JP2022540446A - Ｒｎａ標的ノックダウン及び置換の組成物及び使用方法 - Google Patents

Abstract

有毒な機能獲得または喪失変異をもたらす病原性ＲＮＡ分子を特異的に標的化及びノックダウンし、また同時に、標的化され、ノックダウンされた遺伝子を治療用置換遺伝子と置換するための組成物及び方法が開示される。本開示は、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含む、ＲＮＡ誘導標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物を提供し、ｇＲＮＡ配列により誘導される場合、ＲＮＡ結合ポリペプチドが、標的ＲＮＡと結合してそれを切断し、病原性ＲＮＡが、標的ＲＮＡを含み、治療用タンパク質が、病原性ＲＮＡにコードされた機能獲得または喪失変異に取って代わる置換である。

Description

本開示は、分子生物学、遺伝子治療、ならびにＲＮＡ分子の発現及び活性を改変するための組成物及び方法に関する。

配列表の参照による組み込み
２０２０年７月１０日に作成され、サイズが６．０７ＭＢである「ＬＯＣＮ＿００５＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルの内容は、本明細書に全体が参照により組み込まれる。

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１９年７月１０日に出願された米国仮出願第６２／８７２，６０４号及び２０２０年１月３１日に出願された同第６２／９６８，８１９号に対して優先権及びその利益を主張する。これらの出願のそれぞれの内容は、本明細書に全体が参照により組み込まれる。

効果的な機能獲得または機能喪失遺伝子置換療法を提供するための当該技術分野において、長年にわたり満たされていないニーズがあった。ＲＮＡ標的化システムの効果的な方法を提供するための当該技術分野における長年にわたるニーズもある。したがって、本開示は、ＲＮＡ標的化及び遺伝子置換方策の組み合わせを提供する。特に、本開示は、有毒な機能獲得または喪失変異をもたらす病原性ＲＮＡ分子を、配列固有の様式で、特異的に標的化及びノックダウンし、また同時に標的化及びノックダウン遺伝子を治療用置換遺伝子と置換するための組成物及び方法を提供する。

本開示は、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含む、ＲＮＡ誘導標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物を提供し、ｇＲＮＡ配列により誘導される場合、ＲＮＡ結合ポリペプチドが、標的ＲＮＡと結合してそれを切断し、病原性ＲＮＡが、標的ＲＮＡを含み、治療用タンパク質が、病原性ＲＮＡにコードされた機能獲得または喪失変異に取って代わる置換である。

本開示は、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含む標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物を提供し、ＲＮＡ結合ポリペプチドが、標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡにコードされたタンパク質と結合してそれを切断し、１つ以上の機能獲得または喪失変異を有する病原性タンパク質をコードする病原性ＲＮＡが、標的ＲＮＡを含み、治療用タンパク質が、病原性タンパク質に取って代わる置換タンパク質である。

本開示は、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含む網膜色素変性症（ＲＰ）を処置するための標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物も提供し、ＲＮＡ結合ポリペプチドが、標的ロドプシンＲＮＡまたは標的ロドプシンＲＮＡにコードされたタンパク質と結合してそれを切断し、１つ以上の機能獲得または喪失ロドプシン変異を有する病原性ロドプシンタンパク質をコードする病原性ロドプシンＲＮＡが、標的ロドプシンＲＮＡを含み、治療用タンパク質が、野生型ロドプシンタンパク質である。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、またはＣａｓ１３ｄである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合ポリペプチドは、非誘導ＲＮＡ結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、非誘導ＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＰＵＦ、またはＰＵＭＢＹタンパク質である。いくつかの実施形態では、非誘導ＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質である。一実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹベースの第１のＲＮＡ結合タンパク質は、配列番号３５８のＺＣ３Ｈ１２Ａ（本明細書ではＥ１７とも呼ばれる）として知られるジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである第２のＲＮＡ結合タンパク質に融合される。

いくつかの実施形態では、治療用置換遺伝子（対応する疾患）は、ロドプシン（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３１（常染色体優性網膜色素変性症）、ＧＲＮ（ＦＴＤ）、ＳＯＤ１（ＡＬＳ）、ＰＭＰ２２（シャルコー・マリー歯病）、ＰＡＢＰＮ１（眼咽頭型筋ジストロフィー）、ＫＣＮＱ４（難聴）、ＣＬＲＮ１（アッシャー症候群）、ＡＰＯＥ２（アルツハイマー病）、ＡＰＯＥ４（アルツハイマー病）、ＢＥＳＴ１（眼疾患）、ＭＹＢＰＣ３（家族性心筋症）、ＴＮＮＴ２（家族性心筋症）、及びＴＮＮＩ３（家族性心筋症）からなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ロドプシンまたは野生型ロドプシンである。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ヒトロドプシンである。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は「硬化」ロドプシンである。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、病原性ロドプシンＲＮＡは、少なくとも１つの機能獲得または喪失変異を含むか、またはコードする。

いくつかの実施形態では、ロドプシン標的ＲＮＡは、ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣ（配列番号４０６）を含む。いくつかの実施形態では、ロドプシン標的ＲＮＡは、ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＴ（配列番号４６２）、ＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡ（配列番号４６３）、またはＣＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴ（配列番号４６４）を含む。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、２６９～２７６位にＡＳＶＡＦＹＩＦ（配列番号４０７）を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、２６８～２７７位にＹＡＳＶＡＦＹＩＦＴ（配列番号４８６）を含むアミノ酸をコードする。

いくつかの実施形態では、「硬化」ロドプシンは、ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣ（配列番号４０６）を含むロドプシン標的ＲＮＡを含まない核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、「硬化」ロドプシンは、ＧＣＴＴＣＣＧＴＡＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴ（配列番号４０８）を含む核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、核酸配列は、少なくとも１つのプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、オプシンプロモーター、ＥＦＳプロモーター、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、核酸配列は、２つのプロモーターを含む。一の実施形態では、２つのプロモーターは、置換ロドプシンタンパク質の発現を引き起こすオプシンプロモーター及びＺＣ３Ｈ１２Ａなどのエフェクタータンパク質である第２のＲＮＡ結合タンパク質に融合されたＰＵＦまたはＰＵＭＢＹベースのＲＮＡ結合タンパク質の発現を引き起こすＥＦＳプロモーターである。

本明細書に開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示のノックダウン置換組成物を含むベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、及びデンドリマーからなる群より選択される。本明細書に開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示のベクターを含む細胞である。

本明細書に開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドであり、核酸配列は、それがＲＮＡと会合する方法でＲＮＡと結合する第２のＲＮＡ結合ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合ポリペプチドは、それがＲＮＡを切断するようにＲＮＡと会合する。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡｓｅ１、ＲＮＡｓｅ４、ＲＮＡｓｅ６、ＲＮＡｓｅ７、ＲＮＡｓｅ８、ＲＮＡｓｅ２、ＲＮＡｓｅ６ＰＬ、ＲＮＡｓｅＬ、ＲＮＡｓｅＴ２、ＲＮＡｓｅ１１、ＲＮＡｓｅＴ２様、ＮＯＢ１、ＥＮＤＯＶ、ＥＮＤＯＧ、ＥＮＤＯＤ１、ｈＦＥＮ１、ｈＳＬＦＮ１４、ｈＬＡＣＴＢ２、ＡＰＥＸ２、ＡＮＧ、ＨＲＳＰ１２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＩＤＡ、ＰＤＬ６、ＮＴＨＬ、ＫＩＡＡ０３９１、ＡＰＥＸ１、ＡＧＯ２、ＥＸＯＧ、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＥＲＮ２、ＰＥＬＯ、ＹＢＥＹ、ＣＰＳＦ４Ｌ、ｈＣＧ＿２００２７３１、ＥＲＣＣ１、ＲＡＣ１、ＲＡＡ１、ＲＡＢ１、ＤＮＡ２、ＦＬＪ３５２２０、ＦＬＪ１３１７３、ＥＲＣＣ４、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ）、ＴＥＮＭ１、ＴＥＮＭ２、ＲＮＡｓｅＫ、ＴＡＬＥＮ、ＺＮＦ６３８、及びｈＳＭＧ６からなる群より選択される。一実施形態では、第２のＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＺＣ３Ｈ１２Ａである。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、さらに、真核細胞においてｇＲＮＡを発現することができるプロモーターをコードする配列を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＡＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＧＡＣＴＣＧＴＴＧ（配列番号４６５）、ＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧ（配列番号４０９）、またはＡＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧ（配列番号４６６）を含むスペーサー配列を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、真核細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、ヒト細胞である。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼの発現を引き起こすことができるプロモーターから単離または誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、Ｕ６プロモーターから単離または誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を引き起こすことができるプロモーターから単離または誘導された配列である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リジンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、スレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、またはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離または誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離または誘導される。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、さらに、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％、または間の任意の割合の相補性を有する。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列と１００％の相補性を有する。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、または２９ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２６ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、未処理であり、３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、未処理のスペーサー配列は、３０～３６ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、さらに、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％、または間の任意の割合の相補性を有する。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、さらに、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％、または間の任意の割合の相補性を有する。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ分子内の第２の配列に結合しないか、または選択的に結合しない。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームは、ＲＮＡ分子を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低減するか、または阻害される。いくつかの実施形態では、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加するか、または誘導される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、天然のＤＮＡヌクレアーゼ活性が阻害される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインが、その変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に生ずる。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に生ずる。いくつかの実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。

いくつかの実施形態では、病原性ＲＮＡは、標的ＲＮＡを含み、及び／または標的ＲＮＡは、病原性ＲＮＡと関連する。いくつかの実施形態では、病原性ＲＮＡは、機能獲得または喪失変異をコードする。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低減するか、または阻害される。いくつかの実施形態では、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加するか、または誘導される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、天然のＤＮＡヌクレアーゼ活性が阻害される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインが、その変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に生ずる。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に生ずる。いくつかの実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ１３ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ１３ｄポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低減するか、または阻害される。いくつかの実施形態では、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加するか、または誘導される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、天然のＤＮＡヌクレアーゼ活性が阻害される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、変異を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインが、その変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に生ずる。いくつかの実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に生ずる。いくつかの実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、非誘導ＲＮＡ結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、非誘導ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏ及びＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質またはそのＲＮＡ結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏベースのアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質またはそのＲＮＡ結合部分を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のための多量体化を必要としない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。いくつかの実施形態では、多量体タンパク質複合体は、ＲＮＡ結合タンパク質を含まない。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する高い親和性を含まないか、またはそれと選択的に結合しない。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームは、ＲＮＡ分子を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、２～１３００アミノ酸（端点を含む）を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、さらに、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、またはタグをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列は、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列のＮ末端に配置される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、タンパク質のＣ末端にＮＬＳを含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、さらに、第１のＮＬＳをコードする第１の配列及び第２のＮＬＳをコードする第２の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳをコードする配列は、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列のＮ末端に配置される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質は、タンパク質のＣ末端に第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳを含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、さらに、第２のＲＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、それがＲＮＡと会合する方法でＲＮＡと結合する。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、それがＲＮＡを切断するようにＲＮＡと会合する。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡｓｅを含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、処置を必要とする対象を処置するための方法に使用され、方法は、ノックダウンＲＮＡ及び置換タンパク質をコードする核酸配列と、標的ＲＮＡを接触させることを含む。

本明細書に開示の組成物のいくつかの実施形態では、病原性標的ＲＮＡ分子または病原性ＲＮＡ分子にコードされるタンパク質の発現レベルを低減させ、病原性標的ＲＮＡにより引き起こされた機能獲得または喪失変異を治療用置換タンパク質で置換する方法で、使用され、方法は、標的ＲＮＡ配列へのＲＮＡ結合タンパク質の結合に適する条件下で、標的ＲＮＡ配列を含む病原性標的ＲＮＡ分子を、本明細書に開示の組成物と接触させることを含み、病原性標的ＲＮＡの発現レベルは低減し、病原性標的ＲＮＡの発現が、治療用置換タンパク質の発現と置換される。

特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。本特許またはカラー図面（複数可）を有する特許出願刊行物のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて、局から提供される。

Ａ～Ｅは、病原性ＲＮＡの同時ノックダウン及び置換を促進する核酸配列設計を示す本開示の組成物の例示的な実施形態の概略図である。核酸配列Ａ～Ｅは、それぞれ、例示的なベクター配列について記載する。これらの実施形態では、ポリメラーゼＩＩ（「ＰｏｌＩＩ」）プロモーターは、ＲＮＡ標的化タンパク質の発現を引き起こし、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（「Ｐｏｌ ＩＩＩ」）は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＲＮＡ標的化タンパク質もコードするベクターに任意のシングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）の発現を引き起こす。置換タンパク質は、第２のポリメラーゼＩＩプロモーターにより、またはＲＮＡ標的化タンパク質を引き起こすのと同じプロモーターを介して提供される。単一のポリメラーゼＩＩプロモーターシステムの場合、置換遺伝子及びＲＮＡノックダウンシステムは、２Ａ部位または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）のいずれかで隔てられている。 ノックダウン及び置換ベクターを含む本開示の治療用組成物及び方法の実施形態の概略図である。ある特定の概略的なベクター設計は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの送達ビヒクル中にパッケージ化され、ＡＡＶ血清型により決定される様式及び投与方法で、標的組織に送達される。標的組織に存在すると、治療薬は、変異ＲＮＡを破壊しながら、変異ＲＮＡ及びコードされたタンパク質を同時に置き換える。 同上。 本明細書に開示の組成物のノックダウン効果を検出するためのルシフェラーゼレポーターアッセイのために設計されたｐｍｉｒＧｌｏの例示的な構成を示すプラスミドマップである。 本明細書に開示の組成物のＰＵＭＢＹベースのノックダウン及び置換の実施形態を示すプラスミドマップである。 本明細書に開示の組成物のＰＵＦベースのノックダウン及び置換の実施形態を示すプラスミドマップである。 本明細書に開示の組成物の実施形態を示す。ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹベースのＲＮＡ結合エフェクター融合タンパク質をコードする核酸配列設計を示す本開示の組成物の例示的な実施形態の概略図を示す。 本明細書に開示の組成物の実施形態を示す。ロドプシン標的ＲＮＡのノックダウンを示す。 本明細書に開示の組成物の実施形態を示す。「硬化」ロドプシンとの標的ＲＮＡの置換を示す。 ロドプシン標的ＲＮＡのノックダウンを示す。 「硬化」ロドプシンとの標的ＲＮＡの置換を示す。 標的化なしと比較した、ルシフェラーゼアッセイのＰＵＦ標的化ロドプシンノックダウンスクリーンを示す。

本開示は、ＲＮＡ標的化及び遺伝子置換の治療的組み合わせを提供する。特に、本開示は、有毒な機能獲得または喪失変異がもたらす病原性ＲＮＡ分子を、配列固有の様式で、特異的に標的化及びノックダウンし、また同時に標的化及びノックダウン遺伝子を対応する治療用遺伝子と置換するための組成物及び方法を提供する。一実施形態では、病原性ＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列を含む。一実施形態では、病原性ＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列を含むが、標的ＲＮＡ配列は、機能獲得や喪失変異を含まない。別の実施形態では、標的ＲＮＡは、非コードＲＮＡにある。さらなる実施形態では、病原性ＲＮＡは、１つ以上の追加の標的ＲＮＡを含む。特に、本開示は、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含む標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物を提供し、ＲＮＡ結合ポリペプチドは、標的ＲＮＡと結合してそれを切断し、病原性ＲＮＡは、標的ＲＮＡを含み、治療用タンパク質は、病原性ＲＮＡまたは病原性ＲＮＡにコードされたタンパク質の野生型置換物である。本開示は、ノックダウン及び置換組成物を含むベクター、組成物、及び細胞を提供する。本開示は、疾患または障害を処置するために、本開示のノックダウン及び置換システム、ＲＮＡ誘導（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース）または非ＲＮＡ誘導（ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹベース）ＲＮＡ結合タンパク質融合、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に対応するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、治療薬置換遺伝子またはその部分、ベクター、組成物、ならびに細胞を使用する方法を提供する。組成物は、特定の標的ＲＮＡ配列または特定の標的化ＲＮＡ配列（例えば、特定のｇＲＮＡスペーサー配列）も提供する。

本開示の組成物及び方法は、ノックダウン及び治療効果の組み合わせを提供する。したがって、組成物は、１）標的ＲＮＡ配列を含む病原性ＲＮＡの切断ができるＲＮＡ結合ポリペプチド（ＲＢＰ）またはＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、及び２）置換治療用タンパク質、をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、置換治療用タンパク質は、病原性標的ＲＮＡまたはタンパク質の野生型タンパク質である。いくつかの実施形態では、治療用（例えば、野生型）置換タンパク質は、病原性標的ＲＮＡにコードされた機能獲得または喪失変異を置換する。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質であり、核酸配列は、さらに、標的ＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に対応するｇＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合ポリペプチドではない。特定の実施形態では、非ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＰＵＦタンパク質またはＰＵＭＢＹタンパク質またはその一部である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを含む病原性ＲＮＡは、機能獲得または喪失変異をコードする。

いくつかの実施形態では、病原性ＲＮＡは、ロドプシン遺伝子に機能獲得または喪失変異をコードし、置換遺伝子が、ヒトロドプシンをコードする。いくつかの実施形態では、病原性ロドプシンＲＮＡは、ロドプシン標的ＲＮＡを含む。一実施形態では、ロドプシン標的ＲＮＡ配列は、ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣ（配列番号４０６）を含む。いくつかの実施形態では、ロドプシン標的ＲＮＡは、ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＴ（配列番号４６２）、ＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡ（配列番号４６３）、またはＣＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴ（配列番号４６４）を含む。

別の実施形態では、ロドプシン標的ＲＮＡは、ＡＳＶＡＦＹＩＦ（配列番号４０７）を含むアミノ酸をコードする。一実施形態では、ロドプシン標的ＲＮＡは、例えば、２６９～２７６位に、ＡＳＶＡＦＹＩＦ（配列番号４０７）を含むアミノ酸をコードする。別の実施形態では、標的ＲＮＡは、ＹＡＳＶＡＦＹＩＦＴ（配列番号４８６）を含むアミノ酸をコードする。別の実施形態では、標的ＲＮＡは、例えば、２６８～２７７位に、ＹＡＳＶＡＦＹＩＦＴ（配列番号４８６）を含むアミノ酸をコードする。

いくつかの実施形態では、置換遺伝子は、「硬化」ロドプシンをコードする。「硬化」ロドプシンは、操作された野生型ロドプシンであり、この発現は、本明細書に開示の組成物を使用して、ノックダウンできないように操作される。一実施形態では、「硬化」ロドプシン核酸配列は、少なくとも１つのミスマッチを含む。別の実施形態では、「硬化」ロドプシン核酸配列は、２つ以上のミスマッチを含む。一実施形態では、「硬化」ロドプシンは、ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣ（配列番号４０６）を含むロドプシン標的ＲＮＡを含まない核酸配列にコードされる。別の実施形態では、「硬化」ロドプシンは、ＧＣＴＴＣＣＧＴＡＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴ（配列番号４０８）を含む核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ロドプシン標的ＲＮＡに相補的である配列である。一実施形態では、ロドプシン標的ＲＮＡを標的とするスペーサー配列は、ＡＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＧＡＣＴＣＧＴＴＧ（配列番号４６５）、ＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＴＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧ（配列番号４０９）、またはＡＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＴＧ（配列番号４６６）である。

ガイドＲＮＡ
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）という用語は、本開示全体にわたって互換的に使用される。

本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、スペーサー配列及び足場及び／または「ダイレクトリピート」（ＤＲ）配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、隣接するスペーサー配列及び足場配列を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列及び足場配列は、隣接していない。いくつかの実施形態では、足場配列は、「ダイレクトリピート」（ＤＲ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＤＲ配列を含む。ＤＲ配列は、スペーサー配列にはさまっているＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（細菌ゲノムまたはプラスミドに天然に存在する）のリピート配列を指す。関連ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の配列が既知の場合、対応するＣａｓタンパク質のＤＲ配列を推測することが可能であることは周知である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡをコードする配列は、リンカー配列で隔てられているスペーサー配列及び足場配列及び／またはＤＲ配列を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれらの間の任意数のヌクレオチドを含んでも、それからなってもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または間の任意数のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、足場配列は、Ｃａｓ９足場配列である。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、Ｃａｓ１３ｄ配列である。

一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄ媒介の様式で１つ以上の標的ＲＮＡ分子とハイブリダイズするｇＲＮＡは、１つ以上のダイレクトリピート（ＤＲ）配列、１つ以上のスペーサー配列、例えば、ＤＲ－スペーサー－ＤＲ－スペーサーのアレイを含む１つ以上の配列、を含む。一実施形態では、複数のｇＲＮＡは、単一アレイから生成され、各ｇＲＮＡは異なり得、例えば、異なるＲＮＡを標的とするか、または単一ＲＮＡの複数の領域またはそれらの組み合わせ標的とすることができる。いくつかの実施形態では、単離ｇＲＮＡは、処理されていない（例えば、約３６ｎｔ）または処理されたＤＲ（例えば、約３０ｎｔ）などの１つ以上のダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、さらに、標的ＲＮＡに特異的である（例えば、相補的である）１つ以上のスペーサー配列を含み得る。ある特定のそのような実施形態では、複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを、複数のｇＲＮＡ、スペーサー、及び／またはＤＲを引き起こすために使用することができる。一実施形態では、ガイドアレイは、ＤＲ（約３６ｎｔ）－スペーサー（約３０ｎｔ）－ＤＲ（約３６ｎｔ）－スペーサー（約３０ｎｔ）－ＤＲ（約３６ｎｔ）を含む。

本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、天然に存在しないヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする配列は、改変または合成ＲＮＡヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。例示的な改変ＲＮＡヌクレオチドとしては、プソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、及び７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ヒポキサンチン、キサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルシチジン、５－ヒドロプキシメチルシトシン、イソグアニン、及びイソシトシンが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的配列内の改変ＲＮＡに結合し得る。標的配列内で、本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、改変または変異（例えば、病原性）ＲＮＡと結合し得る。例示的なエピジェネティックまたは転写後修飾ＲＮＡとしては、２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）（２’－Ｏ－メチル化は、リボース部分の遊離２’－ＯＨの酸素で生じる）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、及び５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、非コードＣ／Ｄボックス核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列をコードする少なくとも１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡに相補的である少なくとも１つの配列を含み、ＲＮＡ分子の標的配列は、少なくとも１つの２’－ＯＭｅを含む。いくつかの実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡに相補的である少なくとも１つの配列を含み、標的ＲＮＡに相補的である少なくとも１つの配列は、ボックスＣモチーフ（ＲＵＧＡＵＧＡ）及びボックスＤモチーフ（ＣＵＧＡ）を含む。

本開示のスペーサー配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に結合する。いくつかの実施形態では、本開示のスペーサー配列は、病原性標的ＲＮＡに結合する。

本開示のスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含んでもよい。本開示のスペーサー配列は、標的配列に選択的に結合するために、ＲＮＡ分子の標的配列に対して十分な相補性を有する配列を含むか、またはそれからなる。ＲＮＡ分子の標的配列に結合すると、スペーサー配列は、ＲＮＡ分子に足場配列及び融合タンパク質のうちの１つ以上を誘導し得る。いくつかの実施形態では、標的配列に選択的に結合するために、ＲＮＡ分子の標的配列と十分な相補性を有する配列は、標的配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、または間の任意の割合の同一性を有する。いくつかの実施形態では、標的配列に選択的に結合するために、ＲＮＡ分子の標的配列と十分な相補性を有する配列は、標的配列と１００％の同一性を有する。

本開示の足場配列は、本開示の第１のＲＮＡ結合ポリペプチドと結合する。本開示の足場配列は、トランス作用性ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含んでもよい。本開示の足場配列は、標的配列に選択的に結合するために、ＲＮＡ分子の標的配列に対して十分な相補性を有する配列を含むか、またはそれからなる。ＲＮＡ分子の標的配列に結合すると、足場配列は、融合タンパク質をＲＮＡ分子に誘導し得る。いくつかの実施形態では、標的配列に選択的に結合するために、ＲＮＡ分子の標的配列と十分な相補性を有する配列は、標的配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、または間の任意の割合の同一性を有する。いくつかの実施形態では、標的配列に選択的に結合するために、ＲＮＡ分子の標的配列と十分な相補性を有する配列は、標的配列と１００％の同一性を有する。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、本開示の融合タンパク質の第１のＲＮＡ結合タンパク質または第２のＲＮＡ結合タンパク質に結合する配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、２次構造または３次構造を含む。例示的な２次構造としては、ヘリックス、ステムループ、バルジ、テトラループ、及びシュードノットが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な３次構造としては、Ａ型ヘリックス、Ｂ型ヘリックス、及びＺ型ヘリックスが含まれるが、これらに限定されない。例示的な３次構造としては、ツイストまたはヘリックスのステムループが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な３次構造としては、ツイストまたはヘリックスのシュードノットが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、少なくとも１つの２次構造または少なくとも１つの３次構造を含む。いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、１つ以上の２次構造または１つ以上の３次構造を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、本開示のＲＮＡ分子中のテトラループモチーフに選択的に結合する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、テトラループモチーフを含む。いくつかの実施形態では、テトラループモチーフは、ＧＡＡＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＡＡ、またはＧＡＧＡの配列のうちの１つ以上を含むか、またはそれらからなる「ＧＲＮＡ」モチーフである。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、ＲＮＡ分子の標的配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質または第２のＲＮＡ結合タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合タンパク質または第２のＲＮＡ結合タンパク質に共有結合的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質または第２のＲＮＡ結合タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合タンパク質または第２のＲＮＡ結合タンパク質に非共有結合的に結合する。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、１０～１００ヌクレオチド（端点を含む）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のスペーサー配列は、１０～３０ヌクレオチド（端点を含む）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のスペーサー配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２６ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。

ガイド分子は、一般に、様々な処理状態で存在する。一例では、処理されていないガイドＲＮＡは、３６ｎｔのＤＲとそれに続く３０～３２ｎｔのスペーサーである。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｄ自体または他のＲＮａｓｅで処理（切断／変更）されて、短い「成熟」形態になる。いくつかの実施形態では、処理されていないガイド配列は、長さが、約または少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、またはそれ以上のヌクレオチド（ｎｔ）である。いくつかの実施形態では、処理されたガイド配列は、約４４～６０ｎｔ（例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０ｎｔ）である。いくつかの実施形態では、処理されていないスペーサーは、約２８～３２ｎｔ長さ（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）であるが、成熟（処理された）スペーサーは、約１０～３０ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１４～２５ｎｔ、２０～２２ｎｔ、または１４～３０ｎｔ（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）であり得る。いくつかの実施形態では、処理されていないＤＲは、約３６ｎｔ（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１ｎｔ）であるが、処理されたＤＲは、約３０ｎｔ（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）である。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、成熟した処理前ガイドＲＮＡとして発現されるために、例えば、５’末端に、１～１０ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド）だけ切断される。

いくつかの実施形態では、本開示の例えばＣａｓ９足場配列などの足場配列は、１０～１００ヌクレオチド（端点を含む）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７６、８０、８７、９０、９５、１００または間の任意数のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、８５～９５ヌクレオチド（端点を含む）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、８５ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、９０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示の足場配列は、９３ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、さらに、第１のＲＮＡ結合タンパク質に特異的に結合する足場配列を含む。いくつかの実施形態では、足場配列は、ステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、足場配列は、９０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、足場配列は、９３ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、足場配列は、配列ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号４０３）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、足場配列は、配列ＧＧＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵ（配列番号４０４）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、足場配列は、配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号４０５）を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含まない。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相補的な配列を含まない。

