JP3242118B2 - 生体内分解性標的指向性マイクロパーティクル送達システム - Google Patents

生体内分解性標的指向性マイクロパーティクル送達システム

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、生物活性物質を送達するための生体内分解
性マイクロパーティクル（マイクロ粒子）に関し、具体
的には、特定の細胞型に対して標的指向性であるような
マイクロパーティクルに関する。
関連出願の参照 本出願は、1996年12月20日提出の係属出願中の米国特
許第08/770,050号の一部継続出願である。
発明の背景 長年、ヒトおよび動物を様々な感染症から守るために
ワクチンが用いられてきた。このような従来型のワクチ
ンは、弱毒化病原体（例えば、ポリオウイルス）、不活
化病原体（例えば、百日咳菌）、または病原体の免疫原
性成分（例えば、ジフテリアトキソイドおよびＢ型肝炎
表面抗原）から構成される。
免疫原性が高く、単独で防御免疫応答を引き起こすこ
とができる抗原もある。しかし、他の抗原は、防御免疫
応答を誘導できないか、弱い免疫応答しか誘導しない。
抗原をアジュバントと同時投与すると、弱い免疫原性抗
原の免疫応答を著しく促進することができる。アジュバ
ントは、抗原の免疫原性を促進するが、それ自体が免疫
原性であるとは限らない。アジュバントは、抗原を投与
部位近傍の局所に維持することにより、免疫システムの
細胞に対する、ゆっくりと持続する抗原の放出を容易に
する貯蔵効果を生み出すことができる。アジュバント
は、抗原貯蔵に免疫システムの細胞を引きつけ、これら
の細胞を刺激して免疫応答を引き起こすことができる。
アジュバントは、非経口的に送達された抗原に対する免
疫応答を促進することが確認されている。
通常、アジュバントは、ワクチン製剤中で抗原ととも
に用いられることにより、非経口的免疫感作（筋肉内ま
たは皮下）による全身的免疫誘導が得られる。このアプ
ローチは、傷害を受けた皮膚（すなわち、破傷風）を経
由して体に接近する感染性試剤に適しているが、この方
法で投与される多くのアジュバントの副作用および関連
する毒性に起因して遭遇する問題点がある。アルミニウ
ム塩（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）
から製剤化されたワクチンだけが、ヒトおよび家畜の予
防接種に日常的に用いられている。しかし、これらのア
ジュバントでさえ、すべての抗原とともに用いるのに適
しているわけではなく、注射部位に刺激を引き起こすこ
ともある。注射部位において抗原の免疫原性を安全に促
進するアジュバントの開発が必要なことは明らかであ
る。
用いられる抗原の性質に特有の他の問題がある。例え
ば、従来型の不活化ワクチンの大部分は、効果的な免疫
感作に複数回の投与を必要とする。弱毒生ワクチンおよ
び多くの液状不活化ワクチンは、限定された保存条件が
必要であるという欠点を持ち、不活化を受けやすい（例
えば、熱感受性）。アジュバント不適合性、pH、緩衝方
法および塩の存在に起因して、単一剤形でワクチンを混
合することに関連する問題もある。
粘膜免疫は、主に腸内、気管支または鼻洗浄液および
その他の外分泌液における分泌型免疫グロブリン（sIg
A）の誘導により、誘導される。例えば、非経口のコレ
ラワクチンでは限られた防御作用しか得られないが、一
方、最近開発された経口型は非常に有効であることが分
かっている（ref.1−本明細書を通じ、種々の参考文献
を括弧内に引用し、本発明が関わる技術分野の状況をさ
らに詳しく説明する。各引用の一覧情報は、本明細書の
末尾、請求範囲の直前に示す。これらの参考文献の開示
を、参照として本明細書中に援用する）。ヒト志願者に
よる研究から、インフルエンザワクチン経口投与が、鼻
粘膜分泌物における分泌型抗インフルエンザ抗体の誘導
に有効であることがわかり、このような摂取ワクチンに
対しアジュバントとして有効な物質が確認されている。
しかし、これらアジュバントの大部分は、摂取ワクチン
に対し免疫応答を改善することに関しては、比較的無力
である。最近、これらのアジュバントの大部分が、安全
で、経口的胃腸管、鼻咽頭−気道および生殖道を経由ま
たは眼窩内に投与された抗原に対し、ヒトおよび動物に
おいて免疫応答を促進するために有効であることが証明
された。しかし、これらの経路を経由する抗原の投与
は、通常、免疫応答を引き起こすには無効である。前述
の例は、これらの免疫感作法の潜在力を示しているが、
これらの経路によって使用するためのワクチン製剤の開
発は、様々な理由から遅々としていた。粘膜表面におい
て免疫感作することができないことは、通常、次のよう
に考えられているからである。
（ｉ）粘膜表面へ移行する間に存在する酸および／また
はタンパク質分解酵素による抗原の分解、 （ii）粘膜上皮に存在する分泌物による抗原の分解、 （iii）粘膜上皮からの限られた吸収、 （iv）免疫応答を誘導するために必要な濃度以下に抗原
が希釈されること、 （ｖ）無効なアジュバントおよび／または送達システ
ム。
非経口ワクチン製剤におけるアジュバントの使用、お
よび粘膜部位へワクチンを送達するための適当なシステ
ムの欠如に関連する問題は、様々な経路により投与した
場合に有効であって関連する毒性の問題または副作用の
ない新たな手法の必要性を暗示している。
時間とコストを低減し、ヒトの医療において、入手法
が制限される発展途上国では極めて重要である患者のコ
ンプライアンスを増す利点もあることから、ヒトおよび
動物に単一剤形でワクチン送達を可能にすることも望ま
れる。これは、これらの国々の幼児にまさに当てはまる
ことである。
投与された抗原に対する免疫応答を増すため、担体を
用いて抗原の分解を防ぎ、in vivoにおけるこれらの物
質の取り込みを変調させることができる。感受性抗原を
捕捉し、破壊、免疫原性の減少または希釈から抗原を守
ることができる。担体を製剤化する方法には、抗原を高
分子マトリックス（単一マトリックス）中に分散する、
または抗原の周りを高分子物質で被覆することにより外
部防御壁（コア−シェル）を得ることが含まれる。製剤
プロトコルの操作により、これらの物質の平均サイズを
優先して制御することができる。このことは、経口送達
を経由する腸管内のパイエル板の特定のＭ−細胞におけ
る微粒子の取り込みに重要であることが分かった。
米国特許第5,151,264号は、Bio Vecteurs Supra M
oleculairs（BVSM）と名付けられたリン脂質／糖脂質／
多糖性質の微粒子担体について記載している。微粒子担
体は、その層の１つに生物活性を有する様々な分子を運
搬することを意図している。しかし、米国特許第5,151,
264号は、免疫感作のための抗原を含む微粒子担体につ
いては記載しておらず、経口的胃腸管、鼻咽頭−気道お
よび尿生殖道を経由する免疫感作、および眼窩内または
その他の粘膜部位における免疫感作のための微粒子担体
について具体的に記載していない。
Eldridge、他（ref.2および３）は、PLGまたはPLGAと
して知られているポリラクチド・グリコリド共重合体か
ら製造された生体内分解性マイクロスフェアからのin
vivoにおける抗原の遅延性放出を観察した。マイクロパ
ーティクルの製剤化に際して抗原をカプセル充填するた
めに多数の他の高分子が用いられており、これらには、
ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリカプロラクトン、
ポリ酸無水物、ポリオルトエステルおよびポリ（α−ヒ
ドロキシ酪酸）が含まれる。
米国特許第5,075,109号は、50:50のポリ（DL−ラクチ
ド・グリコリド）中にトリニトロフェニル化キーホール
リンペットヘモシアニンおよびブドウ球菌腸管毒Ｂ抗原
のカプセル充填について記載している。ポリ（グリコリ
ド）、ポリ（DL−ラクチド・グリコリド）、コポリオキ
サレート、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド・カプ
ロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオルトエ
ステル、ポリ（α−ヒドロキシ酪酸）、およびポリ酸無
水物などのカプセル充填用の他のポリマーを提案してい
る。カプセル充填された抗原は、胃内挿管法によりマウ
スに投与され、唾液および腸管分泌液および血清中に顕
著な抗原特異的IgA抗体の出現をもたらした。この特許
に述べられているように、これとは対照的に、同量のカ
プセル充填しない抗原の経口投与は、試験したいずれの
体液中において、いずれのイソタイプの特異的抗体の誘
導に無効であった。ポリ（DL−ラクチド・グリコリド）
マイクロカプセルを用いて、非経口注射によって抗原を
投与することもできた。
公告されたPCT出願WO91/06282は、多数の生体付着性
マイクロスフェアおよび抗原ワクチン成分を含む送達運
搬体について記載している。マイクロスフェアは、デン
プン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアル
ブミンからなる。この送達運搬体は、鼻粘膜からのワク
チン取り込みを具体的に意図している。この送達運搬体
はさらに吸収促進剤を含有することができる。通常、防
御性重合物質中に抗原をカプセル充填する。
米国特許第5,571,531号は、多糖の固体マトリックス
およびタンパク性物質を含む微粒子担体について記載し
ている。生物活性を有する物質の送達のために官能基の
付いたシリコンポリマーをマトリックスに結合させてい
る。
抗原の遅延性放出は前述の仕事で明らかになったが、
記載の方法によってマイクロパーティクルを製造する場
合には困難に遭遇した。生物学的物質を用いる有機溶媒
および物理的力に暴露すると変性する可能性もある。方
法をスケールアップすることも困難である。さらに、親
水性の抗原をカプセル充填するのは非能率的である。
このような制限のない改善された担体を提供すること
が望ましいであろう。具体的には、マイクロパーティク
ルおよびマイクロスフェアに製剤化でき、抗原を予め選
択された配位子に向けるような標的指向性の部分を含む
重合物質を提供することが望まれる。これは、免疫シス
テムの細胞に対する途方もない潜在能力を持つであろ
う。
発明の概要 本発明は、様々な方法によってマイクロパーティクル
およびマイクロスフェアを製造するのに適した性質を有
する新規で有用なポリマーの製造を対象とする。本発明
において、現在のプロセッシング法の改変は、カプセル
充填の効率に著しい改善をもたらす。
本発明は、非経口、経口および鼻内を含む様々な免疫
感作経路による抗原、または抗原とアジュバントのカク
テルに有用なワクチン送達システムの製作を対象とす
る。
本発明の第１の態様により、下記一般式のバックボー
ンを有し、約5,000から約40,000の分子量を有するポリ
マーを含む、新規な生体内分解性、生体適合性のポリマ
ーを提供する。
上式で、 R1、R2、R3、R4およびR5は独立に、Ｈ、直鎖または分
枝鎖アルキル基から選択され、 R6は、Ｈ、アミン保護基、スペーサー分枝または生物
活性分子種から選択され、 Ｘは、ＯまたはＳ基から選択され、および ｘおよびｙは、整数で、ポリマーの少なくとも約95％
がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値をとる。
新規なポリマーは、環状ジエステルを含む少なくとも
１つのα−ヒドロキシ酸またはその誘導体、および少な
くとも１つの疑似−α−アミノ酸を含む、単量体の共重
合によって誘導される。α−ヒドロキシ酸は、一般式R1
R2COHCO2Hを有し、R1およびR2基はＨ、直鎖または分枝
鎖アルキル基である。α−ヒドロキシ酸は、α−ヒドロ
キシ酸の混合物、水素であるR1およびR2基を有するα−
ヒドロキシ酸、およびCH3であるR1基およびＨであるR2
を有するもう１つのα−ヒドロキシ酸の少なくとも１つ
の混合物を含むことができる。疑似−α−アミノ酸は、
一般式R5CHNHR6CO2Hを有し、R5基は、ヒドロキシメチル
またはメチルチオール基、およびR6は、アミン保護基で
ある。
アミン保護基は、カルボベンジルオキシ、ベンジル、
パラメトキシベンジル、ベンジルオキシメトキシ、tert
−ブチルオキシカルボニルまたは［９−フルオレニルメ
チルオキシ］カルボニルでよい。
通常、α−ヒドロキシ酸は、Ｌ−乳酸、D,L−乳酸、
グリコール酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシ酪酸
から選択される。少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸
はセリンでよい。
本発明の好ましい態様において、ポリマーは、ポリ−
D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−Ｚ−セリンエステ
ル（PLGpLS）およびポリ−P,L−ラクチド・グリコリド
・疑似−セリンエステル（PLGpS）である。
このポリマーは、直接または側基を介してポリマーに
共有結合した細胞生体付着性基、マクロファージ刺激物
質、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸および／ま
たは保護されたアミノ酸残基などの生物活性部分を含む
ことができる。
好ましい実施形態において、生物活性置換基は、アミ
ノ酸部分のアミノ基または適当なスペーサー分子を介し
てポリマーと結合する。スペーサー分子は、R7またはR8
基が独立に、Ｈ、直鎖または分枝アルキル単位から選択
され、式R7R8COHCO2Hで表されるα−ヒドロキシ酸、お
よびR9基がヒドロキシメチルまたはメチルチオール基で
あり、R10がアミン保護基である、式R9CHNHR10CO2Hで表
されるα−アミノ酸から選択することができる。
本発明の別の態様により、本発明は、少なくとも１つ
のα−ヒドロキシ酸および少なくとも１つの疑似−α−
アミノ酸を共重合させることを含む生体内の分解性、生
体適合性ポリエステルの製造方法を提供する。
本発明の別の態様により、不活性雰囲気条件において
少なくとも１つのα−ヒドロキシ酸および少なくとも１
つの疑似−α−アミノ酸のエステル化触媒を含む有機溶
媒溶液を調製し、単量体を共重合させて得られるポリマ
ーを単離することを含む、本明細書中に与えられた一般
式を有する生体内分解性、生体適合性のポリマーの製造
方法を提供する。用いる触媒は２−エチルヘキサン酸第
一スズであるのが好ましい。
この方法で生成されるポリマーは、固相触媒還元また
は別法により酢酸溶液中の臭化水素を用いる酸触媒によ
り、さらに脱保護することができる。
この方法は、ポリマーをフィルムまたはマイクロパー
ティクルに成型することを含む。
本発明の別の態様により、下記一般式を有し、約5,00
0から約40,000ドルトンの分子量を有するポリマーを含
み、ポリマーを含む担体である、生物活性物質を宿主に
送達するための微粒子担体を提供する。
上式で、 R1、R2、R3、R4およびR5は独立に、Ｈ、直鎖または分
枝鎖アルキル基から選択され、 R6は、Ｈ、アミン保護基、スペーサー分子または生物
活性分子種から選択され、 Ｘは、ＯまたはＳ基から選択され、および ｘおよびｙは、整数で、ポリマーの少なくとも約95％
がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値をとる。
通常、微粒子担体は、約１から10μＭの粒子径を有す
る。
本発明の別の態様は、少なくとも１つの生物活性物質
を宿主に送達するための微粒子担体製造方法であり、そ
の方法は、 （ａ）α−ヒドロキシ酸ポリマーまたは共重合体を含む
有機溶媒相を、分散または溶解した生物活性物質を含む
水性成分と混合し、第１の油中水型乳剤を生成させるス
テップ、 （ｂ）第１の油中水型乳剤水性洗浄相に分散し、第２の
水中油中水型乳剤を生成させるステップ、 （ｃ）第２の二重エマルションから水を除去し、マイク
ロスフェアを生成させるステップ、および （ｄ）マイクロスフェアを集め、その中に生物学的物質
を捕捉させるステップを含む。
本発明の微粒子担体は、担体と混合または担体中に捕
捉した生物活性物質を有する組成物として用いることが
できる。用いる生物学的物質は、免疫応答を引き起こす
物質から選択することができる。このような物質には、
非タンパク質分解性Hin−47類似体、D15、P1、P2、およ
びP6などのヘモフィルスインフルエンゼタンパク質が含
まれる。生物活性物質には、少なくとも１つのインフル
エンザウイルスが含まれ、多価または１価のインフルエ
ンザウイルスワクチン、またはインフルエンザウイルス
１価タンパク質ワクチンなどのインフルエンザウイルス
タンパク質が含まれる。さらに、生物活性物質には、モ
ラクセラカタラーリスのTbp2タンパク質などの少なくと
も１つのモラクセラカタラーリスタンパク質が含まれ
る。さらに、用いる生物活性物質には、ウレアーゼなど
の少なくとも１つのヘリコバクターピロリタンパク質が
含まれる。他の生物物質には、タンパク質、タンパク質
様物質、細菌、細菌溶解物、ウイルス（例えば、呼吸器
合胞体ウイルス）、ウイルス感染細胞溶解物、DNAプラ
スミド、アンチセンスRNA、ペプチド（例えば、CLTB−3
6およびM2）、抗原、抗体、薬理学的試剤、抗生物質、
炭水化物、脂質、脂質化アミノ酸（例えば、トリパルミ
トイルシステイン）、糖脂質、ハプテンおよびその組合
せおよびその混合物が含まれる。
第１の油中水型乳剤はさらに、親油性の少なくとも１
つの有機溶媒可溶アジュバントを含むことができる。こ
のような有機溶媒アジュバントは、BAY R1−005、トリ
パルミトイルシステインおよびDC−cholからなる基選択
することができる。親油性部分の存在は、カプセル充填
効率を高め、製剤化中の抗原を保護し、従来の製剤より
効率よく免疫システムに抗原が存在するように粒子を放
出することに役立ち、したがってより効果的なワクチン
を提供する。
さらに、第１の油中水型乳剤は、PCPPなどの重合性の
水溶性アジュバント、CT−Ｘまたはそのサブユニットな
どの粘膜アジュバントまたはLTといった少なくとも１つ
の水溶性アジュバントを含むことができる。水溶性アジ
ュバントの存在は、本方法のカプセル充填効率を高め、
製剤化中の抗原を保護し、従来の製剤より効率よく免疫
システムに抗原が存在するように粒子を放出することに
役立ち、それによってより効果的なワクチンを提供す
る。
本発明は、本明細書中で提供される微粒子担体および
生理学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物も提供
する。この組成物は粘膜または非経口的に投与できる。
免疫応答は、局所の抗体応答または血清抗体応答であ
る。本発明のこの態様により、安定微粒子型の制御され
た、または遅延した放出ワクチン調製物およびそのよう
なワクチン調製物の製造方法を提供する。粒子はマイク
ロスフェア的で、生体内分解性ポリマーおよび抗原およ
び／または抗原プラス・アジュバント含有の領域を含
む。
本発明の利点には、 （ａ）完全に生体内分解性および生体適合性マイクロパ
ーティクル製剤化、 （ｂ）免疫システムの細胞に対する抗原呈示が容易とな
り、改善された抗原免疫原性をもたらす、 （ｃ）抗原の生物学的利用能を増加させる改善された製
剤化条件、が含まれる。
本発明の追加の実施形態には、診断測定におけるおよ
び治療戦略に対する粒子担体の用途が含まれる。
図面の簡単な説明 図面を参照しての以下の説明により、本発明をさらに
理解されるであろう。
図１に、本発明の好ましい態様による、乳酸２量体と
グリコール酸２量体およびＮ−（カルボベンジルオキ
シ）−Ｌ−セリンとの開環重合（ROP）と、続く脱保護
を図式的に示す。
図２に、ポリマー中のα−アミノ酸サブユニットの側
鎖を介する生物活性部分のポリマーへの結合を図式的に
示す。代表的な標的基には、水溶性および循環の場合に
はポリ−エチレングリコール（PEG）、マクロファージ
刺激物質および細胞生体付着性基が含まれる。α−ヒド
ロキシ酸またはα−アミノ酸から誘導されるスペーサー
配位子を組み入れて生物活性配位子の結合を容易にする
ことができる。
図３は、本発明の一実施形態によるマイクロパーティ
クル製造のために用いるプロセスの詳細を図式的に示
す。この図において、Hin−47は、ヘモフィルスインフ
ルエンゼに由来する非タンパク質分解性組換えタンパク
質類似体（米国特許第5,506,139号に記載）、Flu X31
は、インフルエンザX31株またはＡ−Texas株、rD−15
は、ヘモフィルスインフルエンゼに由来する組換えタン
パク質（WO94/12641に記載）、PVA＝ポリビニルアルコ
ールである。Flu（トリ）は３価のflu、Tbp2は、モラク
セラカタラーリストランスフェリン結合タンパク質２、
およびrUreaseは、組換えヘリコバクターピロリウレア
ーゼである。
ポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−（Ｚ）−
セリンエステル（PLGpZS）およびポリ−D,L−ラクチド
・グリコリド・疑似−セリンエステル（PLGpS）マイク
ロパーティクルをPBSまたは代表的タンパク質（非タン
パク質分解性Hin−47類似体）の存在下で調製した場合
の、レーザー回折測定による代表的サイズ分布を図４に
示す。
リン酸緩衝食塩水（PBS）の存在下でポリ−D,L−ラク
チド・グリコリド・疑似−（Ｚ）−セリンエステル（PL
GpZS）およびポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似
−セリンエステル（PLGpS）から調製したマイクロパー
ティクルの走査型電子顕微鏡写真を図５に示す。
Hin−47/PBSなどの代表的抗原/PBS混合物の存在下で
ポリ−D,L−ラクチド・グリコリド・疑似−（Ｚ）−セ
リンエステル（PLGpZS）およびポリ−D,L−ラクチド・
グリコリド・疑似−セリンエステル（PLGpS）から調製
したマイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真を図
６に示す。
PBS（pH＝7.4）中でインキュベートされ37℃に維持さ
れた試料14mg（代表的なコアへの充填量は、マイクロパ
ーティクルmgあたり2.5から5.7μｇタンパク質の範囲に
ある）から得られたPLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロパ
ーティクル中にカプセル充填された非タンパク質分解性
Hin−47類似体の３カ月間のin vitroにおける放出経過
を図7Aに示す。
PBS（pH＝7.4）中でインキュベートされ37℃に維持さ
れた試料〜14mg（代表的なコアへの充填量は、マイクロ
パーティクルmgあたり2.5から5.7μｇタンパク質の範囲
にある）から得られたPLG、PLGpZSおよびPLGpSマイクロ
パーティクル中からの非タンパク質分解性Hin−47類似
体の３カ月間の％累積放出を図7Bに比較する。
種々の免疫感作プロトコルに従ってヘモフィルスイン
フルエンゼから得られた47kDa膜タンパク質（非タンパ
ク質分解性Hin−47類似体）により皮下（S.C.）で免疫
感作されたマウスにおける血清IgG応答を図8Aに示す。
５匹のマウスからなる群を、PLG、PLGpZSおよびPLGpSマ
イクロパーティクルに取り込まれた非タンパク質分解性
Hin−47類似体0.2または0.6μｇを含むpH7.4のPBS250μ
Ｌにより、１日目および35日目に免疫感作した。＋10、
＋24、＋35、＋46および＋60日目に採取した血清につい
て、酵素結合免疫吸着検定（ELISA）により抗−Hin−47
IgG抗体の存在を評価した。
種々の免疫感作プロトコルに従ってヘモフィルスイン
フルエンゼから得られた47kDa膜タンパク質（非タンパ
ク質分解性Hin−47類似体）により皮下（S.C.）で免疫
感作されたマウスにおける血清IgG応答を図8Bに示す。
５匹のマウスからなる群を、PLGマイクロパーティクル
と物理的に混合した非タンパク質分解性Hin−47類似体
0.8または2.5μｇを含むpH7.4のPBS250μＬにより、１
日目および35日目に免疫感作した。＋10、＋24、＋35、
＋46および＋60日目に採取した血清について、酵素結合
免疫吸着検定（ELISA）により抗−Hin−47IgG抗体の存
在を評価した。
図8Aおよび図8Bで説明したように行った試験から＋35
および＋60日目に得られたプール血液について、血清Ig
G応答サブタイププロフィルうを図8Cに示す。
ヘモフィルスインフルエンゼから得られた47kDa膜タ
ンパク質（非タンパク質分解性Hin−47類似体）により
胃内（I.G.）で免疫感作されたマウスにおけるIgG血清
抗体応答を図9Aに示す。５匹のマウスからなる群を、PL
G、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティクルに取り込ま
れ、またはPLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティク
ルと物理的に混合された非タンパク質分解性Hin−47類
似体４μｇを含むpH7.4のPBS500μＬにより、１、７、1
4および57日目に免疫感作した。＋13、＋35、＋56およ
び＋78日目に採取した血清について、酸素結合免疫吸着
検定（ELISA）により抗−Hin−47IgG抗体の存在を評価
した。
図9Aで説明したように行った試験から＋56および＋78
日目に得られたプール血液について、血清IgG応答サブ
タイププロフィルを図9Bに示す。
図9Aで説明したように行った試験から＋78日目に得ら
れたプール血液について、血清IgA応答を図9Cに示す。
ヘモフィルスインフルエンゼから得られた47kDa膜タ
ンパク質（非タンパク質分解性Hin−47類似体）および
ヘモフィルスインフルエンゼから得られた115kDa膜タン
パク質（rD−15）の（1:1）カクテルにより鼻腔内（I.
