PT98119B - Processo para a preparacao de adjuvantes para vacinas aperfeicoados compreendendo lipopolissacarideos nao toxicos e/ou copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 98.119

REQUERENTE: EMORY UNIVERSITY, norte-americana, com sede em 1380 South Oxford Road, Atlanta, Georgia 30322, Estados Unidos da América

EPÍGRAFE: Adjuvantes e vacinas aperfeiçoados

INVENTORES: Robert L. Hunter, Kuni K. Takayama,

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

U.S.A., 27 de Junho de 1990, sob ο NQ. : 544,831 U.S.A:, 21 de Junho de 1991, sob o NQ. : 716,807

IN?! MCO 1,3 Rf ,8732

ADJUVANTES E VACINAS APERFEIÇOADOS

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a adjuvantes para vacinas e a vacinas aperfeiçoadas que utilizam esses adjuvantes. Os ad juvantes podem ser designados de forma a obter-se uma resposta imune predominantemente constituída por anticorpos de um isotipo pretendido, por exemplo, isotipos IgG2 ou IgG3 em murganhos ou isotipos correspondentes no homem e outros animais, melhoran do portanto a protecção pela vacina. Além disso, a vacina e adjuvantes melhorados da presente invenção proporcionam longa protecção.

Antecedentes

A designação de antigénio é definida como algo que ser ve como alvo para uma resposta do sistema imunológico. A respo£ ta imune pode ser celular ou humoral. 0 termo vacina é defin_i do aqui como uma suspensão ou solução de grupos antigénicos, cons tituídos usualmente por agentes infecciosos ou por uma parte de agentes infecciosos que são injectados no organismo para produzi, rem imunidade activa. 0 grupo antigénico que constitui a vacina pode ser um microrganismo ou um produto natural purificado proveniente de um microrganismo, um produto sintético ou uma proteína obtida por recombinação genética, péptido polissacárido ou produto similar. A designação imunidade mediada pela célula

-2definida como uma resposta imune induzida de preferência por cé lulas em vez de anticorpos. Esta inclui, mas não se limita a hipersensibilidade do tipo retardada e células T citotóxicas. 0 termo adjuvante, como aqui se utiliza, consiste em qualquer substância cuja mistura com um antigénio injectado aumenta ou modifica de qualquer modo a resposta imunológica. Um haptenoé de finido aqui como uma substância que reage selectivamente com anticorpos apropriados ou células T, mas o próprio hapteno não é usualmente imunogénico. A maioria dos haptenos são pequenas mo léculas ou pequenas partes de grandes moléculas mas, algumas ma cromoléculas também podem funcionar como haptenos. 0 termo con jugação é aqui definido como uma forma, entre duas moléculas.

Pode realizar-se por meios químicos ou por meios biológicos in vivo como por exemplo por recombinação genética. 0 termo iso tipo significa um subtipo de um anticorpo. O termo lipopolis^ sacãrido (LPS) refere-se a um glicofosfolípido anfipático obti^ do da membrana mais exterior de bactérias gramnegativas que têm um grupo hidrofóbicodesignado por lípido A e um grupo de açúcar (polissacãrido ou oligossacárido). A designação LPS não-tóxico define-se como um LPS com muito baixa toxicidade avaliada por uma ou mais determinações da dose letal de 50% em animais (DL__q), dose letal 50% em embrião de frango (OLCE^q), por piro genicidade no coelho ou por reacção dérmica de Shwartzman. As avaliações in vitro da indução do factor de necrose de tecido e de IL-1 por macrófagos pode também ser utilizada para a determinação da toxicidade de LPS. O termo LPS destoxifiçado define-se como sendo LPS com toxicidade reduzida devido a modi.

ficação química ou ã estrutura do grupo lípido A, isto é, ã remoção de um grupo fosfato, de um ou três grupos acilo de ãci-3do gordo, introdução de novos grupos funcionais (por exemplo, metilo, acetilo, álcool, etc.) ou redução ou oxidação parciais . i

I

Uma vacina eficaz deve induzir uma reacção adequada aos antigénios correctos. Há vários tipos diferentes de reacções imunes que variam na sua capacidade para conferir protec ção contra uma doença particular. Por exemplo, os anticorpos podem conferir protecção contra infecções bacterianas, mas a imunidade mediada pelas células é necessária para eliminar do organismo muitas infecções virais e tumores. Existem, tipos distintos múltiplos de anticorpos e de respostas imunes mediadas pelas células. As reacções mediadas pelas células dividem-se em dois grupos principais: 1) hipersensibilidade de tipo re tardado em que as células T actuam indirectamente através dos macrófagos e outras células ou produtos celulares, e 2) citotoxicidade em que células T especializadas atacam directa e especif icamente eliminam as células infectadas.

