CN110869498A

CN110869498A - 经由核递送crispr/cas9导向编辑细胞rna

Info

Publication number: CN110869498A
Application number: CN201880046061.8A
Authority: CN
Inventors: E·叶; K·布莱南; R·玛丽娜; D·尼尔斯
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2020-03-06
Also published as: US11453891B2; EP3622062A1; US20230053915A1; CA3062595A1; AU2018265022A1; US20180334685A1; JP7398279B2; EP3622062A4; JP2023106391A; WO2018208998A1; JP2020519269A

Abstract

本文公开了使用RNA‑靶向CRISPR/Cas9以单核苷酸分辨率进行可编程RNA编辑的技术。申请人将该方法称之为“Cas9导向RNA编辑”或“CREDIT”，该方法提供以时间方式可逆地改变遗传信息的方式，不同于依赖于永久改变DNA序列的传统CRISPR/Cas9驱动的基因组工程改造。

Description

经由核递送CRISPR/CAS9导向编辑细胞RNA

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年5月10日提交的美国临时申请号62/504,497的优先权，其内容通过引用其全文纳入本文。

政府支持声明

本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号HG004659和NS075449资助完成。政府对本发明拥有一定的权利。

背景

旨在靶向并操作活细胞中RNA的本策略主要依赖于使用反义寡核苷酸(ASO)或工程改造的RNA结合蛋白(RBP)。虽然ASO疗法已经在消除致病转录本或操纵RBP结合中显示出巨大前景，但是它们是合成构建的，并因此不能在DNA内被编码。这使得潜在的基因疗法策略复杂化，该策略将依赖于在患者的一生中定期给予ASO。此外，它们不能够调节RNA的遗传序列。虽然可以设计RBP，诸如蛋白质的Pumilio和FBF同源家族(RUF)，以识别靶转录本并与RNA修饰效应物融合，从而能够特异性的识别和操纵，基于这类类型构建体的平台需要针对各种靶标进行大量的蛋白质工程改造并且可以证明是困难且昂贵的。

当前用于直接编辑RNA的系统基于不可编码组件，如化学融合向导RNA与编辑酶部分(例如，SNAP标签)，或者相对低亲和力栓系，其通过融合可编辑适配体结合部分(例如，BoxB蛋白)。

当前的CRISPR/Cas RNA靶向系统通常使用单向导RNA以及任选地，交替的2’OMeRNA(alternating 2’OMe RNA)和DNA碱基(PAM聚体(PAMmer))的寡核苷酸，以提供用于靶向活细胞中特异性RNA分子的简单且快速的可编程系统。然而，对于这些系统的改进和/或替代方案可以协助解决与效率、特异性和/或脱靶编辑事件相关的问题。本发明解决了这些需求并提供了相关的优点。

发明内容

因此，本文提供了可编辑且高度特异性的CRISPR/Cas系统、组合物和方法以实现以简单、可靠和多功能的方式高效且可逆地操纵和调节靶DNA。

在一些方面中，本文提供了用于对靶RNA进行CRISPR/Cas导向RNA编辑(CRISPR/Cas-directed RNA edit)的重组表达系统，其包括，或由下述组成或基本上由下述组成：(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase acting on RNA，ADAR)催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活(nuclease-dead)CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。在一些实施方式中，所述表达系统表达dCas-ADAR核蛋白复合物，其能够对靶序列进行CRISPR/Cas RNA-RNA碱基特异性腺苷至肌苷(A-I)编辑。

在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA进一步包含(iii)间隔子序列，所述间隔子序列含有与靶RNA具有同源性的区域。

在重组表达系统的一些实施方式中，(A)和(B)包含在同一载体内或者包含在不同的载体内。在重组表达系统的一些实施方式中，载体是病毒载体。在重组表达系统的一些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体。

在重组表达系统的一些实施方式中，ADAR选自下组：ADAR1、ADAR2和ADAR3。在一些实施方式中，ADAR的催化活性脱氨酶结构域是ADAR2的催化活性脱氨酶结构域。在重组表达系统的一些实施方式中，ADAR2的催化活性脱氨酶结构域是(1)人ADAR2的野生型催化活性脱氨酶结构域或(2)相较于野生型人ADAR2催化活性增强的ADAR2的突变型人催化活性脱氨酶结构域。在重组表达系统的一些实施方式中，ADAR2的突变型人催化活性脱氨酶结构域包含E488Q突变。

在重组表达系统的一些实施方式中，dCas是核酸酶失活Cas9(dCas9)。在重组表达系统的一些实施方式中，dCas9 N末端结构域与ADAR的催化活性脱氨酶结构域的C末端融合。在重组表达系统的一些实施方式中，dCas与ADAR的催化活性脱氨酶结构域经由接头融合。在重组表达系统的一些实施方式中，接头是半柔性XTEN肽接头。在一些实施方式中，接头是GSGS接头。

在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA的短延伸序列是3'延伸序列。在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA的短延伸序列包含能够与靶序列近乎完美RNA-RNA碱基配对的同源性区域。在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA的短延伸序列还包括针对靶RNA内腺苷的第二错配。在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA的短延伸序列还包括针对靶RNA内腺苷的第三错配，以及任选地针对靶RNA内腺苷的第四错配。在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA的短延伸序列的长度为约15个核苷酸至约60个核苷酸。

在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA还包含标志物序列。

在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA还包含RNA聚合酶III启动子序列。在重组表达系统的一些实施方式中，RNA聚合酶III启动子序列是U6启动子序列。

在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA包含位于间隔子序列和支架序列之间的接头序列。

在重组表达系统的一些实施方式中，esgRNA的(i)、(ii)和(iii)序列按3'-5'位于esgRNA中。

在重组表达系统的一些实施方式中，表达系统还包含编码PAM序列的核酸。

在一些方面中，本文提供了载体，其包含，由下述组成或基本上由下述组成：编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，(ii)dCas支架结合序列，和(iii)与靶核酸互补的序列(间隔子序列)，其中(i)、(ii)和(iii)按3'-5'位于esgRNA中。

在载体的一些实施方式中，所述载体是病毒载体。在载体的一些实施方式中，病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体。在载体的一些实施方式中，载体还包含表达控制元件。

在一些方面中，本文提供了含载体的病毒颗粒，其包含，由下述组成或基本上由下述组成：编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，(ii)dCas支架结合序列，和(iii)与靶核酸互补的序列(间隔子序列)，其中(i)、(ii)和(iii)按3'-5'位于esgRNA中。在一些实施方式中，本文提供了含一种或多种载体的病毒颗粒，其包含(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(ADAR)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。

在一些方面中，本文提供了含有重组表达系统、病毒颗粒和/或载体的细胞，其包含，由下述组成或基本上由下述组成：编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，(ii)dCas支架结合序列，和(iii)与靶核酸互补的序列(间隔子序列)，其中(i)、(ii)和(iii)按3'-5'位于esgRNA中。在一些实施方式中，本文提供了含一种或多种病毒颗粒、重组表达系统和/或载体的细胞，其包含(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(ADAR)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。

本文还提供了选择性RNA编辑的方法，其包括，由下述组成或基本上由下述组成：给予细胞重组表达系统、病毒颗粒和/或载体中的任一种，其包含，由下述组成或基本上由下述组成：编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，(ii)dCas支架结合序列，和(iii)与靶核酸互补的序列(间隔子序列)，其中(i)、(ii)和(iii)按3'-5'位于esgRNA中。在一些实施方式中，方法还包括给予反义合成寡核苷酸化合物，其包含交替的2’OMe RNA和DNA碱基(PAM聚体)。在一些实施方式中，方法为体外的或体内的。在一些实施方式中，本文提供了选择性RNA编辑的方法，其包括，或由下述组成或基本上由下述组成：给予重组表达系统、病毒颗粒和/或载体中的任一种，其包含，或由下述组成或基本上由下述组成：(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(ADAR)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。

本文还提供了表征导向细胞RNA编辑(directed cellular RNA edit)对加工和动力学作用的方法，其包括给予样品细胞重组表达系统、病毒颗粒和/或载体中的任一种，其包含，有下述组成或基本上由下述组成：编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，(ii)dCas支架结合序列，和(iii)与靶核酸互补的序列(间隔子序列)，其中(i)、(ii)和(iii)按3'-5'位于esgRNA中；和确定其作用。在一些实施方式中，样品源自对象。在一些实施方式中，方法为体外的或体内的。在一些实施方式中，本文提供了表征导向细胞RNA编辑对加工和动力学作用的方法，其包括给予样品重组表达系统、病毒颗粒和/或载体中的任一种，其包含，或由下述组成或基本上由下述组成：(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(ADAR)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列；和确定其作用。

在其他方面中，本文提供了治疗对象中疾病或病症的方法，其包括，给予对象或分离自对象的样品细胞重组表达系统、病毒颗粒和/或载体中的任一种，其包含，有下述组成或基本上由下述组成：编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，(ii)dCas支架结合序列，和(iii)与靶核酸互补的序列(间隔子序列)，其中(i)、(ii)和(iii)按3'-5'位于esgRNA中。在一些实施方式中，本文提供了治疗对象中疾病或病症的方法，其包括给予对象或分离自对象的样品细胞重组表达系统、病毒颗粒和/或载体中的任一种，其包含，或由下述组成或基本上由下述组成：(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(ADAR)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。

在一些实施方式中，方法还包括校正靶RNA中的G-A突变。在一些实施方式中，疾病选自下组：霍勒氏综合症(Hurler’s syndrome)，囊性纤维化，杜兴氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)，脊髓损伤，中风，外伤性脑损伤，听力损失(通过噪音过度暴露或耳毒性)，多发性硬化症，阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，帕金森氏病，酒精中毒，酒精戒断，过快的苯二氮(benzodiazepine)戒断和亨廷顿病。

在一些方面中，本文提供了试剂盒，其包含，或由下述组成或基本上由下述组成：一种或多种重组表达系统、病毒颗粒和/或载体，其包含，或由下述组成或基本上由下述组成：(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(ADAR)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列；和使用说明书。在一些实施方式中，说明书根据本文所述方法中的任一种使用。

附图简要说明

图1A-1D显示了(但不限于)重组表达系统以及与之相关数据的实施方式。图1A显示了(i)活细胞中CREDIT的概念上的观念，用于编辑可以导致各种疾病如癌症和神经退行性变的各种RNA，以及(ii)dCas9-脱氨酶融合体与向导RNA的结合指导围绕靶腺苷生成的双联RNA(dsRNA)A-I碱基特异性编辑的靶标周围向导-延伸物的杂交。具体地，图1B显示了CREDIT重组表达系统，其包括通过XTEN接头与人ADARB1(ADAR2)的脱氨酶结构域(DD)融合的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白，和单向导RNA(sgRNA)，其具有3'短RNA延伸(esgRNA)。图1C的荧光成像数据显示了图1B的重组表达系统需要具有3'延伸指导的脱氨基作用的靶向双向导RNA并允许逆转提前终止密码子(PTC)介导的对来自eGFP报告物转录本的表达的沉默。图1D显示了重组表达系统的FACS定量，所示重组表达系统利用通过靶向和非靶向向导导向的针对RCas9的野生型和超活性脱氨酶融合体。

图2显示了(但不限于)基于AAV载体系统的示例性重组表达系统。该AAV系统包含载体，所述载体携带编码ADAR脱氨酶结构/Cas内切核酸酶融合蛋白的核酸序列以及待包装成AAV病毒粒子的延长单向导RNA(esgRNA)。

