JP5153072B2 - ベクター - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は遺伝子導入技術に係るベクターに関する。
【発明の背景】
【0002】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのDNAの発現を目的としており、いかにDNAを標的部位に到達させるか、いかにDNAを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来DNAの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【0003】
DNAを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、例えば、リポフェクチン(Lipofectin)(登録商標)として商品化された、カチオン性脂質であるジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム(Felgner
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413−7417,1987)がある。ベクター用の合成高分子としてはポリエチレンイミンもエキソゲン(Exogen)として商品化されている。
【0004】
DNAと脂質との複合体についてはFelgner等、PNAS,84(1987)7413に記載されている。
【0005】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。
【発明の概要】
【0006】
本発明によれば、核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて核酸を酵素から保護することができるベクターが提供される。
【0007】
本発明のベクターは、分岐鎖を有するポリマーよりなるベクターにおいて、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として複数のカチオン性の高分子鎖が結合しているベクターであって、該高分子鎖の数が4又は6であり、該高分子鎖が3−N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体であることを特徴とする。
【0008】
本発明のベクターは、核酸凝集体と複合体を形成させて生体内へ投与される。
【0009】
体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。
【0010】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明のベクターを用いた核酸含有複合体では、核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて酵素から保護するので、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。また、ミクロ又はナノオーダーのサイズのカプセルやミセルなどへ核酸複合体を挿入して血管内へ投与するようなことも可能である。
【発明の好ましい形態】
【0011】
本発明で用いるカチオン性ポリマーは分岐鎖を有する。
【0012】
本発明の一態様にあっては、ベクターは、特定の分子量範囲で効果が増強され、その範囲が分岐鎖の数によってそれぞれ異なる。
【0013】
本発明の一態様にあっては、ベクターは、高分子鎖の数が4であって、分子量が30000〜65000である。
【0014】
本発明の一態様にあっては、ベクターは、高分子鎖の数が6であって、分子量が10000〜50000である。
【0015】
本発明の一態様にあっては、ベクターは、ベンゼン環を核として、この核に分岐鎖として複数の高分子鎖が結合しているポリマーよりなるベクターであり、該高分子鎖の先端側に非イオン性の分子団が結合している。この非イオン性の分子団は、芳香族化合物、脂肪族化合物、ポリアクリル酸エステル、又はポリメタクリル酸エステルであってもよい。
【0016】
本発明にあっては、分岐鎖がベンゼン環に複数個結合している。この結合数は4又は6であり、結合数が多い程効果的である。
【0017】
分岐鎖を結合させる核となるのはベンゼン環である。具体的には次が例示される。即ち、4分岐鎖としては、1,2,4,5−テトラキス(ブロモメチル)ベンゼンとナトリウムN,N−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる1,2,4,5−テトラキス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)ベンゼンであり、6分岐鎖としては、ヘキサキス(ブロモメチル)ベンゼンとナトリウムN,N−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)ベンゼンである。
【0018】
分岐鎖は、3−N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドCH2=CHCONHC3H6N(CH3)2の重合体である。
【0019】
この3−N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと上記の各ベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−CH2−を介して上記ビニル系モノマーの重合体が結合したカチオン性ポリマーが生成する。このベクターの分子量は5千〜50万、特に5千〜10万とりわけ1万〜5万程度が好ましい。また、分岐鎖が共重合体の場合は、ランダム共重合体又はブロック共重合体のいずれでもよく、モノマーとしてはカチオン官能性のモノマーを含んでいれば、非イオン性や疎水性モノマーとの共重合体でもよい。非イオン性モノマーとしては、N,N−ジメチルアクリルアミド、N−ビニルピロリドン、PEG−(メタ)アクリレートなど非イオン性親水性モノマーが好適であり、疎水性モノマーとしては、エチル(メタ)アクリレート、スチレンなどが好適である。このようにして生成したカチオン性ポリマーよりなるベクターが核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【0021】
