JP2000509428A

JP2000509428A - 生体内分解性標的指向性マイクロパーティクル送達システム

Info

Publication number: JP2000509428A
Application number: JP10528169A
Authority: JP
Inventors: ソコル、ケネス、ケー．; チャング、ペレ; クライン、マイケル、エイチ．
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2000-07-25
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: US6228423B1; JP3242118B2; BR9714065A; JP3428972B2; NZ336718A; US20050163745A1; ATE236207T1; JP2002138139A; DE69720516D1; WO1998028357A1; EP0946624B1; CA2275033C; US6623764B1; PT946624E; JP3990303B2; AU729305B2; AU5472198A; EP0946624A1; DK0946624T3; ES2196385T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、高分子と生物学的に活性な物質のマトリックスからなる物質、特に生物学的活性を有する物質の粒状担体を提供する。粒状担体は微粒子の形態で、粘膜または非経口的に投与すると、検体の免疫系細胞に物質を効果的に運搬し、免疫反応を誘導することができる。本発明の範囲で、改良が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】生体内分解性標的指向性マイクロパーティクル送達システム発明の分野本発明は、生物活性物質を送達するための生体内分解性マイクロパーティクル（マイクロ粒子）に関し、具体的には、特定の細胞型に対して標的指向性であるようなマイクロパーティクルに関する。関連出願の参照本出願は、１９９６年１２月２０日提出の係属出願中の米国特許第０８／７７０，０５０号の一部継続出願である。発明の背景長年、ヒトおよび動物を様々な感染症から守るためにワクチンが用いられてきた。このような従来型のワクチンは、弱毒化病原体（例えば、ポリオウイルス）、不活化病原体（例えば、百日咳菌）、または病原体の免疫原性成分（例えば、ジフテリアトキソイドおよびＢ型肝炎表面抗原）から構成される。免疫原性が高く、単独で防御免疫応答を引き起こすことができる抗原もある。しかし、他の抗原は、防御免疫応答を誘導できないか、弱い免疫応答しか誘導しない。抗原をアジュバントと同時投与すると、弱い免疫原性抗原の免疫応答を著しく促進することができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を促進するが、それ自体が免疫原性であるとは限らない。アジュバントは、抗原を投与部位近傍の局所に維持することにより、免疫システムの細胞に対する、ゆっくりと持続する抗原の放出を容易にする貯蔵効果を生み出すことができる。アジュバントは、抗原貯蔵に免疫システムの細胞を引きつけ、これらの細胞を刺激して免疫応答を引き起こすことができる。アジュバントは、非経口的に送達された抗原に対する免疫応答を促進することが確認されている。通常、アジュバントは、ワクチン製剤中で抗原とともに用いられることにより、非経口的免疫感作（筋肉内または皮下）による全身的免疫誘導が得られる。このアプローチは、傷害を受けた皮膚（すなわち、破傷風）を経由して体に接近する感染性試剤に適しているが、この方法で投与される多くのアジュバントの副作用および関連する毒性に起因して遭遇する問題点がある。アルミニウム塩（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）から製剤化されたワクチンだけが、ヒトおよび家畜の予防接種に日常的に用いられている。しかし、これらのアジュバントでさえ、すべての抗原とともに用いるのに適しているわけではなく、注射部位に刺激を引き起こすこともある。注射部位において抗原の免疫原性を安全に促進するアジュバントの開発が必要なことは明らかである。用いられる抗原の性質に特有の他の問題がある。例えば、従来型の不活化ワクチンの大部分は、効果的な免疫感作に複数回の投与を必要とする。弱毒生ワクチンおよび多くの液状不活化ワクチンは、限定された保存条件が必要であるという欠点を持ち、不活化を受けやすい（例えば、熱感受性）。アジュバント不適合性、ｐＨ、緩衝方法および塩の存在に起因して、単一剤形でワクチンを混合することに関連する問題もある。粘膜免疫は、主に腸内、気管支または鼻洗浄液およびその他の外分泌液における分泌型免疫グロブリン（ｓＩｇＡ）の誘導により、誘導される。例えば、非経口のコレラワクチンでは限られた防御作用しか得られないが、一方、最近開発された経口型は非常に有効であることが分かっている（ｒｅｆ．１−本明細書を通じ、種々の参考文献を括弧内に引用し、本発明が関わる技術分野の状況をさらに詳しく説明する。各引用の一覧情報は、本明細書の末尾、請求範囲の直前に示す。これらの参考文献の開示を、参照として本明細書中に援用する）。ヒト志願者による研究から、インフルエンザワクチン経口投与が、鼻粘膜分泌物における分泌型抗インフルエンザ抗体の誘導に有効であることがわかり、このような摂取ワクチンに対しアジュバントとして有効な物質が確認されている。しかし、これらアジュバントの大部分は、摂取ワクチンに対し免疫応答を改善することに関しては、比較的無力である。最近、これらのアジュバントの大部分が、安全で、経口的胃腸管、鼻咽頭−気道および生殖道を経由または眼窩内に投与された抗原に対し、ヒトおよび動物において免疫応答を促進するために有効であることが証明された。しかし、これらの経路を経由する抗原の投与は、通常、免疫応答を引き起こすには無効である。前述の例は、これらの免疫感作法の潜在力を示しているが、これらの経路によって使用するためのワクチン製剤の開発は、様々な理由から遅々としていた。粘膜表面において免疫感作することができないことは、通常、次のように考えられているからである。（ｉ）粘膜表面へ移行する間に存在する酸および／またはタンパク質分解酵素による抗原の分解、（ｉｉ）粘膜上皮に存在する分泌物による抗原の分解、（ｉｉｉ）粘膜上皮からの限られた吸収、（ｉｖ）免疫応答を誘導するために必要な濃度以下に抗原が希釈されること、（ｖ）無効なアジュバントおよび／または送達システム。非経ロワクチン製剤におけるアジュバントの使用、および粘膜部位へワクチンを送達するための適当なシステムの欠如に関連する問題は、様々な経路により投与した場合に有効であって関連する毒性の問題または副作用のない新たな手法の必要性を暗示している。時間とコストを低減し、ヒトの医療において、入手法が制限される発展途上国では極めて重要である患者のコンプライアンスを増す利点もあることから、ヒトおよび動物に単一剤形でワクチン送達を可能にすることも望まれる。これは、これらの国々の幼児にまさに当てはまることである。投与された抗原に対する免疫応答を増すため、坦体を用いて抗原の分解を防ぎ、ｉｎｖｉｖｏにおけるこれらの物質の取り込みを変調させることができる。感受性抗原を捕捉し、破壊、免疫原性の減少または希釈から抗原を守ることができる。坦体を製剤化する方法には、抗原を高分子マトリックス（単一マトリックス）中に分散する、または抗原の周りを高分子物質で被覆することにより外部防御壁（コア−シェル）を得ることが含まれる。製剤プロトコルの操作により、これらの物質の平均サイズを優先して制御することができる。このことは、経口送達を経由する腸管内のパイエル板の特定のＭ−細胞における微粒子の取り込みに重要であることが分かった。米国特許第５，１５１，２６４号は、ＢｉｏＶｅｃｔｅｕｒｓＳｕｐｒａＭｏｌｅｃｕｌａｉｒｓ（ＢＶＳＭ）と名付けられたリン脂質／糖脂質／多糖性質の微粒子坦体について記載している。微粒子坦体は、その層の１つに生物活性を有する様々な分子を運搬することを意図している。しかし、米国特許第５，１５１，２６４号は、免疫感作のための抗原を含む微粒子坦体については記載しておらず、経口的胃腸管、鼻咽頭−気道および尿生殖道を経由する免疫感作、および眼窩内またはその他の粘膜部位における免疫感作のための微粒子坦体について具体的に記載していない。Ｅｌｄｒｉｄｇｅ、他（ｒｅｆ．２および３）は、ＰＬＧまたはＰＬＧＡとして知られているポリラクチド・グリコリド共重合体から製造された生体内分解性マイクロスフェアからのｉｎｖｉｖｏにおける抗原の遅延性放出を観察した。マイクロパーティクルの製剤化に際して抗原をカプセル充填するために多数の他の高分子が用いられており、これらには、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリカプロラクトン、ポリ酸無水物、ポリオルトエステルおよびポリ（α−ヒドロキシ酪酸）が含まれる。米国特許第５，０７５，１０９号は、５０：５０のポリ（ＤＬ−ラクチド・グリコリド）中にトリニトロフェニル化キーホールリンペットヘモシアニンおよびブドウ球菌腸管毒Ｂ抗原のカプセル充填について記載している。ポリ（グリコリド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド・グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド・カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオルトエステル、ポリ（α−ヒドロキシ酪酸）、およびポリ酸無水物などのカプセル充填用の他のポリマーを提案している。カプセル充填された抗原は、胃内挿管法によりマウスに投与され、唾液および腸管分泌液および血清中に顕著な抗原特異的ＩｇＡ抗体の出現をもたらした。この特許に述べられているように、これとは対照的に、同量のカプセル充填しない抗原の経口投与は、試験したいずれの体液中においても、いずれのイソタイプの特異的抗体の誘導に無効であった。ポリ（ＤＬ−ラクチド・グリコリド）マイクロカプセルを用いて、非経口注射によって抗原を投与することもできた。公告されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／０６２８２は、多数の生体付着性マイクロスフェアおよび抗原ワクチン成分を含む送達運搬体について記載している。マイクロスフェアは、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンからなる。この送達運搬体は、鼻粘膜からのワクチン取り込みを具体的に意図している。この送達運搬体はさらに吸収促進剤を含有することができる。通常、防御性重合物質中に抗原をカプセル充填する。米国特許第５，５７１，５３１号は、多糖の固体マトリックスおよびタンパク性物質を含む微粒子担体について記載している。生物活性を有する物質の送達のために官能基の付いたシリコンポリマーをマトリックスに結合させている。抗原の遅延性放出は前述の仕事で明らかになったが、記載の方法によってマイクロパーティクルを製造する場合には困難に遭遇した。生物学的物質を用いる有機溶媒および物理的力に暴露すると変性する可能性もある。方法をスケールアップすることも困難である。さらに、親水性の抗原をカプセル充填するのは非能率的である。このような制限のない改善された担体を提供することが望ましいであろう。具体的には、マイクロパーティクルおよびマイクロスフェアに製剤化でき、抗原を予め選択された配位子に向けるような標的指向性の部分を含む重合物質を提供することが望まれる。これは、免疫システムの細胞に対する途方もない潜在能力を持つであろう。発明の概要本発明は、様々な方法によってマイクロパーティクルおよびマイクロスフェアを製造するのに適した性質を有する新規で有用なポリマーの製造を対象とする。本発明において、現在のプロセッシング法の改変は、カプセル充填の効率に著しい改善をもたらす。本発明は、非経口、経口および鼻内を含む様々な免疫感作経路による抗原、または抗原とアジュバントのカクテルに有用なワクチン送達システムの製作を対象とする。本発明の第１の態様により、下記一般式のバックボーンを有し、約５，０００から約４０，０００の分子量を有するポリマーを含む、新規な生体内分解性、生体適合性のポリマーを提供する。上式で、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は独立に、Ｈ、直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、Ｒ₆は、Ｈ、アミン保護基、スペーサー分枝または生物活性分子種から選択され、Ｘは、ＯまたはＳ基から選択され、およびｘおよびｙは、整数で、ポリマーの少なくとも約９５％がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値をとる。新規なポリマーは、環状ジエステルを含む少なくとも１つのα−ヒドロキシ酸またはその誘導体、および少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸を含む、単量体の共重合によって誘導される。α−ヒドロキシ酸は、一般式Ｒ₁Ｒ₂ＣＯＨＣＯ₂ Ｈを有し、Ｒ₁およびＲ₂基はＨ、直鎖または分枝鎖アルキル基である。α−ヒドロキシ酸は、α−ヒドロキシ酸の混合物、水素であるＲ₁およびＲ₂基を有するα −ヒドロキシ酸、およびＣＨ₃であるＲ₁基およびＨであるＲ₂を有するもう１つのα−ヒドロキシ酸の少なくとも１つの混合物を含むことができる。疑似−α− アミノ酸は、一般式Ｒ₅ＣＨＮＨＲ₆ＣＯ₂Ｈを有し、Ｒ₅基は、ヒドロキシメチルまたはメチルチオール基、およびＲ₆は、アミン保護基である。アミン保護基は、カルボベンジルオキシ、ベンジル、パラメトキシベンジル、ベンジルオキシメトキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルまたは［９−フルオレニルメチルオキシ］カルボニルでよい。通常、α−ヒドロキシ酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシ酪酸から選択される。少なくとも１つの疑似−α− アミノ酸はセリンでよい。本発明の好ましい態様において、ポリマーは、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−Ｚ−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−Ｐ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）である。このポリマーは、直接または側基を介してポリマーに共有結合した細胞生体付着性基、マクロファージ刺激物質、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸および／または保護されたアミノ酸残基などの生物活性部分を含むことができる。好ましい実施形態において、生物活性置換基は、アミノ酸部分のアミノ基または適当なスペーサー分子を介してポリマーと結合する。スペーサー分子は、Ｒ₇ またはＲ₈基が独立に、Ｈ、直鎖または分枝アルキル単位から選択され、式Ｒ₇Ｒ₈ ＣＯＨＣＯ₂Ｈで表されるα−ヒドロキシ酸、およびＲ₉基がヒドロキシメチルまたはメチルチオール基であり、Ｒ₁₀がアミン保護基である、式Ｒ₉ＣＨＮＨＲ₁ ₀ ＣＯ₂Ｈで表されるα−アミノ酸から選択することができる。本発明の別の態様により、本発明は、少なくとも１つのα−ヒドロキシ酸および少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸を共重合させることを含む生体内分解性、生体適合性ポリエステルの製造方法を提供する。本発明の別の態様により、不活性雰囲気条件において少なくとも１つのα−ヒドロキシ酸および少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸のエステル化触媒を含む有機溶媒溶液を調製し、単量体を共重合させて得られるポリマーを単離することを含む、本明細書中に与えられた一般式を有する生体内分解性、生体適合性のポリマーの製造方法を提供する。用いる触媒は２−エチルヘキサン酸第一スズであるのが好ましい。この方法で生成されるポリマーは、固相触媒還元または別法により酢酸溶液中の臭化水素を用いる酸触媒により、さらに脱保護することができる。この方法は、ポリマーをフィルムまたはマイクロパーティクルに成型することを含む。本発明の別の態様により、下記一般式を有し、約５，０００から約４０，０００ドルトンの分子量を有するポリマーを含み、ポリマーを含む担体である、生物活性物質を宿主に送達するための微粒子担体を提供する。上式で、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は独立に、Ｈ、直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、Ｒ₆は、Ｈ、アミン保護基、スペーサー分子または生物活性分子種から選択され、Ｘは、ＯまたはＳ基から選択され、およびｘおよびｙは、整数で、ポリマーの少なくとも約９５％がα−ヒドロキシ酸残基からなるような値をとる。通常、微粒子担体は、約１から１０μＭの粒子径を有する。本発明の別の態様は、少なくとも１つの生物活性物質を宿主に送達するための微粒子担体製造方法であり、その方法は、（ａ）α−ヒドロキシ酸ポリマーまたは共重合体を含む有機溶媒相を、分散または溶解した生物活性物質を含む水性成分と混合し、第１の油中水型乳剤を生成させるステップ、（ｂ）第１の油中水型乳剤水性洗浄相に分散し、第２の水中油中水型乳剤を生成させるステップ、（ｃ）第２の二重エマルションから水を除去し、マイクロスフェアを生成させるステップ、および（ｄ）マイクロスフェアを集め、その中に生物学的物質を捕捉させるステップを含む。本発明の微粒子担体は、担体と混合または担体中に捕捉した生物活性物質を有する組成物として用いることができる。用いる生物学的物質は、免疫応答を引き起こす物質から選択することができる。このような物質には、非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体、Ｄ１５、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ６などのヘモフィルスインフルエンゼタンパク質が含まれる。生物活性物質には、少なくとも１つのインフルエンザウイルスが含まれ、多価または１価のインフルエンザウイルスワクチン、またはインフルエンザウイルス１価タンパク質ワクチンなどのインフルエンザウイルスタンパク質が含まれる。さらに、生物活性物質には、モラクセラカタラーリスのＴｂｐ２タンパク質などの少なくとも１つのモラクセラカタラーリスタンパク質が含まれる。さらに、用いる生物活性物質には、ウレアーゼなどの少なくとも１つのヘリコバクターピロリタンパク質が含まれる。他の生物物質には、タンパク質、タンパク質様物質、細菌、細菌溶解物、ウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス）、ウイルス感染細胞溶解物、ＤＮＡプラスミド、アンチセンスＲＮＡ、ペプチド（例えば、ＣＬＴＢ−３６およびＭ２）、抗原、抗体、薬理学的試剤、抗生物質、炭水化物、脂質、脂質化アミノ酸（例えば、トリパルミトイルシステイン）、糖脂質、ハプテンおよびその組合せおよびその混合物が含まれる。第１の油中水型乳剤はさらに、親油性の少なくとも１つの有機溶媒可溶アジュバントを含むことができる。このような有機溶媒アジュバントは、ＢＡＹＲ１ −００５、トリパルミトイルシステインおよびＤＣ−ｃｈｏｌからなる基選択することができる。親油性部分の存在は、カプセル充填効率を高め、製剤化中の抗原を保護し、従来の製剤より効率よく免疫システムに抗原が存在するように粒子を放出することに役立ち、したがってより効果的なワクチンを提供する。さらに、第１の油中水型乳剤は、ＰＣＰＰなどの重合性の水溶性アジュバント、ＣＴ−Ｘまたはそのサブユニットなどの粘膜アジュバントまたはＬＴといった少なくとも１つの水溶性アジュバントを含むことができる。水溶性アジュバントの存在は、本方法のカプセル充填効率を高め、製剤化中の抗原を保護し、従来の製剤より効率よく免疫システムに抗原が存在するように粒子を放出することに役立ち、それによってより効果的なワクチンを提供する。本発明は、本明細書中で提供される微粒子担体および生理学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物も提供する。この組成物は粘膜または非経口的に投与できる。免疫応答は、局所の抗体応答または血清抗体応答である。本発明のこの態様により、安定微粒子型の制御された、または遅延した放出ワクチン調製物およびそのようなワクチン調製物の製造方法を提供する。粒子はマイクロスフェア的で、生体内分解性ポリマーおよび抗原および／または抗原プラス・アジュバント含有の領域を含む。本発明の利点には、（ａ）完全に生体内分解性および生体適合性マイクロパーティクル製剤化、（ｂ）免疫システムの細胞に対する抗原呈示が容易となり、改善された抗原免疫原性をもたらす、（ｃ）抗原の生物学的利用能を増加させる改善された製剤化条件、が含まれる。本発明の追加の実施形態には、診断測定におけるおよび治療戦略に対する粒子担体の用途が含まれる。図面の簡単な説明図面を参照しての以下の説明により、本発明をさらに理解されるであろう。図１に、本発明の好ましい態様による、乳酸２量体とグリコール酸２量体およびＮ−（カルボベンジルオキシ）−Ｌ−セリンとの開環重合（ＲＯＰ）と、続く脱保護を図式的に示す。図２に、ポリマー中のα−アミノ酸サブユニットの側鎖を介する生物活性部分のポリマーへの結合を図式的に示す。代表的な標的基には、水溶性および循環の場合にはポリ−エチレングリコール（ＰＥＧ）、マクロファージ刺激物質および細胞生体付着性基が含まれる。α−ヒドロキシ酸またはα−アミノ酸から誘導されるスペーサー配位子を組み入れて生物活性配位子の結合を容易にすることができる。図３は、本発明の一実施形態によるマイクロパーティクル製造のために用いるプロセスの詳細を図式的に示す。この図において、Ｈｉｎ−４７は、ヘモフィルスインフルエンゼに由来する非タンパク質分解性組換えタンパク質類似体（米国特許第５，５０６，１３９号に記載）、ＦｌｕＸ３１は、インフルエンザＸ３１株またはＡ−Ｔｅｘａｓ株、ｒＤ−１５は、ヘモフィルスインフルエンゼに由来する組換えタンパク質（ＷＯ９４／１２６４１に記載）、ＰＶＡ＝ポリビニルアルコールである。Ｆｌｕ（トリ）は３価のｆｌｕ、Ｔｂｐ２は、モラクセラカタラーリストランスフェリン結合タンパク質２、およびｒＵｒｅａｓｅは、組換えヘリコバクターピロリウレアーゼである。ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−（Ｚ）−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）マイクロパーティクルをＰＢＳまたは代表的タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体）の存在下で調製した場合の、レーザー回折測定による代表的サイズ分布を図４に示す。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の存在下でポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−（Ｚ）−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）から調製したマイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真を図５に示す。Ｈｉｎ−４７／ＰＢＳなどの代表的抗原／ＰＢＳ混合物の存在下でポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−（Ｚ）−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）から調製したマイクロパーティクルの走査型電子顕微鏡写真を図６に示す。ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中でインキュベートされ３７℃に維持された試料１４ｍｇ（代表的なコアへの充填量は、マイクロパーティクルｍｇあたり２．５から５．７μｇタンパク質の範囲にある）から得られたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中にカプセル充填された非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体の３カ月間のｉｎｖｉｔｒｏにおける放出経過を図７Ａに示す。ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中でインキュベートされ３７℃に維持された試料〜１４ｍｇ（代表的なコアへの充填量は、マイクロパーティクルｍｇあたり２．