图3显示了pcDNA3.1(1)_ADAR2_XTEN_dCas9(SEQ ID NO:27)的图谱。CMV增强子位于位置235-614(长度为380bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。CMV启动子位于位置615-818(长度为204bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。ADARB1催化结构域位于位置961-2100(长度为1140bp)并编码人ADAR2的催化活性脱氨基结构域(ADARB1)。XTEN位于位置2101-2148(长度为48bp)并编码连接蛋白结构域的肽接头。dCas9位于位置2149-6252(长度为4104bp)并编码来自酿脓链球菌的催化失活的(D10A和H841A)CRISPR-Cas9蛋白。HA位于位置6256-6282(长度为27bp)并编码人流感血球凝集素(HA)表位标签。2X SV40 NLS位于位置6301-6348(长度为48bp)并编码源自猿猴病毒40(SV40)大T抗原的核定位信号(NLS)。bGH多聚(A)信号位于位置6426-6650(长度为225bp)并编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图4显示了pcDNA3.1(1)_ADAR2_XTEN_对照(SEQ ID NO:28)的图谱。CMV增强子位于位置235-614(长度为380bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。CMV启动子位于位置615-818(长度为204bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。ADARB1催化结构域位于位置961-2100(长度为1140bp)并编码人ADAR2的催化活性脱氨基结构域(ADARB1)。XTEN位于位置2101-2148(48bp)并编码连接重组蛋白结构域的肽接头。HA位于位置2152-2178(长度为27bp)并编码人流感血球凝集素(HA)表位标签2X SV40 NLS位于位置2197-2244(长度为48bp)并源自猿猴病毒40(SV40)大T抗原的核定位信号(NLS)。bGH多聚(A)信号位于位置2322-2546(225bp)并编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图5显示了pcDNA3.1_ADAR2(E488Q)_XTEN_dCas9(SEQ ID NO:29)的图谱。CMV增强子位于位置235-614(380bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。CMV启动子位于位置615-818(204bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。ADARB1(E488Q)催化结构域位于位置961-2100(1140bp)并编码具有超活性点突变(E488Q)的人ADAR2的催化活性脱氨基结构域(ADARB1)。XTEN位于位置2101-2148(48bp)并编码连接重组蛋白结构域的肽接头。dCas9位于位置2149-6252(4104bp)并编码来自酿脓链球菌的催化失活的(D10A和H841A)CRISPR-Cas9蛋白。HA位于位置6256-6282(27bp)并编码人流感血球凝集素(HA)表位标签。2X SV40 NLS位于位置6301-6348(48bp)并编码源自猿猴病毒40(SV40)大T抗原的核定位信号(NLS)。bGH多聚(A)信号位于位置6426-6650(225bp)并编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图6显示了pcDNA3.1_ADAR2(E488Q)_XTEN_对照(SEQ ID NO:30)的图谱。CMV增强子位于位置235-614(380bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。CMV启动子位于位置615-818(204bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。ADARB1(E488Q)催化结构域位于位置961-2100(1140bp)并编码具有超活性点突变(E488Q)的人ADAR2的催化活性脱氨基结构域(ADARB1)。XTEN位于位置2101-2148(48bp)并编码肽接头连接重组蛋白结构域。HA位于位置2152-2178(27bp)并编码人流感血球凝集素(HA)表位标签。2X SV40 NLS位于位置2197-2244(48bp)并编码源自猿猴病毒40(SV40)大T抗原的核定位信号(NLS)。bGH多聚(A)信号位于位置2322-2546(225bp)并编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图7显示了50bp_GFP_mCherry_延伸(SEQ ID NO:31)的图谱。U6启动子位于位置4555-4817(263bp)并且是驱动哺乳动物细胞中sgRNA表达的Pol III启动子。EGFP靶向间隔子位于位置4818-4838(21bp)并编码靶向互补EGFP报告物mRNA的sgRNA的间隔子序列。sgRNA支架位于位置4839-4924(86bp)并编码具有(F+E)修饰的酿脓链球菌CRISPR-Cas9系统的sgRNA支架(Chen等2014)。接头位于位置4925-4930(6bp)，编码将sgRAN支架与延伸序列桥接的接头序列。EGFP延伸位于位置4931-4951(21bp)，编码RNA延伸序列，所述RNA延伸序列与靶位点碱基配对并且使用A-C错配实施A-至-I的编辑。sgRNA支架终止位点位于位置1-7(7bp)，包含终止Pol III RNA合成的多聚(T)序列。Ef1a启动子位于位置21-566(546bp)，其是驱动哺乳动物细胞中蛋白表达的组成型启动子。mCherry位于位置572-1282(711bp)，编码DsRed荧光蛋白的单体衍生物。bGH多聚(A)信号位于位置1330-1554(225bp)，编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图8显示了缺间隔子(spacerless)_GFP_mCherry_延伸(SEQ ID NO:32)的图谱。U6启动子位于位置757-1019(263bp)并且是驱动哺乳动物细胞中sgRNA表达的Pol III启动子。sgRNA支架位于位置1020-1105(86bp)，编码具有(F+E)修饰的酿脓链球菌CRISPR-Cas9系统的sgRNA支架(Chen等2014)。接头位于位置1106-1111(6bp)，包含将sgRAN支架与延伸序列桥接的接头序列。EGFP延伸位于位置1112-1132(21bp)，编码RNA延伸序列，所述RNA延伸序列与靶位点碱基配对并且使用A-C错配实施A-至-I的编辑。sgRNA支架终止位于位置1133-1139(7bp)，包含终止Pol III RNA合成的多聚(T)序列。Ef1a启动子位于位置1153-1698(546bp)并且是驱动哺乳动物细胞中蛋白表达的组成型启动子。mCherry位于位置1704-2414(711bp)，编码DsRed荧光蛋白的单体衍生物。bGH多聚(A)信号位于位置2462-2686(225bp)，编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图9显示了GFP_无_间隔子_revcomp_mCherry_gibson(SEQ ID NO:33)的图谱。U6启动子位于位置4555-4817(263bp)并且是驱动哺乳动物细胞中sgRNA表达的Pol III启动子。sgRNA支架位于位置4818-4903(86bp)并编码具有(F+E)修饰的酿脓链球菌CRISPR-Cas9系统的sgRNA支架(Chen等2014)。接头位于位置4904-4909(6bp)，编码将sgRAN支架与延伸序列桥接的接头序列。EGFP revcomp延伸位于位置4910-4930(21bp)，编码与EGFP mRNA靶位点的序列匹配的RNA反向互补延伸序列。sgRNA支架终止位点位于位置1-7(7bp)，包含终止Pol III RNA合成的多聚(T)序列。Ef1a启动子位于位置21-566(546bp)并且是驱动哺乳动物细胞中蛋白表达的组成型启动子。mCherry位于位置572-1282(711bp)，编码DsRed荧光蛋白的单体衍生物。bGH多聚(A)信号位于位置1330-1554(225bp)，编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图10显示了pBluescript II SK+U6-λ2-sgRNA(F+E)(SEQ ID NO:34)的图谱。U6启动子位于位置757-1019(263bp)并且是驱动哺乳动物细胞中sgRNA表达的Pol III启动子。λ2向导序列位于位置1020-1039(20bp)，编码靶向λ噬菌体2的非靶向sgRNA序列。sgRNA支架位于位置1041-1132(92bp)，编码具有(F+E)修饰的酿脓链球菌CRISPR-Cas9系统的sgRNA支架(Chen等2014)。

图11显示了EGFP_缺间隔子_SaCas9_sgRNA(SEQ ID NO:47)的图谱。U6启动子位于位置4555-4817(263bp)并且是驱动哺乳动物细胞中sgRNA表达的Pol III启动子。Sa sgRNA支架位于位置4819-4894(76bp)，编码具有A-U碱基翻转(base flip)的金黄色葡萄球菌CRISPR-Cas9系统的sgRNA支架(Chen等2016)。接头位于位置4895-4900(6bp)，编码将sgRAN支架与延伸序列桥接的接头序列。EGFP延伸位于位置4901-4921(21bp)，编码RNA延伸序列，所述RNA延伸序列与靶位点碱基配对并且使用A-C错配实施A-至-I的编辑。sgRNA支架终止位点位于位置1-7(7bp)，包含终止pol III RNA合成的多聚(T)序列。Ef1a启动子位于位置21-566(546bp)，其是驱动哺乳动物细胞中蛋白表达的组成型启动子。mCherry位于位置572-1282(711bp)，编码DsRed荧光蛋白的单体衍生物。bGH多聚(A)信号位于位置1330-1554(225bp)，编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图12显示了ADAR2_E488Q_dSaCas9_pCDNA3_1(SEQ ID NO:48)的图谱。CMV增强子位于位置235-614(380bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。CMV启动子位于位置615-818(204bp)并在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的组成型表达。ADARB1催化结构域位于位置961-2100(1140bp)并编码人ADAR2的催化活性脱氨基结构域(ADARB1)。GS接头位于位置2101-2112(12bp)并编码甘氨酸-丝氨酸肽接头以桥接蛋白质结构域。dSaCas9位于位置2113-5268(3156bp)，编码来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的催化失活(具有点突变D10A和N580A)CRISPR-Cas9蛋白。HA位于位置5272-5298(27bp)，编码人流感血球凝集素(HA)表位标签。2X SV40 NLS位于位置5317-5364(48bp)，源自猿猴病毒40(SV40)大T抗原的核定位信号(NLS)。bGH多聚(A)信号位于位置5442-5666(225bp)，编码牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。

图13A-13B显示了含有源自酿脓链球菌(S.pyogenes)的核酸酶失活Cas9(dSpCas9)的重组表达系统和含有源自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的核酸酶失活Cas9(dSaCas9)的重组表达系统之间的比较。dSaCas9显著小于dSpCas9，其在病毒包装中提供效率。图13A显示了具有XTEN接头的ADAR2(E488Q)-dSpCas9融合构建体(Sp-CREDITv1)，并显示了具有GSGS接头的ADAR2(E488Q)-dSaCas9融合构建体(Sa-CREDITv1)。图1B显示了这样的实验结果，其中Sp-CREDITv1的效率与Sa-CREDITv1的效率比较。该数据显示了通过两种CREDIT系统成功编辑了GFP报告物，并且Sa-CREDITv1展现出最高频率经编辑的细胞。

发明详述

下文将更完整地描述本公开的实施方式。但是，本公开的各方面可以以许多不同的形式来实施，并且不应被解读成限制于本文阐述的实施方式。当然，提供这些实施方式使得本公开透彻而完整，并且能够向本领域技术人员完整地展示本发明的范围。本文描述中所用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而不是限制性的。

除非另外定义，本文中所使用的所有术语(包括技术和科学术语)的含意与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。还将进一步理解的是，术语，诸如在常用词典中定义的术语，应被解释为具有与其在本申请和相关领域上下文中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过度正式的意义解释，除非本文明确定义。虽然下文没有明确定义，但是应当根据其通常含义理解这类术语。

用于本文说明的术语仅仅用来描述具体的实施方式，而不是用于限制本发明。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。

除非另有说明，本发明的实施将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，它们均在本领域技术范围内。

需要具体说明的是，除非另有说明，否则本文描述的本发明的各种特征可以以任意组合方式使用。此外，本公开还考虑了在一些实施方式中，可以排除或省略本文所示的任何特征或特征的组合。举例说明，如果说明书指出复合体包含组分A、B或C，其具体旨在说明A、B或C中任意一种或其组合可以被省略并且单独或以任意组合方式排除。

除非以其他方式明确地指出，所有特定的实施方式、特征和术语旨在包括所述实施方式、特征或术语及其生物学等同物。

所有指定数值，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都涵盖(+)或(-)1.0或0.1(如适用)幅度变动的近似值，或者+/-15％，或者10％，或者5％或者2％的变化。应理解，尽管并非均为明示，所有指定数值之前都有“约”。还应理解，尽管并非均为明示，本文述及的试剂仅仅是示例性的，其等同物是本领域所知的。

定义

如在本发明和所附权利要求的描述中所使用的，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非文本中有另外的明确表示。

本文所用术语“约”在指示诸如量或浓度等可测量值时，表示涵盖了该特定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。

该术语或“可接受的”、“有效的”或“足够的”在用于描述本文所公开的任何组分、范围、剂型等的选择时旨在表示所述组分、范围、剂型适合所公开的目的。

本文所用“多核苷酸”或“核苷酸”在本文可以互换使用，指代任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。多核苷酸或核苷酸序列可以是双链的或者单链的。当多核苷酸或核苷酸序列是单链时，其可以指代两条互补链中的任一条。核苷酸可以是脱氧核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶纳入聚合物的任何底物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和其类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物的组装之前或之后赋予。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可以被进一步修饰，如通过与标记组分偶联。其他类型的修饰包括，例如，“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷内修饰，例如，具有不带电荷连接(如甲基膦酸酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的那些，含有侧接部分的那些，例如，蛋白质(如核酸酶，毒素，抗体，信号肽，ply-L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(如吖啶，补骨脂素等)的那些，含有螯合剂(如金属，放射性金属，硼，氧化性金属等)的那些，含有烷基化剂的那些，具有经修饰连接(如α异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，糖中通常存在的任何羟基可以被例如膦酸酯基、磷酸基取代，被标准保护基保护，或者被活化以制备其他核苷酸的其他连接，或者可与固体支持物偶联。5′和3′末端OH可以被1-20个碳原子的有机加帽基团或胺取代或磷酸化。其他羟基也可以衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域所熟知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括例如，2′-O-甲基-2′-O-烯丙基，2′-氟代-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖，如阿拉伯糖，木糖或来苏糖(lyxose)，吡喃糖，呋喃糖，七庚二糖，无环类似物和无碱基核苷类似物如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯连接可以被其他连接基团取代。这些其他连接基团包括但不限于，这样的实施方式，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代酯(dithioate)”)、“(O)NR 2(“酰胺(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH 2(“缩甲醛(formacetal)”)取代，其中各R或R′独立地为H或取代的或未取代的烷基(1-20C)，任选地包含醚(—O—)键，芳基，烯基，环烷基，环烯基或芳基。多核苷酸中所有的连接不需要是相同的；之前描述适用于本文所提及的任何多核苷酸，包括RNA和DNA。

本文所用“寡核苷酸”通常指短的，通常为单链，通常为合成的多核苷酸，它们通常(但是不是必需)的长度小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”彼此并不互相排斥。对于多核苷酸的上述描述同样也完全适用于寡核苷酸。

“核酸”、“核酸分子”或“核酸序列”在本文可互换使用以指代多核苷酸和/或寡核苷酸。在一些实施方式中，核酸与多核苷酸和/或寡核苷酸可互换使用。

本文所用“基本上互补的或基本上匹配的”表示两条核酸序列具有至少90％的序列相同性。优选地，两条序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。或者，“基本上互补的或基本上匹配的”表示两条核酸序列可以在高度严格条件下杂交。

本文所用“改善”表示改变至少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、35％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多或列出值之间的任何值。或者，“改善”可以表示改变至少约1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍或更多倍或列出值之间的任何值。

本文所用“无核酸酶(nuclease null)”或“核酸酶失活(nuclease dead)”可以指代这样的多肽，其核酸酶活性降低，内切或外切DNA酶或RNA酶活性降低，切口酶活性降低，或者切割DNA和/或RNA的能力降低。其为核酸酶失活的Cas相关内切核酸酶的非限制性示例包括具有突变的内切核酸酶，所述突变使RuvC和/或HNH核酸酶结构域失活。例如，可以通过点突变D10A和H840A使酿脓链球菌Cas9失活，导致不可以切割靶DNA或RNA的核酸酶失活的Cas9分子。该dCas9分子保留了基于gRNA靶向序列与靶RNA结合的能力。

