JP2007124956A - 遺伝子ベクター - Google Patents

Abstract

【課題】マクロファージーやリンパ球などの休止期細胞への遺伝子導入も可能な遺伝子ベクターを提供する。
【解決手段】芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物に、Ｃ４５Ｄ１８、Ｃ４５Ｄ２０及びＣ４５Ｄ２９よりなる群から選ばれる１種又は２種以上のペプチドを固定してなる遺伝子ベクター。複数の高分子鎖のうちの少なくとも一つの高分子鎖は、その先端側に、反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖を有し、ペプチドは、該高分子ブロック鎖の反応活性を有する官能基を介して固定されている。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子ベクターに係り、特に、合成高分子に特定のペプチドを固定してなり、休止期細胞への遺伝子導入も可能な遺伝子ベクターに関する。

近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。

従来、細胞へ遺伝子を導入する技術としては次のようなものが知られているが、いずれも以下に述べるような欠点がある。
（１）ウイルスベクター法
（２）エレクトロポーション法、マイクロインジェクション法等
（３）リポフェクチン法、ポリカチオン法等

（１）ウイルスベクター法
(1) ウイルス全般については、合成工程が複雑で感染の危険性がある；ウイルス内には挿入できないような大きな核酸が導入できない（例えばアデノウイルスでは、導入サイズは９０００ｂ以下である。）；といった欠点がある。
(2) レセプターを介して細胞へ侵入するタイプのウイルスの場合、レセプターが発現されていない細胞へは導入できない；遺伝子治療を目指して研究をする場合に、マウスなど小動物での実験が必須であるが、ヒト細胞に存在するレセプターがマウスに存在しなければ実験が成立しない；細胞の種類によってレセプター発現量が異なり、これが導入効率に影響してしまう；アデノウイルスの設計には主としてＣＡＲ（コサッキーアデノウイルスレセプター）を利用するが、疾病によってＣＡＲの発現量が少ない患者も多く、遺伝子治療への応用に制約を受けることもある；といった欠点がある。
(3) レトロウイルスの場合は、分裂期の細胞にのみ導入が可能で、休止期の細胞へは応用できない；染色体への組み込みが可能で、免疫原性はないが、不安定で生体内使用には不適である；といった欠点がある。

（２） 細胞膜に一時的に孔を開けるマイクロインジェクション、エレクトロポーション、遺伝子銃、マイクロジェット等による方法は、細胞膜が不可逆的な損傷を受け、溶解してしまうため、生存率も５０％以下と低い。神経細胞など増殖性の低い細胞の場合、生存率が低いことは大きな問題となる。即ち、遺伝子を導入できても、細胞が死滅してしまえば遺伝子導入の意味がない。

（３） 細胞のエンドサイトーシスを利用するリポフェクチン法、りん酸カルシウム法、Ｎａｋｅｄプラスミド法、ポリカチオン法は、一般的に遺伝子導入効率が低く、特に、マクロファージー、リンパ球といった休止期細胞への導入は不可能に近い。

本発明は、上記従来の実状に鑑みてなされたものであって、マクロファージーやリンパ球などの休止期細胞への遺伝子導入も可能な遺伝子ベクターを提供することを目的とする。

本発明（請求項１）の遺伝子ベクターは、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物に、Ｃ４５Ｄ１８、Ｃ４５Ｄ２０及びＣ４５Ｄ２９よりなる群から選ばれる１種又は２種以上のペプチドを固定してなる遺伝子ベクターであって、該複数の高分子鎖のうちの少なくとも一つの高分子鎖は、その先端側に、反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖を有し、前記ペプチドは、該高分子ブロック鎖の反応活性を有する官能基を介して固定されていることを特徴とする。

請求項２の遺伝子ベクターは、請求項１において、前記反応活性を有する官能基がアミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、イミド基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、水酸基、アミド、エステル、ジアゾ、アゾメチン、エポキシ基、イソシアネート、チオイソシアネート、エチレン、アセチレン、ブタジエン及びこれらの誘導体分子団よりなる群から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする。