５から５．７μｇタンパク質の範囲にある）から得られたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中からの非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体の３カ月間の％累積放出を図７Ｂに比較する。種々の免疫感作プロトコルに従ってヘモフィルスインフルエンゼから得られた４７ｋＤａ膜タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体）により皮下（Ｓ．Ｃ．）で免疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧ応答を図８Ａに示す。５匹のマウスからなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれた非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体０．２または０．６μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、１日目および３５日目に免疫感作した。＋１０、＋２４、＋３５、＋４６および＋６０日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｈｉｎ−４７ＩｇＧ抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロトコルに従ってヘモフィルスインフルエンゼから得られた４７ｋＤａ膜タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体）により皮下（Ｓ．Ｃ．）で免疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧ応答を図８Ｂに示す。５匹のマウスからなる群を、ＰＬＧマイクロパーティクルと物理的に混合した非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体０．８または２．５μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、１日目および３５日目に免疫感作した。＋１０、＋２４、＋３５、＋４６および＋６０日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｈｉｎ−４７ＩｇＧ抗体の存在を評価した。図８Ａおよび図８Ｂで説明したように行った試験から＋３５および＋６０日目に得られたプール血液について、血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを図８Ｃに示す。ヘモフィルスインフルエンゼから得られた４７ｋＤａ膜タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体）により胃内（Ｉ．Ｇ．）で免疫感作されたマウスにおけるＩｇＧ血清抗体応答を図９Ａに示す。５匹のマウスからなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれ、またはＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合された非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体４μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ５００μＬにより、１、７、１４および５７日目に免疫感作した。＋１３、＋３５、＋５６および＋７８日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｈｉｎ−４７ＩｇＧ抗体の存在を評価した。図９Ａで説明したように行った試験から＋５６および＋７８日目に得られたプール血液について、血清ＩｇＧ応答サブタイププロフィルを図９Ｂに示す。図９Ａで説明したように行った試験から＋７８日目に得られたプール血液について、血清ＩｇＡ応答を図９Ｃに示す。ヘモフィルスインフルエンゼから得られた４７ｋＤａ膜タンパク質（非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体）およびヘモフィルスインフルエンゼから得られた１１５ｋＤａ膜タンパク質（ｒＤ−１５）の（１：１）カクテルにより鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）で免疫感作されたマウスにおけるＩｇＧ血清抗体応答を図１０Ａに示す。５匹のマウスからなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれ、またはＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合された非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体４μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５μＬにより、１、７、１４および５７日目に免疫感作した。＋１３、＋３５、＋５６および＋７８日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−Ｈｉｎ−４７ＩｇＧ抗体の存在を評価した。図１０Ａで説明したように行った試験から＋５６および＋７８日目に得られたプール血液について、血清ＩｇＧ応答サブタイプ・プロフィルを図１０Ｂに示す。図１０Ａで説明したように行った試験から＋７８日目に得た血液について血清ＩｇＡ応答を図１０Ｃに示す。図１０Ａで説明したように行った試験から＋７８日目に得た血液について肺潅注法ＩｇＧ応答を図１０Ｄに示す。図１０Ａで説明したように行った試験から＋７８日目に得た血液について肺潅注法ｓＩｇＡ応答を図１０Ｅに示す。種々の免疫感作プロトコルによる抗−ＦｌｕＸ３１（すなわち、Ａ型インフルエンザウイルスＸ３１株）ＩｇＧ血清抗体応答を図１１に示す。６匹のマウスからなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたＨＡ１．５μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、皮下（Ｓ．Ｃ．）で１日目に免疫感作した。＋２１および＋３３日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−ＦｌｕＸ−３１１ｇＧ抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロトコルによる抗−ＦｌｕＸ３１（すなわち、Ａ型インフルエンザウイルスＸ３１株）ＩｇＧ血清抗体応答を図１２に示す。６匹のマウスからなる群を、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたＨＡ１．５μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５μＬにより、鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）で１および３４日目に免疫感作した。＋２１、＋３３、＋５７、＋７８および＋９２日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）により抗−ＦｌｕＸ−３１ＩｇＧ抗体の存在を評価した。単回皮下投与後にプールした血清（＋２１および＋４２または＋５７日目）について血球凝集反応阻害抗体検定（すなわち、インフルエンザウイルスＡ−Ｔｅｘａｓ株）応答を図１３に示す。６匹のマウスからなる群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたＨＡ０．３５μｇまたはＨＡ３．５μｇ、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたＨＡ０．３５μｇおよびＢＡＹＲ１ −００５〜２μｇ、またはＨＡ３．５μｇおよびＢＡＹＲ１−００５〜２０μ ｇ、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合されたＨＡ０．３５μｇまたはＨＡ３．５μｇ、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合されたＨＡ０．３５μｇおよびＢＡＹＲ１−００５２μｇ、またはＨＡ３．５μｇおよびＢＡＹＲ１−００５２０μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、皮下（Ｓ．Ｃ．）で１日目に免疫感作した。＋２１および＋４２日目に採取した血清について、赤血球の血球凝集反応阻害を調べた。種々の免疫感作プロトコルによる抗−Ｆｌｕ（３価）ＩｇＧ血清抗体応答（３価ワクチン中に含まれる各インフルエンザウイルス株について；Ａ−Ｔｅｘａｓ（図１４ａ）、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ（図１４ｂ）およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ（図１４Ｃ））を図１４ａからｃに示す。８匹のマウスからなる群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクル、またはＢＡＹＲ１−００５、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰの存在下で製剤化したＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中に取り込んだ合計２．３５μｇのＨＡ（各株から約１／３の特異的ＨＡ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、皮下（Ｓ．Ｃ．）で１日目に免疫感作した。＋２１、＋４２および＋５７日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗−Ｆｌｕ（３価）ＩｇＧ抗体（Ａ−Ｔｅｘａｓ、Ａ／ＪｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇおよびＢ／Ｈａｒｂｉｎ）の存在を評価した。単回皮下投与後の株特異的血球凝集反応阻害抗体検定（すなわち、Ａ−Ｔｅｘａｓ（図１５ａ）、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ（図１５ｂ）およびＢ／Ｈａｒｂｉｎ（図１５ｃ）応答を図１５ａからｃに示す。８匹のマウスからなる群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中に取り込んだ合計２．３５μｇのＨＡ、またはＢＡＹＲ１−００５、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰを一緒にカプセル充填したＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中に取り込んだ合計２．３５μｇのＨＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、皮下（Ｓ．Ｃ．）で１日目に免疫感作した。＋２１、＋４２または＋５７日目に採取した血清について、赤血球の血球凝集反応阻害を評価した。ＰＬＧｐＳ／Ｆ１ｕ（３価）マイクロパーティクル、またはＢＡＹＲ１−００５、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰを一緒にカプセル充填したＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（３価）マイクロパーティクルの単回投与により免疫感作したマウスで行った防御試験の結果を図１６に示す。マウスを同族の生ウイルスでチャレンジし、体重変化および２週間間隔で生存をモニターした。種々の免疫感作プロトコルに従って、モラクセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結合タンパク質により、皮下（Ｓ．Ｃ．）で免疫感作したマウスにおける血清ＩｇＧ抗体応答を図１７ａに示す。５匹のマウスからなる群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込むか、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合するか、またはＡｌｕｍとともに製剤化したｔｂｐ−２０．３ μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、１、２８および４３日目に免疫感作した。＋１４、＋２７、＋４２および＋５５日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗−ｔｂｐ−２ＩｇＧ抗体の存在を評価した。図１７ａで説明したように行った試験から＋５５日目に得られたプール血液について、血清ＩｇＧ抗体サブタイプ応答プロフィルを図１７ｂに示す。モラクセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結合タンパク質（Ｔｂｐ−２）により、鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）で免疫感作したマウスにおけるＩｇＧ血清体応答を図１８に示す。５匹のマウスからなる群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクル中に取り込むか、またはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルと物理的に混合したＴｂｐ−２６μｇを含むｐＨ７．４のＰＢＳ１０μＬまたは５０μＬにより、１、２８および４３日目に免疫感作した。＋１４、＋２７、＋４２および＋５５日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗−Ｔｂｐ−２ＩｇＧ抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロトコルに従って、モラクセラカタラーリスから得られたトランスフェリン結合タンパク質（Ｔｂｐ−２）により、非経口的に免疫感作されたモルモットにおける血清ＩｇＧ抗体応答を図１９に示す。２匹のモルモットからなる群を、１日目にＣＦＡ４００μＬとともに製剤化したＴｂｐ−２５μｇにより筋肉内で免疫感作し、続いて、１４および２８日目にＩＦＡ５００μＬ中で製剤化したＴｂｐ−２５．０μｇにより皮下で免疫感作するか、１、１４および２８日目にＡｌｕｍ５００μＬとともに製剤化したＴｂｐ−２５μｇ、または１および２８日目にＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたＴｂｐ −２５μｇにより免疫感作した。＋４０および＋５６日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗−Ｔｂｐ−２ＩｇＧ抗体の存在を評価した。種々の免疫感作プロトコルに従って、ヘリコバクターピロリから得られた組換えタンパク質ｒＵｒｅａｓｅにより、皮下（Ｓ．Ｃ．）または経口（Ｉ．Ｇ．）で免疫感作されたマウスにおける血清ＩｇＧ抗体サブタイプ応答を図２０に示す。８匹のマウスからなる群を、ＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたｒＵｒｅａｓｅ１０．０μｇ（Ｓ．Ｃ．）または４０．０μｇ（Ｉ．Ｇ．）、またはＰＬＧｐＳマイクロパーティクルに取り込まれたＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＣＴ−Ｘ、ＰＣＰＰまたはＬＴの存在下で製剤化されたｒＵｒｅａｓｅ１０．０μｇ（Ｓ．Ｃ．）または４０．０μｇ（Ｉ．Ｇ．）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ２５０μＬにより、１、２８および５６日目に免疫感作した。＋８５日目に採取した血清について、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗−ｒＵｒｅａｓｅＩｇＧ抗体の存在を評価した。図２０に記載したマウスについて、８５日目のチャレンジ後１カ月の防御試験の結果を図２１ａからｂに示す。ｒＵｒｅａｓｅ活性（皮下または経口経路で免疫感作されたマウスについて）は、マウスを致死させて２４時間後に胃全体の１／４（幽門洞＋胃体部）で測定した。発明の詳細な説明本発明の新規なポリマーは、生体内に存在し、細胞生体付着基、マクロファージ刺激物質、ポリアミノ酸およびα−ヒドロキシ酸およびα−アミノ酸から選択される少なくとも１つのスペーサー分子を介してポリマーと結合するポリエチレングリコールなどの生物活性部分を有する良性代謝物に対して生体適合性、分解性である。このように、新規ポリマーは、官能基を有する。生物活性物質を含むマイクロパーティクルへのプロセッシングに有利な性質を有するポリマーの合成方法も説明するが、生物活性標的基による化学的修飾も可能である。好ましい実施形態において、共重合体は、α−ヒドロキシ酸と疑似−α−アミノ酸の重合によって製造し、およびターポリマー（ｔｅｒｐｏｌｙｍｅｒ）は、２つのα−ヒドロキシ酸と疑似−α−アミノ酸との重合によって製造する。次いで、この共重合体またはターポリマーは、遊離アミノ基との直接の共有結合によるアミノ酸サブユニットを介して生物活性標的配位子により誘導体とされ、さらに適当なスペーサー配位子で誘導化することができる。アミノ酸単量体合成通常、Ｎ−保護セリン（またはシステイン）は光延反応（ｒｅｆ．５）により環化され、４員環ラクトン（またはチオラクトン）が得られる。この変換は、エステル（またはチオエステル）結合を生じる。反応条件に適合するアミノ酸前駆体のアミン部分上の保護が重要である。カルボベンジルオキシ（ＣＢＺまたはＺ）基を用いることが好ましいが、ベンジル（Ｂｎ）、パラ−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｎ）、ベンジルオキシメトキシ（ＢＯＭ）、ｔｅｒｔ −ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）または［９−フルオレニルメチル）オキシ］カルボニル（ＦＭＯＣ）などの他の適当な官能基を用いてもよい。Ｎ−Ｚ−Ｌ−セリンβ−ラクトン単量体の合成は、文献（ｒｅｆ．６）の改良法に基づいた。単量体を含むα−ヒドロキシ酸およびアミノ酸の共重合、およびアミノ酸側鎖の官能基化 α−ヒドロキシ酸単量体の共重合には２つの方法が利用できる。重縮合を介する重合、または溶融（バルク重合）による重合を選択することが可能である。比較的低分子量の物質では、しばしば競争的副反応が伴い、好ましくない副生成物が生じるため、縮合重合には問題のあることが長く知られていた（ｒｅｆ．７および８）。しかし、グリコリドおよびラクチドなどの環状２量体のバルク相からの開環重合（ＲＯＰ）が、様々な触媒の存在下で容易に進行し、好ましくは、オクタン酸第一スズにより高分子量のポリマーを与えることが分かった（ｒｅｆ．９から１５）。ポリ（アミノ酸）（ｒｅｆ．１６、１７および１８）または疑似ポリ（アミノ酸）（ｒｅｆ．６および１９）の調製には多くの方法がある。ポリ−α−ヒドロキシ酸（特に、５０：５０Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのポリマー）およびポリ（アミノ酸）のよく知られた生体内分解性の性質は、α−ヒドロキシ酸ポリマーのバックボーンにアミノ酸を取り込む方法を開発しようとする努力の増加をもたらした（ｒｅｆ．２０から２５）。ラクチドまたはグリコリドなどのα−ヒドロキシ酸サブユニット、およびグリシンまたはリジンなどのα−アミノ酸サブユニットを含む共重合エステルアミドの製造に進歩が見られた（ｒｅｆ．２２、２３および２６）。生体内分解性ポリマーの分解速度、およびグリコリド、ラクチドのホモポリマーまたはこれらの物質の共重合体からのカプセル充填された物質の放出速度は、結晶性の程度、および相対的な疎水性または親水性の程度などといったそれらの分子量および構造に強く影響を受けることが分かった。具体的には、α−ヒドロキシ酸から誘導された高分子量のポリマーから製剤化されたマイクロスフェアは、低分子量の類似体に比べ長時間かかって分解する。同様に、高結晶性物質は、無定形類似体に比べかなりゆっくりした速度で崩壊する。このことは、加水分解に不安定なエステル結合への水の近づきやすさに関連している（ｒｅｆ．２７）。５０％のＤ，Ｌ−ラクチドおよび５０％のグリコリドからなるランダム無定形共重合体は、最も進んだ分解速度を示すことが証明されており（ｒｅｆ．２および３）、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中に浸けた場合、約６週間後に５０重量％が残存する。前述の共重合エステルアミドは半結晶物質であり、カプセル充填された物質が完全に放出された後にも長い間投与部位に滞留する心配もある。カプセル充填された物質が完全に放出された時点または近い時点で分解するポリマーを手にすることは利点があると考え、疑似−α−アミノ酸サブユニットも含むターポリマーに等量のＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドをランダムに取り込む方法を開発した。無定形のターポリマーはフィルムおよびマイクロパーティクルへの加工に十分な機械的強度を保持する一方で、満足のいくポリマー分解速度および捕捉物質の放出速度を示すのではないかということを確かめるために、相対的に中程度の分子量のターポリマーを用いた。Ｎ−保護−Ｌ−セリンラクトンは、エステル結合を含み、エステル交換反応触媒を介して重合させることができる（ｒｅｆ．６）。さらに、ラクチドおよびグリコリドなどの６員環ラクトンは、挿入／配位型触媒／開始剤を用いることにより４員環プロピオラクトンと共重合させることができる（ｒｅｆ．１３）。すべての単量体単位に比較的十分な反応性が達成されるようであれば、Ｓｎ試薬から誘導される触媒などの効率的エステル交換反応触媒が必要となることが予想された。オクタン酸第一スズが介在するグリコリド、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびＮ−Ｚ− Ｌ−セリンラクトンの共重合を用いた。共重合体またはターポリマーのＣＢＺ基の脱保護は、様々な方法で行うことができる。固相触媒還元または酸触媒（ｒｅｆ．２７）が、２つの可能性である（図１）。得られた共重合体またはターポリマーは、図２に示すように、細胞付着性エピトープ、体循環のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）配位子、マクロファージ刺激物質およびポリアミノ酸グラフトなどの標的部分を付け加えることができる。例えば、α−ヒドロキシ酸または疑似−α−アミノ酸ユニットなどのスペーサーユニットを導入し、適当な標的ユニットで誘導化できる。このようにして生成されたポリマーは、約５，０００から約４０，０００ダルトンの分子量を有する。マイクロパーティクルの形成本明細書中で用いるように、「マイクロパーティクル」という用語は、大きさが１ミクロンより大きく生物活性物質の送達に用いる任意の粒子担体を意味する。本明細書中で用いるように、「マイクロスフェア」という用語は、１つまたは複数の活性成分（例えば、抗原、アジュバント、プラスミドＤＮＡ）を含むマイクロパーティクルを意味する。本明細書中に記載するマイクロパーティクル生成方法を例示する流れ図を図３に示す。通常、共重合体（ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ）は、ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトンまたはその混合物などの適合する溶媒中に単独で溶けるか、追加の賦形剤で可溶である。ショ糖、マンノース、トレハロースまたはゼラチンなどの製剤化に含まれる賦形剤は、凍結防止剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）または水解防止剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として役立つ。ＢＡＹＲ１−００５（ＢＡＹ）（ｒｅｆ．２９）またはトリパルミトイルシステイン（ＴＰＣ）（ｒｅｆ．３０）または３ｂ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）（ｒｅｆ．３１）などの既知のアジュバント性を有する他の物質を製剤中に用いてもよい。全量１２ｍＬの１％から２％の共重合体溶液を調製するのが好ましい。