また、本発明のベクター内のカチオン性ポリマーはその正電荷が経時的に失活する性質を有していても良い。このようにベクター内の正電荷が失活することで、ベクターが包囲した核酸凝集体から核酸を放出する機能を付与することができる。この核酸の放出はベクターが細胞膜を透過した後に行われるよう当業者によって適宜条件を設定すれば良い。このような機能を有するカチオン性ポリマーとしては、長鎖状の分岐鎖に4,4’−ベンジリデンビス(N,N−ジメチルアニリン)骨格を有する化合物が担持されているものが挙げられる。4,4’−ベンジリデンビス(N,N−ジメチルアニリン)骨格を有する化合物としてはロイコマラカイトグリーンが挙げられ、該化合物を担持したカチオン性ポリマーは光照射によってカチオン化し、経時的に正電荷を失活する性質を有している。
【0022】
カチオン性ポリマーよりなるベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度1〜1000μg/mL程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してカチオン性ポリマーを過剰量添加し、カチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【0023】
この核酸としては、デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチド特にDNAが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【0024】
核酸は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV1−TK遺伝子),p53癌抑制遺伝子及びBRCA1癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてTNF−α遺伝子,IL−2遺伝子,IL−4遺伝子,HLA−B7/IL−2遺伝子,HLA−B7/B2M遺伝子,IL−7遺伝子,GM−CSF遺伝子,IFN−γ遺伝子及びIL−12遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにgp−100,MART−1及びMAGE−1などの癌抗原ペプチド遺伝子であってもよく、これらは癌治療に利用できる。
【0025】
また、VEGF遺伝子,HGF遺伝子及びFGF遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにc−mycアンチセンス,c−mybアンチセンス,cdc2キナーゼアンチセンス,PCNAアンチセンス,E2Fデコイやp21(sdi−1)遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【0026】
核酸含有複合体の粒径は50〜400nm程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【0027】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばDNAの場合、導入された細胞内で当該DNAが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該DNAが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするDNA、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【0028】
所望により2種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【0029】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸(すなわちその機能)に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞、腫瘍細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、SP細胞、ES細胞、B細胞、T細胞、NK細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜A細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【0030】
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
【0031】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔(心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等)内、骨髄内への投与の他に、例えば、気管内視鏡を用いて肺胞へ噴霧するなど病変組織内に直接投与することも可能である。
【0032】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体(浸透圧調整剤,安定化剤、保存剤、可溶化剤、pH調整剤、増粘剤等)と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。また、当業者に良く知られている、核酸複合体を一度体外で使用してから生体へ投与する間接的方法も利用可能である。例えば、生体から採取した、腫瘍細胞傷害性の高いリンパ球などの細胞へ生体外で核酸複合体を作用させて薬剤感受性を与えて培養し、これを生体内へ投与するという方法である。この場合は腫瘍細胞を培養したリンパ球で傷害させ、副作用が確認された場合に薬剤で投与したリンパ球を死滅させることが可能である。