本文所用“降低的核酸酶活性”表示核酸酶、切口酶、DNA酶或RNA酶活性减少至少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、35％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多或列出值之间的任何值。或者，“降低的核酸酶活性”可以表示减少至少约1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍或更多倍或列出值之间的任何值。

本文所用“增加的催化活性”表示催化活性，例如，脱氨酶活性，相较于对应的野生型催化活性(例如，野生型脱氨酶活性)增加至少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、35％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多或列出值之间的任何值。或者，“增加的催化活性”可以表示相较于对应的野生型催化活性(例如，野生型脱氨酶活性)增加至少约1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍或更多倍或列出值之间的任何值。

本文所用术语“ADAR”指双链RNA特异性腺苷脱氨酶，其催化双链RNA(dsRNA)中腺苷到肌苷的水解脱氨基作用，称之为A-I编辑并且还称之为作用于RNA的腺苷脱氨酶作用。该蛋白质的非限制的示例性序列以及其结构域的注释存在于UniProt参考号P55265(人)和Q99MU3(小鼠)

本文所用术语“腺相关病毒”或“AAV”指这样类型的病毒的成员，所述病毒与该名称相关并属于依赖细小病毒(dependoparvovirus)属，细小病毒科。已知该病毒的多种血清型适于基因递送；所有已知的血清型可以感染来自各种组织类型的细胞。现有技术公开了至少11种(依次编号)。能够用于本公开方法的非限制性示例性血清型包括11种血清型中的任一种，例如，AAV2和AAV8。

此外，如本文所述，“和/或”表示涵盖了任何以及所有可能的一种或多种相关所列项目的组合，以及当在可选情况下解释时缺少组合(“或”)。

本文所用术语“适配体”指可以高亲和力和特异性结合一个或多个选定靶标的单链RNA或RNA分子。非限制性的示例性靶标包括但不限于蛋白质或肽。

术语“Cas相关”指CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)相关内切核酸酶。“Cas9”是Cas相关内切核酸酶，称之为该名称(UniProtKB G3ECR1(CAS9_STRTR))。DeadCas-9或“dCas9”是缺乏或显著缺乏内切核酸酶和/或切割活性的Cas9内切核酸酶。dCas9的非限制性示例是AddGene质粒#74710(可商购自艾德基因公司(AddGene)数据库)中编码的dCas9。

本文所用术语“细胞”可以指原核细胞或真核细胞，任选地获自对象获自可商购的来源。

本文所用术语“gRNA”或“向导RNA”指代用于靶向特定基因从而采用CRISPR技术进行校正的向导RNA序列。本领域已经熟知针对靶特异性设计gRNA和供体治疗性多核苷酸的技术。例如，Doench,J.,等Nature biotechnology 2014；32(12):1262-7和Graham,D.,等Genome Biol.2015；16:260，通过引用纳入本文。

本文所用术语“CRISPR”指代依赖于成簇规律间隔短回文重复序列途径的序列特异性遗传操纵技术，其不同于RNA干扰在转录水平下调节基因表达。本文所用术语“gRNA”或“向导RNA”指代用于靶向特定基因从而采用CRISPR技术进行校正的向导RNA序列。本领域已经熟知针对靶特异性设计gRNA和供体治疗性多核苷酸的技术。例如，Doench,J.,等Naturebiotechnology 2014；32(12):1262-7和Graham,D.,等Genome Biol.2015；16:260。“单向导RNA”或“sgRNA”是gRNA的特定类型，其将tracrRNA(反式激活RNA)(其结合Cas9以活化复合物从而生成所需的链断裂)和crRNA(CRISPR RNA)(含有针对tracerRNA的互补核苷酸)组合成单个RNA构建体。本文所述“延长单向导RNA”或“esgRNA”是含有与靶RNA具有同源性的延伸序列的特定类型的sgRNA，所述延伸序列含有针对待以下述方式编辑的靶RNA靶腺苷的错配，所述编辑形成A-C错配，并且靶转录本在鼓起的腺苷残基处生成待编辑的“假-dsRNA”底物。

如本文所用，术语“包括/包含”意在表示所述组合物和方法包括所提及的要素，但并不排除其它要素。本文所用“基本上由……组成”(以及语法上的变形)将理解成涵盖所述物质或步骤以及所述实施方式“本质上不影响基本和新特征的那些”。参见，In re Herz,537F.2d 549,551-52,190U.S.P.Q.461,463(CCPA1976)(在原文中强调)；同样参见MPEP§2111.03。因此，本文所用术语“基本上由……组成”应当理解为等于“包括/包含”。“由……组成”表示排除多于用于给予本公开组合物的微量元素的其它成分和基本方法步骤。通过各个这些转换术语定义的方面在本发明范围内。

在术语“编码”应用于核酸序列时指代据信将“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或者当通过本领域技术人员已知的方法操纵时，可以经转录和/或翻译以产生多肽的mRNA和/或其片段。反义链与这类核酸互补，并且可以由此推导出编码序列。

术语“等同物”或“生物等同物”当指代特定分子、生物或细胞物质时可以互换使用并意指具有最小同源性但是仍然维持所需结构或功能性的那些。

本文所用术语“表达”指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品内mRNA或蛋白质的量予以确定；此外，可以确定多个基因的表达水平以建立特定样品的表达概况。

本文所用术语“样品”可以指含有靶标的组合物。适合通过本公开的方法、装置和系统分析的样品包括细胞，组织，器官，或生物体或者获自细胞、组织或生物体的组合物。在一些实施方式中，样品分离自对象。

本文所用术语“功能性”可以用于修饰任何分子、生物或细胞材料，从而意指其实现特定、具体作用。

“基因递送载剂”定义为可以携带插入的多核苷酸进入宿主细胞的任何分子。基因递送载剂的示例为脂质体，胶束生物相容性聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属颗粒；和细菌，或病毒，如杆状病毒，腺病毒和逆转录病毒，噬菌体，粘粒，质粒，真菌载体和本领域通常使用的其他重组载剂，已经描述了其在各种真核和原核宿主中的表达，并且可以用于基因疗法以及简单的蛋白质表达。

可以使用基因递送载剂递送本文所公开的多核苷酸至细胞或组织。本文所用“基因递送”、“基因转移”、“转导”等是这样的术语，其指代将外源性多核苷酸导入(有些时候称之为“转基因”)宿主细胞，并不考虑用于导入的方法。这类方法包括各种已知技术，如载体介导的基因转移(通过，例如，病毒感染/转染，或各种其他基于蛋白质或基于脂质的基因递送复合物)以及协助“裸”多核苷酸递送的技术(如电穿孔，“基因枪”递送以及用于导入多核苷酸的各种其他技术)。导入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地维持在宿主细胞中。稳定维持通常需要导入的多核苷酸包含与宿主细胞相容的复制起点或者纳入到宿主细胞的复制子，诸如染色体外复制子(例如，质粒)或核或线粒体染色体。许多“载体”已知能够介导基因向哺乳动物细胞的转移，如本领域已知和本文所述。

“质粒”是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA复制。在许多情况中，其是环状和双链的。质粒提供了在微生物群体内水平基因转移的机制，并且通常在给定的环境状态下提供选择优势。质粒可以携带这样的基因，所述基因在竞争性环境中提供对天然存在的抗生素的抗性，或者产生的蛋白质在相似情况下可以充当毒素。

遗传工程改造中使用的“质粒”被称为“质粒载体”。对于这类用途，许多质粒是市售可得的。将待复制的基因插入质粒的拷贝，所述质粒含有使得细胞对特定抗生素和多克隆位点(MCS，或多聚接头)具有抗性的基因，所述多克隆位点是这样的短区域，其含有多个常用限制性位点，允许在该位置容易地插入DNA片段。质粒的另一主要用途是产生大量蛋白质。在该情况中，研究人员培养含有质粒的细菌，所述质粒具有感兴趣的基因。正如细菌产生蛋白质以赋予其抗生素抗性一样，也可以诱导其由插入的基因产生大量的蛋白质。

“酵母人工染色体”或“YAC”指用于克隆大DNA片段(大于100kb并高达3000kb)的载体。其是人工构建的染色体并含有在酵母细胞中复制和保留所需的端粒、着丝粒和复制起始序列。使用初始环状质粒构建，通过使用限制性酶将将其线性化，然后DNA连接酶可以通过使用粘性末端将感兴趣的序列或基因添加到线性分子内。酵母表达载体，如YAC、YIp(酵母整合质粒)和YEp(酵母附加体质粒)极为有用，因为人们可以得到具有翻译后修饰的真核蛋白产物，因为酵母本身就是真核细胞，然而，已发现YAC比BAC更加不稳定，产生嵌合效应。

“病毒载体”定义为重组产生的病毒或含有待体内、离体或体外递送至宿主细胞的多核苷酸的病毒颗粒。

病毒载体的示例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、甲病毒载体等。基于感染性烟草花叶病病毒(TMV)的载体可以用于制造蛋白质并且已经报告将在烟草叶中表达格菲西尼(Griffithsin)(O'Keefe等(2009)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 106(15):6099-6104)。已经开发了甲病毒载体，如基于塞姆利基森林病毒的载体和基于辛德毕斯病毒的载体，用于基因疗法和免疫疗法。参见，Schlesinger和Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439和Ying等(1999)Nat.Med.5(7):823-827。在通过逆转录病毒载体介导基因转移的方面中，载体构建体指含有逆转录病毒基因组或其部分和治疗性基因的多核苷酸。关于用于基因转移的载体的现代方法的进一步详情存在于，例如，Kotterman等(2015)基因疗法的病毒载体：转化和临床展望(Viral Vectors for GeneTherapy:Translational and Clinical Outlook)Annual Review of BiomedicalEngineering 17。

本文所用“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的含义并且指这样的过程，通过该过程藉由病毒进入细胞并将其基因组整合到宿主细胞基因组中来将基因或核酸序列稳定地转移到宿主细胞中。病毒可以经由其正常的感染机制进入宿主细胞或者可以经修饰，从而使其与不同的宿主细胞表面受体或配体结合以进入细胞。本文所用逆转录病毒指能够通过病毒或病毒样进入机制将外源性核酸导入细胞的病毒颗粒。

逆转录病毒以RNA的形式携带其遗传信息；然而，一旦该病毒感染细胞，RNA被逆转录成DNA形式，所述DNA形式整合到经感染的细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式称之为原病毒。

在通过DNA病毒载体如腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)介导基因转移的方面中，载体构建体指含有病毒基因组或其部分和转基因的多核苷酸。腺病毒(Ad)是相对较好地表征的同源性病毒组，包括超过50种血清型。Ad不需要整合到宿主细胞基因组中。也已经构建了基于重组Ad衍生的载体，特别是降低了重组和生成野生型病毒潜力的那些。这类病毒可以商购自诸如美国宝生物工程公司(Takara Bio USA)(加利福尼亚州山景城)、载体生物学实验室公司(Vector Biolabs)(宾夕法尼亚州费城)和创新生物基因公司(CreativeBiogene)(纽约州舍利)等来源。野生型AAV纳入宿主细胞的基因组中具有高感染性和特异性。参见，Wold和Toth(2013)Curr.Gene.Ther.13(6):421-433，Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470，和Lebkowski等(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996。

含有启动子和克隆位点的载体中，本领域已知多核苷酸可以操作性地连接。这类载体能够体外或体内转录RNA，并且可以商购自诸如安捷伦科技公司(AgilentTechnologie)(加利福尼亚州圣克拉拉)和普洛麦格生物技术公司(Promega Biotech)(美国威斯康星州麦迪逊)的来源。为了优化表达和/或体外转录，可能需要去除、添加或改变克隆的5'和/或3'未翻译部分，以消除额外的、潜在的不合适的其他翻译起始密码子或可能与表达相互作用或者降低表达(转录或翻译水平)的其他序列。或者，可以将共有核糖体结合位点直接插入起始密码子的5'以增强表达。

基因递送载剂还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶病毒蛋白-DNA复合物。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可以用于本文所公开的方法。除了递送多核苷酸至细胞或细胞群，将本文所述蛋白质直接导入细胞或细胞群可以通过蛋白质转染的非限制性技术实现，或者，可以增强本文所公开的蛋白质表达和/或促进其活性的培养条件是其他非限制性技术。

“同源性”或“相同性”或“相似性”指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较各序列中出于比较的目的可以对齐的位置确定。当经比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据，那么分子在该位置具有同源性。序列之间的同源性程度是序列所共享的匹配或同源位置数量的函数。“不相关”或“非同源性”序列与本公开的任一序列共享小于40％的相同性，或者任选地，小于25％的相同性。

“同源性”或“相同性”或“相似性”还可以表示在严格条件下杂交的两个核酸分子。

“杂交”表示这样的反应，所述反应中一个或多个多核苷酸反应以形成经由核苷酸残基的碱基之间的氢键稳定的复合物。氢键可以沃森-克里克碱基配对、霍格斯坦结合(Hoogstein binding)或任何其他序列特异性方式出现。复合物可以包含形成双链结构的两条链，形式多链复合物的三条或更多条链，单一自杂交链，或它们的任意组合。杂交反应可以成为更多过程中的一个步骤，如PCR反应的起始，或者通过核酶对多核苷酸进行酶促切割。

