有两个部分的双链茎和连接所述两个茎部分的环。反义部分可以在茎的5’或3’端。shRNA的茎部分的长度优选为约15至约50个核苷酸。优选地，两个茎部分的长度为约18或19至约21、22、23、24、25、30、35、37、38、39、或40或更多个核苷酸。在优选实施方案中，茎部分的长度应为21个核苷酸或更多。当用于哺乳动物细胞时，茎部分的长度应小于约30个核苷酸以避免引起非特异性应答，如干扰素途径。在非哺乳动物细胞中，茎可以长于30个核苷酸。事实上，茎可以包括与靶mRNA互补的大得多的部分(直到并包括整个mRNA)。事实上，茎部分可以包括与靶mRNA互补的大得多的部分(直到并包括整个mRNA)。
双链茎的两个部分必须足够互补以杂交形成双链茎。因此，所述两个部分可以是，但不一定充分或完全互补。此外，两个茎部分可以具有相同长度，或者一部分可以包括1、2、3或4个核苷酸的悬突。悬突的核苷酸可以包括，例如，尿嘧啶(U)，例如，全部为U。shRNA或工程化RNA前体中的环，可以通过修饰环序列以增加或降低配对核苷酸的数目，或者用四环或其它环序列替代全部或部分环序列而不同于天然pre-miRNA序列。因此，shRNA或工程化RNA前体中环的长度，可以为2、3、4、5、6、7、8、9或更多个，例如，15或20或更多个核苷酸。
shRNA或工程化RNA前体中的环，可以通过修饰环序列以增加或降低配对核苷酸的数目，或者用四环或其它环序列替代全部或部分环序列而不同于天然pre-miRNA序列。因此，shRNA的环部分的长度可以为约2至约20个核苷酸，即约2、3、4、5、6、7、8、9或更多个，例如，15或20或更多个核苷酸。优选的环由“四环”序列组成，或包含“四环”序列。示例性的四环序列包括但不限于序列GNRA(其中N为任意核苷酸，以及R为嘌呤核苷酸)、GGGG和UUUU。
在某些实施方案中，本发明的shRNA包括上文所述的期望的siRNA分子的序列。在其它实施方案中，shRNA的反义部分的序列可以基本上如上文所述进行设计，或者通常通过选择来自靶RNA(例如，htt mRNA)中的，例如来自翻译开始的上游或下游的100至200或300个核苷酸区域的18、19、20、21个核苷酸或更长的序列进行设计。通常，序列可以选自靶RNA(例如，mRNA)的任何部分，包括5'UTR(非翻译区)、编码序列或3'UTR，条件是所述部分远离获得性功能突变位点。该序列可以任选地紧接在含有两个相邻AA核苷酸的靶基因区域之后。核苷酸序列的最后两个核苷酸可以选定为UU。该大约21个核苷酸序列被用于在shRNA中产生双链茎的一部分。该序列可以例如酶促地替代野生型pre-miRNA序列的茎部分，或包含在合成的完整序列中。例如，可以合成编码整个茎环工程化RNA前体，或仅编码待插入前体的双链茎部分的DNA寡核苷酸，以及使用限制酶例如由野生型pre-miRNA构建工程化RNA前体构建体。
工程化RNA前体在双链茎中包括期望在体内产生的siRNA或siRNA样双链体的大约21-22个核苷酸序列。因此，工程化RNA前体的茎部分包括对应于其表达被降低或抑制的基因的外显子部分序列的至少18或19个核苷酸对。选择该茎区域侧翼的两个3'核苷酸，以使来自工程化RNA前体的siRNA产生最大化，以及使所得siRNA在体内和体外靶向相应的mRNA以用于翻译阻遏或通过RNAi的破坏的功效最大化。
在某些实施方案中，本发明的shRNA包括miRNA序列，任选末端修饰的miRNA序列，以增强进入RISC。miRNA序列可以与任何天然存在的miRNA的序列相似或相同(参见例如ThemiRNA Registry；Griffiths-Jones S,Nuc.Acids Res.,2004)。迄今为止，已经鉴定了一千多种天然的miRNA，并且它们被认为总共占基因组中所有预测基因的约1％。许多天然的miRNA聚集在pre-mRNA的内含子中，并且可以使用基于同源性的检索(Pasquinelli等人,2000；Lagos-Quintana等人,2001；Lau等人,2001；Lee and Ambros,2001)或预测候选miRNA基因形成pri-mRNA的茎环结构的能力的计算机算法(例如MiRScan,MiRSeeker)，经由电脑模拟来鉴定(Grad等人,Mol.Cell.,2003；Lim等人,Genes Dev.,2003；Lim等人,Science,2003；Lai E C等人,Genome Bio.,2003)。在线注册提供了所有公开的miRNA序列的可搜索数据库(The miRNA Registry at the Sanger Institute website；Griffiths-Jones S,Nuc.Acids Res.,2004)。示例性的天然miRNA包括lin-4、let-7、miR-10、mirR-15、miR-16、miR-168、miR-175、miR-196和它们的同源物以及来自人和某些模式生物体，包括黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、斑马鱼、拟南芥(Arabidopsis thalania)、小家鼠(Mus musculus)和褐鼠(Rattus norvegicus)的其它天然miRNA，如国际PCT公开号WO03/029459中所述。
天然存在的miRNA由体内的内源性基因表达，并由Dicer或其它RNA酶从发夹或茎环前体(pre-miRNA或pri-miRNA)处理(Lagos-Quintana等人,Science,2001；Lau等人,Science,2001；Lee和Ambros,Science,2001；Lagos-Quintana等人,Curr.Biol.,2002；Mourelatos等人,Genes Dev.,2002；Reinhart等人,Science,2002；Ambros等人,Curr.Biol.,2003；Brennecke等人,2003；Lagos-Quintana等人,RNA,2003；Lim等人,GenesDev.,2003；Lim等人,Science,2003)。miRNA可以作为双链的双链体在体内暂时存在，但仅一条链被RISC复合物摄取以指导基因沉默。某些miRNA，例如，植物miRNA与其靶mRNA具有完全或接近完全的互补性，因此指导靶mRNA的切割。其它miRNA与其靶mRNA具有不太完全的互补性，因此指导靶mRNA的翻译阻遏。认为miRNA与其靶mRNA之间的互补性程度决定其作用机制。例如，miRNA与其靶mRNA之间完全或接近完全的互补性预示切割机制(Yekta等人,Science,2004)，然而不太完全的互补性预示翻译阻遏机制。在具体实施方案中，miRNA序列为天然存在的miRNA序列的序列，其异常表达或活性与miRNA病症相关。
d)双功能寡核苷酸系链(tether)
在其它实施方案中，本发明的RNA沉默剂包括可用于miRNA的细胞间募集的双功能寡核苷酸系链。动物细胞表达一系列miRNA(大约22个核苷酸的非编码RNA)，其可以调控转录后或翻译水平的基因表达。通过结合与RISC结合的miRNA并将其募集到靶mRNA，双功能寡核苷酸系链可以阻抑例如，动脉硬化过程中涉及的基因的表达。寡核苷酸系链的使用，提供了优于现有技术阻抑特定基因表达的几种优势。首先，本文所述的方法允许内源性分子(通常大量存在)，即miRNA介导RNA沉默。因此，本文所述的方法避免引入外来分子(例如，siRNA)来介导RNA沉默的需求。第二，可以使RNA沉默剂，并且具体地，连接部分(例如，寡核苷酸，如2'-O-甲基寡核苷酸)稳定并且耐核酸酶活性。因此，本发明的系链可以被设计成用于直接递送，从而避免需要间接递送(例如病毒)前体分子或设计使期望的试剂存在于细胞内的质粒。第三，系链及其各自的部分，可以被设计成符合特定的mRNA位点和特异性miRNA。该设计可以为细胞和基因产物特异性的。第四，本文公开的方法使mRNA完整，允许本领域技术人员使用细胞自身的机构以短脉冲来阻断蛋白质合成。因此，这些RNA沉默的方法是高度可调节的。
设计本发明的双功能寡核苷酸系链(“系链”)，使得它们将miRNA(例如，内源性细胞miRNA)募集到靶mRNA，以诱导目标基因的调节。在优选实施方案中，系链具有式T-L-μ，其中T为mRNA靶向部分，L为连接部分，以及μ为miRNA募集部分。任何一个或多个部分可以为双链的。优选地，然而，每个部分为单链的。
系链内的部分可以如式T-L-μ所述进行排列或连接(5'至3'方向)(即，靶向部分的3’端连接到连接部分的5’端，并且连接部分的3’端连接到miRNA募集部分的5’端)。可选地，所述部分可以如下排列或连接于系链中：μ-T-L(即，miRNA募集部分的3’端连接到连接部分的5’端，并且连接部分的3’端连接到靶向部分的5’端)。
上文所述的mRNA靶向部分能够捕获特异性靶mRNA。根据本发明，靶mRNA的表达是非期望的，因此mRNA的翻译阻遏是期望的。mRNA靶向部分应具有足够的大小以有效地结合靶mRNA。靶向部分的长度会部分地根据靶mRNA的长度以及靶mRNA与靶向部分之间的互补性程度而变化极大。在不同实施方案中，靶向部分的长度小于约200、100、50、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个核苷酸。在具体实施方案中，靶向部分的长度为约15至约25个核苷酸。
上文所述的miRNA募集部分能够与miRNA缔合。根据本发明，miRNA可以为能够阻抑靶mRNA的任何miRNA。据报道，哺乳动物有250多种内源性miRNA(Lagos-Quintana等人(2002)Current Biol.12:735-739；Lagos-Quintana等人(2001)Science 294:858-862；和Lim等人(2003)Science 299:1540)。在不同实施方案中，miRNA可以为本领域公认的任何miRNA。
连接部分为能够连接靶向部分使得保持靶向部分的活性的任何试剂。连接部分优选为包含足够数目的核苷酸的寡核苷酸部分，使得靶向剂可以与其各自靶标充分相互作用。连接部分与细胞mRNA或miRNA序列具有很少的或不具有序列同源性。示例性的连接部分包括一个或多个2'-O-甲基核苷酸，例如，2'-β-甲基腺苷、2'-O-甲基胸苷、2'-O-甲基鸟苷或2'-O-甲基尿苷。
e)基因沉默寡核苷酸
在某些示例性实施方案中，可以使用基于寡核苷酸的化合物调节基因表达(即，htt基因表达)，所述基于寡核苷酸的化合物包含通过其5'-端连接的两个或更多个单链反义寡核苷酸，其允许存在两个或更多个可及的3'-端以有效地抑制或降低htt基因表达。此种连接的寡核苷酸也被称为基因沉默寡核苷酸(GSO)。(参见，例如，转让给IderaPharmaceuticals,Inc.的US 8,431,544，为了所有目的，通过引用将其整体并入本文)。
GSO的5’端的连接独立于其它寡核苷酸连接，并且可以经由5'、3'或2'羟基直接连接，或经由非核苷酸接头或核苷，利用核苷的2'或3'羟基位置间接连接。连接还可以利用5'末端核苷酸的官能化糖或核碱基。
GSO可以包含经由磷酸二酯、硫代磷酸酯或非核苷接头在其5'-5’端缀合的两个相同或不同的序列。此类化合物可以包含与目标mRNA靶标的特定部分互补的15至27个核苷酸，用于基因产物的反义下调。包含相同序列的GSO可以经由沃森-克里克氢键相互作用结合特定的mRNA并抑制蛋白表达。包含不同序列的GSO能够结合一个或多个mRNA靶标的两个或更多个不同区域并抑制蛋白表达。此类化合物由与靶mRNA互补的异质核苷酸序列组成，并通过沃森-克里克氢键形成稳定的双链体结构。在某些条件下，含有两个游离的3'-端(5'-5'-连接的反义)的GSO，可以是比那些含有单个游离的3'-端或不含游离的3'-端的GSO更有效的基因表达的抑制剂。
在一些实施方案中，非核苷酸接头为式HO--(CH2)o--CH(OH)--(CH2)p--OH的甘油或甘油同源物，其中o和p独立地为1至约6、1至约4、或1至约3的整数。在一些其它实施方案中，非核苷酸接头为1,3-二氨基-2-羟基丙烷的衍生物。一些这样的衍生物具有式HO--(CH2)m--C(O)NH--CH2--CH(OH)--CH2--NHC(O)--(CH2)m--OH，其中m为0至约10、0至约6、2至约6、或2至约4的整数。
一些非核苷酸接头允许超过两个GSO组件(component)的连接。例如，非核苷酸接头甘油具有可以与GSO组件共价连接的三个羟基。因此，本发明的一些基于寡核苷酸的化合物，包含与核苷酸或非核苷酸接头连接的两个或更多个寡核苷酸。根据本发明，此类寡核苷酸被称为“分支的”。
在某些实施方案中，GSO的长度为至少14个核苷酸。在某些示例性实施方案中，GSO的长度为15至40个核苷酸或20至30个核苷酸。因此，GSO的组件寡核苷酸的长度可以独立地为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。
可以通过本领域公认的方法，如氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学来制备这些寡核苷酸，所述方法可以手动进行或通过自动合成仪进行。也可以以多种方式修饰这些寡核苷酸，而不损害其与mRNA杂交的能力。此类修饰可以包括所述寡核苷酸的至少一个核苷酸间连接(其为膦酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、羟基磷酸酯、乙酰胺酯或羧甲基酯或这些的组合)，以及一个核苷酸的5’端与另一核苷酸的3’端之间的其它核苷酸间连接，其中5'核苷酸磷酸二酯键已被任意数目的化学基团代替。
VII.修饰的抗-Htt RNA沉默剂
在本发明的某些方面，可以修饰上文所述的本发明的RNA沉默剂(或其任何部分)，使得试剂的活性进一步改善。例如，上文第II部分中描述的RNA沉默剂，可以用下文所述的任何修饰来修饰。所述修饰可以部分地用来进一步增强靶标区别、增强试剂的稳定性(例如，防止降解)、促进细胞摄取、增强靶效率、改善(例如，与靶标)结合功效、改善患者对试剂的耐受性和/或降低毒性。
1)增强靶标区别的修饰
在某些实施方案中，本发明的RNA沉默剂可以用去稳定的核苷酸取代，以增强单核苷酸靶标区别(参见2007年1月25日提交的美国申请第11/698,689号和2006年1月25日提交的美国临时申请第60/762,225号，均通过引用将两者并入本文)。此类修饰可足以消除RNA沉默剂对非靶mRNA(例如野生型mRNA)的特异性，而不会明显地影响RNA沉默剂对靶mRNA(例如获得性功能突变的mRNA)的特异性。
在优选实施方案中，本发明的RNA沉默剂通过在其反义链中引入至少一个通用核苷酸来修饰。通用核苷酸包含能够与四种常规核苷酸碱基(例如A、G、C、U)中的任一种任意碱基配对的碱基部分。通用核苷酸是优选的，因为它对RNA双链体或通过RNA沉默剂的引导链与靶mRNA形成的双链体的稳定性具有相对较小的影响。示例性的通用核苷酸包括具有选自以下的肌苷碱基部分或肌苷类似物碱基部分的那些核苷酸：脱氧肌苷(例如2'-脱氧肌苷)、7-脱氮-2'-脱氧肌苷、2'-氮杂-2'-脱氧肌苷、PNA-肌苷、吗啉代-肌苷、LNA-肌苷、氨基磷酸酯-肌苷、2'-O-甲氧基乙基-肌苷和2'-OMe-肌苷。在特别优选的实施方案中，通用核苷酸为肌苷残基或其天然存在的类似物。
在某些实施方案中，通过在来自特异性确定的核苷酸(即，识别疾病相关多态性的核苷酸)的5个核苷酸中，引入至少一个去稳定的核苷酸，来修饰本发明的RNA沉默剂。例如，可以在来自特异性确定的核苷酸的5、4、3、2或1个核苷酸中的位置，引入去稳定的核苷酸。在示例性实施方案中，在来自特异性确定的核苷酸的3个核苷酸的位置，引入去稳定的核苷酸(即，使得去稳定的核苷酸与特异性确定的核苷酸之间存在2个稳定的核苷酸)。在具有两条链或链部分的RNA沉默剂(例如siRNA和shRNA)中，可以在不含有特异性确定的核苷酸的链或链部分中，引入去稳定的核苷酸。在优选实施方案中，在含有特异性确定的核苷酸的相同链或链部分中，引入去稳定的核苷酸。
2)增强功效和特异性的修饰
在某些实施方案中，可以根据不对称设计规则来改变本发明的RNA沉默剂，以促进在介导RNAi中具有增强的功效和特异性(参见美国专利第8,309,704号、第7,750,144号、第8,304,530号、第8,329,892号和第8,309,705号)。此类改变促进siRNA(例如，使用本发明的方法设计的siRNA或由shRNA产生的siRNA)的反义链进入RISC以有利于有义链，使得反义链优先引导靶mRNA的切割或翻译阻遏，从而增加或改善靶向切割和沉默的效率。优选地，相对于所述RNA沉默剂的反义链3’端(AS 3')与有义链5’端(S'5)之间的键强度或碱基对强度，通过减弱RNA沉默剂的反义链5’端(AS 5')与有义链3’端(S 3')之间的碱基对强度来增强RNA沉默剂的不对称。
在一个实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得第一链或反义链的5’端与有义链部分的3’端之间的G:C碱基对，少于第一链或反义链的3’端与有义链部分的5’端之间的G:C碱基对。在另一实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得第一链或反义链的5’端与有义链部分的3’端之间存在至少一个错配的碱基对。优选地，错配的碱基对选自：G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C和U:U。在另一实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得第一链或反义链的5’端与有义链部分的3’端之间存在至少一个摇摆碱基对，例如，G:U。在另一实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得存在至少一个包含稀有核苷酸(例如肌苷(I))的碱基对。优选地，碱基对选自：I:A、I:U和I:C。在另一实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得存在至少一个包含修饰的核苷酸的碱基对。在优选实施方案中，修饰的核苷酸选自：2-氨基-G、2-氨基-A、2,6-二氨基-G和2,6-二氨基-A。
3)具有增强的稳定性的RNA沉默剂
可以修饰本发明的RNA沉默剂，以改善细胞培养物在血清或生长培养基中的稳定性。为了增强稳定性，针对降解3'-残基可以为稳定的，例如，可以对其进行选择，使得它们由嘌呤核苷酸，特别是腺苷或鸟苷核苷酸组成。可选地，通过修饰的类似物来取代嘧啶核苷酸，例如，通过2'-脱氧胸苷取代尿苷是耐受的，并且不影响RNA干扰的效率。
在优选的方面，本发明的特征在于包括第一链和第二链的RNA沉默剂，其中通过用修饰的核苷酸取代内部核苷酸来修饰第二链和/或第一链，使得与相应未经修饰的RNA沉默剂相比，体内稳定性增强。如本文所定义，“内部”核苷酸为在除了核酸分子、多核苷酸或寡核苷酸5’端或3’端以外的任何位置存在的核苷酸。内部核苷酸可以在单链分子内，或者在双链体或双链分子的链内。在一个实施方案中，通过取代至少一个内部核苷酸来修饰有义链和/或反义链。在另一实施方案中，通过取代至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个内部核苷酸来修饰有义链和/或反义链。在另一实施方案中，通过取代至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的内部核苷酸来修饰有义链和/或反义链。在另一实施方案中，通过取代所有内部核苷酸来修饰有义链和/或反义链。
在本发明的优选实施方案中，RNA沉默剂可以含有至少一个修饰的核苷酸类似物。核苷酸类似物可以位于这样的位置，在此靶特异性沉默活性，例如，RNAi介导的活性或翻译阻遏活性(例如，在siRNA分子的5'-端和/或3'-端的区域)基本上不受影响。特别地，可以通过掺入修饰的核苷酸类似物来稳定末端。
示例性的核苷酸类似物包括糖-修饰的和/或骨架-修饰的核糖核苷酸(即，包括对磷酸-糖骨架的修饰)。例如，天然RNA的磷酸二酯键可以被修饰成包括氮或硫杂原子中的至少一个。在示例性骨架修饰的核糖核苷酸中，连接相邻核糖核苷酸的磷酸酯基团被修饰的基团(例如，硫代磷酸酯基团)代替。在示例性糖修饰的核糖核苷酸中，2'OH基团被选自以下的基团代替：H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON，其中R为C1-C6烷基、烯基或炔基，以及卤素为F、Cl、Br或I。
在具体实施方案中，所述修饰为2'-氟、2'-氨基和/或2'-硫代修饰。特别优选的修饰包括：2'-氟-胞苷、2'-氟-尿苷、2'-氟-腺苷、2'-氟-鸟苷、2'-氨基-胞苷、2'-氨基-尿苷、2'-氨基-腺苷、2'-氨基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、4-硫代-尿苷、和/或5-氨基-烯丙基-尿苷。在具体实施方案中，2'-氟核糖核苷酸为每个尿苷和胞苷。另外的示例性修饰包括：5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖胸苷、2-氨基嘌呤、2'-氨基-丁酰基-芘-尿苷、5-氟-胞苷和5-氟-尿苷。在本发明的修饰的RNA沉默剂组成成分中，也可以使用2'-脱氧-核苷酸和2'-Ome核苷酸。其他修饰的残基包括：脱氧-脱碱基、肌苷、N3-甲基-尿苷、N6,N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核糖核苷和利巴韦林。在特别优选的实施方案中，2'部分为甲基，使得连接部分为2'-O-甲基寡核苷酸。
在示例性实施方案中，本发明的RNA沉默剂包含锁核酸(LNA)。LNA包含糖-修饰的核苷酸，其抗核酸酶活性(为高度稳定的)，并具有针对mRNA的单核苷酸区别(Elmen等人,Nucleic Acids Res.,(2005),33(1):439-447；Braasch等人(2003)Biochemistry 42:7967-7975,Petersen等人(2003)Trends Biotechnol 21:74-81)。这些分子具有2'-O,4'-C-亚乙基桥接的核酸，以及诸如2'-脱氧-2”-氟尿苷的可能的修饰。此外，LNA通过将糖部分限制在3'-内构象来增加寡核苷酸的特异性，从而预先组织碱基配对的核苷酸，并将寡核苷酸的解链温度增加多达10℃/碱基。
在另一示例性实施方案中，本发明的RNA沉默剂包含肽核酸(PNA)。PNA包含修饰的核苷酸，其中用能够形成聚酰胺骨架的中性2-氨基乙基甘氨酸部分代替核苷酸的糖-磷酸部分，所述聚酰胺骨架对核酸酶消化具有高度抗性并赋予该分子改善的结合特异性(Nielsen,等人,Science,(2001),254:1497-1500).