【0033】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる2種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【0034】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【0035】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌(悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等)、感染症(HIV等)、単一遺伝病(嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α1−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等)等が挙げられる。
【実施例】
【0036】
参考例1[1分岐型ベクターの合成]
まず、下記反応式(化1)に従って、ベンジルN,N−ジエチルジチオカルバメートを合成した。
【0037】
【化1】
【0038】
即ち、ナトリウムN,N−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート(10.3g,46mmol,Mw.225.31)を含むエタノール溶液50ml中に塩化ベンジル(4.8g,38mmol,Mw.126.58)を含むエタノール溶液10mlを窒素雰囲気下0℃で滴下した。反応溶液を室温で23時間撹拌した後、150mlの水を加え、ジエチルエーテルで抽出した(200ml×3回)。有機層を水洗いし(100ml×3回)、硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレータを用いて減圧下で溶媒を留去し、ベンジルN,N−ジエチルジチオカルバメートを得た(無色液体)。収量は17.6g(収率93%)であり、1H−NMR:δ7.407〜7.271ppm(m,5H,Ar−H)δ4.540ppm(s,2H,Ar−CH2S)、δ4.082〜4.012ppm(q,2H,−N−CH2−)、δ3.763ppm〜3.692ppm(q,2H,−N−CH2−)、δ1.311〜1.252ppm(m,6H,−CH2−CH3)である。
【0039】
次に、このベンジルN,N−ジエチルジチオカルバメートを用い、下記反応式(化2)に従ってジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させた。
【0040】
【化2】
【0041】
即ち、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(3.9g,24.96mmol,Mw.156.23)とベンジルN,N−ジエチルジチオカルバメート(23.94mg,0.1mmol,Mw.239.41)の混合物をメタノールで希釈し、全量20mlの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光(光量1mW/cm2)を照射した。紫外光照射30分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去し、高分子を水に溶解し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、GPCにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約18,000であり、1H−NMR:δ7.8〜7.4ppm(br,1H,−NH)、δ3.43〜3.0ppm(br,2H,−NH−CH2−CH2−)、δ2.4〜2.2ppm(br,2H,−CH2−CH2−NR2)、δ2.2〜2.1ppm(br,6H,−N−CH3)、δ1.8〜1.5ppm(br,2H,−CH2−CH2−CH2−)であった。
【0042】
参考例2[3分岐型ベクターの合成]
次に、下記反応式(化3)に従ってナトリウムN,N−ジエチルジチオカルバメートと2,4,6−トリス(ブロモメチル)メシチレンとを反応させ、2,4,6−トリス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)メシチレンを合成した。
【0043】
【化3】
【0044】
即ち、2,4,6−トリス(ブロモメチル)メシチレン(2g,4.02mmol,Mw.398.98)にエタノール(100ml)とナトリウムN,N−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート(5.43g,24.12mmol,Mw.225.31)を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始24時間後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケータにて真空乾燥させて2,4,6−トリス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)メシチレンを得た(白色固体)。収量は3.03g(収率98.4%)であり、1H−NMR:δ4.447ppm(s,6H,Ar−CH2S)、δ4.086〜4.015ppm(q,6H,−N−CH2−)、δ3.746〜3.676ppm(q,6H,−N−CH2−)、δ2.421ppm(s,9H,Ar−CH3)、δ1.324〜1.222ppm(m,18H,−CH2−CH3)であった。
【0045】
この2,4,6−トリス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)メシチレンに対し、下記反応式(化4)に従ってジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて3分岐型ベクターを合成した。
【0046】
【化4】
【0047】