この溶液に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）８００μＬ、またはＰＢＳまたは追加の賦形剤を含むことができる他の安定化緩衝液中の抗原溶液（通常１から２ｍｇ／ｍＬの濃度）８００μＬを加える。ポリ［ジ（カルボキシラートフェノキシ）−ホスファゼン］ナトリウム塩、（ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＭＡ）（ＰＣＰＰ）またはコレラトキシンまたはそのサブユニットなどの既知のアジュバント性を有する他の物質を製剤中に用いてもよい。次いで、この混合物を均質化して、油中水型乳剤を生成する。生成したら直ちに、この混合物を、０．５％から１０．０％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、メチルセルロースまたはＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの非イオン性乳剤安定化剤を含む水溶液１００ｍＬに分散させる。この混合物を均質化すると、水中油中水型二重乳剤が生成する。得られた小滴の平均サイズおよび多分散性（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ）は、ＣｏｕｌｔｅｒＬＳ−１００光散乱検出器を用いることによって容易に測定することができる。ＰＢＳまたは抗原／ＰＢＳ混合物をカプセル充填するときの代表的なサイズ分布は、１から２０ミクロンの範囲にある（大部分が１０ミクロン未満のサイズ）。次いで、緩やかに温め、蒸発によってゆっくりと溶媒を除去すると、始めのマイクロスフェアが固化する。溶媒を除去したら直ちに、混合物を遠心分離してマイクロスフェアを集め、脱イオン水で繰り返し洗浄して、残存する乳剤安定化剤を完全に除去する。次いで、マイクロスフェアをドライアイス／アセトン中で凍結し、一昼夜凍結乾燥すると、白色で自由に流動する粉末としてマイクロスフェアが得られる（光散乱測定法による測定および走査型電子顕微鏡写真法によって直接確認したサイズは通常１．０から１２ミクロン）。通常、この粒子は、約１から約５０μＭの粒子径を有する重合性マトリックスを含み、その中には、捕捉された生物活性物質、および場合によって一緒に捕捉されたアジュバントを有するポリマーを含む。重合性マトリックスに導入される生物活性物質およびアジュバントの量は、大きく異なり、全粒子塊の５０重量％まで含むことができる。本発明の様々な実施形態は、医療の分野および特に、ワクチン接種、細菌およびウイルスを含む病原体による感染症の診断および治療の分野で多くの応用が可能であることは、当業者には明らかである。そのような使用についての限定的でない説明を以下に行う。ワクチン調製ある実施形態において、例えば、ワクチンとして用いるのに適当な免疫原性組成物は、本明細書中に開示するマイクロパーティクルから調製することができる。生物活性免疫原性物質を含む免疫原性組成物は、宿主による抗体の産生を含む、投与された宿主による免疫応答を引き起こす。免疫原性組成物は、液体水剤または乳剤などの注射液として調製することができる。マイクロパーティクルは、マイクロパーティクルと適合する生理学的に許容可能な賦形剤と混合することができる。賦形剤には、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびその組合せが含まれる。さらに、ワクチンは、ワクチンの有効性を促進するために湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントなどの追加の物質を含んでもよい。ワクチンは、非経口で、皮下注射または筋肉内注射により投与することができる。あるいは、本発明により生成されたマイクロパーティクルを含む免疫原性組成物は、粘膜表面で免疫応答を引き起こすような方法で送達することができる。したがって、免疫原性組成物は、鼻内、経口（胃内）、頬側または直腸経路により、粘膜表面に投与することができる。経口製剤には、医薬等級のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は、水剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形をとることができる。経口経路で投与された場合に、マイクロパーティクルおよびマイクロパーティタルのコア中に含まれる、またはマイクロパーティクルと物理的に混合されてカプセル充填された物質を胃の酸性から守るために、マイクロパーティクルの投与前、投与と同時、または投与直後に酸中和調製物（重炭酸ナトリウム調製物など）を投与すると有利である。ワクチンは、剤形に適合した方法で、治療上有効で、防御的および免疫原性となるような量で投与する。投与される量は、治療を受ける対象、例えば、抗体を合成し、必要ならば、細胞媒介性の免疫応答を生み出すという対象の免疫システムの能力によって決まる。投与する必要のある生物活性を有するマイクロパーティクルおよび物質の正確な量は、専門家の判断によって決まる。しかし、適当な投与量範囲は当業者によって容易に決定可能であり、数マイクログラムから数ミリグラム程度でよい。初回投与および迫加免疫投与の適当な処方も変化するが、初回投与と、それに続く投与を含むことができる。ワクチンの用法は投与経路で決まるが、ある宿主から他の宿主ヘと変化する。ワクチン製剤化に応用される本発明のポリマーは、ＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなどを用いる新しいワクチン戦略にとっても有用である。マイクロパーティクル担体として、本発明のポリマーは、コアタンパク質またはエンベロープタンパク質などのウイルスの抗原部分のある遺伝子または複数の遺伝子をコードするＤＮＡを含むように調製することができる。ＤＮＡが担体から放出されるにしたがって、宿主細胞は異種ＤＮＡを取り込み、問題の遺伝子を発現し、細胞内で対応するウイルスタンパク質を合成する。有利には、ウイルスタンパク質は、細胞媒介性免疫を引き起こす細胞の主要組織適合性複合体経路に入る。これに比べ、標準的なワクチン抗原は、細胞に取り込まれ、抗体応答を刺激するＭＨＣII クラスシステムによって処理される。ＤＮＡは、すべての関連タンパク質を持たず、複合体ベクターシステムを必要としない裸のＤＮＡの形でよい。所望の遺伝子は、本命書中に記載のマイクロパーティクル中にカプセル充填されたプラスミドなどのベクターに挿入され、哺乳動物の組織中に注射されて遺伝子産生を発現し、免疫応答を引き起こすことができる。本発明のポリマーと組合せてアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることもできる。核酸配列は、タンパク質の産生を阻害する既知のタンパク質に具体的に対応するｍＲＮＡ配列に結合するようにデザインすることができる。本明細書中に記載するマイクロパーティクルを用い、様々な免疫学的疾患ならびに高血圧、心血管疾患およびガンの治療に対する医療戦略としてこのようなアンチセンスヌクレオチド（オリゴヌクレオチドまたは発現したヌクレオチド）を送達することができる。本明細書中で開発したポリマー・マイクロパーティクルの徐放性の特徴は、マイクロパーティクルを用いて薬理学的試剤をゆっくりと連続的に送達するような薬理学の分野における用途も有する。血圧降下剤、鎮痛剤、ステロイド剤および抗生物質などの広範な薬物を本発明によって使用し、徐放薬物送達システムを得ることができる。捕捉または物理的に混合された生物学的試剤を有するフィルム型のポリマーには、外科的移植組織および器具のコーティングとしての用途を持つ。例えば、マイクロパーティクルに取り込まれた抗生物質を有するフィルム状のポリマーを用いて外科的に埋め込まれたカテーテルを被覆し、感染と闘う抗生物質を継続的に徐放することができる。マイクロパーティクル担体は、診断試薬としても有用である。適当な抗体とともに、イメージング試薬をマイクロパーティクルに導入することができる。このようにして、疾患の臨床的経過を確認またはモニターするために罹患組織を標的とし、これをイメージすることができる。マイクロパーティクルとしてのポリマーは、適当な抗体と組み合わせて用いれば診断キットとしての用途も持つ。実施例前述の開示は本発明を一般的に説明するものである。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単に例示目的で記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。付随的な事柄が手段を示唆あるいは伝えることもあるため、変形形態および等価形態の置き換えを企図している。本明細書中で特定の用語を用いたが、このような用語は、説明を意図したもので、限定を目的としたものではない。本開示中で用いるが明確に説明していない化学、有機化学、ポリマー化学、タンパク質生化学および免疫学の方法、およびこれらの実施例は、科学文献に詳しく報告されており、当業者の能力に含まれるものである。実施例１：この実施例は、Ｎ−Ｚ−Ｌ−セリンβ−ラクトンの調製を例示する。このＮ−保護アミノ酸ラクトンの調製は、改良法に基づくもので、Ｎ−保護− α−アミノ酸を反応させて、環化した疑似−α−アミノ酸単量体を得る（ｒｅｆ．６）。すべてのガラス器具は、１２０℃に設定したオーブン中で一昼夜予備乾燥する。使用に先立って、真空デシケータ中で冷却し、乾燥窒素流中１０分間通気する。１Ｌの３頸丸底フラスコに、窒素中でトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ；Ａｌｄｒｉｃｈ；７．８７ｍＬ：５０ｍｍｏｌ；ＦＷ：１７４．１６）を加えた。これに、無水アセトニトリル（ＣＨ₃ＣＮ；Ａｌｄｒｉｃｈ）および無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ；Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液（体積比８５：１５）２００ｍＬを注射器で加え、固体ＴＰＰが溶けるまで撹拌した。この溶液に、アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ；Ａｌｄｒｉｃｈ；７．８７ｍＬ；５０ｍｍｏｌ；ＦＷ：２６２．２９）を注射器で加え、溶液を室温で３０分間撹拌した。反応溶液をアセトニトリル／ドライアイス浴に浸けて溶液を約−４５℃から−４８℃まで冷却した。溶液の内温が約−４５℃に達したら直ちに、Ｎ−カルボベンジルオキシ− Ｌ−セリン（Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−セリン；Ｓｉｇｍａ；１１．９４ｇ；４９．８ｍｍｏｌ；ＦＷ：２３９．２）の無水ＣＨ₃ＣＮ：ＴＨＦ（体積比８５：１５）２００ｍＬ溶液を注射器により１時間以上かけてゆっくり滴下した。添加中は溶液の温度を約−４５℃に維持し、添加が終了すると同時に室温までゆっくりと温め、一昼夜撹拌を継続した。この反応で、ＣＢＺ保護α−アミノ基の存在下に、セリンヒドロキシ側鎖とカルボン酸の間にエステル結合の生成が起きる。反応完了後、蒸発により溶媒を除去した（３５℃から４５℃）。黄色の油／スラリ（〜３５ｇ）が得られる。このスラリに、ジクロロメタン：酢酸エチル（体積比８５：１５）溶液５０ｍＬを加えると、副生成物の１，２−ジカルベトキシヒドラジンの沈殿が生じる。この物質を減圧ろ過により除去し、続いて、蒸発により溶媒を除去した。前記手順を繰り返し、残存する副生成物をさらに除去することができる。次いで、ろう状固体の粗生成物を、溶離液として８５：１５ジクロロメタン：酢酸エチルを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。生成物のセリンラクトンは、薄層クロマトグラフィにより、１ＭＨ₂ＳＯ₄溶液による発色およびＵＶ検出した場合に、この物質が８５：１５ジクロロメタン：酢酸エチルで展開するシリカゲルプレート上で０．７５のＲ_fを有することが確認できる。この生成物を酢酸エチル：ヘキサン（〜１Ｌ）で再結晶し、ろ過して真空乾燥した。再結晶後、融点（Ｔｍ＝１３３〜１３４℃）の純粋な白芭の固体が４０％の収率で得られ、他のすべての物理パラメータ（ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、元素分析）は従来明らかにされたものと一致する（ｒｅｆ．６）。実施例２：本実施例は、図１に示すポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−Ｚ−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）共重合体の調製を例示する。ガラス製器具は一昼夜予備乾燥した。使用に先立って、真空デシケータ中で冷却した。さらに、重合容器（ガラスアンプル）はシリコン被覆（ＳｕｒｆａＳｉｌ：Ｐｉｅｒｃｅ；２％トルエン溶液）されなければならず、すべての転移反応および重合容器への試薬類および単量体の添加は、乾燥窒素環境に保持されたグローブ・ボックス中で行わなければならない。重合に先立ち、Ｄ，Ｌ−ラクチド（２，６−ジメチル−１，４−ジオキサン− ２，５−ジオン；Ａｌｄｒｉｃｈ；ＦＷ：１４４．１３）およびグリコリド（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍ；ＦＷ：１１６．０９６）を、グローブ・ボックス中で無水酢酸エチルから再結晶し、約２日間真空で乾燥した。十分乾燥したら直ちに、直接グローブ・ボックスに入れた実施例１の新たに再結晶したセリンラクトン（０℃で保存）とともに単量体をグローブ・ボックス中に保存できる。すべての単量体および触媒／開始剤を秤量し、グローブ・ボックス中のガラスアンプルに移す。アンプルに移す単量体の総量は１ｇから５ｇの範囲であり、Ｄ，Ｌ−ラクチド：グリコリド：セリンラクトンのモル比は４２．５：４２．５：１５．０から４９．０：４９．０：２．０の範囲である。好ましい実施形態においては、Ｄ，Ｌ −ラクチド：グリコリド：セリンラクトンのモル比、４７．５：４７．５：５．０を用いた。触媒（２−エチルヘキサン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）₂；Ｓｉｇｍａ；ＦＷ：４０５．１、１．２５ｇ／ｍＬ）の無水クロロホルム（Ａｌｄｒｉｃｈ）保存溶液をグローブ・ボックス中で調製し、マイクロシリンジでガラスアンプルに加えた（触媒の単量体に対するモル比＝１／１０００）。アンプル中に撹拌棒を置いた。グリースを付けたすりガラスのジョイントバルブをアンプル上に置き、グローブ・ボックスから取り出している間の不活性環境を維持した。次いで、アンプルを直接真空ラインにつなげ、蒸発によりクロロホルムをゆっくりと除去した。次いで、アンプルを約１２０℃の油浴中においてすべての試薬を溶融状態とし、続いて、火炎密封して、１２０℃に温度制御されたオーブン中に２８時間置いた。反応後、アンプルを液体窒素中に入れてクエンチし、さらに処理するまで−２０℃で保存する。アンプルにひびを入れ、粗製ポリマーをクロロホルムに溶かして回収した。溶媒を蒸発により除去し、粗製ポリマーを真空乾燥すると、黄褐色の結晶性物質が得られた（収率は８０％から９０％）。このポリマーをクロロホルムに溶かし、不溶の物質をろ過により除き、ヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ）で沈殿させることにより精製した。ポリマーをろ過して回収し、この手順を繰り返して、未反応単量体が完全に除去されたことを確認した。２回の沈殿操作の後、ポリマーを約２日間真空乾燥すると、全収率３０％から３５％で純粋な白色の粉末が得られた。この物質の分子量は、反応時間に左右されたが、代表的な値はＭｗ＝１７，０００〜２２，０００、Ｍｎ＝６，５００〜８，０００であった。示差走査熱量計（ＤＳＣ）分析は、ランダム無定形ポリマーを示す単一の転移を示す。ガラス転移（Ｔｇ）は得られた物質の分子量により３９℃から４３℃の範囲にある。ポリマーのセリン含有量は、ポリマーの加水分解によって得られたフェニルチオイソシアネートセリン誘導体の測定に役立つアミノ酸分析（ＡＡＡ）、¹ＨＮＭＲ（グリコリドおよびＤ，Ｌ−ラクチドサブユニットに対するセリンＣＢＺ保護基の芳香族残基の積算）、および元素分析（セリンの側鎖にのみ存在する窒素）により決定した。ＡＡＡ分析は、通常１．７％から２．１％のセリン含有量を示し、¹ＨＮＭＲは、２．０％から２．５％、元素分析は、２．４％から３．４％のセリンをそれぞれ示した。ポリマーのＩＲ分析は、エステル、カーバメートおよびヒドロキシル基の存在を調べるのに役立った。 ¹ＨＮＭＲは、記載した反応条件下におけるすべての単量体成分の相対的取り込み効率の決定を可能にした。精製ポリマーで測定されたＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド：Ｚ−セリンの代表的な比は、再現性よく、それぞれＤ，Ｌ−ラクチド５２．０％から５４．０％、グリコリド４１．０％から４３．５％、Ｚ−セリン２．０％から２．５％であった。グリコリドまたはＤ，Ｌ−ラクチドに独特の共鳴¹ＨＮＭＲおよび¹³ＣＮＭＲシグナル強度は、互いと良く分離し、配列効果にも感度がよかった。観測されたパターンから、ランダム配列分布が支持された。実施例３：本実施例は、図１に示すポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド・疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）共重合体の調製を例示する。すべてのガラス製器具は、一昼夜予備乾燥した。使用に先立って、真空デシケータ中で冷却し、乾燥窒素流で１０分間通気した。すべての反応は乾燥窒素の不活性雰囲気中で行った。撹拌棒を備えた２頸の１００ｍＬ丸底フラスコにポリマー（ＰＬＧｐＺＳ）４００ｍｇを入れた。これに、臭化水素の３０％酢酸溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ：ＦＷ：８０．９２）１０ｍＬを加え、十分にスラリを生成させた。このスラリを３０から４５分間撹拌し、無水ジエチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）と、続いて、無水メタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を滴下してクエンチした。その結果、ポリマー沈殿が生じ、次いで、真空ろ過により単離した。粗製のポリマー沈殿をジエチルエーテルで洗浄し、クロロホルム：ヘキサンから再沈殿させた。精製ポリマーを２日間真空乾燥すると、全収率５０％から６０％で純粋な白色の粉末が得られた。分子量は、Ｍｗ＝１５，０００〜１８，０００、Ｍｎ＝５，０００〜６，５００の範囲にあった。ＣＢＺ基の脱保護速度は、ＨＢｒ／酢酸によるエステルバックボーンの競争的開裂より速かった。しかし、これらの条件の下では、この試薬を用いた結果として、分子量分布の広がり、および生成物の分子量の減少がある。この傾向は、より短時間で反応を行うことによって低減され、またはパラジウム炭素の存在下、水素を用いる水素添加による保護基の除去によりこの傾向を無くすことができる。ＤＳＣ分析は、ランダム無定形ポリマーを示す単一転移を示す。ガラス転移（Ｔｇ）は得られた物質の分子量により４２℃から４５℃の範囲にある。ポリマーのセリン含有量は、ポリマーの加水分解によって得られたフェニ４ルチオイソシアネートセリン誘導体の検出に役立つアミノ酸分析（ＡＡＡ）および元素分析（セリンの側鎖にのみ存在する窒素）により決定した。ＡＡＡ分析は、通常１．４％から１．７％のセリン含有量を示し、元素分析は、２．０％から２．７％のセリンをそれぞれ示した。ポリマーのＩＲ分析は、エステル、アミンおよびヒドロキシル基の存在を検出するのに役立った。残存する保護ポリマーについての¹ＨＮＭＲは、９０％以上のＮ−カルボベンジルオキシ基がうまく除去されたことを示した。より短い反応時間では、脱保護の含有量は並行して減少する。精製ポリマーで測定されたＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド：Ｚ−セリン：セリンの代表的な比は、再現性よく、それぞれＤ，Ｌーラクチド５３．０％から５５．０％、グリコリド４０．０％から４３．０％、Ｚ−セリン０．１５％から０．２５％およびセリン１．７％から２．１％であった。実施例４：本実施例は、実施例２および３において合成されたコポリマーからのフィルムの生成を説明する。フィルムを生成するために、50mgのポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド（PLG）（分子量＝31,000）、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド-コ-シュード-Z-セリンエステル（PLGpZS）（分子量＝20,000）、ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリド-コ -シュード-セリンエステル（PLGpS）（分子量＝19,000）を秤量し、10mLビーカー中に置いた。無水クロロホルム（1mL）を添加して、コポリマーを溶解した。この溶液を濾過し、ペトリディシュ中に置いた顕微鏡スライドに滴下して添加した。次いで、ペトリディッシュを250mLビーカーで覆い、48時間にわたり、ゆっくりと確実にエバポレーションさせた。得られたフィルムは半透明であり、そして角度測定器を用いて行った接触角の測定はそれぞれ、PLGについて75°、PLGpZ Sについて75°、PLGpSについて68.2°の平均値を与えた。従って、PLGおよびPLG pZSコポリマーは疎水性が同等であるが、PLGpsコポリマーはわずかに親水性が高く、表面エネルギーも高いことが判明した。実施例５：本実施例は、PBSまたは抗原／PBSをカプセル化する微粒子形成のプロセスを説明する（ミクロスフェア形成）。本明細書中に記載される微粒子形成のプロセスを説明する流れ図を図３に示す。具体的には、100mgのコポリマーを、12mLのジクロロメタンに添加した。これに、800μＬのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）溶液または800μＬの、PBS中の非タンパク質分解性Hin-47アナログ（典型的に、１〜２mg/mLの濃度）を添加した。次いで、この混合物をホモジナイズした（6,000rpmで20秒間）。この混合物を、形成後、100mLのポリビニルアルコール（PVA）の1.0％水溶液中に分散し、そして即座にホモジナイズして（8,000rpmで40秒間）、水中油中水の二重乳濁液を形成した。PBSまたは典型的な抗原（Hin-47/PBS）をカプセル化物として使用する場合の典型的なサイズ分布を、図４に示す。多分散系の微粒子（大部分が、10ミクロン未満の大きさ）が、これらの条件下で形成された。次いで、エバポレーションにより溶媒をゆっくりと除去し、ミクロスフェアを遠心分離によって回収した。粒子を脱イオン水で洗浄し（５×）、次いでドライアイス／アセトン浴中で凍結し、そして一晩凍結乾燥して、ミクロスフェアの白色の自由に流動する粉末を得た（光走査測定によって決定され、走査電子顕微鏡検査によって直接的に確認されるように、典型的には、1.5〜10ミクロンのサイズ）。PLGpZ SまたはPLGpSミクロスフェアについての代表的な走査電子顕微鏡写真を、図５に示す。PBS中の典型的な抗原（非タンパク質分解性のHin-47アナログ）をカプセル化する、PLGpZSまたはPLGpSミクロスフェアについての代表的な走査電子顕微鏡写真を、図６に示す。上記の方法によって、いくつかの異なる抗原および／または抗原＋アジュバントを含む微粒子が調製された（表１および５を参照のこと）。実施例６：この実施例は、微粒子コアローティング効率、およびこのような微粒子からの抗原エピトープの回復を説明する。同じ方法の２つの改変を用いて、単離された微粒子の抗原含量または「コアローディング」を測定した。アミノ酸解析を、固体粒子の酸加水分解（6M HCl）によるか、または塩基／SDS加水分解（0.1N NaOH/1% SDS）のいずれかによって、次いで0.1N HClでの中和化によって、得られた微粒子の加水分解物に対して行った。あるいは、固体のミクロスフェアは、DMSO（ポリマーおよびタンパク質の両方を可溶化する相溶性の溶媒）中に溶解することができ、アミノ酸解析を、凍結乾燥されたサンプルに対して直接行うことができる。酸または塩基媒介性の加水分解は、最も再現可能な結果（+/-５％）を与える好ましい方法であることを証明した。利用可能な場合、有効な固相酵素免疫検定法（ELISA）ポリクローナルアッセイが加水分解物に対して行われ、エピトープ当量を決定した。具体的には、ELISAによる非タンパク質分解性Hin-47アナログの定量について、非タンパク質分解性Hin-47アナログ抗原を、アフィニティー精製したモルモット抗Hin-47が被覆されたマイクロタイターウェル上に捕獲し（ウエル当たり非タンパク質分解性Hin-47アナログ抗原の２μg/mL溶液の50μＬを添加した）、これをPBS中の５％スキムミルクでブロックした。