N.）で免疫感作されたマウスにおけるIgG血清抗体応答
を図10Aに示す。５匹のマウスからなる群を、PLG、PLGp
ZSまたはPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれ、ま
たはPLG、PLGpZSまたはPLGpSマイクロパーティクルと物
理的に混合された非タンパク質分解性Hin−47類似体４
μｇを含むpH7.4のPBS25μＬにより、１、７、14および
57日目に免疫感作した。＋13、＋35、＋56および＋78日
目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（EL
ISA）により抗−Hin−47IgG抗体の存在を評価した。
図10Aで説明したように行った試験から＋56および＋7
8日目に得られたプール血液について、血清IgG応答サブ
タイプ・プロフィルを図10Bに示す。
図10Aで説明したように行った試験から＋78日目に得
た血液について血清IgA応答を図10Cに示す。
図10Aで説明したように行った試験から＋78日目に得
た血液について肺潅注法IgG応答を図10Dに示す。
図10Aで説明したように行った試験から＋78日目に得
た血液について肺潅注法sIgA応答を図10Eに示す。
種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu X31（すな
わち、Ａ型インフルエンザウイルスX31株）IgG血清抗体
応答を図11に示す。６匹のマウスからなる群を、PLG、P
LGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれた
HA1.5μｇを含むpH7.4のPBS250μＬにより、皮下（S.
C.）で１日目に免疫感作した。＋21および＋33日目に採
取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ELISA）
により抗−Flu Ｘ−31IgG抗体の存在を評価した。
種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu X31（すな
わち、Ａ型インフルエンザウイルスX31株）IgG血清抗体
応答を図12に示す。６匹のマウスからなる群を、PLG、P
LGpZSおよびPLGpSマイクロパーティクルに取り込まれた
HA1.5μｇを含むpH7.4のPBS25μＬにより、鼻腔内（I.
N.）で１および34日目に免疫感作した。＋21、＋33、＋
57、＋78および＋92日目に採取した血清について、酵素
結合免疫吸着決定（ELISA）により抗−Flu X31IgG抗体
の存在を評価した。
単回皮下投与後にプールした血清（＋21および＋42ま
たは＋57日目）について血球凝集反応阻害抗体検定（す
なわち、インフルエンザウイルスＡ−Texas株）応答を
図13に示す。６匹のマウスからなる群を、PLGpSマイク
ロパーティクルに取り込まれたHA0.35μｇまたはHA3.5
μｇ、PLGpSマイクロパーティクルに取り込まれたHA0.3
5μｇおよびBAY R1−005〜２μｇ、またはHA3.5μｇお
よびBAY R1−005〜20μｇ、PLGpSマイクロパーティク
ルと物理的に混合されたHA0.35μｇまたはHA3.5μｇ、P
LGpSマイクロパーティクルと物理的に混合されたHA0.35
μｇおよびBAY R1−005 ２μｇ、またはHA3.5μｇお
よびBAY R1−005 20μｇを含むpH7.4のPBS250μＬに
より、皮下（S.C.）で１日目に免疫感作した。＋21およ
び＋42日目に採取した血清について、赤血球の血球凝集
反応阻害を調べた。
種々の免疫感作プロトコルによる抗−Flu（３価）IgG
血清抗体応答（３価ワクチン）中に含まれる各インフル
エンザウイルス株について;A−Texas（図14a）、A/Joha
nnesburg（図14b）およびB/Harbin（図14C））を図14a
からｃに示す。８匹のマウスからなる群を、PLGpSマイ
クロパーティクル、またはBAY R1−005、DC−Cholまた
はPCPPの存在下で製剤化したPLGpSマイクロパーティク
ル中に取り込んだ合計2.35μｇのHA（各株から約1/3の
特異的HA）を含むpH7.4のPBS250μＬにより、皮下（S.
C.）で１日目に免疫感作した。＋21、＋42および＋57日
目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（EL
ISA）を用い、抗−Flu（３価）IgG抗体（Ａ−Texas、A/
JohannesburgおよびB/Harbin）の存在を評価した。
単回皮下投与後の株特異的血球凝集反応阻害抗体検定
（すなわち、Ａ−Texas（図15a）、A/Johannesburg（図
15b）およびB/Harbin（図15c）応答を図15aからｃに示
す。８匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパーテ
ィクル中に取り込んだ合計2.35μｇのHA、またはBAY R
1−005、DC−CholまたはPCPPを一緒にカプセル充填した
PLGpSマイクロパーティクル中に取り込んだ合計2.35μ
ｇのHAを含むpH7.4のPBS250μＬにより、皮下（S.C.）
で１日目に免疫感作した。＋21、＋42または＋57日目に
採取した血清について、赤血球の血球凝集反応阻害を評
価した。
PLGpS/Flu（３価）マイクロパーティクル、またはBAY
R1−005、DC−CholまたはPCPPを一緒にカプセル充填
したPLGpS/Flu（３価）マイクロパーティクルの単回投
与により免疫感作したマウスで行った防御試験の結果を
図16に示す。マウスを同族の生ウイルスでチャレンジ
し、体重変化および２週間間隔で生存をモニターした。
種々の免疫感作プロトコルに従って、モラクセラカタ
ラーリスから得られたトランスフェリン結合タンパク質
により、皮下（S.C.）で免疫感作したマウスにおける血
清IgG抗体応答を図17aに示す。５匹のマウスからなる群
を、PLGpSマイクロパーティクルに取り込むか、PLGpSマ
イクロパーティクルと物理的に混合するか、またはAlum
とともに製剤化したtbp−２ 0.3μｇを含むpH7.4のPBS
250μＬにより、１、28および43日目に免疫感作した。
＋14、＋27、＋42および＋55日目に採取した血清につい
て、酵素結合免疫吸着検定（ELISA）を用い、抗−tbp−
2IgG抗体の存在を評価した。
図17aで説明したように行った試験から＋55日目に得
られたプール血液について、血清IgG抗体サブタイプ応
答プロフィルを図17bに示す。
モラクセラカタラーリスから得られたトランスフェリ
ン結合タンパク質（Tbp−２）により、鼻腔内（I.N.）
で免疫感作したマウスにおけるIgG血清抗体応答を図18
に示す。５匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパ
ーティクル中に取り込むか、またはPLGpSマイクロパー
ティクルと物理的に混合したTbp−２ ６μｇを含むpH
7.4のPBS10μＬまたは50μＬにより、１、28および43日
目に免疫感作した。＋14、＋27、＋42および＋55日目に
採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ELIS
A）を用い、抗−Tbp−2IgG抗体の存在を評価した。
種々の免疫感作プロトコルに従って、モラクセラカタ
ラーリスから得られたトランスフェリン結合タンパク質
（Tbp−２）により、非経口的に免疫感作されたモルモ
ットにおける血清IgG抗体応答を図19に示す。２匹のモ
ルモットからなる群を、１日目にCFA400μＬとともに製
剤化したTbp−２ ５μｇにより筋肉内で免疫感作し、
続いて、14および28日目にIFA500μＬ中で製造化したTb
p−２ 5.0μｇにより皮下で免疫感作するか、１、14お
よび28日目にAlum500μＬとともに製剤化したTbp−２
５μｇ、または１および28日目にPLGpSマイクロパーテ
ィクルに取りまれたTbp−２ ５μｇにより免疫感作し
た。＋40および＋56日目に採取した血清について、酵素
結合免疫吸着検定（ELISA）を用い、抗−Tbp−２ IgG
抗体の存在を評価した。
種々の免疫感作プロトコルに従って、ヘリコバクター
ピロリから得られた組換えタンパク質rUreaseにより、
皮下（S.C.）または経口（I.G.）で免疫感作されたマウ
スにおける血清IgG抗体サブタイプ応答を図20に示す。
８匹のマウスからなる群を、PLGpSマイクロパーティク
ルに取り込まれたrUrease10.0μｇ（S.C.）または40.0
μｇ（I.G.）、またはPLGpSマイクロパーティクルに取
り込まれたDC−Chol、CT−Ｘ、PCPPまたはLTの存在下で
製剤化されたrUrease10.0μｇ（S.C.）または40.0μｇ
（I.G.）を含むpH7.4のPBS250μＬにより、１、28およ
び56日目に免疫感作した。＋85日目に採取した血清につ
いて、酵素結合免疫吸着検定（ELISA）を用い、抗−rUr
easeIgG抗体の存在を評価した。
図20に記載したマウスについて、85日目のチャレンジ
後１カ月の防御試験の結果を図21aからｂに示す。rUrea
se活性（皮下または経口経路で免疫感作されたマウスに
ついて）は、マウスを致死させて24時間後に胃全体の1/
4（幽門洞＋胃体部）で測定した。
発明の詳細な説明 本発明の新規なポリマーは、生体内に存在し、細胞生
体付着基、マクロファージ刺激物質、ポリアミノ酸およ
びα−ヒドロキシ酸およびα−アミノ酸から選択される
少なくとも１つのスペーサー分子を介してポリマーと結
合するポリエチレングリコールなどの生物活性部分を有
する良性代謝物に対して生体適合性、分解性である。こ
のように、新規ポリマーは、官能基を有する。
生物活性物質を含むマイクロパーティクルへのプロセ
ッシングに有利な性質を有するポリマーの合成方法も説
明するが、生物活性標的基による化学的修飾も可能であ
る。
好ましい実施形態において、共重合体は、α−ヒドロ
キシ酸と疑似−α−アミノ酸の重合によって製造し、お
よびターポリマー（terpolymer）は、２つのα−ヒドロ
キシ酸と疑似−α−アミノ酸との重合によって製造す
る。次いで、この共重合体またはターポリマーは、遊離
アミノ基との直接の共有結合によるアミノ酸サブユニッ
トを介して生物活性標的配位子により誘導体とされ、さ
らに適当なスペーサー配位子で誘導化することができ
る。
アミノ酸単量体合成 通常、Ｎ−保護セリン（またはシステイン）は光延反
応（ref.5）により環化され、４員環ラクトン（または
チオラクトン）が得られる。
この変換は、エステル（またはチオエステル）結合を
生じる。反応条件に適合するアミノ酸前駆体のアミン部
分上の保護が重要である。カルボベンジルオキシ（CBZ
またはＺ）基を用いることが好ましいが、ベンジル（B
n）、パラ−メトキシベンジル（MeOBn）、ベンジルオキ
シメトキシ（BOM）、tert−ブチルオキシカルボニル
（ｔ−BOC）または［９−フルオレニルメチル）オキ
シ］カルボニル（FMOC）などの他の適当な官能基を用い
てもよい。
Ｎ−Ｚ−Ｌ−セリンβ−ラクトン単量体の合成は、文
献（ref.6）の改良法に基づいた。
単量体を含むα−ヒドロキシ酸およびアミノ酸の共重
合、およびアミノ酸側鎖の官能基化 α−ヒドロキシ酸単量体の共重合には２つの方法が利
用できる。重縮合を介する重合、または溶解（バルク重
合）による重合を選択することが可能である。
比較的低分子量の物質では、しばしば競争的副反応が
伴い、好ましくない副生成物が生じるため、縮合重合に
は問題のあることが長く知られていた（ref.7および
８）。
しかし、グリコリドおよびラクチドなどの環状２量体
のバルク相からの開環重合（ROP）が、様々な触媒の存
在下で容易に進行し、好ましくは、オクタン酸第一スズ
により高分子量のポリマーを与えることが分かった（re
f.9から15）。
ポリ（アミノ酸）（ref.16、17および18）または疑似
ポリ（アミノ酸）（ref.6および19）の調製には多くの
方法がある。
ポリ−α−ヒドロキシ酸（特に、50:50 D,L−ラクチ
ドおよびグリコリドのポリマー）およびポリ（アミノ
酸）のよく知られた生体内分解性の性質は、α−ヒドロ
キシ酸ポリマーのバックボーンにアミノ酸を取り込む方
法を開発しようとする努力の増加をもたらした（ref.20
から25）。
ラクチドまたはグリコシドなどのα−ヒドロキシ酸サ
ブユニット、およびグリシンまたはリジンなどのα−ア
ミノ酸サブユニットを含む共重合エステルアミドの製造
に進歩が見られた（ref.22,23および26）。
生体内分解性ポリマーの分解速度、およびグリコリ
ド、ラクチドのホモポリマーまたはこれらの物質の共重
合体からのカプセル充填された物質の放出速度は、結晶
性の程度、および相対的な疎水性または親水性の程度な
どといったそれらの分子量および構造に強く影響を受け
ることが分かった。具体的には、α−ヒドロキシ酸から
誘導された高分子量のポリマーから製剤化されたマイク
ロスフェアは、低分子量の類似体に比べ長時間かかって
分解する。同様に、高結晶性物質は、無定形類似体に比
べかなりゆっくりした速度で崩壊する。このことは、加
水分解に不安定なエステル結合への水の近づきやすさに
関連している（ref.27）。
50％のD,L−ラクチドおよび50％のグリコリドからな
るランダム無定形共重合体は、最も進んだ分解速度を示
すことが証明されており（ref.2および３）、PBS緩衝液
（pH＝7.4）中に浸けた場合、約６週間後に50重量％が
残存する。
前述の共重合エステルアミドは半結晶物質であり、カ
プセル充填された物質が完全に放出された後にも長い間
投与部位に滞留する心配もある。
カプセル充填された物質が完全に放出された時点また
は近い時点で分解するポリマーを手にすることは利点で
あると考え、疑似−α−アミノ酸サブユニットも含むタ
ーポリマーに等量のD,L−ラクチドおよびグリコリドを
ランダムに取り込む方法を開発した。無定形のターポリ
マーはフィルムおよびマイクロパーティクルへの加工に
十分な機械的強度を保持する一方で、満足のいくポリマ
ー分解速度および捕捉物質の放出速度を示すのではない
かということを確かめるために、相対的に中程度の分子
量のターポリマーを用いた。
Ｎ−保護−Ｌ−セリンラクトンは、エステル結合を含
み、エステル交換反応触媒を介して重合させることがで
きる（ref.6）。さらに、ラクチドおよびグリコリドな
どの６員環ラクトンは、挿入／配位型触媒／開始剤を用
いることにより４員環プロピオラクトンと共重合させる
ことができる（ref.13）。すべての単量体単位に比較的
十分な反応性が達成されるようであれば、Sn試薬から誘
導される触媒などの効率的エステル交換反応触媒が必要
となることが予想された。
オクタン酸第一スズが介在するグリコリド、D,L−ラ
クチドおよびＮ−Ｚ−Ｌ−セリンラクトンの共重合を用
いた。共重合体またはターポリマーのCBZ基の脱保護
は、様々な方法で行うことができる。固相触媒還元また
は酸触媒（ref.27）が、２つの可能性である（図１）。
得られた共重合体またはターポリマーは、図２に示す
ように、細胞付着性エピトープ、体循環のためのポリエ
チレングリコール（PEG）配位子、マクロファージ刺激
物質およびポリアミノ酸グラフトなどの標的部分を付け
加えることができる。例えば、α−ヒドロキシ酸または
疑似−α−アミノ酸ユニットなどのスペーサーユニット
を導入し、適当な標的ユニットで誘導化できる。このよ
うにして生成されたポリマーは、約5,000から約40,000
ダルトンの分子量を有する。
マイクロパーティクルの形成 本明細書中で用いるように、「マイクロパーティク
ル」という用語は、大きさが１ミクロンより大きく生物
活性物質の送達に用いる任意の粒子担体を意味する。本
明細書中で用いるように、「マイクロスフェア」という
用語は、１つまたは複数の活性成分（例えば、抗原、ア
ジュバント、プラスミドDNA）を含むマイクロパーティ
クルを意味する。
本明細書中に記載するマイクロパーティクル生成方法
を例示する流れ図を図３に示す。通常、共重合体（PL
G、PLGpZSまたはPLGpS）は、ジクロロメタン、酢酸エチ
ル、アセトンまたはその混合物などの適合する溶媒中に
単独で溶けるか、追加の賦形剤で可溶である。ショ糖、
マンノース、トレハロースまたはゼラチンなどの製剤化
に含まれる賦形剤は、凍結防止剤（cryoprotectant）ま
たは水解防止剤（lyoprotectant）として役立つ。BAY
R1−005（BAY）（ref.29）またはトリパルミトイルシス
テイン（TPC）（ref.30）または3b［Ｎ−（Ｎ′,N′−
ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロー
ル（DC−Chol）（ref.31）などの既知のアジュバント性
を有する他の物質を製剤中に用いてもよい。
全量12mLの１％から２％の共重合体溶液を調製するの
が好ましい。この溶液に、リン酸緩衝食塩水（PBS）800
μＬ、またはPBSまたは追加の賦形剤を含むことができ
る他の安定化緩衝液中の抗原溶液（通常１から2mg/mLの
濃度）800μＬを加える。ポリ［ジ（カルボキシラート
フェノキシ）−ホスファゼン］ナトリウム塩、（Virs
Research Institute、Cambridge MA）（PCPP）または
コレラトキシンまたはそのサブユニットなどの既知のア
ジュバント性を有する他の物質を製剤中に用いてもよ
い。次いで、この混合物を均質化して、油中水型乳剤を
生成する。生成したら直ちに、この混合物を、0.5％か
ら10.0％のポリビニルアルコール（PVA）、メチルセル
ロースまたはTriton Ｘ−100などの非イオン性乳剤安
定化剤を含む水溶液100mLに分散させる。この混合物を
均質化すると、水中油中水型二重乳剤が生成する。得ら
れた小滴の平均サイズおよび多分散性（polydispersit