还优选的是核碱基修饰的核糖核苷酸，即，含有至少一个非天然存在的核碱基而非天然存在的核碱基的核糖核苷酸。可以修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。示例性修饰的核碱基包括但不限于：在5位修饰的尿苷和/或胞苷，例如，5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位修饰的腺苷和/或鸟苷，例如，8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如，7-脱氮-腺苷；O-和N-烷基化核苷酸，例如，N6-甲基腺苷为合适的。应注意，可以组合上述修饰。
在其它实施方案中，可以采用交联来改变RNA沉默剂的药代动力学，例如，以增加体内的半衰期。因此，本发明包括具有核酸的两条互补链的RNA沉默剂，其中两条链为交联的。本发明还包括这样的RNA沉默剂，其与另一部分(例如非核酸部分，如肽)、有机化合物(例如，染料)等缀合，或是未缀合的(例如，在其3'末端)。以这种方式修饰siRNA衍生物，与相应siRNA相比可以改善所得siRNA衍生物的细胞摄取或增强其细胞靶向活性，可用于追踪细胞中的siRNA衍生物，或与相应siRNA相比改善siRNA衍生物的稳定性。
其它示例性修饰包括：(a)2'修饰，例如，在有义链或反义链，但尤其在有义链中的U上提供2'OMe部分，或者在3'悬突，例如，在3'末端(3'末端意为分子的3'原子或至多3'部分，例如，至多3'P或2'位，如上下文所指示的)提供2'OMe部分；(b)骨架的修饰，例如，在磷酸骨架中用S替代O，例如，尤其在反义链中的U或A或两者上提供硫代磷酸酯修饰；例如，用S替代O；(c)用C5氨基接头替代U；(d)用G替代A(序列变化优选位于有义链而非反义链上)；和(d)在2'、6'、7'、或8'位的修饰。示例性实施方案为，其中这些修饰中的一个或多个存在于有义链而非反义链的那些实施方案，或者反义链具有较少的此种修饰的实施方案。其它示例性修饰包括：在3'悬突，例如在3’末端使用甲基化的P；2'修饰的组合，例如，提供2'O Me部分和骨架的修饰如用S替代O，例如，提供硫代磷酸酯修饰，或者在3'悬突，例如在3’末端使用甲基化的P；利用3'烷基进行修饰；在3'悬突，例如在3’末端用脱碱基咯烷酮进行的修饰；用萘普生、布洛芬或抑制3’末端降解的其它部分进行修饰。
4)增强细胞摄取的修饰
在其它实施方案中，可以用化学部分修饰RNA沉默剂，例如，以增强靶细胞(例如，神经元细胞)的细胞摄取。因此，本发明包括这样的RNA沉默剂，其与另一部分(例如非核酸部分，如肽)、有机化合物(例如，染料)等缀合，或是未缀合的(例如，在其3’末端)。所述缀合可以通过本领域已知的方法，例如，使用以下文献中的方法来实现：Lambert等人,DrugDeliv.Rev.:47(1),99-112(2001)(描述了装载至聚氰基丙烯酸烷基酯(PACA)纳米颗粒的核酸)；Fattal等人,J.Control Release 53(1-3):137-43(1998)(描述了与纳米颗粒结合的核酸)；Schwab等人,Ann.Oncol.5Suppl.4:55-8(1994)(描述了与嵌入剂、疏水性基团、聚阳离子或PACA纳米颗粒连接的核酸)；和Godard等人,Eur.J.Biochem.232(2):404-10(1995)(描述了与纳米颗粒连接的核酸)。
在具体实施方案中，本发明的RNA沉默剂与亲脂性部分缀合。在一个实施方案中，亲脂性部分为包括阳离子基团的配体。在另一实施方案中，亲脂性部分与siRNA的一条链或两条链连接。在示例性实施方案中，亲脂性部分与siRNA的有义链的一端连接。在另一示例性实施方案中，亲脂性部分与有义链的3’端连接。在某些实施方案中，亲脂性部分选自：胆固醇、维生素E、维生素K、维生素A、叶酸或阳离子染料(例如，Cy3)。在示例性实施方案中，亲脂性部分为胆固醇。其它亲脂性部分包括：胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基(geranyloxyhexyl)、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
5)系链配体(tethered ligands)
其它实体可以栓系至本发明的RNA沉默剂。例如，配体栓系至RNA沉默剂以改善稳定性，与靶核酸的杂交热力学，例如，通过内吞作用-依赖性或内吞作用-非依赖性机制，靶向特定组织或细胞类型或细胞渗透性。配体和相关修饰也可以增加序列特异性，从而减少远离位点(off-site)的靶向。系链配体可以包括一个或多个修饰的碱基或糖，其可以作为嵌入剂发挥功能。这些优选位于内部区域，如在RNA沉默剂/靶双链体的凸起中。嵌入剂可以为芳香族的，例如，多环芳香族的或杂环芳香族的化合物。多环嵌入剂可以具有堆积能力，并且可以包括具有2、3或4个稠环的系统。本文所述的通用碱基可以包括在配体上。在一个实施方案中，配体可以包括切割基团，其通过切割靶核酸来促成靶基因抑制。切割基团可以为，例如，博来霉素(例如，博来霉素-A5、博来霉素-A2或博来霉素-B2)、芘、菲咯啉(例如，O-菲咯啉)、多胺、三肽(例如，lys-tyr-lys三肽)或金属离子螯合基团。金属离子螯合基团可以包括，例如，Lu(III)或EU(III)大环配合物、Zn(II)2,9-二甲基菲咯啉衍生物、Cu(II)三联吡啶或吖啶，其可以通过游离的金属离子如Lu(III)来促进靶RNA在凸起位点的选择性切割。在一些实施方案中，肽配体可以栓系RNA沉默剂以促进靶RNA，例如，在凸起区域的切割。例如，1,8-二甲基-1,3,6,8,10,13-六氮杂环十四烷(环拉胺)可以与肽缀合(例如，通过氨基酸衍生物)，以促进靶RNA切割。系链配体可以为氨基糖苷配体，其可以引起RNA沉默剂具有改善的杂交性质或提高的序列特异性。示例性的氨基糖苷包括：糖基化聚赖氨酸、半乳糖化聚赖氨酸、新霉素B、妥布霉素、卡那霉素A和氨基糖苷的吖啶缀合物(如Neo-N-吖啶、Neo-S-吖啶、Neo-C-吖啶、Tobra-N-吖啶和KanaA-N-吖啶)。吖啶类似物的使用可以增加序列特异性。例如，与DNA相比，新霉素B对RNA具有高的亲和力，但低的序列特异性。吖啶类似物neo-5-吖啶，对HIV Rev-反应元件(RRE)具有增加的亲和力。在一些实施方案中，氨基糖苷配体的胍类似物(胍糖苷)栓系至RNA沉默剂。在胍糖苷中，氨基酸上的胺基被交换为胍基。胍类似物的连接可以增强RNA沉默剂的细胞渗透性。系链配体可以为聚精氨酸肽、类肽或肽模拟物，其可以增强寡核苷酸试剂的细胞摄取。
示例性配体经由介入的系链与配体缀合的载体直接或间接地偶联，优选共价偶联。在示例性实施方案中，配体经由介入的系链与载体连接。在示例性实施方案中，配体改变其被引入其中的RNA沉默剂的分布、靶向或寿命。在示例性实施方案中，例如，相比没有此类配体的物种，配体为选定的靶标，例如分子、细胞或细胞类型、腔室(例如细胞或器官的腔室)、组织、器官或身体区域提供增强的亲和力。
示例性配体可以改善运输、杂交和特异性性质，并且还可以改善所得天然或修饰的RNA沉默剂、或者包含本文所述的单体和/或天然或修饰的核糖核苷酸的任何组合的聚合物分子的核酸酶抗性。通常，配体可以包括治疗修饰剂，例如，用于增强摄取；诊断化合物或报告基团，例如，用于监测分布；交联剂；核酸酶抗性赋予部分；和天然或不寻常的核碱基。通常的实例包括：亲脂性分子(lipophiles)、脂质、类固醇(例如，乌发醇、Hecigenin、薯蓣皂素)、萜烯(例如，三萜烯、例如，菝葜皂苷元、无羁萜、表木栓醇衍生的石胆酸)、维生素(例如，叶酸、维生素A、生物素、吡哆醛)、碳水化合物、蛋白质、蛋白质结合剂、整合素靶向分子、聚阳离子剂、肽、多胺和肽模拟物。配体可以包括天然存在的物质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、壳多糖、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；氨基酸或脂质。配体也可以为重组或合成的分子，如合成聚合物，例如，合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括：聚氨基酸为聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷腈。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、肽模拟物多胺、树状物多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺季盐或α螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如，结合特定细胞类型如肾细胞的细胞或组织靶向剂，例如，凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如，抗体。靶向基团可以为：促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯(盐)、聚天冬氨酸酯(盐)、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。配体的其它实例包括：染料、嵌入剂(例如吖啶和取代的吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、Sapphyrin)、多环芳香烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪、菲咯啉、芘)、lys-tyr-lys三肽、氨基糖苷、胍氨基糖苷(guanidium aminoglycodies)、人工内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子例如胆固醇(及其硫代类似物)、胆酸、胆烷酸、石胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、甘油(例如，酯(例如，单-、双-或三脂肪酸酯，例如，C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20脂肪酸)及其醚，例如，C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基；例如，1,3-双-O(十六烷基)甘油、1,3-双-O(十八烷基)甘油)、香叶基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、硬脂酸(例如，二硬脂酸甘油酯)、油酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如，触角肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯(盐)、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、运输/吸收促进剂(例如，阿司匹林、萘普生、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+配合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以为蛋白质，例如，糖蛋白或肽，例如，对共配体具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如，结合特定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞的抗体。配体还可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以为，例如，脂多糖、p38MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。
配体可以为物质，例如药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间纤丝，来增加RNA沉默剂至细胞的摄取。药物可以为，例如，Taxon、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、Japlakinolide、拉春库林(latrunculin)A、鬼笔环肽、Swinholide A、Indanocine或Myoservin。配体可以例如通过激活炎症反应来增加RNA沉默剂至细胞的摄取。具有此种作用的示例性配体包括：肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β或γ干扰素。在一个方面，配体为脂质或基于脂质的分子。此类脂质或基于脂质的分子优选结合血清蛋白，例如，人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分配到靶组织，例如，身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以为肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其它分子也可以被用作配体。例如，可以使用Neproxin或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以：(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或运输到靶细胞或细胞膜，和/或(c)可以用于调节与血清蛋白，例如HSA的结合。基于脂质的配体可以用于调节，例如，控制缀合物与靶组织的结合。例如，更强烈地结合HSA的脂质或基于脂质的配体，将不太可能靶向肾脏，因此不太可能从身体中清除。不太强烈地结合HAS的脂质或基于脂质的配体，可以用于将缀合物靶向肾脏。在优选的实施方案中，基于脂质的配体结合HSA。基于脂质的配体可以以足够的亲和力结合HAS，使得缀合物优选分配到非肾脏组织。然而，优选的是，亲和力并不能强到使HSA-配体结合不能逆转。在另一优选的实施方案中，基于脂质的配体较弱地结合HSA或完全不结合HSA，使得缀合物优选分配到肾脏。也可以使用靶向肾细胞的其它部分代替基于脂质的配体，或除了基于脂质的配体之外，也可以使用靶向肾细胞的其它部分。
在另一方面，配体为部分(例如，维生素)，其被靶细胞如增殖细胞摄取。这些尤其可以用于治疗特征在于例如，恶性或非恶性类型的不想要的细胞增殖如癌细胞的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。包括的其它示例性维生素为维生素B，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或癌细胞摄取的其它维生素或营养物。还包括HAS和低密度脂蛋白(LDL)。
在另一方面，配体为细胞渗透剂，优选螺旋细胞渗透剂。优选地，试剂为两亲性的。示例性试剂为诸如Tat或Antennopedia的肽。如果试剂为肽，则其可以被修饰，包括肽基模拟物(peptidylmimetic)、反演体(invertomer)、非肽或假肽连接，和D-氨基酸的使用。螺旋剂优选为α-螺旋剂，其优选具有亲脂相和疏脂相。
配体可以为肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文也被称为寡肽模拟物)为能够折叠成与天然肽相似的确定的三维结构的分子。肽和肽模拟物与寡核苷酸试剂的连接，可以如通过增强细胞识别和吸收来影响RNA沉默剂的药代动力学分布。肽或肽模拟物部分长度可以为约5-50个氨基酸，例如，长度约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。肽或肽模拟物可以为，例如，细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以为树状物肽、限制性肽或交联肽。肽部分可以为L-肽或D-肽。在另一替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜转位序列(MTS)。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人,Nature354:82-84,1991)。在示例性实施方案中，经由掺入的单体单元栓系至RNA沉默剂的肽或肽模拟物为细胞靶向肽，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度范围可以为约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以增加稳定性或指导构象性质。可以利用下文所述的任何结构修饰。
6)化合物
在一个方面，本文提供了图81中示出的式的化合物，或其药学可接受的盐，其中
R1选自：
Figure BDA0001487578630000681
Figure BDA0001487578630000691
R3在每次出现时独立地选自图82中示出的核苷酸间接头；以及
L为连接两个部分的接头，其中所述接头选自：乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、
Figure BDA0001487578630000692
或它们的组合。
在一个实施方案中，R1选自：
Figure BDA0001487578630000701
在另一实施方案中，R1为
Figure BDA0001487578630000702
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、亚甲基膦酸酯、磷酸三酯和硼烷磷酸酯(boranophosphate)。
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3为硫代磷酸酯。
在另一实施方案中，L选自：乙二醇链、烷基链和肽。
在另一实施方案中，L选自乙二醇链或肽。
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000711
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000712
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000713
在一个实施方案中，图81中示出的式的化合物为图83中示出的式的化合物。
在另一实施方案中，图81中示出的式的化合物为图83中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000714
以及
L为
Figure BDA0001487578630000721
在另一实施方案中，图81中示出的式的化合物为图83中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000722
以及
L为
Figure BDA0001487578630000723
在另一方面，本文提供了图84中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1选自：
Figure BDA0001487578630000724
Figure BDA0001487578630000731
R3在每次出现时独立地选自图82中示出的核苷酸间接头；
L为连接两个部分的接头，其中所述接头选自：乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、
Figure BDA0001487578630000732
或它们的组合；以及
B为两个或更多个接头之间的分支点，其中所述分支点选自：二醇、氨基酸或任何多价有机物质。
在一个实施方案中，R1选自：
Figure BDA0001487578630000741
在另一实施方案中，R1为
Figure BDA0001487578630000742
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、亚甲基膦酸酯、磷酸三酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3为硫代磷酸酯。
在另一实施方案中，L选自：乙二醇链、烷基链和肽。
在另一实施方案中，L选自乙二醇链或肽。
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000751
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000752
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000753
在一个实施方案中，B为两个或更多个接头之间的分支点，其中所述分支点选自二醇或氨基酸。在另一实施方案中，所述分支点为二醇。在另一实施方案中，所述分支点为氨基酸。
在图84中示出的式的化合物的另一实施方案中，如图86所示限定Y。
在另一方面，本文提供了图85中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1选自：
Figure BDA0001487578630000754
Figure BDA0001487578630000761
R3在每次出现时独立地选自图82中示出的核苷酸间接头；
L为连接两个部分的接头，其中所述接头选自：乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、
Figure BDA0001487578630000762
或它们的组合；以及
B为两个或更多个接头之间的分支点，其中所述分支点选自：二醇、氨基酸或任何多价有机物质。
在一个实施方案中，R1选自：
Figure BDA0001487578630000771
在另一实施方案中，R1为
Figure BDA0001487578630000772
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、亚甲基膦酸酯、磷酸三酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3为硫代磷酸酯。
在另一实施方案中，L选自：乙二醇链、烷基链和肽。
在另一实施方案中，L选自乙二醇链或肽。
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000781
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000782
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000783
在一个实施方案中，B为两个或更多个接头之间的分支点，其中所述分支点选自二醇或氨基酸。在另一实施方案中，所述分支点为二醇。在另一实施方案中，所述分支点为氨基酸。
在图85中示出的式的化合物的一个实施方案中，如图86所示限定Y。
在另一方面，本文提供了图87中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1选自：
Figure BDA0001487578630000784