抗原の呈示を、アフィニティー精製したウサギ抗Hin-47、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼF(abs)2、ロバ抗ウサギIgGによって検出した。テトラメチルベンジジン（TMB）（割合１）の存在下の基質H₂O₂（割合９）を100μＬ添加して、この反応を呈色し、そして２Ｍ硫酸溶液を各ウエルに添加することによって、反応の進行を終結した。色の強度（45 0nmでの読み取り）は、ウエルにおける非タンパク質分解性Hin-47アナログの量に正比例した。各試験サンプルにおける非タンパク質分解性Hin-47アナログの濃度は、参照サンプルの倍数希釈によって得られる標準曲線からの外挿によって得られた。全てのサンプルを、二連で分析した。 PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内に非タンパク質分解性Hin-47アナログまたは非タンパク質分解性Hin-47アナログ＋BAY R1-005をカプセル化する微粒子に対するエピトープ回復の、コアローディングについてのアミノ酸解析、および Hin-47特異的ポリクローナルELISA分析を、表２に示す。Hin-47から単独で調製された微粒子についてのコアローディングは、20％〜43％の範囲であり、10％〜 31％のエピトープが、処方の間に保存された。BAY R1-005の存在下で非タンパク質分解性Hin-47アナログから調製された微粒子についてのコアローディングは、 26％〜59％の範囲（６％〜16％の絶対増加）であり、20％〜39％（４％〜18％の絶対増加）のエピトープが、処方の間に保存された。従って、BAY R1-005の存在下での処方は、付随して、ローディング効率を増加し、エピトープを保護するために作用する。 PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内にrD-15をカプセル化する微粒子についてのコアローディングのアミノ酸解析を、表３に示す。39％〜44％の範囲のコアローディングが得られた。このタンパク質は、膜由来であり、従って、以前の実施例の非タンパク質分解性Hin-47アナログよりも疎水性である。この抗原を使用する場合、実施例10の非タンパク質分解性Hin-47アナログに対して増加されたカプセル化効率が、常に観察された。 PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリマー内に、非タンパク質分解性Hin-47アナログとrD-15とのカクテル（１：１のカクテル）をカプセル化する微粒子に対する、コアローディングについてのアミノ酸解析、およびエピトープ回復を、表３に示す。rD-15の存在下での非タンパク質分解性Hin-47アナログの同時カプセル化は、より高い全体のローディング効率を生じることが予測された。35％〜62％の範囲のコアローディングが得られ、８％〜26％の、非タンパク質分解性Hin-47アナログを使用たエピトープが、処方の間保存された。PLGpZSまたはPLGpSコポリマーで処方される場合、より親水性の成分（非タンパク質分解性Hin-47アナログ）の全体のローディング効率は、rD-15との同時カプセル化によって増加された。PLGを使用した場合、この効果は観察されなかった。コポリマー処方に関係なく、実施例10と比較して、類似の非タンパク質分解性Hin-47アナログのエピトープ回復が得られた。 PLG、PLGpZS、およびPLGpSコポリーマー内に、Flu X-31またはFlu X-31＋BAY R1-005をカプセル化する微粒子についての、コアローディングのアミノ酸解析を、表４に示す。26％〜40％の範囲のコアローディングが、Flu X-31で得られ、そしてBAY R1-005の存在下のFlu X-31については、31％〜53％の範囲のコアローディングが得られた。従って、５％〜13％の絶対増加が、BAY R1-005の存在下で処方した場合に得られた。唯一の例外は、BAY R1-005およびPLGpSとのFlu X-31の処方であり、ここでは９％の絶対減少を観察した。 Flu A-Texasをカプセル化するPLGpS微粒子についての21％のコアローディングが得られた。BAY R1-005の存在下でFlu A-Texasをカプセル化するPLGps微粒子について、32％のコアローディングが得られた。 Fluの異なる系統（A-Texas）を、BAY R1-005およびPLGpSコポリマーとともに用いた場合、カプセル化効率を増加する傾向がまた観察された。BAY R1-005の存在下でFlu A-TexasとともにPLGpSを処方する場合、11％の絶対増加が得られた。これは、BAY R1-005の存在下でのPLGpSおよびタンパク質についての処方は、各場合において最適化されなくてはならないことを示唆する。実施例10におけるように、コアジュバントのBAY R1-005の添加は、より高いローディング効率を生じた。 PLGpsコポリマー内にFlu（３価）ワクチンまたはFlu（３価）ワクチンと、BAY R1-005、DC-Chol、またはPCPPとをカプセル化する微粒子についての、コアローディングのアミノ酸解析を、表６に示す。72％〜104％の範囲の非常に優れたコアローディング効率は、実施例５の手順を使用して得られた。カプセル化効率における改良は、至適な濃度のタンパク質が使用されて主な乳濁液が形成される場合に観察される、一般的な結果である。この場合において、至適な濃度は約0.5m g/mLであることが、実験的に決定された。コポリマー内に、rUrease、またはrUrease＋DC-Chol、PCPP、もしくはCT-xをカプセル化する微粒子に対するエピトープ回復の、コアローディングについてのアミノ酸解析、およびrUrease特異的ポリクローナルELISA分析を、表７に示す。エピトープ回復は、アミノ酸解析によって得られる全タンパク質と、ポリクローナルELISAによって得られる全タンパク質との差として規定され、パーセントで表現される。rUreaseから単独で調製された微粒子についてのコアローディングは約46％であり、約72％のエピトープが、処方の間に回復された。同様に、DC-C holの存在下でrUreaseから調製される微粒子についてのコアローディングは約44 ％であり、約69％のエピトープが回復された。わずかに高い全タンパク質が、PC PPの存在下でrUreaseから調製された微粒子について確定された。67％のコアローディングおよび約55％のエピトープ回復が、この組み合わせについて観察された。rUreaseおよびCT-Xの両方がこの値に寄与するので、rUrease／CT-Xの組合せに関しては、rUreaseについての全体のコアローディングは、アミノ酸解析によって評価することができなかった。CT-XについてのポリクローナルELISAアッセイを創出し、微粒子加水分解物を、全体のrUreaseおよびCT-Xのそれぞれについて、アッセイした。rUreaseについて53％の、およびCT-Xについて59％のエピトープ回復が、それぞれ見出された。これらの微粒子加水分解物に対して行われた SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって、非分解のrUreaseおよびCT-Xの存在が確認された。 rUreaseについてのポリクローナルELISAアッセイが、DC-CholおよびPCPPのような付加物によって影響されなかったことを確認するために、適切なコントロール試験を行った。PCPPの場合、アッセイは、しばしば問題があり、一定ではなかった。DC-Cholの存在下でrUreaseをアッセイした場合は、同様な問題はなにも見出されなかった。実施例７：この実施例は、PLG（比較の目的のためにコントロールとして使用した）および合成されたコポリマ−PLGpZSおよびPLGps内にカプセル化された、モデル抗原（非タンパク質分解性Hin-47アナログ）についてのインビトロ放出速度、およびタンパク質の全体の累積回復％を説明する。抗原を含有するミクロスフェア内に処方されたPLGは、分子量＝26,000であり、50:50の割合のD,L-ラクチド：グリコリドを有することが確定された。この物質は、実施例２および３のコポリマーPLGpZSおよびPLGpSについて得られたものに、構成および分子量が類似する。典型的な実験において、14mgのミクロスフェア（ミクロスフェア加水分解物のアミノ酸分析によって確定されるように、非タンパク質分解性Hin-47アナログのコアローディングは、PLGについて2.8μｇ/mg 、PLGpZSについて5.7μｇ/mg、およびPLGpSについて2.5μｇ/mg）を、２mLのエッペンドルフチューブ中に置き、これに1.0mLのPBS（pH=7.4）を添加した。次いで、37℃に維持した熱調節化オーブンに、撹拌しないでチューブを置いた。種々の時間間隔で、PBS溶液を抽出して、そしてアミノ酸解析により、全タンパク質について分析した。各抽出後、PBS溶液は、最大90日まで、連続してサンプリングと置き換えられた。コントロール実験において、PLGまたはPLGpSコポリマーから調製された大部分のミクロスフェア（80重量％を超える）が、45日目までに消滅した。PLGpZSコポリマーから処方された、ミクロスフェアの分解は、いくらか遅延され、本質的に同じ程度まで侵食されるまでに60日を要した。各群の微粒子で同様の抗原放出傾向が観察され、ここでは少量のタンパク質が、最初の数日にわたって放出された。これは、14日目までに、検出できない限界近くまで減少し、これ以後、タンパク質放出速度は、約30日目での最大値まで、着実に増加した。この時点以後、タンパク質の放出は、再び検出の限界に接近するレベルになった。これらのサンプルからのタンパク質の全体の累積回復％は、各群のミクロスフェアのそれぞれのコアローディングに関して、40％〜65％の範囲であった。図７Ａは、各サンプルについての特定の時点での放出速度を説明し、および図７Ｂは、試験した各サンプルについての累積放出％を示す。これらの条件下で、ミクロスフェアからのタンパク質の最も良好な回復は、PLGpS/PLG/PLGpZSの順であるが、PLGpZS微粒子のコアローディングは、PLGまたはPLGpSアナログのコアローディングの約２倍であり、これは放出速度を影響し得る。さらに、このマトリクスは、より遅延された速度で分解されることが示され、従って、微粒子内に残留物質が存在し得る。このことについての証拠は、図７Ｂにおいて見ることができ、これによってタンパク質回復の限界増加が、PLGpZS微粒子について、60日目〜90日目に観察された。この同じ時間間隔にわたって、PLGまたはPLGpS微粒子から回復されたタンパク質は、本質的に存在しなかった。コントロール実験において、37℃でインキュベートされた、PLG、PLGpZS、またはPLGpS微粒子を負荷されたPBSの定期的な抽出物から得られたPBSの上清溶液を、pH変化についてモニターした。PLGAマトリクスについての侵食プロセスには、微粒子内のpH微環境の変化が伴うことが知られている（参考文献36）。これらの変化の結果として、pH誘導性の構造変化が生じ得るので、これはタンパク質の安定性に対して重大な影響を有し得る。これらの変化の大きさの指標は、周囲の媒体のpHをモニターすることによって得ることができる。本発明者らは、コポリマー内の小さなパーセントのアミノ酸サブユニットの取込みが、このプロセスを遅延し得ることを見出した。このことは、酸性pHに感受性であるタンパク質の放出期に重要である。具体的には、1.2mLのPBS緩衝液（pH=7.4）中の〜10mgの微粒子をインキュベートする場合、PLG(分子＝26,000ダルトン)の上清抽出物が、pH5.0以下になるために、約16日間を必要とする。類似して、PLGpZS（分子量＝20,000ダルトン、約2.0％のセリンを混入）、またはPLGpS（分子量＝18,000ダルトン、約1.7％のセリンを混入）から得られた上清抽出物のpHは、それぞれ、約5.5〜6.2であると確定された。この研究において試験されたPLGおよびPLGpSについての分解速度は同様であったが（マトリクスの質量損失によって測定される）、PLGpSマトリクスの分解速度は減少した。従って、インビトロ放出研究は、単一用量の遅延された放出送達系が、PLGpZS またはPLGpSコポリマーから処方されたポリマーの微粒子の使用により達成され得ることを実証する。さらに、マトリクス侵食を伴うpH変化は、タンパク質安定性に対する有害な影響を有し得るので、偽生理食塩水エステル（例えば、PLGpZS またはPLGpS）に由来するマトリクス（ここではタンパク質放出期のこれらの変化について、いくらかの緩衝能力が存在する）を使用することが有利である。実施例８：本実施例では、微粒子でカプセル化または微粒子と物理的に混合した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。本発明にしたがって形成させたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を試験するために、以下の量の抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬに溶解させ、試験１日および試験３５日目に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａＴｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）雌１群５匹に皮下（Ｓ．Ｃ．）免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体０．２μｇまたは０．６μｇを含むＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子（図８Ａ）、および実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体０．８μｇまたは２．５μｇと物理的に混合したＰＬＧ微粒子（図８Ｂ）。カプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を含む微粒子または非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体と物理的に混合した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋１０、＋２４、＋３５、＋４５および＋６０日に血清を採取し、抗原特異性ＥＬＩＳＡを用い、抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＧ抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。０．２μ ｇ／ｍＬの非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を含む０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１００μＬをミクロタイタープレートのウエルに添加し、室温で１夜インキュベーションした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（機能上、洗浄緩衝液と定義する）でプレートを洗浄した。ウエルに５％スキムミルク２００μＬ（機能上、ブロッキング緩衝液と定義する）を加えて、インキュベーションした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ブロッキング緩衝液で逐次希釈した試料１００μＬをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＨＲＰ-共役抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）、ヒツジ抗マウスＩｇＧ１（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｃａｌｔａｇ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（Ｃａｌｔａｇ））を加えたブロッキング緩衝液１００μＬを各ウエルに添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でウエルを５回洗浄し、新たに調製した発色用基質〔Ｈ₂Ｏ₂９部およびＴＭＢ１部〕を各ウエルに添加した。暗黒下の室温で５分間インキュベーションした後、２ＭＨ₂ＳＯ₄溶液５０μＬを添加して反応を停止させ、ミクロプレートリーダーを用いて各ウェル中の液体の吸光度を４５０ｎｍで測定した。正常なマウスのプール血清を用いて、分析における吸光度のベースラインを確定した。陽性対照として、高度免疫性マウスのＨｉｎ −４７抗血清を用いた。陰性対照として、免疫投与前血清を用いた。血清ＩｇＡの分析は、上記の方法を以下のように改良して行った。１．３μｇ／ｍＬの非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を含む０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝９．０）１００μＬをミクロタイタープレートのウェルに注入して、室温で１夜インキュベーションし、０．０６μｇ／ｍＬのウサギのＨＲＢ接合抗マウスＩｇＡ（ＺＹＭＥＤ、ＣＡ）１００μＬを各ウェルに添加した。分泌型ＩｇＡの分析は、上記の方法を以下のように改良して行った。０．０６ μｇ／ｍＬのラットのＨＲＰ共役抗マウスＩｇＡ（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）１００μＬを各ウエルに添加した。免疫投与後の血清抗体の力価を図８Ａおよび８Ｂに示す。免疫投与の結果から、ＰＬＧまたはＰＬＧｐＳ微粒子（図８Ａ）に捕捉させた抗原を免疫システムに提供すると、可溶性抗原単独の場合に要求される最適用量以下で、可溶性抗原に比較して免疫原性が高くなることが認められた。さらに、投与量０．２μｇまたは０．６μｇのカプセル化非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体では、投与量依存性は認められなかったが、投与量０．８μｇまたは２．５μｇの可溶性非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７の場合には、わずかながら力価の増大が認められた。免疫投与の結果から、抗原をＰＬＧ微粒子と物理的に混合して免疫システムに提供すると（図８Ｂ）、可溶性抗原単独の場合と同じ用量（０．８μｇまたは２．５μｇ）で、可溶性抗原に比較して免疫原性がわずかに高くなることが認められた。しかし、溶解状態または微粒子と混合した形態で投与すると、微粒子でカプセル化した抗原よりも数桁小さい反応が誘導されたに過ぎなかったことから、カプセル化すると溶解状態または物理的混合よりも利点のあることが立証された。興味あることに、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体をカプセル化させた微粒子、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を物理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を投与し、試験３５日および試験６０日目に採取した血液プールのＩｇＧサブタイプのプロフィール（図８Ｃ）から、試験３５日目までは、製剤に関係なく、ＩｇＧ１が優勢なサブタイプであり、ほかに少量のＩｇＧ２ｂが検出された。試験６０日目には、微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体で誘導されるＩｇＧサブタイプにクラススイッチがみられ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂに量的な差は認められなくなった。微粒子と物理的に混合させた非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体、または溶解させた同類似体によって産生されるＩｇＧサブタイプの種類は、試験３５日目に測定した場合と実質的に同じで、ＩｇＧ１サブタイプが優勢であった。以上のように、微粒子カプセル化抗原によってもたらされる免疫反応には、物理的に混合した微粒子または可溶性抗原のみの場合とは質的にかなり異なると結論される。ＢＡＢＬＢ／ｃ系マウスにおけるＩｇＧ２ａサブタイプの存在はＴＨ１経路を示唆し、ＩｇＧ１の存在はＴＨ２経路を示唆していると一般的に考えられている。皮下免疫投与の場合、可溶性抗原または微粒子と物理的に混合した抗原ではＴＨ２経路が優勢であり、一方微粒子でカプセル化した抗原では比較的バランスのとれたＴＨ₁／ＴＨ₂反応が得られる。実施例９：本実施例では、本発明にしたがって形成させたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体をマウスに胃内免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗原を０．１５ＭＮａＨＣＯ₃（ｐＨ９．０）２５０μＬに溶解させ、試験１、７、１４および５７日目に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）雌１群５匹に胃内（Ｉ．Ｇ．）免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体４．０μｇを含むＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子、および実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体４．０μｇと物理的に混合したＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子（図９Ａ）。カプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を含む微粒子または非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体と物理的に混合した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋１３、＋３５、＋６５および＋７８日に血清を採取し、実施例８に示す抗原特異性ＥＬＩＳＡを用い、抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の有無を評価した。血清および腸内洗浄液について、Ｈｉｎ−４７特異性抗体の有無を調べた。腸管内の抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＧおよびｓＩｇＡを検出し定量するために、頚椎脱臼法によりマウスを屠殺し、小腸を摘出し、抗原特異性抗体の有無を調べた。各小腸を幽門括約筋から盲腸の間で摘出し、毛細管を挿入して反転させた。氷冷した酵素阻害剤溶液（０．１５ＭＮａＣｌ）０．０１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．００５ＭＥＤＴＡ、０．００２ＭＰＭＳＦ、０．０５Ｕ／ｍＬアプロチニンおよび０．０２％ｖ／ｖＮａＮ₃）５ｍＬに反転させた腸管を浸漬し、４時間インキュベーションした。小腸を除去し、遠心分離（１０００×ｇ、２０分間）により上清を分取し、分析するまで０℃で保存した。上記のＨｉｎ−４７特異性ＥＬＩＳＡを用い、試料中の抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＧおよびｓＩｇＡ力価を測定した。ただし、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清の代わりにヤギ抗マウスＩｇＡ抗血清を使用した。Ｉ．Ｇ．免疫投与後の血清ＩｇＧＨｉｎ−４７特異性抗体の力価を図９Ａに示す。これらの結果から、腸内投与の場合、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子に結合した抗原（非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体）は、同量（４μ ｇ）の可溶性抗原に比較してかなり高い免疫原性を示し、微粒子と物理的に混合した抗体よりも優れていることが認められた。可溶性抗原から本質的に同等の反応を誘導させるためには、微粒子でカプセル化して投与した抗体（４μｇ）の５倍の用量（２０μｇ）が必要であることを実験的に確認した。腸内投与によって血清ＩｇＧ抗体の顕著な反応を誘導するためには、１００μｇを超える抗原を必要とする例が多いので、ほとんどすべての蛋白質について、この結果は例外的である。非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体をカプセル化した微粒子、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体と物理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を投与して、試験５６日および試験７８日目に採取した血液から得られた血清のＩｇＧサブタイプのプロフィール（図９Ｂ）では、実施例８で確認した傾向と似た傾向が認められた。