即ち、2,4,6−トリス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)メシチレン(20.14mg,1.67mmol,Mw.604.08)をクロロホルム(300μl)に溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(1.6224g,10.38mmol,Mw.156.23)に加えた。この混合物をメタノールで希釈し、全量20mlの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光(光量1mW/cm2)を照射した。紫外光照射30分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、GPCにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約18,000であった。また、1H−NMR:δ7.7〜7.4ppm(br,1H,−NH)、δ3.4〜3.0ppm(br,2H,−NH−CH2−CH2−)、δ2.4〜2.3ppm(br,2H,−CH2−CH2−NR2)、δ2.3〜2.1ppm(br,6H,−N−CH3)、δ1.8〜1.5ppm(br,2H,−CH2−CH2−CH2−)であった。
【0048】
実施例1[4分岐型ベクターの合成]
まず、下記反応式(化5)に従って、1,2,4,5−テトラキス(N,N−ジチオカルバミルメチル)ベンゼンを合成した。
【0049】
【化5】
【0050】
即ち、1,2,4,5−テトラキス(ブロモメチル)ベンゼン(1g,2.22mmol,Mw.449.83)にエタノール(100ml)とナトリウムN,N−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート(4g,17.76mmol,Mw.225.31)を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始48時間後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケータにて真空乾燥させて1,2,4,5−テトラキス(N,N−ジチオカルバミルメチル)ベンゼンを得た(白色固体)。収量1.48g(収率91.4%)。1H−NMR測定をした結果、δ7.487ppm(s,2H,Ar−H)、δ4.573ppm(s,8H,Ar−CH2S)、δ4.065〜3.994ppm(q,8H,−N−CH2−)、δ3.765〜3.687ppm(q,8H,−N−CH2−)、δ1.304〜1.256ppm(t,24H,−CH2−CH3)であった。
【0051】
次に、下記反応式(化6)に従い、この1,2,4,5−テトラキス(N,N−ジチオカルバミルメチル)ベンゼンにジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて4分岐型ベクターを合成した。
【0052】
【化6】
【0053】
即ち、1,2,4,5−テトラキス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)ベンゼン(18.08mg,1.25mmol,Mw.723.30)をクロロホルム(300μl)に溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(1.326g,8.49mmol,Mw.156.23)に加えた。この混合物をメタノールで希釈し、全量20mlの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光(光量1mW/cm2)を照射した。紫外光照射30分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、GPCにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約18,000であった。また、1H−NMR:δ7.8〜7.4ppm(br,1H,−NH)、δ3.4〜3.0ppm(br,2H,−NH−CH2−CH2−)、δ2.4〜2.2ppm(br,2H,−CH2−CH2−NR2)、δ2.2〜2.1ppm(br,6H,−N−CH3)、δ1.8〜1.5ppm(br,2H,−CH2−CH2−CH2−)であった。
【0054】
実施例2[6分岐型ベクターの合成]
まず、下記反応式(化7)に従って、ヘキサキス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)ベンゼンを合成した。
【0055】
【化7】
【0056】
即ち、ヘキサキス(ブロモメチル)ベンゼン(1g,1.57mmol,Mw.635.68)にエタノール(200ml)とナトリウムN,N−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート(6.36g,28.23mmol,Mw.225.31)を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始4日後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケーターにて真空乾燥させてヘキサキス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)ベンゼンを得た(白色固体)。収量は1.48g(収率90.2%)であり、1H−NMR:δ4.565ppm(s,12H,Ar−CH2S)、δ4.012〜3.988ppm(q,12H,−N−CH2−)、δ3.731〜3.708ppm(q,12H,−N−CH2−)、δ1.307〜1.261ppm(m,36H,−CH2−CH3)であった。
【0057】
次に、下記反応式(化8)に従い、このヘキサキス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)ベンゼンにジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて6分岐型ベクターを合成した。
【0058】
【化8】
【0059】