Figure BDA0001487578630000791
R3在每次出现时独立地选自图82中示出的核苷酸间接头；
L为连接两个部分的接头，其中所述接头选自：乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、
Figure BDA0001487578630000792
或它们的组合；以及
R2选自：烷基链(例如，C1-6、C1-10、C1-20、C1-30或C1-40)、维生素、配体、肽、生物活性缀合物(包括但不限于鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环类固醇(secosteroids)、类固醇激素或固醇脂质)、
Figure BDA0001487578630000801
Figure BDA0001487578630000811
在一个实施方案中，R1选自：
Figure BDA0001487578630000812
在另一实施方案中，R1为
Figure BDA0001487578630000813
在另一实施方案中，R2选自：
Figure BDA0001487578630000821
Figure BDA0001487578630000831
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、亚甲基膦酸酯、磷酸三酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3为硫代磷酸酯。
在另一实施方案中，L选自：乙二醇链、烷基链和肽。
在另一实施方案中，L选自乙二醇链或肽。
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000832
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000833
在另一实施方案中，L为
Figure BDA0001487578630000841
在一个实施方案中，图87中示出的式的化合物为图88中示出的式的化合物。
在另一实施方案中，图87中示出的式的化合物为图88中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000842
以及
R2为
Figure BDA0001487578630000843
在另一方面，本文提供了图89中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1选自：
Figure BDA0001487578630000851
R3在每次出现时独立地选自图82中示出的核苷酸间接头；以及
R2选自：烷基链(例如，C1-6、C1-10、C1-20、C1-30或C1-40)、维生素、配体、肽、生物活性缀合物(包括但不限于鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环类固醇、类固醇激素或固醇脂质)、
Figure BDA0001487578630000852
Figure BDA0001487578630000861
在一个实施方案中，R1选自：
Figure BDA0001487578630000871
在另一实施方案中，R1为
Figure BDA0001487578630000872
在另一实施方案中，R2选自：
Figure BDA0001487578630000873
Figure BDA0001487578630000881
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、亚甲基膦酸酯、磷酸三酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3在每次出现时为独立地选自以下的核苷酸间接头：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯。
在另一实施方案中，R3为硫代磷酸酯。
在一个实施方案中，图89中示出的式的化合物为图90中示出的式的化合物。
在一个实施方案中，图89中示出的式的化合物为图90中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000891
以及
R2为
Figure BDA0001487578630000892
在一个实施方案中，图89中示出的式的化合物为图90中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000901
以及
R2为
Figure BDA0001487578630000902
在一个实施方案中，图89中示出的式的化合物为图90中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000903
以及
R2为
Figure BDA0001487578630000904
在一个实施方案中，图89中示出的式的化合物为图90中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000911
以及
R2为
Figure BDA0001487578630000912
在一个实施方案中，图89中示出的式的化合物为图90中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000913
以及
R2为
Figure BDA0001487578630000914
在一个实施方案中，图89中示出的式的化合物为图90中示出的式的化合物或其药学可接受的盐，其中
R1为
Figure BDA0001487578630000921
以及
R2为
Figure BDA0001487578630000922
VIII.引入核酸、载体和宿主细胞的方法
本发明的RNA沉默剂，可以直接引入细胞(例如，神经细胞)(即，细胞内)；或者经细胞外引入腔、间隙空间、引入生物体的循环、经口服引入，或者可以通过将细胞或生物体在含有核酸的溶液中沐浴来引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统和脑脊液为可以引入核酸的位点。
可以使用本领域已知的核酸递送方法来引入本发明的RNA沉默剂，所述方法包括：注入含有核酸的溶液、用核酸覆盖的颗粒进行轰击、将细胞或生物体浸渍在核酸溶液中、或在核酸存在下电穿孔细胞膜。可以使用本领域已知的将核酸引入细胞的其它方法，如脂质介导的载体运输、化学介导的运输和阳离子脂质体转染，如磷酸钙等。核酸可以与执行一种或多种下述活性的其它组分一起引入：增强细胞的核酸摄取或在其他方面增加靶基因的抑制。
引入核酸的物理方法包括：注入含有RNA的溶液、用RNA覆盖的颗粒进行轰击、将细胞或生物体浸渍在RNA溶液中、或在RNA存在下电穿孔细胞膜。被包装到病毒颗粒中的病毒构建体，将实现将表达构建体有效引入细胞和由该表达构建体编码的RNA的转录。可以使用本领域已知的将核酸引入细胞的其它方法，如脂质介导的载体运输、化学介导的运输，如磷酸钙等。因此，RNA可以与执行一种或多种下述活性的组分一起引入：增强细胞的RNA摄取、抑制单链的退火、使单链稳定或在其他方面增加靶基因的抑制。
RNA可以直接引入细胞(即，细胞内)；或者经细胞外引入腔、间隙空间、引入生物体的循环、经口服引入，或者可以通过将细胞或生物体在含有RNA的溶液中沐浴来引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统和脑脊液为可以引入核酸的位点。
含有靶基因的细胞可以来自生殖系细胞或体细胞、全能或多能细胞、分裂或非分裂细胞、实质或上皮细胞、永生化或转化细胞等。所述细胞可以为干细胞或分化细胞。分化的细胞类型包括：脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经细胞、胶质细胞、血细胞、巨核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、白细胞、粒细胞、角化细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、肝细胞以及内分泌或外分泌腺的细胞。
取决于特定的靶基因和递送的双链RNA材料的剂量，该过程可以提供靶基因的功能的部分或完全丧失。靶细胞的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多的基因表达的减少或丧失是示例性的。基因表达的抑制是指来自靶基因的蛋白和/或mRNA产物水平的不存在(或可观察到的降低)。特异性是指能够抑制靶基因而对细胞的其它基因没有显示出效果。抑制的结果可以通过检查细胞或生物体的外在性质(如下文实施例中所呈现的)，或者通过生化技术，如RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、逆转录、利用微阵列的基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附分析(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫分析(RIA)、其它免疫分析和荧光激活细胞分选(FACS)来确认。
对于细胞系或整个生物体中RNA介导的抑制，通过使用易于分析其蛋白产物的报告基因或耐药基因可方便地分析基因表达。此类报告基因包括：乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡萄糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)和它们的衍生物。可以获得赋予耐氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素和四环素的多种可选择的标志物。根据分析，对基因表达量进行定量允许测定抑制程度，根据本发明，与未经处理的细胞相比，所述抑制程度大于10％、33％、50％、90％、95％或99％。在施用RNAi剂之后，较低剂量的注入材料和较长的时间，可导致较小部分细胞的抑制(例如，至少10％、20％、50％、75％、90％或95％的靶细胞)。对细胞中基因表达进行定量，可以在靶mRNA的积累水平或靶蛋白的翻译水平显示出相似的抑制量。例如，可以通过评估细胞中基因产物的量来测定抑制效率；可以用具有在用于抑制性双链RNA的区域之外的核苷酸序列的杂交探针来检测mRNA，或者可以用针对该区域的多肽序列而产生的抗体来检测所翻译的多肽。
可以以允许每个细胞递送至少一份拷贝的量引入RNA。较高剂量(例如，至少5、10、100、500或1000份拷贝/细胞)的材料可以产生更有效的抑制；较低剂量也可以用于特定应用。
在示例性方面，测试本发明的RNAi剂(例如，靶向htt靶序列的siRNA)的功效，在特异性降解细胞，具体地，神经元(例如，纹状体或皮质神经元克隆系和/或原代神经元)中的突变mRNA(例如，htt mRNA和/或亨廷汀蛋白的产生)的能力。还适于基于细胞的验证分析为其它容易转染的细胞，例如，HeLa细胞或COS细胞。用人野生型或突变的cDNA(例如，人野生型或突变的亨廷汀cDNA)转染细胞。将标准的siRNA、修饰的siRNA或能够由U-环化的mRNA产生siRNA的载体共转染。测量靶mRNA(例如，亨廷汀mRNA)和/或靶蛋白(例如，亨廷汀蛋白)的选择性降低。靶mRNA或蛋白的降低，可以与不存在RNAi剂或存在不靶向htt mRNA的RNAi剂下的靶mRNA或蛋白的水平进行比较。出于比较目的，可以分析外源引入的mRNA或蛋白(或内源性mRNA或蛋白)。当利用已知对标准转染技术有些抗性的神经元细胞时，通过被动摄取引入RNAi剂(例如，siRNA)是可取的。
重组腺相关病毒和载体
在某些示例性实施方案中，重组腺相关病毒(rAAV)及其相关载体，可以用于将一种或多种siRNA递送到细胞，例如，神经细胞(例如，脑细胞)中。AAV能够感染许多不同的细胞类型，尽管感染效率根据由衣壳蛋白序列确定的血清型而变化。已经鉴定了几种天然的AAV血清型，其中对于重组AAV，血清型1-9为最常用的。AAV-2为最充分研究的和公开的血清型。AAV-DJ系统包括血清型AAV-DJ和AAV-DJ/8。通过多种AAV血清型的DNA改组产生这些血清型，以产生具有混合衣壳的AAV，其在多种细胞和组织具有改善的体外(AAV-DJ)和体内(AAV-DJ/8)转导效率。
在具体实施方案中，可以通过血管内递送重组腺相关病毒7(rAAV7)、RAAV9和rAAV10或其它合适的rAAV来实现广泛的中枢神经系统(CNS)的递送(Zhang等人,(2011)Mol.Ther.19(8):1440-8.doi:10.1038/mt.2011.98.Epub 2011May 24)。rAAV及其相关载体为本领域众所周知的，并且描述于美国专利申请2014/0296486、2010/0186103、2008/0269149、2006/0078542和2005/0220766，将其各自通过引用整体并入用于所有目的。
可以根据本领域已知的任何适当方法，将在组合物中的rAAV递送至对象。rAAV可以悬浮于生理上相容的载体(即，在组合物中)，并且可以施用于对象，即，宿主动物，如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔子、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡、非人类的灵长类动物(例如，猕猴)等。在某些实施方案中，宿主动物为非人宿主动物。
可以例如，通过肌内注射或通过施用到哺乳动物对象的血流中，来将一种或多种rAAV递送至哺乳动物对象。可以通过注射到静脉、动脉或任何其它血管导管施用至血流中。在某些实施方案中，通过分离的肢体灌注(手术领域中众所周知的技术)将一种或多种rAAV施用于血流中，该方法基本上使本领域技术人员能够在施用rAAV病毒颗粒之前将肢体从体循环中分离。本领域技术人员也可以采用美国专利第6,177,403号中所述的分离的肢体灌注技术的变型，将病毒颗粒施用到分离的肢体的脉管系统中，以潜在地增强至肌细胞或组织的转导。此外，在某些情况下，将病毒颗粒递送到对象的中枢神经系统(CNS)是可取的。“CNS”意为脊椎动物脑和脊髓的所有细胞和组织。因此，该术语包括但不限于：神经元细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、脑脊液(CSF)、间隙空间、骨、软骨等。可以通过注入，例如，脑室区域将重组AAV直接递送到CNS或脑，以及使用本领域已知的神经外科技术，如通过立体定位注射，用针、导管或相关装置将将重组AAV直接递送到纹状体(例如，纹状体的尾状核或壳核)、脊髓和神经肌肉接头或小脑小叶(参见，例如，Stein等人,J Virol 73:3424-3429,1999；Davidson等人,PNAS 97:3428-3432,2000；Davidson等人,Nat.Genet.3:219-223,1993；以及Alisky和Davidson,Hum.Gene Ther.11:2315-2329,2000)。
本发明的组合物可以包含单独的rAAV，或rAAV与一种或多种其它病毒(例如，第二rAAV，其编码有一种或多种不同的转基因)的组合。在某些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的rAAV，其各自具有一种或多种不同的转基因。
rAAV的有效量为足以靶向感染动物，靶向期望组织的量。在一些实施方案中，rAAV的有效量为足以产生稳定的体细胞转基因动物模型的量。有效量将主要取决于诸如对象的种类、年龄、重量、健康和待靶向的组织的因素，因此可以在动物和组织之间变化。例如，一种或多种rAAV的有效量范围通常为约1ml至约100ml的含有约109至1016个基因组拷贝的溶液。在一些情况下，约1011至1012个rAAV基因组拷贝的剂量为适当的。在某些实施方案中，1012个rAAV基因组拷贝可有效靶向心脏、肝脏和胰腺组织。在一些情况下，通过多剂量的rAAV产生稳定的转基因动物。
在一些实施方案中，配制rAAV组合物以减少组合物中AAV颗粒的聚集，特别是在存在高的rAAV浓度下(例如，约1013个基因组拷贝/mL或更多)。减少rAAV聚集的方法为本领域众所周知的，并且包括例如，表面活性剂的添加、pH调节、盐浓度调节等。(参见，例如，Wright等人(2005)Molecular Therapy 12:171-178，将其内容通过引用并入本文)。
“重组AAV(rAAV)载体”，在最低限度上包括转基因及其调控序列，以及5'和3'AAV反向末端重复(ITR)。将该重组AAV载体包装到衣壳蛋白中，并递送到选定的靶细胞。在一些实施方案中，转基因为与载体序列异源的核酸序列，其编码目标多肽、蛋白、功能性RNA分子(例如，siRNA)或其它基因产物。核酸编码序列与调控组分以允许在靶组织的细胞中进行转基因转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接。
载体的AAV序列通常包含顺式作用的5'和3'反向末端重复(ITR)序列(参见，例如，B.J.Carter,in"Handbook of Parvoviruses",ed.,P.Tijsser,CRC Press,pp.155 168(1990))。ITR序列的长度通常为约145个碱基对。在某些实施方案中，将编码ITR的基本上全部序列用于该分子中，尽管这些序列的一些程度的微小修饰是允许的。修饰这些ITR序列的能力在本领域技术人员范围内。(参见，例如，教材，如Sambrook等人,"MolecularCloning.A Laboratory Manual",2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；和K.Fisher等人,J Virol.,70:520 532(1996))。本发明中采用的此类分子的实例为含有转基因的“顺式作用”的质粒，其中选定的转基因序列和相关调控元件侧接有5'和3'AAV ITR序列。所述AAV ITR序列可以获自任何已知的AAV，包括本文进一步描述的哺乳动物AAV类型。
IX.治疗方法
本发明提供治疗具有(或易患)全部或部分由获得性功能突变蛋白引起的疾病或病症的风险的对象的预防性和治疗性方法。在一个实施方案中，所述疾病或病症为三核苷酸重复疾病或病症。在另一实施方案中，所述疾病或病症为聚谷氨酰胺病症。在优选的实施方案中，所述疾病或病症为与亨廷汀的表达相关的病症，其中亨廷汀的改变，尤其是CAG重复拷贝数的扩增导致亨廷汀基因(结构或功能)或亨廷汀蛋白(结构或功能或表达)的缺陷，使得临床表现包括在亨廷顿病患者中观察到的那些表现。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”被定义为向患者应用或施用治疗剂(例如，RNA剂或载体或编码其的转基因)，或者向来自患者的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，目的是治愈、治疗、减轻、缓解、改变、医治、改善、改进或影响疾病或病症、疾病或病症的症状或疾病的易感性，所述患者患有疾病或病症、具有疾病或病症的症状、或疾病或病症的易感性。
在一个方面，本发明提供了防止对象的如上文所述的疾病或病症的方法，其通过向对象施用治疗剂(例如，RNAi剂或载体或编码其的转基因)来进行。可以通过，例如，上文所述的诊断或预后分析中的任一种或其组合来鉴定具有疾病风险的对象。预防剂的施用可以在疾病或病症的症状特征表现之前发生，以防止疾病或病症，或者可选地，延迟其进展。
本发明的另一方面涉及在治疗上治疗对象，即改变疾病或病症的症状的发作的方法。在示例性实施方案中，本发明的调节方法涉及使表达获得性功能突变体的细胞与对基因中的靶序列(例如，SEQ ID NO:1、2或3)具有特异性的治疗剂(例如，RNAi剂或载体或编码其的转基因)接触，以获得特异性干扰所述基因的序列。这些方法可以在体外进行(例如，通过用试剂培养细胞)，或者可选地，在体内进行(例如，通过将试剂施用于对象)。
关于预防性和治疗性的治疗方法，可以基于获自药物基因组学领域的知识特异性地调整或修饰此类治疗。如本文所用，“药物基因组学”是指将基因组学技术，如基因测序、统计基因学和基因表达分析应用于临床开发和市场上的药物。更具体地，该术语是指患者的基因如何确定他或她对药物的反应的研究(例如，患者的“药物反应表型”或“药物反应基因型”)。因此，本发明的另一方面提供用本发明的靶基因分子或根据该个体的药物反应基因型的靶基因调节剂来调整个体的预防性或治疗性治疗的方法。药物基因组学允许临床医生或医师使预防性或治疗性治疗靶向从该治疗中最受益的患者，以及避免治疗会经历毒性药物相关副作用的患者。
可以在适当的动物模型中测试治疗剂。例如，本文所述的RNAi剂(或表达载体或编码其的转基因)，可以用于动物模型中以测定用所述试剂治疗的功效、毒性或副作用。可选地，治疗剂可以用于动物模型中以测定此类试剂的作用机制。例如，试剂可以用于动物模型中以测定用此类试剂治疗的功效、毒性或副作用。可选地，试剂可以用于动物模型中以测定此类试剂的作用机制。
含有本发明的RNA沉默剂的药物组合物，可以施用于被诊断为患有神经性病症如亨廷顿病，或具有发展神经性病症如亨廷顿病的风险的任何患者。在一个实施方案中，所述患者被诊断为患有神经性病症，并且所述患者在其它方面通常身体健康。例如，所述患者不是病入膏肓，并且所述患者可能在诊断之后存活至少2、3、5或更多年。所述患者可以在诊断之后立即治疗，或者可以延迟治疗直至患者经历更虚弱的症状，如帕金森病患者的运动波动和运动障碍。在另一实施方案中，所述患者未到达疾病的晚期阶段。
可以以每kg体重小于约1.4mg或每kg体重小于10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg，以及每kg体重小于200nmole RNA剂(例如，约4.4x 1016份拷贝)或每kg体重小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmole RNA沉默剂的单位剂量，施用修饰用于增强摄取进入神经细胞的RNA沉默剂。可以例如通过注射(例如，静脉内或肌内、鞘内或直接进入脑部)、吸入剂量或局部应用来施用单位剂量。特别优选的剂量小于2、1或0.1mg/kg体重。
可以以每种器官约0.00001mg至约3mg，或优选地每种器官约0.0001-0.001mg、每种器官约0.03-3.0mg、每只眼睛约0.1-3.0mg或每种器官约0.3-3.0mg的剂量，将RNA沉默剂直接递送到器官(例如，直接到脑部)。所述剂量可以为有效治疗或预防神经性疾病或病症，例如，亨廷顿病的量。在一个实施方案中，以低于每天一次，例如，小于每2天、每4天、每8天或每30天一次的频率施用单位剂量。在另一实施方案中，不以频率(例如，不是固定频率)施用单位剂量。例如，可以单次施用单位剂量。在一个实施方案中，将有效剂量与其它传统治疗方式一起施用。