抗原を溶解状態または微粒子と混合した形態で投与すると、ＩｇＧ１サブタイプが優勢である。微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体の場合は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａがほぼ等しく生成し、バランスのとれたプロフィールが認められた。このように、微粒子でカプセル化した抗原の胃経由投与により、比較的バランスのとれたＴＨ₁／ＴＨ₂反応が得られた。試験７８日目の採血から得られた抗Ｈｉｎ−４７ＩＧＡ抗体反応の結果を図９Ｃに示す。１回量が４μｇの可溶性抗原の場合は、検出可能な血清ＩｇＡを確認することができなかった。しかし、１回量が２０μｇでは、反応を示す例が少数認められた。顕著な反応が認められたのは、ＰＬＧ微粒子でカプセル化した抗原の場合であり、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原に対しては、中程度の反応が認められた。ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原については、同様に穏やかな反応が認められた。ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原の場合に、血清ＩｇＡの平均濃度が最も高かった。ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体に特異的なＩｇＧまたはｓＩｇＡの濃度が最も低かったのは、試験７８日目に行った腸管洗浄の場合であった。これは、恐らくこの実験に供したカプセル化抗原の濃度が非常に低かった（１回量４μｇ）ためである。経口投与の場合、他の粘膜アジュバントが存在しない状態で粘膜の顕著な反応を誘導するためには、通常３０〜１００μｇの範囲の抗原が必要である。実施例１０：本実施例では、本発明にしたがって形成させたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させた非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体の、マウスに鼻腔内免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５μＬに溶解させ、試験１、７、１４および５７日目に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）雌１群５匹に鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体４．０μｇを含むＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子、および実施例５にしたがって調製し、非蛋白性Ｈｉｎ−４７類似体４．０μｇと物理的に混合したＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子（図１０Ａ）。カプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を含む微粒子または非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体と物理的に混合した微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋１３、＋３５、＋５６および＋７８に血清を採取し、実施例８に示す抗原特異性ＥＬＩＳＡを用い、抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の有無を評価した。血清および肺洗浄液についてＨｉｎ−４７特異性抗体の有無を調べた。気道中の抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＧおよびｓＩｇＡを検出し定量するために、頚椎脱臼法によりマウスを屠殺し、気管に小さな切り口を作り、チューブを気管から肺に挿入し、４００μＬの酵素阻害剤溶液（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．００５ＭＥＤＴＡ) ０．００２ＭＰＭＳＦ、０．０５Ｕ／ｍＬアプロチニンおよび０．０２％ｖ／ｖＮａＮ₃）を肺に注入した。次いでこの溶液を抜き取り、氷上に置き、遠心分離（１０００×ｇ、２０分間）により上清を分取し、分析するまで０℃で保存した。実施例８に示すＨｉｎ−４７特異性ＥＬＩＳＡを用い、試料中の抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＧおよびｓＩｇＡ力価を測定した。Ｉ．N．免疫投与後の血清ＩｇＧＨｉｎ−４７特異性抗体の力価を図１０Ａに示す。これらの結果から、ＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原（非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体）は、同程度の用量（４ μｇ）の可溶性抗原に比較して高い免疫原性を有することが認められた。鼻腔経由で投与した場合、カプセル化した抗原および微粒子と物理的に混合した抗原では、本質的に同程度の反応が得られた。非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体をカプセル化した微粒子、非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を物理的に混合した微粒子または可溶性非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体を投与し、試験５６日および試験７８日目に採取したプール血液のＩｇＧサブタイプのプロフィール（図１０Ｂ）からは、実施例８または実施例９に示した傾向とは異なった傾向が認められた。微粒子でカプセル化した非蛋白分解性Ｈｉｎ−４７類似体の場合、いずれの検査時期（試験５６日目または試験７８日目）にもＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂが本質的に同程度存在し、他に比較してバランスの取れたプロフィールが認められた。溶解状態または微粒子と物理的に混合した形態で投与した抗原に関しては、試験７８日までに類似のプロフィールが認められ、顕著な濃度のＩｇＧ２ａも確認することができた。このように、鼻腔経由で投与した場合、抗原が微粒子内にカプセル化されているか、微粒子と物理的に混合されているか、溶解した形態であるかにかかわらず、ＴＨ₁／ＴＨ₂反応は本質的に同じであった。試験７８日目の採血から得られた抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＡ抗体についての結果を図１０Ｃに示す。可溶性抗原に関しては、血清ＩｇＧは検出できなかった。しかし、微粒子でカプセル化または微粒子と物理的に混合した抗原の場合には、顕著な反応が認められた。ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原、またはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原の場合に、最も高い濃度が得られた。試験７８日目に行った肺洗浄では、分泌物から検出したＩｇＧおよびｓＩｇＡに関してかなりの差が認められた。可溶性抗原からの抗Ｈｉｎ−４７ＩｇＧ抗体反応（図１０Ｄ）は、無視できる程度であったが、微粒子でカプセル化またはＰＬＧ微粒子と物理的に混合した抗原では、検査した各群の半数の動物から顕著な濃度のＩｇＧが確認された。ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原では最も再現性の高いＩｇＧ反応が認められ、検査したほとんどまたは全てのマウスで顕著な濃度のＩｇＧが認められた。抗Ｈｉｎ−４７ｓＩｇＡ抗体反応（図１０Ｅ）は、図１０Ｄに示すＩｇＧで得られた反応と類似していた。可溶性抗原の反応は無視できる程度であり、ＰＬＧ微粒子でカプセル化またはＰＬＧ微粒子と物理的に混合した抗原ではある程度の反応が認められた。ＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原では最も顕著なｓＩｇＡ反応が認められ、大部分のマウスでかなりの濃度のｓＩｇＡが検出された。粘膜表面に局部的な防護を誘導すると、しばしば局部分泌物中にＩｇＧおよびｓＩｇＡが検出される。鼻腔免疫投与しても上気道に免疫を誘導しないという可能性を否定することはできないが、微粒子でカプセル化または微粒子と混合した抗原は血清ＩｇＧ抗体反応を誘導することは明らかである。ＩｇＧおよびｓＩｇＡを局部的に誘導するためには、微粒子、特にＰＬＧｐＺＳまたはＰＬＧｐＳ微粒子と抗原を物理的に混合することがこれらの条件下で比較的適した方法であると思われる。実施例１１：本実施例では、本発明にしたがって形成させたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させたＦｌｕＸ−３１またはＦｌｕＸ−３１＋ｃｏ− アジュバントＢＡＹＲ１-００５をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬに溶解させ、試験１日目に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）雌１群６匹に皮下（Ｓ．Ｃ．）免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、５．０μｇのＦｌｕＸ−３１（ＨＡ１．５μｇ）または５．０μｇのＦｌｕＸ−３１（ＨＡ１．５μｇ）＋５０μｇのＢＡＹＲ１-００５（溶液投与）または約２０μｇのＢＡＹＲ１−００５（ｃｏ−カプセル投与）を含むＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子（図１１）。カプセル化したＦｌｕＸ−３１またはＦｌｕＸ−３１＋ＢＡＹＲ１-００５を含む微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋２１および＋３３日に血清を採取し、実施例８に示す抗原特異性ＥＬＩＳＡを用い、抗ＦｌｕＸ−３１ＩｇＧ抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。４．０μｇ／ｍＬのＦｌｕＸ−３１を含む０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）５００μＬをミクロタイタープレートのウェルに添加し、室温で１夜インキュベーションした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（機能上、洗浄緩衝液と定義する）でプレートを洗浄した。ウェルに５％スキムミルク２００μＬ（機能上、ブロッキング緩衝液と定義する）を添加して、インキュベーションした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ブロッキング緩衝液で逐次希釈した試料１００μＬをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＨＲＰ-共役抗体（ヤギ抗マウスＩＧＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）を加えたブロッキング緩衝液１００μＬを各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でウェルを５回洗浄し、新たに調製した発色用基質〔Ｈ₂Ｏ₂９部およびＴＭＢ１部〕を各ウェルに添加した。暗黒下の室温で５分間インキュベーションした後、２ＭＨ₂ＳＯ₄溶液５０μＬを添加して反応を停止させ、ミクロプレートリーダーを用いてウェル中の液体の吸光度を４５０ｎｍで測定した。正常なマウスの血液プールを用いて、分析における吸光度のベースラインを確定した。陽性対照として、高度免疫性マウスのＦｌｕＸ−３１抗血清を用いた。陰性対照として、免疫投与前血清を用いた。免疫投与後の血清抗体の力価を図１１に示す。１回の免疫投与（試験１日目）の結果から、抗原をＰＬＧまたはＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させて免疫システムに提供すると、可溶性抗原単独の場合に比較して免疫原性が高くなることが認められた。ＰＬＧｐＺＳ微粒子でカプセル化したＦｌｕＸ−３１またはＦｌｕＸ −３１＋ＢＡＹＲ１-００５で、最も顕著な結果が得られた。試験した全ての微粒子で最適用量以下の用量のＢＡＹＲ１−００５をカプセル化したが、ＰＬＧｐＺＳ微粒子では可溶性ＦＬｕＸ−３１およびＢＡＹＲ１-００５単独の場合に比較して免疫原性反応が顕著に高くなることが認められた。本実施例に示した試験によって、本発明にしたがって調製した微粒子に抗原を捕捉させると、インフルエンザビールスから得られたビールス性抗原の免疫原性が高く、高濃度の血清ＩｇＧ抗体を産生した。さらに、微粒子システムを一回だけ免疫投与した場合でも、免疫原性が他の場合に比較して顕著に増進したことから、これらの材料で単回投与ワクチンを開発することができると考えられる。実施例１２：本実施例では、本発明にしたがって形成させたＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させたＦｌｕ−Ｘ−３１またはＦｌｕ−Ｘ−３１＋ｃｏ− アジュバントのマウスに鼻腔内免疫投与したときの免疫原性を説明する。以下の量の抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５μＬに溶解させ、試験１日および試験３４日目に６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）雌１群６匹に鼻腔内（Ｉ．Ｎ．）免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、５．０μｇのＦｌｕ−Ｘ−３１（ＨＡ１．５μｇ）または５．０μｇのＦｌｕ−Ｘ−３１（ＨＡ１．５μｇ）＋５０μｇのＢＡＹＲ１−００５（溶液投与）または約２０μｇのＢＡＹＲ１−００５（ｃｏ−カプセル投与）を含むＰＬＧ、ＰＬＧｐＺＳおよびＰＬＧｐＳ微粒子（図１２）。カプセル化したＦｌｕ−Ｘ−３１またはＦｌｕ−Ｘ−３１＋ＢＡＹＲ１−００５を含む微粒子を投与しても、マウスに肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋２１、＋３３および＋９２に血清を採取し、実施例１０に示す抗原特異性ＥＬＩＳＡを用い、抗Ｆｌｕ−Ｘ−３１ＩｇＧ抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。可溶性抗原、可溶性抗原＋ｃｏ−アジュバントまたはカプセル化抗原を鼻腔内免疫投与したマウスで、同程度の抗Ｆｌｕ−Ｘ−３１ＩｇＧ抗体反応が認められた。興味あることに、カプセル化抗原＋ｃｏ−アジュバントでは、鼻腔経由で投与した場合、試験＋２１日および＋３３日に可溶性抗原、可溶性抗原＋アジュバントまたはカプセル化抗原と比較して免疫反応の低下（放出遅延によるものと思われる）が認められた。しかし、２回目の免疫投与後（試験３４日）には、これらの群でも顕著な反応の上昇が認められ、試験＋９２日には用いたアジュバントには関係なく、基本的に同じ程度の免疫原性が認められた。本実施例で記載した鼻腔内免疫投与の結果から、本発明に係わる微粒子に捕捉させても、抗原または抗原＋CO-アジュバントの免疫原性には顕著な増進が認められなかった。実施例１３：本実施例では、微粒子でカプセル化または物理的に微粒子と混合したＦｌｕ− Ａ−ＴｅｘａｓまたはＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ＋ＢＡＹＲ１−００５をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性を説明する。ほとんどの非複製ウイルスワクチンは、防御効果のある十分な血清抗体力価を得るために反復投与が必要であることは公知である。したがって、抗原を単回投与することによって同様な効果を上げることが強く望まれている。我々は、本発明にしたがって形成させたＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させ、または微粒子と物理的に混合したＦｌｕ−Ａ−ＴｅｘａｓまたはＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ＋ｃｏ−アジュバントを単回投与したときの免疫原性を検討した。以下の量の抗原をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬに溶解させ、試験１日目に６〜８週齢のＤＢＡ２系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）雌１群６匹に皮下免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、１．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ（ＨＡ０．３５μｇ）または１０．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ（ＨＡ３．５μｇ）＋約２．０μｇのＢＡＹＲ１−００５または約１０．０μｇのＦｌｕ−Ａ− Ｔｅｘａｓ（ＨＡ３．５μｇ）＋約２０μｇのＢＡＹＲ１−００５を含むＰＬＧｐＺＳ、または実施例５にしたがって調製し、１．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ（ＨＡ０．３５μｇ）＋約２０μｇのＢＡＹＲ１−００５または１０．０μｇのＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ（ＨＡ３．５μｇ）＋２０μｇのＢＡＹＲ１−００５と物理的に混合した微粒子（図１３）。Ｆｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ＋ＢＡＹＲ１−００５を含むＰＬＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、アミノ酸分析によって測定した（表１）。投与した微粒子の質量は、低用量群にはＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓとして１．０μｇ（ＨＡ０．３５μｇ）になるように、高用量群にはＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓとして１０．０μｇ（ＨＡ３．５μｇ）になるように調整した。したがって、高用量群に投与したＢＡＹＲ１−００５の用量は、低用量群に投与したＢＡＹＲ１−００５よりも１０倍高かった。ｃｏ−カプセル化するＢＡＹＲ１−００５の量がほぼ等しくなるように製剤条件は調整できるものと期待される。カプセル化したＦｌｕ−Ａ−ＴｅｘａｓまたはＦｌｕ−Ａ−Ｔｅｘａｓ＋ＢＡＹＲ１−００５を含む微粒子を投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋２１および＋４２日または＋５７日に血清を採取し、赤血球凝集抗体試験（ＨＡＩ）で機能抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。非特異的阻害剤を除去するために１０％ニワトリ赤血球細胞とともに３０分間インキュベーションした熱不活性化マウス血清を用い、インフルエンザＨＡＩ試験を行った。２倍に希釈した血清を９６穴マイクロタイタープレートに添加し、等量のウイルス懸濁液（８ＨＡ単位）を各ウエルに添加し、室温で３０分間インキュベーションした。１０％ニワトリ赤血球細胞懸濁液を各ウエルに添加し、室温で３０分間インキュベーションした。試験には陽性血清および陰性血清を含め、試験の特異性および感受性を確認した。陽性血清はインフルエンザウイルスを免疫投与した動物から得た。陰性血清はＰＢＳを免疫投与した動物から得、力価は１５またはそれ以下とした。ＨＡＩ力価は、赤血球の凝集を完全に阻害する最高希釈率の逆数で表示される。図１３に示す単回免疫投与（試験１日）の結果から、溶液の形状またはＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉された状態で免疫系に投与した抗原（図１３）は試験＋４２日までに無視できる程度またはきわめて低い機能的抗体を発現したに過ぎなかった。ＢＡＹＲ１−００５と物理的に混合した形態で免疫系に投与したＦｌｕ（１０μｇ）では、発現したＨＡＩ反応が可溶性抗原を同じ用量で投与した場合と比較して８倍高く、ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ微粒子をいずれかの用量で投与した場合と比較して６倍高かった。最も顕著な結果が得られたのはＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（Ａ −Ｔｅｘａｓ）／ＢＡＹＲ１−００５微粒子製剤であり、低用量（１μｇ）でもＨＡＩ力価は可溶性抗原の８倍、高用量（１０μｇ）では可溶性抗原の３２倍であった。Ｆｌｕ＋ＰＬＧｐＳ微粒子またはＦｌｕ＋ＰＬＧｐＳ微粒子＋ＢＡＹＲ１−００５の物理的混合物を投与した対照群でも、ＨＡＩ力価の中等度の増加が認められた。Ｆｌｕ＋ＰＬＧｐＳ微粒子の物理的混合物で表現されたＨＡＩ反応は、可溶性抗原を同じ用量で投与した場合と比較して低用量では４倍、高用量では８倍高かった。Ｆｌｕ＋ＰＬＧｐＳ微粒子＋ＢＡＹＲ１−００５の物理的混合物で表現されたＨＡＩ反応は、可溶性抗原を対応する用量で投与した場合と比較して４倍高かった。本実施例に示した試験で、インフルエンザウイルスから得たウイルス抗原は抗原を本発明にしたがって形成させた微粒子に追加アジュバントの存在下で捕捉させた場合、高レベルの機能的抗体を表現することが確認された（ＨＡＩ力価で測定）。単回免疫投与後に微粒子抗原＋アジュバントｃｏ−カプセル化系で用量依存性が認められたこと、さらに著しく高い機能的抗体（防御作用と相関がある）が表現されたことから、さらにこれらの材料を用いて単回投与剤型を開発することができる可能性を示唆している。実施例１４：本実施例では、マイクロカプセル化に典型的に用いた製剤条件のＦｌｕ（三価）ワクチンの各成分に対する影響を検査する。Ｆ１ｕ（三価）ワクチンは、３種類の相同ＨＡストレイン（Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）をほぼ等量含む。各特異的ＨＡ成分の定量は、単一放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）で行った（参考文献３２）。ＳＲＩＤ法では、各ＨＡ成分の検出にポリクロナール血清を用い、この血清は配座の変化に感受性が高い。この検定法で検出される各成分の最低濃度は、約１０ μｇ／ｍＬである。Ｆｌｕ（三価）ワクチン２．０ｍＬ（濃度＝２６５μｇ／ｍＬ）を含む一連の試料を調製した。これらの各試料について、ＳＲＩＤでＡ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡ＝２０．２５μｇ／ｍＬ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ特異性ＨＡ＝２０．６０μｇ／ｍＬ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ特異性ＨＡ＝２１．４２μ ｇ／ｍＬを測定した。マイクロカプセル化手順に典型的に用いた溶媒、例えばジクロロメタン（ＤＣＭ）または酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）の影響を、ホモジナイズ手順と同様の条件下で評価した。ホモジナイズ手順のモデルとして、短時間（３０秒間）の超音波処理を用いた。さらに、少量の添加物、例えばＢＡＹ（糖脂質ペプチド）およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（カチオン性脂質）を用い、抗原の回収率が向上するか否か検討した。反応のスケールは、実施例５で記載した手順と同様になるように設計した。ＳＲＩＤ分析を行う前に各混合液の有機溶媒を留去し、適当な対照を検査し、有機溶媒、ホモジナイズの方法またはＢＡＹまたはＤＣ−Ｃｈｏｌの添加が結果に影響を及ぼしたか否か検討した。この試験の結果を表８に示す。エントリー１と２を比較して明らかなように、超音波処理の影響はきわめてわずかであった。エントリー３と４から、ＥｔＯＡｃまたはＤＣＭ等の有機溶媒中で超音波処理すると、抗原の回収率に影響が認められた。