严格杂交条件的示例包括：孵育温度为约25℃-约37℃；杂交缓冲液浓度为约6×SSC-约10×SSC；甲酰胺浓度为约0％-约25％；和洗涤溶液为约4×SSC-约8×SSC。中度杂交条件的示例包括：孵育温度为约40℃-约50℃；缓冲液浓度为约9×SSC-约2×SSC；甲酰胺浓度为约30％-约50％；和洗涤溶液为约5×SSC-约2×SSC。高度严格杂交条件的示例包括：孵育温度为约55℃-约68℃；缓冲液浓度为约1×SSC-约0.1×SSC；甲酰胺浓度为约55％-约75％；和洗涤溶液为约1×SSC、0.1×SSC或去离子水。通常，杂交孵育时间为5分钟-24小时，包括1、2或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液。应当理解的是，可以采用使用其他缓冲液系统的SSS等同物。

本文所用术语“特异性地结合”指特定结合对的结合特异性。在其他潜在靶标存在情况下，通过特定靶多核苷酸序列的靶特异性核酸序列的杂交是这类结合的一个特征。特异性结合涉及两个不同的核酸分子，其中，核酸分子之一与第二个核酸分子通过化学或物理手段特异性地杂交。两个核酸分子在这样的意义中是相关的，即它们彼此之间的结合使得它们能够将它们的结合伴侣与具有相似特征的其他实验组分相区分。结合组分对的成员指配体和受体(抗-配体)，特异性结合对(SBP)成员和SBP伴侣等。

本文所用术语“分离的”指分子或生物制品或细胞材料基本上不含其他材料。

如本文所用术语“接头”指可能出现在两个蛋白质结构域之间的短肽序列。接头可以通常包含柔性氨基酸残基，例如，甘氨酸和丝氨酸，从而允许相邻但是融合的蛋白质结构域的自由运动。“XTEN”指Schellenberger等(2009)Nat Biotechnol.27:1186–1190.doi:10.1038/nbt.1588中所提供的任何一种示例性接头及其等价变体。

本文所用术语“器官”是作为个体生物体特定部分的结构，其中该个体生物体的某种功能或某些功能在局部进行且在形态上是分开的。器官的非限制性示例包括皮肤，血管，角膜，胸腺，肾，心，肝，脐带，肠，神经，肺，胎盘，胰腺，甲状腺和脑。

术语“原型间隔子邻近基序”或“PAM”指将活化Cas9核酸酶结构域的序列。“PAM聚体”指PAM展示寡核苷酸。本文所用术语PAM聚体通常指反义合成的寡核苷酸，包含交替的2’OMe RNA和DNA碱基和/或PAM展示寡核苷酸的其他变异，其可以优化CRISPR/Cas9系统并生成RNA靶标的特异性切割并不存在非靶标RNA之间或针对基因组DNA的交叉反义。参见例如，O’Connell等(2014)Nature.516(7530):263-266。

本文所用术语“启动子”指调节编码序列如基因的表达的任何序列。启动子可以是组成型，诱导型，抑制型或组织特异性的，例如。“启动子”是控制序列，其是多核苷酸序列的一个区域，在该区域中控制转录的启动和速率。其可含有调控蛋白和分子(如RNA聚合物和其他转录因子)可结合的遗传元件。非限制性示例性的启动子包括CMV启动子和U6启动子。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基的氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面中，亚基可以通过其他键连接，例如，酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。已知蛋白质和肽具有C-末端和N-末端，所述C-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合羧基的末端，所述N-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合氨基的末端。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸，以及D和L光学异构体，氨基酸类似物和肽模拟物。术语“融合”在蛋白质或多肽上下文中是指两个或更多个蛋白质或多肽(或其结构域)末端之间形成融合蛋白的连接。

本文所用术语“重组表达系统”指用于表达通过重组形成的某些遗传物质或蛋白质的遗传构建体。

本文所用术语“对象”与“患者”可以互换使用并且旨在表示任何动物。在一些实施方式中，对象可以是哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是非人哺乳动物。在一些实施方式中，哺乳动物是牛，马，猪，鼠，猫，犬，猿，大鼠或人。

本文所用术语“组织”指存活或死亡生物体的组织，或者源自或设计为模拟存活或死亡生物体任何组织。该组织可以是健康的，患病的和/或具有遗传突变。生物组织可以包括任何单个组织(例如，可以互连的细胞集合)或者组成生物体身体的器官或部分或区域的一组组织。该组织可以包括同质细胞材料，或者可以是复合结构，诸如在包括胸部的身体的区域中发现的复合结构，所述胸部可以包括肺组织，骨骼组织和/或肌肉组织。示例性的组织包括但不限于，源自肝，肺，甲状腺，皮肤，胰腺，血管，膀胱，肾脏，脑，胆管树，十二指肠，腹主动脉，静脉，心脏和肠的那些组织，包括其任何组合。

本文所用“治疗”或“处理”对象中的疾病指(1)防止症状或疾病在易患或尚未表现出疾病症状的对象中发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；或者(3)改善或导致疾病或疾病症状的消退。如本领域中所理解的，“治疗”是一种用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。出于本公开技术的目的，有益或所需结果可以包括下述一种或多种但不限于：缓和或改善一种或多种症状，减轻病症(包括疾病)的程度，使病症(包括疾病)的状态稳定(即，不恶化)，延缓或减慢病症(包括疾病)，进展，改善或缓和病症(包括疾病)，状态和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。

本文所用术语“载体”意指重组载体，其保留了感染和转导非分裂和/或缓慢分裂细胞并整合到靶细胞基因组中的能力。载体可以源自或基于野生型病毒。本公开的方面涉及腺相关病毒载体。

本文公开了许多其他载体元件；例如，质粒，启动子，接头，信号等。这些载体元件的性质和功能为本领域所熟知，并且许多这些载体元件是可商购的。本文公开了其非限制性示例性序列，例如，SEQ ID NO:1-8，并且其进一步的描述在下文中提供和/或显示于图3-10。

CRISPR/Cas导向RNA编辑(CREDIT)

本文公开了高效、通用和简化平台技术，用于使用RNA-靶向CRISPR/Cas(RCas)以单核苷酸分辨率进行可编程RNA编辑。申请人将该方法称之为“Cas导向RNA编辑”或“CREDIT”，该方法提供以时间方式可逆地改变遗传信息的方式，不同于依赖于永久改变DNA序列的传统CRISPR/Cas9驱动的基因组工程改造。重组表达系统经工程改造，以诱导对特异性RNA碱基的编辑，如向导RNA设计所确定。因此，在一些实施方式中，申请人提供了完全可编码的重组表达系统，其包含与ADAR脱氨酶结构域融合的核酸酶失活形式的酿脓链球菌Cas9(dCas9)和相应延长单向导RNA(esgRNA)。在一些实施方式中，该系统产生具有效应物脱氨酶复合物的重组蛋白，该复合物能够进行核糖核苷酸碱基修饰以改变细胞机制如何识别RNA分子的序列。在一些实施方式中，CREDIT表达系统包含A)核酸序列，所述核酸序列编码与ADAR(RNA依赖性腺苷脱氨酶)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活的CRISPR相关内切核酸酶(dCas)和B)延长单向导RNA(esgRNA)序列，所述esgRNA包含：i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，ii)dCas支架结合序列，和任选地iii)与靶RNA序列互补的序列(在sgRNA上下文中也称之为间隔子序列)。表达CREDIT表达系统组件的示例性构建体包括但不限于，使用针对空间分离的“XTEN”接头肽与人ADAR2(hADAR2DD，E488QhADAR2DD)的催化活性脱氨酶结构域融合的dCas9(图1B)。藉由dCas9作为替代性RBD(RNA-结合结构域)，申请人工程改造并定制了具有独特短延伸序列的单向导RNA(sgRNA)(esgRNA)以将hADAR2DD导向RNA位点用于靶特异性A–I编辑。出于本公开的目的，本文还提供了除了Cas9或Cas9直向同源物外其他的CRISPR/Cas相关内切核酸酶(例如，Cas13(也称之为C2c2)，Cpf1，Cas6f/Csy4，CasX，CasY和CasRx)用于CREDIT表达系统。另见Wright等,CRISPR系统的生物学和应用：利用自然界的工具箱进行基因组工程改造(Biology andApplications of CRISPR Systems:Harnessing Nature’s Toolbox for GenomeEngineering),Cell,卷164(1-2):29-44,2016。

在本文所公开的一些实施方式中，dCas多肽经工程改造以识别靶RNA，其中失活Cas多肽与效应物相关。在一些实施方式中，dCas多肽是酿脓链球菌dCas9多肽。在一些实施方式后中，dCas9多肽在酿脓链球菌dCas9多肽中包含突变，如D10A、H840A或两者。结合RNA的含有经重目的化(repurpose)或工程改造的dCas9多肽的核蛋白复合物在本文中称之为RdCas9。通过允许对人细胞中DNA进行简单编程的识别，CRISPR彻底改变了基因组工程改造，并且支持了成像和基因表达调控中的相关技术。在WO 2017/091630(通过引用其全部内容纳入本文)中，开发了使用RCas9靶向RNA的类似技术。在这一较早的工作中，工程改造的核蛋白复合物含有Cas9蛋白和单向导RNA(sgRNA)。Cas9蛋白和sgRNA组分一起经工程改造以假设地识别任何靶RNA序列。任选地，在这类系统中，(经化学修饰的或合成的)反义PAM聚体寡核苷酸可以包含在RCas9系统，从而通过与靶RNA杂交来模拟被Cas9识别的DNA底物。然而，还显示了在没有PAM聚体的情况下令人惊讶的高效RNA靶向。现在，本文公开了RdCas-ADAR RNA编辑系统，其不需要PAM聚体并且因此是完全可编码的Cas9介导的RNA靶向系统，其提供了用于修饰靶RNA的可逆平台。

出于本公开的目的，本文所使用的Cas9内切核酸酶包括但不限于源自古细菌的直向同源物或细菌Cas9多肽。这类多肽可以源自但不限于，地中海嗜血杆菌(Haloferaxmediteranii)，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，土拉热弗朗西斯菌新凶手亚种(Francisella tularensis subsp.novicida)，多杀性巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，空肠弯曲菌(Campylobacterjejune)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)LMD-9CRISPR 3，海鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)CF89-12，鸡毒支原体F菌株(Mycoplasma gallisepticum str.F)，硝酸素杆菌DSM 1651 1菌株(Nitratifractor salsuginis str DSM 1651 1)，食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)，罗斯氏肠炎胎弧菌(Roseburiaintestinalis)，灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)，醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)，固氮螺菌(Azospirillum B510)，螺旋体球菌巴迪菌株(Sphaerochaetaglobus str.Buddy)，柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)，塔丰傅韦克杆菌(Fluviicola taffensis)，嗜粪拟杆菌(Bacteroides coprophilus)，移动支原菌(Mycoplasma mobile)，香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)，巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，假中葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)，奥克斯产线菌(Filifactor alocis)，齿垢密螺旋体(Treponema denticola)，嗜肺军团菌巴黎菌株(Legionella pneumophila str.Paris)，瓦达氏萨特氏菌(Sutterella wadsworthensis)，白喉棒杆菌(Corynebacterdiphtheriae)或金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)；新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)(例如，新凶手弗朗西丝氏菌CPf1)，或格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)AGO蛋白质(Argonaute)。这些候选Cas多肽各自经修饰和/或重目的化成靶RNA并与ADAR脱氨酶结构域融合用于本文所公开的系统，该系统额外地包含延伸的sgRNA(esgRNA)，所述esgRNA包含向导“支架序列”，其包含所有这些相应细菌或古细菌生物体各自的野生型(WT)同源向导核酸的全部或部分，或衍生自上述WT同源向导核酸。在一些实施方式中，用于本文的Cas内切核酸酶包括但不限于Cas13(c2C2)、Cpf1、CasX、CasY和CasRx。

下表提供了直向同源和生物等同的Cas9的非限制性示例：

在一些实施方式中，编码dCas内切核酸酶的核酸序列是密码子优化dCas。在此情况下，密码子优化序列的示例是对在不限于真核生物、动物和/或哺乳动物，例如人(即，针对在人中的表达进行优化)中的表达进行优化的序列；参见例如，WO 2014/093622中的SaCas9人密码子优化序列，通过引用其全部内容纳入本文。

在一些实施方式中，用于本文所提供的系统的dCas内切核酸酶是变体Cas内切核酸酶，其包含导致内切核酸酶相较于其对应的野生型Cas内切核酸酶缺乏切割活性或者基本上缺乏切割活性的突变。例如，参照通过引用其全部内容纳入本文的WO 2017/091630，在本文所公开的一实施方式中，可以使Cas9活性位点(10和840)突变成丙氨酸(D10A和H840A)以消除酿脓链球菌Cas9的切割活性，产生核酸酶缺陷型或核酸酶失活的Cas9(即，dCas9)。RuvC结构域分布在dCas9一级结构的3个不连续部分(残基1-60、719-775和910-1099)。Rec叶(lobe)由残基61-718组成。HNH结构域由残基776-909组成。PAM-ID结构域由残基1100-1368组成。可以认为REC叶是用于识别sgRNA和靶DNA/RNA的结构支架。NUC叶包含2个核酸酶结构域(HNH和RuvC)，加上PAM相互作用结构域(PAM-ID)，其识别任选的PAM序列。在该在先研究中，例如但不限于，约98核苷酸的sgRNA通常分为两个主要的结构组件：第一个包含靶特异性向导或“间隔子”区段(核苷酸1-20)加上重复-四环-抗-重复(repeat-tetraloop-anti-repeat)和茎-环1(SL1)区域；第二个包含茎-环2和3(SL2、SL3)。相应地，向导-穿过-SL1(guide-through-SL1)RNA区段主要被Cas9 REC叶结合，而SL2-SL3区段主要被NUC叶结合。