在一个实施方案中，向对象施用初始剂量和一种或多种维持剂量的RNA沉默剂。一种或多种维持剂量通常低于初始剂量，例如，为初始剂量的一半。维持方案可以包括用范围为每天0.01μg至1.4mg/kg体重，例如，每天10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg体重的一种或多种剂量治疗对象。优选以不超过每5天、每10天或每30天一次施用维持剂量。此外，治疗方案可以持续一段时间，其将根据具体疾病的性质、其严重性和患者的总体状况而变化。在优选实施方案中，可以以不超过每天一次，例如，不超过每24小时、每36小时、每48小时或更多小时一次，例如，不超过每5天或每8天一次递送剂量。在治疗之后，可以监测患者的状况变化以及疾病状态的症状的缓解。如果患者对目前剂量水平没有显著反应，则可以增加化合物的剂量，或者如果观察到疾病状态的症状的缓解，如果已经消除疾病状态或如果观察到不期望的副作用，则可以降低剂量。
如在特定情况下期望或认为适当的，可以以单剂量或者两个或更多个剂量施用有效剂量。如果期望促进重复或频繁的输注，则植入递送装置，例如，泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储器可以为可取的。在一个实施方案中，药物组合物包含多个RNA沉默剂种类。在另一实施方案中，相对于天然存在的靶序列，RNA沉默剂种类具有与另一种类不重叠和不相邻的序列。在另一实施方案中，多种RNA沉默剂种类对于不同的天然存在的靶基因具有特异性。在另一实施方案中，RNA沉默剂为等位基因特异性的。在另一实施方案中，多种RNA沉默剂种类靶向两个或更多个靶序列(例如，两个、三个、四个、五个、六个或更多个靶序列)。
在成功治疗之后，使患者经历维持治疗以预防疾病状态的复发是可取的，其中以范围为0.01μg至100g/kg体重的维持剂量施用本发明的化合物(参见美国专利第6,107,094号)。
RNA沉默剂组合物的浓度为，足以有效治疗或预防病症或调控人体生理状况的量。施用的RNA沉默剂的浓度或量，将取决于针对试剂确定的参数和施用方法，例如经鼻、口腔或肺施用。例如，鼻制剂倾向于需要较低浓度的一些成分，以避免鼻道的刺激或灼热感。为了提供合适的鼻制剂，有时将口服制剂稀释高达10-100倍是可取的。
某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量，所述因素包括但不限于：疾病或病症的严重性、先前的治疗、对象的一般健康状况和/或年龄，以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的RNA沉默剂治疗对象，可以包括单次治疗，或优选地，可以包括一系列治疗。还应理解，用于治疗的RNA沉默剂的有效剂量，可以在特定的治疗过程中增加或降低。剂量的变化可由于本文所述的诊断分析的结果，并且从其变得显而易见。例如，可以在施用RNA沉默剂组合物之后监测对象。基于来自监测的信息，可以施用另外量的RNA沉默剂组合物。
给药取决于待治疗的疾病状况的严重性和反应性，治疗的过程持续数天到数月，或直到实现治愈或实现疾病状态的减少。最佳给药计划可以从患者体内药物积累的测量来计算。本领域普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以根据单独化合物的相对效力而变化，通常可以基于在体外和体内动物模型中有效的EC50来估算。在一些实施方案中，动物模型包括表达人基因，例如，产生靶RNA(例如，在神经细胞中表达的RNA)的基因的转基因动物。转基因动物可以缺乏相应的内源性RNA。在另一实施方案中，用于测试的组合物包括至少在内部区域与动物模型中的靶RNA与人中的靶RNA之间保守的序列互补的RNA沉默剂。
X.药物组合物和施用方法
如下文所述，本发明涉及上述试剂用于预防性和/或治疗性治疗的用途。因此，可以将本发明的调节剂(例如，RNAi剂)掺入适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含核酸分子、蛋白、抗体或调节化合物和药学可接受的载体。如本文所用，术语“药学可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂对药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容时，本文预期了其在组合物的用途。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。
将本发明的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括：肠胃外(例如，静脉内、皮内、皮下、腹膜内、肌内)、口服(例如，吸入)、经皮(局部)和经粘膜施用。在某些示例性实施方案中，本发明的药物组合物通过这样的施用途径递送到脑脊液(CSF)，所述施用途径包括但不限于：纹状体内(IS)施用、脑室内(ICV)施用和鞘内(IT)施用(例如，经由泵、输注等)。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液，可以包括下述组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。可以将肠胃外给药的制剂包封于玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括：无菌水溶液(在水溶性情况下)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内、IS、ICV和/或IT施用，合适的载体包括：生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须无菌，且应为流体以达到容易注射的程度。它在生产和储存条件下必须稳定，且必须在防止微生物如细菌和真菌的污染作用下保存。载体可以为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过维持在分散液情况下所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫汞撒等来实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过如下来制备：以所需量将活性化合物掺入至具有以上所列的一种成分或成分的组合的适当溶剂中，根据需要，随后进行过滤灭菌。通常，分散液通过如下制备：将活性化合物掺入至含有碱性分散介质和所需的上述所列的其他成分的无菌媒介物中。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其先前无菌过滤的溶液的任何其它所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以被包封在明胶胶囊中或被压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，可以将活性化合物掺入赋形剂并以片剂、锭剂、胶囊的形式使用。也可以使用用作漱口液的流体载体制备口服组合物，其中流体载体中的化合物被口服施用、漱口(swished)和吐出(expectorated)或吞咽。可以包括药学相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有下述成分或类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。
对于通过吸入施用，以来自加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如，气体如二氧化碳)或喷雾器的气雾剂喷雾的形式递送化合物。
也可以通过经粘膜或经皮方式全身施用。对于经粘膜或经皮施用，将适于穿透屏障的渗透液用于制剂中。此类渗透液通常为本领域已知的，并且包括例如，用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，将活性化合物配制成本领域通常已知的软膏剂、药膏、凝胶或乳膏剂。
所述化合物也可以以栓剂(例如，具有常规栓剂基料，如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂的形式制备用于直肠递送。
也可以使用本领域已知的方法，通过转染或感染施用RNA沉默剂，所述方法包括但不限于以下文献中所述的方法：McCaffrey等人.(2002),Nature,418(6893),38-9(流体力学转染)；Xia等人.(2002),Nature Biotechnol.,20(10),1006-10(病毒介导的递送)；或Putnam(1996),Am.J.Health Syst.Pharm.53(2),151-160,erratum at Am.J.HealthSyst.Pharm.53(3),325(1996)。
也可以通过适于施用核酸试剂，如DNA疫苗的任何方法施用RNA沉默剂。这些方法包括基因枪、生物注射器和皮肤贴剂以及无针方法，如美国专利第6,194,389号中公开的微粒DNA疫苗技术，以及美国专利第6,168,587号中公开的采用粉末状疫苗的哺乳动物经皮无针疫苗接种。此外，鼻内递送是可能的，尤其如Hamajima等人(1998),Clin.Immunol.Immunopathol.,88(2),205-10中所述。还可以使用脂质体(例如，如美国专利第6,472,375号中所述)和微型胶囊。还可以使用生物可降解的可靶向的微粒递送系统(例如，如美国专利第6,471,996号中所述)。
在一个实施方案中，所述活性化合物用保护化合物免于从身体中快速消除的载体来制备，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。材料也可以从Alza Corporation and NovaPharmaceuticals,Inc商购获得。脂质体悬浮液(包括利用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药学可接受的载体。这些可以根据本领域已知的方法，例如，如美国专利第4,522,811号中所述进行制备。
以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物，尤其有利于施用的简便性和剂量的均匀性。如本文所用，剂量单位形式是指适合以单位剂量用于待治疗对象的物理离散单位；每个单位含有与所需药物载体结合的经计算产生期望治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格，决定于并且直接取决于活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，以及在混配此类活性化合物以用于治疗个体的领域中固有的局限。
此类化合物的毒性以及治疗功效，可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如，通过测定LD50(致50％的群体死亡的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果的剂量比为治疗指数，并且可以表示为LD50/ED50的比值。表现出大的治疗指数的组合物是优选的。虽然可以使用表现出毒性副作用的化合物，但是应当注意设计出能将此类化合物靶向于受影响组织部位的递送系统，以使对未感染细胞的可能损伤最小化，并从而降低副作用。
获自细胞培养物分析和动物研究的数据，可以用于确立用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选位于包括ED50同时具有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。根据采用的剂量和利用的施用途径，所述剂量可以在该范围内变化。对于在本发明方法中使用的任何化合物，从细胞培养物分析中可以估算治疗有效剂量。可以在动物模型中确立能达到包括在细胞培养物中测定的EC50(能实现最大反应的50％的测试化合物浓度)的血浆循环浓度范围的剂量。此类信息可以用于更准确地确定人中的可用剂量。可以例如通过高效液相色谱来测量血浆水平。
可以将药物组合物和任选的施用说明包括在容器、包装或分配器中。
如本文所定义，RNA沉默剂的治疗有效量(即，有效剂量)取决于所选择的RNA沉默剂。例如，如果选定编码shRNA的质粒，则可以施用大约1μg至1000mg范围内的单剂量的量；在一些实施方案中，可以施用10、30、100或1000μg。在一些实施方案中，可以施用1-5g组合物。可以以每天一次或多次至每周一次或多次，包括每隔一天一次施用组合物。技术人员应理解，某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时间安排，包括但不限于：疾病或病症的严重性、先前的治疗、对象的一般健康状况和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的蛋白、多肽或抗体治疗对象，可以包括单次治疗，或优选地，可以包括一系列治疗。
可以例如，使用本领域已知的方法，包括但不限于Xia等人,(2002)(见上文)中所述的那些方法，将本发明的核酸分子插入表达构建体，例如，病毒载体、逆转录病毒载体、表达盒或质粒病毒载体中。可以通过例如，吸入、口服、静脉内注射、局部施用(参见美国专利第5,328,470号)或通过立体定位注射(参见例如，Chen等人(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,3054-3057)，将表达构建体递送到对象中。递送载体的药物制剂可以包含在可接受稀释剂中的载体，或者可以包含递送媒介物嵌入其中的缓释基质。可选地，在完整的递送载体可以从重组细胞如逆转录病毒载体完整产生的情况下，药物制剂可以包含产生基因递送系统的一种或多种细胞。
本发明的核酸分子还可以包括小发夹RNA(shRNA)，和被工程化以表达shRNA的表达构建体。shRNA的转录起始于聚合酶III(pol III)启动子，并且被认为在4-5-胸腺嘧啶转录终止位点的2位终止。在表达时，shRNA被认为折叠成具有3'UU-悬突的茎环结构；随后，处理这些shRNA的末端，将所述shRNA转化成约21个核苷酸的siRNA样分子(Brummelkamp等人(2002),Science,296,550-553；Lee等人,(2002).见上文；Miyagishi和Taira(2002),Nature Biotechnol.,20,497-500；Paddison等人(2002),见上文；Paul(2002),见上文；Sui(2002)见上文；Yu等人(2002),见上文)。
表达构建体可以为适用于适当表达系统的任何构建体，并且包括但不限于本领域已知的逆转录病毒载体、线性表达盒、质粒和病毒或病毒来源的载体。此类表达构建体可以包括诱导型启动子，RNA Pol III启动子系统，如U6snRNA启动子或H1RNA聚合酶III启动子或本领域已知的其它启动子中的一种或多种。所述构建体可以包括siRNA的一条或两条链。表达两条链的表达构建体还可以包括连接两条链的环结构，或者每条链可以在同一构建体中从单独的启动子分别转录。每条链也可以从单独的表达构建体转录(Tuschl,(2002),见上文)。
在某些示例性实施方案中，包含本发明的RNA沉默剂的组合物，可以通过多种途径递送到对象的神经系统。示例性途径包括：经鞘内、实质(例如，在脑中)、鼻和眼递送。组合物还可以全身递送，例如，通过经静脉内、皮下或肌内注射递送，其特别可用于将RNA沉默剂递送到周围神经元。优选的递送途径为直接至脑部，例如，进入脑的脑室或下丘脑，或者进入脑的侧部或背部区域。用于神经细胞递送的RNA沉默剂，可以掺入适合施用的药物组合物中。
例如，组合物可以包含一种或多种种类的RNA沉默剂和药学可接受的载体。本发明的药物组合物可以以多种方式施用，这取决于期望局部治疗还是全身治疗，以及取决于待治疗的区域。施用可以为局部的(包括眼部、鼻内、经皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注射、鞘内或室内(例如，脑室内)施用。在某些示例性实施方案中，通过使用本文所述的多种合适的组合物和方法，将本发明的RNA沉默剂递送通过血脑屏障(BBB)。
递送途径可以取决于患者的病症。例如，可以将本发明的抗-htt RNA沉默剂直接施用到诊断患有亨廷顿病的对象的脑部(例如，进入基底神经节的苍白球或纹状体，以及纹状体的中型多棘神经元附近)。除了本发明的RNA沉默剂，可以给予患者第二治疗，例如，姑息治疗和/或疾病特异性治疗。第二治疗可以为，例如，有症状的(例如，用于减轻症状)、神经保护的(例如，用于减缓或停止疾病进展)、或恢复性的(例如，用于逆转疾病过程)。对于亨廷顿病的治疗，例如，症状治疗可以包括药物氟哌啶醇(haloperidol)、卡马西平(carbamazepine)或丙戊酸盐(valproate)。其它的治疗可以包括：心理治疗、物理治疗、言语治疗、交际和记忆辅助、社会支持服务和膳食建议。
可以将RNA沉默剂递送到脑神经细胞。可以利用不需要使组合物通过血脑屏障的递送方法。例如，含有RNA沉默剂的药物组合物，可以通过直接注射到含有受疾病影响的细胞的区域递送到患者。例如，可以通过直接注射到脑部递送药物组合物。注射可以通过立体定位注射到脑部的特定区域(例如，黑质、皮质、海马、纹状体或苍白球)。RNA沉默剂可以递送到中枢神经系统的多个区域(例如，进入脑部的多个区域和/或进入脊髓)。RNA沉默剂可以递送到脑部的弥漫性区域(例如，扩散递送到脑的皮质)。
在一个实施方案中，RNA沉默剂可以通过插管或其它递送装置递送，所述插管或其它递送装置具有一端植入至组织，例如脑部，例如，脑部的黑质、皮质、海马、纹状体或苍白球。插管可以与RNA沉默剂的储器连接。流动或递送可以由泵，例如，渗透泵或微型泵，如Alzet泵(Durect,Cupertino,CA)介导。在一个实施方案中，将泵和储器植入于远离组织的区域，例如，在腹部，通过导管从泵或储器引导到释放部位来实现递送。递送至脑部的装置描述于，例如，美国专利第6,093,180号和第5,814,014号中。
可以进一步修饰本发明的RNA沉默剂，使得其能够穿过血脑屏障。例如，RNA沉默剂可以与能够使试剂穿过屏障的分子缀合。此类修饰的RNA沉默剂，可以通过任何期望的方法，如通过室内或肌内注射，或者通过例如肺部递送来施用。
在某些实施方案中，外泌体用于递送本发明的RNA沉默剂。在全身注射后，外泌体可以穿过BBB，并将siRNA、反义寡核苷酸、化疗剂和蛋白特异性递送到神经元(参见，Alvarez-Erviti L,Seow Y,Yin H,Betts C,Lakhal S,Wood MJ.(2011).Delivery ofsiRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.NatBiotechnol.2011Apr；29(4):341-5.doi:10.1038/nbt.1807；El-Andaloussi S,Lee Y,Lakhal-Littleton S,Li J,Seow Y,Gardiner C,Alvarez-Erviti L,Sargent IL,WoodMJ.(2011).Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.NatProtoc.2012Dec；7(12):2112-26.doi:10.1038/nprot.2012.131；EL Andaloussi S,
Figure BDA0001487578630001081
I,Breakefield XO,Wood MJ.(2013).Extracellular vesicles:biology andemerging therapeutic opportunities.Nat Rev Drug Discov.2013May；12(5):347-57.doi:10.1038/nrd3978；El Andaloussi S,Lakhal S,
Figure BDA0001487578630001082
I,Wood MJ.(2013).Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers.Adv DrugDeliv Rev.2013Mar；65(3):391-7.doi:10.1016/j.addr.2012.08.008)。
在某些实施方案中，使用一种或多种亲脂性分子以允许将本发明的RNA沉默剂递送通过BBB(Alvarez-Ervit(2011))。然后，RNA沉默剂将通过例如亲脂性伪装的酶降解而激活，以将药物释放成其活性形式。
在某些实施方案中，可使用一种或多种受体介导的渗透化合物增加BBB的渗透性，以允许本发明的RNA沉默剂的递送。这些药物通过增加血液中的渗透压(这使内皮细胞之间的紧密连接松动)来暂时增加BBB的渗透性((El-Andaloussi(2012))。通过使紧密连接松动，可以进行RNA沉默剂的正常静脉内注射。
在某些实施方案中，使用基于纳米颗粒的递送系统将本发明的RNA沉默剂递送穿过BBB。如本文所用，“纳米颗粒”是指通常为固体、生物可降解的胶体系统的聚合物纳米颗粒，其已经被广泛研究作为药物或基因载体(S.P.Egusquiaguirre,M.Igartua,R.M.Hernandez,and J.L.Pedraz,“Nanoparticle delivery systems for cancertherapy:advances in clinical and preclinical research,”Clinical andTranslational Oncology,vol.14,no.2,pp.83–93,2012)。聚合物纳米颗粒被分成两种主要类别：天然聚合物和合成聚合物。用于siRNA递送的天然聚合物包括但不限于：环糊精、壳聚糖和去端肽胶原(atelocollagen)(Y.Wang,Z.Li,Y.Han,L.H.Liang,and A.Ji,“Nanoparticle-based delivery system for application of siRNA in vivo,”CurrentDrug Metabolism,vol.11,no.2,pp.182–196,2010)。合成聚合物包括但不限于已经被深入研究的聚乙烯亚胺(PEI)、聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和树状物(X.Yuan,S.Naguib,and Z.Wu,“Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles,”Expert Opinionon Drug Delivery,vol.8,no.4,pp.521–536,2011)。对于纳米颗粒和其它合适递送系统的综述，参见Jong-Min Lee,Tae-Jong Yoon和Young-Seok Cho,“Recent Developments inNanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy,”BioMed ResearchInternational,vol.2013,Article ID 782041,10pages,2013.doi:10.1155/2013/782041(通过引用整体并入)。