本開示の治療または医薬組成物は、ＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、任意に、非治療または非医薬組成物は、ＰＡＭｍｅｒオリゴヌクレオチドを含んでもよい。「ＰＡＭｍｅｒ」という用語は、ガイドヌクレオチド配列でプログラム可能なＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができるＰＡＭ配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。ＰＡＭｍｅｒの非限定例は、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１６、２６３～２６６ページ（２０１４）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。ＰＡＭ配列は、約２～約１０ヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフを指す。ＰＡＭ配列は、それらが相互に作用し、当該技術分野で既知であるガイドヌクレオチド配列でプログラム可能なＲＮＡ結合タンパク質に特異的である。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＰＡＭは、配列５’－ＮＧＧ－３’であり、「Ｎ」は、任意の核酸塩基とそれに続く２つのグアニン（「Ｇ」）核酸塩基である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａのＣａｓ９は、標準的なＰＡＭ配列５’－ＮＧＧ－３’を認識するが、ＰＡＭ ５’－ＹＧ－３’（「Ｙ」は、ピリミジンである）を認識するように設計されており、それにより、可能なＣａｓ９標的の範囲に追加される。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａのＣｐｆ１ヌクレアーゼは、ＰＡＭ ５’－ＴＴＴＮ－３’または５’－ＹＴＮ－３’を認識する。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、プロトスペーサー隣接配列（ＰＦＳ）と相補的な配列を含む。ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含む、いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質から単離または誘導された配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含む、いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはそのＲＮＡ結合部分をコードする配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、ＰＦＳと相補的な配列を含まない。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの発現を引き起こすプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ配列を含むベクターは、ガイドＲＮＡの発現を引き起こすプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を引き起こすプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的及び／または細胞型特異的プロモーターである配列である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ハイブリッドまたは組み換えプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物細胞でガイドＲＮＡを発現させることができるプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒト細胞でガイドＲＮＡを発現させることができるプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡを発現させ、ガイドＲＮＡを細胞の核に限定することができるプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーター、またはヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列から単離もしくは誘導された配列である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、またはＵ６プロモーターをコードする配列から単離もしくは誘導された配列である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトｔＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離または誘導された配列である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトバリンｔＲＮＡプロモーター、またはヒトバリンｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離または誘導された配列である。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を引き起こすプロモーターは、さらに、制御エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を引き起こすプロモーター配列を含むベクターは、さらに、制御エレメントを含む。いくつかの実施形態では、制御エレメントは、ガイドＲＮＡの発現を増強する。例示的な制御エレメントとしては、エンハンサーエレメント、イントロン、エクソン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ガイドＲＮＡをコードする配列、ガイドＲＮＡの発現を引き起こすプロモーター配列、及び制御エレメントをコードする配列のうちの１つ以上を含む。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ベクターは、さらに、本開示の融合タンパク質をコードする配列を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ＲＮＡ分子及びＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合タンパク質に対応する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合融合タンパク質に対応し、融合タンパク質は、第１及び第２のＲＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列の５’に配置される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列の３’に配置される。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合することができるタンパク質から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に選択的と結合することができ、ＤＮＡ分子、哺乳動物のＤＮＡ分子、または任意のＤＮＡ分子と結合することができないタンパク質から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子と結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができるタンパク質から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子と結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができ、ＤＮＡ分子、哺乳動物ＤＮＡ分子、または任意のＤＮＡ分子と結合することができないタンパク質から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができ、ＤＮＡ分子、哺乳動物ＤＮＡ分子、または任意のＤＮＡ分子と結合することも、それの破壊を誘導することもできないタンパク質から単離または誘導された配列を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有さないタンパク質から単離または誘導された配列を含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有するタンパク質から単離または誘導された配列を含み、ＤＮＡヌクレアーゼ活性は、本開示の組成物が、ＲＮＡ分子に接触するか、または細胞内もしくは本開示の対象に導入される場合、ＤＮＡ分子、哺乳動物ＤＮＡ分子、または任意のＤＮＡ分子の破壊を引き起こさない。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有するタンパク質から単離または誘導された配列を含み、ＤＮＡヌクレアーゼ活性は、不活性化され、ＤＮＡヌクレアーゼ活性は、本開示の組成物が、ＲＮＡ分子に接触するか、または細胞内もしくは本開示の対象に導入される場合、ＤＮＡ分子、哺乳動物ＤＮＡ分子、または任意のＤＮＡ分子の破壊を引き起こさない。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、本開示の組成物が、ＲＮＡ分子に接触するか、または細胞内もしくは本開示の対象に導入される場合、ＤＮＡヌクレアーゼ活性がＤＮＡ分子、哺乳動物ＤＮＡ分子、または任意のＤＮＡ分子の破壊を引き起こさないレベルに、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を不活性化するか、または減少させる変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を不活性化または減少させる変異を含み、変異は、第１のＲＮＡ結合タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする核酸配列またはアミノ酸配列への、置換、逆位、転位、挿入、欠失のうちの１つ以上、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、本明細書に開示のＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。本開示の例示的なＣａｓ９タンパク質は、限定されないが、細菌または古細菌を含む任意の種から単離または誘導されてもよい。本開示の例示的なＣａｓ９タンパク質は、限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒａｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ ＣＦ８９－１２、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ ｓｔｒ．Ｆ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ ｓｔｒ．ＤＳＭ １６５１１、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、ａ Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、ａｎ Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ Ｂ５１０、ａ Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ ｓｔｒ． Ｂｕｄｄｙ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｓｔｒ．Ｐａｒｉｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａを含む、任意の種から単離または誘導されてもよい。

本開示の例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質は、配列番号４１６のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

ヌクレアーゼ不活性化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質は、１０位のアスパラギン酸（Ｄ）のアラニン（Ａ）との置換、及び８４０位のヒスチジン（Ｈ）のアラニン（Ａ）との置換を含んでもよい。本開示の例示的なヌクレアーゼ不活性化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号４１７のアミノ酸配列（太字及び下線付きＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ）を含んでも、それからなってもよい。

ヌクレアーゼ不活性化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインもしくはその部分、ＨＮＨドメイン、ＤＮＡｓｅ活性部位、ＤＮＡｓｅ活性部位を含むββα金属折り畳みもしくはその部分、またはそれらの任意の組み合わせの欠失を含んでもよい。

他の例示的なＣａｓ９タンパク質またはその一部は、以下のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であり得、配列番号４１８のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９であり得、配列番号４１９のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２０のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２１のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ．ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２２のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２３のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２４のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２５のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２６のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２７のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２８のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ３ Ｃａｓ９であり得、配列番号４２９のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３０のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３１のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３２のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３３のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３４のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３５のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３６のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３７のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３８のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ Ｃａｓ９であり得、配列番号４３９のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｏ．ｌａｎｅｕｓ Ｃａｓ９であり得、配列番号４４０のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質またはその一部から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質を含む。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質は、限定されないが、細菌または古細菌を含む任意の種から単離または誘導されてもよい。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質は、限定されないが、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＮＤ２００６を含む任意の種から単離または誘導されてもよい。本開示の例示的なＣｐｆ１タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化されてもよい。

本開示の例示的な野生型Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）タンパク質は、配列番号４４１のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

本開示の例示的な野生型Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）タンパク質は、配列番号４４２のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

本開示の例示的な野生型Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）タンパク質は、配列番号４４３のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはその一部を含む。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、限定されないが、細菌または古細菌を含む任意の種から単離または誘導されてもよい。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、限定されないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ ｓｅｒｏｖａｒ １／２ｂ（株ＡＴＣＣ ３５９６７／ＤＳＭ２０７５１／ＣＩＰ１００１００／ＳＬＣＣ３９５４）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２、及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓを含む任意の種から単離または誘導されてもよい。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、ＤＮＡヌクレアーゼ不活性化されてもよい。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質としては、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、及びそれらのオルソログが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、本明細書では、それぞれ、Ｃｓｘ２７及びＣｓｘ２８と呼ばれるサブタイプ１及び２が挙げられるが、これらに限定されない。

例示的なＣａｓ１３ａタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：

本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ａタンパク質は、配列番号４５９のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：

本開示の例示的な野生型Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ ＡＴＣＣ ４３７６７ Ｃａｓ１３ｂ（ＢｚＣａｓ１３ｂ）タンパク質は、配列番号４６０のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質から単離または誘導された配列を含む。Ｃａｓ１３ｄは、ＶＩ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのエフェクターである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲＮＡを切断またはそれと結合し得るＲＮＡ誘導ＲＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、１つ以上のより高等な真核生物及び原核生物のヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、野生型または変異ＨＥＰＮドメインのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲＮＡを切断することはできないがガイドＲＮＡを処理することができる変異ＨＥＰＮドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、プロトスペーサー隣接配列を必要としない。限定されないが、Ｃａｓ１３ｄタンパク質のさらなる例及び配列については、ＷＯ公開第ＷＯ２０１９／０４０６６４号及びＵＳ２０１９／００６２７２４（全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照のこと。

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１３ｄ配列は、ＷＯ２０１９／０４０６６４（本明細書で番号が付けられ、本明細書と共に含まれる）の配列番号１～２９６を含むが、これらに限定されない。

配列番号１は、ＨＥＰ部位を含有するＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２は、変異ＨＥＰＮ部位を含有するＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３は、ＨＥＰＮ部位を含有する、未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４は、変異ＨＥＰＮ部位を含有する、未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２７９１０００５４９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８５５０００３１７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３３８９００００２７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８０６１０００１７０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１５０９０００２９９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９５４９０００５９１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７１０００５００由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１２は、ヒト腸メタゲノム由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３９１５０００３５７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４７１９０００１７３由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６９２９０００４６８由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７３６７０００４８６由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７９３００００４０３由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９９３０００５２７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６５５２０００６３９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１１９３２０００２４６由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１２９６３０００２８６由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２２は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２９５２０００４７０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４５１０００３９４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２４は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ｓｉｒａｅｕｍ＿ＤＳＭ＿１５７０２由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２５は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１９Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ３６９０００００３由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７５９３０００３６２由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１２６１９００００５５由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１４０５０００１５１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号２９は、Ｃｈｉｃｋｅｎ＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃ２９８４７４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１５１６０００２２７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１８３８０００３１９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３２は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１３１２３０００２６８由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５２９４０００４３４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６４１５０００１９２由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６１４４０００３００由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９１１８００００４１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３７は、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ＿ｓｌｕｄｇｅ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ＿１２４４８６由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１３２２０００４３７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号３９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４５８２０００５３１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９１９００００２８３由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１７０９０００５１０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４２は、ＨＥＰＮドメインを有するＭ２４＿（ＬＳＱＸ０１２１２４８３＿Ａｎａｅｒｏｂｉｃ＿ｄｉｇｅｓｔｅｒ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３８３３０００４９４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４４は、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ＿ｓｌｕｄｇｅ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ＿１１７３５５由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１１０６１０００３３０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３３８０００３２２由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４７は、ヒト腸メタゲノム由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９５３０００００９７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号４９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１７５００００２５８由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５３７７０００２７４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５１は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１９Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ２４８００００８９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５２は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１１４００００００３１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７９４００００１９１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６０４９０００２５１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１１３７０００５００由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９３６８０００１０５由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５４６０００２７５由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２１６０００５７３由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号５９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４８０６０００４０９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１０７６２０００４８０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４１１４０００３７４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６２は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ＿ＦＤ１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７０９３０００１７０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１１１１３０００３８４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６４０３０００２５９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６１９３０００１２４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２１０００６１９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１６６６０００２７０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号６９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２００２０００４１１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７０は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ａｌｂｕｓ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１３５５２０００３１１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７２は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１００３７０００５２７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２３８０００３２９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２６４３０００４９２由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８７４００００５７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４７８１０００４８９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１２１４４０００３５２由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５５９００００４４８由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号７９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９２６９００００３１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８５３７０００５２０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１８４５０００１３０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８２は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１３Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ３００００７２由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８３は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１ Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃＩ００００７８由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１２９９０００００９９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５２５０００３４９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２２９０００３０２由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３２２７０００３４３．由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７０３００００４６９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号８９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５１４９００００６８由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４００２０００４５由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１０４２００００４４６由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９２は、ｎｅｗ＿ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＸＰＤ３００２（ＣａｓＲｘ）由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９３は、Ｍ２６＿Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６９８０００３０７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９４は、Ｍ３６＿Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ＿Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ｓｐ＿ＴＳ２８＿ｃ４０９５６由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９５は、Ｍ１２＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２５Ｃ０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ１３４００００６６由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９６は、ヒト腸メタゲノム由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９７は、ＭｌＯ＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２５Ｃ９０ｋ２１２０ ｌ ４０９２０＿ｃ２８００００４ １由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９８は、３０Ｍ１ Ｉ＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２５Ｃ７ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ４０７８０００１０５由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号９９は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２５Ｃ０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ３２００００４５由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１００は、Ｍ１３＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２３Ｃ７ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ３００００６７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０１は、Ｍ５＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１８Ｅ９０ｋ２１２０１４０９２０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０２は、Ｍ２１＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１８Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０３は、Ｍ７＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ３８Ｃ７ｋ２１２０ １ ４０９２０＿ｃ４８４ １ ０００００３由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０４は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｂｉｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０５は、例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０６は、例示的なＣａｓ１３ｄコンセンサス配列である。

配列番号１０７は、Ｍ１８＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２２ＥＯｋ２１２０１４０９２０＿ｃ３３９５００００７８由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０８は、Ｍ１７＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２２Ｅ９０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ１１４由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１０９は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｓｐ＿ＣＡＧ５７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１１０は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１ １Ｅ９０ｋ２１２０ １ ４０９２０＿ｃ４３０００１２３由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１１１は、Ｍ６＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１３Ｅ９０ｋ２１２０ １ ４０９２０＿ｃ７０００００９由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１１２は、Ｍ１９＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１７Ｅ９０ｋ２１２０１４０９２０由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１１３は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１７Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０，＿ｃ８７００００４３由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１１４は、例示的なヒトコドン最適化されたＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１１５は、変異型ＨＥＰＮドメインを有する、例示的なヒトコドン最適化されたＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１１６は、Ｎ末端ＮＬＳを有する、例示的なヒトコドン最適化されたＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１１７は、Ｎ末端及びＣ末端ＮＬＳタグを有する、例示的なヒトコドン最適化されたＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１１８は、例示的なヒトコドン最適化未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．のＣａｓ１３ｄ３０核酸配列である。

配列番号１１９は、変異型ＨＥＰＮドメインを有する、例示的なヒトコドン最適化未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．のＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２０は、Ｎ末端ＮＬＳを有する、例示的なヒトコドン最適化未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．のＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２１は、Ｎ末端及びＣ末端のＮＬＳタグを有する、例示的なヒトコドン最適化未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．のＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２２は、例示的なヒトコドン最適化未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤｌ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２３は、変異ＨＥＰＮドメインを有する、例示的なヒトコドン最適化未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ１ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２４は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２５は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２６は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２７は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２８は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１２９は、Ｅ．ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄの例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である。

配列番号１３０は、Ｒｕｍ．Ｓｐ．Ｃａｓ１３ｄの例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である。

配列番号１３１は、Ｒｕｍ．Ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＸＰＤ３００２ Ｃａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘ）の例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である。

配列番号１３２～１３７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である。

配列番号１３８は、７つの全長Ｃａｓ１３ｄオルソログの例示的な５０％のコンセンサス配列である。

配列番号１３９は、胃メタゲノムＰｌＥＯ由来の例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１４０は、嫌気性消化槽由来の例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１４１は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＡＧ：５７由来の例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１４２は、例示的なヒトコドン最適化未培養胃メタゲノムＰｌＥＯ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１４３は、例示的なヒトコドン最適化嫌気性消化槽Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１４４は、例示的なヒトコドン最適化Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１４５は、例示的なヒトコドン最適化Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。

配列番号１４６は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＡＧ：５７のＣＲＩＳＰＲアレイの例示的な処理である。

配列番号１４７は、ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ｜ＯＢＶＨ０１００３０３７．１，ヒト腸メタゲノム配列（ＷＧＳ ｃｏｎｔｉｇｓ ｅｍｂ｜ＯＢＸＺ０１００００９４．１｜ａｎｄ ｅｍｂ｜ＯＢＪＦＯ１００００３３．１にも見られる）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１４８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１４７に対応する）である。

配列番号１４９は、ｃｏｎｔｉｇ ｔｐｇ｜ＤＢＹＩ０１００００９１．１｜（ウシ腸メタゲノムからアセンブルされた未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＵＢＡ１１９０）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１５０～１５２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１４９に対応する）である。

配列番号１５３は、ｃｏｎｔｉｇ ｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜（未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸メタゲノム由来）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１５４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１５３に対応する）である。

配列番号１５５は、ｃｏｎｔｉｇ ＯＧＺＣ０１０００６３９．１（ヒト腸メタゲノムアセンブリ）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１５６～１７７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１５５に対応する）である。

配列番号１５８は、ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ｜ＯＨＢＭ０１０００７６４．１（ヒト腸メタゲノムアセンブリ）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１５９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１５８に対応する）である。

配列番号１６０は、ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ｜０ＨＣＰ０１００００４４．１（ヒト腸メタゲノムアセンブリ）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１６１は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１６０に対応する）である。

配列番号１６２は、ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ１０ＧＤＦ０１００８５１４．１｜（ヒト腸のメタゲノムアセンブリ）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１６３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１６２に対応する）である。

配列番号１６４は、ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ｜０ＧＰＮ０１００２６１０．１（ヒト腸メタゲノムアセンブリ）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１６５は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１６４に対応する）である。

配列番号１６６は、ｃｏｎｔｉｇ ＮＦＩＲ０１０００００８．１（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ａｎ３、ニワトリ腸メタゲノム由来）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１６７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１６６に対応する）である。

配列番号１６８は、ｃｏｎｔｉｇ ＮＦＬＶ０１０００００９．１（ニワトリ腸メタゲノム由来のＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ａｎ１１）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１６９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１６８に対応する）である。

配列番号１７１～１７４は、例示的なＣａｓ１３ｄモチーフ配列である。

配列番号１７５は、ｃｏｎｔｉｇ ＯＪＭＭ０１００２９００ ヒト腸メタゲノム配列由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１７６は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１７５に対応する）である。

配列番号１７７は、ｃｏｎｔｉｇ ＯＤＡＩ０１１６１１２７４．１腸メタゲノム配列由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１７８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１７７に対応する）である。

配列番号１７９は、ｃｏｎｔｉｇ ＯＩＺＸ０１０００４２７．１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１８０は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１７９に対応する）である。

配列番号１８１は、ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ｜ＯＣＶＶ０１２８８９１４４．１｜由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１８２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１８１に対応する）である。

配列番号１８３は、ｃｏｎｔｉｇ ＯＣＴＷ０１１５８７２６６．１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１８４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１８３に対応する）である。

配列番号１８５は、ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ｜ＯＧＮＦＯ １００９１４１．１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１８６は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１８５に対応する）である。

配列番号１８７は、ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ｜ＯＩＥＮ０１００２１９６．１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１８８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１８７に対応する）である。

配列番号１８９は、ｃｏｎｔｉｇ ｅ－ｋ８７＿１１０９２７３６由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１９０～１９３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１８９となる）である。

配列番号１９４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６８９３０００２９１由来の例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。

配列番号１９５～１９７は、例示的なＣａｓ１３ｄモチーフ配列である。

配列番号１９８は、Ｇａ０２２４４１５＿１０００７２７４由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号１９９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号１９８に対応する）である。

配列番号２００は、ＥＭＧ＿１０００３６４１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２０２は、Ｇａ０１２９３０６＿１０００７３５由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２０１は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２００に対応する）である。

配列番号２０２は、Ｇａ０１２９３０６＿１０００７３５由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２０３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２０３に対応する）である。

配列番号２０４は、ＧａＯ１２９３１７＿１００８０６７由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２０５は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２０４に対応する）である。

配列番号２０６は、Ｇａ０２２４４１５＿１００４８７９２由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２０７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２０６に対応する）である。

配列番号２０８は、１６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２０９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２０８に対応する）である。

配列番号２１０は、２５０ｔｗｉｎｓ＿３５８３８＿ＧＬ０１１０３００由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２１１は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２１０に対応する）である。

配列番号２１２は、２５０ｔｗｉｎｓ＿３６０５０＿ＧＬＯＩ５８９８５由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２１３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２１２に対応する）である。

配列番号２１４は、３１００９＿ＧＬ００３４１５３由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２１５は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２１４に対応する）である。

配列番号２１６は、５３０３７３＿ＧＬ００２３５８９由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２１７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２１６に対応する）である。

配列番号２１８は、ＢＭＺ－１ １Ｂ＿ＧＬ００３７７７１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２１９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２１８に対応する）である。

配列番号２２０は、ＢＭＺ－１ １Ｂ＿ＧＬ００３７９１５由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２２１は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２２０に対応する）である。

配列番号２２２は、ＢＭＺ－１ １Ｂ＿ＧＬ００６９６１７由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２２３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２２２に対応する）である。

配列番号２２４は、ＤＬＦ０１４＿ＧＬ００１１９１４由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２２５は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２２４に対応する）である。

配列番号２２６は、ＥＹＺ－３６２Ｂ＿ＧＬ００８８９１５由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２２７～２２８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２２６に対応する）である。

配列番号２２９は、Ｇａ００９９３６４ １００２４１９２由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２３０は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２２９に対応する）である。

配列番号２３１は、Ｇａ０１８７９１０＿１０００６９３１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２３２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２３１に対応する）である。

配列番号２３３は、Ｇａ０１８７９１０＿１００１５３３６由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２３４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２３３に対応する）である。

配列番号２３５は、Ｇａ０１８７９１０＿１００４０５３１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２３６は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２３に対応する）である。

配列番号２３７は、Ｇａ０１８７９１１＿１００６９２６０由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２３８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２３７に対応する）である。

配列番号２３９は、ＭＨ０２８８＿ＧＬ００８２２１９由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２４０は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２３９に対応する）である。

配列番号２４１は、Ｏ２．ＵＣ２９－０＿ＧＬ００９６３１７由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２４２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２４１に対応する）である。

配列番号２４３は、ＰＩＧ－０１４＿ＧＬ０２２６３６４由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２４４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２４３に対応する）である。

配列番号２４５は、ＰＩＧ－０１８＿ＧＬ００２３３９７由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２４６は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２４５に対応する）である。

配列番号２４７は、ＰＩＧ－０２５＿ＧＬ００９９７３４由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２４８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２４７に対応する）である。

配列番号２４９は、ＰＩＧ－０２８＿ＧＬ０１８５４７９由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２５０は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２４９に対応する）である。

配列番号２５１は、Ｇａ０２２４４２２＿１０６４５７５９由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２５２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２５１に対応する）である。

配列番号２５３は、ＯＤＡＩキメラ由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２５４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列（配列番号２５３に対応する）である。

配列番号２５５は、ＨＥＰＮモチーフである。

配列番号２５６及び２５７は、それぞれ、例示的なＣａｓ１３ｄ核局在化シグナルアミノ酸及び核酸配列である。

配列番号２５８及び２６０は、それぞれ、例示的なＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルアミノ酸及び核酸配列である。

配列番号２５９は、ｄＣａｓ９標的配列である。

配列番号２６１は、ｃｃｄＢを標的とする人工のＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ ｎＣａｓ１アレイである。

配列番号２６２は、完全な３６ｎｔのダイレクトリピートである。

配列番号２６３～２６６は、スペーサー配列である。

配列番号２６７は、人工の未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｎＣａｓ１アレイ標的化ｃｃｄＢある。

配列番号２６８は、完全な３６ｎｔのダイレクトリピートである。

配列番号２６９～２７２は、スペーサー配列である。

配列番号２７３は、ｃｃｄＢ標的ＲＮＡ配列である。

配列番号２７４～２７７は、スペーサー配列である。

配列番号２７８は、変異Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－Ｇａ＿０５３ｌ（ｔｒｕｎｃ）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、保存されていないＮ末端が欠失している。

配列番号２７９は、変異Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＥＳ－Ｇａ＿０５３ｌ（ｔｒｕｎｃ）－ＮＥＳ－ＨＡである。この変異体は、保存されていないＮ末端が欠失している。

配列番号２８０は、全長Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ－ＮＬＳ－ＨＡである。

配列番号２８１は、変異Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ５）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸５５８～５８７が欠失している。

配列番号２８２は、変異Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ５．１２）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸５５８～５８７及び９５３～９６６が欠失している。

配列番号２８３は、変異Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ５．１３）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸３７６～３９２及び５５８～５８７が欠失している。

配列番号２８４は、変異Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ５．１２＋５．１３）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸３７６～３９２、５５８～５８７、及び９５３～９６６が欠失している。

配列番号２８５は、変異Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ１３）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸３７６～３９２が欠失している。

配列番号２８６は、ＡＤＡＲ２の発現を編集するために使用されたエフェクター配列である。アミノ酸１～９６９は、ｄＲｆｘＣａｓ１３であり、アミノ酸９７０～９９１は、ＮＬＳ配列であり、アミノ酸９９２～１３７８は、ＡＤＡＲ２ＤＤである。

配列番号２８７は、例示的なＨＩＶ ＮＥＳタンパク質配列である。

配列番号２８８～２９１は、例示的なＣａｓ１３ｄモチーフ配列である。

配列番号２９２は、Ｃａｓ１３ｄオルソログ配列ＭＨ＿４８６６である。

配列番号２９３は、０３７＿－＿ｅｍｂｌＯＩＺＡ０１０００３１５．１１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２９４は、ＰＩＧ－０２２ ＧＬ００２６３５１由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２９５は、ＰＩＧ－０４６＿ＧＬ００７７８１３由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２９６は、ブタキメラ由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２９７は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ３００２（ＣａｓＲｘ）由来の例示的なヌクレアーゼ不活性または死滅Ｃａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ）タンパク質配列である。

配列番号２９８は、例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号２９９は、（ｃｏｎｔｉｇ ｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３、ヒツジ腸メタゲノム由来）由来の例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。

配列番号３００は、Ｃａｓ１３ｄ由来の例示的なＣａｓ１３ｄダイレクトリピートヌクレオチド配列である（ｃｏｎｔｉｇ ｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；ヒツジ腸メタゲノム由来の未培養のＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３（配列番号２９９に対応する）。

配列番号３０１は、例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質ｃｏｎｔｉｇ ｅｍｂ｜ＯＢＬＩ０１０２０２４４である。

Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．７０（２）：３２７－３３９（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１８．０２．２０１８）及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ １７３（３）：６６５－６７６（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ／２０１８．０２．０３３）は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質について記載しており、これらの両方は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＷＯ公開第ＷＯ２０１８／１８３４０３号（Ｃａｓ１３ｄあるＣＡＳＭ）及びＷＯ２０１９／００６４７１（Ｃａｓ１３ｄ）（これらは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照のこと。

配列番号４６７は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４６８は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、分離株２７８９ＳＴＤＹ５８３４９７１由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４６９は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４７０はＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、分離株２７８９ＳＴＤＹ５６０８８９２由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４７１は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＡＧ：５７由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４７２は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ－１由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４７３は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ株ＫＨ２Ｔ６由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４７４は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ株ＸＰＤ３００２由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４７５は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．分離株２７８９ＳＴＤＹ５８３４８９４由来の例示的なＣａｓＭタンパク質である。

配列番号４７６は、例示的なＲｔｃＢホモログである。

配列番号４７７は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＷＹＬである。

配列番号４７８は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．の分離株２７８９ＳＴＤＹ５８３４９７１＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＷＹＬである。

配列番号４７９は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｃｉｒｃｕｌａｎｓ＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＷＹＬである。

配列番号４８０は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．分離株２７８９ＳＴＤＹ５６０８８９２＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＷＹＬである。

配列番号４８１は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＡＧ：５７＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＷＹＬである。

配列番号４８２は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ－１＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＷＹＬである。

配列番号４８３は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ株ＫＨ２Ｔ６＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＷＹＬである。

配列番号４８４は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ株ＸＰＤ３００２＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＷＹＬである。

配列番号４８５は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ＋Ｃ末端ＮＬＳ由来の例示的なＲｔｃＢである。

本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列番号９２または配列番号２９８（ＣａｓＲｘとしても知られるＣａｓ１３ｄタンパク質）のアミノ酸配列を含んでも、それからなってもよい。

Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ３００２ Ｃａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘ）の例示的なダイレクトリピート配列は、核酸配列ＡＡＣＣＣＣＴＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＣ（配列番号４６１）を含む。

治療的置換遺伝子（処置されるべき対応する疾患／障害）
本明細書に開示の治療的置換遺伝子を含む組成物は、任意の効果的な機能獲得または喪失遺伝子置換療法を含む。例示的な治療的置換遺伝子（対応する疾患）としては、ロドプシン（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３－Ｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシング因子３（常染色体優性網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３１（常染色体優性網膜色素変性症）、ＧＲＮ（前頭側頭型認知症（ＦＴＤ））、ＳＯＤ１（ＡＬＳ）、ＰＭＰ２２（シャルコー・マリー・トゥース病）、ＰＡＢＰＮ１（眼咽頭型筋ジストロフィー）、ＫＣＮＱ４（難聴）、ＣＬＲＮ１（アッシャー症候群）、ＡＰＯＥ２（アルツハイマー病）、ＡＰＯＥ４（アルツハイマー病）、ＢＥＳＴ１（眼疾患）、ＭＹＢＰＣ３（家族性心筋症）、ＴＮＮＴ２（家族性心筋症）、及びＴＮＮＩ３（家族性心筋症）などの遺伝子（疾患／障害）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、治療的置換遺伝子は、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、標的部位に関連するコドンは、コドン最適化されていない。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ標的化タンパク質は、確実に変異型対立遺伝子を切断するが、導入遺伝子または治療的置換遺伝子を切断しない。

例示的な治療的置換遺伝子及び対応する配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：

ロドプシン（ヒトＲＨＯ）
例示的な治療用置換遺伝子は、ロドプシンのアミノ酸配列：
MNGTEGPNFYVPFSNATGVVRSPFEYPQYYLAEPWQFSMLAAYMFLLIVLGFPINFLTLYVTVQHKKLRTPLNYILLNLAVADLFMVLGGFTSTLYTSLHGYFVFGPTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVVCKPMSNFRFGENHAIMGVAFTWVMALACAAPPLAGWSRYIPEGLQCSCGIDYYTLKPEVNNESFVIYMFVVHFTIPMIIIFFCYGQLVFTVKEAAAQQQESATTQKAEKEVTRMVIIMVIAFLICWVPYASVAFYIFTHQGSNFGPIFMTIPAFFAKSAAIYNPVIYIMMNKQFRNCMLTTICCGKNPLGDDEASATVSKTETSQVAPA（配列番号３０２）
を含んでも、それからなってもよい。

スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）
例示的な治療用置換遺伝子は、スーパーオキシドジスムターゼ１のアミノ酸配列：
MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ（配列番号３０３）
を含んでも、それからなってもよい。

末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）
例示的な治療用置換遺伝子は、末梢ミエリンタンパク質２２のアミノ酸配列：
MLLLLLSIIVLHVAVLVLLFVSTIVSQWIVGNGHATDLWQNCSTSSSGNVHHCFSSSPNEWLQSVQATMILSIIFSILSLFLFFCQLFTLTKGGRFYITGIFQILAGLCVMSAAAIYTVRHPEWHLNSDYSYGFAYILAWVAFPLALLSGVIYVILRKRE（配列番号３０４）
を含んでも、それからなってもよい。