在用于本文所公开的系统的dCas9的一些实施方式中，对Cas9的最小构建体(即，尽可能地具有最少的核苷酸碱基对)进行了工程改造，其将以高亲和力识别靶RNA序列。在一些实施方式中，编码dCas9的最小构建体将为仅有REC的构建体。在一些实施方式中，构建体将包含较少的最小化构建体，其缺少HNH，PAM-ID，各结构域的部分，同时缺少各结构或其组合。在一些实施方式中，HNH结构域将通过在残基775和909之间插入5残基柔性接头切除(ΔHNH)。在一些实施方式中，去除所有或部分PAM-1D。在一些实施方式中，在残基1098处截短Cas9(ΔPAM-ID#1)，用8残基接头融合残基1138和1345(ΔPAM-ID#2)，或者将残基1138与1200融合或者将1218与1339融合(分别用5残基接头和2残基接头；ΔPAM-ID#3)用于去除所有或部分PAM-ID。ΔPAM-ID#2和3构建体将保留PAM-ID的元件，其有助于sgRNA重复-抗-重复(repeat-anti-repeat)(残基1099-1138)和SL2-SL3(残基1200-1218和1339-1368)区段的结合。在一些实施方式中，HNH缺失将与3个PAM-ID缺失组合。在一些实施方式中，根据通过引用其全部内容纳入本文的WO2016/19655，缺乏或基本缺乏核酸酶和/或切割活性的Cas9变体是用于本文所公开的重组表达系统的dCas9的示例。

因此，用于本文公开的重组表达系统的是编码dCas-ADAR脱氨酶结构域融合蛋白的核酸序列。在一实施方式中，dCas9与催化活性ADAR脱氨酶结构域融合。在这类系统的上下文中，将对应的延长单向导RNA(esgRNA)用于靶向并编辑靶RNA的腺苷。该系统产生具有效应物脱氨酶的重组蛋白，其能够进行核糖核苷酸碱基修饰以改变细胞机制如何识别RNA分子的序列。在一实施方式中，dCas和ADAR脱氨酶结构域被接头分离。在另一实施方式中，接头是但不限于XTEN接头，其是用于隔离邻近蛋白质结构域的柔性接头。本领域已知XTEN接头，并且可见于例如WO 2013/130684，通过引用其全部内容纳入本文。

RNA编辑是一种自然过程，由此给定序列基因产物的多样性通过RNA中的微小修饰增加。通常，修饰涉及腺苷(A)向肌苷(I)的转化，从而产生不同于基因组编码的RNA序列。通常通过ADAR酶确保RNA修饰，从而使前-RNA(pre-RNA)靶标通过含有待编辑的腺苷的外显子与内含子非编码元件之间的碱基配对形成不完善的双链RNA。A-I编辑的经典示例是谷氨酸受体GluR-B mRNA，由此该改变导致通道的电导性质改变(Higuchi M,等Cell.1993；75:1361-70)。

出于本公开的目的，ADAR(作用于RNA的腺苷脱氨酶)脱氨酶结构域可以使ADAR 1、ADAR 2或ADAR 3脱氨酶结构域。参见Nishikura,K.通过ADAR对编码和非编码RNA进行A-I编辑(A-to-I editing of coding and non-coding RNAs by ADARs).Nat Rev Mol CellBiol 17,83-96,doi:10.1038/nrm.2015.4(2016)。

在一些实施方式中，ADAR脱氨酶结构域源自所有或部分ADAR1(Uniprot P55265)。如下提供了ADAR1的非限制性示例性序列(SEQ ID NO:24)：MAEIKEKICDYLFNVSDSSALNLAKNIGLTKARDINAVLIDMERQGDVYRQGTTPPIWHLTDKKRERMQIKRNTNSVPETAPAAIPETKRNAEFLTCNIPTSNASNNMVTTEKVENGQEPVIKLENRQEARPEPARLKPPVHYNGPSKAGYVDFENGQWATDDIPDDLNSIRAAPGEFRAIMEMPSFYSHGLPRCSPYKKLTECQLKNPISGLLEYAQFASQTCEFNMIEQSGPPHEPRFKFQVVINGREFPPAEAGSKKVAKQDAAMKAMTILLEEAKAKDSGKSEESSHYSTEKESEKTAESQTPTPSATSFFSGKSPVTTLLECMHKLGNSCEFRLLSKEGPAHEPKFQYCVAVGAQTFPSVSAPSKKVAKQMAAEEAMKALHGEATNSMASDNQPEGMISESLDNLESMMPNKVRKIGELVRYLNTNPVGGLLEYARSHGFAAEFKLVDQSGPPHEPKFVYQAKVGGRWFPAVCAHSKKQGKQEAADAALRVLIGENEKAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGEGTIPVESSDIVPTWDGIRLGERLRTMSCSDKILRWNVLGLQGALLTHFLQPIYLKSVTLGYLFSQGHLTRAICCRVTRDGSAFEDGLRHPFIVNHPKVGRVSIYDSKRQSGKTKETSVNWCLADGYDLEILDGTRGTVDGPRNELSRVSKKNIFLLFKKLCSFRYRRDLLRLSYGEAKKAARDYETAKNYFKKGLKDMGYGNWISKPQEEKNFYLCPV

在一些实施方式中，ADAR脱氨酶结构域源自所有或部分ADAR2(Uniprot P78563)。如下提供了ADAR2的非限制性示例性序列(SEQ ID NO:25)：MDIEDEENMSSSSTDVKENRNLDNVSPKDGSTPGPGEGSQLSNGGGGGPGRKRPLEEGSNGHSKYRLKKRRKTPGPVLPKNALMQLNEIKPGLQYTLLSQTGPVHAPLFVMSVEVNGQVFEGSGPTKKKAKLHAAEKALRSFVQFPNASEAHLAMGRTLSVNTDFTSDQADFPDTLFNGFETPDKAEPPFYVGSNGDDSFSSSGDLSLSASPVPASLAQPPLPVLPPFPPPSGKNPVMILNELRPGLKYDFLSESGESHAKSFVMSVVVDGQFFEGSGRNKKLAKARAAQSALAAIFNLHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP

在一些实施方式中，ADAR脱氨酶结构域源自所有或部分ADAR3(Uniprot Q9NS39)：如下提供了ADAR2的非限制性示例性序列(SEQ ID NO:26)：MASVLGSGRGSGGLSSQLKCKSKRRRRRRSKRKDKVSILSTFLAPFKHLSPGITNTEDDDTLSTSSAEVKENRNVGNLAARPPPSGDRARGGAPGAKRKRPLEEGNGGHLCKLQLVWKKLSWSVAPKNALVQLHELRPGLQYRTVSQTGPVHAPVFAVAVEVNGLTFEGTGPTKKKAKMRAAELALRSFVQFPNACQAHLAMGGGPGPGTDFTSDQADFPDTLFQEFEPPAPRPGLAGGRPGDAALLSAAYGRRRLLCRALDLVGPTPATPAAPGERNPVVLLNRLRAGLRYVCLAEPAERRARSFVMAVSVDGRTFEGSGRSKKLARGQAAQAALQELFDIQMPGHAPGRARRTPMPQEFADSISQLVTQKFREVTTDLTPMHARHKALAGIVMTKGLDARQAQVVALSSGTKCISGEHLSDQGLVVNDCHAEVVARRAFLHFLYTQLELHLSKRREDSERSIFVRLKEGGYRLRENILFHLYVSTSPCGDARLHSPYEITTDLHSSKHLVRKFRGHLRTKIESGEGTVPVRGPSAVQTWDGVLLGEQLITMSCTDKIARWNVLGLQGALLSHFVEPVYLQSIVVGSLHHTGHLARVMSHRMEGVGQLPASYRHNRPLLSGVSDAEARQPGKSPPFSMNWVVGSADLEIINATTGRRSCGGPSRLCKHVLSARWARLYGRLSTRTPSPGDTPSMYCEAKLGAHTYQSVKQQLFKAFQKAGLGTWVRKPPEQQQFLLTL

在一些实施方式中，ADAR结构域可以包含导致相较于野生型ADAR结构域催化活性增强的突变。在一些实施方式中，催化活性脱氨酶结构域(DD)源自野生型人ADAR2或携带突变(E488Q)的人ADAR2 DD，所述突变(E488Q)增加对RNA底物的亲和力和酶促活性(Phelps等,Jan 2015,Nuc.Acid Res.,43(2):1123-1132；Kuttan和Bass,2012年11月,PNAS 109(48):E3295-E3304)。

因为ADAR2的催化结构域，独立于其RNA识别基序，优选在dsRNA区域中脱氨酶未配对的腺苷残基，申请人对本文所公开的系统的单向导RNA(sgRNA)组件的结构进行改良，以改善针对单核苷酸分辨率的底物特异性。据报道，经补充3'末端盒工程改造的gRNA在活细胞中维持其靶向能力(Konermann等2015年1月,Nature,517:583-588)。

申请人基于系统的sgRNA结构的战略性修饰研发了CRISPR/Cas介导的RNA编辑(CREDIT)平台，其包含能够与靶RNA在编辑所需位点上碱基配对的其他同源性区域。对sgRNA结构这样的修饰生成了本公开系统的延伸的sgRNA(即，esgRNA)，并且导致A-C错配，并且靶转录本在鼓起的腺苷残基处生成待编辑的“假-dsRNA”底物(参见图1A)。本文所公开的系统以及CREDIT平台因此提供了几乎靶向转录组中任何腺苷以直接转换成肌苷(即，A-IRNA编辑)的能力，所述肌苷最终被翻译和剪接机制读作鸟苷。

由于其总体设计的简单性及其完全可编码的性质，本文所公开的重组表达系统当与其他类似的RNA修饰系统和方法比较时提供了高实用性和工程改造通用性。因为dCas9以皮摩尔亲和力与sgRNA支架序列结合，并且因为该改进的系统按照延长单向导RNA(即，esgRNA)结构使用双向导结构，以增加靶标亲和力和特异性，所以高效地实现了在潜在的脱靶编辑事件最小的情况下进行直接RNA编辑。在一些实施方式中，可以设计esgRNA具有i)支架序列和ii)短延伸序列，但是没有间隔子序列。

在一实施方式中，esgRNA包含至少两个区域：i)能够近乎完美RNA-RNA碱基配对的同源性区域(即，与靶RNA具有同源性的短延伸序列)和ii)dCas9结合区域(即，支架序列)。在一实施方式中，短延伸序列包含这样的错配，其与靶转录组形成A-C错配，并在鼓起的腺苷残基处生成待编辑的“假-dsRNA”底物。因此，短延伸序列的同源区域确定了本文所公开的重组表达系统的特异性，并且特别地，其特异性地确定了细胞转录组中被编辑的RNA碱基。通过同源性区域和靶RNA双链体中不匹配的腺苷残基区分经编辑的RNA碱基。参见图1A。支架和短延伸序列的同源性区域的方向是灵活的。在一实施方式中，支架序列位于esgRNA的5'端。在另一实施方式中，携带能够近乎完美RNA-RNA碱基配对的同源性区域的短延伸序列位于esgRNA的3'端。在另一实施方式中，短延伸序列位于esgRNA的5'端。出于本公开的目的，“3'端”或“5'端”在esgRNA的任何一种情况下指esgRNA的末端。在另一实施方式中，esgRNA还包含第三区域，iii)间隔子区域，其包含针对靶RNA的第二同源性区域。在一实施方式中，间隔子序列位于支架序列的5'端。间隔子序列与靶RNA互补，但是不需要错配以实现靶RNA的A-I编辑。在一实施方式中，间隔子序列位于支架序列的5'端。在另一实施方式中，短延伸序列位于支架序列的3'端或间隔子序列的5'端。在另一实施方式中，短延伸序列位于esgRNA的一个末端。在另一实施方式中，短延伸序列与间隔子序列是连续的。在另一实施方式中，短延伸序列与间隔子序列是不连续的。在另一实施方式中，esgRNA以3'-5'的方向包含i-iii)。

在一些实施方式中，核蛋白复合物与单向导RNA(sgRNA)或如本文所公开的延长单向导RNA(esgRNA)复合。在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA在单向导RNA或esgRNA支架序列中具有二级结构的延伸(除了能够编辑靶腺苷的esgRNA中的同源性短延伸序列以外)。在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA包含一个或多个点突变，所述点突变经由去除部分或全部转录终止序列或者下述序列来改善单向导RNA(或esgRNA)的表达水平，上述序列在转录后经由反式作用核酸酶的作用使单向导NRA(或esgRNA)不稳定。在一些实施方式中，单向导RNA(或esgRNA)包含5'端的改变，其稳定所述单向导RNA或esgRNA，防止降解。在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA包含5'端的改变，其改善RNA靶向。在一些实施方式中，所述单向导RNA或esgRNA的5'端的改变选自下组：2′O-甲基，硫代磷酸酯和硫代膦酰基乙酸酯(thiophosphonoacetate)连接和碱基。在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA在sgRNA或esgRNA间隔子或支架区域中包含2′-氟，2′O-甲基和/或2′-甲氧基乙基碱基修饰，以改善靶标识别或者降低单向导RNA或esgRNA上的核酸酶活性。在一些实施方式中，单向导RNA包含降低靶RNA上核酸酶活性的一个或多个甲基膦酸酯，硫代膦酰基乙酸酯或硫代磷酸酯连接。