y）は、Coulter LS−100光散乱検出器を用いることに
よって容易に測定することができる。PBSまたは抗原/PB
S混合物をカプセル充填するときの代表的なサイズ分布
は、１から20ミクロンの範囲にある（大部分が10ミクロ
ン未満のサイズ）。次いで、緩やかに温め、蒸発によっ
てゆっくりと溶媒を除去すると、始めのマイクロスフェ
アが固化する。溶媒を除去したら直ちに、混合物を遠心
分離してマイクロスフェアを集め、脱イオン水で繰り返
し洗浄して、残存する乳剤安定化剤を完全に除去する。
次いで、マイクロスフェアをドライアイス／アセトン中
で凍結し、一昼夜凍結乾燥すると、白色で自由に流動す
る粉末としてマイクロスフェアが得られる（光散乱測定
法による測定および走査型電子顕微鏡写真法によって直
接確認したサイズは通常1.0から12ミクロン）。
通常、この粒子は、約１から約50μＭの粒子径を有す
る重合性マトリックスを含み、その中には、捕捉された
生物活性物質、および場合によって一緒に捕捉されたア
ジュバントを有するポリマーを含む。重合性マトリック
スに導入される生物活性物質およびアジュバントの量
は、大きく異なり、全粒子塊の50重量％まで含むことが
できる。
本発明の様々な実施形態は、医療の分野および特に、
ワクチン接種、細菌およびウイルスを含む病原体による
感染症の診断および治療の分野で多くの応用が可能であ
ることは、当業者には明らかである。そのような使用に
ついての限定的でない説明を以下に行う。
ワクチン調製 ある実施形態において、例えば、ワクチンとして用い
るのに適当な免疫原性組成物は、本明細書中に開示する
マイクロパーティクルから調製することができる。生物
活性免疫原性物質を含む免疫原性組成物は、宿主による
抗体の産生を含む、投与された宿主による免疫応答を引
き起こす。
免疫原性組成物は、液体水剤または乳剤などの注射液
として調製することができる。マイクロパーティクル
は、マイクロパーティクルと適合する生理学的に許容可
能な賦形剤と混合することができる。賦形剤には、水、
食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールお
よびその組合せが含まれる。さらに、ワクチンは、ワク
チンの有効性を促進するために湿潤剤または乳化剤、pH
緩衝剤、またはアジュバントなどの追加の物質を含んで
もよい。ワクチンは、非経口で、皮下注射または筋肉内
注射により投与することができる。
あるいは、本発明により生成されたマイクロパーティ
クルを含む免疫原性組成物は、粘膜表面で免疫応答を引
き起こすような方法で送達することができる。したがっ
て、免疫原性組成物は、鼻内、経口（胃内）、頬側また
は直腸経路により、粘膜表面に投与することができる。
経口製剤には、医薬等級のサッカリン、セルロースおよ
び炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤が含ま
れる。
これらの組成物は、水剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプ
セル剤、徐放性製剤または散剤の形をとることができ
る。経口経路で投与された場合に、マイクロパーティク
ルおよびマイクロパーティクルのコア中に含まれる、ま
たはマイクロパーティクルと物理的に混合されてカプセ
ル充填された物質を胃の酸性から守るために、マイクロ
パーティクルの投与前、投与と同時、または投与直後に
酸中和調製物（重炭酸ナトリウム調製物など）を投与す
ると有利である。
ワクチンは、剤形に適合した方法で、治療上有効で、
防御的および免疫原性となるような量で投与する。投与
される量は、治療を受ける対象、例えば、抗体を合成
し、必要ならば、細胞媒介性の免疫応答を生み出すとい
う対象の免疫システムの能力によって決まる。投与する
必要のある生物活性を有するマイクロパーティクルおよ
び物質の正確な量は、専門家の判断によって決まる。し
かし、適当な投与量範囲は当業者によって容易に決定可
能であり、数マイクログラムから数ミリグラム程度でよ
い。初回投与および追加免疫投与の適当な処方も変化す
るが、初回投与と、それに続く投与を含むことができ
る。ワクチンの用法は投与経路で決まるが、ある宿主か
ら他の宿主へと変化する。
ワクチン製剤化に応用される本発明のポリマーは、DN
AまたはアンチセンスRNAなどを用いるワクチン戦略にと
っても有用である。マイクロパーティクル担体として、
本発明のポリマーは、コアタンパク質またはエンベロー
プタンパク質などのウイルスの抗原部分のある遺伝子ま
たは複数の遺伝子をコードするDNAを含むように調製す
ることができる。DNAが担体から放出されるにしたがっ
て、宿主細胞は異種DNAを取り込み、問題の遺伝子を発
現し、細胞内で対応するウイルスタンパク質を合成す
る。有利には、ウイルスタンパク質は、細胞媒介性免疫
を引き起こす細胞の主要組織適合性複合体経路に入る。
これに比べ、標準的なワクチン抗原は、細胞に取り込ま
れ、抗体応答を刺激するMHC IIクラスシステムによって
処理される。
DNAは、すべての関連タンパク質を持たず、複合体ベ
クターシステムを必要としない裸のDNAの形でよい。所
望の遺伝子は、本命書中に記載のマイクロパーティクル
中にカプセル充填されたプラスミドなどのベクターに挿
入され、哺乳動物の組織中に注射されて遺伝子産生を発
現し、免疫応答を引き起こすことができる。
本発明のポリマーと組合せてアンチセンスオリゴヌク
レオチドを用いることもできる。核酸配列は、タンパク
質の産生を阻害する既知のタンパク質に具体的に対応す
るmRNA配列に結合するようにデザインすることができ
る。本明細書中に記載するマイクロパーティクルを用
い、様々な免疫学的疾患ならびに高血圧、心血管疾患お
よびガンの治療に対する医療戦略としてこのようなアン
チセンスヌクレオチド（オリゴヌクレオチドまたは発現
したヌクレオチド）を送達することができる。
本明細書中で開発したポリマー・マイクロパーティク
ルの徐放性の特徴は、マイクロパーティクルを用いて薬
理学的試剤をゆっくりと連続的に送達するような薬理学
の分野における用途も有する。血圧降下剤、鎮痛剤、ス
テロイド剤および抗生物質などの広範な薬物を本発明に
よって使用し、徐放薬物送達システムを得ることができ
る。
捕捉または物理的に混合された生物学的試剤を有する
フィルム型のポリマーには、外科的移植組織および器具
のコーティングとしての用途を持つ。例えば、マイクロ
パーティクルに取り込まれた抗生物質を有するフィルム
状のポリマーを用いて外科的に埋め込まれたカテーテル
を被覆し、感染と闘う抗生物質を継続的に徐放すること
ができる。
マイクロパーティクル担体は、診断試薬としても有用
である。適当な抗体とともに、イメージング試薬をマイ
クロパーティクルに導入することができる。このように
して、患者の臨床的経過を確認またはモニターするため
に罹患組織を標的とし、これをイメージすることができ
る。
マイクロパーティクルとしてのポリマーは、適当な抗
体と組み合わせて用いれば診断キットとしての用途も持
つ。
実施例 前述の開示は本発明を一般的に説明するものである。
以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全
な理解を得ることができる。これらの実施例は、単に例
示目的で記載するものであり、本発明の範囲を限定する
ことを意図していない。付随的な事柄が手段を示唆ある
いは伝えることもあるため、変形形態および等価形態の
置き換えを企図している。本明細書中で特定の用語を用
いたが、このような用語は、説明を意図したもので、限
定を目的としたものではない。
本開示中で用いるが明確に説明していない化学、有機
化学、ポリマー化学、タンパク質生化学および免疫学の
方法、およびこれらの実施例は、科学文献に詳しく報告
されており、当業者の能力に含まれるものである。
実施例1: この実施例は、Ｎ−Ｚ−Ｌ−セリンβ−ラクトンの調
製を例示する。
このＮ−保護アミノ酸ラクトンの調製は、改良法に基
づくもので、Ｎ−保護−α−アミノ酸を反応させて、環
化した疑似−α−アミノ酸単量体を得る（ref.6）。す
べてのガラス器具は、120℃に設定したオーブン中で一
昼夜予備乾燥する。使用に先立って、真空デシケータ中
で冷却し、乾燥窒素流中10分間通気する。
1Lの３頸丸底フラスコに、窒素中でトリフェニルホス
フィン（TPP;Aldrich;7.87mL;50mmol;FW:174.16）を加
えた。これに、無水アセトニトリル（CH3CN;Aldrich）
および無水テトラヒドロフラン（THF;Aldrich）溶液
（体積比85:15）200mLを注射器で加え、固体TPPが溶け
るまで撹拌した。この溶液に、アゾジカルボン酸ジエチ
ル（DEAD;Aldrich;7.87mL;50mmol;FW:262.29）を注射器
で加え、溶液を室温で30分間撹拌した。反応溶液をアセ
トニトリル／ドライアイス浴に浸けて溶液を約−45℃か
ら−48℃まで冷却した。溶液の内温が約−45℃に達した
ら直ちに、Ｎ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−セリン（Ｎ
−CBZ−Ｌ−セリン;Sigma;11.94g;49.8mmol;FW:239.2）
の無水CH3CN:THF（体積比85:15）200mL溶液を注射器に
より１時間以上かけてゆっくり滴下した。添加中は溶液
の温度を約−45℃に維持し、添加が終了すると同時に室
温までゆっくりと温め、一昼夜撹拌を継続した。この反
応で、CBZ保護α−アミノ基の存在下に、セリンヒドロ
キシ側鎖とカルボン酸の間にエステル結合の生成が起き
る。反応完了後、蒸発により溶媒を除去した（35℃から
45℃）。黄色の油／スラリ（〜35g）が得られる。この
スラリに、ジクロロメタン：酢酸エチル（体積比85:1
5）溶液50mLを加えると、副生成物の1,2−ジカルベトキ
シヒドラジンの沈殿が生じる。この物質を減圧ろ過によ
り除去し、続いて、蒸発により溶媒を除去した。前記手
順を繰り返し、残存する副生成物をさらに除去すること
ができる。次いで、ろう状固体の粗生成物を、溶離液と
して85:15ジクロロメタン：酢酸エチルを用いてシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィで精製した。生成物のセリ
ンラクトンは、薄層クロマトグラフィにより、1MH2SO4
溶液による発色およびUV検出した場合に、この物質が8
5:15ジクロロメタン：酢酸エチルで展開するシリカゲル
プレート上で0.75のRfを有することが確認できる。この
生成物を酢酸エチル：ヘキサン（〜1L）で再結晶し、ろ
過して真空乾燥した。
再結晶後、融点（Tm＝133〜134℃）の純粋な白色の固
体が40％の収率で得られ、他のすべての物理パラメータ
（NMR、IR、質量分析法、元素分析）は従来明らかにさ
れたものと一致する（ref.6）。
実施例2: 本実施例は、図１に示すポリ−D,L−ラクチド・グリ
コリド・疑似−Ｚ−セリンエステル（PLGpZS）共重合体
の調製を例示する。
ガラス製器具は一昼夜予備乾燥した。使用に先立っ
て、真空デシケータ中で冷却した。さらに、重合容器
（ガラスアンプル）はシリコン被覆（SurfaSil;Pierce;
2％トルエン溶液）されなければならず、すべての転移
反応および重合容器への試薬類および単量体の添加は、
乾燥窒素環境に保持されたグローブ・ボックス中で行わ
なければならない。
重合に先立ち、D,L−ラクチド（2,6−ジメチル−1,4
−ジオキサン−2,5−ジオン;Aldrich;FW:144.13）およ
びグリコリド（Boehringer Ingelheim;FW:116.096）
を、グローブ・ボックス中で無水酢酸エチルから再結晶
し、約２日間真空で乾燥した。十分乾燥したら直ちに、
直接グローブ・ボックスに入れた実施例１の新たに再結
晶したセリンラクトン（０℃で保存）とともに単量体を
グローブ・ボックス中に保存できる。すべての単量体お
よび触媒／開始剤を秤量し、グローブ・ボックス中のガ
ラスアンプルに移す。
アンプルに移す単量体の総量は1gから5gの範囲であ
り、D,L−ラクチド：グリコリド：セリンラクトンのモ
ル比は42.5:42.5:15.0から49.0:49.0:2.0の範囲であ
る。好ましい実施形態においては、D,L−ラクチド：グ
リコリド：セリンラクトンのモル比、47.5:47.5:5.0を
用いた。触媒（２−エチルヘキサン酸第一スズ（Sn（Oc
t）2;Sigma;FW:405.1、1.25g/mL）の無水クロロホルム
（Aldrich）保存溶液をグローブ・ボックス中で調製
し、マイクロシリンジでガラスアンプルに加えた（触媒
の単量体に対するモル比＝1/1000）。アンプル中に撹拌
棒を置いた。グリースを付けたすりガラスのジョイント
バルブをアンプル上に置き、グローブ・ボックスから取
り出している間の不活性環境を維持した。次いで、アン
プルを直接真空ラインにつなげ、蒸発によりクロロホル
ムをゆっくりと除去した。次いで、アンプルを約120℃
の油浴中においてすべての試薬を溶融状態とし、続い
て、火炎密封して、120℃に温度制御されたオーブン中
に28時間置いた。反応後、アンプルを液体窒素中に入れ
てクエンチし、さらに処理するまで−20℃で保存する。
アンプルにひびを入れ、粗製ポリマーをクロロホルムに
溶かして回収した。溶媒を蒸発により除去し、新製ポリ
マーを真空乾燥すると、黄褐色の結晶性物質が得られた
（収率は80％から90％）。
このポリマーをクロロホルムに溶かし、不溶の物質を
ろ過により除き、ヘキサン（Aldrich）で沈殿させるこ
とにより精製した。ポリマーをろ過して回収し、この手
順を繰り返して、未反応単量体が完全に除去されたこと
を確認した。２回の沈殿操作の後、ポリマーを約２日間
真空乾燥すると、全収率30％から35％で純粋な白色の粉
末が得られた。この物質の分子量は、反応時間に左右さ
れたが、代表的な値はMw＝17,000〜22,000、Mn＝6,500
〜8,000であった。示差走査熱量計（DSC）分析は、ラン
ダム無定形ポリマーを示す単一の転移を移す。ガラス転
移（Tg）は得られた物質の分子量により39℃から43℃の
範囲にある。ポリマーのセリン含有量は、ポリマーの加
水分解によって得られたフェニルチオイソシアネートセ
リン誘導体の測定に役立つアミノ酸分析（AAA）、1H N
MR（グリコリドおよびD,L−ラクチドサブユニットに対
するセリンCBZ保護基の芳香族残基の積算）、および元
素分析（セリンの側鎖にのみ存在する窒素）により決定
した。AAA分析は、通常1.7％から2.1％セリン含有量を
示し、1H NMRは、2.0％から2.5％、元素分析は、2.4％
から3.4％のセリンをそれぞれ示した。ポリマーのIR分
析は、エステル、カーバメートおよびヒドロキシ基の存
在を調べるのに役立った。
1H NMRは、記載した反応条件下におけるすべての単
量体成分の相対的取り込み効率の決定を可能にした。精
製ポリマーで測定されたD,L−ラクチド：グリコリド:Z
−セリンの代表的な比は、再現性よく、それぞれD,L−
ラクチド52.0％から54.0％、グリコリド41.0％から43.5
％、Ｚ−セリン2.0％から2.5％であった。
グリコリドまたはD,L−ラクチドに独特の共鳴1H NMR
および13C NMRシグナル強度は、互いと良く分離し、配
列効果にも感度がよかった。観測されたパターンから、
ランダム配列分布が支持された。
実施例3: 本実施例は、図１に示すポリ−D,L−ラクチド・グリ
コリド・疑似−セリンエステル（PLGpS）共重合体の調
製を例示する。
すべてのガラス製器具は、一昼夜予備乾燥した。使用
に先立って、真空デシケータ中で冷却し、乾燥窒素流で
10分間通気した。すべての反応は乾燥窒素の不活性雰囲
気中で行った。
撹拌棒を備えた２頸の100mL丸底フラスコにポリマー
（PLGpZS）400mgを入れた。これに、臭化水素の30％酢
酸溶液（Aldrich;FW:80.92）10mLを加え、十分にスラリ
を生成させた。このスラリを30から45分間撹拌し、無水
ジエチルエーテル（Aldrich）と、続いて、無水メタノ
ール（Aldrich）を滴下してクエンチした。その結果、
ポリマー沈殿が生じ、次いで、真空ろ過により単離し
た。粗製のポリマー沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、
クロロホルム：ヘキサンから再沈殿させた。精製ポリマ
ーを２日間真空乾燥すると、全収率50％から60％で純粋
な白色の粉末が得られた。分子量は、Mw＝15,000〜18,0
00、Mn＝5,000〜6,500の範囲にあった。CBZ基の脱保護
速度は、HBr/酢酸によるエステルバックボーンの競争的
開裂より速かった。しかし、これらの条件の下では、こ
の試薬を用いた結果として、分子量分布の広がり、およ
び生成物の分子量の減少がある。この傾向は、より短時
間で反応を行うことによって低減され、またはパラジウ
ム炭素の存在下、水素を用いる水素添加による保護基の
除去によりこの傾向を無くすことができる。DSC分析
は、ランダム無定形ポリマーを示す単一転移を示す。ガ
ラス転移（Tg）は得られた物質の分子量により42℃から
45℃の範囲にある。ポリマーのセリン含有量は、ポリマ
ーの加水分解によって得られたフェニルチオイソシアネ
ートセリン誘導体の検出に役立つアミノ酸分析（AAA）
および元素分析（セリンの側鎖にのみ存在する窒素）に
より決定した。AAA分析は、通常1.4％から1.7％のセリ
ン含有量を示し、元素分析は、2.0％から2.7％のセリン
をそれぞれ示した。ポリマーのIR分析は、エステル、ア
ミンおよびヒドロキシル基の存在を検出するのに役立っ
た。
残存する保護ポリマーについての1H NMRは、90％以
上のＮ−カルボベンジルオキシ基がうまく除去されたこ
とを示した。より短い反応時間では、脱保護の含有量は
並行して減少する。精製ポリマーで測定されたD,L−ラ
クチド：グリコリド:Z−セリン：セリンの代表的な比
は、再現性よく、それぞれD,L−ラクチド53.0％から55.