Existem cinco classes principais de anticorpos: IgM, IgG, IgE, IgA e IgD^-. Estas classes têm funções distintas nas respos^ tas imunes. A IgG, é a classe dominante sanguínea e é subdividida em várias subclasses diferentes ou isotipos. Nos murganhos estes isotipos são IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3. Nos seres humanos, os isotipos são IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4^. Isotipos idênticos têm sido definidos na maioria de outras espécies mamíferas em que tenham sido investigados. A nomenclatura dos isot_i pos IgG é diferente nas diferentes espécies porque as designações foram inventadas antes da estrutura ou da função dos isotipos de anticorpos estarem esclarecidos. Embora ainda permaneça muito para investigar os isotipos de IgG parecem ser gran

-4demente conservados entre as espécies de mamíferos.

Os isotipos de IgG diferem na sua capacidade para conferir protecção a infecções particulares. A IgG2a e IgG2b ém complemento activado de murganho, induzem anticorpos induzidos pela citotoxicidade mediada pelas células e outras funções.

São particularmente eficazes para conferir protecção contra mui. tas das infecções bacterianas, virais e parasitárias. As correspondentes nos seres humanos parecem ser a IgGl e IgG3.

Inversamente, a IgG3 murina é particularmente eficaz pa ra conferir protecção contra bactérias com revestimentos polissa. carídicos tais como os pneumococos. A correspondente humana pa rece ser a IgG4. Os isotipos tais como IgGl no murganho não fi. xam complemento, neutralizam efectivamente as toxinas mas são acentuadamente menos eficazes para muitas infecções bacterianas e virais. Devido aos vários tipos de IgG diferirem acentuadamen te relativamente à sua capacidade para conferir imunidade, é importante que as vacinas induzam o isotipo mais apropriado para uma infecção particular. Embora a nomenclatura seja diferente, as provas disponíveis e as teorias modernas indicam que as propriedades de imunogénios que determinam o isotipo do anticorpo produzido são similares ãs espécies de cruzadas de mamíferos . Por outras palavras, um imugénio que estimula a hipersensibilidade tipo retardado ou complemento que fixa anticorpo de IgG em uma espécie que de um modo geral estimulará respostas idênticas noutras espécies.

A tecnologia de ADN recombinante e bio-sintético está a permitir o desenvolvimento de vacinas que possuem epítopes anti. génicos que eram anteriormente impossível de obtenção. As candidatas a vacinas correntes incluem virtualmente todos os agen-5tes infecciosos, alergenos e até componentes de hospedeiros co mo as hormonas e moléculas relacionadas com doenças auto-imunes, cancro e outras doenças. Os agentes de infecções abrangem, mas nao estão limitados a, virus, bactérias, parasitas, riquêtsias e fungos. As hormonas estão sendo avaliadas como va. cinas para diversos fins como por exemplo a prevenção de gravidez e tratamento de doenças. As vacinas para tratamento do can cro, como por exemplo o melanoma, estão sendo estudadas em animais e no homem. Em cada caso, o efeito óptimo da vacina depen de da estimulação do tipo apropriado, da intensidade e da duração da reacção imune.

trabalho sobre a doença parasitária a malária é especialmente importante. Esta doença atinge mais de 200 milhões de pessoas por todo o mundo e é a doença mais importante mundial em termos de mortalidade e perdas de trabalho. As técnicas de recombinação genética têm sido utilizadas para identificar e, presentemente, para produzir quantidades substanciais, vários péptidos e proteínas associadas com parasitas da malária. Em particular um péptido com doze aminoácidos do estádio de esporo zoite tem sítio determinado para transportar um sítio antigénio importante.

Os anticorpos contra este péptido particular podem exter minar o parasita imediatamente após serem injectados. Infelizmente, este péptido, por si só, não produz uma reacção imune adequada. Cada espécie de malária tem um péptido diferente, mas em todas se tem encontrado a estrutura e unidades repetidas características .