ポリ（Ａ）結合タンパク質核１（ＰＡＢＰＮ１）
例示的な治療用置換遺伝子は、ポリ（Ａ）結合タンパク質核１のアミノ酸配列：
MAAAAAAAAAAGAAGGRGSGPGRRRHLVPGAGGEAGEGAPGGAGDYGNGLESEELEPEELLLEPEPEPEPEEEPPRPRAPPGAPGPGPGSGAPGSQEEEEEPGLVEGDPGDGAIEDPELEAIKARVREMEEEAEKLKELQNEVEKQMNMSPPPGNAGPVIMSIEEKMEADARSIYVGNVDYGATAEELEAHFHGCGSVNRVTILCDKFSGHPKGFAYIEFSDKESVRTSLALDESLFRGRQIKVIPKRTNRPGISTTDRGFPRARYRARTTNYNSSRSRFYSGFNSRPRGRVYRGRARATSWYSPY
（配列番号３０５）を含んでも、それからなってもよい。

カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＱメンバー４（ＫＣＮＱ４）
例示的な治療用置換遺伝子は、カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＱメンバー４のアミノ酸配列：
MAEAPPRRLGLGPPPGDAPRAELVALTAVQSEQGEAGGGGSPRRLGLLGSPLPPGAPLPGPGSGSGSACGQRSSAAHKRYRRLQNWVYNVLERPRGWAFVYHVFIFLLVFSCLVLSVLSTIQEHQELANECLLILEFVMIVVFGLEYIVRVWSAGCCCRYRGWQGRFRFARKPFCVIDFIVFVASVAVIAAGTQGNIFATSALRSMRFLQILRMVRMDRRGGTWKLLGSVVYAHSKELITAWYIGFLVLIFASFLVYLAEKDANSDFSSYADSLWWGTITLTTIGYGDKTPHTWLGRVLAAGFALLGISFFALPAGILGSGFALKVQEQHRQKHFEKRRMPAANLIQAAWRLYSTDMSRAYLTATWYYYDSILPSFRELALLFEHVQRARNGGLRPLEVRRAPVPDGAPSRYPPVATCHRPGSTSFCPGESSRMGIKDRIRMGSSQRRTGPSKQHLAPPTMPTSPSSEQVGEATSPTKVQKSWSFNDRTRFRASLRLKPRTSAEDAPSEEVAEEKSYQCELTVDDIMPAVKTVIRSIRILKFLVAKRKFKETLRPYDVKDVIEQYSAGHLDMLGRIKSLQTRVDQIVGRGPGDRKAREKGDKGPSDAEVVDEISMMGRVVKVEKQVQSIEHKLDLLLGFYSRCLRSGTSASLGAVQVPLFDPDITSDYHSPVDHEDISVSAQTLSISRSVSTNMD（配列番号３０６）を含んでも、それからなってもよい。

クラリン１（ＣＬＲＮ１）
例示的な治療用置換遺伝子は、クラリン１のアミノ酸配列：
MPSQQKKIIFCMAGVFSFACALGVVTALGTPLWIKATVLCKTGALLVNASGQELDKFMGEMQYGLFHGEGVRQCGLGARPFRFSFFPDLLKAIPVSIHVNVILFSAILIVLTMVGTAFFMYNAFGKPFETLHGPLGLYLLSFISGSCGCLVMILFASEVKIHHLSEKIANYKEGTYVYKTQSEKYTTSFWVIFFCFFVHFLNGLLIRLAGFQFPFAKSKDAETTNVAADLM（配列番号３０７）
を含んでも、それからなってもよい。

アポリポタンパク質２（ＡＰＯＥ２）
例示的な治療用置換遺伝子は、アポリポタンパク質２のアミノ酸配列：
MKVLWAALLVTFLAGCQAKVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKCLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH（配列番号３０８）
を含んでも、それからなってもよい。

アポリポタンパク質４（ＡＰＯＥ４）
例示的な治療用置換遺伝子は、アポリポタンパク質４のアミノ酸配列：
MKVLWAALLVTFLAGCQAKVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH（配列番号３０９）
を含んでも、それからなってもよい。

ベストロフィン１（ＢＥＳＴ１）
例示的な治療用置換遺伝子は、ベストロフィン１のアミノ酸配列：
MTITYTSQVANARLGSFSRLLLCWRGSIYKLLYGEFLIFLLCYYIIRFIYRLALTEEQQLMFEKLTLYCDSYIQLIPISFVLGFYVTLVVTRWWNQYENLPWPDRLMSLVSGFVEGKDEQGRLLRRTLIRYANLGNVLILRSVSTAVYKRFPSAQHLVQAGFMTPAEHKQLEKLSLPHNMFWVPWVWFANLSMKAWLGGRIRDPILLQSLLNEMNTLRTQCGHLYAYDWISIPLVYTQVVTVAVYSFFLTCLVGRQFLNPAKAYPGHELDLVVPVFTFLQFFFYVGWLKVAEQLINPFGEDDDDFETNWIVDRNLQVSLLAVDEMHQDLPRMEPDMYWNKPEPQPPYTAASAQFRRASFMGSTFNISLNKEEMEFQPNQEDEEDAHAGIIGRFLGLQSHDHHPPRANSRTKLLWPKRESLLHEGLPKNHKAAKQNVRGQEDNKAWKLKAVDAFKSAPLYQRPGYYSAPQTPLSPTPMFFPLEPSAPSKLHSVTGIDTKDKSLKTVSSGAKKSFELLSESDGALMEHPEVSQVRRKTVEFNLTDMPEIPENHLKEPLEQSPTNIHTTLKDHMDPYWALENRDEAHS（配列番号３１０）
を含んでも、それからなってもよい。

心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）
例示的な治療用置換遺伝子は、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃのアミノ酸配列：
MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPIGLFVMRPQDGEVTVGGSITFSARVAGASLLKPPVVKWFKGKWVDLSSKVGQHLQLHDSYDRASKVYLFELHITDAQPAFTGSYRCEVSTKDKFDCSNFNLTVHEAMGTGDLDLLSAFRRTSLAGGGRRISDSHEDTGILDFSSLLKKRDSFRTPRDSKLEAPAEEDVWEILRQAPPSEYERIAFQYGVTDLRGMLKRLKGMRRDEKKSTAFQKKLEPAYQVSKGHKIRLTVELADHDAEVKWLKNGQEIQMSGSKYIFESIGAKRTLTISQCSLADDAAYQCVVGGEKCSTELFVKEPPVLITRPLEDQLVMVGQRVEFECEVSEEGAQVKWLKDGVELTREETFKYRFKKDGQRHHLIINEAMLEDAGHYALCTSGGQALAELIVQEKKLEVYQSIADLMVGAKDQAVFKCEVSDENVRGVWLKNGKELVPDSRIKVSHIGRVHKLTIDDVTPADEADYSFVPEGFACNLSAKLHFMEVKIDFVPRQEPPKIHLDCPGRIPDTIVVVAGNKLRLDVPISGDPAPTVIWQKAITQGNKAPARPAPDAPEDTGDSDEWVFDKKLLCETEGRVRVETTKDRSIFTVEGAEKEDEGVYTVTVKNPVGEDQVNLTVKVIDVPDAPAAPKISNVGEDSCTVQWEPPAYDGGQPILGYILERKKKKSYRWMRLNFDLIQELSHEARRMIEGVVYEMRVYAVNAIGMSRPSPASQPFMPIGPPSEPTHLAVEDVSDTTVSLKWRPPERVGAGGLDGYSVEYCPEGCSEWVAALQGLTEHTSILVKDLPTGARLLFRVRAHNMAGPGAPVTTTEPVTVQEILQRPRLQLPRHLRQTIQKKVGEPVNLLIPFQGKPRPQVTWTKEGQPLAGEEVSIRNSPTDTILFIRAARRVHSGTYQVTVRIENMEDKATLVLQVVDKPSPPQDLRVTDAWGLNVALEWKPPQDVGNTELWGYTVQKADKKTMEWFTVLEHYRRTHCVVPELIIGNGYYFRVFSQNMVGFSDRAATTKEPVFIPRPGITYEPPNYKALDFSEAPSFTQPLVNRSVIAGYTAMLCCAVRGSPKPKISWFKNGLDLGEDARFRMFSKQGVLTLEIRKPCPFDGGIYVCRATNLQGEARCECRLEVRVPQ
（配列番号３１１）
を含んでも、それからなってもよい。

心筋トロポニンＴ２（ＴＮＮＴ２）
例示的な治療用置換遺伝子は、心筋トロポニンＴ２のアミノ酸配列：
MSDEEVEQVEEQYEEEEEAQEEAAEVHEEVHEPEEVQEDTAEEDAEEEKPRPKLTAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDLMELQALIDSHFEARKKEEEELVALKERIEKRRAERAEQQRIRAEKERERQNRLAEEKARREEEDAKRRAEDDLKKKKALSSMGANYSSYLAKADQKRGKKQTAREMKKKILAERRKPLNIDHLGEDKLRDKAKELWETLHQLEIDKFEFGEKLKRQKYDITTLRSRIDQAQKHSKKAGTPAKGKVGGRWK（配列番号３１２）
を含んでも、それからなってもよい。

心筋トロポニンＴＩ３（ＴＮＮＩ３）
例示的な治療用置換遺伝子は、心筋トロポニンＴＩ３のアミノ酸配列：
MADGSSDAAREPRPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAKQELEREAEERRGEKGRALSTRCQPLELAGLGFAELQDLCRQLHARVDKVDEERYDIEAKVTKNITEIADLTQKIFDLRGKFKRPTLRRVRISADAMMQALLGARAKESLDLRAHLKQVKKEDTEKENREVGDWRKNIDALSGMEGRKKKFES（配列番号３１３）
を含んでも、それからなってもよい。

ｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシングファクター３１（ＰＲＰＦ３１）
例示的な治療用置換遺伝子は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシング因子３１（ＰＲＰＦ３１）（常染色体優性網膜色素変性症）のアミノ酸配列：
MSLADELLADLEEAAEEEEGGSYGEEEEEPAIEDVQEETQLDLSGDSVKTIAKLWDSKMFAEIMMKIEEYISKQAKASEVMGPVEAAPEYRVIVDANNLTVEIENELNIIHKFIRDKYSKRFPELESLVPNALDYIRTVKELGNSLDKCKNNENLQQILTNATIMVVSVTASTTQGQQLSEEELERLEEACDMALELNASKHRIYEYVESRMSFIAPNLSIIIGASTAAKIMGVAGGLTNLSKMPACNIMLLGAQRKTLSGFSSTSVLPHTGYIYHSDIVQSLPPDLRRKAARLVAAKCTLAARVDSFHESTEGKVGYELKDEIERKFDKWQEPPPVKQVKPLPAPLDGQRKKRGGRRYRKMKERLGLTEIRKQANRMSFGEIEEDAYQEDLGFSLGHLGKSGSGRVRQTQVNEATKARISKTLQRTLQKQSVVYGGKSTIRDRSSGTASSVAFTPLQGLEIVNPQAAEKKVAEANQKYFSSMAEFLKVKGEKSGLMST（配列番号４８７）
を含んでも、それからなってもよい。

プログラニュリン（ＧＲＮ）（ＦＴＤ）
例示的な治療用置換遺伝子は、プログラニュリン（ＧＲＮ）（前頭側頭型認知症（ＦＴＤ））のアミノ酸配列：
MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL
（配列番号４８８）
を含んでも、それからなってもよい。

ｇＲＮＡ標的配列
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、病原性配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合タンパク質のガイドＲＮＡのスペーサー配列に対応する配列モチーフを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のスペーサー配列が、１つ以上の標的配列を標的とするために使用される。いくつかの実施形態では、複数のスペーサーが、複数の標的ＲＮＡを標的とするために使用される。そのような標的ＲＮＡは、同じＲＮＡ分子内の異なる標的部位であり得るか、または異なるＲＮＡ分子内の異なる標的部位であり得る。スペーサー配列は、非コードＲＮＡも標的とし得る。いくつかの実施形態では、複数のプロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）を、複数の標的ＲＮＡを標的とするためのｇＲＮＡ内の複数のスペーサーを引き起こすために使用することができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ（複数可）または標的配列モチーフ（複数可）が、本明細書に開示のＲＮＡ標的化組成物により標的化及びノックダウンされる場合、病原性または疾患を引き起こす機能獲得または喪失変異が破壊される。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの配列モチーフは、疾患または障害の特徴である。

本開示の配列モチーフは、ゲノム配列に見出される外来の配列または外因性配列から単離または誘導され、それにより、本開示のｍＲＮＡ分子または本開示のＲＮＡ配列に見出される外来の配列もしくは外因性配列に翻訳されてもよい。

本開示の標的配列モチーフは、疾患もしくは障害を引き起こす内因性配列における変異を含んでも、それからなっても、それと会合してもよい。変異は、配列置換、逆位、欠失、挿入、転位、またはそれらの任意の組み合わせを含んでも、それからなってもよい。

本開示の標的配列モチーフは、リピート配列を含んでも、それからなってもよい。いくつかの実施形態では、リピート配列は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）と関連し得る。１つ以上の遺伝子座でのＭＳＩは、本開示の細胞の障害されたＤＮＡミスマッチ修復機序からもたらされる。ＤＮＡの超可変配列は、超可変配列を含むか、またはそれからなる標的配列を含む本開示のｍＲＮＡに転写され得る。

本開示の標的配列モチーフは、バイオマーカーを含んでも、それからなってもよい。バイオマーカーは、疾患または障害を発症するリスクを示し得る。バイオマーカーは、健常な遺伝子を示し得る（疾患または障害を発症するリスクが低いか、またはまったくない）。バイオマーカーは、編集された遺伝子を示し得る。例示的なバイオマーカーとしては、一塩基多型（ＳＮＰ）、配列変形、または変異、エピジェネティックマーク、スプライスアクセプター部位、外因性配列、異種配列、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の標的配列モチーフは、２次、３次、または４次構造を含んでも、それからなってもよい。２次、３次、または４次構造は、内因性のものであっても、天然に存在するものであってもよい。２次、３次、または４次構造は、誘導性のものであっても、天然に存在しないものであってもよい。２次、３次、または４次構造は、内因性、外因性、または異種配列にコードされてもよい。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、エンドポイントを含む、２～１００ヌクレオチドまたは核酸塩基を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、２～５０ヌクレオチドまたは核酸塩基（端点を含む）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、２～２０ヌクレオチドまたは核酸塩基（端点を含む）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、２０～３０ヌクレオチドまたは核酸塩基（端点を含む）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、約２６ヌクレオチドまたは核酸塩基（端点を含む）を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、連続的である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、不連続である。例えば、ＲＮＡ分子の標的配列は、１つ以上の断続的なヌクレオチドが、標的配列のヌクレオチドの間に配置されるので、連続していない１つ以上のヌクレオチドまたは核酸塩基を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列が天然に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、天然に存在しないものである。例示的な天然に存在しない標的配列は、配列変形もしくは変異、キメラ配列、外因性配列、異種配列、キメラ配列、組み換え配列、改変もしくは合成ヌクレオチドを含む配列、またはそれらの任意の組み合わせを含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示のガイドＲＮＡに結合する。本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の１つ以上の標的配列は、本開示の１つ以上のガイドＲＮＡスペーサー配列に結合する。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示の第１のＲＮＡ結合タンパク質に結合する。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示の第２のＲＮＡ結合タンパク質に結合する。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるロドプシンタンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
TGGGGTTTTT CCCATTCCCA GGACTGCCTC CTCCACCTCT AGCCCCAGGG GACTCTGTGC 60
TGCTTGGCTC TGCTCATTGC TCAATCCAGC CATCCCAGGG TCAGGGATCA GGTGGAAGCT 120
GGCAGTTTCA ATCTATCCTG TGGATAGAGT GTGAAAGCAA CAAAACCCAC CACCGTTAAT 180
ACCAACATAG GAGCTGAGCT TTTAATGGCC CAATTTGCCT TAGTCTCCAG GCAGAGCTGG 240
GTAAAGCTAG AGCTTCTGGC TTTGCTTATA TGGAGAAGGG GGAGCAGTTA CTGAGGCAGC 300
TTAATTCTGA CACCTCAGAG ATGTGGCCAG CTTTTTGGAG CAGATTCTCC AGAATGGAGA 360
ATGGACTAGC AACTGCTGAA GATGGGCTTG TCTGGCAAGG GAAACTGGAA ACTGGGGCCC 420
ATGAACATCC CCAAGGAAGG TAGGCCCAGT GGAATTTCCC ACTCTTTGTT TCTAAGCTCT 480
TCGAGATAAG GATGACATCA GGGACTCAGC TGTTAATTAA ATGTGGGCGG GTGAGCATGG 540
CTTCTAGAGG CTCCATGCTC TAGATGCTGG GACCCAGGTG CTAGAGCAAA AGAGCAGGTG 600
GCTTCCAGAG GCTGAGAGAA AGGCCTGTCT CTCCATAGGC CACATTGGGA AGGGGAGGCA 660
CGGGACCTGG GGCCCCACAC TAGGGGTGAG ACCCCAGGCC CAATCTCACC CTCATTGGGA 720
ACTTGGCCTT CACCGTCCCC CTCCCCCAGT GTTGTTTTTT CAGGTCTGAT GACTGCATTC 780
TGCATTCCTG TGACTGTCCC TGCCTACAGC CCAACCCCCA GCCCTGGTCT GGCCTTGATG 840
CCTAGCTAAT TTTTAAAAAC CTGCCCCAAG GTTGGGTGAA ACCCCATCAT CTGAATGCCC 900
AATCTCAAAA TGTTCACTAT CAGGAGGTGA TAATCATAGT AATTAACTAG TTACATTAAT 960
TGATGTTATT CACAACATTA ACTAGAATCT GTACAGCTTC TTGCTATTTA CAAAGTGCTG 1020
AAACACACAC ATAGACACAC ACACACCTCT TTTGGTCTTC TCAGTAGCTG CGTGTCGGCA 1080
GGACCAGGGA TCTGGGATTT CCATTTTATA GGAGAAGAAA GTGAGGCCCA GGGAGGGAAA 1140
AACAACTGCT CCATATCATT AGCCAAGTAT GAGTTGCTGC TGCTGCGAGG GTCTGAGAGG 1200
ATAGATATGT TCTCCCTTCC CATTCATTCC TCCATTCCTT CCTGCATCCA TCCAGCATTT 1260
ATTAAGCACC TACTGTGTGC CCCATTCTGT GCTAGACACT TATCCCTAAG CTGGGACACT 1320
TTTCCAGAAA GCAAGAATCC TCGTGTTCCT GAAAGATGAG TTGGGAGGAG GAGGGGCACA 1380
CATCCCGCTG GCCTTGGGGA ACGTGGGACT CCAGATCAGT AGGTCTTGGT GGATGTCCCT 1440
TCTCAGGCTG TCCCAGGTGA GTGAGGAGCC TCATTAATTA TTTCTTAAAA AAAAAAAAAA 1500
AATTAAGGAG CCTATGTGAC TTCGTTCATT CTGCACAGGC GCTGCTCCTG GTGGGATGGC 1560
TGTGGCTGGG GGAAGGTGTA GGGGATGGGA GACGCCTATA GTCGGCCACA GAGTCCTAGG 1620
CAGGTCTTAG GCCGGGGCCA CCTGGCTCGT CTCCGTCTTG GACACGGTAG CAGAGGCCTC 1680
ATCGTCACCC AGTGGGTTCT TGCCGCAGCA GATGGTGGTG AGCATGCAGT TCCGGAACTG 1740
CTTGTTCATC ATGATATAGA TGACAGGGTT GTAGATGGCG GCGCTCTTGG CAAAGAACGC 1800
TGGGATGGTC ATGAAGATGG GACCGAAGTT GGAGCCCTGG TGGGTGAAGA TGTAGAATGC 1860
CACGCTGGCG TAGGGCACCC AGCAGATCAG GAAAGCGATG ACCATGATGA TGACCATGCG 1920
GGTGACCTCC TTCTCTGCCT TCTGTGTGGT GGCTGACTCC TGCTGCTGGG CAGCGGCCTC 1980
CTTGACGGTG AAGACGAGCT GCCCATAGCA GAAAAAGATG ATAATCATGG GGATGGTGAA 2040
GTGGACCACG AACATGTAGA TGACAAAAGA CTCGTTGTTG ACCTCCGGCT TGAGCGTGTA 2100
GTAGTCGATT CCACACGAGC ACTGCAGGCC CTCGGGGATG TACCTGGACC AGCCGGCGAG 2160
TGGGGGTGCG GCGCAGGCCA GCGCCATGAC CCAGGTGAAG GCAACGCCCA TGATGGCATG 2220
GTTCTCCCCG AAGCGGAAGT TGCTCATGGG CTTACACACC ACCACGTACC GCTCGATGGC 2280
CAGGACCACC AAGGACCACA GGGCAATTTC ACCGCCCAGG GTGGCAAAGA AGCCCTCCAA 2340
ATTGCATCCT GTGGGCCCGA AGACGAAGTA TCCATGCAGA GAGGTGTAGA GGGTGCTGGT 2400
GAAGCCACCT AGGACCATGA AGAGGTCAGC CACGGCTAGG TTGAGCAGGA TGTAGTTGAG 2460
AGGCGTGCGC AGCTTCTTGT GCTGGACGGT GACGTAGAGC GTGAGGAAGT TGATGGGGAA 2520
GCCCAGCACG ATCAGCAGAA ACATGTAGGC GGCCAGCATG GAGAACTGCC ATGGCTCAGC 2580
CAGGTAGTAC TGTGGGTACT CGAAGGGGCT GCGTACCACA CCCGTCGCAT TGGAGAAGGG 2640
CACGTAGAAG TTAGGGCCTT CTGTGCCATT CATGGCTGTG GCCCTTGTGG CTGACCCGTG 2700
GCTGCTCCCA CCCAAGAATG CTGCGAAGGC CTGAGCTCAG CCACTCAGGG CTCCAGCTGG 2760
ATGACTCT 2768（配列番号３１４）。

本開示のロドプシンタンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号６１９～配列番号３３６１のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

いくつかの実施形態では、例示的なｇＲＮＡスペーサー配列及び対応するＲｈｏ標的配列は、表１に詳述される配列を含むか、またはそれらからなる。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＳＯＤ１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
tttttttttt ttttttttag tttgaatttg gattctttta atagcctcat aataagtgcc 60
atacagggtt tttattcaca ggcttgaatg acaaagaaat tctgacaagt ttaataccca 120
tctgtgattt aagtctggca aaatacaggt cattgaaaca gacattttaa ctgagtttta 180
taaaactata caaatcttcc aagtgatcat aaatcagttt ctcactacag gtactttaaa 240
gcaactctga aaaagtcaca caattacact tttaagatta cagtgtttaa tgtttatcag 300
gatacatttc tacagctagc aggataacag atgagttaag gggcctcaga ctacatccaa 360
gggaatgttt attgggcgat cccaattaca ccacaagcca aacgacttcc agcgtttcct 420
gtctttgtac tttcttcatt tccacctttg cccaagtcat ctgctttttc atggaccacc 480
agtgtgcggc caatgatgca atggtctcct gagagtgaga tcacagaatc ttcaatagac 540
acatcggcca caccatcttt gtcagcagtc acattgccca agtctccaac atgcctctct 600
tcatcctttg gcccaccgtg ttttctggat agaggattaa agtgaggacc tgcactggta 660
cagcctgctg tattatctcc aaactcatga acatggaatc catgcaggcc ttcagtcagt 720
cctttaatgc ttccccacac cttcactggt ccattacttt ccttctgctc gaaattgatg 780
atgccctgca ctgggccgtc gcccttcagc acgcacacgg ccttcgtcgc cataactcgc 840
taggccacgc cgaggtcctg gttccgagga ctgcaacgga aaccccagac gctgcaggag 900
actacgacgc aaaccagcac cccgtctccg cgactacttt ataggccaga cctccgcgcc 960
tcgcccactc tggccccaaa c 981
（配列番号３１５）。

本開示のＳＯＤ１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号３３６２～配列番号４３１７のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＰＭＰ２２タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
TGAGTTACTC TGATGTTTAT TTTAATGCAT CTTAGTCCAC ACAGTTGGTA TAAAATCAGA 60
AAATGCAAAG CAAAAACAAA AGGTCTGGAG TCTTAGCATC AGAAGGGCAC CATATATACA 120
TCTACAGTTG GTGGCCAATA CAAGTCATTG CCAGACAGTC CTTGGAGGCA CAGAACAGCC 180
TAGACCCAGC CAAGCTCTAG GAACTCACGG TCCCAAGGAG TCTAGACGCT TGTTCTGATG 240
CTCCGACCGT AAGAAAAATG TGGGAGTGAT GAAGGCTTTA TGATTTACTC ATTATAGTAA 300
TAATAGCAGC CTAGCTAGGT ACAAAAGCAG TTATAAACCA TTTATATTAC ACAGAATTAT 360
TCAGGTCTCC ATTCTATCTT ATGTTGTAAA ATTGTTAATT GGATTTCCAG TGAGTTGTTT 420
AGATGATTAG TGATAATAAG GAATGGTAAA TCCATAGCAC CATTTCAAAG ACTTGTTGTC 480
ACTGATTTCT CATTTAGATG TGTGACGAAG ATACTCCACC TGTAAGGGCA AGTATGCCAA 540
TGCCACAAGC CGTGTTTTTG CAAGGGCTCC AGTTTGGGCA TTTTGTCCGT GTGCGCGTAA 600
AGCTTCACAC AGAGGTTCGG GCAGCGGCTG TTTCTGTTGG ATGCACTGGG TCACCCACCA 660
GAAAAGGGCT TTTGGACATT TGGGGTTTCT ACCCACACTT TGGTTTTCTA AATGAGGTGG 720
ACTGGGAGGG AGGTATCTTC TTTCAGATGA AAGGGAAGGG GCGAGATGGA GTTATCTTAT 780
TTCTGGGTAA AACAAAACAA ACAAACAAAA AACAAAACAA AAATACTGAG CTGGATTATA 840
CTGTTAGGAT GTAAAGTTCC TTAGCTACTT CTTTAAGGCT CAACACGAGG CTGATGGTCA 900
ACATAAAAAG CAAACAATAC TATGTACATA TATGTAAAAA GTGTTATAAA TAGGTTTTAT 960
AAACCGGAGA TATTATATAC ATCTTCAATC AACAGCAACC CCCACCTCCA CTGCTTTCTG 1020
TTTGGTTTGG TTTGAGTTTG GGATTTTGGG CTAGCTCTTT TTTCTTTGTC TGCTTTCTGT 1080
TTTCCCTTCC TCCCTTCCCT ATGTACGCTC AGAGCCTCAG ACAGACCGTC TGGGCGCCTC 1140
ATTCGCGTTT CCGCAAGATC ACATAGATGA CACCGCTGAG AAGGGCCAGG GGGAAGGCCA 1200
CCCAGGCCAG GATGTAGGCG AAACCGTAGG AGTAATCCGA GTTGAGATGC CACTCCGGGT 1260
GCCTCACCGT GTAGATGGCC GCAGCACTCA TCACGCACAG ACCAGCAAGA ATTTGGAAGA 1320
TTCCAGTGAT GTAAAACCTG CCCCCCTTGG TGAGGGTGAA GAGTTGGCAG AAGAACAGGA 1380
ACAGAGACAG AATGCTGAAG ATGATCGACA GGATCATGGT GGCCTGGACA GACTGCAGCC 1440
ATTCGTTTGG TGATGATGAG AAACAGTGGT GGACATTTCC TGAGGAAGAG GTGCTACAGT 1500
TCTGCCAGAG ATCAGTTGCG TGTCCATTGC CCACGATCCA TTGGCTGACG ATCGTGGAGA 1560
CGAACAGCAG CACCAGCACC GCGACGTGGA GGACGATGAT ACTCAGCAAC AGGAGGAGCA 1620
TTCTGGCGGC AAGTTCTGCT CAGCGGAGTT TCTGCCCGGC CAAACAGCGT AACCCCTTCT 1680
TCCAAGCAGA TTTCTTTGCA GCCAAATGCA AGGGATGTTA AGGCAAGACC CTCCCCACAG 1740
GGCAGTCAGA GACCCGCAGC CGACAGACTA AGCCTGCAGC TTCCAACCAG GCTCCCCGAG 1800
ATGTTCCCTG GTGGTGCTCC CTGTAACT 1828（配列番号３１６）。