0％、グリコリド40.0％から43.0％、Ｚ−セリン0.15％
から0.25％およびセリン1.7％から2.1％であった。
実施例4: 本実施例は、実施例２および３において合成されたコ
ポリマーからのフィルムの生成を説明する。
フィルムを生成するために、50mgのポリ−D,L−ラク
チド−コ−グリコリド（PLG）（分子量＝31,000）、ポ
リ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド−コ−シュード−
Ｚ−セリンエステル（PLGpZS）（分子量＝20,000）、ポ
リ−D,L−ラクチド−コ−グリコリド−コ−シュード−
セリンエステル（PLGpS）（分子量＝19,000）を秤量
し、10mLビーカー中に置いた。無水クロロホルム（1m
L）を添加して、コポリマーを溶解した。この溶液を濾
過し、ペトリディシュ中に置いた顕微鏡スライドに滴下
して添加した。次いで、ペトリディッシュを250mLビー
カーで覆い、48時間にわたり、ゆっくりと確実にエバポ
レーションさせた。得られたフィルムは半透明であり、
そして角度測定器を用いて行った接触角の測定はそれぞ
れ、PLGについて75゜、PLGpZSについて75゜、PLGpSにつ
いて68.2゜の平均値を与えた。従って、PLGおよびPLGpZ
Sコポリマーは疎水性が同等であるが、PLGpsコポリマー
はわずかに親水性が高く、表面エネルギーも高いことが
判明した。
実施例5: 本実施例は、PBSまたは抗原/PBSをカプセル化する粒
子形成のプロセスを説明する（ミクロスフェア形成）。
本明細書中に記載される微粒子形成のプロセスを説明す
る流れ図を図３に示す。
具体的には、100mgのコポリマーを、12mLのジクロロ
メタンに添加した。これに、800μＬのリン酸緩衝化生
理食塩水（PBS）溶液または800μＬの、PBS中の非タン
パク質分解性Hin−47アナログ（典型的に、１〜2mg/mL
の濃度）を添加した。次いで、この混合物をホモナイズ
した（6,000rpmで20秒間）。この混合物を、形成後、10
0mLのポリビニルアルコール（PVA）の1.0％水溶液中に
分散し、そして即座にホモジナイズして（8,000rpmで40
秒間）、水中油中水の二重乳濁液を形成した。PBSまた
は典型的な抗原（Hin−47/PBS）をカプセル化物として
使用する場合の典型的なサイズ分布を、図４を示す。多
分散系の微粒子（部分が、10ミクロン未満の大きさ）
が、これらの条件下で形成された。次いで、エバポレー
ションにより溶媒をゆっくりと除去し、ミクロスフェア
を遠心分離によって回収した。粒子を脱イオン水で洗浄
し（５×）、次いでドライアイス／アセトン浴中で凍結
し、そして一晩凍結乾燥して、ミクロスフェアの白色の
自由に流動する粉末を得た（光走査測定によって決定さ
れ、走査電子顕微鏡検査によって直接的に確認されるよ
うに、典型的には、1.5〜10ミクロンのサイズ）。PLGpZ
SまたはPLGpSミクロスフェアについての代表的な走査電
子顕微鏡写真を、図５に示す。PBS中の典型的な抗原
（非タンパク質分解性のHin−47アナログ）をカプセル
化する、PLGpZSまたはPLGpSミクロスフェアについての
代表的な走査電子顕微鏡写真を、図６に示す。
上記の方法によって、いくつかの異なる抗原および／
または抗原＋アジュバントを含む微粒子が調製された
（表１および５を参照のこと）。
実施例6: この実施例は、微粒子コアローティング効率、および
このような微粒子からの抗原エピトープの回復を説明す
る。
同じ方法の２つの改変を用いて、単離された微粒子の
抗原含量または「コアローディング」を測定した。アミ
ノ酸解析を、固体粒子の酸加水分解（6M HCl）による
か、または塩基/SDS加水分解（0.1N NaOH/1％SDS）のい
ずれかによって、次いで0.1N HClでの中和化によって、
得られた微粒子の加水分解物に対して行った。あるい
は、固体のミクロスフェアは、DMSO（ポリマーおよびタ
ンパク質の両方を可溶化する相溶性の溶媒）中に溶解す
ることができ、アミノ酸解析を、凍結乾燥されたサンプ
ルに対して直接行うことができる。酸または塩基媒介性
の加水分解は、最も再現可能な結果（＋／− 5％）を与
える好ましい方法であることを証明した。利用可能な場
合、有効な固相酵素免疫検定法（ELISA）ポリクローナ
ルアッセイが加水分解物に対して行われ、エピトープ当
量を決定した。
具体的には、ELISAによる非タンパク質分解性Hin−47
アナログの定量について、非タンパク質分解性Hin−47
アナログ抗原を、アフィニティー精製したモルモット抗
Hin−47が被覆されたマイクロタイターウェル上に捕獲
し（ウエル当たり非タンパク質分解性Hin−47アナログ
抗原の２μg/mL溶液の50μＬを添加した）、これをPBS
中の５％スキムミルクでブロックした。抗原の呈示を、
アフィニティー精製したウサギ抗Hin−47、次いで西洋
ワサビペルオキシダーゼＦ（abs）２、ロバ抗ウサギIgG
によって検出した。テトラメチルベンジジン（TMB）
（割合１）の存在下の基質H2O2（割合９）を100μＬ添
加して、この反応を呈色し、そして2M硫酸溶液を各ウエ
ルに添加することによって、反応の進行を終結した。色
の強度（450nmでの読取り）は、ウエルにおける非タン
パク質分解性Hin−47アナログの量に正比例した。各試
験サンプルにおける非タンパク質分解性Hin−47アナロ
グの濃度は、参照サンプルの倍数希釈によって得られる
標準曲線からの外挿によって得られた、全てのサンプル
を、二連で分析した。
PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内に非タンパク
質分解性Hin−47アナログまたは非タンパク質分解性Hin
−47アナログ＋BAY R1−005をカプセル化する微粒子に
対するエピトープ回復の、コアローディングについての
アミノ酸解析、およびHin−47特異的ポリクローナルELI
SA分析を、表２に示す。Hin−47から単独で調製された
微粒子についてのコアローディングは、20％〜43％の範
囲であり、10％〜31％のエピトープが、処方の間に保存
された。BAY R1−005の存在下で非タンパク質分解性Hin
−47アナログから調製された微粒子についてのコアロー
ディングは、26％〜59％の範囲（６％〜16％の絶対増
加）であり、20％〜39％（４％〜18％の絶対増加）のエ
ピトープが、処方の間に保存された。従って、BAY R1−
005の存在下での処方は、付随して、ローディング効率
を増加し、エピトープを保護するために作用する。
PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内にrD−15をカ
プセル化する微粒子についてのコアローディングのアミ
ノ酸解析を、表３に示す。39％〜44％の範囲のコアロー
ディングが得られた。このタンパク質は、膜由来であ
り、従って、以前の実施例の非タンパク質分解性Hin−4
7アナログよりも疎水性である。この抗原を使用する場
合、実施例10の非タンパク質分解性Hin−47アナログに
対して増加されたカプセル化効率が、常に観察された。
PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内に、非タンパ
ク質分解性Hin−47アナログとrD−15とのカクテル（1:1
のカクテル）をカプセル化する微粒子に対する、コアロ
ーディングについてのアミノ酸解析、およびエピトープ
回復を、表３に示す。rD−15の存在下での非タンパク質
分解性Hin−47アナログの同時カプセル化は、より高い
全体のローディング効率を生じることが予測された。35
％〜62％の範囲のコアローディングが得られ、８％〜26
％の、非タンパク質分解性Hin−47アナログを使用たエ
ピトープが、処方の間保存された。PLGpZSまたはPLGpS
コポリマーで処方される場合、より親水性の成分（非タ
ンパク質分解性Hin−47アナログ）の全体のローディン
グ効率は、rD−15との同時カプセル化によって増加され
た。PLGを使用した場合、この効果は観察されなかっ
た。コポリマー処方に関係なく、実施例10と比較して、
類似の非タンパク質分解性Hin−47アナログのエピトー
プ回復が得られた。
PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリ−マー内に、Flu X
−31またはFlu X−31＋BAY R1−005をカプセル化する微
粒子についての、コアローディングのアミノ酸解析を、
表４に示す。26％〜40％の範囲のコアローディングが、
Flu X−31で得られ、そしてBAY R1−005の存在下のFlu
X−31については、31％〜953％の範囲のコアローディン
グが得られた。従って、５％〜13％の絶対増加が、BAY
R1−005の存在下で処方した場合に得られた。唯一の例
外は、BAY R1−005およびPLGpSとのFlu X−31の処方で
あり、ここでは９％の絶対減少を観察した。
Flu A−Texasをカプセル化するPLGpS微粒子について
の21％コアローディングが得られた。BAY R1−005の存
在下でFlu A−Texasをカプセル化するPLGps微粒子につ
いて、32％のコアローディングが得られた。
Fluの異なる系統（Ａ−Texas）を、BAY R1−005およ
びPLGpSコポリマーとともに用いた場合、カプセル化効
率を増加する傾向がまた観察された。BAY R1−005の存
在下でFlu A−TexasとともにPLGpSを処方する場合、11
％の絶対増加が得られた。これは、BAY R1−005の存在
下でのPLGpSおよびタンパク質についての処方は、各場
合において最適化されなくてはならなことを示唆する。
実施例10におけるように、コアジュバントのBAY R1−00
5の添加は、より高いローディング効率を生じた。
PLGpsコポリマー内にFlu（３価）ワクチンまたはFlu
（３価）ワクチンと、BAY R1−005、DC−Chol、またはP
CPPとをカプセル化する微粒子についての、コアローデ
ィングのアミノ酸解析を、表６に示す。72％〜104％の
範囲の非常に優れたコアローディング効率は、実施例５
の手順を使用して得られた。カプセル化率における改良
は、至適な濃度のタンパク質が使用されて主な乳濁液が
形成される場合に視察される、一般的な結果である。こ
の場合において、至適な濃度は約0.5mg/mLであること
が、実験的に決定された。
コポリマー内に、rUrease、またはrUrease＋DC−Cho
l、PCPP、もしくはCT−Ｘをカプセル化する微粒子に対
するエピトープ回復の、コアローディングについてのア
ミノ酸解析、およびrUrease特異的ポリクローナルELISA
分析を、表７に示す。エピトープ回復は、アミノ酸解析
によって得られる全タンパク質と、ポリクローナルELIS
Aによって得られる全タンパク質との差として規定さ
れ、パーセントで表現される。rUreaseから単独で調製
された微粒子についてのコアローディングは約46％であ
り、約72％のエピトープが、処方の間に回復された。同
様に、DC−Cholの存在下でrUreaseから調製される微粒
子についてのコアローディングは約44％であり、約69％
のエピトープが回復された。わずかに高い全タンパク質
が、PCPPの存在下でrUreaseから調製された微粒子につ
いて確定された。67％のコアローディングおよび約55％
のエピトープ回復が、この組み合わせについて観察され
た。rUreaseおよびCT−Ｘの両方がこの値に寄与するの
で、rUrease/CT−Ｘの組合せに関しては、rUreaseにつ
いての全体のコアローディングは、アミノ酸解析によっ
て評価することができなかった。CT−Ｘについてのポリ
クローナルELISAアッセイを創出し、微粒子加水分解物
を、全体のrUreaseおよびCT−Ｘのそれぞれについて、
アッセイした。rUreaseについて53％の、およびCT−Ｘ
について59％のエピトープ回復が、それぞれ見出され
た。これらの微粒子加水分解物に対して行われたSDS−P
AGEおよびウェスタンブロットによって、非分解のrUrea
seおよびCT−Ｘの存在が確認された。
rUreaseについてのポリクローナルELISAアッセイが、
DC−CholおよびPCPPのような付加物によって影響されな
かったことを確認するために、適切なコントロール試験
を行った。PCPPの場合、アッセイは、しばしば問題があ
り、一定ではなかった。DC−Cholの存在下でrUreaseを
アッセイした場合は、同様な問題はなにも見出されなか
った。
実施例7: この実施例は、PLG（比較の目的のためにコントロー
ルとして使用した）および合成されたコポリマーPLGpZS
およびPLGps内にカプセル化された、モデル抗原（非タ
ンパク質分解性Hin−47アナログ）についてのインビト
ロ放出速度、およびタンパク質の全体の累積回復％を説
明する。
抗原を含有するミクロスフェア内に処方されたPLG
は、分子量＝26,000であり、50:50の割合のD,L−ラクチ
ド：グリコリドを有することが確定された。この物質
は、実施例２および３のコポリマーPLGpZSおよびPLGpS
について得られたものに、構成および分子量が類似す
る。典型的な実験において、14mgのミクロスフェア（ミ
クロスフェア加水分解物のアミノ酸分析によって確定さ
れるように、非タンパク質分解性Hin−47アナログのコ
アローディングは、PLGについて2.8μg/mg、PLGpZSにつ
いて5.7μg/mg、およびPLGpSについて2.5μg/mg）を、2
mLのエッペンドルフチューブ中に置き、これに1.0mLのP
BS（pH＝7.4）を添加した。次いで、37℃に維持した熱
調節化オーブンに、攪拌しないでチューブを置いた。種
々の時間間隔で、PBS溶液を抽出して、そしてアミノ酸
解析により、全タンパク質について分析した。各抽出
後、PBS溶液は、最大90日まで、連続してサンプリング
と置き換えられた。コントロール実験において、PLGま
たはPLGpSコポリマーから調製された大部分のミクロス
フェア（80重量％を超える）が、45日目までに消滅し
た。PLGpZSコポリマーから処方された、ミクロスフェア
の分解は、いくらか遅延され、本質的に同じ程度まで侵
食されるまでに60日を要した。
各群の微粒子で同様の抗原放出傾向が観察され、ここ
では少量のタンパク質が、最初の数日にわたって放出さ
れた。これは、14日目までに、抽出できない限界近くま
で減少し、これ以後、タンパク質放出速度は、約30日目
での最大値まで、着実に増加した。この時点以後、タン
パク質の放出は、再び検出の限界に近接するレベルにな
った。これらのサンプルからのタンパク質の全体の累積
回復％は、各群のミクロスフェアのそれぞれのコアロー
ディングに関して、40％〜65％の範囲であった。
図7Aは、各サンプルについての特定の時点での放出速
度を説明し、および図7Bは、試験した各サンプルについ
ての累積放出％を示す。これらの条件下で、ミクロスフ
ェアからのタンパク質の最も良好な回復は、PLGpS/PLG/
PLGpZSの順であるが、PLGpZS微粒子のコアローディング
は、PLGまたはPLGpSアナログのコアローディングの約２
倍であり、これは放出速度を影響し得る。さらに、この
マトリクスは、より遅延された速度で分解されることが
示され、従って、微粒子内に残留物質が存在し得る。こ
のことについての証拠は、図7Bにおいて見ることがで
き、これによってタンパク質回復の限界増加が、PLGpZS
微粒子について、60日目〜90日目に観察された。この同
じ時間間隔にわたって、PLGまたはPLGpS微粒子から回復
されたタンパク質は、本質的に存在しなかった。
コントロール実験において、37℃でインキュベートさ
れた、PLG、PLGpZS、またはPLGpS微粒子を負荷されたPB
Sの定期的な抽出物から得られたPBSの上清溶液を、pH変
化についてモニターした。PLGAマトリクスについての侵
食プロセスには、微粒子内のpH微環境の変化が伴うこと
が知られている（参考文献36）。これらの変化の結果と
して、pH誘導性の構造変化が生じ得るので、これはタン
パク質の安定性に対して重大な影響を有し得る。これら
の変化の大きさの指標は、周囲の媒体のpHをモニターす
ることによって得ることができる。本発明者らは、コポ
リマー内の小さなパーセントのアミノ酸サブユニットの
取込みが、このプロセスを遅延し得ることを見出した。
このことは、酸性pHに感受性であるタンパク質の放出期
に重要である。具体的には、1.2mLのPBS緩衝液（pH＝7.