本发明的RNA沉默剂可以眼部施用，如以治疗视网膜病症，例如，视网膜病变。例如，可以将药物组合物施用至眼睛表面或附近组织，例如，眼睑内部。它们可以例如，通过喷雾、滴剂、作为洗眼剂、或软膏剂局部施用。可以通过本领域已知的眼部递送系统，如涂抹器或眼部滴管来递送软膏剂或滴液。此类组合物可以包括粘液模拟物质(mucomimetics)，如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇)；防腐剂，如山梨酸、EDTA或苯扎氯铵以及通常量的稀释剂和/或载体。药物组合物还可以施用于眼内部，并且可以通过可以将其引入到选定区域或结构的针或其它递送装置引入。含有RNA沉默剂的组合物还可以经由眼部贴剂施用。
通常，本发明的RNA沉默剂可以通过任何合适的方法施用。如本文所用，局部递送可以指将RNA沉默剂直接施用至身体的任何表面，包括眼睛、粘膜、体腔表面或施用至任何内部表面。局部施用的制剂可以包括：皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶、滴剂、喷雾剂和液体。常规药物载体、水性、粉状、或油性基质、增稠剂等可以是必需或期望的。局部施用也可以用作将RNA沉默剂选择性递送至对象的表皮或真皮，或至其特定层，或至下方组织的手段。
用于鞘内或室内(例如，脑室内)施用的组合物，可以包括包括无菌水溶液，其还可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。用于鞘内或室内施用的组合物优选不包含转染试剂或另外的亲脂性部分，除了例如与RNA沉默剂连接的亲脂性部分之外。
用于肠胃外施用的制剂可以包含无菌水溶液，其还可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。可以通过例如，与储器连接的室内导管促进室内注射。对于静脉内使用，应控制溶质的总浓度以使制剂等渗。
本发明的RNA沉默剂可以通过肺部递送施用于对象。可以通过吸入分散液来递送肺部递送组合物，使得分散液中的组合物能够到达肺部，在那它可以容易地通过肺泡区域直接吸收到血液循环中。肺部递送对于全身递送和局部递送来治疗肺病是有效的。在一个实施方案中，通过肺部递送施用的RNA沉默剂已被修饰，使得其能够穿过血脑屏障。
可以通过不同的方法实现肺部递送，所述方法包括使用基于喷雾、雾化、胶束和干粉的制剂。可以用液体喷雾器、基于气溶胶的吸入器和干粉分散装置实现递送。计量的剂量装置为优选的。使用雾化器或吸入器的益处之一为，因为装置为独立的，所以使污染的可能性最小化。干粉分散装置，例如，递送可以容易地被配制成干粉的药物。RNA沉默剂组合物可以作为冻干的或喷雾干燥的粉末单独地或与合适的粉末载体组合稳定储存。用于吸入的组合物的递送，可以由给药时间安排元件介导，所述给药时间安排元件包括计时器、剂量计数器、时间测量装置或时间指示器，当并入装置时，所述给药时间安排元件能够在气雾剂药物的施用期间对患者进行剂量追踪、顺从性监测和/或剂量引发。
可用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂，如人血清白蛋白(HSA)；填充剂，如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲液；盐，如氯化钠等。这些载体可以呈结晶或非结晶形式，或者可以为这两者的混合物。
特别有价值的填充剂包括：相容的碳水化合物、多肽、氨基酸或它们的组合。合适的碳水化合物包括：单糖，如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、海藻糖等；环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精；和多糖，如棉子糖、麦芽糊精、葡聚糖等；糖醇，如甘露糖醇、木糖醇等。优选的碳水化合物组包括：乳糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糊精和甘露糖醇。合适的多肽包括阿斯巴甜。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，其中甘氨酸为优选的。
合适的pH调节剂和缓冲液包括由有机酸和碱制备的有机盐，如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等；柠檬酸钠为优选的。
可以通过口服和经鼻递送来施用本发明的RNA沉默剂。例如，通过这些膜施用的药物快速起效，提供治疗性血浆水平，避免肝脏代谢的首过效应，以及避免药物暴露于不利的胃肠(GI)环境中。另外的优势包括容易进入膜部位，使得可以容易地施加、定位和去除药物。在一个实施方案中，通过口服或经鼻递送施用的RNA沉默剂已被修饰成能够穿过血脑屏障。
在一个实施方案中，包含RNA沉默剂的组合物的单位剂量或测量剂量由植入装置分配。所述装置可以包括监测对象内参数的传感器。例如，所述装置可以包括泵，如渗透泵，以及任选地，相关电子装置。
RNA沉默剂可以包装在病毒天然衣壳中，或包装在化学或酶促产生的人工衣壳或由其得到的结构中。
XI.试剂盒
在某些其它方面，本发明提供试剂盒，其包含含有RNA沉默剂，例如，双链RNA沉默剂或sRNA剂(例如前体，例如，可以被加工成sRNA剂的较大RNA沉默剂，或者编码RNA沉默剂如双链RNA沉默剂或sRNA剂或其前体的DNA)的药物制剂的合适容器。在某些实施方案中，药物制剂的各个组分可以在一个容器中提供。可选地，在两个或更多个容器中分别提供药物制剂的组分是可取的，例如，一个容器用于RNA沉默剂制备，以及至少另一容器用于载体化合物。所述试剂盒可以以多个不同的配置包装，如在单个盒子中的一个或多个容器。例如，根据试剂盒提供的说明书，可以组合不同的组分。可以根据本文所述的方法组合所述组分，例如，以制备和施用药物组合物。所述试剂盒还可以包含递送装置。
本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文公开的实施方案的范围的情况下，可以使用合适的等同形式对本文所述的方法进行其它合适的修改和改进。现已详细描述了某些实施方案，所述实施方案通过参考下述实施例得以更清楚地理解，所述实施例仅为了说明目的而被包括在内，并且不旨在限制。
实施例
实施例1.用非配制的稳定的疏水性siRNA降低原代神经元和小鼠脑部中的亨廷汀
探索了疏水性修饰的ASO-siRNA杂交物的用途，所述杂交物有可能提供较好的体内功效和分布以及体外原代神经元的敲低。亨廷汀基因被用作mRNA敲低的靶标。亨廷顿病为单基因的(Mangiarini,L.等人.Exon 1of the HTT gene with an expanded CAGrepeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype intransgenic mice.Cell 87,493–506(1996))，并具有导致疾病病理学的许多细胞机制(Zuccato,C.,Valenza,M.&Cattaneo,E.Molecular Mechanisms and PotentialTherapeutical Targets in Huntington's Disease.Physiological Reviews 90,905–981(2010))，使其成为可能的未来寡核苷酸治疗的极好候选物。
开发了靶向亨廷汀基因的一组疏水性修饰的siRNA。在没有任何用于递送的制剂下，单次低剂量注射后，在体外原代神经元和体内小鼠脑部中均观察到功效和效力。这些化合物结合在早期模型siRNA和hsiRNA以及在ASO中存在的许多不同的化学和结构修饰。这些性质(其包括稳定碱基修饰、胆固醇缀合和完全硫代磷酸化的单链尾部)使得这些hsiRNA成为研究在难以靶向的原代细胞和器官(其可以适用于许多不同的生物学上相关的系统)中的基因功能的极好工具。
1.1hsiRNA—疏水性修饰的siRNA/反义杂交物被原代神经元有效地内化
hsiRNA为具有短的双链体区域(15个碱基对)和单链完全硫代磷酸化尾部的不对称化合物。这些化合物中的所有嘧啶为2’-氟和2’-O-甲基修饰的(提供稳定性)，并且过客链的3’端缀合至TEG-胆固醇(图1A、图8)13。该胆固醇缀合物能够进行快速的膜缔合，而单链硫代磷酸化尾部对于通过与常规反义寡核苷酸所用的机制相似的机制进行细胞内化是必需的。将Cy3-标记的hsiRNA添加到原代皮质神经元，导致立即(数分钟内)细胞缔合(图1B)。令人关注的是，首先，优先在树突中观察到摄取，随后重新定位到细胞体(图9)。皿中所有细胞的摄取均匀，确认了有效的内化。
1.2靶向亨廷汀的hsiRNA的鉴定
设计并合成了一组靶向亨廷汀mRNA的94种hsiRNA化合物(图8)。这些序列跨越该基因并被选择以符合标准的siRNA设计参数(Birmingham,A.等人,A protocol fordesigning siRNAs with high functionality and specificity.Nat Protoc 2,2068–2078(2007))，其包括评估GC含量、特异性和低的种子互补频率(Anderson,E.M.等人,Experimental validation of the importance of seed complement frequency tosiRNA specificity.RNA 14,853–861(2008))、消除含有miRNA种子的序列和检查热力学偏差(Khvorova,A.,Reynolds,A.&Jayasena,S.D.Functional siRNAs and miRNAs ExhibitStrand Bias.Cell 115,209–216(2003)；Schwarz,D.S.等人,Asymmetry in the Assemblyof the RNAi Enzyme Complex.Cell 115,199–208(2003))。超过50％的碱基为化学修饰的，以提供体内稳定性和使免疫应答最小化(Judge,A.,Bola,G.,Lee,A.&MacLachlan,I.Design of Noninflammatory Synthetic siRNA Mediating Potent Gene Silencingin Vivo.Molecular Therapy 13,494–505(2006))。修饰将另外的限制施用于序列空间，降低了命中率。在将HeLa细胞暴露于1.5μM hsiRNA(被动摄取，无制剂)72小时之后，通过QUANTIGENE分析测量了对亨廷汀mRNA表达的影响(图2)，其中7％的序列显示出超过70％的沉默。除了3’UTR的远端部分之外，功能性靶位点遍布该基因，这随后通过在HeLa细胞中优先表达较短的htt同种型来解释(Li,S.H.等人,Huntington's disease gene(IT15)iswidely expressed in human and rat tissues.NEURON 11,985–993(1993))。鉴定16个活性序列的IC50值，基于初筛活性和物种间的保守性对其进行选择(图10)。在被动摄取(无制剂)中，IC50值的范围为90至766nM，以及在脂质介导的摄取中，IC50值的范围为4至91pM(图8)。完全化学优化的活性化合物很容易被鉴定，这表明在未来其它基因的筛选中，小得多的文库应是足够的，尽管命中率可能在靶标之间变化。将hsiRNA靶向位置10150(HTT10150(即，5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)))用于进一步研究。为确保hsiRNA化学支架不会负面影响HTT10150的功效和效力，在被动和脂质介导的沉默分析中，测试了经修饰和未经修饰形式的化合物(图3)。如所预期的，仅经修饰的序列在通过被动摄取(IC50＝82.2nM)进行的细胞递送和Htt沉默中成功，而经修饰和未经修饰的化合物在脂质介导的递送中显示出相似的IC50值(分别为4pM和13pM)，表明hsiRNA支架修饰不会干扰RNA诱导的沉默复合物(RISC)的负载。
1.3在原代神经元中用非配制的hsiRNA进行的有效和特异性基因沉默
进一步测试HTT10150对分离自FVBN小鼠的原代神经元中mRNA的沉默。在将简单的非配制的化合物添加至皮质神经元之后72小时和1周均观察到功效(图4A)，其中在1.25μM浓度下观察到最大沉默(70％)。HTT10150在原代纹状体神经元中也显示出相似沉默(图4B)。在1周之后，通过蛋白质印迹测量蛋白质水平(图14)，确认了在用1.25μM化合物处理后具有85％的蛋白质减少的mRNA数据(图4C)。管家基因(PPIB、GAPDH)和通过ALAMARBLUE分析测量的总体细胞活力(图11B和14)，在这些浓度下不受影响。在其它实验中，在3μM观察到对细胞活力的轻微影响。
为评价单次HTT10150治疗后的作用持续时间，在一周、两周和三周间隔测量沉默(图4D)。负载的RISC复合物的半衰期为数周(Song,E.等人Sustained Small InterferingRNA-Mediated Human Immunodeficiency Virus Type 1Inhibition in PrimaryMacrophages..Journal of Virology 77,7174–7181(2003))，并且预期沉默在非分裂细胞中是持久的。事实上，用hsiRNA的单次治疗足以在测试的所有时间诱导htt沉默。三周是原代神经元能够保持培养的最长时间。其它系统将用于长期实验。
为证明hsiRNA作为神经元基因沉默的工具的一般适用性，以及确认该化学支架对于神经元递送是有效的，用几种其它hsiRNA靶向HTT和用一种靶向管家基因PPIB(亲环蛋白B)进行相似实验(图11A和13)。用HTT和PPIB分别实现了高达70％和90％的沉默。
总之，这些数据显示，疏水性修饰的siRNA为原代神经元中基因沉默的简单和直接的方法，并且可以适用于多种基因靶标。
1.4在单次注射后hsiRNA在小鼠脑部的体内分布
hsiRNA被体外不同类型的神经元有效地内化。进一步评价选定的hsiRNA、HTT10150在体内使脑部的基因表达沉默的潜能。为确定HTT10150在体内施用后的分布概况，纹状体内注射12.5μg Cy3标记的hsiRNA(对于序列，参见图8)，24小时之后，灌注脑部，切片，并通过荧光显微镜(Leica DM5500–DFC365FX)使寡核苷酸分布可视化。同时处理的人工CSF注射样品，用于确立显微镜成像环境以控制背景组织落射荧光。
大多数化合物显示出急剧的扩散梯度远离注射部位，大部分同侧纹状体被覆盖(图5A、5B)。令人关注的是，在脑部(皮质和纹状体)的非注射侧(对侧)检测到hsiRNA，尽管相对浓度显得低得多。较高放大率的图像显示，hsiRNA与纤维轨迹(fiber track)显著关联，这最可能是由于存在疏水性修饰。hsiRNA的这一方面可使其用作标记试剂，以使脑部信号传导结构可视化(图5C、5D)。除了纤维轨迹和神经突标记之外，hsiRNA可以在不同细胞类型(包括神经元)的核周空间以点状染色被检测到，如从注射之后仅24小时与NeuN(神经元标志物)染色的细胞进行共定位所显示(图5E)。
维生素D对hsiRNA分布的影响描述于图79和80中。
1.5在单次注射后hsiRNA在小鼠脑部的体内功效
为测定HTT10150的体内功效，用单次注射3至25μg(0.1-0.9mg/kg)化合物经纹状体内给药野生型FVBN小鼠，并且在注射部位的同侧和对侧均检查mRNA沉默。每个处理组给药八只动物，并从纹状体的每侧取出三个单独的打孔样品(punch)用于mRNA和蛋白定量。通过QUANTIGENE分析来测量亨廷汀表达的水平，并归一化至管家基因(对于详细内容，参见在线方法)。
使用GraphPad Prism，利用针对重复测量的邦费罗尼校正(Bonferronicorrection)，通过针对CSF或PBS对照的单向ANOVA比较，进行统计学分析(对于详细内容，参见在线方法)。所有组诱导了针对CSF、PBS和非靶向对照处理的动物显著的沉默。来自每个处理组的24次单独打孔样品的原始数据(8只动物，每只动物3次打孔取样)，可以在图15中看到。在施用部位(同侧)，在所有浓度均观察到达到统计学显著性的剂量依赖性沉默。25μg处理诱导了77％的沉默(p<0.0001)，用两组动物在不同日期重复12.5μg处理，并显示出66％和42％的统计学上显著的沉默(图6)。
虽然初始分布研究显示，急剧的扩散梯度远离注射部位，且最小量的化合物迁移到对侧，用较高剂量的25μg和12.5μg处理导致了在非注射侧的统计学显著的沉默(p<0.0001)。然而，沉默的水平显著低于(对于25μg组，仅36％)在脑部治疗侧。
总之，这些数据显示，hsiRNA的单次纹状体内注射足以在施用部位周围诱导有效的基因沉默。该效果在不同处理组和独立实验中是可重复的。
1.6在小鼠脑部进行单次hsiRNA注射之后的神经元活力
未修饰的裸siRNA的胆固醇修饰，先前已经用于siRNA脑部分布的改善，在高剂量时的毒性被鉴定为潜在的限制。为评价对脑的非特异性化学相关作用的程度，研究了DARPP32表达，其是在纹状体的中型多棘神经元中多巴胺受体表达的已确立的标志物并代表神经元活力。此外，通过评估hsiRNA注射后小胶质细胞活化的程度，来进行免疫应答的潜在诱导。
对于高达12.5μg的剂量未观察到对DARPP32表达的显著影响，表明持续的神经元活力(图7A、7B、16)。类似地，在12.5μg的剂量显现最低的小胶质细胞活化(图7C，7D)，表明在修饰的hsiRNA存在下的有限免疫应答。25μg的剂量确实诱导注射部位周围的DARPP32的一些降低，表明毒性和在指定的施用途径时确立该化学支架的最大剂量水平。10-12.5μg单次施用hsiRNA使三个功能良好的独立研究中的HTT mRNA有效地沉默，具有62％、42％和52％的稳健沉默而无毒性。这些数据表明该技术可以广泛地用于其它神经学上重要靶标的功能研究。
1.7神经元的进一步表征
在终末分化神经元中实现了21天的持续沉默(图24)。用RNAi(细胞质)而非RNaseH(主要为细胞核)化合物，观察到沉默平台期(图25)。观察到的平台期对htt基因具有特异性。大约60％的htt mRNA位于细胞核中(图26)。
在神经元中验证了探针组(图27)。大多数检测到的信号对htt mRNA具有特异性。观察到高分数(fraction)的黄色(共定位染色)区域。不希望受科学理论的束缚，高程度的红色信号可能与两个探针组的不均匀浓度相关。
验证了针对神经元中内含子60-61的另外探针组(图28)。内含子特异性探针在对转录位点具有特异性的细胞核中显示一至两个黄点。外显子特异性探针显示较高程度的重叠。
Htt mRNA细胞核定位对神经元具有特异性，而对成纤维细胞不具特异性(图29)。皮质神经元的HsiRNAHTT处理，优先除去了细胞质的htt mRNA(图30和31)。
在原代皮质神经元中，观察到接近完全的HTT蛋白沉默(图32)。
HTT10150的直接注射不会引起神经元数目的可检测的变化(图33)。胆固醇-hsiRNA在注射部位附近表现出小面积的毒性(图34)。
图58-60揭示了hsiRNA在野生型和Q140原代海马神经元中的功效。
1.8讨论
本研究显示，将疏水性修饰的siRNA用于递送至原代细胞，是能够进行神经元途径和神经性病症的功能和基因组研究的有价值工具。
在没有使用毒性制剂下，引起原代神经元中的基因沉默的能力对神经科学研究具有重要影响，有助于在原代细胞系的背景下促进更深入地研究神经性病症，并最终提供更相关的体内功能和病理学的理解。由于易于递送和细胞维持，大多数神经元研究在稳定细胞系中完成，但使用人工细胞系统可导致数据中的伪差，这可能归因于对这些细胞系的操作，可以通过使用原代细胞来避免该问题(Cheung,Y.-T.等人,Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model inneurotoxicity research.NeuroToxicology 30,127–135(2009)；Gilany,K.等人,Theproteome of the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y:An enlargedproteome.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins and Proteomics1784,983–985(2008)；Lopes,F.M.等人Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies.Brain Research1337,85–94(2010)；Zhang,W.等人,Cyclohexane1,3-diones and their inhibition ofmutant SOD1-dependent protein aggregation and toxicity inPC12cells.BIOORGANIC&MEDICINAL CHEMISTRY 1–17(2011).doi:10.1016/j.bmc.2011.11.039)。将siRNA递送到原代神经元的目前方法，包括使用慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)或LipofectamineTM-介导的转染((Karra,D.&Dahm,R.TransfectionTechniques for Neuronal Cells.Journal of Neuroscience 30,6171–6177(2010)))。通过将疏水性部分如胆固醇直接缀合到siRNA自身，或通过利用另外的单链硫代磷酸化尾部增强摄取，本文已经证明siRNA不仅可以在体外以最低毒性被有效地递送到原代神经元，而且仍然是mRNA的有效沉默剂。
不希望受科学理论的束缚，RNAi相对于反义技术的主要优势之一为，负载的RISC预期在非分裂细胞中长时间保持活性(Bartlett,D.W.Insights into the kinetics ofsiRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescentimaging.Nucleic Acids Research 34,322–333(2006))。此外，有限数目的负载的RISC足以诱导RNAi介导的沉默(Stalder,L.等人,The rough endoplasmatic reticulum is acentral nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing.The EMBO Journal 32,1115–1127(2013))。本文呈现的数据显示，在用hsiRNA单次治疗后体外原代皮质神经元长达三周的沉默，支持了这样的观点：RNAi介导的沉默可以为有效的和持久的。本文呈现的数据还显示，这些化合物可以用于靶向两个不同基因中的多个区域，这显示hsiRNA适用于替代性神经通路和疾病的研究。