ＥｔＯＡｃを用いた場合、Ａ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡおよびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ特異性ＨＡの回収率はそれぞれ７５％および７８％であった。ＥｔＯＡｃ処理後には、この方法でＢ／Ｈａｒｂｉｎ特異性ＨＡ成分は検出されなかった。この成分の検出限界は低く、約１０μｇ／ｍＬであったことから、この成分の実際の回収率は５０％以下であったと考えられる。溶媒としてＤＣＭを用いた場合、Ａ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡおよびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ特異性ＨＡの回収率はそれぞれ８５％および９６％で、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ特異性ＨＡの回収率は５０％以下であった。エントリー５および６では、溶媒としてＥｔＯＡｃを用いたときの有機相に対する添加物ＢＡＹおよびＤＣ−Ｃｈｏｌの影響を検討した。この組合せでは全ての成分が検出され（検出限界＞５０％）、回収率はＡ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡで６５％（ＢＡＹ）および８２％（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ特異性ＨＡで８２％（ＢＡＹ）および７０％（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）およびＡ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ特異性ＨＡで８７％（ＢＡＹ）および８８％（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）であった。エントリー７および８では、溶媒としてＤＣＭを用いたときの有機相に対する添加物ＢＡＹおよびＤＣ−Ｃｈｏｌの影響を検討した。分析の結果、一部の成分は完全には回収されず、分析にある程度の影響が認められた。特に、Ａ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡは９１％（ＢＡＹ）および９２％（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が回収された。Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ特異性ＨＡの回収率は、いずれの場合も５０％以下であった。Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ特異性ＨＡでは、これらの組合せで直線性からのかけ離れがあったため、明瞭な結果が得られなかった。これは、溶媒としてＤＣＭを用いた場合にのみ認められた。ＥｔＯＡｃに溶解させたＦｌｕ（三価）ワクチンおよび添加物としてＢＡＹまたはＤＣ−Ｃｈｏｌを用いた製剤では、いずれの成分でも最高の回収率が得られた。この実施例から、ＢＡＹまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ等の親油性物質は感受性成分を含む製剤の安定化に使用できると考えられる。このような性質を有する物質はインターフェースとして作用し、ホモジナイズの過程で蛋白が空気／水疎水性表面に接触するのを防止する。蛋白構造は、これらの作用に特に感受性が高い。この実施例で報告したＳＲＩＤ分析結果は、この結論を裏づけている。実施例１５：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子でｃｏ−カプセル化したＦｌｕ（三価）またはＦｌｕ（三価）＋アジュバントカクテルをマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性について説明する。Ｆｌｕ（三価）ワクチンは、３種類の相同ＨＡストレイン（Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）をほぼ等量含む。Ｆｌｕ（三価）ワクチン１０．０μｇ中の総ＨＡ含有量は、２．３５μｇである。単一放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）（参考文献３２）で各特異性ＨＡ成分を測定したところ、Ａ／Ｔｅｘａｓで０．７６μｇ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇで０．８１ μｇ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎで０．７８μｇであった。この試験では、各成分のＨＡ投与量が実施例１３と比較して著しく低かった。すなわち、実施例１３で用いた単価ワクチンは、約３．２５μｇのＡ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡを含んでいた。Ｔｈ₂／Ｔｈ₁プロファイルに基づいて選抜したアジュバント、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（カチオン性脂質）、ＢＡＹＲ１−００５（Ｔｈ₂／Ｔｈ₁のバランスのとれた糖脂質ペプチド）、主要Ｔｈ₂のＰＣＰＰ（ポリ［ジ（カルボキシラートヘノキシ）−ホスファゼン］ナトリウム塩）（Virus Research Institute,Cambridge M A）の存在下で、マウスに皮下免疫投与した。ＰＬＧｐＳ微粒子は、実施例８と同様にバランスのとれたＴｈ₂／Ｔｈ₁プロファイルを誘導することが認められた。６〜８週齢のＤＢＡ−２系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）雌１群８匹に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬに溶解させた抗原を試験１日目に以下の用量で免疫投与した。実施例５で調製し、Ｆｌｕ（三価、ＨＡとして２．３５μｇ）１０．０μｇまたはＦｌｕ（三価、ＨＡとして２．３５μｇ）１０．０μｇ＋ＢＡＹＲ１−００５、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰを含むＰＬＧｐＳ微粒子（表５）。Ｆｌｕ（三価）を含むＰＬＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、アミノ酸分析によって測定した（表６）。いずれのＰＬＧｐＳ微粒子製剤でも、抗原の回収率は良好であった（＞７０％）。この結果は、蛋白溶液の初期濃度がカプセル化効率に顕著な影響を及ぼすという我々の知見と一致した。投与した微粒子の質量は、Ｆｌｕとして１０．０μｇ（三価、総ＨＡ２．３５μｇ）の必要容量になるように調整した。共投与したアジュバントの用量を最適化する努力は行わなかったが、これは製剤条件によって決まると期待される。カプセル化したＦｌｕ（三価）ワクチンまたはＦｌｕ（三価）ワクチン＋アジュバントカクテルを含むＰＬＧｐＳ微粒子を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験２１、４２および５７日に血清を採取し、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａを評価し、赤血球凝集抗体試験（ＨＡＩ）で機能抗体の有無を評価した。各ストレイン（Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）について検査を行い、カプセル化および放出のマルチコンポーネント系における免疫原性および機能抗体に対する影響を検討した。試料は、全て２回分析した。抗体ＥＬＩＳＡは、実施例１３と同様に行った。図１４ａ〜ｃに示すように、ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）微粒子製剤によってＦｌｕ（三価）ワクチンに含まれる各ストレインに特異的なＩｇＧ抗体反応が誘導された。試験５７日までに総ＩｇＧ力価が最も高かったのは、ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＤＣ−Ｃｈｏｌ微粒子製剤であった。この結果は、検査したいずれのストレインにも該当した（Ａ／Ｔｅｘａｓ＝可溶性Ｆｌｕ対照の３２倍、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ＝可溶性Ｆｌｕ対照の６４倍、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ＝可溶性Ｆｌｕ対照の６４倍）。試験５７日までにＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＰＣＰＰ微粒子製剤で比較的高いＩｇＧ抗体反応（力価に基づく）が認められたのは、Ａ／Ｔｅｘａｓ（可溶性Ｆｌｕ対照の２倍）、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ（可溶性Ｆｌｕ対照の４倍）であった。ＰＬＧｐＳ／Ｆ１ｕ（三価）、ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＢＡＹ微粒子製剤および可溶性Ｆｌｕ（三価）ワクチン対照では、試験５７日までに誘導された総特異性ＩｇＧ抗体反応に基本的に差がなかった。これは、単価ワクチンを用いた実施例１３の結果（これら３種類の系で結果に差が認められなかった）と一致した。各ＨＡストレインについてインフルエンザＨＡＩ試験を行うために血清試料を５６℃で３０分間加熱して補体を不活性化し、トリプシン（８ｍｇ／ｍＬを０．１ｍＬ）／過ヨウ素酸塩（０．００１Ｍを１２．５μＬ）で前処理を行って内在血球凝集阻害物質を破壊した。連続希釈した抗血清について、標準的なＨＡＩ法（参考文献３３）を用い、それぞれ４ＨＡＵのＡ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／ＪｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇまたはＢ／Ｈａｒｂｉｎウイルスによる１％ニワトリ赤血球細胞の凝集阻害能を２連で測定した。図１５ａ〜ｃに示すように、三価ワクチンに含まれる各ＨＡストレインに対して特異的なＨＡＩ力価が誘導された。Ｆｌｕ（三価）ワクチン＋ＤＣ−Ｃｈｏｌを含むＰＬＧｐＳ微粒子製剤では、試験５７日までに最も高く持続性のあるＨＡＩ力価が認められた（ＨＡ特異性Ａ／ＴｅｘａｓではＨＡＩ力価２４０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の８倍）、ＨＡ特異性Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇでは２４０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の１６倍）、ＨＡ特異性Ｂ／Ｈａｒｂｉｎでは６０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の８倍））。Ｆｌｕ（三価）＋ＢＡＹを含むＰＬＧｐＳ微粒子製剤でも、特に高いＨＡＩ力価が認められた（ＨＡ特異性Ａ／ＴｅｘａｓではＨＡＩ力価６０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の２倍）、ＨＡ特異性Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇでは６０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の４倍）、ＨＡ特異性Ｂ／Ｈａｒｂｉｎでは１５（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照と同等））。この実施例でＦｌｕ（三価）ワクチンを含むＢＡＹ製剤で認められたＨＡＩ力価は、実施例１３の低用量（Ｆｌｕ（単価）ワクチン１μｇ−Ａ／Ｔｅｘａｓ特異性ＨＡとして０．３２５μｇを投与）と同等であった。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＰＣＰＰ微粒子製剤では、検出されるほどの機能抗体反応の誘導は認められなかった。高用量のＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＤＣ−Ｃｈｏｌ製剤微粒子を投与した実験を行った。この群のマウスには、試験１日目に別の群に投与したＦｌｕ（三価）ワクチンの約２倍を免疫投与した（投与量：Ｆｌｕ（三価）＝２１．２μｇ、総ＨＡ＝５．００μｇ）。この高用量で得られた結果は、図１５ａ〜ｃに示す。可溶性Ｆｌｕ（三価）ワクチンをこの用量で免疫投与した対照群で誘導されたＨＡＩ力価はわずかであり、検査した低用量群と基本的に同等であった（結果は表示せず）。試験５７日までに、この製剤では低用量群と比較して著しく高い特異性ＨＡＩ力価の誘導が認められた（ＨＡＩ力価：ＨＡ特異性Ａ／Ｔｅｘａｓで４８０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の５倍）、ＨＡ特異性Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇで４８０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の５倍）、ＨＡ特異性Ｂ／Ｈａｒｂｉｎで１２０（可溶性Ｆｌｕ（三価）対照の３倍））。さらに、誘導されたＨＡＩ力価は持続性があり、試験２１日から５７日まで同じレベルに保たれることが確認された。ＢＡＹまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ等の添加物はポリマーおよび有機溶媒を含む有機相に導入され、インターフェースとして作用し、製剤の過程で抗原を防御する（実施例１３、表８参照）。それによって、抗原物質の回収率が高くなる。さらに、ｉｎｖｉｔｒｏで行った放出試験で、３日以内にカプセル封入成分のかなりの量が放出されることが確認された。カプセル封入抗原の約５〜１５％が、この段階で検出されることが実験的に確認された（微粒子の表面に局在している抗原）。初回免疫は、アジュバントの共放出によって著しく増強される。これは、初期放出段階で抗原の周囲に局在していることによるものと思われる。ＰＣＰＰ等のアジュバントと抗原をｃｏ−カプセル化したＰＬＧｐＳ微粒子製剤では、ワクチン効果の改善が得られないことは注目に値する。この物質は一次乳化液の水相に添加したが、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＢＡＹの親油性を保持していない。ＰＣＰＰは別の系で強いアジュバント特性を有することが知られているが、この実施例ではカプセル化効果または微粒子製剤の抗原性補強効果にはきわめてわずかな改善が認められたに過ぎなかった。この実施例に示す試験で、多成分系インフルエンザウイルスのウイルス抗原はＦｌｕ抗原をｃｏ−カプセル化したＢＡＹまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ等の存在下で微粒子に捕捉させると高レベルの総ＩｇＧ抗体および機能抗体（ＨＡＩ）を誘導することが確認された。実施例１６：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子製剤をマウスモデルに単回皮下免疫投与したときの感染率および防御率を評価した結果を説明する。卵由来尿膜腔液中の生インフルエンザウイルスＡ／台湾／１／８６（Ｈ１Ｎ１）、マウス適応Ａ／台湾／１／８６および市販のＡ／台湾／１／８６単価サブユニットワクチン（Ｆｌｕｚｏｎｅ^R）を、ＰａｓｔｅｕｒＭｅｒｉｅｕｘ、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、米国（Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡ）から入手した。Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／ＪｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇおよびＢ／Ｈａｒｂｉｎストレイン（ＰＢＳ０．２５ｍＬ中総ＨＡ２．３５μｇ）を含むＦｌｕ（三価）ワクチンを、試験１日目に６〜８週齢のＤＢＡ−２系マウス雌（実施例１４に記載）１群８匹に皮下免疫投与した。対照群のマウスには、ＰＢＳのみまたは尿膜腔液として生Ａ／Ｔｅｘａｓウイルスを４００血球凝集単位（ＨＡＵ）で投与した。１４日後に麻酔下のマウスに尿膜腔液中のマウス適応生Ａ／台湾／１／８６ワクチン５０μＬを鼻腔内攻撃投与した（ＬＤ５０の５倍）。攻撃投与後１４日間にわたって、毎日死亡率を測定し、２日に１回罹病率（体重変化）を測定して防御率を評価した。攻撃投与の結果を図１６に示す。期待したように、相同性生（Ａ／Ｔｅｘａｓ）ウイルスを免疫投与した全てのマウスで認められた体重の減少は最小限で、ベースラインからの体重変化率に基づいて判断したところ、攻撃投与後２週間以内に完全に回復した。また、ＰＢＳを免疫投与したマウスでは期待したように急激な体重の減少が認められ、試験１０日までにベースラインの３０％以下に減少した。この対照群では、１０日までに全ての動物が死亡した。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＤＣ−Ｃｈｏｌ微粒子製剤を免疫投与したマウスでは攻撃投与後４日以内に体重の平均減少率が８％であったことから、感染が起こったと考えられた。検査したＰＬＧｐＳ製剤群の動物のうちこれらのマウスでは急速な回復が認められ、２週間後にはベースラインの１００％に達した。群全体の動物が回復し、各マウスで防御力価が上昇したものと考えられた。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＢＡＹ微粒子製剤を免疫投与したマウスでは攻撃投与後１０日以内に体重の平均減少率が１０％であったことから、感染が認められた。これらのマウスでは緩慢な回復が認められ、２週間後にはベースラインの９５％に達した。群全体の動物が回復し、これらの各マウスで防御力価の上昇が認められたが、回復速度から防御レベルは同じ用量を投与したＤＣ−Ｃｈｏｌ群よりも低かったものと考えられる。これは、実施例１５で測定したこれら２群のＨＡＩ値と一致する。可溶性Ｆｌｕ（三価）ワクチン対照群およびＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）またはＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＰＣＰＰ微粒子製剤群では、効果が低かった。これらの群では、攻撃投与後８〜１０日までに２３〜２９％の平均体重の減少が認められた。これらのマウスでは回復速度が最も遅く、２週間後にベースラインの８６〜９２％に回復した。さらに、これらの群では数匹の死亡例がみられた。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）微粒子製剤群では、８匹中６匹が生存した。ＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）／ＰＣＰＰ製剤群では８匹中７匹、Ｆｌｕ（三価）対照群では８匹中６匹が生存した。これらの例では、防御が認められないか、認められても低かった。実施例１４で、我々はマイクロカプセル化条件のＦｌｕ（三価）ワクチンに対する影響を評価した。ＳＲＩＤ法で抗原回復のストレイン特異性（Ａ／Ｔｅｘａｓ、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ）分析を行ったところ、ＰＬＧｐＳポリマーおよびＥｔＯＡｃを溶媒とし、有機相にＣｈｏｌまたはＢＡＹを用いた場合、この多成分系の３ストレイン全てで抗原活性の低下がきわめてわずかであることが認められた。実施例１５で、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＢＡＹの存在下で製剤したＰＬＧｐＳ／Ｆｌｕ（三価）ワクチンの単回皮下投与で高い機能抗体（防御に関連がある）が誘導されたことから、これらの製剤はマウスモデルに利用できることが確認された。実施例１６で記載した攻撃／防御試験の結果は、機能抗体試験で得られた防御効果の順位とよく一致した。抗原およびアジュバントを生分解性微粒子に捕捉させて投与すると、さらに効果的に免疫系に提供することができる。ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＢＡＹと抗原の可溶性混合物で認められた免疫増強効果は、これを製剤に利用することによって免疫活性がさらに向上することを示唆している。これらの結果は、使用回数および用量（抗原／アジュバント）を軽減できることを示唆している。特に、この実施例はこれら新規微粒子製剤を単回投与で有効な製剤の開発に利用できることを強く示唆している。実施例１７：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子中にカプセル化したＭｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来トランスフェリン結合蛋白（Ｔｂｐ−２）（ＷＯ９７／１３７８５、本出願人、参考例としてここに引用する）、ＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合したＴｂｐ−２または明礬で製剤したＴｂｐ−２をマウスに皮下免疫投与したときの免疫原性について説明する。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）雌１群５匹に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬに溶解させた抗原を試験１、２８および４３日目に以下の用量で皮下免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、０．３ μｇのＴｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子、実施例５にしたがって調製し、０．３μｇのＴｂｐ−２と物理的に混合したＰＬＧｐＳ微粒子、および０．３μｇのＴｂｐ−２と製剤した明礬（１．５ｍｇ／回）（表５）。カプセル化したＴｂｐ−２を含む微粒子、Ｔｂｐ−２を物理的に混合した微粒子またはＴｂｐ−２を物理的に混合した明礬を投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験＋１４、＋２７、＋４２および＋５５日で血清を採取し、実施例８と同様に抗原特異性ＥＬＩＳＡで抗Ｔｂｐ−２ＩｇＧ抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。Ｔｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、実施例６と同様にアミノ酸分析によって測定した（４．０μｇ／ｍｇ（３２．８％））。免疫投与の結果（図１７ａ）から明らかなように、ＰＬＧｐＳ微粒子に捕捉させて免疫系に投与した抗原は可溶性抗原またはＰＬＧｐＳ微粒子のみと物理的に混合した抗原と比較してかなり高い力価を誘導した。さらに、この試験でマイクロカプセル化製剤は従来の明礬アジュバント化システムと同様に免疫原性を有するものと思われる。免疫反応のカイネティックスは、両製剤で差がなかった。試験５５日に採取した血液のＩｇＧサブタイププロファイル（図１７ｂ）で、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化したＴｂｐ−２とＰＬＧｐＳ微粒子に物理的に混合したＴｂｐ−２または明礬で製剤したＴｂｐ−２で誘導される免疫反応に差が認められた。抗原を可溶性の形態またはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合し、または明礬で製剤して投与した場合、検出された優勢なサブタイプはＩｇＧ１であった（ＩｇＧ２もある程度認められた）。この実施例で、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化したＴｂｐ−２で誘導されるＩｇＧサブタイプはさらに高いＩｇＧ２ａを誘導した。この傾向は、実施例８でＨｉｎ−４７で認められた傾向と同様であった。これらの結果から、カプセル化抗原の免疫投与で誘導される免疫の機構は明礬で誘導されるものとは異なるものと思われる。抗原を微粒子でカプセル化して投与すると、さらにバランスのとれたＴｈ₂／Ｔｈ₁プロファイル（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１の比）が認められた。