Num esforço para induzir uma reacção imune eficaz ao péptido do esperozoito, o péptido tem sido conjugado com veicu-βίο s e administrado com agentes adjuvantes. Até ao momento presente, contudo, os adjuvantes utilizados com o peptido ou os conjugados peptídicos não produziram resultados satisfatórios. Identicamente, têm sido identificados antigénios importantes durante a permanência no sangue do parasita da malária, mas as composições de vacinas disponíveis não são aptas a induzir a imu nidade protectora.

vírus da imunodeficiência humana (HIV) causa a SIDA . Têm sido preparados muitos antigénios e péptidos recombinantes para HIV. Existe prova de que os anticorpos contra estes antigénios podem neutralizar o vírus e que a reacção imune do organismo é capaz de impedir ou controlar as infecções. Contudo , as vacinas de um modo geral eficazes para induzir reacções imunes protectoras contra HIV permanecem um objectivo a alcançar . Outros exemplos são a hemophilus influenza e o pneumococcus pneumonia . Os antigénios importantes destas bactérias são polissacá ridos que provocam reacções imunes protectoras muito fracas nas crianças e nos idosos que são os de maior risco para estas infecções. Situações idênticas existem em numerosas outras infecções virais, bacterianas e parasitárias além dos tumores e outras doenças que podem ser induzidas por reacções imunes. A ciência actual tem proporcionado os meios de identificação e pr£ dução de antigénios para a maioria das situações que são influen ciadas por reacções imunes. A insuficiência de muitos dos novos antigénios para produzir protecção óptima tem realçado a crescente necessidade de meios para influenciar o tipo, intensidade e duração da reacção imune produzida pelas vacinas.

Deste modo, tem sidc- crescente o interesse para o desenvolvimento de agentes adjuvantes potentes e não tóxicos que pos.

-7sam melhorar e provavelmente com maior importância, induzir a imunogenicidade de epitopes hapténicos. Além disso, os adjuvantes são necessários para utilização com vacinas convencionais afim de provocarem uma resposta mais rápida, mais acentuada e mais prolongada do tipo apropriado. Um adjuvante dejõ tes também será útil nos casos em gue o fornecimento de antigénios ê limitado ou é muito onerosa a sua produção.

desenvolvimento de adjuvantes tem, até recentemente, sido empírico. Um grande número de compostos tem sido considerado como moduladores da resposta imune. Estes compostos têm sido notavelmente diversos quer na substância quer na função, um facto que tem complicado as tentativas de descoberta de mecanismos unificadores da acção adjuvante. 0 esclarecimento de_s tes mecanismos tem permanecido na retaguarda das recentes aqu_i sições na compreensão do sistema imunológico.

Esta diversidade de adjuvantes tem apresentado dificuldades para a sua classificação. Os adjuvantes são ocasionalmen te agrupados de acordo ccm a sua origem, seja ela mineral, bacteriana, vegetal, sintética ou o produto de hospedeiro. 0 primeiro grupo sob esta classificação é o grupo dos adjuvantes minerais como por exemplo os compostos de alumínio. A primeira aplicação dos compostos de alumínio como adjuvantes foi descri, ta em 1926. Desde então cs antigénios precipitados com sais de alumínio ou antigénios misturados com composcos de alumínio adsorv.idos ou previamente formados têm sido utilizados grandemente para aumentar a resposta imune nos animais e nos seres humanos. Os compostos de alumínio e os adjuvantes similares parecem exercer a sua acção através do mecanismo seguinte. As ligações físicas de alumínio com os antigénios para formarem

-8partículas. Estas formam um depósito antigénio no tecido após a injecção. A excreção do antigénio é lenta, prolongado portanto o tempo de interaeção do antigénio com as células que apresentam antigénio tais como os macrófagos ou as células den dríticas foliculares. Além disso, as células imunocompetentes são atraídas para a área da injecção e activadas. Têm sido de tectadas partículas de alumínio na região dos nódulos linfáticos de coelhos sete dias após a imunização e, pode acontecer que outra função significativa seja dirigir o antigénio para as células T das áreas contidas nos próprios módulos. A potência do adjuvante tem-se verificado estar relacionada com a inflamação e com a drenagem dos nódulos linfáticos. Embora muitos estudos tenham confirmado que os antigénios administrados com sais de alumínio conduzem a imunidade humoral acrescida, a imu nidade induzida pelas células parece ser unicamente ligeiramen te maior, de acordo com medições da hipersensibilidade do tipo retardado. 0 hidróxido de alumínio tem sido descrito como acti. vado o esquema do complemento. Este mecanismo pode ter um desempenho na resposta inflamatória local assim como na produção de imunoglobulina e na memória das células B.