尽管hsiRNA的单次纹状体内注射导致体内注射部位附近有效的基因沉默，但该作用并不能均匀地传播遍及脑部。虽然有限，但传播至脑部的其它区域(通过体内功效研究证明)可以通过许多机制发生。这些包括在CSF中运动，经由纤维束或可能通过逆运输传播，所述纤维束在分布研究中显示具有大的视觉密度的Cy3标记的hsiRNA(Stewart,G.R.&Sah,D.Retrograde Transport of siRNA and Therapeutic Uses to Treat NeurologicalDisorders.United States Patent Application Publication US2008/0039415A1,1–18(2008))，尽管将进行进一步研究以确定实际机制。
本文呈现的技术可用于理解特定脑部区域的功能基因组学，以及用于研究脑部区域之间的关系。此外，一些神经性病症(例如记忆病症(Samuelson,K.W.Post-traumaticstress disorder and declarative memory functioning:a review.Dialogues inClinical Neuroscience 13,346–351(2011)))的研究，可以受益于有限的和区域性靶向的分布和沉默。然而，由于其分布概况，目前存在的hsiRNA对于一般神经性病症，如亨廷顿病不是可行的治疗剂。多次注射可起作用，以增加小的啮齿动物中的整体沉默，但为了使该技术适用于较大动物的脑部和人，以及实现均匀和广泛的传播分布，将利用其它化学修饰和治疗性递送方法。这可以通过许多方法实现。首先，可以对hsiRNA组合物自身进行化学调整。这些包括将其与不同脂质缀合、用另外的硫代磷酸酯基团补充其骨架、或通过将疏水性部分添加至核苷酸自身(Vaught,J.D.,Dewey,T.&Eaton,B.E.T7RNA PolymeraseTranscription with 5-Position Modified UTP Derivatives.J.Am.Chem.Soc.126,11231–11237(2004))。所有这些修饰能够支持一系列疏水性，其将允许跨越更大距离的较为改善的分布。也可以用不同的注射模式，如进入CSF而非纹状体内，来实现增加的生物利用度，增加暴露于整个脑部的可能性。然而，经由CSF的递送可以有利于将hsiRNA定位于除纹状体之外的脑部区域，使其成为用于治疗亨廷顿病的不太理想的递送方法。另一可能性为配制的递送，其通过将这些疏水性修饰的siRNA包装到外泌体和脂质体(比目前LipofectamineTM制剂的毒性小)中，以及使用这些天然和合成的纳米载体以更均匀分布的方式递送货物来进行(Alvarez-Erviti,L.等人,Delivery of siRNA to the mouse brainby systemic injection of targeted exosomes.Nat Biotechnol 1–7(2011).doi:10.1038/nbt.1807；Marcus,M.&Leonard,J.FedExosomes:Engineering TherapeuticBiological Nanoparticles that Truly Deliver.Pharmaceuticals 6,659–680(2013))。然而，对于这些方法，仍需要验证递送的hsiRNA的效力和功效。
总之，HTT10150在体外有效靶向原代神经元中的亨廷汀mRNA，并且在体内局部靶向小鼠脑部。该化合物不需要递送至原代细胞的任何制剂，并且使得能够进行亨廷汀以及其它靶标的基因功能研究，使其成为研究神经性病症的非常有用的工具。该技术的潜在进步应允许将来hsiRNA作为亨廷顿病以及其它神经性疾病的治疗性治疗发挥功能。
1.9方法
细胞培养
将HeLa细胞保持在补充有10％胎牛血清(Gibco)和100U/mL青霉素/链霉素(Invitrogen)的DMEM(Corning Cellgro)中，并在37℃和5％CO2下生长。每2-5天分开细胞，直至第15代，然后丢弃。
用于被动摄取的细胞培养
将细胞以10,000个细胞/孔接种于组织培养物处理过的96孔板中的具有6％FBS的DMEM中。将hsiRNA在OptiMEM(Gibco)中稀释至2X终浓度，并将50μL稀释的hsiRNA添加至50μL细胞中，FBS最终为3％。将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。
用于脂质介导的摄取的细胞培养
将细胞以10,000个细胞/孔接种于组织培养物处理过的96孔板中的具有6％FBS的DMEM中。将hsiRNA在OptiMEM中稀释至4X终浓度。将LIPOFECTAMINE RNAIMAX转染试剂(Invitrogen#13778150)稀释至4X终浓度(最终＝0.3μL/25μL/孔)。将RNAIMAX和hsiRNA以1:1混合，并将50μL添加至50μL细胞中，FBS最终为3％。将细胞在37℃和5％CO2孵育72小时。
原代神经元的制备
原代皮质神经元获自WT(FVBN)小鼠的E15.5小鼠胚胎。通过IP注射Avertin(250mg/kg重量)麻醉怀孕雌性小鼠，随后采用颈椎错位法。取出胚胎，并将其转移至具有冰冷DMEM/F12培养基(Invitrogen)的培养皿中。取出脑部，并小心地分离脑膜。分离皮质，并将其转移至具有预热木瓜蛋白酶溶液的1.5ml管中，在37℃和5％CO2下保持25分钟以溶解组织。如下制备木瓜蛋白酶溶液：将木瓜蛋白酶(Worthington#54N15251)溶于2mLHibernateE(Brainbits)和1mL EBSS(Worthington)中。另外，将脱氧核糖核酸酶(Worthington#54M15168)重新悬浮在0.5mL HibernateE中。然后，将0.25mL重新悬浮的脱氧核糖核酸酶转移至重新悬浮的木瓜蛋白酶中用于最终溶液。在孵育25分钟之后，去除木瓜蛋白酶溶液，并将补充有2.5％FBS的1mL NbActiv4(Brainbits)添加至组织中。然后，通过用火抛光的玻璃巴斯德吸管上下吸打来分离皮质。计数皮质神经元，并将其以1x106个细胞/ml接种。对于活细胞成像研究，用聚-L-赖氨酸(Sigma#P4707)预包被培养板，并将2x105个细胞添加至每个皿的玻璃中心。对于沉默分析，将神经元以1x105个细胞/孔接种于聚-L-赖氨酸预包被的96孔板(BD BIOCOAT#356515)中。在37℃和5％CO2过夜孵育后，将补充有抗有丝分裂剂、0.484μL/mL 5’UtP(Sigma#U6625)和0.2402μL/mL 5’FdU(Sigma#F3503)的等量的NbActiv4(Brainbits)添加至神经元培养物中，以防止非神经元细胞的生长。每48小时更换一半体积的培养基(用新的具有抗有丝分裂剂的NbActiv4)，直至用siRNA处理神经元。一旦处理细胞，不再去除培养基，仅添加培养基。所有随后的培养基添加物含有抗有丝分裂剂。
mRNA定量
使用QuantiGene 2.0分析(Affymetrix#QS0011)定量mRNA。在55℃下，将细胞在250μL稀释的裂解混合物(Affymetrix#13228)(1份裂解混合物，2份H2O和0.167μg/μL蛋白酶K(Affymetrix#QS0103))中裂解30分钟。将细胞裂解物充分混合，并将40μL(大约8000个细胞)裂解物和40μL不含蛋白酶K的另外稀释的裂解混合物一起添加至捕获板中。如Affymetrix方案中详细说明的，稀释探针组。对于HeLa细胞，将20μL人HTT或PPIB探针组(Affymetrix#SA-50339,#SA-10003)添加至适当的孔中，终体积为100μL。对于原代神经元，使用20μL小鼠HTT或PPIB探针组(Affymetrix#SB-14150,#SB-10002)。
对于5mg组织打孔样品，使用300μL具有2μg/μL蛋白酶K的均化缓冲液(Affymetrix#10642)类似地处理组织。然后，在QIAGEN TissueLyser II上，在96孔板格式中均化组织，并将40μL添加至捕获板中。如Affymetrix方案中详细说明的，稀释探针组，并将60μL HTT或PPIB探针组(Affymetrix#SB-14150,#SB-10002)添加至捕获板的每个孔中，终体积为100μL。对于DARPP32定量，将仅10μL组织样品和30μL均化缓冲液添加至具有60μL小鼠Ppp1r1b探针组(Affymetrix#SB-21622)的每个孔中。根据Affymetrix方案放大信号。在Veritas光度计或Tecan M1000上检测发光。
活细胞染色
为监测活细胞hsiRNA摄取，如上文原代神经元的制备中所述，将细胞以每个35mm玻璃底皿2x105个细胞的密度进行接种。在成像之前，如制造商所示，使用NUCBLUE(LifeTechnologies的分子探针，#R37605)在无酚红的NbActiv4中对细胞核进行染色。在无酚红的NbActiv4中进行成像。用0.5μM Cy3标记的hsiRNA处理细胞，并随时间进行活细胞成像。用Zeiss共聚焦显微镜获得所有活细胞共聚焦图像，并使用ImageJ(1.47v)软件处理图像。
免疫组织化学/免疫荧光
对于分布研究，用1nmol(12.5μg)Cy3标记的hsiRNA注射脑部。在24小时之后，处死小鼠，取出脑部并将其送至UMASS医学院的DERC形态学中心(DERC Morphology Core)，包埋在石蜡中，切成4μm切片并加载到载玻片上。将切片在二甲苯中脱蜡8分钟，进行两次。然后，用梯度乙醇稀释液(100％、95％、80％)再水化切片，每次4分钟，然后用PBS洗涤两次，每次2分钟。对于NueN染色，将载片在抗原恢复缓冲液中煮沸5分钟，然后在室温放置20分钟，随后用PBS洗涤5分钟。然后，用PBS+0.05％Tween 20中的5％正常山羊血清封闭载片1小时，并用PBS+0.05％Tween20洗涤一次，持续5分钟。将第一抗体(1:1000的稀释度于PBS+0.05％Tween 20中)添加至载片中孵育1小时，随后用PBS+0.05％Tween 20进行三次5分钟的洗涤。将第二抗体(1:1000的稀释度于PBS+0.05％Tween 20中)添加至载片中在暗处孵育30分钟，随后用PBS+0.05％Tween 20进行三次5分钟的洗涤。然后，用DAPI(Life Technologies的分子探针，#D3571)对载片进行染色，在PBS中稀释至250ng/mL，保持1分钟，随后用PBS进行三次1分钟的洗涤。将封片介质和盖玻片施用于载片，并干燥过夜，然后在Leica DM5500–DFC365FX显微镜下以指示的放大率成像。
对于毒性和小胶质细胞活化研究，将提取的经灌注的脑部在Leica 2000T振动切片机上于冰冷的PBS中切成40μm切片。在每第6个切片上针对DARPP32(Millipore，1:10,000的稀释度)和IBA-1(Millipore，1:500的稀释度)进行免疫组织化学。将切片封片，并通过光学显微镜使其可视化。在每个切片的注射侧和非注射侧的纹状体中，在20X下拍摄四个图像。使用ImageJ定量DARPP32阳性神经元的数目。通过针对IBA-1的染色细胞的形态学，定量激活的小胶质细胞。
动物，立体定位的注射
野生型(FVBN)小鼠通过立体定位置于右侧纹状体(striata)(坐标(相对于前囱)为：前侧1.0mm，外侧2.0mm和腹侧3.0mm)接受显微注射。在用1.2％Avertin注射之前，使动物深度麻醉。对于毒性(DARPP32)和功效研究，小鼠接受以下注射：PBS或人工脑脊液(每个纹状体2μL，N＝8只小鼠)、12.5μg NTC hsiRNA(每个纹状体2μL 500μM储备液，N＝8只小鼠)、25μg HTT10150hsiRNA(每个纹状体2μL 1mM储备液，N＝8只小鼠)、12.5μgHTT10150hsiRNA(每个纹状体2μL 500μM储备液，N＝总计16只小鼠，在两个不同日期的两组8只小鼠)、6.3μg HTT10150hsiRNA(每个纹状体2μL 250μM储备液，N＝8只小鼠)，或3.1μgHTT10150 hsiRNA(每个纹状体2μL 125μM储备液，N＝8只小鼠)，并在5天之后使其安乐死。收获脑部，并制备3个300μm冠状切片。对于每个切片在每侧(注射的和未注射的)进行1个2mm打孔取样，并在4℃置于RNAlater(Ambion#AM7020)中保持24小时。将每个打孔样品处理成单独样品用于QuantiGene测定分析。所有动物方案，均得到麻省大学医学院动物管理和使用委员会(University of Massachusetts Medical School Institutional AnimalCare and Use Committee)(IACUC，协议号A-2411)的批准。
统计学分析
使用GraphPad Prism 6的6.04版软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)进行数据分析。对于浓度依赖性曲线IC50，使用log(抑制剂)相对于反应—可变斜率(四个参数)拟合曲线。曲线的底部被设定为不小于零，并且曲线的顶部被设定为不大于100。对于每个独立的小鼠实验，将在每个剂量的敲低水平归一化至对照组的平均值(所述对照组为PBS的非注射侧或人工CSF组)，使得所有数据表示为对照的比例。使用针对多重比较的Kruskal-Wallis检验(单向ANOVA)和邦费罗尼校正来分析体内数据。所有比较的差异，在P-值小于0.05时被认为是显著的。
用于被动摄取的细胞培养(初筛和剂量反应)
将细胞以10,000个细胞/孔接种于组织培养物处理过的96孔板的具有6％FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)中。将hsiRNA在OptiMEM(Gibco)中稀释至2X终浓度，并将50μL稀释的hsiRNA添加至50μL细胞中，FBS最终为3％。将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。
用于脂质介导的摄取的细胞培养
将细胞以10,000个细胞/孔接种于组织培养物处理过的96孔板中的具有6％FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)中。将hsiRNA在OptiMEM(Gibco)中稀释至4X终浓度。将LIPOFECTAMINE RNAIMAX转染试剂(Invitrogen CAT#13778150)稀释至4X终浓度(最终＝0.3μL/25μL/孔)。将RNAIMAX和hsiRNA以1:1混合，并将50μL添加至50μL细胞中，FBS最终为3％。将细胞在37℃和5％CO2孵育72小时。
mRNA定量
使用QuantiGene 2.0分析(Affymetrix QS0011)来定量mRNA。在55℃下，将细胞在250μL稀释的裂解混合物(1份裂解混合物，2份H2O和0.167μg/μL蛋白酶K(AffymetrixQS0103))中裂解30分钟。将细胞裂解物充分混合，并将40μL(大约8000个细胞)裂解物和40μL不含蛋白酶K的另外稀释的裂解混合物一起添加至捕获板中。对于5mg组织打孔样品，使用300μL具有2μg/μL蛋白酶K的均化缓冲液(Affymetrix)，类似地处理组织。然后，在QaigenTissueLyser上，在96孔板格式中均化组织，并将40μL添加至捕获板中。如Affymetrix方案中详细说明的，稀释探针组，并将20μL HTT或PPIB探针组(Affymetrix:SA-50339,SA-10003)添加至捕获板的每个孔中，终体积为100μL。根据制造商的方案放大信号。在Veritas光度计或Tecan M 1000上检测发光。
活细胞染色和脑部切片免疫染色
对于活细胞摄取监测，将细胞以每个35mm玻璃底皿2x105个细胞的密度进行接种，并生长过夜。在成像之前，除非说明，否则使用购自Life Technologies的染色试剂在HBSS(Gibco)中对细胞器进行染色：如制造商所指示的，分别使用NUCBLUE Live READYPROBE、ER-TRACKER Green(Bodipy FL Glibenclamide)和LYSOTRACKER Deep Red试剂对细胞核、内质网和溶酶体进行染色。在非补充的无酚红(Invitrogen)的DMEM中进行成像。用0.5μMCy3标记的hsiRNA处理细胞，并随时间进行活细胞成像。
共聚焦成像
用安装在具有60x Plan/APO油镜和Coolsnap HQ2相机(Roper)的TE-200E2倒置显微镜(Nikon)上的CSU10B转盘式共聚焦系统扫描头(Solamere Technology Group)，获得所有共聚焦图像。使用ImageJ(1.47v)软件处理图像。在无或有hsiRNA下，使用ImageJ软件计数神经元的数目。以1μm的z-轴间隔获得脑部切片图像。
实施例2.hsiRNA保留和分布与疏水性直接相关
虽然FM-hsiRNA在脑部和脊髓中显示改善的保留和积累，并在比部分稳定的hsiRNA低10倍的剂量诱导最大的沉默，但它们大部分保留在注射部位附近(图102；Chol-hsiRNA)。假设hsiRNA的有限分布可能是由于胆固醇缀合物的强疏水性而导致hsiRNA优先与脂质富集的髓磷脂和有髓结构结合，以及调整hsiRNA缀合物的疏水性将改善在脊髓和脑部的分布。为测试该想法，筛选一组天然存在的能够进行主动神经元运输的疏水性分子，包括：(i)神经活性类固醇，即，穿过血脑屏障并结合多种门控离子通道和神经元表达的受体的内源性类固醇(Rupprecht R.Neuroactive steroids:mechanisms of action andneuropsychopharmacological properties.Psychoneuroendocrinology.2003；28:139-68.PMID:12510009)，包括GABA(Lan NC,Gee KW.Neuroactive steroid actions at theGABAA receptor.Hormones and behavior.1994；28:537-44.PMID:7729823)；(ii)神经节苷脂—对神经元可塑性和修复重要的神经保护性糖脂(Aureli M,Mauri L,Ciampa MG,Prinetti A,Toffano G,Secchieri C,Sonnino S.GM1Ganglioside:Past Studies andFuture Potential.Molecular neurobiology.2015.PMID:25762012)；和(iii)内源性大麻素样长链多不饱和脂肪酸—由涉及食欲、疼痛、情绪和记忆的受体识别的神经调节脂质(Dyall SC.Long-chain omega-3fatty acids and the brain:a review of theindependent and shared effects of EPA,DPA and DHA.Frontiers in agingneuroscience.2015；7:52.PMID:25954194；PMCID:PMC4404917；Janssen CI,KiliaanAJ.Long-chain polyunsaturated fatty acids(LCPUFA)from genesis to senescence:the influence of LCPUFA on neural development,aging,andneurodegeneration.Progress in lipid research.2014；53:1-17.PMID:24334113；Figueroa JD,De Leon M.Neurorestorative targets of dietary long-chain omega-3fatty acids in neurological injury.Molecular neurobiology.2014；50:197-213.PMID:24740740；PMCID:PMC4183712)。
用于合成寡核苷酸缀合物的最稳健的方法是，将激活的缀合物与氨基酸修饰的支持物连接。接头的结构和长度为多变的(例如，分支的)，并且只要切实可行则支持物被官能化。将图93和94中概述的合成方法的变体，用于合成与皮质醇、二十二碳六烯酸(DHA)、钙化醇、胆固醇和GM1神经节苷脂缀合的hsiRNA(图98和99)。所有化合物为经HPLC纯化的，并通过质谱确认其身份。钙化醇官能化的支持物是不稳定的，导致在所体内测试出的几种变体的混合物(下文所述)。
如所预期的，在反相色谱期间，基于保留时间化合物显示出不同程度的疏水性。将Cy3标记的hsiRNA缀合物注射到野生型小鼠的纹状体或ICV(图92)，显示出不同程度的hsiRNA分布和保留，其与疏水性强相关。未缀合的或仅有接头的hsiRNA在脑部中显示出最小保留(类似于反义寡核苷酸)，并且疏水性最大的化合物(胆固醇和GM1)主要保留在注射部位附近。用具有中等疏水性特性的DHA和钙化醇缀合物(下文)实现了最佳的保留/分布。详细研究了DHA-hsiRNA，并且其显示出很大的功效和前所未有的安全性(治疗指数>20倍)(Nikan等人,2016；Molecular Therapy,修订，参见附录)。总之，本文呈现的数据显示，调整缀合物的疏水性是鉴定出支持在脑组织中具有最佳保留、分布和安全性的缀合物的有效策略。
GM1-hsiRNA在原代皮质神经元中被有效地内化，并诱导亨廷汀mRNA沉默(图108)。在纹状体内注射后，GM1-hsiRNA在小鼠脑部显示出有限分布(图109)。
实施例3.DHA-hsiRNA
部分修饰的hsiRNA显示短的作用持续时间和无全身暴露(图35A-C)。进一步探索了代谢稳定性(图36)。完全代谢稳定性不干扰hsiRNA的RISC进入(图37)。完全代谢稳定的hsiRNA(FM-hsiRNA)增强局部递送和分布，并能够进行较长的作用持续时间(图38、39A-B、91、110和111，术语“核苷”)。
研究天然存在的脂质(即，鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环类固醇、类固醇激素和固醇脂质)作为hsiRNA生物缀合物(图40)。脂质生物缀合物对hsiRNAHTT有义链疏水性具有显著的作用。
设计了研究以探索hsiRNA缀合物的体内分布。用含P2-稳定的siRNA CY3缀合物的aCSF，对FVBN WT小鼠进行纹状体内单侧注射(2nmol/2μl)。注射后48小时，用PBS和10％福尔马林灌注动物。取出它们的脑部，并后固定48小时。制备4μm冠状和矢状切片，并用DAPI染色。在Leica DM 5500荧光显微镜上进行成像(CY3和DAPI)。经确定hsiRNA疏水性与脑部分布和保留直接相关(图41)。重要的性质为分布与保留之间的平衡。
合成了二十二碳六烯酸(DHA)-hsiRNA(图42)。DHA为ω-3脂肪酸，其为人脑部中的主要组分(70％)。DHA穿过血脑屏障(BBB)，并被神经元和其它细胞类型主动内化。它是一种无毒的补充物，在临床上显示改善HD和ALS患者中的认知功能。DHA的疏水性显著低于胆固醇的疏水性。
显示DHA-hsiRNA和chol-hsiRNA被内化至原代皮质神经元中(图43)。DHA-hsiRNA与神经元和星形胶质细胞共定位(图44)，并定位于纹状体神经元的核周区域(在纹状体神经元中，chol-hsiRNA是检测不到的)(图45)。在单次纹状体内注射后，DHA-hsiRNA与神经元和星形胶质细胞共定位于皮质中(图46)。DHA-hsiRNA定位于皮质神经元中的核周区域，然而chol-hsiRNA是检测不到的(图47)。DHA-hsiRNA有效地分布遍及脑部，并在纹状体和皮质中均使基因沉默(图57)。