4）中の〜10mgの微粒子をインキュベートする場合、PLG
（分子＝26,000ダルトン）の上清抽出物が、pH5.0化に
なるために、約16日間を必要とする。類似して、PLGpZS
（分子量＝20,000ダルトン、約2,0％のセリンを混
入）、またはPLGpS（分子量＝18,000ダルトン、約1.7％
のセリンを混入）から得られた上清抽出物のpHは、それ
ぞれ、約5.5〜6.2であると確定された。この研究におい
て試験されたPLGおよびPLGpSについての分解速度は同様
であったが（マトリクスの質量損失によって測定され
る）、PLGpSマトリクスの分解速度は減少した。
従って、インビトロ放出研究は、単一用量の遅延され
た放出送達系が、PLGpZSまたはPLGpSコポリマーから処
方されたポリマーの微粒子の使用により達成され得るこ
とを実証する。さらに、マトリクス侵食を伴うpH変化
は、タンパク質安定性に対する有害な影響を有し得るの
で、偽生理食塩水エステル（例えば、PLGpZSまたはPLGp
S）に由来するマトリクス（ここではタンパク質放出期
のこれらの変化について、いくらかの緩衝能力が存在す
る）を使用することが有利である。
実施例8: 本実施例では、微粒子でカプセル化または微粒子と物
理的に混合した非蛋白分解性Hin−47類似体をマウスに
皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。
本発明にしたがって形成させたPLG、PLGpZSおよびPLG
pS微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Hin−47類似体を試
験するために、以下の量の抗原をPBS（pH7.4）250μＬ
に溶解させ、試験１日および試験35日目に６〜８週齢の
BALB/c系マウス（Charles River Breeding LaboraTo
ries,Wilmington,MA）雌１群５匹に皮下（S.C.）免疫投
与した：実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Hi
n−47類似体0.2μｇまたは0.6μｇを含むPLG、PLGpZSお
よびPLGpS微粒子（図8A）、および実施例５にしたがっ
て調製し、非蛋白分解性Hin−47類似体0.8μｇまたは2.
5μｇと物理的に混合したPLG微粒子（図8B）。
カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体を含む微
粒子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合
した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化また
は行動の変化は認められなかった。試験＋10、＋24、＋
35、＋45および＋60日に血清を採取し、抗原特異性ELIS
Aを用い、抗Hin−47IgG抗体の有無を評価した。試料
は、全て２回分析した。0.2μg/mLの非蛋白分解性Hin−
47類似体を含む0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH9.0）
100μＬをミクロタイタープレートのウエルに添加し、
室温で１夜インキュベーションした。PBS＋0.05％Tween
20（機能上、洗浄緩衝液と定義する）でプレートを洗浄
した。ウエルに５％スキムミルク200μＬ（機能上、ブ
ロッキング緩衝液と定義する）を加えて、インキュベー
ションした。PBS＋0.05％Tween20で洗浄した後、ブロッ
キング緩衝液で逐次希釈した試料100μＬをウェルに添
加し、37℃で１時間インキュベーションした。ウェルを
PBS＋0.05％Tween20で洗浄し、HRP−共役抗体（ヤギ抗
マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）（Jackson）、ヒツジ抗マウスIgG1
（Serotec），ヤギ抗マウスIgG2a（Caltag）またはヤギ
抗マウスIgG2b（Caltag））を加えたブロッキング緩衝
液100μＬを各ウエルに添加した。37℃で１時間インキ
ュベーションした後、PBS＋0.05％Tween20でウエルを５
回洗浄した、新たに調製した発色用基質〔H2O29部およ
びTMB1部〕を各ウエルに添加した。暗黒下の室温で５分
間インキュベーションした後、2M H2SO4溶液50μＬを
添加して反応を停止させ、ミクロプレートリーダーを用
いて各ウェル中の液体の吸光度を450nmで測定した。正
常なマウスのプール血清を用いて、分析における吸光度
のベースラインを確定した。陽性対照として、高度免疫
性マウスのHin−47抗血清を用いた。陰性対照として、
免疫投与前血清を用いた。
血清IgAの分析は、上記の方法を以下のように改良し
て行った。1.3μg/mLの非蛋白分解Hin−47類似体を含む
0.05M炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH＝9.0）100μＬをミ
クロタイタープレートのウェルに注入して、室温で１夜
インキュベーションし、0.06μg/mLのウサギのH R B接
合抗マウスIgA（ZYMED、CA）100μＬを各ウェルに添加
した。
分泌型IgAの分析は、上記の方法を以下のように改良
して行った。0.06μg/mLのラットのHRP共役抗マウスIgA
（Biotin−Pharmigen）100μＬを各ウエルに添加した。
免疫投与後の血清抗体の力価を図8Aおよび8Bに示す。
免疫投与の結果から、PLGまたはPLGpS微粒子（図8A）に
捕捉させた抗原を免疫システムに提供すると、可溶性抗
原単独の場合に要求される最適用量以下で、可溶性抗原
に比較して免疫原性が高くなることが認められた。さら
に、投与量0.2μｇまたは0.6μｇのカプセル化非蛋白分
解性Hin−47類似体では、投与量依存性は認められなか
ったが、投与量0.8μｇまたは2.5μｇの可溶性非蛋白分
解性Hin−47の場合には、わずかながら力価の増大が認
められた。
免疫投与の結果から、抗原をPLG微粒子と物理的に混
合して免疫システムに提供すると（図8B）、可溶性抗原
単独の場合と同じ用量（0.8μｇまたは2.5μｇ）で、可
溶性抗原に比較して免疫原性がわずかに高くなることが
認められた。しかし、溶解状態または微粒子と混合した
形態で投与すると、微粒子でカプセル化した抗原よりも
数桁小さい反応が誘導されたに過ぎなかったことから、
カプセル化すると溶解状態または物理的混合よりも利点
のあることが立証された。
興味あることに、非蛋白分解性Hin−47類似体をカプ
セル化させた微粒子、非蛋白分解性Hin−47類似体を物
理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分解性Hin−4
7類似体を投与し、試験35日および試験60日目に採取し
た血液プールのIgGサブタイプのプロフィール（図8C）
から、試験35日目までは、製剤に関係なく、IgG1が優勢
なサブタイプであり、ほかに少量のIgG2bが検出され
た。試験60日目には、微粒子でカプセル化した非蛋白分
解性Hin−47類似体で誘導されるIgGサブタイプにクラス
スイッチがみられ、IgG1、IgG2aおよびIgG2bに量的な差
は認められなくなった。微粒子と物理的に混合させた非
蛋白分解性Hin−47類似体は、また溶解させた同類似体
によって産生されるIgGサブタイプの種類は、試験35日
目に測定した場合と実質的に同じで、IgG1サブタイプが
優勢であった。
以上のように、微粒子カプセル化抗原によってもたら
される免疫反応には、物理的に混合した微粒子または可
溶性抗原のみの場合とは質的にかなり異なると結論され
る。BABLB/c系マウスにおけるIgG2aサブタイプの存在は
TH1経路を示唆し、IgG1の存在はTH2経路を示唆している
と一般的に考えられている。皮下免疫投与の場合、可溶
性抗原または微粒子と物理的に混合した抗原ではTH2経
路が優勢であり、一方微粒子でカプセル化した抗原では
比較的バランスのとれたTH1/TH2反応が得られる。
実施例9: 本実施例では、本発明にしたがって形成させたPLG、P
LGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Hin
−47類似体をマウスに胃内免疫投与したときの免疫原性
を説明する。
以下の量の抗原を0.15M NaHCO3（pH9.0）250μＬに
溶解させ、試験１、７、14および57日目に６〜８週齢の
BALB/c系マウス（Charles River Breeding Laborato
ries,Wilmington,MA）雌１群５匹に胃内（I.G.）免疫投
与した：実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Hi
n−47類似体4.0μｇを含むPLG、PLGpZSおよびPLGpS粒
子、および実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性
Hin−47類似体4.0μｇと物理的に混合したPLG、PLGpZS
およびPLGpS微粒子（図9A）。
カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体を含む微
粒子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合
した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化また
は行動の変化は認められなかった。試験、＋13、＋35、
＋65および＋78日に血清を採取し、実施例８に示す抗原
特異性ELISAを用い、抗Hin−47IgGおよびIgA抗体の有無
を評価した。
血清および腸内洗浄液について、Hin−47特異性抗体
の有無を調べた。腸管内の抗Hin−47IgGおよびsIgAを検
出し定量するために、頚椎脱臼法によりマウスを屠殺
し、小腸を摘出し、抗原特異性抗体の有無を調べた。各
小腸を幽門括約筋から盲腸の間で摘出し、毛細管を挿入
して反転させた。水冷した酵素阻害剤溶液（0.15M NaC
l、0.01M Na2HPO4、0.005M EDTA、0.002M PMSF、0.0
5U/mLアプロチニンおよび0.02％v/v NaN3）5mLに反転さ
せた腸管を浸漬し、４時間インキュベーションした。小
腸を除去し、遠心分離（1000×ｇ、20分間）により上清
を分取し、分析するまで０℃で保存した。上記のHin−4
7特異性ELISAを用い、試料中の抗Hin−47IgGおよびsIgA
力価を測定した。ただし、ヤギ抗マウスIgG抗血清の代
わりにヤギ抗マウスIgA抗血清を使用した。
I.G.免疫投与後の血清IgG Hin−47特異性抗体の力価
を図9Aに示す。これらの結果から、腸内投与の場合、PL
G、PLGpZSまたはPLGpS微粒子に結合した抗原（非蛋白分
解性Hin−47類似体）は、同量（４μｇ）の可溶性抗原
に比較してかなり高い免疫原性を示し、微粒子と物理的
に混合した抗体よりも優れていることが認められた。可
溶性抗原から本質的に同等の反応を誘導させるために
は、微粒子でカプセル化して投与した抗体（４μｇ）の
５倍の用量（20μｇ）が必要であることを実験的に確認
した。腸内投与によって血清IgG抗体の顕著な反応を誘
導するためには、100μｇを超える抗原を必要とする例
が多いので、ほとんどすべての蛋白質について、この結
果は例外的である。
非蛋白分解性Hin−47類似体をカプセル化た微粒子、
非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合した微粒子
または可溶性非蛋白分解性Hin−47類似体を投与して、
試験56日および試験78日目に採取した血液から得られた
血清のIgGサブタイプのプロフィール（図9B）では、実
施例８で確認した傾向と似た傾向が認められた。抗原を
溶解状態または微粒子と混合した形態で投与すると、Ig
G1サブタイプが優勢である。微粒子でカプセル化した非
蛋白分解性Hin−47類似体の場合は、IgG1およびIgG2aが
ほぼ等しく生成し、バランスのとれたプロフィールが認
められた。このように、微粒子でカプセル化した抗原の
胃経由投与により、比較的バランスのとれたTH1/TH2反
応が得られた。
試験78日目の採血から得られた抗Hin−47IGA抗体反応
の結果を図9Cに示す。１回量が４μｇの可溶性抗原の場
合は、検出可能な血清IgAを確認することができなかっ
た。しかし、１回量が20μｇでは、反応を示す例が少数
認められた。顕著な反応が認められたのは、PLG微粒子
でカプセル化した抗原の場合であり、PLGpZSまたはPLGp
S微粒子でカプセル化した抗原に対しては、中程度の反
応が認められた。PLG、PLGpZSまたはPLGpS微粒子と物理
的に混合した抗原については、同様に穏やかな反応が認
められた。PLGpS微粒子でカプセル化した抗原の場合
に、血清IgAの平均濃度が最も高かった。
PLG、PLGpZSまたはPLGpS微粒子でカプセル化した非蛋
白分解性Hin−47類似体に特異的なIgGまたはsIgAの濃度
が最も低かったのは、試験78日目に行った腸管洗浄の場
合であった。これは、恐らくこの実験に供したカプセル
化抗原の濃度が非常に低かった（１回量４μｇ）ためで
ある。経口投与の場合、他の粘膜アジュバントが存在し
ない状態で粘膜の顕著な反応を誘導するためには、通常
30〜100μｇの範囲の抗原が必要である。
実施例10: 本実施例では、本発明にしたがって形成させたPLG、P
LGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Hin
−47類似体の、マウスに鼻腔内免疫投与したときの免疫
原性を説明する。
以下の量の抗原をPBS（pH7.4）25μＬに溶解させ、試
験１、７、14および57日目に６〜８週齢のBALB/c系マウ
ス（Charles River Breeding Laboratories,Wilming
ton,MA）雌１群５匹に鼻腔内（I.N.）免疫投与した：実
施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Hin−47類自
体4.0μｇを含むPLG、PLGpZSおよびPLGpS微粒子、およ
び実施例５にしたがって調製し、非蛋白性Hin−47類似
体4.0μｇと物理的に混合したPLG、PLGpZSおよびPLGpS
微粒子（図10A）。
カプセル化した非蛋白分解性Hin−47類似体を含む微
粒子または非蛋白分解性Hin−47類似体と物理的に混合
した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化また
は行動の変化は認められなかった。試験＋13、＋35、＋
56および＋78日に血清を採取し、実施例８に示す抗原特
異性ELISAを用い、抗Hin−47IgGおよびIgA抗体の有無を
評価した。
血清および肺洗浄液についてHin−47特異性抗体の有
無を調べた。気道中の抗Hin−47IgGおよびsIgAを検出し
定量するために、頚椎脱臼法によりマウスを屠殺し、気
管に小さな切り口を作り、チューブを気管から肺に挿入
し、400μＬの酵素阻害剤溶液（0.15M NaCl、0.01M N
a2HPO4、0.005M EDATA、0.002M PMSF、0.05U/mLアプ
ロチニンおよび0.2％v/v NaN3）を肺に注入した。次い
でこの溶液を抜き取り、氷上に置き、遠心分離（1000×
ｇ、20分間）により上清を分取し、分析するまで０℃で
保存した。実施例８に示すHin−47特異性ELISAを用い、
試料中の抗Hin−47IgGおよびsIgA力価を測定した。
I.N.免疫投与後の血清IgG Hin−47特異性抗体の力価
を図10Aに示す。これらの結果から、PLG、PLGpZSまたは
PLGpS微粒子と物理的に混合した抗原（非蛋白分解性Hin
−47類自体）は、同程度の用量（４μｇ）の可溶性抗原
に比較して高い免疫原性を有することが認められた。鼻
腔経由で投与した場合、カプセル化した抗原および微粒
子と物理的に混合した抗原では、本質的に同程度の反応
が得られた。
非蛋白分解性Hin−47類似体をカプセル化した微粒
子、非蛋白分解性Hin−47類似体を物理的に混合した微
粒子または可溶性非蛋白分解性Hin−47類似体を投与
し、試験56日および試験78日目に採取したプール血液の
IgGサブタイプのプロフィール（図10B）からは、実施例
８または実施例９に示した傾向とは異なった傾向が認め
られた。微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Hin−47
類似体の場合、いずれの検査時期（試験56日目または試
験78日目）にもIgG1、IgG2aおよびIgG2bが本質的に同程
度存在し、他に比較してバランスの取れたプロフィール
が認められた。溶解状態または微粒子と物理的に混合し
た形態で投与した抗原に関しては、試験78日までに類似
のプロフィールが認められ、顕著な濃度のIgG2aも確認
することができた。
このように、鼻腔経由で投与した場合、抗原が微粒子
内にカプセル化されているか、微粒子と物理的に混合さ
れているか、溶解した形態であるにかかわらず、TH1/TH
2反応は本質的に同じであった。
試験78日目の採血から得られた抗Hin−47IgA抗体につ
いての結果を図10Cに示す。可溶性抗原に関しては、血
清IgGは検出できなかった。しかし、微粒子でカプセル
化または微粒子と物理的に混合した抗原の場合には、顕
著な反応が認められた。PLGpS微粒子でカプセル化した
抗原、またはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原の場
合に、最も高い濃度が得られた。
試験78日目に行った肺洗浄では、分泌物から検出した
IgGおよびsIgAに関してかなりの差が認められた。可溶
性抗原からの抗Hin−47IgG抗体反応（図10D）は、無視
できる程度であったが、微粒子でカプセル化またはPLG
微粒子と物理的に混合した抗原では、検査した各群の半
数の動物から顕著な濃度のIgGが確認された。PLGpZSま
たはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原では最も再現
性の高いIgG反応が認められ、検査したほとんどまたは
全てのマウスで顕著な濃度のIgGが認められた。
抗Hin−47sIgA抗体反応（図10E）は、図10Dに示すIgG
で得られた反応と類似していた。可溶性抗原の反応は無
視できる程度であり、PLG微粒子でカプセル化またはPLG
微粒子と物理的に混合した抗原ではある程度の反応が認
められた。PLGpZSまたはPLGpS微粒子と物理的に混合し
た抗原では最も顕著なsIgA反応が認められ、大部分のマ
ウスでかなりの濃度のsIgAが検出された。
粘膜表面に局部的な防護を誘導すると、しばしば局部
分泌物中にIgGおよびsIgAが検出される。鼻腔免疫投与
しても上気道に免疫を誘導しないという可能性を否定す
ることはできないが、微粒子でカプセル化または微粒子
と混合した抗原は血清IgG抗体反応を誘導することは明
らかである。IgGおよびsIgAを局部的に誘導するために
は、微粒子、特にPLGpZSまたはPLGpS微粒子と抗原を物
理的に混合することがこれらの条件下で比較的適した方
法であると思われる。
実施例11: 本実施例では、本発明にしたがって形成させたPLG、P
LGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させたFlu Ｘ−31また
はFlu Ｘ−31＋co−アジュバントBAY R1−005をマウス
に皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。
以下の量の抗原をPBS（pH7.4）250μＬに溶解させ、
試験１日目に６〜８週齢のBALB/c系マウス（Charles R
iver Breeding Laboratories,Wilminton,MA）雌１群