請求項３の遺伝子ベクターは、請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする。

請求項４の遺伝子ベクターは、請求項３において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とする。

請求項５の遺伝子ベクターは、請求項４において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とする。

請求項６の遺伝子ベクターは、請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とする。

請求項７の遺伝子ベクターは、請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とする。

請求項８の遺伝子ベクターは、請求項７において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とする。

請求項９の遺伝子ベクターは、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖と、その先端に結合した、前記反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖とを有することを特徴とする。

請求項１０の遺伝子ベクターは、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖が、ポリアミノスチレン系高分子ブロック鎖であることを特徴とする。

請求項１１の遺伝子ベクターは、請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とする。

請求項１２の遺伝子ベクターは、請求項１１において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５万であることを特徴とする。

請求項１３の遺伝子ベクターは、請求項１ないし１２のいずれか１項において、前記ペプチドがＣ４５Ｄ１８であることを特徴とする。

本発明の遺伝子ベクターで用いられる高分子化合物は、芳香環に導入された高分子鎖の先端側に、反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖（以下、反応活性を有する官能基を「反応性官能基」と称し、反応性官能基を側鎖に称する高分子ブロック鎖を「活性高分子ブロック鎖」と称す場合がある。）を有するため、この活性高分子ブロック鎖の反応性官能基を介して特定のペプチドを固定することができる。

そして、本発明の遺伝子ベクターに固定されたペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（以下『ＨＩＶ−１』という。）の、約１５ｋＤａのアクセサリータンパク質であるＶｐｒ（ウイルス・プロテイン・ｒ）のアミノ酸配列の一部分を有するものである。該ＶｐｒはＨＩＶ−１の感染や遺伝子の不安定化、細胞周期の異常化、アポトーシスの作用を有し、休止期細胞、即ち非分裂細胞に侵入するために必須なものである。

このように、休止期細胞への侵入に必須なアミノ酸配列よりなるペプチドを固定した本発明の遺伝子ベクターであれば、休止期細胞への遺伝子導入が可能である。

以下に本発明の遺伝子ベクターの実施の形態を詳細に説明する。

［ペプチド］
まず、本発明の遺伝子ベクターに固定されているペプチドについて説明する。
本発明の遺伝子ベクターに固定されているペプチドは、以下の［配列表］に記載の、ＨＩＶ-１のアクセサリータンパク質のアミノ酸配列の一部分を有するペプチドであり、休止期細胞、即ち非分裂細胞に侵入するために必須なものである。

このペプチドのうち、Ｃ４５Ｄ１８は、Ｖｐｒタンパク質のアミノ酸配列のうちの５２番から７８番の２７ｍｅｒのアミノ酸配列部分のペプチドであり、Ｃ４５Ｄ２０は、５２番から７６番の２５ｍｅｒのアミノ酸配列部分のペプチドであり、Ｃ４５Ｄ２９は、５２番から６９番の１８ｍｅｒのアミノ酸配列部分のペプチドである。

なお、本発明でいうＶｐｒ、Ｃ４５Ｄ１８などのペプチドは化学的に合成することも可能であるし、天然由来ＤＮＡ、組換え遺伝子、ｃＤＮＡクローンなどから発現させたものでも良く、当然、糖鎖修飾の有無やミスマッチなどによる差異も起こりえるが、相同性が９０％以上あるものを利用する限りは本発明の範囲内である。

本発明の遺伝子ベクターは、これらの３種のペプチドのうちの１種のみが固定されたものであっても良く、２種又は３種が固定されたものであっても良い。

これらのペプチドのうち、特に休止期細胞への遺伝子導入効率が高いことから、Ｃ４５Ｄ１８が最も好ましい。

ペプチドと高分子化合物の固定は、当業者に周知の方法で行うことが可能である。すなわち、ペプチド中のシステインのＳＨ基、ヒスチジンのイミダゾール分子団、アスパラギン酸のカルボキシル基、アルギニンのグアニジル基、セリンのＯＨ基といった反応の拠点となり得る官能基と高分子化合物の反応性官能基とを公知の化学架橋剤などによって結合させれば良い。

例えば、ペプチドがＣ４５Ｄ１８であれば、Ｃ末端領域のシステインのＳＨ基を利用してヘキサメチレンジイソシアネート、Ｎ−（ｅ−マレイミドカプロイロキシ）サクミンイミドエステル又はデナコール（二官能性のエポキシ化合物）などを利用して高分子化合物に固定される。