本開示のＰＭＰ２２タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号４３１８～配列番号６１２０のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
TTTTTTTTTT TTTTTTTTAC ACCCAAAAGG CCAAACAATT TTTATTTTCA AAAACAACTT 60
TATTCATGAC ACATATTAAA AAAAAATTCC CACCCCTGGA AATGAGCTAA AAAAATAAAC 120
AAAATCCACC TCCCACCTCC CTGTTCCCAC TTCCTCCCAT TCCCTCCAAA TAAAAGGGAA 180
AAAAGGCAAA GGAAAAAAAA AAAAAACAAA AAAACAAAAC AACTGAAAAA CAAAAACACC 240
CCTAAACCCC CCAAAACAAG GTAGTGCATT TCCCCAGGGG GAAGGGGAAT TTACACTGGA 300
GCCGCTGGGA GCGGAACGGA GATCTTCCGG CTACAGAAAC CTGCAAAGAA AGACACTCAA 360
AACAGAAAAA GAAACACAAA AGGAAACAAA ATAGATCACC AGGCAATCTG GAGGGGCAGG 420
GAGCCGGAGA AGAGGGGTGG GGTGGGTGGT AGACCTGGCT GGACAGGAGC AGGCAGGAGG 480
GGACTGTGAA AGGCGAGGAG AAGACGGAGG GAAGGTAACA AGCAGAACAG TTTGGTGTCC 540
TTCCAGAGCC CTGGGTAAAA AAAAAAACCT CCTACCACCC ACGCCCACCT ACCCTTGAGC 600
AGCCCCCAAG GGGGTGAAGT GGGGCAGGGA AACATGGGCA GCAGCTTGCG CAGTTGAGAC 660
GTGTCCATGG CGAATCCCCA GAGTGAATAA GCAGCCCCCT GCCCCACTCC CTGGGCCTTC 720
CCCTACTCCC CAAAGCAGGT CCCTCCTCAG CAGTTAGTTA TGGGATTCTC CCCCCTTCCA 780
CAGTATATCT TTTTTTTAAA AAATATTTTT TTTCCATCAA GGTCATCTTC TGTTTTTCTT 840
TTTTTTTTTT TTAATTCTTT TTTTTTTCCT TCTTTCCTCT TTTTTTCCTC TCTCTCCTCC 900
TAATACACAC TTTTTTTAGT AAGGGGAATA CCATGATGTC GCTCTAGCCC GGCCCCTGTA 960
GACGCGACCC CGGGGCCTGC TGTTAAAACC ACTGTAGAAT CGAGAGCGGG AGCTGTTGTA 1020
GTTGGTGGTC CGGGCGCGGT AGCGGGCTCG TGGAAAACCC CGGTCTGTTG TGCTGATGCC 1080
TGGTCTGTTG GTTCGTTTTG GGATCACCTT GATTTGCCTT CCTCTAAATA GGGACTCATC 1140
TAAGGCCAAG GAAGTCCTCA CTGACTCTTT GTCTGAGAAC TCTATATACG CAAACCCTTT 1200
GGGATGGCCA CTAAATTTGT CACACAGTAT GGTAACACGG TTGACTGAAC CACAGCCATG 1260
AAAGTGAGCT TCCAGCTCTT CTGCTGTTGC ACCATAGTCC ACATTGCCAA CATAGATGGA 1320
ACGGGCATCA GCCTCCATCT TCTCCTCAAT GGACATGATC ACCGGGCCAG CATTGCCTGG 1380
AGGTGGACTC ATATTCATCT GCTTCTCTAC CTCGTTCTGT AGCTCCTTTA GCTTCTCAGC 1440
TTCTTCCTCC ATCTCCCTGA CTCGAGCTTT GATAGCTTCC AGCTCCGGGT CCTCAATGGC 1500
GCCGTCCCCC GGGTCACCCT CGACCAGTCC CGGCTCCTCC TCCTCCTCTT GGCTGCCGGG 1560
GGCTCCCGAA CCAGGCCCAG GGCCCGGAGC TCCCGGGGGG GCGCGGGGCC GGGGCGGCTC 1620
CTCTTCGGGC TCGGGCTCCG GCTCGGGCTC CAGCAGCAGC TCCTCAGGCT CCAGTTCCTC 1680
AGACTCCAGG CCGTTCCCGT AGTCCCCTGC GCCCCCCGGG GCCCCCTCCC CGGCCTCCCC 1740
ACCGGCCCCG GGCACAAGAT GGCGCCGCCG CCCCGGCCCG GAGCCCCGAC CGCCCGCAGC 1800
CCCCGCTGCT GCTGCCGCCG CCGCCGCCGC CGCCATCGCC GCTCAGACTG GGGCCCGCCG 1860
CCCGGCGATT GGAGAGCTGC GCCGGCCACG CCGAGGACTC ATTAGTCAAG CTGCCTGCCC 1920
GTCACCATGA GCTAGTACTC CATTGGGGAA TATTACTTGG CAATCAAATA AGGCCCCACC 1980
TCTAAGGCGG GGCACTGCGC CAAATTCTCA AATCCCGGTA GGGGAAATCT GCCTGTCAAT 2040
CAACACGCGT CCCACCTCCT ATCGAGTCCT TAGGTAATAA TACCGCCACG CTGTGACGAT 2100
ATTCCTGCTT CTCCCCGGCC TACGGGCGGG CCCGCGAAGT ATGGGACGCT CCGTGATTGG 2160
CCCTAGCTAG GCGACTGGAA AGGACCAATC TTCCGATCGC CTCACCGCAG TGGCCCAGTC 2220
TCAGATGCCG ATTGGCTTGC GAGAGTCGAA GGGGTGACAC TCGTTTCGTG ACAGGTGAAC 2280
CTTGCCCCCG AAAGGACTGC CGGGCTTCAA ACTTGGGAAA CCCGAGGTCA CATGACTAGC 2340
CAGTCCTAGG GGGCCGCCAT CTTGATACTA CTGCTTGCCA GCTAGTGAGC TGTTGGCCGG 2400
GTGAGGCCCA AAACAGAGCA GCAGTTTCAG GAAACTTGTA TCTCGACCAG GAAGCACCAG 2460
TAGATGGGAT GTTGCTGAAA ATGGAGGTTG TGAATGAAGC ATTCCAGGAG GGAGCTTACT 2520
TTCCCCATCC AGGTTATTGG CACCATCATC CACTAGCTCT CCCGCACCAG AAAGCAGGGA 2580
GGATTCCTCA GTCCAGAGCT ACTAGTCACA AGTCCTGTCT GTCCCGCCCT CTTGCGTAGG 2640
CCTTCTGCTC CCCAGTTCCA TTTTCTTTTT CCTGGACAGC TTCCAATGTC ACCCCTCCAA 2700
TCTGCACCGC TAACAGACTG GCCCCCCTTT GCTGGCGAGG TAAAGTCTCA AAACCGTAAA 2760
TCACGGCCTT CGATACGCCA GCATGTGGTT ACTTTGTGGA TGTTGTTTCC TTCCACTCTT 2820
CTCGTTCCTT TGGGTGTACC TGCACCCAGT CTGTGCCTCT AACATGTAGT CCCCCTTCAA 2880
TCAAACCACT GCAAACCCCA GCTTCCCCTC ATTTCCCAGG ACAAGTGGGC CTATCTCCAC 2940
GGCGCGCTTA ATTGTTTTAC TGTTTCCTAA CTAGGTTGTG AGCGCCTGCA GATGAGGGGC 3000
CGGTTCCTAT TTATATTCGC ATCTCCACGG CCTGGCAATA TGCCTACCAC ATAATGTCCT 3060
GTTAGATGTT TGTTGATTGA ACAGGCATTG ATTGGGGATT TGGGTGCCAC CCTTCATT 3118（配列番号３１７）。

本開示のＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号６１２１～配列番号９２１３のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＫＣＮＱ４タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
tcctcttgaa aactttaatg aaaccaataa gttaataagt taacaaagtg aggtacttgc 60
atatccgaga accgagttga tggcggaacc tcgatcgtgg aaggaaggag ggcttcttcc 120
catgtctcct tggtcatagg gtaatcccat tctcctggcc ctctccacag ctgtctctga 180
gtgggtggag gggtggctct ctggggacag tgcagtgcag gtggggtgag ccaggagtgg 240
ctccatccag ggcatgacgg tcacatgcag agggcatgtt ggggcagagg ctgggcacca 300
tggactgagt aagatccagt ccaagccctg gtgctggcgc atgcaggtcc ccagcacgag 360
atgcaggcag cgtggcctcg gccccttgtt cccacagagg gttgccattg gtccactacc 420
cctcaccttc ctgccacctg cattggcttt gcagaagagg agcaaagggg tggggataag 480
aaagtgttcc tggagtgaat gggggctgac gcctggatgt ggcgctgcca attgaagtga 540
agaagtgggg tgtggaggga ggggagacag tgcatgtgaa agccggatgc gcggttggta 600
tagctattac atgcattctt attctctctg ggagttagag tgactaggaa ggcacaggcc 660
tggctagaag tgggcctggg gtctctccag tggtgtcagg cctgggcccg agttgtgctg 720
tggagacacg gaggcgggcc cttggggaca ggcagaggca gtgggttagg gctcctggac 780
cagagaggag gagatcttct tgaagaaggg gagcgggtaa aggtctgggt ggggcctgga 840
gagctctcgg gttacttcaa agctccttct cctgctcaga tggagttggg ggtcttcctc 900
ttagtggtcg tcaccctgca aggccagtcc actggcatct gctgcagagg cccaggagcg 960
gctgagtggc tctgcactca tgtctccaag tgtgtcacgt cattgcatgt ttaagtgtga 1020
gaggctttct tcctgtctgg agaaactaaa aggctatgtt tgtgcgatcg tccacgaagc 1080
actgtctggg agttttgggg aggatacaga aacctgtgct gactatgagt ggtgtctgga 1140
gggccaagga ggggagtggc cacccagcag gaggagggag cccctgggag ctgacacttg 1200
caaatgggaa gaaaggccca ggcattgccc ttaggagagg gcaggggaga aacaggcccc 1260
atgctgggag gggaaggagt gataagccaa agaataggga cagggtggtg gccaagcagc 1320
ctgagaccag ctactgctgg gggcccagct cccaatgggg gagggacaga gagaccccat 1380
gggggtcccc aaagttgcat atttaacatg gtttgcatat atggtgtcca cctgccttgt 1440
ggcagggtcc tgtgctttgt gggtacctgt gggggcacct tggcccaccc ccaagtgggg 1500
cggggacttg gcgggagggc ttccctgctg tgtccgaagg gtgggccaga gacctcacct 1560
tgcatagctg gaagctgggt cagggcccag ggccccagcg cccgctccca ctcccggggc 1620
tgtgcccctg ccaggtgggc cacatagggc cttgatggag tgggcagggc actggggggc 1680
ccagaggccg cgggacggcc gctgctgctg ccctctgtgc gacctggcat ctcacgctcc 1740
tgaggtgggg aaggggcgct ggcacccaca gcaggtacca cgcccactca ggcagctcaa 1800
tactgcgtgt ggtctctctc cccgtgaggg agtgagttca agtacgagag gagtccggag 1860
gcctcagagg gcagtcggag cgccaggccg cggggctggc cgtgtgctgc cctgcctctg 1920
agaagtccct cagtccatgt tggtgctgac cgagcgggag atgctgagcg tctgtgcgga 1980
gacggagatg tcctcgtggt ccacagggct gtggtagtcg gaggtgatgt cggggtcgaa 2040
cagcggcact tgcacggcgc ccaggctggc cgaggtgcca gagcgcaggc agcgcgaata 2100
gaagcccaac agcaggtcca gcttgtgctc gatggactgc acctgcttct ccaccttgac 2160
cacgcgtccc atcatgctga tttcatccac cacctccgcg tcggagggcc ccttgtcgcc 2220
cttctcccgg gccttcctgt ccccgggccc ccgacccaca atttggtcca cccgagtttg 2280
caggctcttg atccggccca gcatgtccag gtggcctgct gagtactgct caatgacgtc 2340
cttcacgtcg tacggtcgca gtgtctcctt gaatttcctt ttggccacca ggaacttgag 2400
aatcctgatg gagcggatga ctgtcttcac agcaggcatg atgtcgtcca ccgtgagctc 2460
acactggtag ctcttctcct ctgctacttc ctctgagggg gcatcctcag cagaggtgcg 2520
gggtttgagt ctcagagatg cccggaagcg ggtgcggtca ttgaagctcc agctcttttg 2580
caccttggtg gggctggtgg cctcacccac ctgctcgctg cttggggagg tgggcattgt 2640
tggaggtgcc agatgctgct tggaaggacc cgtccgccgc tgggagctgc ccatgcggat 2700
gcggtctttg atgcccatcc ggctgctttc cccagggcag aaggaggtgc tgcccggccg 2760
gtggcaggtg gcaacgggcg ggtaacggga gggtgctccg tcgggtaccg gcgcccgccg 2820
cacctccagg ggccgtaggc ccccattgcg ggcccgttgc acgtgctcaa acaagagggc 2880
cagctctctg aaggatggga ggatactgtc atagtagtac caggtggctg tcaggtaggc 2940
ccggctcata tcggtggagt acaggcgcca ggcagcctgg atgaggttgg ctgccggcat 3000
cctccgcttc tcgaagtgct tctgccggtg ctgctcctgg accttcaggg caaagccgga 3060
gcctaggatg ccggcaggca gggcaaagaa agagatgccc agtaaggcga agccagcagc 3120
caggaccctg cccagccatg tgtgcggtgt cttgtcacca tagccgatgg ttgtcaatgt 3180
aatcgtcccc caccagagcg agtcggcgta ggaggagaag tcggagttgg cgtccttctc 3240
agccaggtag accaggaagg aggcgaagat gagcaccagg aacccgatgt accaggcggt 3300
gatcagctcc ttgctatgcg cgtagaccac tgagcccagc agcttccagg tgccgccgcg 3360
gcggtccatg cgcaccatgc gcaggatctg caggaagcgc atgctgcgca gcgcggacgt 3420
ggcgaagatg ttgccctggg tacccgcggc gatgacggcc accgaggcca cgaacacgat 3480
gaagtcgatg acacagaagg gctttctggc aaagcggaag cgaccctgcc atcctcggta 3540
gcggcagcag catccggcgg accagacccg gacgatgtac tccaagccga aaaccacgat 3600
catcacgaat tccaagatga ggagacactc gttggcaagt tcctggtgct cctggatagt 3660
ggacagcaca gacagcacca ggcagctgaa gaccagcaaa aatatgaaga cgtggtagac 3720
gaaggcccag ccgcggggcc gctccagcac gttgtagacc cagttctgca ggcggcggta 3780
gcgcttgtgc gcggccgagg agcgctggcc gcaggcggag cccgagccgg agcccggccc 3840
agggaggggc gcgcccggcg gcagggggct gcccaggagg ccgaggcggc gcggggagcc 3900
gcccccgccc gcctcgccct gttcgctctg cacggccgtg agcgccacta gctccgcgcg 3960
gggggcgtcc ccgggcgggg gacccaggcc gaggcggcgc gggggggcct cggccatggg 4020
cggcgccggg ctgggggcgc cggggcccgg gcacggtccg gggcgggggc gcgctcgggg 4080
cgctcagaga cgcatggctc ggacccgggg ccagaggggc gacccggggc gggcgcgggc 4140
ggcgggggct aggggccggg ccggggccgc gggcgggcgc tcggagcctg ggggccgccg 4200
gagcccgcac tgacctcccg cttccccggc gactggggct gctctttccg actccaactc 4260
tcttattacg cgctccatgc cgctcgcctt tccacctgcc accggcgcgc gccgctcaca 4320
tgtc 4324 4324（配列番号３１８）。

本開示のＫＣＮＱ４タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号９２１４～配列番号１３５１２のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＣＬＲＮ１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
agcatctgga aactcggtgt gttctgatgt ctgctggcga atagcgaatt gacaccagag 60
caagttattt ctcaggtata cggttgtttc atccttgtaa atagttccaa agggaaacag 120
tgttttattt taaggagtac tttcaaacct attatatgag ggctgctgag tactcagcac 180
ctgtggtcag aggcctagtg atctgtttgc tgtcattctc tgctttttcc ttggtgcttt 240
ctggaggaca gcaggttgag gatgaaggaa gggtcagttc caggctcagc tgtggccttt 300
agtcagctgc agatcaattt gatgggtaat tcaggggaaa aaaaaagttg acctgggtca 360
tgcttggtga cagccagaac aagaccaaga tgatacagtg ataccgtcat aatcccagat 420
ttaatataat tttcataatt gcatattagt actcgagaca ctatagctag aaaaacagcc 480
cctaataagt cattttgcat caaatgtact aagcagagat catttttcat gattcctcag 540
tggtcctaac aattatgttc attgaaagta ctgtcgtgaa tgtaattggg actcaggcac 600
gggaggaaaa ataccctaag cttggttttt tcttcttttc ttcttttaga gtttgcagat 660
tttgaccaac agacatggtt aataagacta tgctttttta aagcctatat tttatattta 720
ttttattttt taattttgtt agtgacaggg tctcacttta ttgcccaggc tgtaactcga 780
actcctgaac tcaaatgatc ttcccacctt ggcctcctga agtgctggaa ttacaggtgt 840
gagtcaccac gcctggccta agagtatact ttaaacaaat tttttaaaat gtgtgttgat 900
acattttata gatgttcatt taatacacta ctgttttagg aaagcgattg cagctcagtt 960
ttctgaaatc tggcaacaaa tgtgtggata tattagagat attatttgtt tttattaaaa 1020
tatattccat gtgcctttga tatctttttg ataggaagac atcttacaca cacacacaca 1080
cacacacaca cacatatata tatatggagt aacaatttgt cgattctagt caactgcctt 1140
tgactacctg ggtcaagcaa tttcccacca gataaaacaa cttttcaaag ccttccttct 1200
gcttccctta ctttccagcc tgtatcctta gtacgtaatt tgtaaacatt gtcacgaagg 1260
gtcctgatgc tttaatatat gcagactaaa aggatatgca aaattaacca catctaaaag 1320
tgaccaaagc aagtctactc ccttgtaaaa ttatagaaag gtttgccttt cagtacatta 1380
gatctgcagc tacattagtt gtttctgcgt ctttagattt tgcaaaaggg aactgaaatc 1440
cagcaagtcg tattaggagc ccattcagaa aatgaacaaa aaagcaaaag aaaatgaccc 1500
agaatgaggt ggtatatttt tcactttgcg ttttgtagac ataagtccct tctttataat 1560
ttgcaatttt ttctgagagg tgatggattt tcacttcaga ggcaaacaat atcatgacaa 1620
gacagccaca ggagcctgaa atgaagctca aaaggtacag ccctagggga ccatgcagag 1680
tttcaaaagg ttttccaaaa gcattgtaca tgaagaaggc tgtccccacc atggttaaca 1740
caataaggat ggcagagaag agaatgacat tgacgtggat gctcactggg attgctttga 1800
gcaaatctgg aaaaaatgag aaccgaaagg gccttgctcc caacccacac tgcctcacac 1860
cctctccgtg gaaaagcccg tactgcattt cacccataaa cttgtccagc tcctgccctg 1920
aggcattgac gagcagagct cccgttttgc agaggacagt ggctttgatc cacaacggtg 1980
tccccaaggc tgtcacaact ccgagggcac atgcaaaact gaacactccg gccatgcaaa 2040
aaatgatttt cttctgttgg cttggcatga tgagaaacgg cttctgt 2087
（配列番号３１９）。

本開示のＣＬＲＮ１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号１３５１３～配列番号１５５７４のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＡＰＯＥ２タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
tgcgtgaaac ttggtgaatc tttattaaac tagggtccac cccaggagga cggctggggc 60
ggggacaggg tctcccgctg caggctgcgc ggaggcagga ggcacggggt ggcgtggggt 120
cgcatggctg caggcttcgg cgttcagtga ttgtcgctgg gcacaggggc ggcgctggtg 180
cccacggcag cctgcacctt ctccaccagc ccggcccact ggcgctgcat gtcttccacc 240
aggggctcga accagctctt gaggcgggcc tggaaggcct cggcctgcag gcgtatctgc 300
tgggcctgct cctccagctt ggcgcgcacc tccgccacct gctccttcac ctcgtccagg 360
cggtcgcggg tccggctgcc catctcctcc atccgcgcgc gcagccgctc gccccaggcc 420
tgggcccgct cctgtagcgg ctggccggcc agggagccca cagtggcggc ccgcacgcgg 480
ccctgttcca ccaggggccc caggcgctcg cggatggcgc tgaggccgcg ctcggcgccc 540
tcgcgggccc cggcctggta cactgccagg cgcttctgca ggtcatcggc atcgcggagg 600
agccgcttac gcagcttgcg caggtgggag gcgaggcgca cccgcagctc ctcggtgctc 660
tggccgagca tggcctgcac ctcgccgcgg tactgcacca ggcggccgca cacgtcctcc 720
atgtccgcgc ccagccgggc ctgcgccgcc tgcagctcct tggacagccg tgcccgcgtc 780
tcctccgcca ccggggtcag ttgttcctcc agttccgatt tgtaggcctt caactccttc 840
atggtctcgt ccatcagcgc cctcagttcc tgggtgacct gggagctgag cagctcctcc 900
tgcacctgct cagacagtgt ctgcacccag cgcaggtaat cccaaaagcg acccagtgcc 960
agttcccagc gctggccgct ctgccactcg gtctgctggc gcagctcggg ctccggctct 1020
gtctccaccg cttgctccac cttggcctgg catcctgcca ggaatgtgac cagcaacgca 1080
gcccacagaa ccttcatctt cctgcctgtg attggccagt ctggaggcca ggggttccca 1140
gggtcccagc tctttctaga ggcccctgag ctcatccccg tgcccccgac tgcgcttctc 1200
accggctcct ggggaaggac gtccttcacc tccgctgggg ctgagtag 1248
（配列番号３２０）。

本開示のＡＰＯＥ２タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号１５５７５～配列番号１６７９７のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＴＮＮＩ３タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
tttcagctca gagagaagct ttattcctca gggccctcct cagggcaggg gcagtaggca 60
ggaaggctca gctctcaaac tttttcttgc ggccctccat tccactcagt gcatcgatgt 120
tcttgcgcca gtctcccacc tcccggtttt ccttctcggt gtcctccttc ttcacctgct 180
tgaggtgggc ccgcaggtcc agggactcct tagcccgggc ccccagcagc gcctgcatca 240
tggcatctgc agagatcctc actctccgca gggtgggccg cttaaacttg cctcgaaggt 300
caaagatctt ctgagtcaga tctgcaatct ccgtgatgtt cttggtgact tttgcctcta 360
tgtcgtatct ctcttcatcc accttgtcca cacgggcgtg gagctgtcgg cacaagtcct 420
gcagctccgc gaagcccagc ccggccaact ccagcggctg gcagcgggtg ctcagagcgc 480
gccccttctc tccgcgccgc tcctccgcct ctcgctccag ctcttgcttt gcaatctgca 540
gcagcagagt cttcagctgc aattttctcg aggcggagat cttagatttt ttcttggcgt 600
gcggctccgt ggcataagcg cggtagttgg aggagcggcg tctgattggg gctggtgcag 660
ggcgaggttc cctagccgca tcgctgctcc catccgccat gctgagactc aggccgggaa 720
tggcaggagg cagggcgagg acaggggcgt ttggagggtc agtgaggggg ccgcccgggt 780
gaccttcagg gtcccaggga ccgtcagtct cctccgggct gcttgagact ccccgaggac 840
act 843
（配列番号３２１）。

本開示のＴＮＮＩ３タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号１６７９８～配列番号１７６１５のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＢＥＳＴ１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
aacgagtatt tgtatttatt aaactcatta gtttgggcag tatactaagg tgtggctgtc 60
ttggattcag atagaactaa gggttcccga ctctgaatcc agagtctgag ttaaatgttt 120
ccaatggttc agtctagctt tcacagtttt tatgaataaa aggcattaaa ggctgaagta 180
gtctgggatt tttatctatt aagctaacca tttgattcag gctgttgtag gacatgttct 240
tcagtgtgga cagctgtatg gctgtgactg gatcagtgtc ctgctggtgt acacacaggt 300
gaggacctgg ctggcgaagc atccccatta ggaagcaggt taggaatgtg cttcatccct 360
gttttccaag gcccaataag gatccatgtg atctttgagt gtagtgtgta tgttggttgg 420
tgattgttcc aaaggttctt tgaggtgatt ttcggggatc tctggcatat ccgtcaggtt 480
aaactccaca gttttcctcc tcacttgaga tacttctggg tgctccatca aggccccatc 540
gctctctgag agcaattcaa aacttttctt ggccccagaa ctcacagtct ttaagctttt 600
gtctttggtg tctatgcctg tgacactgtg aagctttgac ggcgctgatg gttctagggg 660
gaagaacatg ggagtggggc tgaggggcgt ctgtggggca ctgtagtagc ctggcctctg 720
atacagtggg gcagacttga aggcgtccac agccttaagc ttccaggcct tgttgtcttc 780
ctggccccta acgttctgtt tggctgcctt gtggtttttg ggcaggccct cgtggagaag 840
ggattccctc ttgggccaca gtagtttggt ccttgagttt gccctgggag gatggtgatc 900
atgggactgc aggcctagga agcggccaat gatgccagcg tgagcatcct cctcgtcctc 960
ctgattgggc tggaactcca tctcctcttt gttcaggctg atgttgaagg tggagcccat 1020
aaaggaggct cgacggaact gggcggaagc agctgtgtag gggggctgtg gctcgggctt 1080
attccagtac atgtccggct ccatccgagg caggtcctgg tgcatctcat ccacagccaa 1140
cagggacacc tgcaaattcc tgtcgacaat ccagttggtc tcaaaatcat catcatcctc 1200
tccaaagggg ttgatgagct gctctgccac cttcagccag ccaacataga agaagaactg 1260
caggaacgtg aagacgggca caacgaggtc cagctcatgg ccagggtagg ccttggctgg 1320
gttcagaaac tgccgcccaa ctagacaagt caggaagaag ctgtacaccg ccacagtcac 1380
cacctgtgta tacaccagtg ggatactaat ccagtcgtag gcatacaggt gtccacactg 1440
agtacgcaag gtgttcatct cgttcagcag gctctggagc aggatagggt cccggattcg 1500
acctccaagc cacgccttca ttgacaggtt ggcaaaccac acccagggca cccagaacat 1560
gttgtgtggt aggctcagtt tctccaactg cttgtgttct gccggagtca taaagcctgc 1620
ttgcaccagg tgctgggcgc tggggaagcg cttgtagact gcggtgctga cgctgcgcag 1680
gatgagcacg ttgcccaggt tggcgtagcg gatgagcgtg cgccgcagca gccggccttg 1740
ctcgtccttg ccttcgacga agcccgacac caggctcatg aggcggtcgg gccacggcag 1800
gttctcgtac tggttccacc agcgggtcac gaccagcgtc acgtagaagc ccagcacgaa 1860
ggaaatgggg atgagctgga tgtagctgtc gcaatacaga gtcagtttct caaacatcag 1920
ctgttgttct tccgtgaggg ccagcctata aataaagcgg atgatgtagt agcagagcag 1980
gaagattaag aactcgccat atagcagctt gtagatgctg ccccgccagc acagcagcag 2040
gcgggagaag gagcctaagc gggcattagc cacttggctt gtgtaagtga tggtcatggc 2100
caggcagtgg gctgcagcag gtgggcttgg gtcaggtggg gttccaggtg ggtccgatga 2160
tcccacagaa ggtctggcga ctaggctggt gggactccct gggactctgt 2210
（配列番号３２２）。