６匹に皮下（S.C.）免疫投与した：実施例５にしたがっ
て調製し、5.0μｇのFlu Ｘ−31（HA 1.5μｇ）また
は5.0μｇのFlu Ｘ−31（HA 1.5μｇ）＋50μｇのBAY
R1−005（溶液投与）または約20μｇのBAY R1−005
（co−カプセル投与）を含むPLG、PLGpZSおよびPLGpS微
粒子（図11）。
カプセル化したFlu Ｘ−31またはFlu Ｘ−31＋BAY
R1−005を含む微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病
理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋21
および＋33日に血清を採取し、実施例８に示す抗原特異
性ELISAを用い、抗Flu Ｘ−31IgG抗体の有無を評価し
た。試料は、全て２回分析した。
4.0μg/mLのFlu Ｘ−31を含む0.05M炭酸塩−重炭酸
塩緩衝液（pH9.6）500μＬをミクロタイタープレートの
ウェルに添加し、室温で１夜インキュベートした。PBS
＋0.05％Tween20（機能上、洗浄緩衝液と定義する）で
プレートを洗浄した。ウェルに５％スキムミルク200μ
Ｌ（機能上、ブロッキング緩衝液と定義する）を添加し
て、インキュベーションした。PBS＋0.05％Tween20で洗
浄した後、ブロッキング緩衝液で逐次希釈した試料100
μＬをウェルに添加し、37℃で１時間インキュベーショ
ンした。ウェルをPBS＋0.05％Tween20で洗浄し、HRP−
共役抗体（ヤギ抗マウスIGG（Ｈ＋Ｌ）、IgG1、IgG2aま
たはIgG2b）を加えたブロッキング緩衝液100μＬを各ウ
ェルに添加した。37℃で１時間インキュベーションした
後、PBS＋0.05％Tween20でウェルを５回洗浄し、新たに
調製した発色用基質〔H2O29部およびTMB1部〕を各ウェ
ルに添加した。暗黒下の室温で５分間インキュベーショ
ンした後、2M H2SO4溶液50μＬを添加して反応を停止
させ、ミクロプレートリーダーを用いてウェル中の液体
の吸光度を40nmで測定した。正常なマウスの血液プール
を用いて、分析における吸光度のベースラインを確定し
た。陽性対照として、高度免疫性マウスのFlu Ｘ−31
抗血清を用いた。陰性対照として、免疫投与前血清を用
いた。
免疫投与後の血清抗体の力価を図11に示す。１回の免
疫投与（試験１日目）の結果から、抗原をPLGまたはPLG
pS微粒子に捕捉させて免疫システムに提供すると、可溶
性抗原単独の場合に比較して免疫原性が高くなることが
認められた。PLGpZS微粒子でカプセル化したFlu Ｘ−3
1またはFlu Ｘ−31＋BAY Rl−005で、最も顕著な結果
が得られた。試験した全ての微粒子で最適用量以下の用
量のBAY R1−005をカプセル化したが、PLGpZS微粒子で
は可溶性Flu Ｘ−31およびBAY R1−005単独の場合に比
較して免疫原性反応が顕著に高くなることが認められ
た。本実施例に示した試験によって、本発明にたがって
調製した微粒子に抗原を捕捉させると、インフルエンザ
ビールスから得られたビールス性抗原の免疫原性が高
く、高濃度の血清IgG抗体を産生した、さらに、微粒子
システムを一回だけ免疫投与した場合でも、免疫原性が
他の場合に比較して顕著に増進したことから、これらの
材料で単回投与ワクチンを開発することができると考え
られる。
実施例12: 本実施例では、本発明にしたがって形成させたPLG、P
LGpZSおよびPLGpS微粒子に捕捉させたFlu−Ｘ−31また
はFlu−Ｘ−31＋co−アジュバントのマウスに鼻腔内免
疫投与したときの免疫原性を説明する。
以下の量の抗原をPBS（pH7.4）25μＬに溶解させ、試
験１日および試験34日目に６〜８週齢のBALB/c系マウス
（Charles River Breeding Laboratories,Wilmington,M
A）雌１群６匹に鼻腔内（I.N.）免疫投与した：実施例
５にしたがって調製し、5.0μｇのFlu−Ｘ−31（HA 1.5
μｇ）または5.0μｇのFlu−Ｘ−31（HA 1.5μｇ）＋50
μｇのBAY R1−005（溶液投与）または約20μｇのBAY R
1−005（co−カプセル投与）を含むPLG、PLGpSおよびPL
GpS微粒子（図12）。
カプセル化したFlu−Ｘ−31またはFlu−Ｘ−31＋BAY
R1−005を含む微粒子を投与しも、マウスに肉眼的病理
変化または行動の変化は認められなかった。試験＋21、
＋33および＋92日に血清を採取し、実施例10に示す抗原
特異性ELISAを用い、抗Flu−Ｘ−31IgG抗体の有無を評
価した。試料は、全て２回分析した。
可溶性抗原、可溶性抗原＋co−アジュバントまたはカ
プセル化抗原を鼻腔内免疫投与したマウスで、同程度の
高Flu−Ｘ−31IgG抗体反応が認められた。興味あること
に、カプセル化抗原＋co−アジュバントでは、鼻腔経由
で投与した場合、試験＋21日および＋33日に可溶性抗
原、可溶性抗原＋アジュバントまたはカプセル化抗原と
比較して免疫反応の低下（放出遅延によるものと思われ
る）が認められた。しかし、２回目の免疫投与後（試験
34日）には、これらの群でも顕著な反応の上昇が認めら
れ、試験＋92日には用いたアジュバントには関係なく、
基本的に同じ程度の免疫原性が認められた。
本実施例で記載した鼻腔内免疫投与の結果から、本発
明に係わる微粒子に捕捉させても、抗原または抗原＋CO
−アジュバントの免疫原性には顕著な増進が認められな
かった。
実施例13: 本実施例では、微粒子でカプセル化または物理的に微
粒子と混合したFlu−Ａ−TexasまたはFlu−Ａ−Texas＋
BAY R1−005をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原
性を説明する。
ほとんどの非複製ウイルスワクチンは、防御効果のあ
る十分な血清抗体力価を得るために反復投与が必要であ
ることは公知である。したがって、抗原を単回投与する
ことによって同様な効果を上げることが強く望まれてい
る。
我々は、本発明にしたがって形成されたPLGpS微粒子
に捕捉させ、または微粒子と物理的に混合したFlu−Ａ
−TexasまたはFlu−Ａ−Texas＋co−アジュバントを単
回投与したときの免疫原性を検討した。以下の量の抗原
をPBS（pH7.4）250μＬに溶解させ、試験１日目に６〜
８週齢のDBA2系マウス（Charles River Breeding Labor
atorise,Wilmington,MA）雌１群６匹に皮下免疫投与し
た：実施例５にしたがって調製し、1.0μｇのFlu−Ａ−
Texas（HA 0.35μｇ）または10.0μｇのFlu−Ａ−Texas
（HA 3.5μｇ）＋約2.0μｇのBAY R1−005または約10.0
μｇのFlu−Ａ−Texas（HA 3.5μｇ）＋約20μｇのBAY
R1−005を含むPLGpZS、または実施例５にしたがって調
製し、1.0μｇのFlu−Ａ−Texas（HA 0.35μｇ）＋約20
μｇのBAY R1−005または10.0μｇのFlu−Ａ−Texas（H
A 3.5μｇ）＋20μｇのBAY R1−005と物理的に混合した
微粒子（図13）。
Flu−Ａ−Texas−BAY R1−005を含むPLGpS微粒子のコ
ア負荷量は、アミノ酸分析によって測定した（表１）。
投与した微粒子の質量は、低用量群にはFlu−Ａ−Texas
として1.0μｇ（HA 0.35μｇ）になるように、高用量群
にはFlu−Ａ−Texasとして10.0μｇ（HA 3.5μｇ）にな
るように調整した。したがって、高用量群に投与したBA
Y R1−005の用量は、低用量群に投与したBAY R1−005よ
りも10倍高かった。co−カプセル化するBAY R1−005の
量がほぼ等しくなるように製剤条件は調整できるものと
期待される。
カプセル化されたFlu−Ａ−TexasまたはFlu−Ａ−Tex
as＋BAY R1−005を含む微粒子を投与したマウスで、肉
眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試
験＋21および＋42日または＋57日に血清を採取し、赤血
球凝集抗体試験（HAI）で機能抗体の有無を評価した。
試料は、全て２回分析した。
非特異的阻害剤を除去するために10％ニワトリ赤血球
細胞とともに30分間インキュベーションした熱不活性化
マウス血清を用い、インフルエンザHAI試験を行った。
２倍に希釈した血清を96穴マイクロタイタープレートに
添加し、等量のウイルス懸濁液（8HA単位）を各ウエル
に添加し、室温で30分間インキュベーションした。10％
ニワトリ赤血球細胞懸濁液を各ウエルに添加し、室温で
30分間インキュベーションした。試験には陽性血清およ
び陰性血清を含め、試験の特異性および感受性を確認し
た。陽性血清はインフルエンザウイルスを免疫投与した
動物から得た。陰性血清はPBSを免疫投与した動物から
得、力価は15またはそれ以下とした。HAI力価は、赤血
球の凝集を完全に阻害する最高希釈率の逆数で表示され
る。
図13に示す単回免疫投与（試験１日）の結果から、溶
液の形状またはPLGpS微粒子に捕捉された状態で免疫系
に投与した抗原（図13）は試験＋42日までに無視できる
程度またはきわめて低い機能的抗体を発現したに過ぎな
かった。BAY R1−005と物理的に混合した形態で免疫系
に投与したFlu（10μｇ）では、発現したHAI反応が可溶
性抗原を同じ用量で投与した場合と比較して８倍高く、
PLGpS/Flu微粒子をいずれかの用量で投与した場合と比
較して６倍高かった。最も顕著な結果が得られたのはPL
GpS/Flu（Ａ−Texas）/BAY R1−005微粒子製剤であり、
低用量（１μｇ）でもHAI力価は可溶性抗原の８倍、高
用量（10μｇ）では可溶性抗原の32倍であった。Flu＋P
LGpS微粒子またはFlu＋PLGpS微粒子＋BAY R1−005の物
理的混合物を投与した対照群でも、HAI力価の中等度の
増加が認められた。Flu＋PLGpS微粒子の物理的混合物で
表現されたHAI反応は、可溶性抗原を同じ用量で投与し
た場合と比較して低用量では４倍、高用量では８倍高か
った。Flu＋PLGpS微粒子＋BAY R1−005の物理的混合物
で表現されたHAI反応は、可溶性抗原を対応する用量で
投与した場合と比較して４倍高かった。
本実施例に示した試験で、インフルエンザウイルスか
ら得たウイルス抗原は抗原を本発明にしたがって形成さ
せた微粒子に追加アジュバントの存在下で捕捉させた場
合、高レベルの機能的抗体を表現することが確認された
（HAI力価で測定）。単回免疫投与後に微粒子抗原＋ア
ジュバントco−カプセル化系で用量依存性が認められた
こと、さらに著しく高い機能的抗体（防御作用と相関が
ある）が表現されたことから、さらにこれらの材料を用
いて単回投与剤型を開発することができる可能性を示唆
している。
実施例14: 本実施例では、マイクロカプセル化に典型的に用いた
製剤条件のFle（三価）ワクチンの各成分に対する影響
を検査する。
Flu（三価）ワクチンは、３種類の相同HAストレイン
（A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbin）をほぼ等量含
む。各特異的HA成分の定量は、単一放射免疫拡散法（SR
ID）で行った（参考文献32）。SRID法では、各HA成分の
検出にポリクロナール血清を用い、この血清は配座の変
化に感受性が高い。この検定法で検出される各成分の最
低濃度は、約10μg/mLである。Flu（三価）ワクチン2.0
mL（濃度＝265μg/mL）を含む一連の試料を調製した。
これらの各試料について、SRIDでA/Texas特異性HA＝20.
25μg/mL、A/Johannesburg特異性HA＝20.60μg/mL、B/H
arbin特異性HA＝21.42μg/mLを測定した。
マイクロカプセル化手順に典型的に用いた溶媒、例え
ばジクロロメタン（DCM）または酢酸エチル（EtOAc）の
影響を、ホモジナイズ手順と同様の条件下で評価した。
ホモジナイズ手順のモデルとして、短時間（30秒間）の
超音波処理を用いた。さらに、少量の添加物、例えばBA
Y（糖脂質ペプチド）およびDC−Chol（カチオン性脂
質）を用い、抗原の回収率が向上するか否か検討した。
反応のスケールは、実施例５で記載した手順と同様に
なるように設計した。SRID分析を行う前に各混合液の有
機溶媒を留去し、適当な対照を検査し、有機溶媒、ホモ
ジナイズの方法またはBAYまたはDC−Cholの添加が結果
に影響を及ぼしたか否か検討した。
この試験の結果を表８に示す。エントリー１と２を比
較して明らかなように、超音波処理の影響はきわめてわ
ずかであった。エントリー３と４から、EtOAcまたはDCM
等の有機溶媒中で超音波処理すると、抗原の回収率に影
響が認められた。EtOAcを用いた場合、A/Texas特異性HA
およびA/Johannesburg異性体HAの回収率はそれぞれ75％
および78％であった。EtOAc処理後には、この方法でB/H
arin特異性HA成分は検出されなかった。この成分の検出
限界は低く、約10μg/mLであったことから、この成分の
実際の回収率は50％以下であったと考えられる。溶媒と
してDCMを用いた場合、A/Texas特異性HAおよびA/Johann
esburg特異性HAの回収率はそれぞれ85％および96％で、
B/Harbin特異性HAの回収率は50％以下であった。
エントリー５および６では、溶媒としてEtOAcを用い
たときの有機相に対する添加物BAYおよびDC−Cholの影
響を検討した。この組合せでは全ての成分が検出され
（検出限界＞50％）、回収率はA/Texas特異性HAで65％
（BAY）および82％（DC−Chol）、B/Harbin特異性HAで8
2％（BAY）および70％（DC−Chol）およびA/Johannesbu
rg特異性HAで87％（BAY）および88％（DC−Chol）であ
った。エントリー７および８では、溶媒としてDCMを用
いたときの有機相に対する添加物BAYおよびDC−Cholの
影響を検討した。分析の結果、一部の成分は完全には回
収されず、分析にある程度の影響が認められた。特に、
A/Texas特異性HAは91％（BAY）および92％（DC−Chol）
が回収された。B/Harbin特異性HAの回収率は、いずれの
場合も50％以下であった。A/Johannesburg特異性HAで
は、これらの組合せで直線性からのかけ離れがあったた
め、明瞭な結果が得られなかった。これは、溶媒として
DCMを用いた場合にのみ認められた。
EtOAcに溶解させたFlu（三価）ワクチンおよび添加物
としてBAYまたはDC−Cholを用いた製剤では、いずれの
成分でも最高の回収率が得られた。この実施例から、BA
YまたはDC−Chol等の親油性物質は感受性成分を含む製
剤の安定化に使用できると考えられる。このような性質
を有する物質はインターフェースとして作用し、ホモジ
ナイズの過程で蛋白が空気／水疎水性表面に接触するの
を防止する。蛋白構造は、これらの作用に特に感受性が
高い。この実施例で報告したSRID分析結果は、この結論
を裏づけている。
実施例15: 本実施例では、PLGpS微粒子でco−カプセル化したFlu
（三価）またはFlu（三価）＋アジュバントカクテルを
マウスに皮下免疫投与したときの免疫原性について説明
する。
Flu（三価）ワクチンは、３種類の相同HAストレイン
（A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbin）をほぼ等量含
む。Flu（三価）ワクチン10.0μｇ中の総HA含有量は、
2.35μｇである。単一放射免疫拡散法（SRID）（参考文
献32）で各特異性HA成分を測定したところ、A/Texasで
0.76μｇ、A/Johannesburgで0.81μｇ、B/Harbinで0.78
μｇであった。
この試験では、各成分のHA投与量が実施例13と比較し
て著しく低かった。すなわち、実施例13で用いた単価ワ
クチンは、約3.25μｇのA/Texas特異性HAを含んでい
た。
Th2/Th1プロファイルに基づいて選抜したアジュバン
ト、DC−Chol（カチオン性脂質）、BAY R1−005（Th2/T
h1のバランスのとれた糖脂質ペプチド）、主要Th2のPCP
P（ポリ［ジ（カルボキシラートヘノキシ）−ホスファ
ゼン］ナトリウム塩）（Virus Research Institute,Cam
bridge MA）の存在下で、マウスに皮下免疫投与した。P
LGpS微粒子は、実施例８と同様にバランスのとれたTh2/
Th1プロファイルを誘導することが認められた。
６〜８週齢のDBA−２系マウス（Charles River Breed
ing Laboratories、Wilmington、MA）雌１群８匹に、PB
S（pH7.4）250μＬに溶解させた抗原を試験１日目に以
下の用量で免疫投与した。実施例５で調製し、Flu（三
価、HAとして2.35μｇ）10.0μｇまたはFlu（三価、HA
として2.35μｇ）10.0μｇ＋BAY R1−005、DC−Cholま
たはPCPPを含むPLGpS微粒子（表５）。
Flu（三価）を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、アミ
ノ酸分析によって測定した（表６）。いずれのPLGpS微
粒子製剤でも、抗原の回収率は良好であった（＞70
％）。この結果は、蛋白溶液の初期濃度がカプセル化効
率に顕著な影響を及ぼすという我々の知見と一致した。
投与した微粒子の質量は、Fluとして10.0μｇ（三
価、総HA 2.35μｇ）の必要容量になるように調整し
た。共投与したアジュバントの用量を最適化する努力は
行わなかったが、これは製剤条件によって決まると期待
される。
カプセル化したFlu（三価）ワクチンまたはFlu（三
価）ワクチン＋アジュバントカクテルを含むPLGpS微粒
子を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動
の変化は認められなかった。試験21、42および57日に血
清を採取し、総IgG、IgG1、IgG2aを評価し、赤血球凝集
抗体試験（HAI）で機体抗体の有無を評価した。各スト
レイン（A/Texas、A/Johannesburg、B/Harbin）につい
て検査を行い、カプセル化および放出のマルチコンポー
ネント系における免疫原性および機能抗体に対する影響
を検討した。試料は、全て２回分析した。抗体ELISA
は、実施例13と同様に行った。
図14a〜ｃに示すように、PLGpS/Flu（三価）微粒子製
剤によってFlu（三価）ワクチンに含まれる各ストレイ
ンに特異的なIgG抗体反応が誘導された。
試験57日までに総IgG力価が最も高かったのは、PLGpS
/Flu（三価）/DC−Chol微粒子製剤であった。この結果
は、検査したいずれのストレインにも該当した（A/Texa
s＝可溶性Flu対照の32倍、A/Johannesburg＝可溶性Flu
対照の64倍、B/Harbin＝可溶性Flu対照の64倍）。
試験57日までにPLGpS/Flu（三価）/PCPP微粒子製剤で
比較的高いIgG抗体反応（力価に基づく）が認められた
ものは、A/Texas（可溶性Flu対照の２倍）、A/Johannes
burg（可溶性Flu対照の４倍）であった。
PLGpS/Flu（三価）、PLGpS/Flu（三価）/BAY微粒子製
剤および可溶性Flu（三価）ワクチン対照では、試験57
日までに誘導された総特異性IgG抗体反応に基本的に差
がなかった。これは、単価ワクチンを用いた実施例13の
結果（これら３種類の系で結果に差が認められなかっ
た）と一致した。
各HAストレインについてインフルエンザHAI試験を行
うために血清試料を56℃で30分間加熱して補体を不活性
化し、トリプシン（8mg/mLを0.1mL）／過ヨウ素酸塩
（0.001Mを12.5μＬ）で前処理を行って内在血球凝集阻
害物質を破壊した。連続希釈した抗血清について、標準
的なHAI法（参考文献33）を用い、それぞれ4HAUのA/Tex