高分子化合物に対するペプチドの固定割合には特に制限はないが、ペプチドの固定割合が少な過ぎると、休止期細胞へ遺伝子導入効果が得られず、多過ぎると、高分子化合物のポリカチオンとしての性質が損なわれることと、立体的に大きなものとなってしまって遺伝子との複合体の形成に不利となってしまうことから、高分子化合物１分子に対するペプチドの固定量は３個以上、特に３個〜１０個とすることが好ましい。

高分子化合物へのペプチドの固定は、後述の実施例に示されるように、高分子化合物をリン酸バッファー溶液（ｐＨ７，リン酸バッファー溶液の好ましいリン酸濃度は１〜１００ｍＭ程度で、好ましい高分子化合物濃度は０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ程度）として、ここへＮ−（ｅ−マレイミドカプロイロキシ）サクミンイミドエステル等を終濃度０．０１ｍＭ〜１０ｍＭとなるように添加混合し、これに所定量のペプチドを混合することにより行うことができる。

［高分子化合物］
次に、本発明の遺伝子ベクターにおいて、前述のペプチドを固定するための高分子化合物について説明する。

この高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された化合物であって、複数の高分子鎖のうちの少なくとも一つの高分子鎖は、反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖を有するものである。

ここで、この高分子鎖の核となる芳香環としては、炭素数５〜８の芳香環、特に炭素数６の芳香環（即ちベンゼン環）の、単環又は２〜６個の縮合環、例えば、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環、ピレン環が挙げられ、好ましくはベンゼン環である。

核となる芳香環に導入される高分子鎖の数は、ベンゼン環であれば２〜６個、ナフタレン環の場合２〜８個、アントラセン環、ピレン環の場合２〜１０個であるが、多い程効果的であり、例えばベンゼン環であれば２，３，４又は６個、特に４又は６個、とりわけ６個であることが好ましい。

高分子鎖を導入するための原料となる芳香環化合物としては、例えば芳香環がベンゼン環の場合、次のようなベンゼン誘導体が挙げられる。

即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。

芳香環に導入された高分子鎖のうちの少なくとも一つ、好ましくはそのすべてがその先端側に活性高分子ブロック鎖を有するものである。この高分子鎖は、特に、基端側がビルル系単量体の単独又は異なるビニル系単量体の共重合体よりなるビニル系高分子ブロック鎖で、先端側が活性高分子ブロック鎖であるものが好ましく、特に基端側は３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＣ_３Ｈ_６Ｎ（ＣＨ_３）_２等の重合体よりなるポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖であることが好ましい。

なお、ここで、基端側とは高分子鎖のうち芳香環との結合部に近い側をさし、先端側とはこの結合部から遠い側をさす。

また、高分子鎖の先端側の活性高分子ブロック鎖としては、反応性官能基として、前述のペプチドの末端ＳＨ基等と反応活性を有する基、例えばアミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、イミド基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、水酸基、アミド、エステル、ジアゾ、アゾメチン、エポキシ基、イソシアネート、チオイソシアネート及びこれらの誘導体分子団よりなる群から選ばれる、当業者に良く知られる、分子修飾の拠点となり得る官能基（なお、ここで官能基は、ハロゲン原子等の単一原子や末端がフリーでない分子内結合を含む広義の官能基である。）の１種又は２種以上を側鎖に有するものであることが好ましく、従って、これらの反応性官能基を有するビニル系単量体の重合体又は異なるビニル系単量体の共重合体よりなる活性高分子ブロック鎖、例えば、ポリアミノスチレン、ポリブロモメチルスチレン、ポリグリシジルメタクリレートもしくはポリメタクリル酸又はこれらの誘導体からなる活性高分子ブロック鎖であることが好ましい。

芳香環にこのような高分子鎖を導入してなる本発明に係る高分子化合物、例えば、基端側が３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体よりなる高分子ブロック鎖で、先端側が４−アミノスチレンの重合体よりなる活性高分子ブロック鎖よりなる高分子鎖を導入した高分子化合物を合成するには、まず、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと前述の各ベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ_２−等を介して３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子前駆体を製造する。