ここに示した結果から明らかなように、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原で仲介される免疫反応は、ＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原、明礬で製剤した抗原または可溶性抗原として投与したもので得られる免疫反応とは質的にかなり異なる。さらに、抗原／明礬製剤で明礬により誘導される免疫反応の程度はカプセル化した抗原を含む微粒子の免疫反応とほぼ同じであった。実施例１８：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化したＴｂｐ−２およびＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合したＴｂｐ−２を鼻腔内免疫投与したマウスにおける免疫原性を説明する。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）雌１群５匹に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０または５０μＬに溶解させた抗原を試験１、２８および４３日目に以下の用量で鼻腔内免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、６．０μｇのＴｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子、および実施例５にしたがって調製し、６．０μｇのＴｂｐ−２と物理的に混合したＰＬＧｐＳ微粒子（表５）。カプセル化したＴｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子またはＴｂｐ−２を物理的に混合したＰＬＧｐＳ微粒子を投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験１４、２７、４２および５５日で血清を採取し、実施例８と同様に抗原特異性ＥＬＩＳＡで抗Ｔｂｐ−２ＩｇＧ抗体の有無を評価した。試料は、全て２回分析した。Ｔｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、実施例６と同様にアミノ酸分析によって測定した（４．０μｇ／ｍｇ（３２．８％））。鼻腔内免疫投与後の血清ＩｇＧＴｂｐ−２特異性抗体力価を図１８に示す。これらの結果から、投与容量が少ない（１０μＬ）と、ＰＬＧｐＳ微粒子に取り込まれた抗原（Ｔｂｐ−２）またはＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原は同じ用量（６．０μｇ）の可溶性抗原と比較して免疫原性が低い。投与容量を高くする（５０μＬ）と、いずれの群でも全体的な力価が著しく増加した。これらの結果から、ＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合した抗原（Ｔｂｐ −２）は、さきにＨｉｎ−４７の鼻腔内免疫投与（実施例１０）で認められた結果と同様に同じ用量（６．０μＬ）の微粒子カプセル化抗原または可溶性抗原と比較して免疫原性がかなり高かった。さきに行ったＨｉｎ−４７の鼻腔内免疫投与試験（実施例１０）で、微粒子と物理的に混合したＨｉｎ−４７を投与すると強い体液反応および分泌反応が認められた。Ｔｂｐ−２を用いたこの試験でも、同様な反応が認められた。さらに、投与容量によって、発現する免疫反応の種類および強さが異なることを確認した。実施例１９：本実施例では、微粒子による抗原の放出を説明する。ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化した抗原は明礬製剤と同様に免疫原性を有することが確認されたことから、これら高分子マトリックスでカプセル化した抗原の初期放出および徐放特性が免疫投与量の軽減に利用できるか否か検討した。この実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化したＴｂｐ−２、ＰＬＧｐＳ微粒子と物理的に混合したＴｂｐ−２、および明礬またはＣＦＡ／ＩＦＡで製剤したＴｂｐ−２をモルモットに皮下免疫投与して免疫原性を検査した。６〜８週齢のモルモット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）雌１群２匹に、抗原を以下の用量で皮内免疫投与した：試験１および２８日に実施例５にしたがって調製し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５００μＬに懸濁させた５．０μｇのＴｂｐ−２をカプセル化したＰＬＧｐＳ微粒子、および試験１日に５．０μｇのＴｂｐ−２を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を混合したフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、ついで試験１４および２８日に５．０μｇのＴｂｐ−２を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を混合したフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、または試験１、１４および２８日に５．０μgのＴｂｐ−２を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を混合した明礬（表５）。カプセル化したＴｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子、Ｔｂｐ−２を物理的に混合したＰＬＧｐＳ微粒子、Ｔｂｐ−２のＣＦＡ／ＩＦＡ製剤またはＴｂｐ−２明礬製剤を免疫投与したモルモットで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験４０および５６日で血清を採取し、抗原特異性ＥＬＩＳＡで抗Ｔｂｐ−２ＩｇＧ抗体の有無を検査した。試料は、全て２回分析した。抗体ＥＬＩＳＡ法は、実施例８と同様である。Ｔｂｐ−２を含むＰＬＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、実施例６と同様にアミノ酸分析によって測定した（４．０μｇ／ｍｇ（３２．８％））。図１９に示す結果から明らかなように、ＰＬＧｐＳでマイクロカプセル化したＴｂｐ−２を２回投与すると、ＣＦＡ／ＩＦＡまたは明礬で製剤したＴｂｐ−２を３回投与した場合と同程度の抗Ｔｂｐ−２抗体反応を誘発した。これらの結果から、マイクロカプセル化したＴｂｐ−２は２回投与用のワクチンとして開発する価値があると思われる。実施例２０：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子でカプセル化したｒウレアーゼまたはｒウレアーゼ／アジュバントカクテルをマウスに皮下または胃内免疫投与したときの免疫原性を説明する。６〜８週齢の非近交系Ｓｗｉｓｓマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、フランス）１群８匹に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００μＬに溶解させた抗原を以下の用量で試験１、２８および５６日に皮下（Ｓ．Ｃ．）免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、１０．０μｇのｒウレアーゼを含むＰＬＧｐＳ微粒子、実施例５にしたがって調製し、１０．０μｇのｒウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＣＰＰまたはＣＴ−Ｘをｃｏ−カプセル化したＰＬＧｐＳ微粒子、対照として１０．０μｇのｒウレアーゼ＋可溶性のＤＣ−Ｃｈｏｌ（６５μｇ／回）またはＰＣＰＰ（１００ μｇ／回）、または試験１、２８および５６日に０．１５ＭＮａＨＣＯ₃（ｐＨ９．０）３００μＬに溶解させた抗原を以下の用量で胃内免疫投与した：実施例５にしたがって調製し、４０．０μｇのｒウレアーゼを含むＰＬＧｐＳ微粒子、実施例５にしたがって調製し、４０．０μｇのｒウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＰＣＰＰまたはＣＴ−Ｘをｃｏ−カプセル化したＰＬＧｐＳ微粒子（表５）。ｒウレアーゼを含むＰＬＧｐＳ微粒子のコア負荷量は、実施例６と同様にアミノ酸分析またはポリクロナールｒウレアーゼ特異性ＥＬＩＳＡによって測定した（表７）。ＰＬＧｐＳ微粒子抽出物についてポリクロナールＥＬＩＳＡ分析を行うと、典型的にカプセル化した総蛋白量（回収されたエピトープ）が得られる。対照実験で、抗原の完全性に対する溶媒／塩基（ＳＤＳ）の影響を定量することができる。用いた条件下で、抽出された蛋白の約６５〜７５％がこの検定法で完全に検出される形態で残っていたと推定される。したがって、この測定法で得られた値は、アミノ酸分析（ＡＡＡ）で得られた値よりも低い。アジュバント（ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＣＴ−ＸまたはＰＣＰＰ）が存在していても測定値を妨害しないことを確認するため、適当な対照を実験に含めた。ＤＣ−Ｃｈｏｌが存在していても分析には影響がないと思われたが、ＰＣＰＰが存在すると異常値が得られ、ＡＡＡ法による分析値と比較して非特徴的に高かった。ＣＴ−Ｘの場合は、ｃｏ −カプセル化されたＣＴ−Ｘの量を定量するために別のポリクロナールＥＬＩＳＡ法を開発した。微粒子の投与質量は、ｒウレアーゼの投与量が１０．０μｇ（皮下投与）または４０．０μｇ（経口投与）になるように調整した。カプセル化したｒウレアーゼまたはｃｏ−カプセル化したｒウレアーゼとアジュバントの混合物を含むＰＬＧｐＳ微粒子を免疫投与したマウスで、肉眼的病理変化または行動の変化は認められなかった。試験８５日に血清を採取し、抗原特異性ＥＬＩＳＡで抗ｒウレアーゼＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の有無を評価した。いずれの試料も２回分析した。ＥＬＩＳＡは標準的なプロトコール（ビオチン抱合体、ストレプタビジンペルオキシダーゼ複合体はＡｍｅｒｓｈａｍから、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質はＳｉｇｍａから入手した）。０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に懸濁させたＨ．ｐｙｌｏｒｉ抽出物（５μｇ／ｍＬ）で、プレートを一夜コーティングした（４℃）。ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で飽和させた後、プレートを血清（１．５時間）、ビオチン抱合体（１．５時間）、ストレプタビジンペルオキシダーゼ複合体（１時間）および基質（ＯＰＤ−１０分間）とともにインキュベーションした。対照として、各実験にＨ．ｐｙｌｏｒｉ抽出物に対するポリクロナールマウス血清を設けた。力価は、４９２ｎｍにおける最大吸収の５０％を与える希釈率の逆数で表示した。陰性対照として、免疫投与前の血清を用いた。マウスに、Ｔｈ₂／Ｔｈ₁プロファイルに基づいて選んだアジュバント（ＤＣ− Ｃｈｏｌ−バランスのとれたＴｈ₂／Ｔｈ₁、ＰＣＰＰ−一次Ｔｈ₂）または既知の粘膜アジュバント活性に基づいて選んだアジュバント（コレラ毒素（ＣＴ−Ｘ）またはＥ．ｃｏｌｉの熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ））の存在下で皮下または胃内免疫投与した。ＰＬＧｐＳ微粒子は、その他の典型的なアジュバント、例えば明礬と比較して一層バランスのとれたＴｈ₂／Ｔｈ₁プロファイルを誘導することが認められている。皮下免疫投与後試験８５日に得たプール血液のＩｇＧサブタイプを図２０に示す。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ微粒子製剤を皮下投与した場合は、いずれもＩｇＧ１反応がＩｇＧ２ａ反応と比較して高かった（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比は０．０８〜０．３３の範囲にあった）。可溶性対照群（ｒウレアーゼ＋ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰ）の総ＩｇＧ１反応は、同じ絶対値の範囲にあった。抗原とｃｏ−カプセル化した場合も、抗原と物理的に混合して投与した場合にも、アジュバントシステム間でＩｇＧ２ａに差が認められた。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ微粒子（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１＝０．３３）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ微粒子／ＣＴ−Ｘ（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１＝０．３０）およびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ微粒子／ＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１＝０．２０）では、バランスのとれたＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１抗体反応（Ｔｈ₂／Ｔｈ₁で評価）が得られた。一方、ｒウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃｈｏｌ対照群では、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１＝０．０３であった。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ微粒子製剤では、主としてＴＨ₂反応が認められ、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比は０．０８であった。ｒウレアーゼ＋ＰＣＰＰの相同可溶性混合物ではＴｈ₂が強く、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比はきわめて低く、０．００３であった。一般に、これらのアジュバントの存在下で抗原をｃｏ−カプセル化すると、典型的な免疫プロファイルがバランスのとれたＴｈ₂／Ｔｈ₁反応の方向にシフトする傾向が認められた。胃内免疫投与すると、ほとんどの場合検出可能な浸透反応が認められなかった。特記すべき例外は、中等度の浸透反応が認められたＬＴ陽性対照（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比＝０．１）およびＣＴ−Ｘとｃｏ−カプセル化したｒウレアーゼ／ＰＬＧｐＳ微粒子（ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比＝２．１）であった。興味あることに、経口免疫投与では、抗原＋粘膜アジュバントをカプセル化するときわめて異なった浸透抗体反応が認められた。この場合、ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比がＩｇＧ２ａに片寄り、Ｔｈ₁経路を示唆していた。文献調査で、ＣＴ−Ｘを抗原と経口共投与すると典型的にＬＴで認められたような免疫反応を誘導するという報告があった。主として、ＩｇＧ１またはＴｈ₂型の反応が報告されている（参考文献３４）。この試験は、ＰＬＧｐＳ微粒子でｃｏ−カプセル化すると免疫反応が質的に変化することを示唆している。実施例２１：本実施例では、ＰＬＧｐＳ微粒子／ｒウレアーゼ製剤をマウスモデルに皮下または経口免疫投与したときの感染率および防御率を評価する。マウスを用い、２回目の追加免疫投与６週間後（試験８５日）に、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌（３ｘ１０⁶ｃｆｕ）懸濁液３００μＬを胃内に強制攻撃投与した。Ｉｎｖｉｔｒｏの放出試験（実施例７）から微粒子からの抗原の放出には約４週間を要すると考えられたので、この時から２週間後に攻撃投与を計画した。攻撃投与４週間後にマウスを屠殺し、ウレアーゼ活性（Ｊａｔｒｏｘテスト、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）を評価するために無菌層流フード内で胃を採取した。ウレアーゼ活性は、屠殺２４時間後に５５０ｎｍにおける吸収を測定することにより評価した。このテストの原理は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉのウレアーゼによって反応液中の尿素を分解させ、ｐＨの上昇による反応液中のｐＨ指示薬（フェノールレッド）の黄色から淡赤色への色の変化を測定するものである。マウスは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのストレプトマイシン耐性マウス適応株（Ｘ４３ −２ＡＮ）を感染させた。胃におけるウレアーゼ活性の測定値（Ｊａｔｒｏｘテスト）に基づいて判定したところ、感染率には再現性があり、全ての実験で１００％のマウスが感染した。攻撃投与に用いた菌株はストレプトマイシン耐性であったため、選択性の高い培地でも生育することができ、したがってこのテストの感度はきわめて高かった（正常な細菌相による汚染はみられなかった）。この菌株は２０％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖ牛胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）添加Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス（ＢＢ）（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）中−７０℃で保存した。攻撃投与用懸濁液は、以下のように調整した：前培養は、５％ｖ／ｖヒツジ血液（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）およびＨ．ｐｙｌｏｒｉＸ４３−２ＡＮ株の選択マーカー抗生物質（スリメトプリム（５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（１０μｇ／ｍＬ）、ポリミキシンＢ硫酸塩（５μｇ／ｍＬ）、アンホテリシン（５μｇ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ））（ＴＶＰＡＳ）を含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天（ＭＨＡ；Ｄｉｆｃｏ）上でＨ．ｐｙｌｏｒｉを培養した。抗生物質は、全てＳｉｇｍａから購入した。ＭＨＡ−ＴＶＰＡＳプレートを好気的条件下、３７℃で３日間培養した。前培養した菌株を用い、５％ｖ／ｖＦＢＳおよびすべての抗生物質（ＴＶＰＡＳ）を添加したＢＢ５０ｍＬを含む７５ｃｍ²の通気口付きフラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）に接種した。フラスコを、好気的条件下で２４時間ゆっくりと振とうした。グラム染色、ウレアーゼ活性（尿素インドール培地、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＰａｓｔｅｕｒ）、カタラーゼ（Ｈ₂Ｏ₂、３％ｖ／ｖ）およびオキシダーゼ活性（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘディスク）を測定し、懸濁液の特性を検討した。位相差顕微鏡下で、生存率および運動性を検査した。５５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．が０．１になるようにＢＢで懸濁液を希釈した（１ｘ１０⁷ＣＦＵ／ｍＬ）。この試験では、ＯＤ．＜０．１または細菌数が少なくとも１０³〜１０⁴／胃（対照では１０⁵〜１０⁶）のマウスは防御能を有すると考えた。この試験では、非免疫投与／感染および非免疫投与／非感染対照群のマウスも設けた（結果は表示せず）。図２１ａから明らかなように、上記の検定法で判断した防御効果（皮下投与による）の順位は、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ（幾何学的平均＝０．０９２）＞ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ（幾何学的平均＝０．１０５）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ（幾何学的平均＝０．１６３）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ（幾何学的平均＝０．２６９）であった。この試験では、防御の標準としてＬＴ＋ｒウレアーゼ（経口）陽性対照（幾何学的平均＝０．１３６）を用いた。興味あることに、ｒウレアーゼ＋可溶性ＤＣ−Ｃｈｏｌ（幾何学的平均＝０．６００）またはｒウレアーゼ＋ＰＣＰＰ（幾何学的平均＝１．０７）対照群では抗原とアジュバントをＰＬＧｐＳ微粒子製剤としてカプセル化する明瞭な利点が認められた。データをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの方法で統計学的に解析し、以下の結論が得られた。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ製剤は、ＬＴ＋ｒウレアーゼ陽性対照群と比較して有意差が認められなかった。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ、ｒウレアーゼ＋ＤＣ −Ｃｈｏｌおよびｒウレアーゼ＋ＰＣＰＰ群ではこれらの群と比較して有意差が認められ（ｐ＜０．０１）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ群ではＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ、ｒウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃｈｏｌおよびｒウレアーゼ＋ＰＣＰＰ群と比較して有意差が認められた（ｐ＜０．０１）。この統計学的解析から、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ（マウス７／８匹でＯＤ．＜０．１）およびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ（マウス５／８匹でＯＤ．＜０．１）微粒子群では明瞭な防御効果が認められ、一方ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ（マウス２／８匹でＯＤ．＜０．１）微粒子群およびｒウレアーゼ＋ＤＣ−Ｃｈｏｌ群（マウス２／１０匹でＯＤ．＜０．１）群では中等度の防御効果が認められ、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ（マウス０／８匹でＯＤ．＜０．１）微粒子群およびｒウレアーゼ＋ＰＣＰＰ群（マウス０／１０匹でＯＤ．＜０．１）群では防御効果が低いか、全く認められなかった。この傾向は、免疫原性試験（実施例２０）で得られたＴｈ₂／Ｔｈ₁バランス比と一致した。図２１ｂに示すように、経口免疫投与では、アジュバントを含むＰＬＧｐＳ微粒子を免疫投与したいずれの群のマウスでも完全な防御効果は得られなかった。統計学的順位は、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ（幾何学的平均＝０．２２９）＞ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ（幾何学的平均＝０．４０３）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ（幾何学的平均＝０．４７５）、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰ（幾何学的平均＝０．４９３）であった。この試験では、陽性対照としてＬＴ＋ｒウレアーゼ（経口）群（幾何学的平均＝０．１３６）を用いた。データをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの方法で統計学的に解析し、以下の結論が得られた。ＬＴ＋ｒウレアーゼ陽性対照群ではＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ −ＣｈｏｌおよびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ製剤と比較して有意差が認められた（ｐ＜０．０１）。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ製剤では、その他の群と比較して有意差が認められなかった。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼおよびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＰＣＰＰでは、その他の群と比較して有意差が認められなかった。この試験で、ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ（マウス２／８匹でＯＤ．＜０．１）およびＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＤＣ−Ｃｈｏｌ（マウス１／８匹でＯＤ．＜０．１）微粒子製剤群では部分的な防御効果が認められた。一方ｒウレアーゼ＋ＬＴ陽性対照群では完全な防御効果が認められた（マウス７／８匹でＯＤ．＜０．１）。実施例１４〜１６で明らかなように、アジュバントをＰＬＧｐＳ微粒子等の担体とともに免疫系に供給するとアジュバント効果が高くなり、その結果ワクチンの効果も高くなる。特に、この実施例における典型的な対照試験でＤＣ−ＣｈｏｌまたはＰＣＰＰ等のアジュバントと、ｒウレアーゼの可溶性混合物を皮下免疫投与後の免疫原性および防御効果を測定したところ、防御効果は低いか、中等度であることが確認された。これらの結果から、抗原とアジュバントを微粒子状のマトリックスとともに供給するとかなり効果の高いワクチンが得られるという証拠が得られた。この実施例では、さらにアジュバントの毒性軽減およびこの種のアジュバントの特徴である免疫反応の質的改善等の利点があることが実証された。ＰＬＧｐＳ／ｒウレアーゼ／ＣＴ−Ｘ製剤微粒子の経口免疫投与後に得られたｒウレアーゼに対するＩｇＧサブタイプ抗体反応が非特徴的にＩｇＧ２ａ側（Ｔｈ₁経路）にかたよるということも実験的に実証された。また、ｃｏ−カプセル化した抗原とＣＴ−Ｘ（既知の粘膜アジュバント）を皮下または経口投与した場合、この物質は製剤および貯蔵中に高分子マトリックス内の抗原を安定化させ、ＨＳＡまたはＢＳＡの存在下で調製した微粒子と同様な機構（参考文献３５）で放出するものと思われる。結論として、この試験で、ＰＬＧｐＳ微粒子を利用した全身免疫投与により、マウスモデルでＨ．ｐｙｌｏｒｉの感染に対して著しい防御効果を誘導する効果のあることが確認された。また、この試験で、ＰＬＧｐＳ微粒子を利用した経口免疫投与により、マウスモデルでＨ．ｐｙｌｏｒｉの感染に対して部分的な防御効果を誘導する効果のあることも確認された。さらに、アジュバント（特にＤＣ−ＣｈｏｌまたはＣＴ−Ｘ）とともにｒウレアーゼをｃｏ−カプセル化すると、ワクチン効果の顕著な向上が得られる。開示の要約本発明は、高分子と生物学的に活性な物質のマトリックスからなる物質、特に生物学的活性を有する物質の粒状担体を提供する。粒状担体は微粒子の形態で、粘膜または非経口的に投与すると、検体の免疫系細胞に物質を効果的に運搬し、免疫反応を誘導することができる。本発明の範囲で、改良が可能である。