本開示のＢＥＳＴ１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号１７６１６～配列番号１９８００のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＭＹＢＰＣ３タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
tgagttctct gtgactgcac ttatctttta ttgcccaata aacattggga agacatagca 60
ggccagaaag gcctgtcccc agacattgtt tcttgaggcc accctccttt taccccaaag 120
atccaggggc ttccttcagg agccctgtgg accagtctgt gcaacaccca ctcaggactg 180
cccgacaact gccctgctga tcccccatcg cagcacagga gacacacttg tcacacatac 240
atccaacagt agggaggggt ttccccaact tccctccagg ctcctggcac ggggctggca 300
tccggttgta cctggccatc cccaggagcc agcctggtca ctgaggcact cgcacctcca 360
ggcggcactc acaccgtgcc tcgccctgta agttggtggc cctgcagaca tagatgcccc 420
cgtcaaaggg gcagggcttt ctaatctcca gagtcaacac tccctgcttg ctgaacatgc 480
ggaagcgggc gtcttctccc aggtccaggc cattcttgaa ccaggaaatc ttgggcttgg 540
ggctaccccg gacagcacag cagagcatag cagtgtagcc cgcgatgacc gagcggttca 600
ccaggggctg ggtgaagctt ggggcctcgg agaagtccag ggccttatag ttgggtggct 660
cataggtgat gcctggtctg gggataaaga cgggctcctt ggtggtggcc gctctgtcac 720
taaagccaac catattctgg ctgaagacgc ggaagtagta gccattgcca atgatgagct 780
ctggcaccac gcagtgggtg cggcggtaat gctccaagac ggtgaaccac tccatggtct 840
tcttgtcggc tttctgcact gtgtaccccc agagctccgt gttgccgaca tcctggggtg 900
gcttccactc cagagccaca ttaagacccc aggcgtcagt cacccggaga tcctggggag 960
gacttggctt gtcaacaacc tgcagcacca gcgtggcctt gtcctccatg ttctcaatgc 1020
gcaccgtcac ctggtaagtg cctgaatgca cgcggcgagc ggcccggatg aacaggatgg 1080
tgtctgtggg gctgttgcgg atgctcacct cctcgcctgc caggggctgc ccctctttgg 1140
tccaggtcac ctgaggccgg ggcttgccct ggaaagggat gagaaggttc acaggctccc 1200
cgaccttctt ctgaatggtc tggcgcaggt gcctgggcag ctgaagccgt ggccgttgca 1260
ggatctcctg cactgtcacc ggctccgtgg tggtaacagg ggctccaggc cctgccatat 1320
tgtgtgcccg cactcggaaa agcagccggg cccccgtggg caggtccttc accagtatcg 1380
atgtgtgctc tgtcagcccc tgcagggcag ccacccactc tgagcagccc tctgggcagt 1440
actccacgct gtagccatcc aggcctcctg ctcccacgcg ctctgggggc cgccacttga 1500
gggagaccgt ggtgtcagag acgtcctcta ctgccaggtg ggtgggttcg ctggggggac 1560
cgataggcat gaagggctgg gaggcagggc tgggcctgga catgccgatg gcgttgaccg 1620
cgtagacgcg catctcgtac accacgccct cgatcatgcg ccgcgcttca tgactcagct 1680
cctgaatcag gtcgaagttc agccgcatcc accggtagct cttcttcttc ttgcgctcca 1740
ggatgtagcc caggatgggc tgcccgccat cgtaggcagg cggctcccac tgtactgtgc 1800
aggagtcctc tcccacgttg ctgatcttgg gggccgcagg tgcgtctggc acgtcgatga 1860
ccttgactgt gaggttgacc tggtcctcgc ccacagggtt cttcactgtg accgtgtaga 1920
cgccctcatc ttccttctct gccccctcga ccgtgaagat gctgcggtcc ttggtggtct 1980
ccacgcggac ccggccctcg gtctcacaca gcagcttctt gtcaaacacc cactcatcgc 2040
tgtcacctgt gtcctctggg gcatctgggg ctggcctggc tggggcctta ttcccctgcg 2100
tgatagcctt ctgccagatc acagtgggag cagggtcccc agagataggg acgtccagac 2160
gtagcttatt tccagctaca accacaatgg tgtctggtat gcggcctggg cagtccaggt 2220
ggatcttggg aggttcctgc ctgggtacga agtcaatctt gacctccatg aagtggagct 2280
tggctgacag gttgcaggcg aagccctcgg gcacaaagct gtagtcagcc tcgtcggcag 2340
gtgtgacgtc gtcaatggtc agtttgtgga cccgcccgat gtgggacacc tttatgcggc 2400
tgtcgggcac cagctccttc ccattcttca gccacacacc ccgaacattc tcatctgaga 2460
cctcacattt gaacaccgcc tggtcctttg cgcccaccat caggtctgcg atgctctggt 2520
acacctccag cttcttttcc tgcacaatga gctcagccag cgcctggccc ccgctagtgc 2580
acagtgcata gtgccccgcg tcctccagca tggcctcgtt gatgatcagg tggtgtctct 2640
gcccgtcctt cttgaaccgg tatttgaagg tctcctcccg ggtcagctcc accccgtcct 2700
tcagccattt gacttgcgcc ccctcctccg atacttcaca ctcaaactcc acccgctgcc 2760
ccaccatcac cagctggtcc tccaaggggc gcgtgatgag cacagggggc tctttcacaa 2820
agagctccgt gctacacttc tcgccaccca ccacgcactg gtaggctgcg tcgtccgcca 2880
atgagcactg gctgatggtc agggtacgct tggcaccgat ggactcaaag atgtacttgc 2940
tgccgctcat ctggatctcc tggccattct tgagccattt gacctcagcg tcatggtcag 3000
ccagttccac ggtcagccgg atcttgtggc ctttgctcac ctggtaggcc ggctccagct 3060
tcttctgaaa ggctgtgctc ttcttctcat cgcgcctcat gcccttgagc ctctttagca 3120
tgccgcgcag gtcagtgacg ccgtactgga aggcgatgcg ctcgtactca gatgggggtg 3180
cctgccgtag gatctcccac acgtcctcct ctgctggtgc ctccagcttc gagtccctcg 3240
gggtccggaa actgtctctc tttttcagca gtgagctgaa gtccagaatc ccagtgtcct 3300
catggctatc actgatccgc cgaccacctc cagccaggct cgtgcggcgg aaggctgata 3360
ggaggtccag gtctccggtg cccatggcct cgtggacagt gagattgaag ttggagcagt 3420
caaatttgtc cttggtggac acctcacagc ggtagctgcc agtgaaggca ggctgggcat 3480
cggtgatgtg cagctcgaac agatagacct tgctggcgcg gtcgtagctg tcgtgcagct 3540
gcaggtgctg gcccaccttg ctgctcaggt ccacccattt gcccttgaac cacttgacca 3600
caggcggctt caggaggctg gcgccggcca cgcgggctga gaaggtgatg ctgccaccca 3660
cggtcacctc gccatcctgt ggccgcatca cgaagaggcc aatggggtca tcgggggctc 3720
caggggtagg accattgaga gctgctgagc ttgacccttt gggacttggg gcactttctc 3780
ccagctcagc ggctggggcc ggggcttctc caggggctcc agtggcctca gcaggggcag 3840
gggcaggggc cagcatgggc tctgccttct ctgcctctat gaccttgagg tcgaacttga 3900
ccttggagga gccagcaatg actgcgtaag atccctggtc ggcagggccc acttcccgca 3960
ctgtcagcgt atgccgtgtg ccctctgtgg ccaggccgta cttgttgctg gcgctgatgt 4020
cactgcctcc gcgctgccag cgcaccttca ctcctgcccg ctctgtctcg gcctcgaaca 4080
cggcagggct gcctgcggcc acttccactg accgtggctt cttgctaaaa gctgagactg 4140
gcttcttccc cggctcaggc atcctgagag acgtcacacc aggcacgaag caggcacagg 4200
tcacccaaag agggact 4217
（配列番号３２３）。

本開示のＭＹＢＰＣ３タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号１９８０１～配列番号２３９９２のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるＴＮＮＴ２タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
tcagtgtgtg gtggcttttt attactggtg tggagtgggt gtgggggcag gcaggagtgg 60
tggctcccac ctaggccagc tccccatttc caaacaggag ctgcctgggg tgcccaggag 120
ggcccgggaa ctgggggagt gcaggccgga ggcaggtgcg agcgaggagc agatctttgg 180
tgaaggaggc caggctctat ttccagcgcc cggtgacttt agccttcccg cgggtcttgg 240
agactttctg gttatcgttg atcctgtttc ggagaacatt gatctcatat ttctgctgct 300
tgaacttctc ctgcaggtcg aacttctctg cctccaagtt atagatgctc tgccacagct 360
ccttggcctt ctccctcagc tgatcttcat tcaggtggtc aatggccagc accttcctcc 420
tctcagccag aatcttcttc ttcttttccc gctcagtctg cctcttccca cttttccgct 480
ctgtctgggc ctgcttctgg atgtaacccc caaaatgcat catgttggac aaagccttct 540
tcttccgggc ctcatcctca gccttcctcc tgttctcctc ctcctctcgt cgagccctct 600
cttcagccag gcggttctgc cgctccttct cccgctcatt ccggatgcgc tgctgctcgg 660
cccgctctgc ccgacgtctc tcgatcctgt ctttgagaga aacgagctcc tcctcctctt 720
tcttcctgtt ctcaaagtga gcctcgatca gcgcctgcaa ctcattcagg tccttctcca 780
tgcgcttccg gtggatgtca tcaaagtcca ctctctctcc atcggggatc ttgggaggca 840
ccaagttggg catgaacgac ctgggctttg gtttggactc ctccattggg ccatcttcag 900
cctcctttgc ttcctcttct tcttcatctt cttctgccct ggtctcctcg gtctcagcct 960
ctgcttcagc atcctcttcc gctgcctcct cctgctcgtc ttcgtcctct ctccagtcct 1020
cctcttcttc aacagctgct tcttcctgct cctcctcctc gtactcttcc accacctctt 1080
ctatgtcaga catggtctct gctctccctc caaaaggaga aaaaagtcag tgcaggtaca 1140
aagggaagcc tgccttcctc agaagagctc tggcccccgt tgtacagaga tcagcgaggc 1200
ctagggtgaa tctagttcca cccctcatga gctgtgtgac ctcagaacag cagctgccga 1260
cagatcctgg aggcgtctgc tcagtctcag cggggactgg gtgaggcaga ggatggagag 1320
ggctttaagc aggcatgtgg gctggggcct ggtgagccag cc 1362
（配列番号３２４）。

本開示のＴＮＮＴ２タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号２３９９３～配列番号２５３２９のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシング因子３１（ＰＲＰＦ３１）タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
tcttgacaat gtccttttaa ttgtactctt ttcaaaaaat ctcctttctc agttaaaaaa 60
gacaaggcat gatgaagacc tgctctagcc catactgggc ggtgatctcg gtcctggggg 120
aggccaggcc ggactcttcc aaggcctcct ccctgggcag tcccagcaat ggggccagtg 180
gcagggcagg ttctccctgc cagaacccga tcctagccct tcagaaggac tggacctctg 240
tgtcccttca gtgggaagcc accttggaca cacgcagtca ttcaggtgga cataaggcca 300
ctcttctcgc ccttgacctt gaggaactca gccatgctgg agaaatactt ctggttggcc 360
tcagccacct tcttctctgc cgcctgtggg ttcacaatct ccaggccctg gagtggggtg 420
aaggccacgc tggaggccgt gcccgaggag cggtcgcgga tggtggactt cccgccatat 480
acgacgctct gcttctgcag ggtccgctgc agcgtcttgg agatcctggc cttggtggcc 540
tcgtttacct gtgtctgccg cacacgccca ctgcccgact tgcccaggtg gcccaggctg 600
aatcccaggt cctcctggta ggcgtcctcc tcgatctctc cgaagctcat acggttggcc 660
tgcttccgga tctccgtcag ccccagccgc tccttcatct tgcggtacct gcggccgcct 720
cgcttcttcc gctgtccatc caggggcgca ggcagcggct tcacctgctt cacaggcggc 780
ggctcctgcc acttgtcgaa tttgcgctcg atctcatcct tcagttcgta gcccaccttc 840
ccttctgtgc tctcgtggaa actgtccaca cgggctgcca gtgtgcactt ggcggccacc 900
agccgggccg ctttccgccg cagatccggt ggcagggact gcacgatgtc actgtggtag 960
atgtagccgg tgtggggcag cactgaggta gacgagaagc ccgacagcgt cttgcgctgg 1020
gccccgagca gcatgatgtt gcaggcgggc atcttggaga ggttggtcag gccgccggcc 1080
acacccatga tcttggcggc cgtggatgcc ccgataatga tggacaggtt gggtgcgatg 1140
aaggacatcc gggactccac atactcgtag atgcggtgct tggaggcgtt cagctccagc 1200
gccatgtcgc aggcctcctc cagccgctcc agctcctcct ccgacagctg ctgcccctgg 1260
gtggtggagg cggtgacgct gacgaccatg atggtggcat tggtgaggat ctgctgcagg 1320
ttctcattgt tcttgcactt gtccaggctg ttgcccagct ccttgaccgt gcggatgtaa 1380
tccagtgcat tggggaccaa ggactccagt tcagggaatc tctttgagta cttatcccgg 1440
atgaacttat ggatgatgtt cagctcgttt tcgatctcca cggtcaggtt gttggcatcc 1500
acgatgacgc ggtattcagg cgcggcctcc actggtccca tcacttctga agctttggct 1560
tgcttgctga tatactcctc aatcttcatc ataatctcag caaacatctt actatcccat 1620
agcttggcga tggtcttgac tgaatccccg gaaagatcca gctgtgtctc ctcctgcaca 1680
tcctcgatcg ctggctcctc ttcttcctcc ccatagcttc ctccttcctc ctcttctgct 1740
gcctcttcga gatcagctaa gagctcatct gccagagaca tcccgaggcc tctcctctcc 1800
gcgcaccact gtttctagcg ttagtcgctc acc 1833
（配列番号４９１）。

本開示のＰＲＰＦ３１タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号２５３３０～配列番号２７１３７のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物は、以下の配列の約２０～３０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなるプログラニュリン（ＧＲＮ）タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含んでもよい：
ttaagaaagt gtacaaactt tattgaaacg cacacgcgca cacacacaaa cacccctgtg 60
gatagggaaa agcacctggc cacagggtcc actgaaacgg ggaggggatg gcagcttgta 120
atgtggcttt tgccacaacc cccttctgac agggaaggcc ttagattgag gccccacctc 180
ccatggtgat ggggagctca gaatggggtc cagggagaat ttggttaggg ggaggtgcta 240
gggaggcctg agcagagggc accctccgag tggggtcccg agggctgcag agtcttcagt 300
actgtccctc acagcagctg tctcaaggct gggtccctca aaggggcgtc ccagcgcggg 360
gcctccctgc gcaaacactt ggtacccctg gctgcgcagc ggaagccagc aggacagcag 420
tggcgccgat cagcacaaca gacgccctgg cggtagggac agcaggccca gccctgtcgg 480
ttgtctcggc agcaggtctg gttatcatgg cagaagtgtc cttccccaca ctccacgtcc 540
ttcacaccca cgtgagggct acgggccagg aaggtggcag gctgggcaga gaccacttcc 600
ttctcgcagg atcgagcctt cacgttgcag gtgtagccag ccgggcagca gtgctggcga 660
tcctcgcagc acacagcatg gggcaactgg cagcaggccc agctcccacc caggctcggg 720
cagcaggtct gccccaccgg gcagctggtg tgctggtcac agccgatgtc tctggggtgg 780
gataaggaag cccggcgggc aggcatcttc tccagtccag ccacgatctc gcttcctcgc 840
tgacactgcc cctcagctac acacgtgtag ccctgggggc agcagtgctg gtggtccgag 900
cagcagacag cctctgggat tggacagcag ccccactccc cagacgtgag ttggcagcag 960
gtatcggagg agggacagct gctgacatta tcacagggga catctctctt caaggcttgt 1020
gggtctggca ggctgaggtg agctggggcc ttctccatcc agggcacctg gtggggcccc 1080
tgttcacagg tacccttctg cgtgtcacac gtaaaccccg cgggacagca gtgtatgtgg 1140
tcctcacagc acacagcctg ggtaaaaggg cagcagcccc aggcccccga ctgtagacgg 1200
cagcaggtat agccatctgg gcagctcacc tccatgtcac atttcacatc ccccactgtg 1260
tgcgcaggca gcttagtgag gaggtccgtg gtagcgttct ccttggagag gcacttactc 1320
tggatcaggt cacacacagt gtcttggggg cagcagtgca ggtgatcgga gcagcaggtg 1380
gcgttgggca ttgggcagca gccatacttc ccactgggca gctcacagca ggtagaacca 1440
tcagggcacc gggaccgtgc gtccggacac atgaccgagc tggacaaggc cactgccctg 1500
ttagtcctct gggcagggag cttctttgcc agggggtggg tgcccgtggg tgtgatgcag 1560
cgggtgtgaa ccaggtcgca gaaggcaccg tgcggacagc agtgcaccct gtcttcacag 1620
caggaagcct ggggcatggg gcagcacccc caggagccat cgaccataac acagcacgtg 1680
gagaagtccg ggcattcgaa ctgactatca gggcactgga tggcacccac ggagttgtta 1740
cctgatcttt ggaagcagga tcgcccgtct gcactgcagt ggaagccccg tgggcagcag 1800
tgatggccat ccccgcatgc cacggcctct gggaaggggc agcaactgga agtccctgag 1860
acggtaaaga tgcaggagtg gccggcagag cagtgggcat caacctggca ggggccaccc 1920
agatgcctgc tcagtgttgt gggccatttg tccagaaggg gacggcagca gctgtagctg 1980
gctcctccgg ggtccaggca gcaggccaca gggcagaact gaccatctgg gcaccgcgtt 2040
ccagccacca gccctgctgt taaggccacc cagctcacca gggtccacat ggtctgcctg 2100
cgtccgactc cgcggtcctt gggcagcagc 2130
（配列番号４９２）。

本開示のプログラニュリン（ＧＲＮ）タンパク質をコードするＲＮＡ分子の標的配列に特異的に結合する本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号２７１３８～配列番号２９２４２のいずれか１つから選択される配列を有する核酸を含んでも、それからなってもよい。

ＲＮＡ分子
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、病原性ＲＮＡが、標的ＲＮＡ配列を含むか、または標的配列が、病原性ＲＮＡと会合している。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、少なくとも１つの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、１つ以上の標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、２つ以上の標的配列を含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、非コードＲＮＡである。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、天然に存在するＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、天然に存在しない分子である。例示的な天然に存在しないＲＮＡ分子は、配列変形もしくは変異、キメラ配列、外因性配列、異種配列、キメラ配列、組み換え配列、改変もしくは合成ヌクレオチドを含む配列、またはそれらの任意の組み合わせを含んでも、それからなってもよい。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、ウイルスから単離または誘導された配列を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、原核生物から単離または誘導された配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、古細菌の種もしくは株または細菌の種もしくは数から単離または誘導された配列を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、真核生物から単離または誘導された配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、原生動物、寄生生物、原生生物、藻類、真菌、酵母、アメーバ、蠕虫、微生物、無脊椎動物、脊椎動物、昆虫、齧歯動物、マウス、ラット、哺乳動物、または霊長類の種から単離または誘導された配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、ヒトから単離または誘導された配列を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、生物またはウイルスのゲノムのコード配列に由来する配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、１次ＲＮＡ転写物、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、プロセシングされていない遺伝子産物（例えば、転写物）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、転写後プロセシング（例えば、５’キャップ及び３’ポリアデニル化シグナルを含む転写物）に供されている遺伝子産物を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、選択的スプライシングを受けた遺伝子産物（例えば、スプライスバリアント）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、非コード及び／またはイントロン配列（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の除去を受けている遺伝子産物を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、非コード配列に由来する配列（例えば、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ））を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、リボソームＲＮＡを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、小さなｎｃＲＮＡ分子を含むか、またはそれからなる。本開示の例示的な低分子ＲＮＡ分子としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモール干渉（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、スモールヌクレオラーＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外またはエキソソームＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、及び低分子Ｃａｊａｌ体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、長いｎｃＲＮＡ分子を含むか、またはそれからなる。本開示の例示的な長鎖ＲＮＡ分子としては、Ｘ不活性特異的転写物（Ｘｉｓｔ）及びＨＯＸ転写物アンチセンスＲＮＡ（ＨＯＴＡＩＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、細胞内空間で本開示の組成物と接触する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、細胞質ゾル空間内で本開示の組成物と接触する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、核内で本開示の組成物と接触する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、小胞、細胞の膜結合区画、または細胞小器官内で本開示の組成物と接触する。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、細胞外空間内で本開示の組成物と接触する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、エキソソーム内で本開示の組成物と接触する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、リポソーム、ポリマーソーム、ミセル、またはナノ粒子内で本開示の組成物と接触する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、細胞外マトリックス内で本開示の組成物と接触する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、液滴内で本開示の組成物と接触する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、マイクロ流体液滴内で本開示の組成物と接触する。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、一本鎖配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子は、二本鎖配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、２つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖配列は、１つのＲＮＡ分子及び１つのＤＮＡ分子を含む。二本鎖配列が１つのＲＮＡ分子及び１つのＤＮＡ分子を含むものを含むいくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ＲＮＡ分子と選択的に結合し、任意に、それを選択的に切断する。

ＲＮＡ結合エンドヌクレアーゼ
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれらからなる任意の第２のＲＮＡ結合タンパク質があってよい。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、エフェクタータンパク質である。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、それがＲＮＡと会合する方法でＲＮＡと結合する。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、それがＲＮＡを切断するようにＲＮＡと会合する。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＰＵＦ、ＰＵＭＢＹ、またはＰＰＲベースのタンパク質である第１のＲＮＡ結合タンパク質に融合される。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅを含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ１タンパク質は、配列番号３２５を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅ４を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ４タンパク質は、配列番号３２６を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅ６を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ６タンパク質は、配列番号３２７を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅ７を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ７タンパク質は、配列番号３２８を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅ８を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ８タンパク質は、配列番号３２９を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅ２を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ２タンパク質は、配列番号３３０を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅ６ＰＬを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ６ＰＬタンパク質は、配列番号３３１を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅＬを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅＬタンパク質は、配列番号３３２を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅＴ２を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅＴ２タンパク質は、配列番号３３３を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１１を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅ１１タンパク質は、配列番号３３４を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡｓｅＴ２様を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅＴ２様タンパク質は、配列番号３３５を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異ＲＮＡｓｅを含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ））ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）ポリペプチドは、配列番号３３６を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、配列番号３３７を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号３３８を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異Ｒｎａｓｅ１を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号３３９を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号３４０を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、配列番号３４１を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、変異Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ））ポリペプチドは、配列番号３４２を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、配列番号３４３を含むか、またはこれからなる変異Ｒｎａｓｅ１（Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むか、またはこれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＮＯＢ１ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＮＯＢ１ポリペプチドは、配列番号３４４を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、エンドヌクレアーゼを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、エンドヌクレアーゼＶ（ＥＮＤＯＶ）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＥＮＤＯＶタンパク質は、配列番号３４５を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＥＮＤＯＧタンパク質は、配列番号３４６を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、エンドヌクレアーゼＤ１（ＥＮＤＯＤ１）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＥＮＤＯＤ１タンパク質は、配列番号３４７を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ヒトフラップエンドヌクレアーゼ１（ｈＦＥＮ１）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｈＦＥＮ１ポリペプチドは、配列番号３４８を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼＸＰＦ（ＥＲＣＣ４）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＥＲＣＣ４ポリペプチドは、配列番号３４９を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、エンドヌクレアーゼＩＩＩ様タンパク質１（ＮＴＨＬ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＮＴＨＬポリペプチドは、配列番号３４０を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ヒトシュラフェン１４（ｈＳＬＦＮ１４）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｈＳＬＦＮ１４ポリペプチドは、配列番号３５１を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ヒトベータラクタマーゼ様タンパク質２（ｈＬＡＣＴＢ２）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｈＬＡＣＴＢ２ポリペプチドは、配列番号３５２を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、アプリン／アピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、アプリン／アピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ２）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＰＥＸ２ポリペプチドは、配列番号３５３を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＡＰＥＸ２ポリペプチドは、配列番号３５４を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、アプリンまたはアピリミジン部位リアーゼ（ＡＰＥＸ１）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＰＥＸ１ポリペプチドは、配列番号３５５を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、アンギオゲニン（ＡＮＧ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＡＮＧポリペプチドは、配列番号３５６を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、熱応答性タンパク質１２（ＨＲＳＰ１２）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＨＲＳＰ１２ポリペプチドは、配列番号３５７を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ａ（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドは、配列番号３５８を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドは、配列番号３５９を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、反応性中間体イミンデアミナーゼＡ（ＲＩＤＡ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＩＤＡポリペプチドは、配列番号３６０を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ホスホリパーゼＤファミリーメンバー６（ＰＤＬ６）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ６ポリペプチドは、配列番号３６１を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ミトコンドリアリボヌクレアーゼＰ触媒サブユニット（ＫＩＡＡ０３９１）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＫＩＡＡ０３９１ポリペプチドは、配列番号３６２を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、アルゴノート２（ＡＧＯ２）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＧＯ２ポリペプチドは、配列番号３６３を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ミトコンドリアヌクレアーゼＥＸＯＧ（ＥＸＯＧ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＥＸＯＧポリペプチドは、配列番号３６４を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ｄ（ＺＣ３Ｈ１２Ｄ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ｄポリペプチドは、配列番号３６５を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、小胞体から核へのシグナル伝達２（ＥＲＮ２）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＥＲＮ２ポリペプチドは、配列番号３６６を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ｐｅｌｏｔａ ｍＲＮＡ監視及びリボソームレスキュー因子（ＰＥＬＯ）ポリペプチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＰＥＬＯポリペプチドは、配列番号３６７を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＹＢＥＹメタロペプチダーゼ（ＹＢＥＹ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＹＢＥＹポリペプチドは、配列番号３６８を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、切断及びポリアデニル化特異的因子４様（ＣＰＳＦ４Ｌ）ポリペプチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ＣＰＳＦ４Ｌポリペプチドは、配列番号３６９を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドは、配列番号３７０を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドは、配列番号３７１を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、除去修復交差相補群１（ＥＲＣＣ１）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＥＲＣＣ１ポリペプチドは、配列番号３７２を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１アイソフォーム（ＲＡＣ１）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＡＣ１ポリペプチドは、配列番号３７３を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、リボヌクレアーゼＡ Ａ１（ＲＡＡ１）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＡＡ１ポリペプチドは、配列番号３７４を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、Ｒａｓ関連タンパク質（ＲＡＢ１）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＡＢ１ポリペプチドは、配列番号３７５を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ２ポリペプチドは、配列番号３７６を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドは、配列番号３７７を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドは、配列番号３７８を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、テネウリン膜貫通タンパク質（ＴＥＮＭ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、テネウリン膜貫通タンパク質１（ＴＥＮＭ１）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＴＥＮＭ１ポリペプチドは、配列番号３７９を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、テネウリン膜貫通タンパク質２（ＴＥＮＭ２）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＴＥＮＭ２ポリペプチドは、配列番号３８０を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、リボヌクレアーゼカッパ（ＲＮＡｓｅＫ）ポリペプチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｓｅＫポリペプチドは、配列番号３８１を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮポリペプチドは、配列番号３８２を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮポリペプチドは、配列番号３８３を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、ＺＮＦ６３８ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ６３８ポリペプチドポリペプチドは、配列番号３８４を含むか、またはそれからなる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合タンパク質は、テロメラーゼ結合タンパク質ＥＳＴ１Ａアイソフォーム３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２４３７５６．１としても一般に知られるヒトＳＭＧ６タンパク質に由来するＰＩＮドメインを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｈＳＭＧ６のＰＩＮは、本明細書では、例えば、Ｃａｓ融合タンパク質の形態で、内部コントロールとして使用され、限定されないが、図９（ＰＩＮ－ｄＳａｕＣａｓ９、ＰＩＮ－ｄＳａｕＣａｓ９ｄＨＮＨ、ＰＩＮ－ｄＳＰＣａｓ９、及びｄｃｊｅＣａｓ９－ＰＩＮを示す）を参照のこと。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、さらに、（ａ）ＲＮＡ分子内で特異的に結合するｇＲＮＡを含む配列、及び、（ｂ）ヌクレアーゼをコードする配列、を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳタンパク質は、Ｉ型、ＩＡ型、ＩＢ型、ＩＣ型、ＩＤ型、ＩＥ型、ＩＦ型、ＩＵ型、ＩＩＩ型、ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、ＩＩＩＤ型、ＩＶ型、ＩＶＡ型、ＩＶＢ型、ＩＩ型、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、ＩＩＣ型、Ｖ型、ｏｒＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のいずれか１つから単離または誘導される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮまたはそのヌクレアーゼドメインから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインから単離または誘導された配列を含む。

融合タンパク質
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）第１のＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部をコードする配列、及び任意に（ｂ）第２のＲＮＡ結合ポリペプチドをコードする配列を含む標的ＲＮＡ結合融合タンパク質をコードする配列を含み、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドは標的ＲＮＡに結合し、第２のＲＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ結合融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導標的ＲＮＡ結合融合タンパク質である。ＲＮＡ誘導標的ＲＮＡ結合融合タンパク質は、ＲＮＡ結合ポリペプチドを標的ＲＮＡに誘導するｇＲＮＡに対応する少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドを含む。ＲＮＡ誘導標的ＲＮＡ結合融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓベースのＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部であるＲＮＡ結合ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ結合融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導標的ＲＮＡ結合融合タンパク質ではなく、そのようなものであるから、対応するｇＲＮＡ配列なしで標的ＲＮＡに結合することができる少なくとも１つのＲＮＡ結合ポリペプチドを含む。そのような非誘導ＲＮＡ結合ポリペプチドとしては、ＰＵＦ（Ｐｕｍｉｌｉｏ及びＦＢＦ相同性ファミリー）である少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質またはそのＲＮＡ結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。このタイプのＲＮＡ結合ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓなどのｇＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合タンパク質の代わりに使用することができる。ｍＲＮＡの安定性及び翻訳の媒介に関与するＰＵＦタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｐｕｍｉｌｉｏ及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｆｅｍ－３結合因子に由来して名付けられた）の固有のＲＮＡ認識様式は、当該技術分野で周知である。当該技術分野でも既知のヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは、同族のＲＮＡ配列にしっかりと結合し、その特異性を改変することができる。それは、８つの連続したＲＮＡ塩基を認識する８つのＰＵＦリピートを含み、各リピートは、１つの塩基を認識する。各リピート中の２つのアミノ酸側鎖が、対応する塩基のワトソン－クリックエッジを認識し、そのリピートの特異性を決定するので、ＰＵＦドメインは、ほとんどの８ｎｔのＲＮＡを特異的に結合するように設計することができる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６（１１）：８２５－８３０。全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０６８６２７も参照のこと。