次に、この高分子前駆体と４−アミノスチレンとをメタノールなどのアルコール溶液として混合し、光重合反応させることにより、高分子前駆体の高分子鎖の先端側に４−アミノスチレンの高分子ブロック鎖を導入する。

なお、この際、本重合方法がＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートをイニファターとした光照射リビングラジカル重合でであることにより、４−アミノスチレンの高分子ブロック鎖の先端には、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル基等の出発原料であるベンゼン誘導体に導入されている置換基が結合している。

本発明において、芳香環に複数の高分子鎖が導入されてなる高分子化合物の分子量は５千〜５０万、特に５千〜５万、とりわけ１万〜２万程度であることが好ましい。この分子量が過度に大きいと、高分子化合物及び核酸で複合体を形成させた際の複合体のサイズが大きくなったり、溶解性が低くなったり、生体内へ使用する場合に、排泄に不利になることが考えられる。逆に過度に小さいと低分子量有機化合物としての性質が強く発生して細胞毒性、高浸透圧、など生物学的な弊害が出てしまう。

また、１本の高分子鎖を構成する単量体の数は、その単量体の種類や反応性等によっても異なるが、基端側のポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖を構成する単量体数は５〜１０００で、先端側の活性高分子ブロック鎖を構成する反応性官能基を有する単量体数は１〜５００で、基端側のポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖を構成する単量体数に対して、先端側の活性高分子ブロック鎖を構成する反応性官能基を有する単量体数が１／１０〜１／２程度であることが好ましい。この単量体数が好適である理由は、基端側の高分子ブロック鎖の単量体数は遺伝子の導入効率が最も高く発現される範囲であることにより、上記範囲であることが好ましく、先端側の高分子ブロック鎖の単量体数は、実質的に遺伝子と複合体を形成するには機能しないことから、上記範囲であることが好ましく、また、基端側の高分子ブロック鎖の単量体数に対して、先端側の活性高分子ブロック鎖の単量体数が多過ぎると遺伝子と静電的に複合体を形成させるためのカチオン性のブロック鎖と遺伝子との距離が長くなり、結果、クーロン力の作用が弱まって複合体形成に影響を与える可能性があり、少な過ぎるとペプチドを固定できる量が少なくなってしまうことによる。

［核酸の投与］
上述のような高分子化合物に前述の特定のペプチドが固定されてなる本発明の遺伝子ベクターは、核酸凝集体と複合体を形成させて生体内へ投与される。

体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。

核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明の遺伝子ベクターを用いた核酸含有複合体では、核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にペプチドを固定したベクターを配置させて酵素から保護するので、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。しかも、ベクターにペプチドが固定されていることにより、休止期細胞内へも容易に侵入し得る。

この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。

本発明の遺伝子ベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子ベクターを過剰量添加し、遺伝子ベクターを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。

核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。

また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。

また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。

核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。

核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。

所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。

本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。

本発明の遺伝子ベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。

当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。

この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。

また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。

投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。

この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。

以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。

［実施例１：ベクターの合成］
〈活性高分子ブロック鎖導入高分子化合物の合成〉
［１］ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの合成

ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３１．８ｇをエタノール１Ｌ中へ加え、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、ここへ１５０ｍＬの水を加えて液液抽出を行って臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させた。濾過後、ｎ−ヘキサンを加えて再結晶を行って、微かに淡青色を帯びたヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの白色結晶を得た（収率９０％）。
¹H NMR(in CDCl₃):δ 1.26-1.31(t,36H,J=6.9 Hz,-CH₂SC(S)N(CH₂CH₃)₂),3.71-4.01(wq,24H,J=6.9 Hz,-CH₂SC(S)N(CH₂CH₃)₂),4.57(s,12H,-CH₂SC(S)NEt₂)

［２］６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーの合成

モノマーの３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドは、減圧蒸留で精製した。ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバミルメチル）ベンゼン８．７ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．９ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで希釈して５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした。２００Ｗ高圧水銀灯で３０分間の光照射を行った。照度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ^２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させて精製した。これを少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させてヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー）を得た（重合率４０％）。