在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA可以识别靶RNA，例如，通过与靶RNA杂交。在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA包含与靶RNA互补的序列。在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA的长度为，约为，小于或大于10nt、20nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、110nt、120nt、130nt、140nt、150nt、160nt、170nt、180nt、190nt、200nt、300nt、400nt、500nt、1,000nt、2,000nt，或上述值中任意两个之间的范围。在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA可以包含一个或多个经修饰的核苷酸。

在另一实施方式中，各种RNA靶标可以被单向导RNA或esgRNA识别。例如，靶RNA可以是信使RNA(mRNA)，核糖体RNA(rRNA)，信号识别颗粒RNA(SRP RNA)，转移RNA(tRNA)，小核RNA(snRNA)，小核仁RNA(snoRNA)，反义RNA(aRNA)，长非编码RNA(lncRNA)，微小RNA(miRNA)，piwi相互作用RNA(piRNA)，小干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)，逆转录转录子RNA，病毒基因组RNA，病毒非编码RNA等。在一些实施方式中，靶RNA可以是涉及病症的病原性或治疗性靶标的RNA，病症例如癌症，神经变性，皮肤病，内分泌病，肠疾病，传染病，神经病，肝病，心脏疾病，自身免疫病等。

在其他实施方式中，示例性的G-A突变靶RNA以及待治疗的对应疾病、病症和/或综合症是但不限于下述：

SDHB(琥珀酸脱氢酶复合物铁硫亚基B)，用于治疗神经节细胞瘤，胃间质肉瘤，神经节细胞瘤4，嗜铬细胞瘤，副神经节瘤1，和/或遗传性癌症易感综合症；

DPYD(二氢嘧啶脱氢酶)，用于治疗二氢嘧啶脱氢酶缺乏症，希尔施普龙病1，氟尿嘧啶响应，嘧啶类似物响应-毒性/ADR，卡培他滨响应-毒性/ADR，氟尿嘧啶响应-毒性/ADR和/或喃氟啶响应-毒性/ADR；

MSH2(mutS类似物2)，用于治疗林奇综合征，肿瘤易感综合征和/或蒂尔柯综合征(Turcot syndrome)；

MSH6(mutS类似物6)，用于治疗林奇综合征；

DYSF(Dysferlin)，用于治疗三好肌营养不良症1和/或2B型肢带型肌营养不良症；

SCN1A(钠电势门控通道α亚基1)，用于治疗婴儿期严重的肌阵挛性癫痫；

TTN(肌联蛋白)/TTN-AS1，用于治疗原发性扩张型心肌病；

VHL(希佩尔林道(von Hippel-Lindau)肿瘤抑制剂)，用于治疗希佩尔林道综合征；和/或遗传性癌症易感综合征；

MLH1(mutL类似物1)，用于治疗林奇综合征，遗传性癌症易感综合征和/或肿瘤易感性综合征；

PDE6B(磷酸二酯酶6B)，用于治疗色素性视网膜炎和/或色素性视网膜炎40；

CC2D2A(包含卷曲螺旋和C2结构域的2A)，用于治疗朱伯特综合症(Joubertsyndrome)9和/或蚯部家族性发育不全；

FRAS1(弗雷泽(Fraser)胞外基质复合物亚基1)，用于治疗隐眼综合征；

DSP(桥粒斑蛋白)，用于治疗8型心律失常性右室心肌病和/或心肌病；

PMS2(PMS1类似物2，错配修复系统组件)，用于治疗林奇综合征和/或肿瘤易感综合征；

ASL(精氨酸琥珀酸裂解酶)，用于治疗精氨酸琥珀酸尿症；

ELN(弹性蛋白)，用于治疗主动脉瓣上狭窄(Supravalvar aortic stenosis)；

SLC26A4(溶质运载体家族26成员4)，用于治疗扩大的前庭水管综合征和/或鹏德氏综合征(Pendred's syndrome)；

CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节剂)，用于治疗囊性纤维化；

CNGB3(环核苷酸门控的通道β3)，用于治疗色盲3；

FANCC(凡科尼(Fanconi)贫血互补群C)–C9orf3，用于治疗凡科尼贫血和/或遗传性癌症易感综合征；

PTEN(磷酸酶和张力蛋白类似物)，用于治疗遗传性癌症易感综合症，BRR综合症(Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrome)，多发性错构瘤综合征(Cowden syndrome)，乳腺癌，自闭症谱系障碍，头颈鳞状细胞癌，肺癌和/或前列腺癌；

ANO5(Anoctamin 5)，用于治疗2L型肢节型肌营养不良症，鼻咽生长发育不良症(Gnathodiaphyseal dysplasmia)，三好肌病和/或三好肌营养不良症3；

MYBPC3(肌球蛋白结合蛋白C，心脏)，用于治疗原发性家族性肥厚型心肌病；

MEN1(梅宁(Menin)1)，用于治疗家族性孤立性甲状旁腺功能亢进，多发性内分泌肿瘤，原发性大结节性肾上腺皮质增生和/或肿瘤；

ATM(ATM丝氨酸/苏氨酸激酶)和/或ATM-C11orf65，用于治疗共济失调-毛细血管扩张综合征和/或遗传性癌症易感综合征；

PKP2(桥粒斑菲素蛋白(Plakophilin)2)，用于治疗9型心律失常性右室心肌病和/或心律失常性右室心肌病；

PAH(苯丙氨酸羟化酶)，用于治疗苯丙酮尿症；

GJB2(间隙连接蛋白β2)，用于治疗耳聋，常染色体隐性遗传1A，非综合征性遗传性耳聋和/或听力障碍；

B3GLCT(β3-葡萄糖基转移酶)，用于治疗彼得斯+(Peters plus)综合症；

BRCA2(BRCA2，与DNA修复相关)，用于治疗家族性乳腺癌，乳腺-卵巢癌-家族性2，遗传性癌症易感综合征，凡科尼贫血，互补群D1，遗传性乳腺和卵巢癌综合征，遗传性遗传易感综合征，乳腺-卵巢癌-家族性1和/或遗传性乳腺和卵巢癌综合症；

MYH7(肌球蛋白重链7)，用于治疗原发性扩张型心肌病，心肌病和/或心肌病-左心室不紧致；

FBN1(原纤蛋白1)，用于治疗马凡氏综合征；

HEXA(己糖胺酶亚基α)，用于治疗泰-萨二氏病；

TSC2(TSC复合物亚基2)，用于治疗结节性硬化症2和/或结节性硬化症综合征；

CREBBP(CREB结合蛋白)，用于治疗鲁宾斯坦-泰比综合症(Rubinstein-Taybisyndrome)；

CDH1(钙黏着蛋白1)，用于治疗遗传性扩散性胃癌，肿瘤易感综合征和/或遗传性癌症遗易感综合征；

SPG7(SPG7，截瘫基质(paraplegin matrix)AAA肽酶亚基)，用于治疗痉挛性截瘫7；

BRCA1(BRCA1，DNA修复相关)，用于治疗乳腺-卵巢癌-家族性1，遗传性乳腺和卵巢癌综合症和/或遗传性癌症易感综合症；

BRIP1(BRCA1相互作用蛋白C末端解旋酶1)，用于治疗家族性乳腺癌和/或肿瘤易感综合征；

LDLR(低密度脂蛋白受体)和/或LDLR-MIR6886，用于治疗家族性高胆固醇血症和/或高胆固醇血症；

BCKDHA(支链酮酸脱氢酶E1，α多肽)，用于治疗枫糖浆尿病；

CHEK2(检查点激酶2)，用于治疗家族性乳腺癌，乳腺癌和结直肠癌-易感性和/或遗传性癌症易感综合症；

DMD(肌营养不良蛋白)，用于治疗贝克肌肉营养不良，杜兴氏肌肉营养不良和/或扩张型心肌病3B；和/或

IDUA(艾杜糖苷酶，α-L)，用于治疗霍勒氏综合症，多发性成骨异常，黏多糖贮积症，MPS-I-H/S和/或I型黏多糖贮积症。

在一些实施方式中，esgRNA包含与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其长度约为10-100个核苷酸，或者约10、15-60、20-50或25-40个核苷酸，或者为之间的任意范围。在一些实施方式中，esgRNA的短延伸序列包含但不限于约1个错配或2、3、4或5个错配。

在一些实施方式中，单向导RNA或esgRNA包含但不限于包含，与靶RNA结合或杂交的序列，如这样的间隔子序列，所述间隔子序列包含与靶RNA具有同源性的其他区域(除了本文所公开的具有同源性的短延伸序列)，从而特异性地支持RNA识别，并独特地提供对基因组的灵活和可及的操纵。参见WO2017/091630，通过引用其全部内容将其纳入本文。

下表提供了针对靶向CFTR mRNA(囊性纤维化跨膜传导调节剂，参照序列：NM_000492)和IDUA mRNA(艾杜糖醛酸酶，参照序列：NM_000203)的esgRNA设计的非限制性示例性间隔子序列和延伸序列：

在一实施方式中，本文所公开的系统包含核酸序列，所述核酸序列经最小化至适合单个载体的核苷酸长度。在一些实施方式中，载体是AAV载体。AAV载体能够包装大小约4.5kb的转基因。在一些情况中，使用这样的AAV载体，其能够包装较大的转基因，如约4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5.0kb、5.1kb、5.2kb、5.3kb、5.4kb、5.5kb、5.6kb、5.7kb、5.8kb、5.9kb、6.0kb、6.1kb、6.2kb、6.3kb、6.4kb、6.5kb、6.6kb、6.7kb、6.8kb、6.9kb、7.0kb、7.5kb、8.0kb、9.0kb、10.0kb、11.0kb、12.0kb、13.0kb、14.0kb、15.0kb或更大。

在另一个实施方式中，本文所公开的系统包含但不限于，用于驱动系统组件表达的一个或多个启动子序列。用于表达小RNA的示例性启动子是但不限于，聚合酶III启动子，如U6和H1。用于驱动系统组件表达的其他启动子是但不限于，EF1α(或其短、无内含子形式，EFS)，CAG(CMV增强子，鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-球蛋白剪接受体位点融合体)，迷你CMV(巨细胞病毒)，CMV，MCK(肌肉肌酸激酶)，MCK/SV40，肌间线蛋白和/或c512(谷氨酸羧肽酶II)。

在一实施方式中，重组表达系统在通过载体(例如，腺相关病毒(AAV))携带的DNA中编码并且可以经由下述方法之一递送至适当的组织：使用展示特定组织嗜性的特定AAV血清型(如AAV-9靶向神经元或肌肉)；将编码RdCas9系统的裸DNA注射到组织诸如肌肉或肝脏中；使用纳米颗粒，其包含脂质，聚合物或携带编码治疗性重组表达系统的DNA或RNA的其他合成或天然物质；或任何上述内容，其中系统在两种分开的病毒或DNA分子之间分割，从而使得：一种病毒编码dCas9蛋白-ADAR融合体，而另一种病毒编码sgRNA；或者一种病毒编码dCas9蛋白和/或sgRNA，而另一种病毒编码ADAR蛋白和/或sgRNA。在其中CREDIT的部分在分开的载体上编码的实施方式中，ADAR和dCas9的编码的部分可以彼此相互作用，从而形成功能性dCas9-ADAR核蛋白复合物。示例性的分割系统可见于Wright等,合理设计分割-Cas9酶复合物(Rational design of a split-Cas9 enzyme complex).PNAS 112:2984-2989(2015)，其内容通过引用其全部内容纳入本文。

为了将本文所提供的示例性重组表达系统用于治疗人对象或动物，载体(例如，AAV)系统可以例如通过下述方法注射：(1)同时在多个位点的骨骼肌组织(肌肉内)(相关适应症：肌强直性营养不良)——每次注射注射10¹¹-10¹⁴GC(基因组拷贝)到主要肌肉群，如腹肌，二头肌，三角肌，竖脊柱，腓肠肌，比目鱼肌，臀肌，腿筋，背阔肌，菱肌，斜肌，胸大肌，四头肌，斜方肌和/或三头肌；(2)静脉内递送靶向的AAV血清型，如AAV-9或AAV-6，用于肌肉靶向——每次注射注射10¹¹-10¹⁴GC，递送总计10¹²-10¹⁷GC；3.软膜下脊髓注射AAV-6、AAV-9或展现出神经元趋向的其他血清型——以单剂量或多剂量注射10¹¹-10¹⁷GC；4.颅内注射AAV-6、AAV-9或展现出神经元趋向的其他血清型——以单剂量或多剂量注射10¹¹-10¹⁷GC。

在其他实施方式中，本文所公开的重组表达载体可以通过本领域已知的方法配制。另外，可以考虑任何给药途径，例如，通过任何常规给药途径，包括但不限于，口服，肺，腹膜内(ip)，静脉内(iv)，肌肉内(im)，皮下(sc)，透皮，口腔，鼻，舌下，眼，直肠和阴道。此外，直接给药至神经系统可包括但不限于，通过经由具有或不具有泵装置的颅内或脊柱内针或导管递送的脑内，心室内，脑室内，鞘内，脑池内，脊柱内或脊髓周围的给药途径。提供本文所述治疗效果的任何剂量或给药频率都适用于本发明的治疗。在具体实施方式中，通过肌肉内途径向对象给予病毒载体，所述病毒载体编码根据本发明的重组表达系统。在一实施方式中，载体是如上所定义的AAV载体，是AAV9载体。在一些实施方式中，人对象可以接受载体的单次注射。此外，可以采用标准制药学方法控制作用的持续时间。这些方法为本领域所熟知，并且包括，控释制剂，并且可以包括合适的大分子，例如，聚合物，聚酯，聚氨基酸，聚乙烯化合物，吡咯烷酮，乙烯乙酸乙烯酯，甲基纤维素，羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。此外，药物组合物可以包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含本公开的重组表达系统。

