JP2010088399A - 遺伝子導入剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法を提供する。
【解決手段】複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体を形成した後、該分子間架橋体の芳香環に該芳香環から放射状に伸延するカチオン性の分岐鎖を複数導入してなる分岐型架橋重合体よりなる遺伝子導入剤。この分子間架橋体としては、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、該イニファターに光照射することにより、イニファター同士を架橋してなる分子間架橋体が好ましい。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法に関する。

安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。

本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１,２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。

本願出願人らはまた、特許文献１，２に記載される遺伝子導入剤の遺伝子導入効率を更に向上させたものとして、芳香環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の該分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤を発明した（下記特許文献３）。

この遺伝子導入剤は、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性の分岐鎖が伸延する分岐型重合体同士を架橋させた架橋体よりなる合成高分子ベクターであり、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。即ち、この遺伝子導入剤は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、特許文献１，２に記載されるような１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。

特許文献３の遺伝子導入剤を構成する架橋体は、細胞への悪影響が懸念される架橋剤を用いることなく、分岐鎖末端の光開裂性官能基の光開裂で発生するラジカルを利用して分岐鎖同士を架橋して形成される。
ＷＯ２００４／０９２３８８号公報 特開２００７−７０５７９号公報 特願２００７−２６１０４０

上述の如く、特許文献３の遺伝子導入剤は、特許文献１，２の遺伝子導入剤よりも分岐鎖の入り組んだ複雑な構造を有するものとなっているため、この特異的な構造上の効果で遺伝子導入活性がより高いものとなっているが、以下のような不具合があった。

即ち、分岐型重合体に光照射して分岐鎖末端の光開裂性官能基からラジカルを発生させて分岐鎖同士を架橋反応させる際、分岐鎖のω末端とω末端との反応は、ラジカル核同士の反応であるために速やかに進行して安定な共有結合を形成するが、分岐型重合体のω末端と他の分岐型重合体のω末端との衝突確率は、同一分岐型重合体内或いは分岐型重合体間の側鎖及び／又は主鎖との衝突確率よりも極端に低いため、分岐型重合体に光照射すると分岐型重合体同士の架橋よりも、同一分岐型重合体内或いは分岐型重合体間のω末端と側鎖及び／又は主鎖との結合が多く形成される。この結果、分岐鎖末端同士が結合した２量体や３量体よりも、同一分岐型重合体内で優先的に複雑なネットワーク構造が形成されることとなる。光照射量を増加させて、２量化、３量化を図ろうとすると、次の様な問題点が生じる。

（Ａ） 過度に架橋が進むことにより不溶性のゲルが形成されてしまい、たとえ架橋体を
分離回収できたとしても歩留まりが悪い。
（Ｂ） 架橋点が点在するネットワーク構造では、不溶性のゲルとなる架橋度と、架橋に
よる効果が得られる架橋度が近接しており、分子設計、分子量制御が困難である
。そのため、例えば、内側にカチオン性ポリマー層を導入し、外層に非イオン性
ポリマー層を導入する分子設計なども困難である。
（Ｃ） 光分解性の側鎖分解により極性基が露出し、この極性基により補体Ｃ３ａの活性
化などのタンパクへの悪影響や細胞毒性の問題が起こる。
（Ｄ） ポリマー自体のイオン交換容量が低下する。

本発明は、上記特許文献３の架橋反応時のゲル化、側鎖分解等の問題点を解決し、遺伝子導入効率がさらに向上した架橋体よりなる遺伝子導入剤及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体を形成した後、該分子間架橋体の芳香環に、該芳香環から放射状に伸延するカチオン性の分岐鎖を複数導入してなる分岐型架橋重合体よりなることを特徴とするものである。

請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記分子間架橋体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、該イニファターに光照射することにより該イニファター同士を架橋してなる分子間架橋体であることを特徴とするものである。

請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記イニファターは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。

請求項４の遺伝子導入剤は、請求項２又は３において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基であることを特徴とするものである。