分子量はＧＰＣにより１７，３００と測定され，¹H NMR(in D₂O)の測定結果は、δ 1.00-1.70(br,416H,-CH₂CH-and-CH₂CH₂CH₂-),1.90(br,104H,-CH₂CH-),2.09(s,624H,-N(CH₃)₂),2.25(br,208H,-CH₂N(CH₃)₂),2.98(br,208H,-CONHCH₂-)で、目的物であることを確認した。

［３］６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＡＳの合成

６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー１５０ｍｇをメタノールへ溶解し、ここへ４−アミノスチレン６２０ｍｇを混合して全量をメタノールで５０ｍＬに調整した。上記［２］と同様の手法で光照射重合を行い、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って、ヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（４−アミノスチレン）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＡＳブロックポリマー）を得た（重合率３８％）。

分子量はＧＰＣにより１８，３００と測定され、¹H-NMR(in D₂O)はδ 1.00-1.70(br,432H,-CH₂CH-and-CH₂CH₂CH₂-),1.90(br,104H,-CH₂CH-of PDMAPAAm),2.06(s,624H,-N(CH₃)₂ of PDMAPAAm),2.21(br,208H,-CH₂N(CH₃)₂),3.02(br,208H,-CONHCH₂-),6.40-6.80(br,16H,3-H and 5-H of aromatic ring proton),6.95-7.30(br,16H,2-H and 6-H of aromatic ring proton)と測定された。

以上より、６分岐型ポリマーの６本のポリマー鎖に各々、１８個モノマー単位の３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックと、６個モノマー単位の４−アミノスチレンのポリマーブロックが導入された６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｐＡＳブロックポリマーが合成されたことが確認された。

〈活性高分子ブロック鎖導入高分子化合物へのペプチドの固定〉
Ｃ４５Ｄ１８ペプチドは化学的に合成した。
このペプチドのＣ末端領域にあるシステインＳＨ基を利用して高分子化合物に導入した。

まず、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーを１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）へ溶解して濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。ここへＮ−（ｅ−マレイミドカプロイロキシ）サクミンイミドエステルを終濃度０．１ｍＭとなるように混合し、室温で３０分間攪拌した。６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマーの３倍モル量となるようにＣ４５Ｄ１８ペプチドを室温下で混合し、３時間放置した。未反応のペプチドはリン酸バッファーを使用して透析して除去し、Ｃ４５Ｄ１８導入−６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー（以下「Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶ」と称す。）を得た。このＣ４５Ｄ１８−ＳＶは、６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー１分子に対して、Ｃ４５Ｄ１８が３分子固定されたものである。

［実施例２及び比較例１：遺伝子導入実験−その１］
〈休止期細胞の準備〉
休止期細胞は、ＨＴ１０８０（ヒト繊維肉腫細胞株）をＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ添加培地で培養し、トランスフェクションの３日前より、０．１％ＦＣＳ添加培地へ変更して休止期とさせた。増殖期の細胞に関しては、１０％ＦＣＳ添加培地で培養したものを遺伝子導入に使用した。

〈遺伝子導入及び測定〉
ｐＧＬ３プラスミドを使用し、レポータージーンアッセイを行った。Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶとＤＮＡとの複合体（実施例２）と、ＳＶ（Ｃ４５Ｄ１８を導入していない６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭ−ｂ−ｐＡＳブロックポリマー）とＤＮＡとの複合体（比較例１）をそれぞれ１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートし、これを培養細胞へ加えた。ＤＮＡ量は２５０ｎｇとなるように調整した。トランスフェクションから４８時間後にルシフェラーゼアッセイを行った（東洋インキ社，ピッカジーン試薬）。補正はタンパク量で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。

結果は図１の通り、増殖期の細胞（ＨＴ１０８０の１０％ＦＣＳ培養系）に関しては、ＳＶ、Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶともに遺伝子導入効率に差は確認されなかったが（図１（ａ））、休止期の細胞（ＨＴ１０８０の０．１％ＦＣＳ培養系）に関しては、ＳＶでは遺伝子導入活性がほとんど確認されなかったのに対し、Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶでは遺伝子導入活性が確認された（図１（ｂ））。