【手続補正書】【提出日】平成１１年７月３０日（１９９９．７．３０）【補正内容】請求の範囲１．一般式：（上式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅はそれぞれ独立して、水素原子、直鎖状アルキル基および分岐鎖状アルキル基から選択され、Ｒ₆は水素原子、アミン保護基、スペーサ分子及び生物学的に活性な活性種から選択され、Ｘは−Ｏ−及び−Ｓ−から選択され、ｘおよびｙは整数である）の骨格を有することを特徴とする生分解性及び生体適合性を有するポリマー。２．ｘおよびｙが、ポリマーが、少なくとも約９５％のα−ヒドロキシ残基を有する値の整数である請求項１に記載のポリマー。３．少なくとも１種のα−ヒドロシキ酸と、少なくとも１種の疑似（pseudo） −α−アミノ酸を含むモノマーの共重合により得られる請求項１または２に記載のポリマー。４．前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸が、式：Ｒ₁Ｒ₂ＣＯＨＣＯ₂Ｈで表わされ、該式中、Ｒ₁およびＲ₂は、それぞれ独立して、水素原子、または直鎖状アルキル単位もしくは分岐鎖状アルキル単位であり、かつ該アルキル基単位は式：Ｃ_nＨ_2n+1で表され、該式中、ｎは１から１０の整数である請求項３に記載のポリマー。５．前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸が、２種以上のα−ヒドロキシ酸の混合物であり、該混合物が、前記式：Ｒ₁Ｒ₂ＣＯＨＣＯ₂ＨにおけるＲ₁およびＲ₂が水素であるα−ヒドロキシ酸と、該式におけるＲ₁がＣＨ₃、Ｒ₂が水素原子であるα−ヒドロキシ酸を含む請求項４に記載のポリマー。６．前記少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸が、式：Ｒ₅ＣＨＮＨＲ₆ＣＯ₂ Ｈで表わされ、該式中、Ｒ₅はヒドロキシメチル基またはメチルチオール基であり、Ｒ₆はアミン保護基である請求項３〜５のいずれかに記載のポリマー。７．前記アミン保護基が、カルボベンジルオキシ（ＣＢＺまたはＺ）、ベンジル（Ｂｎ）、パラメトキシベンジル（ＭｅＯＢｎ）、ベンジルオキシメトキシ（ＢＯＭ）、tert−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢｏＣ）および［９−フルオレニルメチルオキシ］カルボニル（ＦＭＯＣ）からなる群から選択されたものである請求項６に記載のポリマー。８．前記少なくとも１種のα−ヒドロキシ酸が、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシ酪酸からなる群から選択されたものであり、前記少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸が、セリンから誘導されたものである請求項３に記載のポリマー。９．前記ポリマーが、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド−ｃｏ−疑似−Ｚ−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）である請求項１に記載のポリマー。１０．前記ポリマーが、ポリ−Ｐ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド−ｃｏ− 疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）である請求項１に記載のポリマー。１１．前記Ｒ₆が、少なくとも１種の生物学的に活性な活性種である請求項３〜１０のいずれかに記載のポリマー。１２．前記Ｒ₆が、少なくとも１種の生物学的に活性な活性種が結合している、少なくとも１種のスペーサ分子である請求項１１に記載のポリマー。１３．スペーサ分子が、式；Ｒ₇Ｒ₈ＣＯＨＣＯ₂Ｈで表されるα−ヒドロキシ酸（該式中、Ｒ₇及びＲ₈はそれぞれ独立して、水素原子、直鎖状アルキル単位または分岐鎖アルキル単位である）および式Ｒ₉ＣＨＮＨＲ₁₀ＣＯ₂Ｈで表される疑似−α−アミノ酸（該式中、Ｒ₉基はヒドロキシメチル基またはメチルチオール基であり、Ｒ₁₀はアミン保護基である）から選択されたものである請求項１２に記載のポリマー。１４．前記少なくとも１種の生物学的に活性な活性種が、細胞の生物学的な付着基、マクロファージ刺激物質、ポリアミノ酸およびポリエチレングリコールからなる群から選択されたものである請求項１１〜１３のいずれかに記載のポリマー。１５．５０００〜４００００ダルトンの分子量を有する請求項１〜１４のいずれかに記載のポリマー。１６．生物学的に活性な物質の宿主への配送のための粒子担体の形に形成されている請求項１〜１５に記載のポリマー。１７．前記粒子担体が１〜５０μｍの大きさを有する請求項１６に記載のポリマー。１８．前記粒子担体が、該粒子担体中に捕獲された、あるいは該粒子担体と物理的に混合された、少なくとも１種の生物学的に活性な物質を有する請求項１６または１７に記載のポリマー。１９．前記少なくとも１種の生物学的に活性な物質が、免疫応答を引き起こすことのできるものである請求項１８に記載のポリマー。２０．少なくとも１種のアジュバントが、捕獲され、あるいは物理的に混合されている請求項１６〜１９のいずれかに記載のポリマー。２１．少なくとも１種のα−ヒドロシキ酸モノマーと、少なくとも１種の疑似 −α−アミノ酸を共重合する工程を有することを特徴とする生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製法。２２．下記式：（上式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅はそれぞれ独立して、水素原子、直鎖状アルキル基および分岐鎖状アルキル基から選択され、Ｒ₆は水素原子、アミン保護基、スペーサ分子及び生物学的に活性な活性種から選択され、Ｘは−Ｏ− 及び−Ｓ−から選択され、ｘおよびｙは整数である）で表わされる生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製法であって、不活性雰囲気条件下で、エステル化触媒の有機溶媒溶液により、少なくとも１種のα−ヒドロシキ酸と、アミン保護基を有する少なくとも１種の疑似−α−アミノ酸とを含むモノマーの混合物を形成する工程と、前記モノマーを共重合させてポリマーを得る工程と、前記ポリマーを反応混合物から単離する工程とを有することを特徴とするポリマーの製造方法。２３．前記形成されたポリマーが、更に、固相触媒による還元または酸触媒の作用で脱保護処理される請求項２２に記載の製造方法。２４．前記脱保護が、酢酸溶液中の臭化水素の存在下における酸触媒作用により行われる請求項２３に記載の製造方法。２５．前記触媒が、２−エチルヘキサン酸第一スズである請求項２２〜２４のいずれかに記載の製造方法。２６．前記有機溶媒が無水クロロホルムである請求項２２〜２５のいずれかに記載の製造方法。２７．ポリマーをフィルムまたは微小粒子に成形する工程を更に含む請求項２２〜２６のいずれかに記載の製造方法。２８．少なくとも１種の生物学的に活性な物質を宿主に配送するための粒子担体の製法であって、（ａ）α−ヒドロキシ酸ポリマーまたはコポリマーを含む有機溶媒相を、分散または溶解した生物学的に活性な物質を含む水性組成物と混合して、第１の油中水型エマルジョンを形成する工程と、（ｂ）前記第１の油中水型エマルジョンを、水性洗剤相に分散して、第２の水中油中水型ダブルエマルジョンを形成する工程と、（ｃ）前記第２のダブルエマルジョンから水を除去して、ミクロスフェア球体）を形成する工程と、（ｄ）前記ミクロスフェアを回収し、その中に前記生物学的に活性な物質を閉じ込める工程とを有することを特徴とする粒子担体の製法。２９．前記ポリマーが、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド−ｃｏ−疑似−Ｚ−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド−ｃｏ −疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）からなる群から選択されたものである請求項２８に記載の製法。３０．前記有機溶媒が、ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトンおよびそれらの混合物からなる群から選択されたものである請求項２８または２９に記載の製法。３１．前記水性洗剤相が、少なくとも１種の非イオン性エマルジョン安定剤を含む請求項２８〜３０のいずれかに記載の製法。３２．前記少なくとも１種の非イオン性エマルジョン安定剤が、ポリビニルアルコール、メチルセルロースおよびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００からなる群から選択されたものである請求項３１に記載の製法。３３．前記第１の油中水型エマルジョンが少なくとも１種のアジュバントを追加的に含む請求項２８〜３２のいずれかに記載の製法。３４．前記第１の油中水型エマルジョンが、少なくとも１種の界面活性剤を追加的に含む請求項２８〜３３のいずれかに記載の製法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者クライン、マイケル、エイチ. カナダ国エム２ピー１ビー９オンタリオ州ウィロウダールマンロウブールヴァード 16

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式：上式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は独立して選択され、Ｈ、直鎖または分岐鎖アルキル基から選択され、Ｒ₆はＨ、アミン保護基、スペーサ分子または生物学的に活性な化学種から選択され、ＸはＯまたはＳ基から選択され、ｘおよびｙは整数である、の骨格を有する生体分解性、生体適合性ポリマー。２．ｘおよびｙが、ポリマーが少なくとも約９５％のα−ヒドロキシ残基からなるような値の整数である請求項１に記載のポリマー。３．少なくとも１つのα−ヒドロシキ酸と少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸を含むモノマーの共重合により得られる請求項１に記載のポリマー。４．少なくとも１つのα−ヒドロキシ酸が式Ｒ₁Ｒ₂ＣＯＨＣＯ₂Ｈを有し、上式中、Ｒ₁およびＲ₂基はＨ、線状または枝分かれアルキル単位であり、アルキル単位は式Ｃ_nＨ_2n+1で表され、上式中、ｎは約１から１０の整数である請求項３に記載のポリマー。５．α−ヒドロキシ酸がα−ヒドロキシ酸混合物を含み、前記α−ヒドロキシ酸混合物の１つが水素であるＲ₁およびＲ₂基を有し、前記α−ヒドロキシ酸混合物のその他がＣＨ₃であるＲ₁基およびＨであるＲ₂基を有する請求項４に記載のポリマー。６．少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸が式Ｒ₅ＣＨＮＨＲ₆ＣＯ₂Ｈを有し、上式中、Ｒ₅基はヒドロキシメチルまたはメチルチオール基であり、Ｒ₆はアミン保護基である請求項３に記載のポリマー。７．アミン保護基を、カルボベンジルオキシ（ＣＢＺまたはＺ）、ベンジル（Ｂｎ）、パラメトキシベンジル（ＭｅＯＢｎ）、べンジルオキシメトキシ（ＢＯＭ）、第三ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯｃ）および［９−フルオレニルメチルオキシ］カルボニル（ＦＭＯＣ）からなる群から選択する請求項６に記載のポリマー。８．少なくとも１つのα−ヒドロキシ酸を、Ｌ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシ酪酸からなる群から選択する請求項３に記載のポリマー。９．少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸がセリンから得られる請求項３に記載のポリマー。１０．前記ポリマーがポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド−コ−疑似−Ｚ −セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）である請求項１に記載のポリマー。１１．前記ポリマーがポリ−Ｐ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド−コ−疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）である請求項１に記載のポリマー。１２．Ｒ₆が少なくとも１つの生物学的に活性な化学種である請求項１に記載のポリマー。１３．Ｒ₆が、少なくとも１つの生物学的に活性な化学種が結合した少なくとも１つのスペーサ分子である請求項１２に記載のポリマー。１４．スペーサ分子を、式Ｒ₇Ｒ₈ＣＯＨＣＯ₂Ｈで表されるα−ヒドロキシ酸（上式中、Ｒ₇またはＲ₈基は独立して、直鎖または分岐鎖アルキル単位である）および式Ｒ₉ＣＨＮＨＲ₁₀ＣＯ₂Ｈで表される疑似−α−アミノ酸（上式中、Ｒ₉基はヒドロキシメチルまたはメチルチオール基であり、Ｒ₁₀はアミン保護基である）から選択する請求項１３に記載のポリマー。１５．少なくとも１つの生物学的に活性な化学種を、細胞生体接着基、マクロファージ刺激物質、ポリアミノ酸およびポリエチレングリコールからなる群から選択する請求項１２に記載のポリマー。１６．分子量が約５０００から約４００００ダルトンである請求項１に記載のポリマー。１７．少なくとも１つのα−ヒドロシキ酸モノマーと少なくとも１つの疑似−α −アミノ酸モノマーを共重合することを含む生体分解性、生体適合性ポリマーの製法。１８．請求項１に記載の式を有する生体分解性、生体適合性ポリマーの製法であって、 −不活性雰囲気条件下、エステル化触媒の有機溶媒溶液を使用して、少なくとも１っのα−ヒドロシキ酸とアミン保護基を有する少なくとも１つの疑似−α−アミノ酸を含むモノマー混合物を形成するステップと、 −前記モノマーを共重合するステップと、 −得られたポリマーを単離するステップとを含む方法。１９．形成されたポリマーを固相触媒による還元または酸触媒作用で脱保護する請求項１８に記載の方法。２０．前記脱保護を、酢酸溶液中、臭化水素の存在下、酸触媒作用により実施する請求項１９に記載の方法。２１．前記触媒が２−エチルヘキサン酸第一スズである請求項１８に記載の方法。２２．前記重合を約１２０℃の温度で約２８時間実施する請求項１８に記載の方法。２３．前記有機溶媒が無水クロロホルムである請求項１８に記載の方法。２４．前記方法がさらに、ポリマーをフィルムに形成するステップを含む請求項１８に記載の方法。２５．前記方法がさらに、ポリマーを微小粒子に形成するステップを含む請求項１８に記載の方法。２６．生物学的に活性な物質を宿主に送達するための粒状担体であって、一般式：上式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は独立して選択され、Ｈ、直鎖または分岐鎖アルキル基から選択され、Ｒ₆はＨ、アミン保護基、スペーサ分子または生物学的に活性な化学種から選択され、ＸはＯまたはＳ基から選択され、ｘおよびｙは整数である、の骨格を有するポリマーを含む粒状担体。２７．前記担体の粒径が約１から５０μＭである請求項２６に記載の粒状担体。２８．前記ポリマーの分子量が約５０００から約４００００ダルトンである請求項２７に記載の粒状担体。２９．前記ポリマーの少なくとも約９５％がα−ヒドロキシ酸残基からなる請求項２８に記載の粒状担体。３０．請求項２６に記載の粒状担体とその担体内に閉じ込めた少なくとも１つの生物学的に活性な物質を含む組成物。３１．請求項２６に記載の粒状担体とその担体と物理的に混合した少なくとも１つの生物学的に活性な物質とを含む組成物。３２．前記少なくとも１つの生物学的に活性な物質が免疫応答を誘導できる請求項３０または３１に記載の組成物。３３．前記少なくとも１つの生物学的に活性な物質が少なくとも１つのインフルエンザ菌のタンパク質を含む請求項３２に記載の組成物。３４．インフルエンザ菌のタンパク質を、非タンパク質分解性Ｈｉｎ−４７類似体、Ｄ１５、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ６およびそれらの混合物からなる群から選択する請求項３３に記載の組成物。３５．前記少なくとも１つの生物学的に活性な物質が少なくとも１つのインフルエンザウィルスまたはインフルエンザウィルスのタンパク質を含む請求項３２に記載の組成物。３６．前記インフルエンザウィルスが多価インフルエンザウィルスワクチンを含む請求項３５に記載の組成物。３７．前記インフルエンザウィルスが一価インフルエンザウィルスワクチンを含む請求項３５に記載の組成物。３８．前記インフルエンザウィルスのタンパク質が一価インフルエンザウィルスワクチンのタンパク質を含む請求項３５に記載の組成物。３９．前記少なくとも１つの生物学的に活性な物質が少なくとも１つのモラクセラ・カタラーリスのタンパク質を含む請求項３２に記載の組成物。４０．少なくとも１つのモラクセラ・カタラーリスのタンパク質がモラクセラ・カタラーリスのＴｂｐ２タンパク質である請求項３９に記載の組成物。４１．前記少なくとも１つの生物学的に活性な物質が少なくとも１つのヘリコバクター・ピロリのタンパク質を含む請求項３２に記載の組成物。４２．前記ヘリコバクター・ピロリのタンパク質がウレアーゼを含む請求項４１に記載の組成物。４３．その中に閉じ込められた少なくとも１つのアジュバントをさらに含む請求項２６に記載の組成物。４４．その中に混合された少なくとも１つのアジュバントをさらに含む請求項２６に記載の組成物。４５．前記アジュバントを、リポペプチド、無機塩、脂質、糖脂質、炭水化物ならびにそれらの組み合わせ、誘導体および混合物からなる群から選択する請求項４３または４４に記載の組成物。４６．前記アジュバントが有機溶媒溶解性アジュバントである請求項４５に記載の組成物。４７．前記アジュバントを、ＢＡＹＲ１−００５、トリパルミトイルシステインおよびＤＣ−ｃｈｏｌからなる群から選択する請求項４６に記載の組成物。４８．前記アジュバントが水溶性アジュバントである請求項４５に記載の組成物。４９．前記アジュバントがポリマー性水溶性アジュバントである請求項４８に記載の組成物。５０．前記ポリマーアジュバントがＰＣＰＰである請求項４９に記載の組成物。５１．前記水溶性アジュバントが粘膜アジュバントである請求項４９に記載の組成物。５２．前記粘膜アジュバントがＣＴ−Ｘである請求項５１に記載の組成物。５３．前記粘膜アジュバントがＬＴである請求項５１に記載の組成物。５４．前記担体が、約１から５０μＭの粒径を有するマトリックスを含む請求項３０または３１に記載の組成物。５５．少なくとも１つの生物学的に活性な物質を宿主に送達するための粒状担体の製法であって、（ａ）α−ヒドロキシ酸ポリマーまたはコポリマーを含む有機溶媒相を、分散または溶解した生物学的に活性な物質を含む水性組成物と混合して、第１の油中水型エマルジョンを形成するステップと、（ｂ）第１の油中水型エマルジョンを水性洗剤相に分散して、第２の水中油中水型ダブルエマルジョンを形成するステップと、（ｃ）第２のダブルエマルジョンから水を除去して、ミクロスフェアを形成するステップと、（ｄ）ミクロスフェアを回収し、その中に前記生物学的に活性な物質を閉じ込めるステップとを含む方法。５６．前記ポリマーを、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド−コ−疑似−Ｚ−セリンエステル（ＰＬＧｐＺＳ）およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド−コ−疑似−セリンエステル（ＰＬＧｐＳ）からなる群から選択する請求項５５に記載の方法。５７．前記有機溶媒を、ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトンおよびそれらの混合物からなる群から選択する請求項５５に記載の方法。５８．前記水性洗剤相が少なくとも１つの非イオン性エマルジョン安定剤を含む請求項５８に記載の方法。５９．前記少なくとも１つの非イオン性エマルジョン安定剤を、ポリビニルアルコール、メチルセルロースおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる群から選択する請求項５８に記載の方法。６０．前記第１の油中水型エマルジョンが少なくとも１つの有機溶媒溶解性アジュバントを含む請求項５５に記載の方法。６１．前記有機溶媒溶解性アジュバントが親油性である請求項５５に記載の方法。６２．前記アジュバントを、ＢＡＹＲ１−０５５、トリパルミトイルシステインおよびＤＣ−Ｃｈｏｌからなる群から選択する請求項６１に記載の方法。６３．前記第１の油中水型エマルジョンが少なくとも１つの水溶性アジュバントをさらに含む請求項５５に記載の方法。６４．前記水溶性アジュバントがポリマーの水溶性アジュバントである請求項６３に記載の方法。６５．前記ポリマー性水溶性アジュバントがＰＣＰＰである請求項６４に記載の方法。６６．前記水溶性アジュバントが粘膜アジュバントである請求項６２に記載の方法。６７．前記粘膜アジュバントがＣＴ−Ｘである請求項６３に記載の方法。６８．前記粘膜アジュバントがＬＴである請求項６６に記載の方法。６９．前記第１の油中水型エマルジョンが少なくとも１つの表面活性剤をさらに含む請求項５５に記載の方法。７０．前記表面活性剤を、蔗糖、マンノース、トレハロースおよびゼラチンからなる群から選択する請求項６９に記載の方法。７１．請求項２６に記載の粒状担体、免疫原およびその生理学的に許容される担体を含む免疫原性組成物。７２．請求項７１に記載の免疫原性組成物を宿主に投与することを含む、宿主で免疫応答を起こす方法。７３．前記組成物を粘膜からまたは非経口的に投与する請求項７２に記載の方法。７４．前記免疫応答が抗体応答である請求項７２に記載の方法。７５．前記抗体応答が局所または血清抗体反応である請求項７４に記載の方法。