請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記カチオン性の分岐鎖は、前記分子間架橋体にビニル系モノマーを光照射リビング重合させることにより、前記芳香環に導入されることを特徴とするものである。

請求項６の遺伝導入剤は、請求項５において、前記ビニル系モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。

請求項７の遺伝子導入剤は、請求項２ないし６のいずれか１項において、前記イニファターのＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が架橋点として寄与していることを特徴とするものである。

請求項８の遺伝子導入剤は、請求項５ないし７のいずれか１項において、前記カチオン性の該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とするものである。

請求項９の遺伝子導入剤は、請求項５ないし７のいずれか１項において、前記カチオン性の分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、該ビニル系モノマーとは異なるモノマーとのランダムコポリマー又はブロックコポリマーであることを特徴とするものである。

請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分子間架橋体は、前記芳香族化合物が２〜５個架橋したものであることを特徴とするものである。

本発明（請求項１１）の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤を製造する方法であって、複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体を形成する芳香族化合物架橋工程と、該分子間架橋体の芳香環に該芳香環から放射状に伸延するカチオン性の分岐鎖を複数導入する分岐鎖導入工程とを有することを特徴とするものである。

請求項１２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１１において、前記芳香族化合物架橋工程の後、該分子間架橋体を分子量に応じて分画する分画工程を有することを特徴とするものである。

本発明の遺伝子導入剤は、複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体を形成した後、この分子間架橋体の芳香環に該芳香環から放射状に伸延するカチオン性の分岐鎖を複数導入してなる分岐型架橋重合体よりなる高分子ベクターである。この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。

また、複数の芳香族化合物を架橋してなる分子間架橋体に複数のカチオン性の分岐鎖を導入したものであるため、１個の芳香族化合物に複数のカチオン性の分岐鎖を導入してなる遺伝子導入剤に比べて、カチオン性の分岐鎖を多数導入することができ、ＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。

また、１個の芳香族化合物に複数のカチオン性の分岐鎖を導入した後、架橋体とした遺伝子導入剤に比べて次のような利点がある。

（１） ゲル化を防止することができ、分子設計、分子量などの制御が容易である。
（２） 内側にカチオン性ポリマー層を、外層に非イオン性ポリマー層を配置するといっ
た分子設計も容易である
（３） 超高分子量体の生成を抑制し、細胞毒性の問題を回避することができる。
（４） 光架橋時の側鎖の分解による極性基の露出に起因するタンパクへの悪影響や、イ
オン交換容量の変化などの問題もない。

以下に、本発明の遺伝子導入剤及びその製造方法の実施の形態を詳細に説明する。

［遺伝子導入剤］
本発明の遺伝子導入剤は、複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体を形成した後、該分子間架橋体の芳香環に該芳香環から放射状に伸延するカチオン性の分岐鎖を複数導入してなる分岐型架橋重合体よりなる。

このような本発明の遺伝子導入剤を製造する方法に特に制限はないが、複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体を形成する芳香族化合物架橋工程と、該分子間架橋体の芳香環に該芳香環から放射状に伸延するカチオン性の分岐鎖を複数導入する分岐鎖導入工程とを有する本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造することが好ましい。この方法において、芳香族化合物架橋工程の後に、必要に応じて、該分子間架橋体を分子量に応じて分画する分画工程を有することが好ましい。

以下に、本発明の遺伝子導入剤を、本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造する場合の製造手順に従って説明するが、本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、何ら以下の方法に限定されるものではない。

＜芳香族化合物の架橋工程＞
まず、複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体（以下、「オリゴイニファター」と称す場合がある。）を形成する。

この分子間架橋体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに光照射することにより、イニファター同士を架橋して製造することが好ましい。

イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。

上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。

なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。

イニファター同士を反応させるには、イニファターを含んでなる溶液を調製し、これに撹拌下で光照射することによりイニファター同士が架橋した分子間架橋体とする。

前記溶液のイニファターの濃度は、２０〜１００ｍＭ程度が好適である。ただし、イニファターが完全に溶媒に溶解せずにペースト状になっていてもよい。この場合のペースト中のイニファター濃度は１０〜２０重量％程度である。

照射する光の波長は、２５０〜４００ｎｍ程度が好適である。光の照射時間は、照射強度にも依存するが、６０〜７２０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ^２〜１０ｍＷ／ｃｍ^２程度の低い照射強度で１２０〜３６０分程度が特に好適である。

このような条件で反応させることにより、複数の芳香族化合物が架橋した分子間架橋体を得ることができる。例えば、芳香族化合物がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物である場合、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基のチオ基が開いて芳香族化合物同士が架橋する。

本発明では、この分子間架橋体は、２〜５個の芳香族化合物が架橋したものであることが好ましい。この架橋数が多い程、架橋構造を導入することによる効果が高いが、架橋数が過度に高いものは溶解性が低く、ポリマー重合の開始剤として不適切である。

＜分岐鎖導入工程＞
このようにして分子間架橋体を得た後に、この分子間架橋体をオリゴイニファターとして、このオリゴイニファターの芳香環に、該芳香環から放射状に伸延する複数のカチオン性の分岐鎖を導入する。

このように、予めイニファター同士を架橋した分子間架橋体に対してカチオン性の分岐鎖を導入した遺伝子導入剤は、１個の芳香族化合物に複数のカチオン性の分岐鎖を導入した後、架橋して分子間架橋体とした遺伝子導入剤に比べてゲル化の可能性が少なく、分子量の制御が容易である。また、内側にカチオン性ポリマー層を、外層に非イオン性ポリマー層を配置するといった分子設計も容易である。さらに、架橋時の側鎖の分解による極性基の露出に起因する細胞毒性等の問題や光架橋時の側鎖の分解による極性基の露出や、イオン交換容量などの問題もない。

オリゴイニファターにカチオン性の分岐鎖を導入するには、このイニファターにビニル系モノマーを光照射リビング重合させることが好ましい。

この場合、オリゴイニファターに重合させるビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＣ_３Ｈ_６Ｎ（ＣＨ_３）_２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＣ_３Ｈ_６Ｎ（ＣＨ_３）_２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。

オリゴイニファターと上記ビニル系モノマーとを反応させるには、オリゴイニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、オリゴイニファターに対しビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。

該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、オリゴイニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。

照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ^２〜１０ｍＷ／ｃｍ^２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。

この光照射により、反応液中に目的とする分岐型架橋重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分に同一のビニル系モノマーよりなるポリマー鎖が導入されたホモポリマーを得る。

この分岐型架橋重合体の数平均分子量は架橋数や分岐鎖の鎖数によるが、２，０００〜５００，０００、特に２，０００〜１５０，０００、とりわけ２，０００〜１００，０００程度が好ましい。

なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。

本発明に係る分岐型架橋重合体は、このようなホモポリマーであってもよく、分岐鎖部分にさらに異なるモノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、ホモポリマーの合成に用いたビニル系モノマーとは異なるビニル系モノマー、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。

即ち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。

なお、先にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型架橋重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側に前述のカチオン性ビニル系モノマーよりなるポリマーブロックを導入するようにしてもよい。

カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型架橋重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型架橋重合体の濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ^２程度が好適である。

上記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。

＜分画工程＞
本発明の遺伝子導入剤の製造方法において、上記の芳香族化合物架橋工程と、分岐鎖導入工程との間に分子間架橋体を分子量に応じて分画する工程を有していてもよい。

この場合、分画方法としては、サイズ排除カラム、溶解度フラクション等が挙げられる。分画する分子量の大きさとしては、特に制限はなく、単量体、２量体、３量体、４量体…というように架橋数毎に分画してもよいが、後の分岐鎖導入工程においてゲル状になりやすい未架橋の芳香族化合物（単量体）に対応する分子量を取り除くように分画することが好ましい。