〈細胞周期の確認〉
細胞を３０分間，２４時間，４８時間、１０μＭ ＢｒｄＵ（Bromodeoxyuridine）で処理し、７０％氷冷エタノールで固定後、抗ＢｒｄＵ抗体で処理し、Ｃｙ３でラベルしたマウスＩｇＧで検出した。ＢｒｄＵ陽性割合は、１０％ＦＣＳ添加培地で培養した系で４３％、０．１％ＦＣＳ添加培地で培養した系で９％となった。これよりＳ期細胞数が０．１％ＦＣＳ添加系で顕著に減少することことが確認された。

［実施例３及び比較例２：遺伝子導入実験−その２］
〈休止期細胞の準備〉
ＴＨＰ−１細胞をＩＭＤＭ １０％ＦＣＳ添加培地で培養し、ポリ−Ｄ−リジンをコーティングした６Ｗｅｌｌプレートへ播種し（播種密度：１×１０^５個）、５×１０^−８Ｍ ＰＭＡ（Phorpbol mystate acetate）で２日間処理して分化させ、Ｍａｃ−１の発現を特異抗体で確認した。

〈遺伝子導入実験〉
ｐＧＬ３プラスミドを使用し、レポータージーンアッセイを行った。Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶとＤＮＡとの複合体（実施例３）又はＳＶとＤＮＡとの複合体（比較例２）を１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートし、これを培養細胞へ加えた。ＤＮＡ量は２５０ｎｇとなるように調整した。トランスフェクションから４８時間後にルシフェラーゼアッセイを行った（東洋インキ社，ピッカジーン試薬）。補正はタンパク量で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。

結果は図２の通り、Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶ群でのみ高い遺伝子発現が確認された。

また、同様の手順で、ｐＧＬ３に替えてｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミドを使用してトランスフェクションを行い、遺伝子発現レベルを解析するために、逆転写されたＧＦＰのｍＲＮＡをＰＣＲ解析を行った。

実施例２と同様の手順でトランスフェクション後、ＲＮｅａｓｙ（インビトロゲン社）を使用してｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法でｃＤＮＡを合成した。

β−アクチン合成用の上流プライマーは、５’＜ＴＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣ＜３’
下流プライマーは、５’＜ＴＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＡ＜３’
ＧＦＰ合成用の上流プライマーは、５’＜ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＡ＜３’
下流プライマーは，５’＜ＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ＜３’
を使用した。

プライマーは、北海道システムサイエンス社製のものを使用した。増幅されたｃＤＮＡは、アガロースゲルで電気泳動分離し、Ｖｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎで染色し、ＦＸ−ＰＲＯＰＵＬＳ（バイオラッド社）で画像解析して定量した。

ＧＦＰのｍＲＮＡの発現レベルＣ４５Ｄ１８−ＳＶ群とＳＶ群間で比較した結果は図３の通り、Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶ群でのみ遺伝子発現が確認された。

なお、ＢｒｄＵ取り込み実験による確認では、未処理のＴＨＰ−１細胞群は約３０％の細胞においてＢｒｄＵ取り込みが陽性であったのに対し、ＰＭＡで処理したＴＨＰ−１細胞群はわずかに１％が陽性であった。このＰＭＡで処理したＴＨＰ−１細胞群は、さらに２日間の追加培養を行ってＢｒｄＵ取り込み実験を行っても陽性細胞は０．６％と測定され、ＰＭＡ処理群が２日間は休止期にあることが確認された。

［実施例４及び比較例３：遺伝子導入実験−その３］
ヒトＭＤＭｓは末梢血を健常人よりヘパリン採取し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ液で調整した。コラーゲンコートディッシュを使用して７日間１００ｎｇ／ｍＬ Ｍ−ＣＳＦの存在下で培養した。培養２日後にはＭａｃ−１の発現が確認された。

トリプシンで剥がした後、Ｍ−ＣＳＦ非添加系で４日間追加培養を行った。これを６Ｗｅｌｌプレートへ播種した（播種密度：１×１０^５個）。

先の実施例と同様にしてｐＧＬ３プラスミドを使用し、ルシフェラーゼ活性値を測定した。

結果は図４の通り、Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶ群でのみ高いルシフェラーゼ活性が確認された。