本发明还提供了组合物，其包含，由下述组成或者基本上由下述组成：本文所述的重组表达系统、载体、细胞或病毒颗粒中的一种或多种以及运载体。在一些实施方式中，运载体是药学上可接受的运载体。

在一些实施方式中，本文所公开的重组表达系统可以任选地包括PAM聚体寡核苷酸的额外的给药，即与公开的系统同时或依次共同给予对应的PAM聚体。针对PAM聚体寡核苷酸序列的选择技术为本领域所熟知，并且可见于例如WO 2015/089277，通过引用其全部内容纳入本文。虽然在一些情况中，PAM聚体可以增加dCas9对RNA的体内以及体外结合亲合力，申请人的在先工作WO 2017/091630(通过引用其全部内容纳入本文)令人惊讶地发现了不需要PAM聚体即可实现RNA识别和编辑。为了简化本文所述申请人的递送策略并将本文所公开的系统保持为完全可编码的系统，在没有PAM聚体的情况下进行了下述实验。该机制的示意图在图1中概述。

本文公开了使用本文所公开的重组表达系统作为研究工具(例如)以表征导向细胞RNA编辑对加工和动力学的作用的方法。

本文另外公开了使用本文所公开的重组表达系统作为疾病的治疗剂的方法，例如，通过使用病毒(AAV)或其他基于载体的递送方法来递送重组表达系统用于体内或离体RNA编辑以治疗需要这类编辑的疾病。

靶标和相关疾病的非限制性示例包括但不限于，过早终止密码子RNA疾病，例如霍勒氏综合症，囊性纤维化，杜兴氏肌肉营养不良等，以及与RNA编辑中的缺陷相关的疾病，如与AMPA亚基GluA2的Q/R残基编辑不足相联系的兴奋性中毒性神经元疾病。兴奋性毒性可能涉及脊髓损伤，中风，脑外伤，听力损失(通过噪声过度暴露或耳毒性)，以及中枢神经系统(CNS)的神经退行性疾病，如多发性硬化症，阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，帕金森氏病，酒精中毒，酒精戒断，尤其是过快的苯二氮戒断，以及亨廷顿病。

实施例

下述实施例为非限制性和说明性的过程，其可以用于在各种情况中实现本公开内容。此外，本文下文所公开所有引用内容通过引用其全部内容纳入本文。

下文描述了申请人生成的重组表达系统的原型，其1)在碱基特异性水平上识别并编辑了活细胞中的报告物mRNA构建体，并且2)逆转了过早终止密码子(PTC)介导的来自活细胞中eGFP报告物转录本的表达沉默(参见图1C和1D)。

实施例1–经由核递送CRISPR/CAS9导向编辑细胞RNA

质粒构建

编码dCas9-2xNLS的序列克隆自pCDNA3.1-dCas9-2xNLS-EGFP(Addgene质粒#74710)。对于ADAR2-XTEN-dCas9融合产物，使用Gibson组装，dCas9序列与XTEN肽接头和ADAR2催化结构域(PCR扩增自人ADAR2 ORF)融合到pCDNA3.1(英杰公司(Invitrogen)骨架。通过反向PCR使用侧接dCas9-NLS序列的引物去除dCas9部分以生成ADAR2-XTEN融合体。分别使用ADAR2-XTEN-dCas9和ADAR2-XTEN作为模板，进行PCR介导的位点导向诱变以生成ADAR2-XTEN-dCas9 E488Q和ADAR2-XTEN E488Q突变变体。通过PCR扩增和使用FastDigestHindIII和NotI(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))的限制性消化，将所有融合序列克隆到pCDNA5/FRT/TO(英杰公司)中。

为了构建esgRNA骨架，将哺乳动物Ef1a启动子、Cherry ORF和BGH多聚(A)信号的序列Gibson组装到pBlueScript II SK(+)(安捷伦公司(Agilent))骨架中，所述pBlueScript II SK(+)骨架具有U6聚合酶III启动子驱动的经修饰的sgRNA支架(Chen等2013)。具有3'延伸序列的个体sgRNA这样生成，通过使用具有间隔子和延伸序列的定制引物对经修饰的sgRNA支架进行PCR扩增并在U6启动子下游Gibson组装到pBlueScript II SK(+)-mCherry载体中。

细胞系和转染

Flp-In T-REX 293在补充有10％胎牛血清(吉布可公司(Gibco))的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中生长。使用TrypLE Express(吉布可公司)每3-4天对细胞传代，并以37℃、5％CO₂维持于组织培养孵育箱中。

这样生成稳定的强力霉素诱导系，通过将细胞接种在10cm组织培养皿并用1ugpCDNA5/FRT/TO以及9ug pOG44(英杰公司)以60-70％汇合度共转染，所述pCDNA5/FRT/TO含有ADAR2融合构建体，所述pOG44编码Flp重组酶，使用聚乙烯亚胺(PEI)。随后，将细胞传代至25％汇合度，并在48小时后使用5ug/ml杀稻瘟菌素和100ug/ml潮霉素B(吉布可公司)选择。细胞处于选择状态，直到鉴定出抗潮霉素的个体菌落，并挑选8-10个菌落用于扩增和验证。

转染之前，将0.1x 10⁶个细胞在转染当天之前24小时接种到24孔板，并用多西环素以1ug/ml的最终浓度预孵育24小时。然后使用Lipofectamine 3000(英杰公司)，将细胞与150ug相应的sgRNA-mCherry构建体与350ug的W58X突变体或WT eGFP报告物构建体(来自Stafforst lab的馈赠)共转染。转染后将细胞在多西环素诱导下保存48小时，然后进行成像和FACS分析。使用Zeiss荧光显微镜以20倍放大率捕获图像。

流式细胞术分析

使用标准方案用TrypLE Express解离细胞。然后将细胞重悬于补充有5％FBS的1XDPBS(康宁公司(Corning))中，穿过35μm尼龙细胞滤网，并使用LSRFortessa或Accuri仪器(BD公司)进行流式细胞术分析。对细胞进行适当地门控，并分析GFP(FITC)荧光。为了对转染效率进行标准化，这样计算针对各融合体-esgRNA对校正的单个eGFP百分比值：由W58XeGFP转染群获取GFP阳性细胞分数并除以当另外用WT eGFP报告物转染时的GFP阳性细胞的分数。使用FlowJo软件分析FACS分析，并使用Graphpad Prism 6绘制编译的结果。

讨论

在这些实验中(并且并不限于此)，上述重组表达系统包含：A)核酸序列，其编码与人ADAR2蛋白催化脱氨酶结构域融合的核酸酶失活的Cas9(dCas9)蛋白，和B)由U6聚合酶III启动子驱动的延长单向导RNA(esgRNA)序列。使用适当的转染试剂将系统递送到哺乳动物细胞的细胞核，序列结合并在形成RCas9-RNA识别复合物后编辑靶mRNA。这允许进行选择RNA编辑，其中，靶向的腺苷残基经脱氨基成为肌苷，以被细胞机制识别为鸟苷。

上述系统中所述的催化活性脱氨酶结构域(DD)是野生型人ADAR2或人ADAR2 DD，所述人ADAR2 DD具有相对于野生型人ADAR2增加对RNA底物的酶促活性和亲和力的突变(E488Q)。DD与半柔性XTEN肽接头在其C-末端融合，然后与dCas9在其N-末端融合(图1B)。对于RNA识别独立背景编辑的对照，还生成了缺乏dCas9部分的融合构建物(AX，AX-488Q)。

esgRNA构建体经这样的同源性区域修饰，所述同源性区域能够在编辑的所需位点上近乎完美的RNA-RNA碱基配对。该同源性区域包含靶向的腺苷的错配，迫使A-C错配并在靶转录本上生成“假-dsRNA”底物(图1A)。这产生了可编程的RNA底物识别并同时碱基特异性脱氨基的方法。此外，这些经修饰的esgRNA构建体克隆到载体中，所述载体还包含标志物基因，例如，由单独的Ef1a pol II启动子驱动的mCherry构建体，如实施例所示。这提供了使用流式细胞术分选经esgRNA转染的细胞，以及用靶向的RNA编辑进一步富集细胞。

实施例2-dSpCas9和dSaCas9 CREDIT系统的比较

dSaCas9显著小于dSpCas9，其在病毒包装中提供效率。制备CREDIT系统，其包含(1)与GSGS接头融合的ADAR2(E488Q)-dSaCas9(SEQ ID NO:12)和(2)具有支架序列的esgRNA(SEQ ID NO:11)，所述支架序列对靶向EGFP报告物的SaCas9具有特异性。通过该系统进行的mRNA编辑的效率与含有ADAR2(E488Q)-dSpCas9的系统进行比较，如图13B所示。ADAR2-dSaCas9导致约30％的靶细胞成功表达经编辑的EGFP RNA，与之相比，ADAR2-dSpCas9为约20％。总之，该数据证明了ADAR2-dSaCas9和ADAR2-dSpCas9的成功编辑。

实施例3-治疗2B型肢带型肌营养不良症

2B型肢带型肌营养不良症由Dysferlin基因中的缺陷而引起。通过研发准确校正对象中Dysferlin mRNA的方法，具有完整功能性的Dysferlin蛋白可以在患有该疾病的患者中表达。

本公开的重组表达系统允许简单校正突变Dysferlin mRNA。当与公开的AAV递送系统联用时，这些系统可以藉由单次静脉内给药高效地靶向每个主要肌肉，并提供稳健的治疗策略以治疗肌营养不良症。因为AAV最终将用于靶向骨骼肌，所以应当使用具有骨骼肌趋向的AAV，如AAV1，AAV6，AAV7，AAV8或AAV9。

如本文所述制备病毒颗粒。简言之，Flp-In T-REX 293细胞是如实施例1所述的经转染的载体。设计esgRNA以靶向对象dysferlin mRNA内的突变基因座。可以设计esgRNA以靶向下述一个或多个dysferlin mRNA中的突变：NM_001130455，NM_001130976，NM_001130977，NM_001130978，NM_001130979，NM_001130980，NM_001130981，NM_001130982，NM_001130983，NM_001130984，NM_001130985,NM_001130986,NM_001130987或NM_003494)。在一些实施方式中，在设计esgRNA之前对对象的dysferlin mRNA进行测序以确认存在可校正的A点突变。将编码esgRNA的核酸克隆到合适的载体中。转染包装细胞后，收获组装的病毒颗粒并测试Cas9蛋白表达，以及esgRNA的表达。还测试该包装病毒的病毒效价，其范围应当在约10^8GC/mL至10^17GC/mL，最佳效价为约10^13GC/mL。测试病毒效价可以通过western印迹或通过病毒基因组拷贝数，其通过qPCR并与拷贝数量标准样品比较。

可以将经修饰的病毒颗粒离体或体外给予患2B型肢带型肌营养不良症的对象的肌肉干细胞或祖细胞。在整合病毒载体后，将经修饰的细胞通过肌肉内注射移植回对象。这样测量使用经修饰的AAV处理的细胞的细胞疗法有效性：肌肉形态学改善，多聚肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物和神经元一氧化氮合酶的肌纤维膜定位减少，以及检测dysferlin表达。

或者，通过例如局部或全身递送，如肌内注射，腹膜内注射或静脉内注射，病毒颗粒可以体内给予肌肉组织。病毒基因疗法的有效性通过肌肉形态学改善以及检测dysferlin表达来测量。

CRISPR介导的RNA编辑的效率通过设计这样的PCR引物测试，所述PCR引物检测经修复的dysferlin mRNA片段的逆转录拷贝。经修复的基因产物的表达还可以通过经治疗的肌肉组织的PCR、组织学染色或western印迹检测。

实施例4-编辑CFTR mRNA

囊性纤维化是影响肺、胰腺、肝、肾和肠的遗传性疾病。长期症状包括由于肺部频繁感染而导致呼吸困难和咳嗽。其他迹象和症状可能包括鼻窦感染，生长不良，大便肥腻，手指和脚趾杵状指和不育。囊性纤维化是由囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)基因中的突变引起的。通过研发准确校正对象中CFTR mRNA的方法，具有完整功能性的CFTR蛋白可以在这些患者中表达。

本公开的重组表达系统允许简单校正CFTR mRNA。当与病毒递送系统如AAV或慢病毒联用时，这些系统可以用于高效地靶向影响的组织并提供稳健的治疗策略以治疗囊性纤维化。具有肺趋向的AAV包括但不限于，AAV4、AAV5、AAV6和AAV9。

设计esgRNA以靶向对象CTFR mRNA内的突变基因座。在一些实施方式中，在设计esgRNA之前对对象的CFTR mRNA进行测序以确认存在可校正的A点突变。将编码esgRNA的核酸克隆到合适的载体中。合适的CFTR靶间隔子序列的非限制性示例为SEQ ID NO:43。合适的CFTR延伸序列的非限制性示例为SEQ ID NO:44。含有靶向CFTR的esgRNA的慢病毒质粒的非限制性示例为LCV2_purpo_CFTR_51_1217_gibson(SEQ ID NO:35)。