［核酸複合体］
上記の本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。

上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。

核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。

また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。

核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。

核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。

所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。

本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。

本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。

生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。

この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。

また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。

投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。

この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。

以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。

［遺伝子導入剤の合成］
＜実施例１＞
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。

１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノールへ投入して３０分間撹拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ_３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ_２ＣＨ_３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ_２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。

ii）イニファター同士を架橋してなるオリゴイニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン同士を架橋してなるオリゴイニファターを次のようにして合成した。
なお、下記反応式は、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン２分子の架橋反応を示すものであるが、実際の反応では、２分子の架橋反応の他に３分子の架橋反応、更には４分子以上の架橋反応が生じていると推察される。

上記ｉ)で合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン０．２ｇとトルエン２．０ｇとを混合しペースト状にした。このペーストを１００ｍＬ滅菌瓶に移し、回転子で緩やかに撹拌しながら３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を３６０分間照射した。照射強度は、ウシオ電機社のＵＩＴ−１５０にＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して測定し、５．０ｍＷ／ｃｍ^２に調整した。光照射は落射式で、ガラス板で密閉性を確保し、イニファターのトルエンペーストには、２ｍｍ厚の軟質ガラス板を介し光が暴露されるように行った。このシステムは、軟質ガラス板を介して光照射を行っている。従って、光源が２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線であっても、実際に透過する光の波長は、３２０ｎｍ〜４００ｎｍの近紫外光である。

光照射終了後、トルエンペーストは黄褐色を呈し、僅かに不溶性のゲル状成分が生成した。ゲル状成分が混入しないようにデカンテーションを行い、ここへメタノール１０ｍＬを加えて撹拌し、不溶分を回収した。この不溶分を乾燥後、クロロホルムへ溶解し、不溶分を除去してから、クロロホルム溶液を濃縮し、メタノールへ滴下して再沈殿させ、減圧乾燥することでイニファター同士を架橋してなる分子間架橋体を得た。

この分子間架橋体のゲルパーミエーションクロマトグラフィーでは分離不完全なブロードピークが確認され、ＧＰＣによるポリエチレングリコール換算の分子量は約７００〜２，０００であった。また、このＧＰＣシステムでは、単量体の分子量は４６０（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０７）と測定されるが、これよりも低分子量側にアルキルベンゼンと推測される化合物のピークが確認された。

iii）オリゴイニファターよりなる多分岐型カチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン同士を架橋してなるオリゴイニファターに対して、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）をビニル系モノマーとする分岐鎖を導入した。
なお、下記反応式は、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン２分子を架橋してなる２量体のオリゴイニファターに対して、カチオン性の分岐鎖を導入する分岐鎖導入工程を示すものである。実際の反応では、２量体のオリゴイニファターの他にも、３量体のオリゴイニファター、更には４量体以上のオリゴイニファターに対しても、下記反応式と同様にカチオン性の分岐鎖が導入されると推察される。

上記ii）により合成した分子間架橋体３０ｍｇを３０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）１５．６ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく撹拌しながら、高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、上記ii）で使用した光照射装置（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を４０分間照射した。照射強度は、２．５ｍＷ／ｃｍ^２に調整した。

４０分間照射後、重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて、分子間架橋体よりなる多分岐型カチオン性ホモポリマーを得た（重合率２５％）。分子量はポリエチレングリコール換算によるＧＰＣにより、１８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）と測定された。

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）の測定結果はδ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ_３），δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ_２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ_２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。

得られたポリマー成分は、イニファター単量体からなる４分岐型カチオン性ホモポリマー、イニファターの２量体からなる６分岐型カチオン性ホモポリマー、イニファターの３量体からなる８分岐型カチオン性ホモポリマーの混合物になっていると推測される。