DHA-hsiRNA在纹状体和皮质中显示稳健功效(图48和49)。高达200μg DHA-hsiRNA对DARPP-32水平无影响，表明化合物的安全性(图50)。相比之下，25μg(1mg/kg)为chol-hsiRNA的最大耐受的纹状体内剂量。高达200μg DHA-hsiRNA未引起激活的小胶质细胞的显著增加，表明最小的免疫刺激(图51)。
hsiRNA在体内允许脑部中原代神经元的简单和有效的基因沉默。寡核苷酸疏水性限定脑组织保留和分布。寡核苷酸化学显示影响细胞递送和分布(图52-56)。DHA-hsiRNA缀合物代表一种新类别的具有广泛的体内功效和广泛的治疗指数的寡核苷酸。
实施例4.PC-DHA-hsiRNA(PC-DHA-hsiRNA)
受到DHA-hsiRNA的广泛治疗指数的鼓励，更详细地研究了DHA和相关缀合物。循环的DHA主要以溶血磷脂酰胆碱酯存在，所述溶血磷脂酰胆碱酯为借助特定的转运蛋白Mfsd2a来通过血脑屏障的活性运输的唯一形式(Nguyen LN,Ma D,Shui G,Wong P,Cazenave-Gassiot A,Zhang X,Wenk MR,Goh EL,Silver DL.Mfsd2a is a transporterfor the essential omega-3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature.2014；509:503-6.PMID:24828044)。
DHA的溶血磷脂酰胆碱酯是不稳定的，因此合成了DHA的溶血磷脂酰胆碱(PC)酰胺(图93、94、100和101)。PC-DHA为与固相寡核苷酸合成相容的代谢稳定的类似物。通过NMR和质谱确认其身份。测试溶血磷脂酰胆碱应改善DHA-hsiRNA的运输的观点，经确定相比DHA-hsiRNA，PC-DHA-hsiRNA在脑组织中显示更广泛的分布和增加的功效(图92和103)。重要的是，DHA缀合物作为一种类别，在比最小有效剂量高20倍的浓度下显示出广泛的治疗指数，而无明显的先天免疫活化或神经元变性(图92)。相比之下，Chol-hsiRNA在25μg注射时显示出显著毒性(图92C)。最后，弹丸CSF(ICV)输注支持在脑部中的广泛分布，并覆盖纹状体、皮质甚至到达脑部的较为后部和腹侧区域(图92)。由于PC-DHA-hsiRNA的特殊特性，将其选择作为先导化学物质进行研究。
PC-DHA为DHA的代谢活性类似物(图62)。相对于DHA-hsiRNA，PC-DHA-hsiRNA显示增强的体外神经元沉默、增强的脑部分布和增强的体内效力(无毒性迹象)。
PC-DHA-hsiRNA和chol-hsiRNA各自显示出有效地使突变的和野生型htt mRNA沉默(图61)。Chol-hsiRNA显示出毒性(6只动物中有3只死亡)。活体动物显示出非常低的(超过背景3倍)人htt表达。
相对于DHA-hsiRNA，PC-DHA-hsiRNA在递送到原代神经元时显示出增强的效力(图63)。虽然chol-hsiRNA更有效地降低原代神经元中的htt基因表达(图64)，但PC-DHA-hsiRNA显示出优越的脑部保留和更广泛的分布(图65)。
在单次间质(IS)注射之后，PC-DHA-hsiRNA在小鼠纹状体中显示出大约80％的沉默(图66)，并且在单次IS注射之后，在小鼠皮质中显示出大约60％的沉默(图67)。没有毒性迹象。沉默限于脑部的注射侧。
肾脏为PC-DHA-hsiRNA的主要靶标(图107)。PC-DHA-hsiRNA在近端曲小管中积累。
实施例5.Di-hsiRNA的发现
分支寡核苷酸代表一种新型类别的寡核苷酸治疗剂。2至8个寡核苷酸通过疏水性接头连接在一起，其中优选2-3个寡核苷酸连接在一起。通常使用大量的化学稳定作用，至少40％的碱基为修饰的，优选完全修饰的。通常使用2-20个单链硫代磷酸化尾部(优选8-10个)。
双支链hsiRNA(di-hsiRNA)化合物的发现是纯粹的意外发现。钙化醇容易氧化，并且固体支持物被证明是不稳定的，使QC和纯化复杂化。将四种主要副产物的混合物注射到野生型小鼠的纹状体中。它比先前注射到CNS的任何化合物表现更好。该产物显示出广泛的扩散，很好的保留以及优先摄取到皮质、纹状体和脊髓中的神经元，这是几乎理想的特性。通过HPLC和质谱的详细表征，鉴定了粗混合物中存在的副产物：期望的钙化醇-hsiRNA缀合物、用三乙二醇接头(TEG)封端的hsiRNA和通过TEG接头连接的两个hsiRNA。后一种化合物是由支持物负载期间切割钙化醇而产生的，留下在其上生长hsiRNA过客链的两个活性基团(图95A)。在纯化每种副产物之后，经确定每种均能够在体外有效地进入RISC(图95B)，但仅Di-hsiRNA显示出广泛的分布和优先的神经元摄取(图95C)。设计了直接合成具有>70％收率的Di-hsiRNA(通过质谱确认的)(图93和94)的路线(图100和101)。
经确定Di-hsiRNA的弹丸ICV输注支持双支链hsiRNA(di-hsiRNA)化合物遍及脑部的递送，以支持在脑部中的广泛分布(图68、69和104A)。注意，在图104A中用Cy3-Di-hsiRNA注射的脑部全部为粉色。在注射部位的同侧和对侧均检测到单次注射的di-siRNA，表明传播不限于注射的半球，而且也发生了跨越中线进入非注射侧。虽然在对侧较小程度的di-siRNA的积累显著，但可需要双侧注射用于全脑沉默。在仅用一次注射下，注射的替代方法，包括脑内-脑室也可以促进双侧分布。
经确定分支对于增强的脑部分布是必不可少的(图70)。在纹状体内注射后，Di-hsiRNA的分布遍及小鼠脑部的注射半球。虽然单个未缀合的hsiRNA可以使原代神经元中的mRNA沉默，但di-hsiRNA结构对于修饰的寡核苷酸的增强的组织分布和组织保留是必不可少的。虽然保留其它缀合物(如胆固醇)，但当远离注射部位其显示出急剧的扩散梯度。两个单链硫代磷酸化尾部的微妙疏水性支持组织保留，同时还允许在遍及注射的脑部同侧半球的广泛传播和均匀分布。
研究了单次IS注射di-hsiRNA之后的体内基因沉默(图71)。单次注射di-siRNA在小鼠脑部的纹状体和皮质中均诱导了稳健沉默(图72和73)。在未缀合的siRNA中此前从未显示出该水平的功效。虽然di-hsiRNA在视觉上显示与纹状体中的纤维束相关，但观察到的功效清楚地表明纹状体神经元在很大程度上使di-siRNA内化。
Di-hsiRNA还支持均匀的脊髓分布(图74)。di-hsiRNA弹丸IT注射支持脊髓中的htt沉默(图75)。在鞘内注射后，Di-siRNA在遍及脊髓显示出稳健和均匀的沉默。在脊髓的腰椎区域单次注射di-hsiRNA，以与在颈椎、胸椎和腰椎区域中相同的程度使mRNA沉默，表明了均匀和长范围的分布。该接受的药物递送的方法，将允许对影响脊髓中神经元的神经变性疾病进行治疗。
当经纹状体内注射到脑部时，Di siRNA显示出非常独特的细胞分布(图76)。荧光标记的di-siRNA显示优先定位于皮质中的神经元。该选择性特征对于这些化合物为特异性的，并且对其它siRNA缀合物如胆固醇并不适用，所述其它siRNA缀合物不显示细胞类型偏好。
Di-siRNA显示定位于纹状体中的纤维束，但存在于皮质的神经元细胞体中(图77)。不希望受科学理论的束缚，向皮质的运动可通过扩散，或可以为经由纹状体纤维束逆运输的结果。逆运输部分负责的理论，由以下事实支持：皮质的一些区域显示完全的神经元渗透，而相邻区域中的神经元未显示di-hsiRNA缔合。
di-hsiRNA的鞘内注射，对脊髓产生了相似地令人印象深刻的结果(图105A)。chol-hsiRNA(最初缀合的hsiRNA)显示出急剧的分布梯度，其中相对少的量到达灰质和运动神经元，然而di-hsiRNA均匀分布遍及脊髓并与运动神经元共定位(在图105A中放大)。
在单次注射之后di-hsiRNA的广泛分布，与纹状体中大于85％的沉默，皮质中大于70％的沉默(图104B)，以及脊髓中大约50％的沉默(图105B)相关。虽然，显著量的di-hsiRNA在纹状体、皮质、肝脏和肾脏中随时间积累(图104C)，但在测试的最高剂量(即，400μg ICV和150μg IT)下未检测到炎症或神经元变性的证据，所述最高剂量远超过最小有效剂量。在这些水平下，Chol-hsiRNA是有毒的。基于这些数据，已经将di-hsiRNA选择作为第二类化学物质用于详细表征、优化和验证。将进行di-hsiRNA的详细表征，以确定剂量-反应、最大耐受剂量和治疗指数。细胞、分子和生化分析，将用于进一步测量化合物的体内分布和积累以及靶基因调控的程度。
实施例6.轴突运输促成脑中Di-hsiRNA分布的证据
将di-hsiRNA优先递送到神经元，尤其注射部位的远端，是令人鼓舞的。在用Cy3-di-hsiRNA经纹状体内注射到小鼠中(图95C)，我们在皮质的每个NeuN-阳性细胞(神经元)中检测到Di-hsiRNA，而在其它非神经元细胞类型(例如，胶质细胞)中未检测到Di-hsiRNA。该观察的一种解释为，di-hsiRNA优先沿轴突运输到远端神经元。为什么分支寡核苷酸对其分布具有如此深远的影响？假设存在协同结合的作用，由此一条hsiRNA弱结合至受体，并且第二独立结合事件促进内化(Alves ID,Ciano KA,Boguslavski V,Varga E,Salamon Z,Yamamura HI,Hruby VJ,Tollin G.Selectivity,cooperativity,and reciprocity inthe interactions between the delta-opioid receptor,its ligands,and G-proteins.The Journal of biological chemistry.2004；279:44673-82.PMID:15317820)。通过共价连接的hsiRNA的协同结合，可以显著增强细胞摄取的速率，因此增强组织保留。将测试这个和其它假设，并进行di-hsiRNA的详细结构-活性关系研究。
实施例7.证据PC-DHA和Di-hsiRNA缀合物:两种新型类别的CNS活性寡核苷酸。
如上文数据所述的，已经设计了两种新型的、化学上不同类别的治疗性siRNA、PC-DHA-hsiRNA和Di-hsiRNA，其支持在CSF输注之后在CNS组织中的广泛分布和有效的基因沉默。Di-hsiRNA显得是有前途的，但目前缺乏关于安全性和治疗指数的数据。PC-DHA-hsiRNA具有广泛的治疗窗(图103)。这是重要的，因为针对CNS适应症的临床试验中的反义寡核苷酸具有窄的治疗指数。
为减轻潜在风险，将详细评价两类化合物。目标是用经由CSF的弹丸注射来在小于200μg/注射的剂量下实现大于70％的靶基因沉默，大于10倍的治疗指数和1个月至3个月的作用持续时间。简单技术平台的开发将显著推进神经科学研究领域，所述平台允许小动物脑部和脊髓中直接和持久的沉默。它将能够对疑似涉及脑生物学和神经变性疾病进展的一系列新型靶标进行直接功能分析。本文所述的数据显示，化学物质限定寡核苷酸的分布、功效和安全性。将评价PC-DHA-hsiRNA和di-hsiRNA的化学变体，以鉴定具有更高功效和更广泛治疗指数(这是未来该技术平台向人治疗学转化所必不可少的特征)的支架。最后，在确立的神经变性疾病的动物模型中，通过在HD中使HTT沉默将验证几种化合物的性能。
实施例8.PC-DHA和Di-hsiRNA在脑部和脊髓中的分布、功效和安全性的表征
寡核苷酸合成
合成hsiRNA和Di-hsiRNA(0.2克，+/-Cy3)，并将其作为完全代谢稳定的hsiRNA(包括作为末端磷酸酯类似物的5’-E-VP)进行HPLC纯化，随后通过质谱表征。已经筛选了多种接头，并且已经鉴定了用于PC-DHA和di-hsiRNA缀合的最佳支架。如图93和94中所示，合成官能化支持物。将使用下述化合物：HTT-10150(HD)和PPIB-437(管家对照)。数字表示引导链的5’核苷酸靶向的人mRNA的位置。先前使用最佳的生物信息学参数(Birmingham A,Anderson E,Sullivan K,Reynolds A,Boese Q,Leake D,Karpilow J,Khvorova A.Aprotocol for designing siRNAs with high functionality and specificity.Natureprotocols.2007；2:2068-78.PMID:17853862)和大量的实验筛选鉴定了所有化合物。每个siRNA靶向并沉默相应的人、小鼠和猴子mRNA，这将简化未来临床发展。
除了标准的寡核苷酸合成系统，即，Mermaid12和Expedite，已经确立了中型规模的RNA合成能力(通过S10拨款资助)，包括OligoPilot 100、制备型HPLC和高分辨率LC-MS。将合成以下提出的体内研究所需的大批新型化合物。
施用途径的优化
比较几种施用途径，并且已确定经由CSF的弹丸输注(ICV和IT输注)支持在CNS组织中的最佳程度的化合物保留和分布。经由这些途径的CSF递送类似于“脊髓穿刺”(一种临床上可接受的施用途径)。当在一周时间内通过弹丸注射或通过ALZET泵递送等效剂量时，进行组织保留和功效的并排比较。用弹丸注射观察到显著较好的组织保留和功效，这与针对ASO报道的数据一致(Rigo F,Chun SJ,Norris DA,Hung G,Lee S,Matson J,Fey RA,Gaus H,Hua Y,Grundy JS,Krainer AR,Henry SP,Bennett CF.Pharmacology of acentral nervous system delivered 2'-O-methoxyethyl-modified survival of motorneuron splicing oligonucleotide in mice and nonhuman primates.The Journal ofpharmacology and experimental therapeutics.2014；350:46-55.PMID:24784568；PMCID:PMC4056267)。不希望受科学理论的束缚，弹丸施用比泵施用具有更好的性能，可能与寡核苷酸摄取的机制相关。例如，相比通过泵输注，通过弹丸输注可以使非生产性寡核苷酸槽更快地饱和，从而允许更容易地运输过量的寡核苷酸。
为直接定量组织中的完整引导链，我们开发并实施了新型和定量肽核酸(PNA)杂交分析(图106)。该分析高度灵敏，检测限为每克组织小于10fmole hsiRNA。具有全长、部分降解的5′-磷酸化和5′-去磷酸化的引导链的HsiRNA代谢物，可以容易地被定量为HPLC痕迹中的单独的峰或肩。使用该分析，可定量取自遍及脊髓和脑部的区域的2-mm打孔样品活检中的引导链保留的动力学。
基于先前的经验，在注射之后1周每克组织的1至5μg寡核苷酸的积累，通常足以支持生产性靶标沉默(图104B、104C)。荧光和PNA分析允许映射递送的缀合的hsiRNA的分布和数量。这些研究将补充功能分析，并为沉默功效研究确立基础。
鉴定最大耐受剂量
在初步研究中，将200μg DHA-hsiRNA和di-hsiRNA确立为纹状体内注射的安全剂量(DHA的数据存在于图103B和103C中)，将150μg确立为鞘内注射的安全剂量，以及将400μg确立为脑室内注射的安全剂量。在这些水平开始，以两倍的增量增加剂量，直至动物显示任何毒性的适应症或直至到达对于PC-DHA-hsiRNA大约20mM和对于Di-hsiRNA大约50mM的药物溶解限度。注射后三周(观察到寡核苷酸毒性所需的最佳时间)，采集脑部组织，并通过对神经元标志物NeuN和DARPP-32染色来评估神经元的数目和活力(Mullen RJ,Buck CR,Smith AM.NeuN,a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.Development(Cambridge,England).1992；116:201-11.PMID:1483388；Weyer A,SchillingK.Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuNin the murine cerebellum.Journal of neuroscience research.2003；73:400-9.PMID:12868073；Ouimet CC,Miller PE,Hemmings HC,Jr.,Walaas SI,Greengard P.DARPP-32,adopamine-and adenosine3':5'-monophosphate-regulated phosphoprotein enrichedin dopamine-innervated brain regions.III.Immunocytochemical localization.TheJournal of neuroscience:the official journal of the Society forNeuroscience.1984；4:111-24.PMID:6319625)。也通过对IBA1染色来评估小胶质细胞活化(先天免疫活化)(Judge AD,Bola G,Lee AC,MacLachlan I.Design of noninflammatorysynthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo.Molecular therapy:thejournal of the American Society of Gene Therapy.2006；13:494-505.PMID:16343994；Marques JT,Williams BR.Activation of the mammalian immune system bysiRNAs.Nature biotechnology.2005；23:1399-405.PMID:16273073)。为测试化合物是否引发可逆的短期炎症反应，用最大耐受剂量注射小鼠，并在施用后6小时检查胶质细胞活化。本研究的完成将产生本文所述的两种新类别的治疗性hsiRNA的最大耐受剂量的数据。
估算PC-DHA和Di-hsiRNA的清除概况
将确定CSF和血液中RNA的停留时间。在小鼠中重复的CSF取出(withdrawal)是难以实施的，因此将使用大鼠进行CSF清除研究，相应地调整剂量。使用重叠动物组，在施用PC-DHA-和Di-hsiRNA后1、6、12和24小时以及1周取出10μl CSF。类似地，在注射后5和30min，以及1、4、12、24、48、72和96小时，采集20μL血液。为使在短时间内重复抽血相关的忧虑最小化，以及为使获得精确数据所需的动物数目最小化，将使用颈静脉导管插入术。
基于先前对相关siRNA化合物的药代动力学研究，预期将观察到两相清除动力学，其中在四至六小时内完成快相清除。基于初步研究，完全的药物清除可花费一个月或数月。然而，一周初步研究足以接近清除概况。该研究的完成将产生本文所述的两种新类别的治疗性hsiRNA的清除概况的初步数据。
确立剂量反应
将进行剂量-反应研究以确定在显示显著寡核苷酸积累的脑部区域中沉默的最佳剂量。以类似于图103、104和105中呈现的实验来进行实验。从用渐增剂量的PC-DHA和Di-hsiRNA注射的小鼠脑部和脊柱收获3-mm打孔样品活检，使用
Figure BDA0001487578630001351
分析来测量HTT或对照mRNA的水平。
Figure BDA0001487578630001352
为高度灵敏的基于96孔的分析，其使用信号放大来直接检测组织或细胞裂解物中的mRNA。最近公布了描述直接连接TissueLyser和
Figure BDA0001487578630001353
的自动化高通量(96孔)分析形式的方案(Coles AH,Osborn MF,Alterman JF,Turanov AA,Godinho BM,Kennington L,Chase K,Aronin N,Khvorova A.A High-Throughput Methodfor Direct Detection of Therapeutic Oligonucleotide-Induced Gene Silencing InVivo.Nucleic acid therapeutics.2015.PMID:26595721)。因此，对于许多组织和/或动物，可以进行同时定量HTT和管家mRNA。在初步研究中，经确定每组八只小鼠足够以80％的置信度检测靶基因表达40％的降低。Id。
将HTT mRNA水平归一化至对照管家mRNA。相同化学组成的人工CSF和非靶向对照(NTC)，将用于控制非序列特异性事件。NTC hsiRNA仅以最高无毒浓度注射，以限制使用的动物数目。虽然NTC为较好的阴性对照，但第二靶向hsiRNA(例如，PPIB-靶向)将为相同数目的动物提供两种不同靶标的沉默数据。在向动物疾病模型转变之前，对蛋白质水平的沉默进行确认是必不可少的，因此将以与针对chol-hsiRNA进行的相似方式进行蛋白质印迹(Alterman JF,Hall LM,Coles AH,Hassler MR,Didiot MC,Chase K,Abraham J,Sottosanti E,Johnson E,Sapp E,Osborn MF,Difiglia M,Aronin N,KhvorovaA.Hydrophobically Modified siRNAs Silence huntingtin mRNA in Primary Neuronsand Mouse Brain.Molecular therapy Nucleic acids.2015；4:e266.PMID:26623938)。本研究的完成应鉴定本文所述的两种新类别的治疗性hsiRNA能够在CNS的不同区域进行功能基因沉默的剂量。
PC-DHA和Di-hsiRNA在单次施用后的沉默持续时间
大多数神经变性病症和疾病模型呈现迟发症状(例如，在小鼠中为3至9个月)。应确定一次注射的沉默持续时间和需要多少次注射才能支持6至9个月的沉默。通常，预期在非分裂细胞中siRNA诱导的沉默持续数月。负载的RISC复合物的半衰期为数周(WhiteheadKA,Langer R,Anderson DG.Knocking down barriers:advances in siRNAdelivery.Nature reviews Drug discovery.2009；8:129-38.PMID:19180106)，以及每个细胞小于1,000个负载的RISC分子足以诱导沉默(Stalder L,Heusermann W,Sokol L,Trojer D,Wirz J,Hean J,Fritzsche A,Aeschimann F,Pfanzagl V,Basselet P,WeilerJ,Hintersteiner M,Morrissey DV,Meisner-Kober NC.The rough endoplasmaticreticulum is a central nucleation site of siRNA-mediated RNA silencing.TheEMBO journal.2013；32:1115-27.PMID:23511973；PMCID:3630355；Pei Y,Hancock PJ,Zhang H,Bartz R,Cherrin C,Innocent N,Pomerantz CJ,Seitzer J,Koser ML,AbramsMT,Xu Y,Kuklin NA,Burke PA,Sachs AB,Sepp-Lorenzino L,Barnett SF.Quantitativeevaluation of siRNA delivery in vivo.Rna.2010；16:2553-63.PMID:20940339；PMCID:2995415)。