as、A/JohannesburgまたはB/Harbinウイルスによる１％
ニワトリ赤血球細胞の凝集阻害能を２連で測定した。
図15a〜ｃに示すように、三価ワクチンに含まれる各H
Aストレインに対して特異的なHAI力価が誘導された。Fl
u（三価）ワクチン＋DC−Cholを含むPLGpS微粒子製剤で
は、試験57日までに最も高く持続性のあるHAI力価が認
められたた（HA特異性A/TexasではHAI力価240（可溶性F
lu（三価）対照の８倍）、HA特異性A/Johannesburgでは
240（可溶性Flu（三価）対照の16倍）、HA特異性B/Harb
inでは60（可溶性Flu（三価）対照の８倍））。Flu（三
価）＋BAYを含むPLGpS微粒子製剤でも、特に高いHAI力
価が認められた（HA特異性A/TexasではHAI力価60（可溶
性Flu（三価）対照の２倍）、HA特異性A/Johannesburg
では60（可溶性Flu（三価）対照の４倍）、HA特異性B/H
arbinでは15（可溶性Flu（三価）対照と同等））。この
実施例でFlu（三価）ワクチンを含むBAY製剤で認められ
たHAI力価は、実施例13の低用量（Flu（単価）ワクチン
１μｇ−A/Texas特異性HAとして0.325μｇを投与）と同
等であった。PLGpS/Flu（三価）/PCPP微粒子製剤では、
検出されるほどの機能抗体反応の誘導は認められなかっ
た。
高用量のPLGpS/Flu（三価）/DC−Chol製剤微粒子を投
与した実験を行った。
この群のマウスには、試験１日目に別の群に投与した
Flu（三価）ワクチンの約２倍を免疫投与した（投与量:
Flu（三価）＝21.2μｇ、総HA＝5.00μｇ）。この高用
量で得られた結果は、図15a〜ｃに示す。可溶性Flu（三
価）ワクチンをこの用量で免疫投与した対照群で誘導さ
れたHAI力価はわずかであり、検査した低用量群と基本
的に同等であった（結果は表示せず）。試験57日まで
に、この製剤では低用量群と比較して著しく高い特異性
HAI力価の誘導が認められた（HAI力価:HA特異性A/Texas
で480（可溶性Flu（三価）対照の５倍）、HA特異性A/Jo
hannesburgで480（可溶性Flu（三価）対照の５倍）、HA
特異性B/Harbinで120（可溶性Flu（三価）対照の３
倍））。さらに、誘導されたHAI力価は持続性があり、
試験21日から57日まで同じレベルに保たれることが確認
された。
BAYまたはDC−Chol等の添加物はポリマーおよび有機
溶媒を含む有機相に導入され、インターフェースとして
作用し、製剤の過程で抗原を防御する（実施例13、表８
参照）。それによって、抗原物質の回収率が高くなる。
さらに、in ivtroで行った放出試験で、３日以内に
カプセル封入成分のかなりの量が放出されることが確認
された。カプセル封入抗原の約５〜15％が、この段階で
検出されることが実験的に確認された（微粒子の表面に
局在している抗原）。初回免疫は、アジュバントの共放
出によって著しく増強される。これは、初期放出段階で
抗原の周囲に局在していることによるものと思われる。
PCPP等のアジュバントと抗原をco−カプセル化したPL
GpS微粒子製剤では、ワクチン効果の改善が得られない
ことは注目に値する。この物質は一次乳化液の水相に添
加したが、DC−CholまたはBAYの親油性を保持していな
い、PCPPは別の系で強いアジュバント特性を有すること
が知られているが、この実施例ではカプセル化効果また
は微粒子製剤の抗原性補強効果にはきわめてわずかな改
善が認められたに過ぎなかった。
この実施例に示す試験で、多成分系インフルエンザウ
イルスのウイルス抗原はFlu抗原をco−カプセル化したB
AYまたはDC−Chol等の存在下で微粒子に捕捉させると高
レベルの総IgG抗体および機能抗体（HAI）を誘導するこ
とが確認された。
実施例16: 本実施例では、PLGpS微粒子製剤をマウスモデルに単
回皮下免疫投与したときの感染率および防御率を評価し
た結果を説明する。
卵由来尿膜腔液中の生インフルエンザウイルスA/台湾
/1/86（H1N1）、マウス適応A/台湾/1/86および市販のA/
台湾/1/86単価サブユニットワクチン（FluzoneR）を、P
asteur Merieux、Connaught、米国（Swiftwater、PA）
から入手した。
A/Texas、A/JohannesburgおよびB/Harbinストレイン
（PBS0.25mL中総HA2.35μｇ）を含むFlu（三価）ワクチ
ンを、試験１日目に６〜８週齢のDBA−２系マウス雌
（実施例14に記載）１群８匹に皮下免疫投与した。対照
群のマウスには、PBSのみまたは尿膜腔液として生A/Tex
asウイルスを400血球凝集単位（HAU）で投与した。14日
後に麻酔下のマウスに尿膜腔液中のマウス適応生A/台湾
/1/86ワクチン50μＬを鼻腔内攻撃投与した（LD50の５
倍）。攻撃投与後14日間にわたって、毎日死亡率を測定
し、２日に１回罹病率（体重変化）を測定して防御率を
評価した。
攻撃投与の結果を図16に示す。期待したように、相同
性生（A/Texas）ウイルスを免疫投与した全てのマウス
で認められた体重の減少は最小限で、ベースラインから
の体重変化率に基づいて判断したところ、攻撃投与後２
週間以内に完全に回復した。また、PBSを免疫投与した
マウスでは期待したように急激な体重の減少が認めら
れ、試験10日までにベースラインの30％以下に減少し
た。この対照群では、10日までに全ての動物が死亡し
た。
PLGpS/Flu（三価）/DC−Chol微粒子製剤を免疫投与し
たマウスでは攻撃投与後４日以内に体重の平均減少率が
８％であったことから、感染が起こったと考えられた。
検査したPLGpS製剤群の動物のうちこれらのマウスでは
急速な回復が認められ、２週間後にはベースラインの10
0％に達した。群全体の動物が回復し、各マウスで防御
力価が上昇したものと考えられた。
PLGpS/Flu（三価）/BAY微粒子製剤を免疫投与したマ
ウスでは攻撃投与後10日以内に体重の平均減少率が10％
であったことから、感染が認められた。これらのマウス
では緩慢な回復が認められ、２週間後にはベースライン
の95％に達した。群全体の動物が回復し、これらの各マ
ウスで防御力価の上昇が認められたが、回復速度から防
御レベルは同じ用量を投与したDC−Chol群よりも低かっ
たものと考えられる。これは、実施例15で測定したこれ
ら２群のHAI値と一致する。
可溶性Flu（三価）ワクチン対照群およびPLGpS/Flu
（三価）またはPLGpS/Flu（三価）/PCPP微粒子製剤群で
は、結果が低かった。これらの群では、攻撃投与後８〜
10日までに23〜29％の平均体重が減少が認められた。こ
れらのマウスでは回復速度が最も遅く、２週間後にベー
スラインの86〜92％に回復した。さらに、これらの群で
は数匹の死亡例がみられた。PLGpS/Flu（三価）微粒子
製剤群では、８匹中６匹が生存した。PLGpS/Flu（三
価）/PCPP製剤群では８匹中７匹、Flu（三価）対照群で
は８匹中６匹が生存した。これらの例では、防御が認め
られないか、認められても低かった。
実施例14で、我々はマイクロカプセル化条件のFlu
（三価）ワクチンに対する影響を評価した。SRID法で抗
原回復のストレイン特異性（A/Texas、A/Johannesbur
g、B/Harbin）分析を行ったところ、PLGpSポリマーおよ
びEtOAcを溶媒とし、有機相にCholまたはBAYを用いた場
合、この多成分系の３ストレイン全てで抗原活性をの低
下がきわめてわずかであることが認められた。実施例15
で、DC−CholまたはBAYの存在下で製剤したPLGpS/Flu
（三価）ワクチンの単回皮下投与で高い機能抗体（防御
に関連がある）が誘導されたことから、これらの製剤は
マウスモデルに利用できることが確認された。実施例16
で記載した攻撃／防御試験の結果は、機能抗体試験で得
られた防御効果の順位とよく一致した。
抗原およびアジュバントを生分解性微粒子に捕捉させ
て投与すると、さらに効果的に免疫系に提供することが
できる。DC−CholまたはBAYと抗原の可溶性混合物で認
められた免疫増強効果は、これを製剤に利用することに
よって免疫活性がさらに向上することを示唆している。
これらの結果は、使用回数および用量（抗原／アジュバ
ント）を軽減できることを示唆している。特に、この実
施例はこれら新規微粒子製剤を単回投与で有効な製剤の
開発に利用できることを強く示唆している。
実施例17: 本実施例では、PLGpS微粒子中にカプセル化したMorax
ella catarrhalis由来トランスフェリン結合蛋白（Tbp
2）（WO 97/13785、本出願人、参考例としてここに引
用する）、PLGpS微粒子と物理的に混合したTbp−２また
は明礬で製剤したTbp−２をマウスに皮下免疫投与した
ときの免疫原性について説明する。
６〜８週齢のBALB/c系マウス（Charles River Breedi
ng Laboratories、Wilmington,MA）雌１群５匹に、PBS
（pH7.4）250μＬに溶解させた抗原を試験１、28および
43日目に以下の用量で皮下免疫投与した：実施例５にし
たがって調整し、0.3μｇのTbp−２を含むPLGpS微粒
子、実施例５にしたがって調製し、0.3μｇのTbp−２と
物理的に混合したPLGpS微粒子、および0.3μｇのTbp−
２と製材した明礬（1.5ml/回）（表５）。
カプセル化したTbp−２を含む微粒子、Tbp−２を物理
的に混合した微粒子またはTbp−２を物理的に混合した
明礬を投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の
変化は認められなかった。試験＋14、＋27、＋42および
＋55日で血清を採取し、実施例８と同様に抗原特異性EL
ISAで抗Tbp−2IgG抗体の有無を評価した。試料は、全て
２回分析した。
Tbp−２を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実施例６
と同様にアミノ酸分析によって測定した（4.0μg/mg（3
2.8％））。
免疫投与の結果（図17a）から明らかなように、PLGpS
微粒子に捕捉させて免疫系に投与した抗原は可溶性抗原
またはPLGpS微粒子のみと物理的に混合した抗原と比較
してかなり高い力価を誘導した。さらに、この試験でマ
イクロカプセル化製剤は従来の明礬アジュバント化シス
テムと同様に免疫原性を有するものと思われる。免疫反
応のカイネティックスは、両製剤で差がなかった。
試験55日に採取した血液のIgGサブタイププロファイ
ル（図17b）で、PLGpS微粒子でカプセル化したTbp−２
とPLGpS微粒子に物理的に混合したTbp−２または明礬で
製剤したTbp−２で誘導される免疫反応に差が認められ
た。抗原を可溶性の形態またはPLGpS微粒子と物理的に
混合し、または明礬で製剤して投与した場合、検出され
た優勢なサブタイプはIgG1であった（IgG2もある程度認
められた）。
この実施例で、PLGpS微粒子でカプセル化したTbp−２
で誘導されるIgGサブタイプはさらに高いIgG2aを誘導し
た。この傾向は、実施例８でHin−47で認められた傾向
と同様であった。
これらの結果から、カプセル化抗原の免疫投与で誘導
される免疫の機構は明礬で誘導されるものとは異なるも
のと思われる。抗原を微粒子でカプセル化して投与する
と、さらにバランスのとれたTh2/Th1ロファイル（IgG2
a:IgG1の比）が認められた。
ここに示した結果から明らかなように、PLGpS微粒子
でカプセル化した抗原で仲介される免疫反応は、PLGpS
微粒子と物理的に混合した抗原、明礬で製剤した抗原ま
たは可溶性抗原として投与したもので得られる免疫反応
とは質的にかなり異なる。さらに、抗原／明礬製剤で明
礬により誘導される免疫反応の程度はカプセル化した抗
原を含む微粒子の免疫反応とほぼ同じであった。
実施例18: 本実施例では、PLGpS微粒子でカプセル化したTbp−２
およびPLGpS微粒子と物理的に混合したTbp−２を鼻腔内
免疫投与したマウスにおける免疫原性を説明する。
６〜８週齢のBALB/c系マウス（Charles River Breedi
ng Laboratories、Wilmington、MA）雌１群５匹に、PBS
（pH7.4）10または50μＬに溶解させた抗原を試験１、2
8および43日目に以下の用量で鼻腔内免疫投与した：実
施例５にしたがって調製し、6.0μｇのTbp−２を含むPL
GpS微粒子、および実施例５にしたがって調製し、6.0μ
ｇのTbp−２と物理的に混合したPLGpS微粒子（表５）。
カプセル化したTbp−２を含むPLGpS微粒子またはTbp
−２を物理的に混合したPLGpS微粒子を投与したマウス
で、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかっ
た。試験14、27、42および55日で血清を採取し、実施例
８と同様に抗原特異性ELISAで抗Tbp−2IgG抗体の有無を
評価した。試料は、全て２回分析した。
Tbp−２を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実施例６
と同様にアミノ酸分析によって測定した（4.0μg/mg（3
2.8％））。
鼻腔内免疫投与後の血清IgG Tbp−２特異性抗体力価
を図18に示す。これらの結果から、投与容量が少ない
（10μＬ）と、PLGpS微粒子に取り込まれた抗原（Tbp−
２）またはPLGpS微粒子と物理的に混合した抗原は同じ
用量（6.0μｇ）の可溶性抗原と比較して免疫原性が低
い。
投与用量を高くする（50μＬ）と、いずれの群でも全
体的な力価が著しく増加した。これらの結果から、PLGp
S微粒子と物理的に混合した抗原（Tbp−２）は、さきに
Hin−47の鼻腔内免疫投与（実施例10）で認められた結
果と同様に同じ用量（6.0μＬ）の微粒子カプセル化抗
原または可溶性抗原と比較して免疫原性がかなり高かっ
た。
さきに行ったHin−47の鼻腔内免疫投与試験（実施例1
0）で、微粒子と物理的に混合したHin−47を投与すると
強い体液反応および分泌反応が認められた。Tbp−２を
用いたこの試験でも、同様な反応が認められた。さら
に、投与容量によって、発現する免疫反応の種類および
強さが異なることを確認した。
実施例19: 本実施例では、微粒子による抗原の放出を説明する。
PLGpS微粒子でカプセル化した抗原は明礬製剤と同様
に免疫原性を有することが確認されたことから、これら
高分子マトリックスでカプセル化した抗原の初期放出お
よび徐放特性が免疫投与量の軽減に利用できるか否か検
討した。
この実施例では、PLGpS微粒子でカプセル化したTbp−
２、PLGpS微粒子と物理的に混合したTbp−２、および明
礬またはCFA/IFAで製剤したTbp−２をモルモットに皮下
免疫投与して免疫原性を検査した。
６〜８週齢のモルモット（Charles River Breeding L
aboratories、Wilmington、MA）雌１群２匹に、抗原を
以下の用量で皮内免疫投与した：試験１および28日に実
施例５にしたがって調製し、PBS（pH7.4）500μＬに懸
濁させた5.0μｇのTbp−２をカプセル化したPLGpS微粒
子、および試験１日に5.0μｇのTbp−２を含むPBS（pH
7.4）を混合したフロイントの完全アジュバント（CF
A）、ついで試験14および28日に5.0μｇのTbp−２を含
むPBS（pH7.4）を混合したフロイントの不完全アジュバ
ント（IFA）、または試験１、14および28日に5.0μｇの
Tbp−２を含むPBS（pH7.4）を混合した明礬（表５）。
カプセル化したTbp−２を含むPLGpS微粒子、Tbp−２
を物理的に混合したPLGpS微粒子、Tbp−２のCFA/IFA製
剤またはTbp−２明礬製剤を免疫投与したモルモット
で、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかっ
た。試験40および56日で血清を採取し、抗原特異性ELIS
Aで抗Tbp−2IgG抗体の有無を検査した。試料は、全て２
回分析した。抗体ELISA法は、実施例８と同様である。
Tbp−２を含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実施例６
と同様にアミノ酸分析によって測定した（4.0μg/mg（3
2.8％））。
図19に示す結果から明らかなように、PLGpSでマイク
ロカプセル化したTbp−２を２回投与すると、CFA/IFAま
たは明礬で製剤したTbp−２を３回投与した場合と同程
度の抗Tbp−２抗体反応を誘発した。
これらの結果から、マイクロカプセル化したTbp−２
は２回投与用のワクチンとして開発する価値があると思
われる。
実施例20: 本実施例では、PLGpS微粒子でカプセル化したｒウレ
アーゼまたはｒウレアーゼ／アジュバントカクテルをマ
ウスに皮下または胃内免疫投与したときの免疫原性を説
明する。
６〜８週齢の非近交系Swissマウス（Janvier、フラン
ス）１群８匹に、PBS（pH7.4）300μＬに溶解させた抗
原を以下の用量で試験１、28および56日に皮下（S.C.）
免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、10.0μｇ
のｒウレアーゼを含むPLGpS微粒子、実施例５にしたが
って調製し、10.0μｇのｒウレアーゼ＋DC−Chol、PCPP
またはCT−Ｘをco−カプセル化したPLGpS微粒子、対照
として10.0μｇのｒウレアーゼ＋可溶性のDC−Chol（65
μg/回）またはPCPP（100μg/回）、または試験１、28
および56日に0.15M NaHCO3（pH9.0）300μＬに溶解させ
た抗原を以下の用量で胃内免疫投与した：実施例５にし
たがって調製し、40.0μｇのｒウレアーゼを含むPLGpS
微粒子、実施例５にしたがって調製し、40.0μｇのｒウ
レアーゼ＋DC−Chol、PCPPまたはCT−Ｘをco−カプセル
化したPLGpS微粒子（表５）。
ｒウレアーゼを含むPLGpS微粒子のコア負荷量は、実
施例６と同様にアミノ酸分析またはポリクロナールｒウ
レアーゼ特異性ELISAによって測定した（表７）。PLGpS
微粒子抽出物についてポリクロナールELISA分析を行う
と、典型的にカプセル化した総蛋白量（回収されたエピ
トープ）が得られる。対照実験で、抗原の完全性に対す
る溶媒／塩基（SDS）の影響を定量することができる。
用いた条件下で、抽出された蛋白の約65〜75％がこの検
定法で完全に検出される形態で残っていたと推定され
る。したがって、この測定法で得られた値は、アミノ酸
分析（AAA）で得られた値よりも低い。アジュバント（D
C−Chol、CT−ＸまたはPCPP）が存在していても測定値
を妨害しないことを確認するため、適当な対照を実験に
含めた。DC−Cholが存在していても分析には影響がない
と思われたが、PCPPが存在すると異常値が得られ、AAA
法による分析値と比較して非特徴的に高かった。CT−Ｘ
の場合は、co−カプセル化されたCT−Ｘの量を定量する
ために別のポリクロナールELISA法を開発した。
微粒子の投与質量は、ｒウレアーゼの投与量が10.0μ
ｇ（皮下投与）または40.0μｇ（傾向投与）になるよう
に調整した。
カプセル化したｒウレアーゼまたはco−カプセル化し
たｒウレアーゼとアジュバントの混合物を含むPLGpS微
粒子を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変化または行
動の変化は認められなかった。試験85日に血清を採取
し、抗原特異性ELISAで抗ｒウレアーゼIgG1およびIgG2a
の抗体の有無を評価した。いずれの試料も２回分析し
た。
ELISAは標準的なプロトコール（ビオチン抱合体、ス
トレプタビジン、ペルオキシダーゼ複合体はAmershamか
ら、ｏ−フェニレンジアミン 二塩酸塩（OPD）基質はS
igmaから入手した）。0.05M炭酸−重炭酸緩衝液（pH9.