ＰＵＦ－ＲＮＡ相互作用のモジュール性は、ＰＵＦドメインの結合特異性を合理的に設計するために使用されている（Ｃｈｅｏｎｇ，Ｃ．Ｇ．＆ Ｈａｌｌ，Ｔ．Ｍ．（２００６）ＰＮＡＳ １０３：１３６３５－１３６３９；Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｅｌｌ １１０：５０１－５１２）。しかし、上掲のＷＯ２０１２／０６８２７の教示の前に、アデニン、グアニン、またはウラシルを認識するリピートを伴うＰＵＦドメインの良好な設計のみが報告されている。野生型ＰｕｍＨＤは、Ｃと結合しないが、分子工学は、Ｐｕｍユニットのいくつかが、良好な収率及び特異性でＣと結合するように変異させることができることを示している。例えば、Ｄｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ（ＰＵＦ）ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８６，２６７３２－２６７４２（２０１１）を参照のこと。したがって、ＰｕｍＨＤは、ＲＮＡの任意の８塩基配列へのプログラム可能な結合を示すＷＴ Ｐｕｍｉｌｉｏタンパク質の修正バージョンである。ＰｕｍＨＤの８つのユニットのそれぞれは、４つ全てのＲＮＡ塩基に結合し得、標的配列に隣接するＲＮＡの塩基は結合に影響しない。ＰＵＦ設計の当該技術分野で認識されたＲＮＡ結合について、以下のものも参照のこと：Ｆｉｌｉｐｏｖｓｋａ Ａ，Ｒａｚｉｆ ＭＦ，Ｎｙｇａｒｄ ＫＫ，＆ Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ．Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＰＵＦ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，７（７），４２５－４２７（２０１１）；Ｆｉｌｉｐｏｖｓｋａ Ａ，＆ Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ．Ｍｏｄｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ＰＵＦ，ＴＡＬＥ ａｎｄ ＰＰＲ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，８（３），６９９－７０８（２０１２）；Ａｂｉｌ Ｚ，Ｄｅｎａｒｄ ＣＡ，＆ Ｚｈａｏ Ｈ．Ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＰＵＦ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＲＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８（１），７（２０１４）；Ｚｈａｏ Ｙ，Ｍａｏ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｌｉ Ｈ，Ｙａｎｇ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｚ，＆ Ｗｕ Ｊ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＰＵＦ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６（９），４７７１－４７８２（２０１８）；Ｓｈｉｎｏｄａ Ｋ，Ｔｓｕｊｉ Ｓ，Ｆｕｔａｋｉ Ｓ，＆ Ｉｍａｎｉｓｈｉ Ｍ．Ｎｅｓｔｅｄ ＰＵＦ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，１９（２），１７１－１７６（２０１８）；Ｋｏｈ ＹＹ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｑｉｕ Ｃ，Ｏｐｐｅｒｍａｎ Ｌ，Ｇｒｏｓｓ Ｌ，Ｔａｎａｋａ Ｈａｌｌ ＴＭ，＆ Ｗｉｃｋｅｎｓ Ｍ．Ｓｔａｃｋｉｎｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰＵＦ－ＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ＲＮＡ，１７（４），７１８－７２７（２０１１）。

したがって、ヒトＰＵＭ１（１１８６アミノ酸）が、タンパク質のＣ末端にＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）（Ｐｕｍｉｌｉｏ相同性ドメインＰＵＭ－ＨＤアミノ酸８２８～アミノ酸１１７５としても既知）を含有すること、ならびにＰＵＦがヒトＰＵＭ１のＲＢＤに基づくことは、当該技術分野で周知である。タンパク質の構造及び安定性に重要なＲＮＡ結合ならびに隣接Ｎ末端及びＣ末端領域に対し、３６アミノ酸の８つの構造リピートモジュールがある（但し、モジュール７は、４３アミノ酸を有する）。各リピートモジュール内で、アミノ酸１２、１３、及び１６は、ＲＮＡ塩基認識を制御する１２及び１６とのＲＮＡ結合に重要である。アミノ酸１３は、ＲＮＡ塩基とスタックし、特異性及び親和性を調整するように改変することができる。あるいは、ＰＵＦ設計は、アミノ酸１３をヒトＰＵＭ１の天然残基として維持してもよい。Ｎ末端及びＣ末端のＰＵＦが３’から５’へのＲＮＡを認識するので、認識は、逆方向に行われる。したがって、当技術分野で知られている通り、８モジュールのＰＵＦ操作（８ＰＵＦ）は、ヒトタンパク質を模倣する。例示的な８－ｍｅｒＲＮＡ認識（８ＰＵＦ）は、以下のように設計されるであろう：Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’。一実施形態では、８ＰＵＦが、ＲＢＤとして使用される。別の実施形態では、８ＰＵＦ設計の変形が、１２－ｍｅｒのＲＮＡ認識（１２ＰＵＦ）ＲＢＤまたは１６－ｍｅｒのＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）ＲＢＤを作成するために使用される。野生型ヒトＰＵＭ１のリピート１～８は、それぞれ、配列番号６０９～６１６でこれと共に提供される。ヒトＰＵＭ１由来のＰＵＦドメインをコードする核酸配列は、配列番号６１７であり、ヒトＰＵＭ１アミノ酸８２８～１７６のＰＵＦドメインのアミノ酸配列は、配列番号６１８である。米国特許第９，５８０，７１４号（全体が本明細書に組み込まれる）も参照のこと。

本開示の非誘導ＲＮＡ結合融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＰＵＭＢＹ（Ｐｕｍｉｌｉｏベースのアセンブリ）タンパク質である少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質またはそのＲＮＡ結合部分を含む。ＲＮＡ結合タンパク質ＰｕｍＨＤは、ＲＮＡを標的とするために天然及び改変形態で広く使用されているが、４つの標準的なタンパク質モジュールのセットを生じるように設計されたタンパク質構造に操作されており、これらのそれぞれは、１つのＲＮＡ塩基を標的とする。これらのモジュール（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏベースのアセンブリの場合、Ｐｕｍｂｙ）は、所望の標的ＲＮＡと結合するために、様々な組成及び長さの鎖に連結される。本質的には、ＰＵＭＢＹは、より単純でモジュール形式のＰｕｍＨＤであり、ＰｕｍＨＤの単一のタンパク質ユニットが、任意のサイズ及び結合配列特異性のアレイに連結される。そのようなＰｕｍｂｙ－ＲＮＡ相互作用の特異性は高く、標的配列から３つ以上のミスマッチを有するＲＮＡ配列へのＰｕｍｂｙ鎖の結合は検出されない。Ｋａｔａｒｚｙｎａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１６；１１３（１９）：Ｅ２５７９－Ｅ２５８８。全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２３８５９３も参照のこと。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏ及びＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡ結合タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏベースのアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合タンパク質は、Ｅ１７などのヌクレアーゼドメインと融合される。

本明細書に開示の組成物及び方法で使用された例示的なＰＵＦ ＲＮＡ結合タンパク質は、以下の通りである：

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２６タンパク質（元の配列）は、配列番号３９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２６タンパク質は、配列番号３９４を含むか、またはそれからなる最適化された核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５４タンパク質（元の配列）は、配列番号３９５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５４タンパク質は、配列番号３９６を含むか、またはそれからなる最適化された核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６０タンパク質（元の配列）は、配列番号３９７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６０タンパク質は、配列番号３９８を含むか、またはそれからなる最適化された核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１０タンパク質（元の配列）は、配列番号３９９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１０タンパク質は、配列番号４００を含むか、またはそれからなる最適化された核酸配列にコードされる。

本明細書に開示の組成物及び方法で使用された例示的なＰＵＦ ＲＮＡ結合タンパク質（８つのＲｈｏヌクレオチドを標的とする）は、以下の通りである：

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ０８（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ０８（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９２を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１６（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１６（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９４を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２２（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２２（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９６を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ３４（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ３４（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９８を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５６（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号４９９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５６（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５００を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６４（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６４（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０２を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６６（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６６（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０４を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ９０（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ９０（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０６を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１０２（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１０２（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０８を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１２（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５０９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１２（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１０を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１２２（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１２２（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１２を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１２８（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１２８（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１４を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１３０（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１３０（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１６を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１５４（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１５４（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１８を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１６６（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５１９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１６６（８ヌクレオチドを標的とする）は、配列番号５２０を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

例示的なＰＵＦ ＲＮＡ結合タンパク質（１６のＲｈｏヌクレオチドを標的とする）は、以下の通りである：

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２６（設計１－Ｐ００１ＩＳ）は、配列番号５２１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２６（設計１－Ｐ００１ＩＳ）は、配列番号５２２を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２６（設計２－Ｐ００１ＫＺ）は、配列番号５２３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２６（設計２－Ｐ００１ＫＺ）は、配列番号５２４を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２６（設計３－Ｐ００１ＬＥ）は、配列番号５２５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ２６（設計３－Ｐ００１ＬＥ）は、配列番号５２６を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５４（設計１－Ｐ００１ＩＴ）は、配列番号５２７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５４（設計１－Ｐ００１ＩＴ）は、配列番号５２８を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５４（設計２－Ｐ００１ＬＡ）は、配列番号５２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５４（設計２－Ｐ００１ＬＡ）は、配列番号５３０を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５４（設計３－Ｐ００１ＬＦ）は、配列番号５３１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ５４（設計３－Ｐ００１ＬＦ）は、配列番号５３２を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６０（設計１－Ｐ００１ＩＵ）は、配列番号５３３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６０（設計１－Ｐ００１ＩＵ）は、配列番号５３４を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６０（設計２－Ｐ００１ＬＢ）は、配列番号５３５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６０（設計２－Ｐ００１ＬＢ）は、配列番号５３６を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６０（設計３－Ｐ００１ＬＧ）は、配列番号５３７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ６０（設計３－Ｐ００１ＬＧ）は、配列番号５３８を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１０（設計１－Ｐ００１ＩＶ）は、配列番号５３９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１０（設計１－Ｐ００１ＩＶ）は、配列番号５４０を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１０（設計２－Ｐ００１ＬＣ）は、配列番号５４１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１０（設計２－Ｐ００１ＬＣ）は、配列番号５４２を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１０（設計３－Ｐ００１ＬＨ）は、配列番号５４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＦ１１０（設計３－Ｐ００１ＬＨ）は、配列番号５４５を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

例示的なＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合タンパク質（８つのＲｈｏヌクレオチドを標的とする）は、以下の通りである：

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＭ１４タンパク質は、配列番号４０１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＭ１４タンパク質は、配列番号４０２を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

例示的なＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合タンパク質（１６つのＲｈｏヌクレオチドを標的とする）は、以下の通りである：

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＭ１４タンパク質（設計１－Ｐ００１ＪＧ）は、配列番号５４５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＭ１４タンパク質（設計１－Ｐ００１ＪＧ）は、配列番号５４６を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＭ１４タンパク質（設計２－Ｐ００１ＪＢ）は、配列番号５４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＵＭ１４タンパク質（設計２－Ｐ００１ＪＢ）は、配列番号５４８を含むか、またはそれからなる核酸配列にコードされる。

本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質またはそのＲＮＡ結合部分の少なくとも１つは、ＰＰＲタンパク質である。ＰＰＲタンパク質（植物由来のペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）モチーフを有するタンパク質）は、核にコードされており、ＲＮＡレベルのオルガネラ（葉緑体及びミトコンドリア）、切断、翻訳、スプライシング、ＲＮＡ編集、ＲＮＡの安定性に特異的に作用する遺伝子で排他的に制御される。ＰＰＲタンパク質は通常、３５アミノ酸のモチーフであり、ＰＰＲモチーフは、約１０の連続するアミノ酸である構造を有する。ＰＰＲモチーフの組み合わせは、ＲＮＡへの配列選択的結合に使用することができる。ＰＰＲタンパク質は、多くの場合、約１０のリピートドメインのＰＰＲモチーフからなる。ＰＰＲドメインまたはＲＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性であるように構成されてもよい。全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０５８４０４。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の融合タンパク質は、少なくとも２つのＲＮＡ結合ポリペプチド間にリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの１つ以上のリピートを含む。他の実施形態では、リンカーは、非ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリラート、ポリシアノアクリラート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のために多量体化を必要としない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。いくつかの実施形態では、多量体タンパク質複合体は、ＲＮＡ結合タンパク質を含まない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質の少なくとも１つは、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する高い親和性を含まないか、またはそれと選択的に結合しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、２～１３００のアミノ酸（端点を含む）を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の融合タンパク質の少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、さらに、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、ＲＮＡ結合タンパク質のＮ末端に配置される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、タンパク質のＣ末端にＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、さらに、第１のＮＬＳをコードする第１の配列及び第２のＮＬＳをコードする第２の配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳは、ＲＮＡ結合タンパク質のＮ末端に配置される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、タンパク質のＣ末端に第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質は、さらに、ＮＥＳ（核外輸送シグナル）または他のペプチドタグまたは分泌シグナルを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれからなる第２のＲＮＡ結合タンパク質と共に、第１のＲＮＡ結合タンパク質として少なくとも１つのＲＮＡ結合タンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドのＣ末端で、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドと作動可能に構成される。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＡ結合ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドのＮ末端で、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドと作動可能に構成される。例えば、そのような例示的な融合タンパク質の１つは、ＲＮＡｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ１９Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ）がＳｐｙＣａｓ９のＮ末端に位置するように構成されるＥ９９であるが、別の例示的な融合タンパク質Ｅ１００は、ＲＮＡｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ１９Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ）がＳｐｙＣａｓ９のＣ末端に位置するように構成される。別の実施形態では、例示的な融合タンパク質は、配列番号３５８（Ｅ１７とも呼ばれる）のＺＣ３Ｈ１２Ａとして知られるジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである第２のＲＮＡ結合タンパク質に融合されたＰＵＦまたはＰＵＭＢＹベースの第１のＲＮＡ結合タンパク質である。

ベクター
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示の少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示の１つ以上のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示の２つ以上のガイドＲＮＡを含む。一実施形態では、ベクターは、３つのガイドＲＮＡを含む。一実施形態では、ベクターは、４つのガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、さらに、本開示の誘導または非誘導ＲＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、さらに、本開示のＲＮＡ結合融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合タンパク質及び第２のＲＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質及びｇＲＮＡを含むＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合システムは、単一ベクター内にある。特定の実施形態では、単一ベクターは、Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合システムであるＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合システムを含む。一実施形態では、単一ベクターは、ＣａｓＲｘ ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合システムであるＣａｓ１３ｄ ＲＮＡ誘導ＲＮＡ結合システムを含む。別の実施形態では、単一ベクターは、ＺＣ３Ｈ１２Ａなどのヌクレアーゼドメインと融合されたＰＵＦまたはＰＵＭＢＹベースのタンパク質を含む非誘導ＲＮＡ結合システムを含む。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを含み、第２のベクターは、本開示のＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第１のベクターは、本開示の少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のベクターは、本開示の１つ以上のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のベクターは、本開示の２つ以上のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合タンパク質及び第２のＲＮＡ結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターは、同一のベクターまたはベクター血清型である。いくつかの実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターは、同一のベクターまたはベクター血清型ではない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、（ａ）ＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合融合タンパク質及び本開示の治療用置換タンパク質をコードする核酸配列、ならびに、（ｂ）５’末端に、標的ＲＮＡ配列（例えば、標的ＲＮＡ配列を含む病原性ＲＮＡ）にハイブリダイズまたは結合するＲＮＡ配列（またはスペーサー配列）を、及び３’末端に、融合タンパク質のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質に結合または会合することができるＲＮＡ配列（または足場配列）を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、を含む「２成分Ｃａｓ９ベースのＲＮＡ標的化システム」の成分であるか、またはそれからなり、２成分ＲＮＡ標的化システムが、ＰＡＭｍｅｒの非存在下で、細胞内の標的ＲＮＡ（例えば、病原性の標的ＲＮＡ内に含まれる）を認識及び変更する。いくつかの実施形態では、２成分系の配列は、単一ベクター内にある。いくつかの実施形態では、２成分系のスペーサー配列は、１つ以上の機能獲得または喪失変異を含むＲＮＡを標的とする。

ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、例えば、標準的な分子クローニング手法により、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためのベクターに存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスにより運ばれるポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルス（例えば、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自律複製ができ、例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター、ならびに他のベクター、例えば、非エピソーム哺乳動物ベクターは、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。

いくつかの実施形態では、例えば、発現ベクターなどのベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。一般的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態をとる。いくつかの実施形態では、組み換え発現ベクターは、本明細書で提供される核酸、例えば、ＲＮＡ配列またはＲＮＡ配列から発現され得るガイドＲＮＡ、及び宿主細胞内の核酸の発現に適する形態のＣａｓ１３ｄタンパク質をコードする核酸、を含む。組み換え発現ベクターは、１つ以上の制御エレメントを含み、これは、発現されるべき核酸配列と作動可能に連結されている、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択されてもよい。組み換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムで、またはベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞内で、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で、目的のヌクレオチド配列が、制御エレメント（複数可）に連結されることを意味するものとされる。ベクターのある特定の実施形態は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、及び所望の発現レベルなどの要因に依存する。ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物、タンパク質、酵素、それらの変異体形態、その融合タンパク質などの、本明細書に記載の核酸にコードされた融合タンパク質またはペプチドを含む転写物、タンパク質、またはペプチドを産生することができる。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスから単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、複製不能である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、単離されるか、または組み換えである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離または誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２のＡＡＶから単離または誘導された逆方向末端リピート配列またはカプシド配列を含む。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、改変カプシドを含む。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２－Ｔｙｒ変異型ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ２の位置Ｔｙｒ２５２、Ｔｙｒ２７２、Ｔｙｒ２７５、Ｔｙｒ２８１、Ｔｙｒ５０８、Ｔｙｒ６１２、Ｔｙｒ７０４、Ｔｙｒ７２０、Ｔｙｒ７３０、またはＴｙｒ６７３に、表面露出チロシン残基に対応する位置に非チロシンアミノ酸を有するカプシドを含む。全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／１２４７２４も参照のこと。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、操作カプシドを含む。操作カプシドを含むＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ９．７ｍ８、ＡＡＶ２ ２ｔＹＦ、及びＡＡＶ８ Ｙ７３３Ｆを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、複製不能である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、単離または組み換え（ｒＡＡＶ）される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示のベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックスまたはデンドリマーを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組み換え発現システムである。本明細書で使用される場合、「組み換え発現システム」という用語は、組み換えにより形成されたある特定の遺伝物質の発現のための遺伝子構築物を指す。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される発現ベクター、ウイルスベクター、または非ウイルスベクターは、発現制御エレメントを含むが、こられに限定されない。本明細書で使用される「発現制御エレメント」は、遺伝子などのコード配列の発現を制御する任意の配列を指す。例示的な発現制御エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、マイクロＲＮＡ、転写後制御エレメント、ポリアデニル化シグナル配列、及びイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。発現制御エレメントは、例えば、構成的、誘導可能、抑制可能、または組織特異的であってよい。「プロモーター」は、転写の開始及び速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。それは、制御タンパク質及び分子が、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子と結合し得る遺伝エレメントを含有してもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターによる発現制御は、組織特異的である。いくつかの実施形態では、プロモーターによる発現制御は、構成的または遍在的である。非限定例のプロモーターとしては、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６及びＨ１プロモーター、ならびに／または、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ（任意に、ＣＭＶエンハンサーを含む）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター（任意に、ＲＳＶエンハンサーを含む）、ＣＢＡ（ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチン）、ＣＡＧ（ニワトリβアクチンに融合されたハイブリッドＣＭＶエンハンサー）、短縮形ＣＡＧ、Ｃｂｈ（ハイブリッドＣＢＡ）、ＥＦ－１ａ（ヒト伸長因子アルファ－１）またはＥＦＳ（短いイントロンレスＥＦ－１アルファ）、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）、ＵＢＣ（ユビキチンＣ）、ＧＵＳＢ（リゾソーム酵素ベータグルクロニダーゼ）、ＵＣＯＥ（ユビキタスクロマチンオープニングエレメント）、ｈＡＡＴ（アルファ１抗トリプシン）、ＴＢＧ（サイロキシン結合グロブリン）、デスミン、ＭＣＫ（筋肉クレアチンキナーゼ）、Ｃ５－１２（合成筋肉プロモーター）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシン、シナプシン１（ＳＹＮ－１）、オプシン、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＰＤＧＦ－Ａ、ＭｅｃＰ２（メチルＣｐＧ結合タンパク質２）、ＣａＭＫＩＩ（カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）、ｍＧｌｕＲ２（代謝性グルタム受容体２）、ＮＦＬ（ニューロフィラメント軽鎖）、ＮＦＨ（ニューロフィラメントヘビー）、ｎβ２、ＰＰＥ（ラットプレプロエンケファリン）、ＥＮＫ（プレプロエンケファリン）、プレプロエンケファリン－ニューロフィラメントキメラプロモーター、ＥＡＡＴ２（グルタミン酸トランスポーター）、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）、ヒトロドプシンキナーゼプロモーター（ｈＧＲＫ１）、βアクチンプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、及びそれらの組み合わせが挙げられる。「エンハンサー」は、タンパク質を活性化して転写の可能性または頻度を増加させることにより、結合することができるＤＮＡの領域である。非限定例のエンハンサー及び転写後制御エレメントとしては、ＣＭＶエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、ＨＴＬＶ－１のＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント、ＳＶ４０エンハンサー、ウサギβグロビンのエクソン２及びエクソン３間のイントロン配列、ならびにＷＰＲＥが挙げられる。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される発現ベクター、ウイルスベクター、または非ウイルスベクターは、限定されないが、ベクターエレメント、例えば、すなわち、二重または三重または複数のコード領域またはエクソンを有する、「マルチシストロン性」または「ポリシストロン性」または「バイシストロン性」または「トリシストロン性」構築物の構成のためのＩＲＥＳまたは２Ａペプチド部位を含み、そのようなものであるから、ｍＲＮＡから単一構築物の２つ以上のタンパク質を発現する能力を有するであろう。マルチシストロン性ベクターは、同じｍＲＮＡから２つ以上の別々のタンパク質を同時に発現する。マルチシストロン性構成を構築するために最も広く使用される２つの方策は、ＩＲＥＳまたは２Ａ自己切断部位の使用によるものである。「ＩＲＥＳ」は、ポリシストロン性ベクター構築物内で使用される、ウイルス、原核生物、または真核生物起源の内部リボソーム進入部位またはその一部を指す。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、キャップに依存しない方法で、翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。「自己切断ペプチド」または「自己切断ペプチドをコードする配列」または「２Ａ自己切断部位」という用語は、リボソームスキッピングを促進する部位を組み込むために、それにより、単一プロモーターから２つのポリペプチドを生成するために、ベクター構築物内で使用される連結配列を指し、そのような自己切断ペプチドとしては、Ｔ２Ａ及びＰ２Ａペプチド、または自己切断ペプチドをコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、ベクター構成は、例えば、図１、２、または６に示される。別の実施形態では、ベクターの構成は、置換遺伝子の発現を引き起こすプロモーターまたは制御配列と作動可能に連結して、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸の発現を引き起こすプロモーターまたは制御配列を含む。別の実施形態では、ベクター構成は、置換または「硬化」ロドプシンタンパク質をコードする核酸配列の発現を引き起こすオプシンプロモーターなどのプロモーターと作動可能に連結して、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質をコードする核酸の発現を引き起こすロドプシンキナーゼプロモーターなどのプロモーターを含む。別の実施形態では、ベクター構成は、置換または「硬化」ロドプシンタンパク質をコードする核酸配列の発現を引き起こすロドプシンキナーゼプロモーターなどのプロモーターと作動可能に連結して、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質をコードする核酸の発現を引き起こすオプシンプロモーターなどのプロモーターを含む。別の実施形態では、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、ＩＲＥＳまたは２Ａペプチドを介して置換タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルス／レトロウイルスキメラベクター、単純ヘルペスウイルスＩまたはＩＩベクター、パルボウイルスベクター、細網内皮症ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または２つ以上のウイルスベクターの有利な態様を組み込む任意のハイブリッドまたはキメラベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、さらに、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の発現制御エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、さらに、１つ以上の選択可能なマーカーを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、毒性が低い。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、宿主ゲノムに組み込まれず、それにより、挿入型変異導入を引き起こす可能性が低い。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、４．５ｋｂ～４．７５ｋｂの範囲の総ポリヌクレオチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物、システム、方法、及びキットのいずれかで使用され得る例示的なＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ベクター、改変ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、改変ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ２－Ｔｙｒ変異型ベクター、ＡＡＶ３ベクター、改変ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、改変ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、改変ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、改変ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、改変ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、及び改変ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、ＡＡＶ－Ｔｙｒ変異型ベクター、ならびにそれらの任意の組み合わせまたは同等物が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子プラスミドベクター、及び関連プラスミドと併用した導入遺伝子プラスミドベクター（例えば、パッケージングプラスミド、ｒｅｖ発現プラスミド、エンベローププラスミド）、及びウイルスまたはウイルス様の侵入機序を介して細胞に外因性核酸を導入することが可能なレンチウイルスベースの粒子を指し得る。レンチウイルスベクターは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｔｒｏｎｏ Ｄ．（２００２）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｖｉｒｕｓｅｓ ３（２）：１３２－１５９ ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ３０２０１３２を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物、システム、方法、及びキットのいずれかで使用されて得る例示的なレンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、スーティーマンガベイシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ_ＳＭ）ベクター、改変スーティーマンガベイシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ_ＳＭ）ベクター、アフリカミドリザルシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ_ＡＧＭ）ベクター、改変アフリカミドリザルシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ_ＡＧＭ）ベクター、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、改変ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、改変ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、改変ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、改変ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、または改変ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を含み得る。

核酸
本明細書に記載の遺伝子導入及び発現手法で使用される本明細書に開示のノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列が本明細書で提供される。本明細書で提供される配列が、発現産物、ならびに同じ生物学的特性を有するタンパク質を産生する実質的に同一の配列を提供するために使用することができることを、必ずしも明確に記載するとは限らないが、理解されるべきである。これらの「生物学的に同等の」または「生物学的に活性な」または「同等の」ポリペプチドは、本明細書に記載されるように、同等のポリヌクレオチドによりコードされる。それらは、デフォルトの条件下で実行される配列同一性法を使用して比較された場合、参照ポリペプチドと、少なくとも６０％、あるいは少なくとも６５％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％同一の１次アミノ酸配列を有してもよい。特定のポリペプチド配列が、特定の実施形態の例として提供される。同様の電荷を有する代替アミノ酸を有するアミノ酸への配列の改変。さらに、同等のポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、参照ポリヌクレオチドにハイブリダイズするものもしくはその相補体、または、ポリペプチドに関して、ストリンジェントな条件下で、参照コード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドまたはその相補鎖である。あるいは、同等のポリペプチドまたはタンパク質は、同等のポリヌクレオチドから発現されるものである。

本明細書に開示の核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、当該技術分野で周知の手法である。本明細書に開示のいくつかの実施形態では、例えば、配列番号９２をコードする核酸配列（ＣａｓＲｘとして知られるＣａｓ１３ｄ）または配列番号２９８をコードする核酸配列（ＣａｓＲｘとして知られるＣａｓ１３ｄ）などの例示的なＣａｓ配列は、ヒト細胞での発現について、コドン最適化される。コドン最適化は、異なる細胞が特定のコドンの使用法が異なるという事実を指す。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的な存在量のバイアスに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的な存在量と一致するように配列内のコドンを変更することにより、発現を増加させることが可能である。対応するｔＲＮＡが、特定の細胞型でまれであることが知られているコドンを慎重に選択することにより発現を減少させることも可能である。コドン使用量表は、哺乳動物細胞及び他の様々な生物について当該技術分野で既知である。遺伝コードに基づいて、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を生成することができる。いくつかの実施形態では、そのような配列は、宿主または標的細胞、例えば、Ｃａｓタンパク質を発現するために使用される宿主細胞または開示の方法が実施される細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞のような）内の、発現について最適化される。特定の種のコドン選好及びコドン使用表は、特定の種のコドン使用選好を利用するＣａｓタンパク質をコードする単離核酸分子（例えば、対応する野生型タンパク質と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードしたもの）を操作するために使用することができる。例えば、本明細書に開示のＣａｓタンパク質は、目的の特定の生物により優先的に使用されるコドンを有するように設計することができる。一例では、Ｃａｓ核酸配列は、例えば、対応する野生型または元の核酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するもののように、ヒト細胞の発現について最適化される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣａｓタンパク質をコードする単離核酸分子（ベクターの一部であり得る）は、真核細胞での発現についてコドン最適化される少なくとも１つのＣａｓタンパク質コード配列、またはヒト細胞での発現についてコドン最適化された少なくとも１つのＣａｓタンパク質コード配列を含む。一実施形態では、そのようなコドン最適化Ｃａｓコード配列は、対応する野生型または元の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。別の実施形態では、真核細胞コドン最適化核酸配列は、対応する野生型または元のタンパク質と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＣａｓタンパク質をコードする。別の実施形態では、機能的に同等の核酸、例えば、配列が異なるが同じＣａｓタンパク質配列をコードする核酸を含有する様々なクローンを、日常的に生成し得る。コード配列のサイレント変異は、遺伝コードの縮重（すなわち、冗長性）に起因し、それにより、複数のコドンが、同じアミノ酸残基をコードし得る。したがって、例えば、ロイシンは、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧでコードすることができ、セリンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣでコードすることができ、アスパラギンは、ＡＡＴまたはＡＡＣにコードすることができ、アスパラギン酸は、ＧＡＴまたはＧＡＣでコードすることができ、システインは、ＴＧＴまたはＴＧＣでコードすることができ、アラニンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧでコードすることができ、グルタミンは、ＣＡＡまたはＣＡＧでコードすることができ、チロシンは、ＴＡＴまたはＴＡＣでコードすることができ、イソロイシンは、ＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡでコードすることができる。標準遺伝コードを示す表は、様々な情報源で見つけることができる（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３．ｓｕｐ．ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．５ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹを参照）。

「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグスティーン結合により、またはその他の配列特異的な方法で、発生し得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２本鎖、多本鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのより広範なプロセスのステップを構成し得る。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度、約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約０％～約２５％のホルムアミド濃度、及び約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度、約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液濃度、約３０％～約５０％のホルムアミド濃度、及び約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度、約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度、約５５％～約７５％のホルムアミド濃度、及び約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄液、または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分～２４時間であり、１、２、またはそれ以上の洗浄ステップがあり、洗浄インキュベーション時間は、約１、２、または１５分である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を使用するＳＳＣと同等のものを用いることができることが理解される。