此外，FM-hsiRNA可以提供另一优势。细胞通常摄取数百万个hsiRNA，但绝大部分被捕获在溶酶体中。截留在溶酶体中的常规的部分修饰的hsiRNA被降解，但FM-hsiRNA不会被降解。因此，暂时捕获在溶酶体中的FM-hsiRNA形成缓慢释放FM-hsiRNA的细胞内“储库”，使其可用于RISC负载。来自Alnylam GalNAc试验的数据表明，通过单次皮下注射，至肝脏的最佳递送提供长达六个月的功效。本文呈现的数据与该观察一致；单次FM-hsiRNA注射提供至少一个月的最大沉默(图2D)。
为测量hsiRNA的保留和沉默持续时间，用最高耐受剂量的PC-DHA-或di-hsiRNA注射三只小鼠，并且使用PNA分析在1、2和4周以及在2、3、4和6个月，测量组织中完整引导链的水平(图106)。一旦完整引导链水平降低到每克组织低于1μg hsiRNA，将终止研究。在单独的研究中(n＝8)，在引导链浓度为高于1μg/克组织的时间点测量HTT mRNA水平，以可靠地检测沉默效果。虽然预期沉默的持续时间将至少为三个月，但需要进行实验验证。
探索Di-hsiRNA的细胞摄取和运输的机制
与等剂量的接头结合的单个siRNA相比，双支链hsiRNA在CNS组织中显示显著增强的保留和分布，表明通过共价连接的siRNA的协同结合或受体二聚化驱动细胞摄取(图95C)。使用TESM显微镜(时间分辨的落射荧光结构显微镜)和质谱的组合，使差异摄取可视化并对其进行表征。
开发HTT化合物的“解毒剂”
目前考虑将基因治疗方法(即，永久性基因沉默)用于治疗神经变性病症，因此1至6个月的沉默持续时间似乎相对安全。然而，逆转沉默的“解毒剂”将满足关于安全性的忧虑。“解毒剂”也是研究体内基因功能的很好的工具，允许测试基因需要下调多长时间才能产生相关表型。
为解决来自FDA的相似忧虑，Alnylam已经开发了一种技术，被称为
Figure BDA0001487578630001381
其能够逆转长期沉默。该概念涉及开发与功能性hsiRNA的种子区域完全互补的高亲和力反义(LNA和2’-O-甲基/脱氧)
Figure BDA0001487578630001382
将设计和合成靶向HTT10150(和最终其它化合物)的hsiANTIDOTE的WA组，并评估其在体外和体内逆转沉默的能力(图96)。解毒剂将在PC-DHA缀合物的背景下合成，以能够产生与PC-DHA-hsiRNA相似的分布性质。本研究的完成将产生针对先导hsiRNA化合物的解毒剂，以能够逆转其体内活性(如果需要)。
替代性方法：测试PC-DHA缀合物和双支链结构是否改善脑部中反义介导的沉默
用于治疗神经变性病症的反义寡核苷酸，处于临床上先进的发展阶段(Evers MM,Toonen LJ,van Roon-Mom WM.Antisense oligonucleotides in therapy forneurodegenerative disorders.Advanced drug delivery reviews.2015.PMID:25797014；Kordasiewicz HB,Stanek LM,Wancewicz EV,Mazur C,McAlonis MM,Pytel KA,Artates JW,Weiss A,Cheng SH,Shihabuddin LS,Hung G,Bennett CF,ClevelandDW.Sustained therapeutic reversal of Huntington's disease by transientrepression of huntingtin synthesis.Neuron.2012；74:1031-44.PMID:22726834；PMCID:PMC3383626)。IONIS-HTTRx为Ionis专有的一代2.5反义化学，并且通常不用于学术界。
然而，已经开发了靶向HTT的高度有效的锁核酸(LNA)GapmeR。为测试PC-DHA缀合物和/或双分支是否可以改善反义寡核苷酸在脑部组织中的分布和保留以及降低其有效剂量，将合成靶向HTT的PC-DHA-和di-LNA GapmeR。
本实施例的完成，将导致本文所述的两种新型寡核苷酸缀合物(即，PC-DHA和di-hsiRNA)在CNS(脑部和脊髓)中的全面表征，包括最佳递送途径、药物清除和保留、安全性、剂量反应和作用持续时间。本文所述的实验，将使这些化学物质能够在体内用于CNS中的基因沉默和靶标验证研究，以及为HD的新型疗法的发展奠定坚实的基础。
实施例9.一组改善分布和治疗指数的PC-DHA和Di-hsiRNA化学变体的合成和表征
本文呈现的数据(图92、103、104和105)表明，PC-DHA-和di-hsiRNA化学物质将足以在脊髓、纹状体和皮质中达到1个月至3个月作用持续时间的目标，这对于体内功能基因组学研究是足够的。仅此就是一个重要的成就，而该技术平台向人治疗学的未来转化代表另一复杂性水平。在我们转化该技术之前，我们将针对以下来优化该化学物质：(i)尽可能广泛的治疗指数，和(ii)增强的分布以支持向巨大脑部递送。
缀合物化学支架的轻微变化可以深刻地影响组织分布，如通过用磷脂酰胆碱官能化DHA所证明的(图92)。利用这些合成平台，将合成一组PC-DHA-和di-hsiRNA变体，以进一步优化治疗指数和广泛的组织分布。
PC-DHA优化
PC-DHA结构有两种基本组分：磷脂酰胆碱和DHA(参见图92中的结构)。本文所述的合成方法(图93和94)，将允许这些化学物质独立地变化。关于寡核苷酸缀合物的结构-功能关系，文献中存在很少至无此类信息，但存在大量信息描述聚合物结构和脂质化合物如何影响脂质-颗粒形成48。该研究表明，脂质的长度对整体制剂功效具有重要影响。
多不饱和键对于增强hsiRNA在CNS组织中的分布是必不可少的。DCA(DHA的完全饱和类似物)的缀合，不会促进在CNS中的广泛分布。EPA(比DHA少两个碳)的缀合，导致令人关注的分布概况，但尚未测试功效。将合成一组磷脂酰胆碱修饰的多不饱和脂肪酸变体，其脂质尾部的长度在10至22个碳变化，以及多不饱和键的数目在0至4变化。这些合成反应的前体均是商购的。这些化合物将揭示脂质尾部长度和多不饱和键的数目如何影响寡核苷酸在CNS中的分布。
第二，将进行胆碱实体的系统取代用于一系列修饰，主要有利于天然存在的化学支架，例如，磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰胺。这些合成中的大多数可以平行进行，产生具有固定脂质尾部组成和多种头部基团的化合物文库。该文库用于限定头部基团对hsiRNA缀合物的体内性能的重要性。
众所周知，不管用于递送的化学物质或制剂的性质怎样，绝大部分的内化寡核苷酸不是生物学上可用的。箭头研究公司(Arrowhead Research Corporation)已经使用内吞体裂解(endosomolytic)的肽修饰的聚合物(Wong SC,Klein JJ,Hamilton HL,Chu Q,FreyCL,Trubetskoy VS,Hegge J,Wakefield D,Rozema DB,Lewis DL.Co-injection of atargeted,reversibly masked endosomolytic polymer dramatically improves theefficacy of cholesterol-conjugated small interfering RNAs in vivo.Nucleicacid therapeutics.2012；22:380-90.PMID:23181701)，来增强共同施用的胆固醇修饰的siRNA化合物的全身功效。基于这个概念，合成了改变内吞体裂解肽的数目和组成的接头文库。大多数变体对chol-hsiRNA功效无影响，但最好的先导物(lead)(图97A)在被动摄取后使沉默增强大于10倍(图97B)。不希望受科学理论的束缚，增强的活性可能由于内化的chol-hsiRNA增强的生物利用度，因为修饰的接头未增加通过脂质介导摄取的功效(图97B)或寡核苷酸内化的总量。该接头将与脂质长度和头部基团的最佳组合进行组合。
Di-hsiRNA优化
di-hsiRNA化合物中的两个hsiRNA不对称连接：一个通过磷酸酯键，另一个通过氨基磷酸酯键(图93、94和103A)。为确定氨基磷酸酯键是否是必需的，目前测试的是其中hsiRNA均经由磷酸酯与接头连接的双支链化合物(基于图93和94中的修改的合成方案)。显示氨基磷酸酯键不是必不可少的，这将简化结构-活性关系的研究，因为可以使用大量商购的前体。然而，对磷酸酰胺键的需求将是令人关注的，因为磷酸酰胺在酸性条件下相当不稳定并且预期会促进化合物从核内体释放。
将合成一组变体，测试下述参数：hsiRNA的数目(2、3、4或6，使用从Glen Research获得的两-和三-分支分割物)；和连接寡核苷酸的接头的化学性质(TEG，饱和以及不饱和的烷基链，带电的，不带电的，长度为3至30个碳和质子海绵)。还鉴定摄取所需的硫代磷酸酯键的最小数目。已经确定，硫代磷酸酯键对于hsiRNA的被动摄取和功效是必不可少的，因此据推测，两个硫代磷酸酯尾部的协同结合驱动Di-hsiRNA的增强的分布和摄取。然而，硫代磷酸酯键也驱动反义寡核苷酸的毒性(Geary RS,Norris D,Yu R,BennettCF.Pharmacokinetics,biodistribution and cell uptake of antisenseoligonucleotides.Advanced drug delivery reviews.2015；87:46-51)。因此，优化和减少硫代磷酸酯的数目是增强治疗指数的合理途径。
PC-DHA-和Di-hsiRNA变体的功效评价
将组织培养实验用于确认安全性和有效进入RISC复合物。然后，在如本文所述确立的最小有效剂量和最大耐受剂量下，ICV注射每种化合物。将选择在较低浓度下有效的或/和在较高浓度下无毒的化合物用于详细研究。最后，将评估最有前途的化合物遍及巨大脑部(例如，绵羊)分布的能力。本文已经设计绵羊模型，以评价AAV-htt载体的分布。本文所述的PNA分析，将用于测量在弹丸ICV输注之后来自绵羊脑部的不同区域的活检中的化合物水平。
本实施例的完成预期可：(i)告知限定PC-DHA-和Di-hsiRNA的体内功效的化学结构；和(ii)产生具有增强的分布、功效和治疗指数的这些化合物的形式。
实施例10.亨廷顿病模型的候选临床前化合物的开发
在亨廷顿病动物模型中评估hsiRNA H TT10150的新型缀合物
本文描述了Htt，HTT-10150的超功能性FM-hsiRNA。将使用目前在其实验室运行的多种HD动物模型(Chang R,Liu X,Li S,Li XJ.Transgenic animal models for study ofthe pathogenesis of Huntington's disease and therapy.Drug design,developmentand therapy.2015；9:2179-88.PMID:25931812；PMCID:PMC4404937)，包括YAC128(HodgsonJG,Agopyan N,Gutekunst CA,Leavitt BR,LePiane F,Singaraja R,Smith DJ,BissadaN,McCutcheon K,Nasir J,Jamot L,Li XJ,Stevens ME,Rosemond E,Roder JC,PhillipsAG,Rubin EM,Hersch SM,Hayden MR.A YAC mouse model for Huntington's diseasewith full-length mutant huntingtin,cytoplasmic toxicity,and selectivestriatal neurodegeneration.Neuron.1999；23:181-92.PMID:10402204)、BACHD(Hult S,Soylu R,Bjorklund T,Belgardt BF,Mauer J,Bruning JC,Kirik D,Petersen A.Mutanthuntingtin causes metabolic imbalance by disruption of hypothalamicneurocircuits.Cell metabolism.2011；13:428-39.PMID:21459327；Hult Lundh S,Nilsson N,Soylu R,Kirik D,Petersen A.Hypothalamic expression of mutanthuntingtin contributes to the development of depressive-like behavior in theBAC transgenic mouse model of Huntington's disease.Human moleculargenetics.2013；22:3485-97.PMID:23697793；Gray M,Shirasaki DI,Cepeda C,Andre VM,Wilburn B,Lu XH,Tao J,Yamazaki I,Li SH,Sun YE,Li XJ,Levine MS,Yang XW.Full-length human mutant huntingtin with a stable polyglutamine repeat can elicitprogressive and selective neuropathogenesis in BACHD mice.The Journal ofneuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience.2008；28:6182-95.PMID:18550760；PMCID:PMC2630800)，和最近确立的包括Q140在内的等位基因系列(网站：chdifoundation.org)。
基于本文所述鉴定的最佳参数，将HTT-10150的弹丸ICV注射施用至每只亨廷顿小鼠模型中，将分析小鼠的Htt沉默、亨廷顿的行为和/或亨廷顿相关表型的发作，并且验证组织学参数。已经设计了一组验证的分析，以检测YAC128和Q140突变的mRNA以及野生型HttmRNA的差异表达。已经设计了一组行为分析，以评估运动功能，包括旋转、高架台和旷场分析(Sah DW,Aronin N.Oligonucleotide therapeutic approaches for Huntingtondisease.The Journal of clinical investigation.2011；121:500-7.PMID:21285523；PMCID:3026739；Kordasiewicz HB,Stanek LM,Wancewicz EV,Mazur C,McAlonis MM,Pytel KA,Artates JW,Weiss A,Cheng SH,Shihabuddin LS,Hung G,Bennett CF,Cleveland DW.Sustained therapeutic reversal of Huntington's disease bytransient repression of huntingtin synthesis.Neuron.2012；74:1031-44.PMID:22726834；PMCID:PMC3383626)。将一组小鼠在三个月龄时处理以评估疾病预防，并且将另一组小鼠在六个月龄时处理以评估疾病逆转。使用商购的抗聚谷氨酰胺抗体(3B5H10)，通过免疫组织化学染色来评估HTT聚集体。如果需要，将重新施用HTT-10150hsiRNA缀合物。对照组将包括用PBS和与HTT-10150hsiRNA缀合物具有相同化学性质的非靶向对照化合物注射的小鼠。将在亨廷顿病的几种行为模型中通过在另一组独立地重新测试最好的先导物。
本实施例的完成以及功效、安全性和持续时间研究，将产生足以使最佳的hsiRNAHTT-10150转移至临床前开发的一组数据。目前，用于基于寡核苷酸治疗亨廷顿病的最佳可用程序为2’-O-甲氧基乙基GapmeR(Id.)，将其用作基准。IONIS-HTTRx化合物最近开始1期临床试验，其中患者接受弹丸脊髓穿刺注射，并且将CSF中HTT水平的降低作为概念证明的生物标志物。这为开发治疗亨廷顿病的寡核苷酸治疗确立了临床前景。最初，与IONIS方法相似，计划使突变的和野生型Htt均沉默。本文所述的支架也用于产生通过SNP区别来使突变的HTT选择性沉默的化合物。事实上，在75％的亨廷顿病患者突变中，5个SNP等位基因与毒性CAG扩展有关(Pfister EL,Kennington L,Straubhaar J,Wagh S,Liu W,DiFiglia M,Landwehrmeyer B,Vonsattel JP,Zamore PD,Aronin N.Five siRNAs targeting threeSNPs may provide therapy for three-quarters of Huntington's diseasepatients.Current biology:CB.2009；19:774-8.PMID:19361997；PMCID:PMC2746439)。
通过引用并入
为了所有目的，将本申请中引用的所有引用参考文献(包括文献参考资料、专利、专利申请和网站)的内容据此通过引用整体明确地并入本文，如同在其中引用的参考文献一样。除非另有指出，否则本公开将采用常规免疫学、分子生物学和细胞生物学的技术，其为本领域众所周知的。
本公开还通过引用整体并入分子生物学和药物递送领域众所周知的技术。这些技术包括但不限于下述出版物中所述的技术：
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等同形式
在不脱离本公开精神或基本特征的情况下，本公开可以以其它具体形式体现。因此，前述实施方案在所有方面都被认为是说明性的而不是限制本公开。因此，本公开的范围由所附权利要求而不是前面的描述来指示，因此在权利要求的等同物的含义和范围内的所有变化旨在被涵盖在本文中。
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Claims (19)

1.dsRNA分子，所述dsRNA包含有义链和反义链，每条链具有5’端和3’端，其中：
(1)所述反义链包含与5'CAGUAAAGAGAUUAA 3'(SEQ ID NO:1)完全互补的互补性区域；
(2)所述反义链包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸；
(3)所述反义链的5’端第2位和第14位的核苷酸不是2’-甲氧基-核糖核苷酸；
(4)所述反义链与所述有义链互补；
(5)所述有义链包含SEQ ID NO:1；
(6)所述有义链包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸；
(7)所述有义链的3’端第2位和第14位的核苷酸是2’-甲氧基-核糖核苷酸；并且
(8)所述有义链的核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接，
并且其中所述dsRNA的长度为15至30个碱基对。
2.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述dsRNA为平端的。
3.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述dsRNA包含至少一个单链核苷酸悬突。
4.如权利要求3所述的dsRNA分子，其中所述单链核苷酸悬突的长度为1-7个核苷酸。
5.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述反义链的长度为15-30个核苷酸。
6.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述有义链的长度为15-30个核苷酸。
7.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述反义链包含UUAAUCUCUUUACUGAUAUA。
8.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述dsRNA在所述有义链的3’端包含胆固醇部分。
9.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述有义链以其3’端与疏水性分子连接。
10.如权利要求9所述的dsRNA分子，其中所述有义链与所述疏水性分子之间的连接包含聚乙二醇或三乙二醇。
11.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中自所述有义链3’端第1位和第2位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
12.如权利要求1所述的dsRNA分子，其中自所述有义链3’端第1位和第2位的核苷酸以及自所述有义链5’端第1位和第2位的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核糖核苷酸连接。
13.用于抑制生物体中亨廷汀(HTT)基因表达的药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的dsRNA分子和药学可接受的载体。
14.抑制细胞中HTT基因表达的体外方法，所述方法包括：
(a)向所述细胞中引入权利要求1-12中任一项所述的dsRNA分子；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以获得所述HTT基因的mRNA转录本降解的时间，从而抑制所述细胞中HTT基因的表达。
15.权利要求1-12中任一项所述的dsRNA分子在制备用于治疗或管理患者的亨廷顿病的药物中的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述药物用于施用至所述患者的脑部。
17.如权利要求15所述的用途，其中所述药物用于通过纹状体内输注施用。
18.如权利要求16所述的用途，其中所述药物施用于所述脑部引起纹状体中HTT基因mRNA的减少。
19.如权利要求15所述的用途，其中所述药物施用于所述患者的脑部引起皮质中HTT基因mRNA的减少。
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