＜比較例１＞
iv）イニファター単量体よりなる４分岐型カチオン性ホモポリマーの合成
上記i）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン９０ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）４ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。光照射時間を３０分間としたこと以外は、上記ii）の方法と同様に重合を行い、精製を行って、イニファター単量体よりなる４分岐型カチオン性ホモポリマー（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）を得た。分子量は、ポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより、１７，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）と測定された。

＜比較例２，３＞
ｖ）イニファター単量体よりなる４分岐型カチオン性ホモポリー同士の光架橋
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン同士の光架橋を行った。

即ち、上記iv）で合成した分子量１７，０００のイニファター単量体よりなる４分岐型カチオン性ホモポリマー（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）０．２ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ、３．０ｇのトルエンへ溶解し、回転子で緩やかに撹拌しながらii）と同じ光照射装置で光照射重合を行った。光照射は落射式で２ｍｍ厚の軟質ガラス板を介して行い、照射強度は１．０ｍＷ／ｃｍ^２、光照射時間は９０分（比較例２）、１８０分（比較例３）とした。照射終了後、比較例３では、ポリマーのほぼ全量が不溶性のゲルとなった。ゲルは黄褐色を呈し、強いアミン臭がした。比較例２では、トルエン溶液に不溶性のゲルが浮遊していた。比較例２及び比較例３のトルエン溶液を濾過して不溶分を除去し、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。

得られたカチオン性ホモポリマー同士の光架橋体の分子量は、ポリエチレングリコール換算によるＧＰＣにより、比較例２が２２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．２）、比較例３が３２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．７）となり、分子量が増大し、ピーク形状も高分子量側に大きな肩を有するブロードなものとなった。

ポリマー成分の回収率は、比較例２が約５０％、比較例３が約５％であり、比較例３ではほとんどのポリマーが不溶性のゲルとなったことがわかる。不溶性のゲルとなる理由としては、複雑に架橋点が点在するネットワーク構造体となっていることが推測される。

＜比較例４＞
vi）ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンの合成
ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５．０ｇとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム塩３１．８ｇをエタノール１Ｌ中へ加え、室温で４日間撹拌した。沈殿物を濾過し、１Ｌのメタノールで３回洗浄して減圧乾燥し、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させた後濾過し、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、微かに淡青色を帯びたヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンの白色結晶を得た（収率９０％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣＬ_３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，３６Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ３．７１−４．０１ｐｐｍ（ｗｑ，２４Ｈ，−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，１２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ_２）となった。

vii） イニファター単量体よりなる６分岐型カチオン性ホモポリマーの合成
上記vi）により合成したヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン４６ｍｇを３０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド７．９ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで５０ｍＬに調整した。上記ii）と同様に４０分間の光照射を行い、照射後、重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて６分岐型カチオン性ホモポリマーを得た（重合率２５％）。分子量は、ポリエチレングリコール換算によるＧＰＣにより、１８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２）と測定された。

^１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ_２Ｏ）の測定結果は、δ１．０−１．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−），δ１．９−２．１ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ_３），δ２．１−２．３ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ_２−Ｎ），δ２．９−３．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ_２）となった。

［遺伝子導入実験］
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。

上記iii）にて合成した分子間架橋体よりなる多分岐型カチオン性ホモポリマー（実施例１）、上記iv）で合成したイニファター単量体よりなる４分岐型カチオン性ホモポリマー（比較例１）、上記v）で合成したイニファター単量体よりなる４分岐型カチオン性ホモポリマー同士の光架橋体（比較例２，３）、上記vii）で合成したイニファター単量体よりなる６分岐型カチオン性ホモポリマー（比較例４）を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数は、カチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均分子量６６０とから計算した。

この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬）。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。

［考察］
以上の結果から次のことがわかる。
４分岐型カチオン性ホモポリマーよりなる遺伝子導入剤（比較例１）よりも６分岐型カチオン性ホモポリマーよりなる遺伝子導入剤（比較例４）の方が高い遺伝子導入活性を示していることから、分岐鎖数が多い遺伝子導入剤の方が遺伝子の導入に有利であることがわかる。また、４分岐型カチオン性ホモポリマーよりなる遺伝子導入剤（比較例１）よりも、４分岐型カチオン性ホモポリマー同士を９０分間光照射して架橋した遺伝子導入剤（比較例２）の方が高い遺伝子導入活性を示していることからも、分岐鎖の数が多い方が遺伝子の導入に有利であることがわかる。