6）に懸濁させたH.pylori抽出物（５μg/mL）で、プレ
ートを一夜コーティングした（４℃）。BSA（Sigma）で
飽和させた後、プレートを血清（1.5時間）、ビチオン
抱合体（1.5時間）、ストレプタビジン ペルオキシダ
ーゼ複合体（１時間）および基質（OPD−10分間）とと
もにインキュベートした。対照として、各実験にH.pylo
ri抽出物に対するポリクロナールマウス血清を設けた。
力価は、492nmにおける最大吸収の50％を与える希釈率
の逆数で表示した。陰性対照として、免疫投与前の血清
を用いた。
マウスに、Th2/Th1プロファイルに基づいて選んだア
ジュバント（DC−Chol−バランスのとれたTh2/Th1、PCP
P−一次Th2）または既知の粘膜アジュバント活性に基づ
いて選んだアジュバント（コレラ毒素（CT−Ｘ）または
E.coriの熱不安定エンテロトキシン（LT））の存在下で
皮下または胃内免疫投与した。PLGpS微粒子は、その他
の典型的なアジュバント、例えば明礬と比較して一層バ
ランスのとれたTh2/Th1プロファイルを誘導することが
認められている。
皮下免疫投与後試験85日に得たプール血液のIgGサブ
タイプを図20に示す。PLGpS/rウレアーゼ微粒子製剤を
皮下投与した場合は、いずれもIgG1反応がIgG2a反応と
比較して高かった（IgG2a:IgG1比は0.08〜0.33の範囲に
あった）。可溶性対照群（ｒウレアーゼ＋DC−Cholまた
はPCPP）の総IgG1反応は、同じ絶対値の範囲にあった。
抗原とco−カプセル化した場合も、抗原と物理的に混合
して投与した場合にも、アジュバントシステム間でIgG2
aに差が認められた。
PLGpS/rウレアーゼ微粒子（IgG2a:IgG1＝0.33）、PLG
pS/rウレアーゼ微粒子/CT−Ｘ（IgG2a:IgG1＝0.30）お
よびPLGpS/rウレアーゼ微粒子/DC−Chol（IgG2a:IgG1＝
0.20）では、バランスのとれたIgG2a:IgG1抗体反応（Th
2/Th1で評価）が得られた。一方、ｒウレアーゼ＋DC−C
hol対照群では、IgG2a:IgG1＝0.03であった。
PLGpS/rウレアーゼ/PCPP微粒子製剤では、主としてTH
2反応が認められ、IgG2a:IgG1比は0.08であった。ｒウ
レアーゼ＋PCPPの相同可溶性混合物ではTh2が強く、IgG
2a:IgG1比はきわめて低く、0.003であった。
一般に、これらのアジュバントの存在下で抗原をco−
カプセル化すると、典型的な免疫プロファイルがバラン
スのとれたTh2/Th1反応の方向にシフトする傾向が認め
られた。
胃内免疫投与すると、ほとんどの場合検出可能な浸透
反応が認められなかった。特記すべき例外は、中等度の
浸透反応が認められたLT陽性対照（IgG2a:IgG1比＝0.
1）およびCT−Ｘとco−カプセル化したｒウレアーゼ/PL
GpS微粒子（IgG2a:IgG1比＝2.1）であった。興味あるこ
とに、経口免疫投与では、抗原＋粘膜アジュバントをカ
プセル化するときわめて異なった浸透抗体反応が認めら
れた。この場合、IgG2a:IgG1比がIgG2aに片寄り、TH1経
路を示唆していた。文献調査で、CT−Ｘを抗原と経口共
投与すると典型的にLTで認められたような免疫反応を誘
導するという報告があった。主として、IgG1またはTh2
型の反応が報告されている（参考文献34）。この試験
は、PLGpS微粒子でco−カプセル化すると免疫反応が質
的に変化することを示唆している。
実施例21: 本実施例では、PLGpS微粒子/rウレアーゼ製剤をマウ
スモデルに皮下または経口免疫投与したときの感染率お
よび防御率を評価する。
マウスを用い、２回目の追加免疫投与６週間後（試験
85日）に、H.pylori細菌（3x106cfu）懸濁液300μＬを
胃内に強制攻撃投与した。In vitroの放出試験（実施例
７）から微粒子からの抗原の放出には約４週間を要する
と考えられたので、この時から２週間後に攻撃投与を計
画した。
攻撃投与４週間後にマウスを屠殺し、ウレアーゼ活性
（Jatroxテスト、Procter ＆ Gamble）を評価するため
に無菌層流フード内で胃を採取した。ウレアーゼ活性
は、屠殺24時間後に550nmにおける吸収を測定すること
により評価した。このテストの原理は、Helicobacter
pyloriのウレアーゼによって反応液中の尿素を分解さ
せ、pHの上昇による反応液中のpH指示薬（フェノール
レッド）の黄色から淡赤色への色の変化を測定するもの
である。
マウスは、H.pyloriのストレプトマイシン耐性マウス
適応株（X43−2AN）を感染させた。胃におけるウレアー
ゼ活性の測定値（Jatroxテスト）に基づいて判定したと
ころ、感染率には再現性があり、全ての実験で100％の
マウスが感染した。攻撃投与に用いた菌株はストレプト
マイシン耐性であったため、選択性の高い培地でも生育
することができ、したがってこのテストの感度はきわめ
て高かった（正常な細菌相による汚染はみられなかっ
た）。
この菌株は20％v/vグリセロールおよび10％v/v牛胎仔
血清（FBS）（Hyclone）添加Brucellaブロス（BB）（Bi
omerieux）中−70℃で保存した。攻撃投与用懸濁液は、
以下のように調整した：前培養は、５％v/vヒツジ血液
（Biomerieux）およびH.pylori X43−2AN株の選択マー
カー抗生物質（スリメトプリム（５μg/mL）、バンコマ
イシン（10μg/mL）、ポリミキシンＢ硫酸塩（５μg/m
L）、アンホテリシン（５μg/mL）、およびストレプト
マイシン（50μg/mL））（TVPAS）を含むMueller−Hint
on寒天（MHA;Difco）上でH.pyloriを培養した。抗生物
質は、全てSigmaから購入した。MHA−TVPASプレートを
好気的条件下、37℃で３日間培養した。前培養した菌株
を用い、５％v/v FBSおよびすべての抗生物質（TVPAS）
を添加したBB50mLを含む75cm2の通気口付きフラスコ（C
ostar）に接種した。フラスコを、好気的条件下で24時
間ゆっくりと振とうした。グラム染色、ウレアーゼ活性
（尿素インドール培地、Diagnostic Pasteur）、カタ
ラーゼ（H2O2、３％v/v）およびオキシダーゼ活性（Bio
merieuxディスク）を測定し、懸濁液の特性を検討し
た。位相差顕微鏡下で、生存率および運動性を検査し
た。550nmにおけるO.D.が0.1になるようにBBで懸濁液を
希釈した（1x107CFU/mL）。
この試験では、OD.＜0.1または細菌数が少なくとも10
3〜104/胃（対照では105〜106）のマウスは防御能を有
すると考えた。この試験では、非免疫投与／感染および
非免疫投与／非感染対照群のマウスも設けた（結果は表
示せず）。
図21aから明らかなように、上記の検定法で判断した
防御効果（皮下投与による）の順位は、PLGpS/rウレア
ーゼ/DC−Chol（幾何学的平均＝0.092）＞PLGpS/rウレ
アーゼ/CT−Ｘ（幾何学的平均＝0.105）、PLGpS/rウレ
アーゼ（幾何学的平均＝0.163）、PLGpS/rウレアーゼ/P
CPP（幾何学的平均＝0.269）であった。この試験では、
防御の標準としてLT＋ｒウレアーゼ（経口）陽性対照
（幾何学的平均＝0.136）を用いた。興味あることに、
ｒウレアーゼ＋可溶性DC−Chol（幾何学的平均＝0.60
0）またはｒウレアーゼ＋PCPP（幾何学的平均＝1.07）
対照群では抗原とアジュバントをPLGpS微粒子製剤とし
てカプセル化する明瞭な利点が認められた。
データをMann−Whitneyの方法で統計学的に解析し、
以下の結論が得られた。PLGpS/rウレアーゼ/DC−Cholお
よびPLGpS/rウレアーゼ/CT−Ｘ製剤は、LT＋ｒウレアー
ゼ陽性対照群として比較して有意差が認められなかっ
た。PLGpS/rウレアーゼ/PCPP、ｒウレアーゼ＋DC−Chol
およびｒウレアーゼ＋PCPP群ではこれらの群と比較して
有意差が認められ（ｐ＜0.01）、PLGpS/rウレアーゼ群
ではPLGpS/rウレアーゼ/PCPP、ｒウレアーゼ＋DC−Chol
およびｒウレアーゼ＋PCPP群と比較して有意差が認めら
れた（ｐ＜0.01）。
この統計学的解析から、PLGpS/rウレアーゼ/DC−Chol
（マウス7/8匹でOD.＜0.1）およびPLGpS/rウレアーゼ/C
T−Ｘ（マウス5/8匹でOD.＜0.1）微粒子群では明瞭な防
御効果が認められ、一方PLGpS/rウレアーゼ（マウス2/8
匹でOD.＜0.1）微粒子群およびｒウレアーゼ＋DC−Chol
群（マウス2/10匹でOD.＜0.1）群では中等度の防御効果
が認められ、PLGpS/rウレアーゼ/PCPP（マウス0/8匹でO
D.＜0.1）微粒子群およびｒウレアーゼ＋PCPP群（マウ
ス0/10匹でOD.＜0.1）群では防御効果が低いか、全く認
められなかった。この傾向は、免疫原性試験（実施例2
0）で得られたTh2/Th1バランス比と一致した。
図21bに示すように、経口免疫投与では、アジュバン
トを含むPLGpS微粒子を免疫投与したいずれの群のマウ
スでも完全な防御効果は得られなかった。統計学的順位
は、PLGpS/rウレアーゼ/CT−Ｘ（幾何学的平均＝0.22
9）＞PLGpS/rウレアーゼ/DC−Chol（幾何学的平均＝0.4
03）、PLGpS/rウレアーゼ（幾何学的平均＝0.475）、PL
GpS/rウレアーゼ/PCPP（幾何学的平均＝0.493）であっ
た。この試験では、陽性対照としてLT＋ｒウレアーゼ
（経口）群（幾何学的平均＝0.136）を用いた。
データをMann−Whitneyの方法で統計学的に解析し、
以下の結論が得られた。LT＋ｒウレアーゼ陽性対照群で
はPLGpS/rウレアーゼ/DC−CholおよびPLGpS/rウレアー
ゼ/CT−Ｘ製剤と比較して有意差が認められた（ｐ＜0.0
1）。PLGpS/rウレアーゼ/DC−CholおよびPLGpS/rウレア
ーゼ/CT−Ｘ製剤では、その他の群と比較して有意差が
認められなかった。PLGpS/rウレアーゼおよびPLGpS/rウ
レアーゼ/PCPPでは、その他の群と比較して有意差が認
められなかった。
この試験で、PLGpS/rウレアーゼ/CT−Ｘ（マウス2/8
匹でOD.＜0.1）およびPLGpS/rウレアーゼ/DC−Chol（マ
ウス1/8匹でOD.＜0.1）微粒子製剤群では部分的な防御
効果が認められた。一方ｒウレアーゼ＋LT陽性対照群で
は完全な防御効果が認められた（マウス7/8匹でOD.＜0.
1）。
実施例14〜16で明らかなように、アジュバントをPLGp
S微粒子等の担体とともに免疫系に供給するとアジュバ
ント効果が高くなり、その結果ワクチンの効果も高くな
る。
特に、この実施例における典型的な対照試験でDC−Ch
olまたはPCPP等のアジュバントと、ｒウレアーゼの可溶
性混合物を皮下免疫投与後の免疫原性および防御効果を
測定したところ、防御効果は低いか、中等度であること
が確認された。これらの結果から、抗原とアジュバント
を微粒子状のマトリックスとともに供給するとかなり効
果の高いワクチンが得られるという証拠が得られた。
この実施例では、さらにアジュバントの毒性軽減およ
びこの種のアジュバントの特徴である免疫反応の質的改
善等の利点があることが実証された。PLGpS/rウレアー
ゼ/CT−Ｘ製剤微粒子の経口免疫投与後に得られたｒウ
レアーゼに対するIgGサブタイプ抗体反応が非特徴的にI
gG2a側（Th1経路）にかたよるということも実験的に実
証された。
また、co−カプセル化した抗原とCT−Ｘ（既知の粘膜
アジュバント）を皮下または経口投与した場合、この物
質は製剤および貯蔵中に高分子マトリックス内の抗原を
安定化させ、HSAまたはBSAの存在下で調製した微粒子と
同様な機構（参考文献35）で放出するものと思われる。
結論として、この試験で、PLGpS微粒子を利用した全
身免疫投与により、マウスモデルでH.pyloriの感染に対
して著しい防御効果を誘導する効果のあることが確認さ
れた。また、この試験で、PLGpS微粒子を利用した経口
免疫投与により、マウスモデルでH.pyloriの感染に対し
て部分的な防御効果を誘導する効果のあることも確認さ
れた。
さらに、アジュバント（特にDC−CholまたはCT−Ｘ）
とともにｒウレアーゼをco−カプセル化すると、ワクチ
ン効果の顕著な向上が得られる。
開示の要約 本発明は、高分子と生物学的に活性な物質のマトリッ
クスからなる物質、特に生物学的活性を有する物質の粒
状担体を提供する。粒状担体は微粒子の形態で、粘膜ま
たは非経口的に投与すると、検体の免疫系細胞に物質を
効果的に運搬し、免疫反応を誘導することができる。本
発明の範囲で、改良が可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０８Ｌ 81:00 Ｃ０８Ｌ 81:00 (72)発明者 クライン、 マイケル、 エイチ. カナダ国 エム２ピー １ビー９ オン タリオ州 ウィロウダール マンロウ ブールヴァード 16 (56)参考文献 欧州特許出願公開600161（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08G 63/00 - 63/91 C08G 75/26 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式： （上記式中、R1、R2、R3、R4およびR5はそれぞれ独立し
    て、水素原子、直鎖状アルキル基および分岐鎖状アルキ
    ル基から選択され、R6は水素原子、アミン保護基、スペ
    ーサ分子及び生物学的に活性な活性種から選択され、Ｘ
    は−Ｏ−及び−Ｓ−から選択され、ｘおよびｙは整数で
    ある） の骨格を有することを特徴とする生分解性及び生体適合
    性を有するポリマー。
  2. 【請求項２】ｘおよびｙが、ポリマーが、少なくとも95
    ％のα−ヒドロキシ残基を有する値の整数である請求項
    １に記載のポリマー。
  3. 【請求項３】少なくとも１種のα−ヒドロシキ酸と、少
    なくとも１種の疑似（pseudo）−α−アミノ酸を含むモ
    ノマーの共重合により得られる請求項１または２に記載
    のポリマー。
  4. 【請求項４】前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸
    が、式:R1R2COHCO2Hで表わされ、該式中、R1およびR
    2は、それぞれ独立して、水素原子、または直鎖状アル
    キル単位もしくは分岐鎖状アルキル単位であり、かつ該
    アルキル基単位は式:CnH2n+1で表され、該式中、ｎは１
    から10の整数である請求項３に記載のポリマー。
  5. 【請求項５】前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸
    が、２種以上のα−ヒドロキシ酸の混合物であり、該混
    合物が、前記式:R1R2COHCO2HにおけるR1およびR2が水素
    であるα−ヒドロキシ酸と、該式におけるR1がCH3、R2
    が水素原子であるα−ヒドロキシ酸を含む請求項４に記
    載のポリマー。
  6. 【請求項６】前記少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸
    が、式:R5CHNHR6CO2Hで表わされ、該式中、R5はヒドロ
    キシメチル基またはメチルチオール基であり、R6はアミ
    ン保護基である請求項３〜５のいずれかに記載のポリマ
    ー。
  7. 【請求項７】前記アミン保護基が、カルボベンジルオキ
    シ（CBZまたはＺ）、ベンジル（Bn）、パラメトキシベ
    ンジル（MeOBn）、ベンジルオキシメトキシ（BOM）、te
    rt−ブチルオキシカルボニル（ｔ−BOC）および［９−
    フルオレニルメチルオキシ］カルボニル（FMOC）からな
    る群から選択されたものである請求項６に記載のポリマ
    ー。
  8. 【請求項８】前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸
    が、Ｌ−乳酸、D,L−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ
    吉草酸およびヒドロキシ酪酸からなる群から選択された
    ものであり、前記少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸
    が、セリンから誘導されたものである請求項３に記載の
    ポリマー。
  9. 【請求項９】前記ポリマーが、ポリ−D,L−ラクチド−c
    o−グリコリド−co−疑似−Ｚ−セリンエステル（PLGpZ
    S）である請求項１に記載のポリマー。
  10. 【請求項１０】前記ポリマーが、ポリ−P,L−ラクチド
    −co−グリコリド−co−疑似−セリンエステル（PLGp
    S）である請求項１に記載のポリマー。
  11. 【請求項１１】前記R6が、少なくとも１種の生物学的に
    活性な活性種である請求項３〜10のいずれかに記載のポ
    リマー。
  12. 【請求項１２】前記R6が、少なくとも１種の生物学的に
    活性な活性種が結合している、少なくとも１種のスペー
    サ分子である請求項11に記載のポリマー。
  13. 【請求項１３】スペーサ分子が、式;R7R8COHCO2Hで表さ
    れるα−ヒドロキシ酸（該式中、R7及びR8はそれぞれ独
    立して、水素原子、直鎖状アルキル単位または分岐鎖ア
    ルキル単位である）および式R9CHNHR10CO2Hで表される
    疑似−α−アミノ酸（該式中、R9基はヒドロキシメチル
    基またはメチルチオール基であり、R10はアミン保護基
    である）から選択されたものである請求項12に記載のポ
    リマー。
  14. 【請求項１４】前記少なくとも１種の生物学的に活性な
    活性種が、細胞の生物学的な付着基、マクロファージ刺
    激物質、ポリアミノ酸およびポリエチレングリコールか
    らなる群から選択されたものである請求項11〜13のいず
    れかに記載のポリマー。
  15. 【請求項１５】5000〜40000ダルトンの分子量を有する
    請求項１〜14のいずれかに記載のポリマー。
  16. 【請求項１６】生物学的に活性な物質の宿主への配送の
    ための粒子担体の形に形成されている請求項１〜15のい
    ずれかに記載のポリマー。
  17. 【請求項１７】前記粒子担体が１〜50μｍの大きさを有
    する請求項16に記載のポリマー。
  18. 【請求項１８】前記粒子担体が、該粒子担体中に捕獲さ
    れた、あるいは該粒子担体と物理的に混合された、少な
    くとも１種の生物学的に活性な物質を有する請求項16ま
    たは17に記載のポリマー。
  19. 【請求項１９】前記少なくとも１種の生物学的に活性な
    物質が、免疫応答を引き起こすことのできるものである
    請求項18に記載のポリマー。
  20. 【請求項２０】少なくとも１種のアジュバントが、捕獲
    され、あるいは物理的に混合されている請求項16〜19の
    いずれかに記載のポリマー。
  21. 【請求項２１】下記式： （上記式中、R1、R2、R3、R4およびR5はそれぞれ独立し
    て、水素原子、直鎖状アルキル基および分岐鎖状アルキ
    ル基から選択され、R6は水素原子、アミン保護基、スペ
    ーサ分子及び生物学的に活性な活性種から選択され、Ｘ
    は−Ｏ−及び−Ｓ−から選択され、ｘおよびｙは整数で
    ある） で表わされる生分解性及び生体適合性を有するポリマー
    の製法であって、 不活性雰囲気条件下で、エステル化触媒の有機溶媒溶液
    により、少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸と、アミン
    保護基を有する少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸と
    を含むモノマーの混合物を形成する工程と、 前記モノマーを共重合させてポリマーを得る工程と、 前記ポリマーを反応混合物から単離する工程と を有することを特徴とするポリマーの製造方法。
  22. 【請求項２２】前記形成されたポリマーが、更に、固相
    触媒による還元または酸触媒の作用で脱保護処理される
    請求項21に記載の製造方法。
  23. 【請求項２３】前記脱保護が、酢酸溶液中の臭化水素の
    存在下における酸触媒作用により行われる請求項22に記
    載の製造方法。
  24. 【請求項２４】前記触媒が、２−エチルヘキサン酸第一
    スズである請求項21〜23のいずれかに記載の製造方法。
  25. 【請求項２５】前記有機溶媒が無水クロロホルムである
    請求項21〜24のいずれかに記載の製造方法。
  26. 【請求項２６】ポリマーをフィルムまたは微小粒子に成
    形する工程を更に含む請求項21〜25のいずれかに記載の
    製造方法。
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