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的としたアラインされ得る各配列の位置を比較することにより決定することができる。比較された配列の位置が、同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、分子は、その位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有される一致または相同の位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同の」配列は、本発明の配列の１つと、４０％未満の同一性または２５％未満の同一性を共有する。

細胞
本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の細胞は、原核細胞である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ウシ、マウス、ネコ、ウマ、ブタ、イヌ、サル、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト哺乳動物細胞、例えば、非ヒト霊長類細胞、である。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、生殖系列細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の生殖系列細胞は、ヒト細胞ではない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の胚性幹細胞は、ヒト細胞ではない。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、多能性幹細胞または多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、成体幹細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。

本開示のいくつかの実施形態では、体細胞は、眼細胞である。眼細胞は、角膜上皮細胞、角膜実質細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、水晶体上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、結膜線維芽細胞、非色素繊毛様体上皮細胞、小柱網細胞、眼脈絡膜線維芽細胞、結膜上皮細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、眼細胞は、網膜細胞または角膜細胞である。一実施形態では、網膜細胞は、光受容細胞または網膜色素上皮細胞である。別の実施形態では、網膜細胞は、神経節細胞、アマクリン細胞、双極細胞、水平細胞、ミュラーグリア細胞、桿体細胞、または錐体細胞である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の体細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、Ｔリンパ球（本明細書ではＴ細胞とも呼ばれる）である。本開示の例示的なＴ細胞は、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及びガンマデルタＴ細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、Ｂリンパ球である。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、抗原提示細胞である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の体細胞は、筋細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の筋細胞は、筋芽細胞または筋細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の筋細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、または平滑筋細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の筋細胞は、横紋筋細胞である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の体細胞は、上皮細胞である。いくつかの実施形態では、本開示の上皮細胞は、扁平上皮細胞上皮、立方体細胞上皮、円柱細胞上皮、層状細胞上皮、多列円柱細胞上皮、または移行細胞上皮を形成する。いくつかの実施形態では、本開示の上皮細胞は、限定されないが、松果体、胸腺、下垂体、甲状腺、副腎、アポクリン腺、ホロクリン腺、漏出分泌腺、リンパ腺、粘液腺、及び脂腺を含む腺を形成する。いくつかの実施形態では、本開示の上皮細胞は、限定されないが、肺、脾臓、胃、膵臓、膀胱、腸、腎臓、胆嚢、肝臓、喉頭、または咽頭を含む器官の外面に接触する。いくつかの実施形態では、本開示の上皮細胞は、血管または静脈の外面に接触する。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の体細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、本開示のニューロン細胞は、中枢神経系のニューロンである。いくつかの実施形態では、本開示のニューロン細胞は、脳または脊髄のニューロンである。いくつかの実施形態では、本開示のニューロン細胞は、網膜のニューロンである。いくつかの実施形態では、本開示のニューロン細胞は、脳神経または視神経のニューロンである。いくつかの実施形態では、本開示のニューロン細胞は、末梢神経系のニューロンである。いくつかの実施形態では、本開示のニューロン細胞は、神経膠細胞またはグリア細胞である。いくつかの実施形態では、本開示のグリアは、限定されないが、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、及びミクログリアを含む中枢神経系のグリア細胞である。いくつかの実施形態では、本開示のグリアは、限定されないが、シュワン細胞及び衛星細胞を含む末梢神経系のグリア細胞である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の体細胞は、初代細胞である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の体細胞は、培養細胞である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の体細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕである。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の体細胞は、自己または同種異系である。

使用方法
本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の発現レベルを改変する方法を提供し、方法は、ＲＮＡ分子への、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合融合タンパク質（またはその一部）のうちの１つ以上の結合に適する条件下で、本開示の組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。

本開示は、ＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の活性を改変する方法を提供し、方法は、ＲＮＡ分子への、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）のうちの１つ以上の結合に適する条件下で、本開示の組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含む。

本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の発現レベルを改変する方法を提供し、方法は、ＲＮＡ分子への、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）のうちの１つ以上の結合に適する条件下で、本開示の組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕである。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、本開示のガイドＲＮＡ及び本開示のＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質ならびに本開示の治療用置換タンパク質を含むベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。

本開示は、ＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の活性を改変する方法を提供し、方法は、ＲＮＡ分子への、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）のうちの１つ以上の結合に適する条件下で、本開示の組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕである。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、本開示のガイドＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ配列、ならびに本開示のＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質及び本開示の治療用置換タンパク質をコードする核酸配列、を含むベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。

本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の発現レベルを改変する方法を提供し、方法は、ＲＮＡヌクレアーゼ活性に適する条件下で、本開示の組成物とＲＮＡ分子を接触させることを含み、ＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質は、ＲＮＡ分子の破壊を引き起こす。

本開示は、ＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の活性を改変する方法を提供し、方法は、ＲＮＡヌクレアーゼ活性に適する条件下で、本開示の組成物及びＲＮＡ分子を接触させることを含み、ＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質は、ＲＮＡ分子の破壊を引き起こす。

本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の発現レベルを改変する方法を提供し、方法は、ＲＮＡヌクレアーゼ活性に適する条件下で、本開示の組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を接触させることを含み、ＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質は、ＲＮＡ分子の破壊を引き起こす。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、さらに、標的ＲＮＡを含む病原性ＲＮＡに対応する置換治療用タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕである。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡ、本開示のＲＮＡ結合融合タンパク質、及び本開示の治療用置換タンパク質を含む組成物を含むベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。

本開示は、ＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の活性を改変する方法を提供し、方法は、ＲＮＡヌクレアーゼ活性に適する条件下で、組成物と、ＲＮＡ分子を含む細胞を接触させることを含み、ＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質は、ＲＮＡ分子の破壊を引き起こす。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕである。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ、ならびに本開示のＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質及び治療用置換タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物を含むベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。

本開示は、治療的有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を処置する方法を提供する。

本開示は、治療的有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を処置する方法を提供し、組成物が、本開示のガイドＲＮＡならびに本開示のＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質及び本開示の治療用置換タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物を含むベクターを含み、組成物が、本開示のＲＮＡ分子の病原性標的ＲＮＡまたはＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の発現レベルを（対応する野生型タンパク質の発現レベルと比較して）改変、低減、または減少させ、治療用タンパク質が、病原性ＲＮＡにコードされた機能獲得または喪失変異を置換する。

本開示は、治療的有効量の本開示の組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を処置する方法を提供し、組成物が、本開示のガイドＲＮＡならびに本開示のＲＮＡ結合タンパク質または融合タンパク質及び本開示の治療用置換タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物を含むベクターを含み、組成物が、本開示のＲＮＡ分子の病原性標的ＲＮＡまたはＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の発現レベルを（対応する野生型タンパク質の発現レベルと比較して）改変、低減、または減少させ、治療用タンパク質が、病原性ＲＮＡにコードされた機能獲得または喪失変異を置換する。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、疾患または障害は、ロドプシン発現またはその欠如に関連する疾患または障害を含むが、限定されるものではない。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、網膜変性障害または網膜症である。いくつかの実施形態では、網膜変性障害は、網膜色素変性症である。

網膜色素変性症は、ロドプシン遺伝子の機能獲得または喪失変異により引き起こされた常染色体優性障害である。ロドプシンを発現する桿体視細胞の喪失は、視力の退行性喪失を引き起こす錐体視細胞の喪失につながる。ヒトロドプシン遺伝子の変異は、タンパク質の折り畳み、輸送、及び活性に影響を及ぼし、これは、ほとんどの場合、罹患患者に網膜変性を引き起こす。ヒトオプシン遺伝子（Ｐ２３Ｈ）のコドン２３位での単一の塩基置換も、網膜色素変性症の一般的な原因である。網膜色素変性症は、４０００人に１人の有病率の遺伝性網膜変性症の最も一般的な形態のうちの１つである。疾患は、変異遺伝子に応じた様々な遺伝パターン（常染色体優性、常染色体劣性、及びＸ連鎖）の結果である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害には、遺伝性疾患または障害を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、遺伝性疾患または障害は、単一遺伝子の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、単一遺伝子の疾患もしくは障害は、常染色体優性疾患もしくは障害、常染色体劣性疾患もしくは障害、Ｘ染色体連鎖（Ｘ連鎖）疾患もしくは障害、Ｘ連鎖優性疾患もしくは障害、Ｘ連鎖劣性疾患もしくは障害、Ｙ連鎖疾患もしくは障害、またはミトコンドリア疾患もしくは障害である。いくつかの実施形態では、遺伝性疾患または障害は、複数遺伝子の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、遺伝性疾患または障害は、複数遺伝子の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、単一遺伝子の疾患または障害は、限定されないが、ハンチントン病、１型神経線維腫症、２型神経線維腫症、マルファン症候群、遺伝性非腺腫性結腸直腸癌、遺伝性多発性外骨腫症、フォンヴィレブランド病、及び急性間欠性ポルフィリン症を含む常染色体優性疾患または障害である。いくつかの実施形態では、単一遺伝子の疾患または障害は、限定されないが、白皮症、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、嚢胞性線維症、鎌状赤血球病、テイサックス病、ニーマンピック病、脊髄性筋萎縮症、及びロバーツ症候群を含む常染色体劣性疾患または障害である。いくつかの実施形態では、単一遺伝子の疾患または障害は、限定されないが、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、レット症候群、及び血友病Ａを含むＸ連鎖疾患または障害である。いくつかの実施形態では、単一遺伝子の疾患または障害は、限定されないが、レーバー遺伝性視神経症を含むミトコンドリア障害である。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害は、免疫性の疾患または障害を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫疾患または障害は、限定されないが、Ｂ細胞欠損症、Ｔ細胞欠損症、好中球減少症、無脾症、補体欠損症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、及び医学的介入による免疫抑制（医学的治療の意図したまたは悪影響としての免疫抑制）を含む免疫不全疾患または障害である。いくつかの実施形態では、免疫疾患または障害は、限定されないが、以下を含む自己免疫疾患または障害である：特発性食道拡張症、アジソン病、成人スティル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自律神経異常症、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経ニューロパシー（ＡＭＡＮ）、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグストラウス症候群（ＣＳＳ）または多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、混合性本態性クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート－イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッカハーベルマン病、多発限局性運動性末梢神経炎（ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼内瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、パーソネイジターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、不穏下肢症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ性熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、サザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トローザハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病、ＡＡＴ（アルファ１抗トリプシン欠乏症）、ウェゲナー肉芽腫症、ウィルソン病、１型～５型遺伝性ヘモクロマトーシス、Ｉ型チロシン血症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、Ｉ型～ＶＩＩＩ型糖原病、シトリン欠損症、コレステロールエステル蓄積症、３型進行性家族性肝内胆汁鬱滞症、多発性嚢胞腎、アルストレーム症候群、及び先天性肝線維症。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害は、炎症性疾患または障害を含むが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害には、代謝性疾患または障害を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、代謝性疾患または障害は、先天性代謝異常症に関連する。いくつかの実施形態では、代謝異常に関連する代謝性疾患または障害は、アミノ酸代謝の障害、炭水化物代謝の障害、尿素サイクルの障害または欠陥、有機酸代謝の障害（例えば、有機酸尿症）、脂肪酸酸化及びミトコンドリア代謝の障害、ポルフィリン代謝の障害、プリンまたはピリミジン代謝の障害、ステロイド代謝の障害、ペルオキシソーム機能の障害、リソソーム蓄積障害、ならびに胆汁鬱滞性疾患を含むが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害は、ミトコンドリア病を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア病は、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー病または症候群、ニューロパシー、運動失調、及び網膜色素変性症（ＮＡＲＰ）、カーンズセイヤー症候群（ＫＳＳ）、ピアソン症候群、慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）、ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、ミトコンドリア脳筋症，乳酸アシドーシス，脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ）、及びミトコンドリアエノイルＣｏＡレダクターゼタンパク質関連神経変性症（ＭＥＰＡＮ）を含むが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害は、変性または進行性の疾患または障害を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、変性または進行性の疾患または障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、及び老化を含むが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害は、感染性疾患または障害を含むが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害は、小児または発育異常疾患または障害を含むが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害は、心血管疾患または障害を含むが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、本開示の疾患または障害は、増殖性の疾患または障害を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、増殖性疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（リンパ腫）、原発性ＣＮＳリンパ腫（リンパ腫）、肛門癌、虫垂癌、胃腸カルチノイド腫瘍、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、中枢神経系（脳癌）、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、癌腫、心臓（心臓）腫瘍、胚性腫瘍、胚細胞腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、子宮頸癌、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、大腸癌、頭蓋咽頭癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、胚芽腫、子宮体癌（子宮癌）、上衣腫、食道癌、神経上皮腫（頭頸部癌）、ユーイング肉腫（骨癌）、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、小児眼内黒色腫、眼内黒色腫、網膜芽腫、卵管癌、骨の線維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢癌、胃（胃）癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）、小児消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌、妊娠性絨毛性疾患、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌（頭頸部癌）、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、腎臓（腎細胞）癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌（頭頸部癌）、白血病、口唇及び口腔癌（頭頸部癌）、肝癌、肺癌（非小細胞及び小細胞）、小児肺癌、リンパ腫、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、黒色腫、メルケル細胞癌（皮膚癌）、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌（頭頸部癌）、ＮＵＴ遺伝子変化のある正中線癌、口癌（頭頸部癌）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫（リンパ腫）、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔及び副鼻腔癌（頭頸部癌）、上咽頭癌（頭頸部癌）、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口唇及び口腔癌及び口咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵臓癌、膵臓神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌（頭頸部癌）、褐色細胞腫、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、再発癌、腎細胞（腎臓）がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、小児（軟部組織肉腫）、唾液腺癌（頭頸部癌）、肉腫、小児横紋筋肉腫（軟部組織肉腫）、小児血管腫瘍（軟部組織肉腫）、ユーイング肉腫（骨癌）、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、骨肉腫（骨癌）、子宮肉腫、セザリー症候群、リンパ腫、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、皮膚の扁平上皮癌、扁平上皮癌、胃（胃）癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽喉癌（頭頸部癌）、上咽頭癌、口咽頭癌、下咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、腎細胞癌、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、血管腫瘍（軟部組織肉腫）、外陰部癌、ウィルムス腫瘍、及び他の小児腎臓腫瘍を含むが、これらに限定されない。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、疾患または障害と診断されている。いくつかの実施形態では、本開示の対象は、疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状を呈する。いくつかの実施形態では、対象は、疾患または障害を発症するリスクを予測するバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子変異である。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、女性である。本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、男性である。いくつかの実施形態では、本開示の対象は、２つのＸＸまたはＸＹ染色体を有する。いくつかの実施形態では、本開示の対象は、２つのＸＸまたはＸＹ染色体及びＸまたはＹのいずれかである第３の染色体を有する。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、新生児、乳児、小児、成人、高齢者、または老人である。本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日齢である。本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月齢である。本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、または任意数、または間の部分数の年齢である。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本開示の対象は、非ヒト哺乳動物である。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の対象は、ヒトである。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、治療的有効量は、本開示の組成物の単回用量を含む。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、本開示の組成物の少なくとも１つの用量を含む。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、本開示の組成物の１つ以上の用量を含む。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、治療的有効量は、疾患または障害の徴候または症状を排除する。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低減する。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、治療的有効量は、疾患または障害を排除する。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、治療的有効量は、疾患または障害の発症を予防する。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、疾患または障害の発症を遅らせる。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低減する。いくつかの実施形態では、治療的有効量は、対象の予後を改善する。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象に全身投与される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象に静脈内経路により投与される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象に注射または注入により投与される。

本開示の方法のいくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象に局所投与される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象に、骨内、眼内、脳脊髄内、または脊髄内経路により投与される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、中枢神経系の脳脊髄液に直接投与される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、眼の組織または流体に直接投与され、眼の構造の外側で生物学的利用能を有さない。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象に注射または注入により投与される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、医薬組成物として製剤化される。要約すると、本明細書に開示の使用のための医薬組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、任意に、免疫直交でもある、任意にＡＡＶに含まれる、タンパク質（複数可）またはタンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭化水素、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含んでもよい。本開示の組成物は、例えば、経口、経腸、局所、経皮、鼻腔内、及び／または吸入などの投与経路に対して；例えば、静脈内、筋肉内、軟膜下、髄腔内、線条体内、皮下、皮内、腹腔内、腫瘍内、静脈内、眼内、及び／または非経口投与などの注射または注入を介した投与経路に対して、製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、眼内投与は、網膜下、硝子体内、深部硝子体内、または局所（点眼による）投与を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、網膜下注射は、光受容体及びＲＰＥ（網膜色素上皮）細胞を標的とする。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。

例示的実施形態
実施形態１．ＲＮＡ誘導標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物であって、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含み、前記ＲＮＡ結合ポリペプチドが、ｇＲＮＡ配列により誘導される場合、標的ＲＮＡと結合してそれを切断し、病原性ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡを含み、前記治療用タンパク質が、前記病原性ＲＮＡにコードされた機能獲得または喪失変異の置換である、前記組成物。

あるいは

標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物であって、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含み、前記ＲＮＡ結合ポリペプチドが、標的ＲＮＡと結合してそれを切断し、病原性ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡを含み、前記治療用タンパク質が、前記病原性ＲＮＡにコードされた機能獲得または喪失変異の置換である、前記組成物。

あるいは

標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物であって、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含み、前記ＲＮＡ結合ポリペプチドが、標的ＲＮＡと結合してそれを切断し、病原性ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡを含み、前記病原性ＲＮＡが、１つ以上の機能獲得ロドプシン変異をコードし、前記治療用タンパク質が、機能獲得または喪失ロドプシン変異を置換する野生型ロドプシンまたは「硬化」ロドプシンである、前記組成物。

実施形態２．前記治療用タンパク質が、ロドプシン（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３１（常染色体優性網膜色素変性症）、ＧＲＮ（ＦＴＤ）、ＳＯＤ１（ＡＬＳ）、ＰＭＰ２２（シャルコー・マリー歯病）、ＰＡＢＰＮ１（眼咽頭型筋ジストロフィー）、ＫＣＮＱ４（聴覚損失）、ＣＬＲＮ１（アッシャー症候群）、ＡＰＯＥ２（アルツハイマー病）、ＡＰＯＥ４（アルツハイマー病）、ＢＥＳＴ１（眼疾患）、ＭＹＢＰＣ３（家族性心筋症）、ＴＮＮＴ２（家族性心筋症）、及びＴＮＮＩ３（家族性心筋症）からなる群より選択される、実施形態１の組成物。

実施形態３．前記病原性標的配列が、少なくとも１つの機能獲得または喪失変異を含むか、またはコードする、実施形態１または２の組成物。

実施形態４．前記ｇＲＮＡを含む前記配列が、真核細胞にｇＲＮＡを発現させることができるプロモーターを含む、実施形態１の組成物。

実施形態５．前記真核細胞が、動物細胞である、実施形態４の組成物。

実施形態６．前記動物細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態４の組成物。

実施形態７．前記動物細胞が、ヒト細胞である、実施形態５の組成物。

実施形態８．前記プロモーターが、構成的に活性なプロモーターである、実施形態１～７のいずれか１つの組成物。

実施形態９．前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの発現を引き起こすことができるプロモーターから単離または誘導される、実施形態１～７のいずれか１つの組成物。

実施形態９．前記プロモーターが、Ｕ６プロモーターから単離または誘導される、実施形態９の組成物。

実施形態１０．前記プロモーターが、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を引き起こすことができるプロモーターから単離または誘導される、実施形態１～９のいずれか１つの組成物。

実施形態１１．前記プロモーターが、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リジンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、スレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、またはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離または誘導される、実施形態１０の組成物。

実施形態１２．前記プロモーターが、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離または誘導される、実施形態１１の組成物。

実施形態１３．前記ｇＲＮＡを含む前記配列が、前記標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列を含む、実施形態１～１２のいずれか１つの組成物。

実施形態１４．前記スペーサー配列が、前記標的ＲＮＡ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％、または間の任意の割合の相補性を有する、実施形態１３の組成物。

実施形態１５．前記スペーサー配列が、前記標的ＲＮＡ配列と１００％の相補性を有する、実施形態１４の組成物。

実施形態１６．前記スペーサー配列が、２０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、実施形態１３～１５のいずれか１つの組成物。

実施形態１７．前記スペーサー配列が、２６ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、実施形態１３～１５のいずれか１つの組成物。

実施形態１８．前記ｇＲＮＡを含む前記配列が、第１のＲＮＡ結合タンパク質に特異的に結合するダイレクトリピート（ＤＲ）または足場配列を含む、実施形態１～１７のいずれか１つの組成物。

実施形態２０．前記足場配列が、ステムループ構造を含む、実施形態１８の組成物。

実施形態２１．前記足場配列が、９０ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、実施形態１９または２０の組成物。

実施形態２２．前記足場配列が、９３ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、実施形態１９または２０の組成物。

実施形態２３．前記足場配列が、配列
ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号４０３）
を含む、実施形態２２の組成物。

実施形態２４．前記足場配列が、ステップループ構造を含む、実施形態１９の組成物。

実施形態２５．前記足場配列が、８５ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、実施形態１９の組成物。

実施形態２６．前記足場配列が、配列
ＧＧＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵ
（配列番号４０４）
を含む、実施形態２５の組成物。

実施形態２７．前記ｇＲＮＡを含む前記配列が、前記第１のＲＮＡ結合タンパク質に特異的に結合するＤＲ配列を含む、実施形態１９の組成物。

実施形態２８．前記ＤＲ配列が、ステムループ構造を含む、実施形態２７の組成物。

実施形態２９．前記ＤＲ配列が、約２０～３６ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、実施形態２７の組成物。

実施形態３０．前記足場配列が、３０～３２ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、実施形態２７の組成物。

実施形態３１．前記ＤＲ配列が、
ＡＡＣＣＣＣＴＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＣ（配列番号４６１）
を含むヌクレオチド配列を含む、実施形態２７の組成物。

実施形態３２．前記ｇＲＮＡが、前記ＲＮＡ分子内の第２の配列に結合しないか、または選択的に結合しない、実施形態１～３１のいずれか１つの組成物。

実施形態３３．ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームが、前記ＲＮＡ分子を含む、実施形態３２の組成物。

実施形態３４．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、実施形態１～３３のいずれか１つの組成物。

実施形態３５．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である、実施形態３４の組成物。

実施形態３６．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合部分を含む、実施形態３５の組成物。

実施形態３７．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である、実施形態３４の組成物。

実施形態３８．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｃｐｆ１ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合部分を含む、実施形態３４の組成物。

実施形態３９．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である、実施形態３４の組成物。

実施形態４０．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｃａｓ１３ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合部分を含む、実施形態３９の組成物。

実施形態４１．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、実施形態３４～４０のいずれか１つの組成物。

実施形態４２．前記天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性が、低減するか、または阻害される、実施形態４１の組成物。

実施形態４３．前記天然のＲＮＡヌクレアーゼ活性が、増加するか、または誘導される、実施形態４１の組成物。

実施形態４４．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、天然のＤＮＡヌクレアーゼ活性を含み、前記天然ＤＮＡヌクレアーゼ活性が、阻害され、不活性であり、及び／または死滅した（例えば、ｄＣａｓ）、実施形態３４～４３のいずれか１つの組成物。

実施形態４５．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、変異を含む、実施形態３４の組成物。

実施形態４６．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインが、変異を含む、実施形態４５の組成物。

実施形態４７．前記変異が、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする核酸で生じる、実施形態４５の組成物。

実施形態４８．前記変異が、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸で生じる、実施形態４５の組成物。

実施形態４９．前記変異が、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む、実施形態４５～４８のいずれか１つの組成物。

実施形態５０．前記変異が、ヌクレアーゼドメイン、前記ヌクレアーゼドメイン内の結合部位、前記ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、または前記ヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む、実施形態４５～４９のいずれか１つの組成物。

実施形態５１．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｐｕｍｉｌｉｏ及びＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む、実施形態２～３のいずれか１つの組成物。

実施形態５２．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｐｕｍｉｌｉｏベースのアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む、実施形態５１の組成物。

実施形態５３．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、ＲＮＡ結合活性のために多量体化を必要としない、実施形態５１～５２のいずれか１つの組成物。

実施形態５４．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、多量体複合体の単量体ではない、実施形態５３の組成物。

実施形態５５．多量体タンパク質複合体が、前記第１のＲＮＡ結合タンパク質を含まない、実施形態５４の組成物。

実施形態５６．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、前記ＲＮＡ分子内の病原性標的配列に選択的に結合する、実施形態１～５５のいずれか１つの組成物。

実施形態５７．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、前記ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない、実施形態５６の組成物。

実施形態５８．ＲＮＡ結合タンパク質が、前記ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する高い親和性を含まないか、またはそれに選択的に結合しない、実施形態５６または５７の組成物。

実施形態５９．ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームが、前記ＲＮＡ分子を含む、実施形態５８の組成物。

実施形態６０．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、２～１３００アミノ酸（端点を含む）を含む、実施形態１～５９のいずれか１つの組成物。

実施形態６１．前記ＲＮＡ結合タンパク質をコードする前記配列が、さらに、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列を含む、実施形態１～６０のいずれか１つの組成物。

実施形態６２．核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする前記配列が、前記第１のＲＮＡ結合タンパク質をコードする前記配列の３’側に配置される、実施形態６１の組成物。

実施形態６３．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、前記タンパク質のＣ末端にＮＬＳを含む、実施形態６２の組成物。

実施形態６４．前記ＲＮＡ結合タンパク質をコードする前記配列が、さらに、第１のＮＬＳをコードする第１の配列及び第２のＮＬＳをコードする第２の配列を含む、実施形態１～６３のいずれか１つの組成物。

実施形態６５．前記第１のＮＬＳまたは前記第２のＮＬＳをコードする前記配列が、前記ＲＮＡ結合タンパク質をコードする前記配列の３’側に配置される、実施形態６４の組成物。

実施形態６６．前記ＲＮＡ結合タンパク質が、前記タンパク質のＣ末端に前記第１のＮＬＳまたは前記第２のＮＬＳを含む、実施形態６５の組成物。

実施形態６７．前記第２のＲＮＡ結合タンパク質が、ヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれからなる、実施形態１～６６のいずれか１つの組成物。

実施形態６８．組成物であって、１）（ａ）第１のＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部をコードする配列、及び（ｂ）第２のＲＮＡ結合ポリペプチドをコードする配列を含む、標的ＲＮＡ結合融合タンパク質であって、前記第１のＲＮＡ結合ポリペプチドが、ｇＲＮＡ配列により誘導されない病原性標的ＲＮＡと結合し、前記第２のＲＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む、前記標的ＲＮＡ結合融合タンパク質、ならびに、２）治療用置換タンパク質であって、前記治療用置換タンパク質が、前記病原性標的ＲＮＡにコードされた少なくとも１つの機能獲得または喪失変異を含む対応する遺伝子を置換する、前記治療用置換タンパク質をコードする配列を含む、前記組成物。

実施形態６９．前記第１のＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部が、ＰＵＦ、ＰＵＭＢＹ、もしくはＰＰＲポリペプチドまたはその一部である、実施形態６８の組成物。

実施形態７０．病原性ＲＮＡ分子または前記ＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の発現のレベルを改変するための方法であって、前記方法が、前記ＲＮＡ分子への前記ＲＮＡ結合タンパク質またはその一部の結合に適する条件下で、実施形態１、２、３、または６８の組成物と、前記ＲＮＡ分子を接触させることを含む、前記方法。

実施形態７１．本明細書に開示のＲＮＡ標的ノックダウン及び置換組成物または本明細書に開示のＲＮＡ標的ノックダウン及び置換組成物を含むベクターを製造する方法。

実施例１：標的ｍＲＮＡのＲＮＡ誘導切断
エフェクターヌクレアーゼを用いて及び用いずに、様々なＲＮＡ標的タンパク質を構築した。ＲＮＡ標的化タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、またはＰＵＦもしくはＰｕｍｂｙタンパク質として既知の操作ＲＮＡ結合タンパク質のいずれかである（図１Ａ～１Ｅ）。ＲＮＡ誘導標的化ＲＮＡ結合タンパク質をコードするプラスミドが、例えば、ＳＯＤ１、ヒトロドプシン、ＰＲＰＦ３、ＰＭＰ２２、ＰＡＢＰＮ１、ＫＣＮＱ４、ＣＬＲＮ１、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ４、ＢＥＳＴ１、ＭＹＢＰＣ３、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮ１３をコードする遺伝子、もしくはその他の遺伝子、または疾患を引き起こすか、もしくは障害をもたらす変異遺伝子において、標的ＲＮＡ配列を標的とする対応するガイドＲＮＡをコードするプラスミドで同時トランスフェクトされる。標的ＲＮＡに特異的な例示的なガイドＲＮＡスペーサー配列を使用して、プラスミド及びベクターを設計した。ＲＨＯ、ＳＯＤ１、ＰＭＰ２２、ＰＡＢＰＮ１、ＫＣＮＱ４、ＣＬＲＮ１、ＡＰＯＥ２、ＴＮＮＩ３、ＢＥＳＴ１、ＭＹＢＰＣ３、及びＴＮＮＴ２を標的とする例示的なｇＲＮＡ配列について、配列番号２５０～配列番号２４９６０を参照のこと。標的ＲＮＡ配列を標的とする対応するガイドＲＮＡをコードするプラスミドで、Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡ誘導標的化ＲＮＡ結合タンパク質をコードするプラスミドを同時トランスフェクトした。ＣａｓＲｘ配列に基づくＣａｓ１３ｄシステムを使用した。ロドプシン標的ＲＮＡを標的とする以下のスペーサー配列を含む３つのｇＲＮＡを構築し、以下のロドプシン標的配列のノックダウンに使用した。ｇＲＮＡは、核酸配列ＡＡＣＣＣＣＴＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＧＡＡＣ（配列番号４６１）を有するＣａｓＲｘ ＤＲ配列を含んでいた。トランスフェクトされた細胞株を、標的ＲＮＡをコードするプラスミドで同時トランスフェクトした。加えて、標的ＲＮＡを天然に発現した細胞株が使用される。標的ＲＮＡのレベルをＲＴ－ＰＣＲで評価した。本発明者らは、ＷＴ ＲＨＯ含有ｍＲＮＡのノックダウンを観察した。