转染包装细胞后，收获组装的病毒颗粒并测试Cas9蛋白表达，以及esgRNA的表达。还测试该包装病毒的病毒效价，其范围应当在约10^8GC/mL至10^17GC/mL，最佳效价为约10^13GC/mL。测试病毒效价可以通过western印迹或通过病毒基因组拷贝数，其通过qPCR并与拷贝数量标准样品比较。

通过例如局部或全身递送，如腹膜内注射、器官靶向注射或静脉内注射，病毒颗粒可以体内给予对象。这样测量病毒基因疗法的有效性：肺功能改善，减少或改善囊性纤维化的一种或多种症状，和/或检测校正的CFTR蛋白表达。

CRISPR介导的RNA编辑的效率通过设计这样的PCR引物测试，所述PCR引物检测经修复的CFTR mRNA片段的逆转录拷贝。经修复的基因产物的表达还可以通过经治疗的肺组织的PCR、组织学染色或western印迹检测。

实施例5-编辑IDUA mRNA

霍勒氏综合症是由于缺乏α-L艾杜糖苷酸酶(IDUA)(一种负责溶酶体中黏多糖降解的酶)而导致糖胺聚糖堆积的遗传性疾病。没有这种酶，硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素就会在体内堆积。症状包括但不限于肝脾肿大，侏儒症，独特的面部特征，进行性智力低下以及因器官损伤而引起的早逝。

本公开的重组表达系统允许简单校正IDUA mRNA。当与病毒递送系统如AAV或慢病毒联用时，这些系统可以用于提供稳健的治疗策略以治疗霍勒氏综合症。

设计esgRNA以靶向对象IDUA mRNA内的突变基因座。在一些实施方式中，在设计esgRNA之前对对象的IDUA mRNA进行测序以确认存在可校正的A点突变。将编码esgRNA的核酸克隆到合适的载体中。合适的IDUA靶向间隔子序列的非限制性示例为SEQ ID NO:45。合适的IDUA延伸序列的非限制性示例为SEQ ID NO:46。含有靶向IDUA的esgRNA的慢病毒质粒的非限制性示例为AXCM_LCV2_puro_IDUA_无-间隔子_gibson(SEQ ID NO:39)。

通过例如全身递送，如静脉内注射，病毒颗粒可以体内给予对象。这样测量病毒基因疗法的有效性：对象中硫酸肝素量的减少，减少或改善霍勒氏综合症的一种或多种症状，和/或检测校正的IDUA蛋白表达。

CRISPR介导的RNA编辑的效率通过设计这样的PCR引物测试，所述PCR引物检测经修复的IDUA mRNA片段的逆转录拷贝。经修复的基因产物的表达还可以通过经治疗的组织的PCR、组织学染色或western印迹检测。

等同形式

应当理解的是，尽管通过优选的实施方式和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以凭借本文所公开的发明进行修改、改良和变化，因此应认为这类修改、改良和变化落在本发明的范围内。本文所述的材料、方法和示例是优选实施方式的代表，是示例性的，而非旨在作为对本发明范围的限制。

本文广泛和概括性地描述了本发明。落入一般性公开内容中的各较窄种类和亚属群组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，其附带条件或否定限制是从这一类别中去除了任何主题，无论排除的材料是否在本文中具体叙述。

另外，当按照马库什基团描述本发明的特征或方面的时候，本领域技术人员应认识到，本发明还可由此按照所述马库什基团的任意单独组成部分或子群描述本发明。

本文所提及的所有公开出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用其全部内容清楚地纳入，就如同其各自通过单独地引用纳入本文。若有抵触，以本说明书(包括定义)为准。

参考文献

1.Fukuda,M.,等,利用细胞内A至I RNA编辑构建用于位点导向RNA诱变的向导RNA(Construction of a guide-RNA for site-directed RNA mutagenesis utilisingintracellular A-to-I RNA editing).Sci Rep,2017.7:第41478页.

2.Halo等"用于由人血检测，分离和培养活肿瘤细胞的NanoFlares(NanoFlaresfor the detection,isolation,and culture of live tumor cells from humanblood)"PNAS doi:10.1073/pnas.1418637111.

3.Hanswillemenke等,体内位点导向RNA编辑可通过人造核糖蛋白的光驱动装配触发(Site-Directed RNA Editing in Vivo Can Be Triggered by the Light-DrivenAssembly of an Artificial Riboprotein).J Am Chem Soc,2015.137(50):第15875-81页.

4.Hua等"外围SMN修复对于长期拯救严重的脊髓性肌萎缩症小鼠模型至关重要(Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severespinal muscular atrophy mouse model)."Nature.2011Oct 5；478(7367):123-6.doi:10.1038/nature10485.

5.McMahon等,TRIBE：劫持RNA编辑酶以识别RNA结合蛋白的细胞特异性靶标(TRIBE:Hijacking an RNA-Editing Enzyme to Identify Cell-Specific Targets ofRNA-Binding Proteins).Cell,2016.165(3):p.742-53.

6.Montiel-Gonzalez等“选择性改变mRNA内遗传信息的高效系统(An efficientsystem for selectively altering genetic information within mRNAs).”NucleicAcids Res.2016 44:e157.doi:10.1093/nar/gkw738.

7.Montiel-Gonzalez等“通过位点导向RNA编辑校正囊性纤维化跨膜电导调节剂内的突变(Correction of mutations within the cystic fibrosis transmembraneconductance regulator by site-directed RNA editing).”PNAS.2013 110:18285-90.

8.Schneider等“用于反式重导向hADAR1和hADAR2脱氨酶活性的最佳向导RNA(Optimal guideRNAs for re-directing deaminase activity of hADAR1 and hADAR2in trans).”Nucleic Acids Res.2014 42:e87.doi:10.1093/nar/gku272.

9.Wang等"具有设计特异性的工程改造剪接因子(Engineering splicingfactors with designed specificities)"Nat Methods.2009年11月；6(11):825–830.

10.1038/nmeth.1379

10.WO 2015089277

11.WO 2016183402

序列

下文提供了本文所述构建体的示例性序列。

pcDNA3.1(1)_ADAR2_XTEN_dCas9(SEQ ID NO:27)

/翻译＝"MLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP"

/翻译＝"MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD"

/翻译＝"MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF"

翻译＝"MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW"

pcDNA3.1(1)_ADAR2_XTEN_对照(SEQ ID NO:28).

翻译＝"MLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP"

翻译＝"MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF"

pcDNA3.1_ADAR2(E488Q)_XTEN_dCas9(SEQ ID NO:29).

翻译＝"MLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGQGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP"

翻译＝"MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD"

pcDNA3.1_ADAR2(E488Q)_XTEN_对照(SEQ ID NO:30).

50bp_GFP_mCherry_延伸(SEQ ID NO:31).

翻译＝"MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK"

缺间隔子_GFP_mCherry_延伸(SEQ ID NO:32).

GFP_无_间隔子_revcomp_mCherry_gibson(SEQ ID NO:33).

pBluescriptIISK+U6-λ2-sgRNA(F+E)(SEQ ID NO:34).

EGFP_缺间隔子_SaCas9_sgRNA(SEQ ID NO:47)

ADAR2_E488Q_dSaCas9_pCDNA3_1(SEQ ID NO:48)

LCV2_puro_CFTR_51_1217_gibson(SEQ ID NO:35)

翻译＝

"MLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGQGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP"

翻译＝

"MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD"

AXCM_LCV2_puro_IDUA_无-间隔子_gibson(SEQIDNO:39)

/翻译

＝"MLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGQGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP"

/翻译＝

Claims

1.一种用于对靶RNA进行CRISPR/Cas导向RNA编辑的重组表达系统，其包含：

(A)编码CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白的核酸序列，所述CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白包含与RNA依赖性腺苷脱氨酶(ADAR)的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)；和

(B)编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸序列，所述esgRNA包含：(i)与所述靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。

2.如权利要求1所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA进一步包含(iii)间隔子序列，所述间隔子序列含有与所述靶RNA具有同源性的区域。

3.如权利要求1所述的重组表达系统，其中，(A)和(B)包含在同一载体内或者包含在不同的载体内。

4.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述ADAR选自下组：ADAR1、ADAR2和ADAR3。

5.如权利要求4所述的重组表达系统，其中，所述ADAR的催化活性脱氨酶结构域是ADAR2的催化活性脱氨酶结构域。

6.如权利要求5所述的重组表达系统，其中，所述ADAR2的催化活性脱氨酶结构域是(1)人ADAR2的野生型催化活性脱氨酶结构域或(2)相较于所述野生型人ADAR2催化活性增强的ADAR2的突变型人催化活性脱氨酶结构域。

7.如权利要求6所述的重组表达系统，其中，ADAR2的突变型人催化活性脱氨酶结构域包含E488Q突变。

8.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述dCas是核酸酶失活Cas9(dCas9)。

9.如权利要求8所述的重组表达系统，其中，所述dCas9 N末端结构域与所述ADAR的催化活性脱氨酶结构域的C末端融合。

10.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述dCas与所述ADAR的催化活性脱氨酶结构域经由接头融合。

11.如权利要求10所述的重组表达系统，其中，所述接头是半柔性XTEN肽接头。

12.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列是3'延伸序列。

13.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列包含能够与靶序列接近完美RNA-RNA碱基配对的同源性区域。

14.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列还包含针对所述靶RNA内腺苷的第二错配。

15.如权利要求14所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列还包含针对所述靶RNA内腺苷的第三错配，以及任选地针对所述靶RNA内腺苷的第四错配。

16.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的短延伸序列的长度为约15个核苷酸至约60个核苷酸。

17.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA还包含标志物序列。

18.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA还包含RNA聚合酶III启动子序列。

19.如权利要求18所述的重组表达系统，其中，所述RNA聚合酶III启动子序列是U6启动子序列。

20.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA包含位于所述间隔子序列和所述支架序列之间的接头序列。

21.如权利要求2所述的重组表达系统，其中，所述esgRNA的序列(i)、(ii)和(iii)按3'-5'位于esgRNA中。

22.如前述权利要求中任一项所述的重组表达系统，其还包含编码PAM序列的核酸。

23.如权利要求3所述的重组表达系统，其中，所述载体是病毒载体。

24.如权利要求22所述的重组表达系统，其中，所述病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体。

25.一种含有编码延长单向导RNA(esgRNA)的核酸的载体，所述esgRNA包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，(ii)dCas支架结合序列，和(iii)与所述靶核酸互补的序列(间隔子序列)，其中(i)、(ii)和(iii)按3'-5'位于所述esgRNA中。

26.如权利要求25所述的载体，其中，所述载体是病毒载体。

27.如权利要求26所述的载体，其中，所述病毒载体是腺相关病毒载体(AAV)、慢病毒载体或腺病毒载体。

28.如权利要求25-27中任一项所述的载体，其还包含表达控制元件。

29.一种包含权利要求25-28中任一项所述载体的病毒颗粒。

30.一种含有权利要求1-24中所述重组表达系统、权利要求25-28中所述载体或权利要求29中所述病毒颗粒中任一项的细胞。

31.一种esgRNA，其包含：(i)与靶RNA具有同源性的短延伸序列，其包含针对靶腺苷的错配，和(ii)dCas支架结合序列。

32.一种CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白，其包含与ADAR的催化活性脱氨酶结构域融合的核酸酶失活CRISPR相关内切核酸酶(dCas)。

33.一种进行选择性RNA编辑的方法，其包括向细胞给予权利要求1-24中所述重组表达系统、权利要求25-28中所述载体或权利要求29中所述病毒颗粒中的任一项。

34.如权利要求33所述的方法，其还包括给予反义合成寡核苷酸化合物，其包含交替的2'OMe RNA和DNA碱基(PAM聚体)。

35.如权利要求33或34所述的方法，其中，所述方法为体外或体内的。

36.一种表征导向细胞RNA编辑对加工和动力学作用的方法，其包括给予样品权利要求1-24中所述重组表达系统、权利要求25-28中所述载体、权利要求29中所述病毒颗粒或权利要求30中所述细胞中的任一项，和确定其作用。

37.如权利要求36所述的方法，其中，所述样品源自对象。

38.一种治疗对象中疾病或病症的方法，其包括给予对象或分离自对象的样品权利要求1-24中所述重组表达系统、权利要求25-28中所述载体、权利要求29中所述病毒颗粒或权利要求30中所述细胞中的任一项。

39.如权利要求38所述的方法，其还包括校正靶RNA中的G-A突变。

40.如权利要求38或39所述的方法，其中，所述疾病选自下组：霍勒氏综合症，囊性纤维化，肌营养不良症，脊髓损伤，中风，外伤性脑损伤，听力损失(通过噪音过度暴露或耳毒性)，多发性硬化症，阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，帕金森氏病，酒精中毒，酒精戒断，过快的苯二氮戒断和亨廷顿病。

41.一种试剂盒，其包含：

(A)下述一种或多种物质：

(i).权利要求1-24中任一项所述的重组表达系统；

(ii).权利要求25-28中任一项所述的载体；

(iii).权利要求29所述的病毒颗粒；和/或

(iv).权利要求30所述的细胞；

(v).权利要求31所述的esgRNA；

(vi).和权利要求32所述的CRISPR/Cas RNA编辑融合蛋白；和

(B)使用说明书。

42.如权利要求41所述的试剂盒，其中，说明书是用来按照权利要求33-40中任一项所述的方法使用。