即ち、ヘキサキス(N,N−ジエチルジチオカルバミルメチル)ベンゼン(17.43mg,0.83mmol,Mw.1045)を少量のクロロホルムに溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(3.9g,24.96mol,Mw.156.23)に加えた。この混合物をクロロホルムで希釈し、全量20mlの溶液を調整した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光(光量1mW/cm2)を照射した。紫外光照射30分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、GPCにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約18,000であった。また、1H−NMR:δ7.8〜7.4ppm(br,1H,−NH)、δ3.43〜3.0ppm(br,2H,−NH−CH2−CH2−)、δ2.4〜2.2ppm(br,2H,−CH2−CH2−NR2)、δ2.2〜2.1ppm(br,6H,−N−CH3)、δ1.8〜1.5ppm(br,2H,−CH2−CH2−CH2−)であった。
【0060】
(核酸含有複合体の形成)
各ベクター(2.36mg,M.w.18,000)をそれぞれトリス−HCl−バッファー(2ml)に溶解した。この溶液を50μl採取し、トリス−HCl−バッファーを加えて希釈し、全量500μlのベクター溶液とした。別に、pGL3コントロールプラスミド(0.2μg/μl,90μl)に2×バッファー溶液(450μl)を加え、全量540μlのDNA溶液を調製した。DNA溶液(100μl)にベクター溶液(67μl)を加え(カチオン性高分子の正電荷量とDNAの負電荷量の比は1:1)、37℃で24時間静置させ、核酸含有複合体を形成させた。動的光散乱測定によりポリイオンコンプレックスの粒径測定を行なった結果を図1に示す。また、この平均粒径の経時変化を図2に示す。
【0061】
図1,2に示すように、各カチオン性高分子はDNAと混合直後にポリイオンコンプレックスを形成した。キュムラント解析による粒径では約250nmのナノ粒子を生成しており、24時間後も安定であるとわかった。
【0062】
24well−plate上で培養1日目のCOS−1細胞に、1well当たり25μlのポリイオンコンプレックス溶液を添加し、5%CO2インキュベータ内で培養した。培養3時間後、培地を除去し、PBSで洗浄した後、1well当たり1mlのDMEMを加え、再度5%CO2インキュベータ内で培養した。培養2日後、培地を除去し、PBSで洗浄した後、Luciferase cell culture
lysis5×Reagentを1well当たり200μl加え、静置させた。30分後、細胞をエッペンドルフ型チューブに移し、遠心分離した(4℃、15000rpm、1min)。遠心後、上清を4μlずつマイクロプレートに採取し、ルミノメータでルシフェラーゼ活性を測定した。また、遠心後の上清を5μl採取し、蛋白定量を行なった。
【0063】
分岐数の異なる高分子ベクターを用いてトランスフェクション実験を行なうと、C/A比が10の場合、図3に示すように、高分子の分岐数が増加するにつれて遺伝子発現効率は大幅に増加した。また、最も高い遺伝子発現効率を示した6分岐型カチオン性高分子を用いて、C/A比(カチオン/アニオン比)を変化させたときの遺伝子発現効率への影響ついても調べた。図4に示すように、C/A=40のとき、最も高い遺伝子発現効率を示した。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、ポリイオンコンプレックスの粒状分布の測定結果を示すグラフである。
【図2】図2は、ポリイオンコンプレックスの粒径の経時変化を示すグラフである。
【図3】図3は、トランスフェクション実験の結果を示すグラフである。
【図4】図4は、カチオン/アニオン比と遺伝子発現効率との関係の測定結果を示すグラフである。
【図5】図5は、リンタングステン酸で染色された遺伝子複合体のTEM写真である。
【図6】図6は、酢酸ウランで染色した遺伝子複合体のTEM写真である。
【図7】図7は、1分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
【図8】図8は、3分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
【図9】図9は、4分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
【図10】図10は、4分岐鎖を有した分子量1万のベクターであって、分岐鎖の先端にジメチルアクリルアミドをブロック重合したものにおいて、ブロック重合体の分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
【図11】図11は、このベクターのブロック重合体、分岐体及びPEIの溶液内安定性(遺伝子発現効率の初期値を100%としたときの経時変化)を示すグラフである。
Claims (9)
- 分岐鎖を有するポリマーよりなるベクターにおいて、
ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として複数のカチオン性の高分子鎖が結合しているベクターであって、
該高分子鎖の数が4又は6であり、
該高分子鎖が3−N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体であることを特徴とするベクター。 - 請求項1において、該高分子鎖の先端側に非イオン性の分子団が結合していることを特徴とするベクター。
- 請求項2において、該非イオン性の分子団が芳香族化合物であることを特徴とするベクター。
- 請求項2において、該非イオン性の分子団が脂肪族化合物であることを特徴とするベクター。
- 請求項2において、該非イオン性の分子団がポリアクリル酸エステルであることを特徴とするベクター。
- 請求項2において、該非イオン性の分子団がポリメタクリル酸エステルであることを特徴とするベクター。
- 請求項1ないし6のいずれか1項において、分子量が5千〜50万であることを特徴とするベクター。
- 請求項7において、分子量が5千〜5万であることを特徴とするベクター。
- 請求項1ないし8のいずれか1項において、カチオン性ポリマーの正電荷が経時的に失活することを特徴とするベクター。
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