［実施例５及び比較例４：核中への移行の確認］
核中へ移行したＤＮＡを分析するために、Ｃｙ３−ｄＣＴＰでラベルしたＤＮＡ（アマシャムバイオサイエンス社製）を同量のプラスミドＤＮＡと混合してトランスフェクションを行い、共焦点走査レーザー顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ社）で可視化して観察した。図５の通り、Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶ（実施例５）でトランスフェクションを行った群では、核中に大きなＤＮＡ由来のドットが観察されたのに対して、ＳＶ（比較例４）でトランスフェクションした群では細胞内で細かいドットとなって観察された。

また、ＤＮＡ凝集塊が２μｍ以上であるものを計量した結果は、図６の通り、Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶでトランスフェクションを行った群では、１５％もの細胞で大きなドットが観察された。

この結果と、ＰＣＲによる解析の結果によって（ＰＣＲ解析では、Ｃ４５Ｄ１８−ＳＶを用いたトランスフェクションによって導入されたＤＮＡは、細胞内において必ずしも自立増殖しているわけではないことが推測された）、休止期細胞中への高い遺伝子導入機能によって高い遺伝子発現が得られていることが示唆された。

以上より、本発明に係るＣ４５Ｄ１８−ＳＶは、休止期細胞、神経細胞、造血幹細胞への遺伝子導入が可能であることが示唆された。

［実施例６及び比較例５：他のペプチドとの比較］
ヒト免疫不全ウイルス１型の転写活性化タンパクにＴａｔがある。ＴａｔはＨＩＶのＬＴＲ（ロングターミナルリピート）の初期転写産物に結合して転写を促進する。ペプチド導入ＳＶの休止期細胞への遺伝子導入効果をＣ４５Ｄ１８−ＳＶの効果と比較検討した。

先の実施例と同様の手法でトランスフェクションを行った結果、遺伝子の発現は図７の通りＣ４５Ｄ１８−ＳＶ群でのみ確認され、Ｔａｔを導入したＳＶでは遺伝子発現は確認されなかった。

実施例２及び比較例１におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフであり、（ａ）図は増殖期の細胞の場合、（ｂ）図は休止期の細胞の場合を示す。 実施例３及び比較例２におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。 実施例３及び比較例２におけるＧＦＰのＰＣＲ解析結果を示す図である。 実施例４及び比較例３におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。 実施例５及び比較例４における核中のＤＮＡの共焦点走査レーザー顕微鏡観察結果を示す図である。 実施例５及び比較例４における２μｍ以上のＤＮＡ凝集塊が観察された細胞割合の計量結果を示すグラフである。 実施例６及び比較例５におけるルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。

Claims (13)

1. 芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物に、Ｃ４５Ｄ１８、Ｃ４５Ｄ２０及びＣ４５Ｄ２９よりなる群から選ばれる１種又は２種以上のペプチドを固定してなる遺伝子ベクターであって、
   該複数の高分子鎖のうちの少なくとも一つの高分子鎖は、その先端側に、反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖を有し、
   前記ペプチドは、該高分子ブロック鎖の反応活性を有する官能基を介して固定されていることを特徴とする遺伝子ベクター。
2. 請求項１において、前記反応活性を有する官能基がアミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、イミド基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル、水酸基、アミド、エステル、ジアゾ、アゾメチン、エポキシ基、イソシアネート、チオイソシアネート、エチレン、アセチレン、ブタジエン及びこれらの誘導体分子団よりなる群から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする遺伝子ベクター。
3. 請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする遺伝子ベクター。
4. 請求項３において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とする遺伝子ベクター。
5. 請求項４において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とする遺伝子ベクター。
6. 請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とする遺伝子ベクター。
7. 請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とする遺伝子ベクター。
8. 請求項７において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とする遺伝子ベクター。
9. 請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖とその先端に結合した、前記反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖とを有することを特徴とする遺伝子ベクター。
10. 請求項１ないし９のいずれか１項において、前記反応活性を有する官能基を側鎖に有する高分子ブロック鎖が、ポリアミノスチレン、ポリブロモメチルスチレン、ポリグリシジルメタクリレートもしくはポリメタクリル酸又はこれらの誘導体からなる高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子ベクター。
11. 請求項１ないし１０のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とする遺伝子ベクター。
12. 請求項１１において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とする遺伝子ベクター。
13. 請求項１ないし１２のいずれか１項において、前記ペプチドがＣ４５Ｄ１８であることを特徴とする遺伝子ベクター。

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