これに対し、４分岐型カチオン性ホモポリマー同士を１８０分間光照射して架橋した遺伝子導入剤（比較例３）は、４分岐型カチオン性ホモポリマー同士を９０分間光照射して架橋した遺伝子導入剤（比較例２）よりも遺伝子導入活性が低下した。これは、分岐型重合体同士の架橋よりも、同一分岐型重合体内で複雑なネットワーク構造が形成され、比較例３の遺伝子導入剤の溶媒に対する溶解性が低下したためであると考えられる。

即ち、この遺伝子導入実験では、遺伝子導入剤を生理食塩水に溶解して用いており、比較例３の遺伝子導入剤のように溶媒に対する溶解性が低い場合、ＤＮＡと遺伝子導入剤とを最適混合比である１：２０で混合することができないため、遺伝子導入活性が低下すると考えられる。また、この比較例３では、光照射時間が９０分を過ぎるとゲル状の不溶成分が急激に増加し、架橋による効果を得ることができる架橋度と、不溶性のゲルとなる架橋度とを見極めることが困難であった。従って、回収率も非常に少なかった。

一方、予めイニファター同士を架橋したオリゴイニファターにカチオン性の分岐鎖を導入した実施例１の遺伝子導入剤は、イニファター単量体にカチオン性の分岐鎖を導入した比較例１，４の遺伝子導入剤や、イニファター単量体にカチオン性の分岐鎖を導入した後、架橋体とした比較例２，３の遺伝子導入剤に比べて遺伝子導入活性に優れている。また、オリゴイニファターにカチオン性の分岐鎖を導入した実施例１の遺伝子導入剤は、イニファター単量体にカチオン性の分岐鎖を導入した後、架橋体とした比較例２，３に遺伝子導入剤よりも、ゲル化の可能性が少なく、分子設計、分子量などの制御が容易であることもわかる。

実施例及び比較例の結果を示すグラフである。

Claims (12)

1. 複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体を形成した後、該分子間架橋体の芳香環に、該芳香環から放射状に伸延するカチオン性の分岐鎖を複数導入してなる分岐型架橋重合体よりなる遺伝子導入剤。
2. 請求項１において、前記分子間架橋体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、該イニファターに光照射することにより該イニファター同士を架橋してなる分子間架橋体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
3. 請求項２において、前記イニファターは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
4. 請求項２又は３において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
5. 請求項１ないし４のいずれか１項において、前記カチオン性の分岐鎖は、前記分子間架橋体にビニル系モノマーを光照射リビング重合させることにより、前記芳香環に導入されることを特徴とする遺伝子導入剤。
6. 請求項５において、前記ビニル系モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
7. 請求項２ないし６のいずれか１項において、前記イニファターのＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が架橋点として寄与していることを特徴とする遺伝子導入剤。
8. 請求項５ないし７のいずれか１項において、前記カチオン性の分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
9. 請求項５ないし７のいずれか１項において、前記カチオン性の分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、該ビニル系モノマーとは異なるモノマーとのランダムコポリマー又はブロックコポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
10. 請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分子間架橋体は、前記芳香族化合物が２〜５個架橋したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
11. 請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤を製造する方法であって、
    複数の芳香族化合物を架橋して分子間架橋体を形成する芳香族化合物架橋工程と、
    該分子間架橋体の芳香環に該芳香環から放射状に伸延するカチオン性の分岐鎖を複数導入する分岐鎖導入工程とを有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
12. 請求項１１において、前記芳香族化合物架橋工程の後、該分子間架橋体を分子量に応じて分画する分画工程を有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。

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