Ｒｈｏ標的化に使用されたスペーサー配列及び標的配列は、表２に詳述されるものである。

実施例２：標的遺伝子の同時ノックダウン及び置換
対応する病原性変異を欠く、標的遺伝子のコドン最適化バージョンを備えた、実施例１に記載のＲＮＡ標的化システムを運ぶベクターを構築した（図２）。得られたベクターは、内因性、変異遺伝子をノックダウンし、野生型コピーと同じ遺伝子の発現を再構成することができる。細胞は、ベクターでトランスフェクトされる。加えて、細胞は、ＲＮＡ標的化システムを含むＡＡＶベクターに感染する（図２）。本発明者らは、細胞内の変異遺伝子のレベル及び再構成された治療置換遺伝子のレベルの両方を評価する（図２）。

実施例３：疾患モデルにおける標的遺伝子の同時ノックダウン及び置換
対応する病原性変異を欠く、標的遺伝子のコドン最適化バージョンを備えた、実施例１に記載のＲＮＡ標的化システムを搭載するベクターを構築した。得られたベクターは、内因性、変異遺伝子をノックダウンし、野生型コピーと同じ遺伝子の発現を再構成することができる。以下の遺伝子のうちの１つの変異コピーを保有するマウスが、上記（括弧内に関連ヒト疾患）のシステムを搭載するＡＡＶベクターで処置される：ロドプシン（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３１（常染色体優性網膜色素変性症）、ＧＲＮ（ＦＴＤ）、ＳＯＤ１（ＡＬＳ）、ＰＭＰ２２（シャルコー・マリー歯病）、ＰＡＢＰＮ１（眼咽頭型筋ジストロフィー）、ＫＣＮＱ４（聴覚損失）、ＣＬＲＮ１（アッシャー症候群）、ＡＰＯＥ２（アルツハイマー病）、ＡＰＯＥ４（アルツハイマー病）、ＢＥＳＴ１（眼疾患）、ＭＹＢＰＣ３（家族性心筋症）、ＴＮＮＴ２（家族性心筋症）、及びＴＮＮＩ３（家族性心筋症）。本発明者らは、細胞内の変異遺伝子のレベル及び標的組織における再構成された非変異治療置換遺伝子のレベルでの両方を評価する。本発明者らは、これらの現象が疾患モデルにより調節された状況での機能的／行動的／生理学的変化も評価する。

実施例４：ロドプシンのノックダウン及び置換
ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）により引き起こされたホタルルシフェラーゼの３’ＵＴＲに野生型（ＷＴ）ＲＨＯ ｍＲＮＡ配列を導入することにより、ロドプシン（ＲＨＯ）のノックダウンの検出のために、ｐｍｉｒＧｌｏプラスミド（図３）を使用して、ルシフェラーゼレポーターアッセイを設計した。レポータープラスミドは、正規化の目的でＳＶ４０プロモーターにより引き起こされたウミシイタケルシフェラーゼも発現した。ＲＨＯ ５００ｎｇのノックダウン及び置換のために、リポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、オプシンプロモーターにより引き起こされた「硬化」ロドプシン（ＲＨＯ）オープンリーディングフレーム及びＥＦＳプロモーターにより引き起こされた、切断のために、ＷＴ ＲＨＯ ｍＲＮＡの特定の部位を標的とするＺＣ３Ｈ１２Ａに連結されているＰＵＭＢＹまたはＰＵＦタンパク質（Ｅ１７とも呼ばれる（図４、図５、図６Ａ））を発現する、『ノックダウン及び置換』ＰＵＭ及びＰＵＦ構築物（１つのＰＵＭＢＹ構築物ＰＵＭ１４、以下に記載の異なる最適化されたＰＵＦ配列－ＰＵＦ配列を有する４つのＰＵＦ構築物２６、５４、６０、１１０）を、１００ｎｇのｐｍｉｒＧｌｏレポーターと共に、（製造者のプロトコールに従って）ＣｏｓＭ６細胞にトランスフェクトした。細胞を洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して、ＲＮＡを回収した。ＱｕａｎｔａｂｉｏワンステップＲＴ－ＱＰＣＲキット、Ｂｉｏｒａｄ ｑＰＣＲ装置、及び以下のプライマーセットを使用して、正常及び硬化ロドプシンのためのＲＴ－ＱＰＣＲを実施した：ホタルルシフェラーゼ－順方向：ＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＴＡＧ（配列番号４１０）、逆方向：ＣＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＴＣＧＴＴＡＧ（配列番号４１１）、ウミシイタケルシフェラーゼ－順方向：ＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号４１２）、逆方向：ＴＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＧ（配列番号４１３）、硬化ＲＨＯ－順方向：ＡＣＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴ（配列番号４１４）逆方向：ＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡ（配列番号４１５）。トランスフェクションのコントロールに使用される、ＷＴ ＲＨＯ ｍＲＮＡノックダウンで正規化されたウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡの発現の尺度として、ホタルルシフェラーゼ発現を使用した。硬化ロドプシン発現は、ＧＡＰＤＨに正規化し、置換の尺度であった。本発明者らのノックダウン及び置換ベクターが、ｍＲＮＡを含有するＷＴ ＲＨＯをノックダウンし、ホタルルシフェラーゼの発現を減少させることができるが、これの硬化ＲＨＯレベルの同時発現を持続したことを、本発明者らは観察した。（図６Ｂ～Ｃ及び７Ａ～Ｂ）。

以下の配列は、上記の参照プラスミドのノックダウンモジュールに存在する。

元のＰＵＦ２６アミノ酸配列：
MGRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGHIMEFSQDQHGSRFIRLKLERATPAERQLVFNEILQAAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRGHVLSLALQMYGSRVIEKALEFIPSDQQNEMVRELDGHVLKCVKDQNGSYVVRKCIECVQPQSLQFIIDAFKGQVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQHTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGNVLVLSQHKFASYVVRKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHSALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRPHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号３９３）

ＰＵＦ２６の最適化（ホモサピエンス（ヒト）の場合）配列
Ａ２８５ Ｔ２０５ Ｃ２８６ Ｇ２９２｜ＧＣ％：５４．１２％｜長さ：１０６８
ATGGGAAGGAGCAGACTCCTCGAGGACTTTAGGAACAATAGATACCCCAACCTCCAGCTGAGAGAAATCGCCGGCCACATCATGGAGTTCAGCCAAGACCAGCACGGATCTAGATTCATTAGGCTGAAGCTCGAGAGAGCTACACCCGCCGAGAGGCAACTGGTGTTCAATGAGATTCTGCAAGCCGCCTACCAGCTCATGGTCGACGTCTTCGGAAACTACGTGATCCAGAAGTTCTTCGAGTTCGGATCTCTGGAGCAGAAACTCGCTCTGGCTGAGAGGATCAGAGGCCATGTGCTGTCTCTGGCTCTCCAGATGTACGGCTCTAGAGTGATCGAGAAAGCCCTCGAGTTCATCCCCTCCGACCAACAGAATGAGATGGTGAGGGAGCTGGACGGCCACGTGCTGAAATGTGTGAAGGACCAGAACGGCTCCTACGTCGTGAGAAAGTGCATTGAGTGCGTGCAGCCCCAGAGCCTCCAGTTTATCATCGACGCCTTCAAGGGCCAAGTGTTCGCTCTCAGCACCCATCCTTACGGCTGTAGAGTCATCCAGAGAATTCTGGAGCATTGCCTCCCCGACCAGACACTGCCTATTCTCGAGGAGCTCCATCAGCATACCGAGCAACTCGTCCAAGACCAGTACGGCAACTACGTGATTCAGCATGTGCTGGAGCATGGCAGACCCGAGGACAAGAGCAAGATCGTGGCTGAGATCAGAGGCAATGTGCTGGTGCTGAGCCAGCACAAATTCGCCAGCTATGTGGTGAGGAAGTGTGTGACACACGCCTCTAGAACAGAGAGGGCTGTGCTCATCGATGAGGTGTGCACCATGAACGATGGCCCTCACAGCGCTCTGTACACCATGATGAAGGACCAGTACGCCAACTACGTGGTGCAGAAAATGATCGACGTGGCTGAGCCCGGCCAGAGGAAAATCGTGATGCACAAGATCAGACCTCATATCGCCACCCTCAGAAAGTACACCTATGGCAAACACATTCTGGCCAAGCTCGAGAAGTACTACATGAAAAATGGCGTCGATCTGGGC
（配列番号３９４）

ＰＵＦ５４の元の配列
MGRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGHIMEFSQDQHGNRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQAAYQLMVDVFGSYVIEKFFEFGSLEQKLALAERIRGHVLSLALQMYGSRVIEKALEFIPSDQQNEMVRELDGHVLKCVKDQNGNYVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKGQVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQHTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGNVLVLSQHKFASYVVRKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHSALYTMMKDQYASYVVRKMIDVAEPGQRKIVMHKIRPHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号３９５）

ＰＵＦ５４の最適化（ホモサピエンス（ヒト）の場合）配列
Ａ２９０ Ｔ１９４ Ｃ２８５ Ｇ２９９｜ＧＣ％：５４．６８％｜長さ：１０６８
ATGGGAAGATCCAGACTGCTGGAGGACTTTAGAAACAATAGGTACCCCAATCTGCAGCTGAGAGAGATCGCCGGCCACATCATGGAATTCAGCCAAGACCAGCACGGCAATAGATTCATCCAGCTGAAGCTCGAGAGGGCTACACCCGCTGAGAGGCAGCTGGTCTTCAACGAGATTCTGCAAGCCGCCTATCAACTGATGGTGGACGTGTTCGGCAGCTATGTGATCGAGAAGTTCTTCGAATTCGGCTCTCTGGAACAGAAGCTGGCTCTGGCCGAGAGGATCAGAGGCCATGTGCTGTCTCTGGCTCTGCAGATGTACGGCTCTAGAGTCATCGAGAAGGCCCTCGAGTTCATCCCCTCCGACCAACAGAACGAGATGGTGAGGGAGCTGGACGGACACGTGCTGAAGTGCGTGAAGGACCAGAACGGAAACTACGTCGTCCAGAAGTGCATCGAATGCGTGCAGCCCCAGAGCCTCCAGTTCATTATCGACGCCTTCAAGGGCCAAGTGTTCGCCCTCAGCACACACCCTTACGGAAGCAGAGTGATCGAGAGGATTCTGGAGCACTGTCTGCCCGACCAGACACTGCCTATTCTGGAGGAGCTGCACCAACACACAGAGCAGCTGGTGCAAGACCAGTACGGCAACTATGTCATTCAGCACGTCCTCGAGCATGGCAGACCCGAGGACAAAAGCAAGATCGTCGCCGAAATCAGAGGCAATGTGCTGGTGCTCAGCCAACACAAGTTCGCTTCCTACGTCGTGAGGAAGTGCGTGACACACGCTTCCAGAACAGAGAGAGCCGTGCTCATCGATGAGGTGTGCACCATGAACGATGGCCCTCACAGCGCTCTGTATACCATGATGAAGGACCAATACGCCAGCTATGTGGTGAGAAAGATGATCGACGTGGCTGAACCCGGCCAGAGAAAGATCGTGATGCACAAGATCAGACCCCACATTGCCACACTGAGGAAGTATACCTACGGCAAGCACATTCTGGCCAAGCTCGAGAAGTACTACATGAAGAACGGAGTGGATCTGGGC（配列番号３９６）

ＰＵＦ６０の元の配列
MGRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGHIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQAAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRGHVLSLALQMYGSRVIEKALEFIPSDQQNEMVRELDGHVLKCVKDQNGNYVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKGQVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQHTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGNVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHSALYTMMKDQYASYVVEKMIDVAEPGQRKIVMHKIRPHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号３９７）

ＰＵＦ６０の最適化（ホモサピエンス（ヒト）の場合）配列
Ａ２８８ Ｔ２０１ Ｃ２８１ Ｇ２９８｜ＧＣ％：５４．２１％｜長さ：１０６８
ATGGGAAGATCCAGACTGCTGGAGGACTTTAGAAATAATAGATACCCCAATCTGCAGCTGAGGGAAATCGCTGGCCACATCATGGAGTTCTCCCAAGACCAGCATGGATCTAGATTCATCCAGCTGAAGCTCGAGAGAGCCACCCCCGCCGAAAGGCAGCTCGTCTTCAACGAAATTCTGCAAGCCGCCTACCAACTGATGGTGGATGTGTTTGGCAACTACGTGATCCAGAAGTTCTTCGAATTTGGCAGCCTCGAGCAGAAGCTGGCTCTGGCCGAAAGAATTAGAGGCCATGTGCTGTCTCTGGCCCTCCAGATGTATGGCTCTAGAGTCATCGAAAAGGCTCTGGAGTTCATCCCCTCCGACCAGCAGAACGAGATGGTGAGAGAGCTCGACGGACATGTGCTGAAGTGTGTGAAGGACCAGAACGGCAATTACGTCGTCCAGAAGTGCATCGAGTGCGTGCAGCCCCAGTCTCTGCAGTTTATCATCGACGCCTTCAAGGGCCAAGTGTTCGCTCTGAGCACACACCCTTACGGCAGCAGAGTGATCGAGAGGATTCTGGAACACTGTCTGCCCGACCAGACACTGCCTATTCTGGAGGAGCTGCACCAGCACACAGAGCAGCTGGTGCAAGACCAGTACGGCAACTATGTGATCCAGCATGTGCTGGAGCATGGCAGACCCGAGGACAAGAGCAAGATCGTGGCCGAAATCAGAGGCAACGTGCTGGTGCTGAGCCAGCACAAGTTCGCCTCCAACGTGGTGGAAAAGTGCGTGACCCACGCTTCTAGAACAGAAAGGGCTGTGCTCATCGATGAGGTGTGTACCATGAACGATGGCCCTCACAGCGCTCTGTACACCATGATGAAAGACCAGTACGCCAGCTACGTGGTGGAGAAAATGATCGACGTCGCTGAGCCCGGCCAGAGGAAGATCGTGATGCACAAGATCAGACCCCACATTGCCACACTGAGGAAGTACACCTATGGCAAACACATTCTGGCCAAGCTCGAGAAGTACTACATGAAGAACGGAGTGGATCTGGGC（配列番号３９８）

ＰＵＦ１１０の元の配列
MGRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGHIMEFSQDQHGSRFIELKLERATPAERQLVFNEILQAAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRGHVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDGHVLKCVKDQNGSYVVRKCIECVQPQSLQFIIDAFKGQVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQHTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGNVLVLSQHKFASYVVRKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHSALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRPHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号３９９）

ＰＵＦ１１０の最適化（ホモサピエンス（ヒト）の場合）配列
Ａ２９２ Ｔ１９６ Ｃ２９３ Ｇ２８７｜ＧＣ％：５４．３１％｜長さ：１０６８
ATGGGAAGATCCAGACTGCTGGAGGACTTTAGAAACAATAGGTACCCCAACCTCCAGCTGAGAGAAATCGCCGGCCACATCATGGAGTTCAGCCAAGACCAGCACGGCTCTAGATTTATTGAGCTGAAGCTCGAGAGAGCCACCCCCGCCGAGAGGCAACTGGTGTTCAATGAGATTCTGCAAGCCGCCTACCAGCTCATGGTCGACGTCTTCGGCAACTACGTCATCCAGAAGTTCTTCGAGTTCGGCTCTCTGGAACAGAAGCTGGCTCTGGCCGAGAGGATCAGAGGCCACGTGCTGTCCCTCGCTCTGCAGATGTACGGCTGTAGGGTGATCCAGAAGGCTCTGGAGTTCATCCCTTCCGACCAGCAGAACGAGATGGTGAGAGAGCTGGATGGACACGTGCTGAAATGCGTCAAGGACCAGAACGGCTCCTATGTGGTGAGAAAGTGCATCGAGTGCGTGCAGCCCCAGTCTCTGCAGTTCATCATCGACGCCTTCAAGGGCCAAGTCTTCGCCCTCAGCACACACCCTTACGGAAATAGAGTCATCCAGAGGATTCTGGAACACTGTCTGCCCGACCAGACACTGCCTATTCTGGAGGAGCTGCACCAACACACAGAGCAGCTGGTCCAAGACCAGTATGGCTGCTACGTGATCCAGCACGTGCTGGAGCATGGAAGACCCGAGGATAAGAGCAAGATCGTCGCCGAAATCAGAGGCAATGTGCTGGTGCTCAGCCAACACAAGTTCGCTTCCTACGTCGTGAGGAAATGCGTGACACACGCTTCTAGAACAGAAAGGGCCGTGCTCATCGATGAGGTGTGCACCATGAACGATGGCCCCCACAGCGCTCTGTATACCATGATGAAGGACCAGTACGCCAACTACGTGGTGCAGAAGATGATCGACGTGGCTGAGCCCGGCCAGAGGAAGATTGTGATGCACAAGATTAGGCCCCATATCGCCACACTGAGAAAGTACACCTACGGAAAGCATATCCTCGCCAAGCTCGAGAAGTACTACATGAAGAACGGCGTCGACCTCGGC
（配列番号４００）

ロドプシンを標的とするＰＵＭＢＹ（ＰＵＭ１４）は、以下のアミノ酸配列を含む：
MGRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAHTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGHTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRGPHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLGGR（配列番号４０１）。

ロドプシンを標的とするＰＵＭＢＹ（ＰＵＭ１４）は、以下の核酸配列を含む：
ATGGGCAGAAGCCGGCTGCTGGAAGATTTCCGGAACAACAGATACCCCAACCTGCAGCTGAGAGAGATCGCCCACACAGAGCAGCTGGTGCAGGACCAGTACGGCAACTACGTGATCCAGCATGTGCTGGAACACGGCAGACCCGAGGACAAGTCTAAGATCGTGGCCGAGATCAGAGGCCACACCGAACAGCTCGTCCAGGATCAATACGGCTGTTATGTGATTCAGCACGTCCTCGAGCACGGACGGCCTGAGGATAAGAGCAAAATTGTGGCCGAAATCCGGGGCCATACTGAACAACTGGTTCAGGATCAGTATGGGTCCTATGTGATCCGCCACGTCCTGGAACATGGACGCCCAGAGGACAAAAGCAAGATCGTCGCTGAGATTCGGGGACATACCGAGCAACTCGTCCAAGACCAGTACGGCTGTTACGTGATCCAGCATGTGCTGGAACACGGCAGACCCGAGGACAAGTCTAAGATCGTGGCCGAGATCAGAGGCCACACCGAACAGCTGGTGCAGGACCAGTACGGCAACTATGTGATTCAGCACGTCCTCGAGCACGGACGGCCTGAGGATAAGAGCAAAATTGTGGCCGAAATCCGGGGACACACAGAGCAGCTCGTCCAGGATCAGTATGGCTCCTACGTGATCAGACACGTTTTGGAGCACGGCAGGCCAGAAGATAAGTCCAAGATTGTCGCTGAGATTCGCGGGCATACTGAGCAACTGGTGCAAGATCAATACGGGAATTACGTCATCCAACACGTTCTCGAACATGGAAGGCCAGAGGACAAAAGCAAGATCGTCGCAGAAATTAGGGGCCATACAGAACAACTGGTCCAGGACCAGTACGGCAACTACGTGATCCAGCATGTGCTGGAACACGGCAGACCCGAGGACAAGTCTAAGATCGTGGCCGAGATCAGAGGCCACACCGAACAGCTGGTGCAGGATCAGTACGGCTGTTATGTGATTCAGCACGTCCTCGAGCACGGACGGCCTGAGGATAAGAGCAAAATTGTGGCCGAAATCCGGGGACACACAGAGCAGCTGGTCCAAGACCAGTATGGAAGCTATGTCATCAGGCACGTCCTGGAACATGGACGCCCAGAGGACAAAAGCAAGATCGTCGCTGAGATTCGGGGCCATACTGAGCAGCTCGTTCAGGACCAATACGGGTCTTACGTGATCGAACACGTGTTGGAGCATGGCAGGCCCGAAGATAAGTCCAAAATTGTCGCAGAGATACGCGGCCACACCGAACAGCTGGTGCAGGATCAGTACGGCAGCTACGTGATCGAGCATGTGCTGGAACACGGCAGACCCGAGGACAAGTCTAAGATCGTGGCCGAGATCAGAGGCCACACCGAGCAGCTCGTTCAGGACCAGTATGGCAATTATGTGATCCAGCACGTCCTCGAGCACGGACGGCCTGAGGATAAGAGCAAAATTGTGGCCGAAATCCGGGGACACACAGAGCAACTGGTCCAAGACCAGTACGGCTCCTATGTGATTGAACACGTTCTGGAACATGGACGCCCAGAGGACAAAAGCAAGATCGTCGCTGAGATTCGGGGCCCTCACATTGCCACACTGCGGAAGTACACCTACGGCAAGCACATCCTGGCCAAGCTGGAAAAGTACTACATGAAGAACGGCGTGGACCTCGGCGGCAGA
（配列番号４０２）。

実施例５：追加候補のノックダウン置換スクリーニング
ロドプシン（ＲＨＯ）ノックダウン検出ルシフェラーゼレポーターアッセイは、前の実施例４に記載され、そのように実施された。

追加のＰＵＦ候補は、表４に示される通り詳述された。

参照による組み込み
相互参照または関連する特許または出願を含む、本明細書で引用されるあらゆる文献は、明示的に除外または別途制限されない限り、本明細書により、全体が参照により本明細書に組み込まれる。いずれの文献の引用も、本明細書で開示もしくは具体化された任意の発明に関して先行技術であること、または、それが、単独でもしくは他の任意の参考文献（複数可）と組み合わせて、任意のそのような発明を教示、示唆、もしくは開示すること、を認めるものではない。さらに、この文献中の用語の任意の意味または定義は、参照により組み込まれた文献中の同じ用語の任意の意味または定義と矛盾する限りにおいて、この文献中のその語に割り当てられた意味または定義が、適用されるものとする。

他の実施形態
本開示の特定の実施形態が図示及び記載されたが、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を含む。

Claims (25)

1. 標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物であって、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含み、前記ＲＮＡ結合ポリペプチドが、標的ＲＮＡまたは前記標的ＲＮＡにコードされたタンパク質と結合してそれを切断し、１つ以上の機能獲得または喪失変異を有する病原性タンパク質をコードする病原性ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡを含み、前記治療用タンパク質が、前記病原性タンパク質の置換タンパク質である、前記組成物。
2. 標的ＲＮＡノックダウン及び置換治療薬をコードする核酸配列を含む組成物であって、（ａ）ＲＮＡ結合ポリペプチドまたはその一部、及び（ｂ）治療用タンパク質を含み、前記ＲＮＡ結合ポリペプチドが、標的ロドプシンＲＮＡまたは前記標的ロドプシンＲＮＡにコードされたタンパク質と結合してそれを切断し、１つ以上の機能獲得または喪失ロドプシン変異を有する病原性ロドプシンタンパク質をコードする病原性ロドプシンＲＮＡが、前記標的ロドプシンＲＮＡを含み、前記治療用タンパク質が、野生型ロドプシンタンパク質である、前記組成物。
3. 前記治療用タンパク質が、ロドプシン（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３（網膜色素変性症）、ＰＲＰＦ３１（常染色体優性網膜色素変性症）、ＧＲＮ（ＦＴＤ）、ＳＯＤ１（ＡＬＳ）、ＰＭＰ２２（シャルコー・マリー歯病）、ＰＡＢＰＮ１（眼球咽頭筋ジストロフィー）、ＫＣＮＱ４（難聴）、ＣＬＲＮ１（アッシャー症候群）、ＡＰＯＥ２（アルツハイマー病）、ＡＰＯＥ４（アルツハイマー病）、ＢＥＳＴ１（眼病）、ＭＹＢＰＣ３（家族性心筋症）、ＴＮＮＴ２（家族性心筋症）、及びＴＮＮＩ３（家族性心筋症）からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
4. 前記治療用タンパク質が、ロドプシンである、請求項２または３に記載の組成物。
5. ロドプシンが、ヒトロドプシンである、請求項３または４に記載の組成物。
6. 前記治療ロドプシンが、「硬化」ロドプシンである、請求項４に記載の組成物。
7. 前記ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｐｕｍｉｌｉｏ及びＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む、請求項１または２に記載の組成物。
8. 前記ＲＮＡ結合タンパク質が、Ｐｕｍｉｌｉｏベースのアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む、請求項１または２に記載の組成物。
9. 前記ロドプシン標的ＲＮＡ配列が、
   ＣＡＡＣＧＡＧＴＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＴ（配列番号４６２）、
   ＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡ（配列番号４６３）、またはＣＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴ（配列番号４６４）
   を含む、請求項２に記載の組成物。
10. 前記ロドプシン標的ＲＮＡが、２６８～２７７位にＹＡＳＶＡＦＹＩＦＴ（配列番号４８６）を含むアミノ酸をコードする、請求項９に記載の組成物。
11. 前記「硬化」ロドプシンが、ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣ（配列番号４０６）を含む前記ロドプシン標的ＲＮＡを含まない核酸配列にコードされる、請求項５に記載の組成物。
12. 前記「硬化」ロドプシンが、ＧＣＴＴＣＣＧＴＡＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴ（配列番号４０８）を含む核酸配列にコードされる、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記核酸配列が、少なくとも１つのプロモーターを含む、請求項１または２に記載の組成物。
14. 前記少なくとも１つのプロモーターが、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターである、請求項８に記載の組成物。
15. 前記少なくとも１つのプロモーターが、オプシンプロモーター、ＥＦＳプロモーター、及びその両方からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
16. 前記核酸配列が、２つのプロモーターを含む、請求項１または２に記載の組成物。
17. 請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物を含む、ベクター。
18. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、及びデンドリマーからなる群より選択される、請求項１７に記載のベクター。
19. 請求項１７に記載のベクターを含む、細胞。
20. 前記ＲＮＡ結合ポリペプチドが、第１のＲＮＡ結合ポリペプチドであり、前記核酸配列が、ＲＮＡに会合する方法でＲＮＡに結合する第２のＲＮＡ結合ポリペプチドをコードする、請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
21. 前記第２のＲＮＡ結合ポリペプチドが、それがＲＮＡを切断するようにＲＮＡと会合する、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記第２のＲＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡｓｅ１、ＲＮＡｓｅ４、ＲＮＡｓｅ６、ＲＮＡｓｅ７、ＲＮＡｓｅ８、ＲＮＡｓｅ２、ＲＮＡｓｅ６ＰＬ、ＲＮＡｓｅＬ、ＲＮＡｓｅＴ２、ＲＮＡｓｅ１１、ＲＮＡｓｅＴ２－ｌｉｋｅ、ＮＯＢ１、ＥＮＤＯＶ、ＥＮＤＯＧ、ＥＮＤＯＤ１、ｈＦＥＮ１、ｈＳＬＦＮ１４、ｈＬＡＣＴＢ２、ＡＰＥＸ２、ＡＮＧ、ＨＲＳＰ１２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＩＤＡ、ＰＤＬ６、ＮＴＨＬ、ＫＩＡＡ０３９１、ＡＰＥＸ１、ＡＧＯ２、ＥＸＯＧ、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＥＲＮ２、ＰＥＬＯ、ＹＢＥＹ、ＣＰＳＦ４Ｌ、ｈＣＧ＿２００２７３１、ＥＲＣＣ１、ＲＡＣ１、ＲＡＡ１、ＲＡＢ１、ＤＮＡ２、ＦＬＪ３５２２０、ＦＬＪ１３１７３、ＥＲＣＣ４、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、Ｒｎａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ）、ＴＥＮＭ１、ＴＥＮＭ２、ＲＮＡｓｅＫ、ＴＡＬＥＮ、ＺＮＦ６３８、及びｈＳＭＧ６からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
23. 前記第２のＲＮＡ結合ポリペプチドが、ＺＣ３Ｈ１２Ａである、請求項２２に記載の組成物。
24. 病原性標的ＲＮＡ分子または前記病原性ＲＮＡ分子にコードされたタンパク質の発現レベルを低減させ、前記病原性標的ＲＮＡにより引き起こされた機能獲得または喪失変異を治療用置換タンパク質で置換する方法であって、前記方法が、前記標的ＲＮＡ配列への前記ＲＮＡ結合タンパク質の結合に適する条件下で、請求項１または２に記載の組成物と、標的ＲＮＡ配列を含む前記病原性標的ＲＮＡ分子を接触させることを含み、前記病原性標的ＲＮＡの前記発現レベルが低減し、前記病原性標的ＲＮＡの前記発現が、治療用置換タンパク質の発現と置換される、前記方法。
25. 請求項１に記載の組成物を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

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