Principalmente devido ao excelente registo de segurança, os compostos de alumínio são presentemente os únicos adjuvantes utilizados nos seres humanos. Contudo, estes não são isentos de problemas. As vacinas que contêm alumínio causa ocasionalmente reacções locais. Embora as manifestações alérgicas não sejam usualmente um problema clínico, tem-se acusado os compostos de alumínio de atraírem eosinofilos para a área injectada através de mecanismos dependentes da célula T, para induzirem uma resposta de IgE se irjectados após um antigénio iniciador e para

-9provocar uma população celular específica do veículo como função auxiliar para a reacção de IgE. Além disso, as vacinas que contêm alumínio não podem ser liofilizadas, portanto, necessitam de um transporte e acondicionamento refrigerados com riscos resultantes de contaminação.

Finalmente, e ainda mais importante, os compostos de alu mínio não são sempre bem sucedidos para induzirem protecção prolongada contra a doença. Isto é devido, em parte., à sua incapacidade para induzirem a maioria dos isotipos apropriados de anticorpos ou o tipo óptimo de imunidade mediada pela célula. Assim, enquanto os sais de alumínio têm sido suficiente adjuvante para imunogénios fortes que necessitam apenas de resposta dos anticorpos para provocarem protecção, eles não são eficazes quan do utilizados com imunogénios fracos, como os pêptidos sintéticos da malária ou para a introdução de reacções imunes mediadas pela célula ou do isotipo IgG do tipo necessário para lutar con tra as infecções.

Outro grande grupo de adjuvantes são os de origem bacteriana. Os adjuvantes são de origem bacteriana. Os adjuvantes com origem bacteriana têm sido recentemente purificados e sinte tizados (por exemplo muramil - dipeptidos, lípido A) e mediadores hospedeiros têm sido clonados (interleucina 1 e 2), proporcionando produtos quimicamente caracterizados para estudo. A última década tem um progresso significativo na purificação quí. mica de três adjuvantes de componentes activos de origem bacteriana: Borderella pertussis, lipopolissacãridos e adjuvante completo de Freund (FCA).

A Borderella pertussis tem interesse devido ã capacida de para modular imunidade mediada pela célula durante a acção

-10sobre populações de linfócitos T. Para os lipopolissacáridos e adjuvante completo de Freund, os grupos com acção adjuvante identificados e sintetizados têm permitido o estudo das relações de estrutura-função.

Os lipopolissacáridos e os seus derivados, incluindo o lípido A, tem-se verificado serem adjuvantes poderosos na associação com lipossomas ou outras emulsões lipídicas. Não es tá ainda claro se os derivados com toxicidade suficientemente baixa para o uso geral nos seres humanos podem ser produzidos. O adjuvante completo de Freund é o padrão para a maioria dos estudos experimentais. Contudo, produz reacções inflamatórias sistémicas e locais graves que podem servir bastante para prejudicar ou eliminar o hospedeiro. Não pode ser utilizado em seres humanos e deve ser eliminado para a sua utilização nos animais.

Têm sido utilizados muitos outros tipos de materiais e em vários momentos, como adjuvantes. Estes incluem produtos vegetais como a saponina, produtos animais como a quitina e nu merosos químicos de síntese. A fonte de um adjuvante destas categorias não se tem demonstrado particularmente útil para a previsão das suas propriedades biológicas.

Também têm sido classificados os adjuvantes de acordo com os mecanismos de acção proposta. Este tipo de classificação é necessariamente um pouco arbitrária devido ao facto da maioria dos adjuvantes funcionarem por mais de um mecanismo. Os adjuvantes podem actuar através da localização de antigénios e sua libertação, ou por efeitos directos sobre as células produ zidas pelo sistema imunolõgico tais como os macrófagos e os lin fócitos. Outro mecanismo através do qual os adjuvantes refez-11çam a reacção imune é a criação de um depósito de antigénios. Este parece contribuir para a actividade de adjuvantes de com postos de alumínios, emulsões oleosas, lipossomas e polímeros sintéticos. A actividade de adjuvantes lipopolissacáridos e dipéptidos de muramilo parece ser mediada principalmente através da activação dos macrófagos. Enquanto que a Borderella pertussis afecta os macrófagos e linfócitos. Vias recentes e especulativas de imunopotenciação., tais como a utilização de monocinas e linfocinas e a manipulação do antigénio, veículo e adjuvante têm sido habitualmente apresentados, para aumentar a resposta imune.

Podem-se ligar pequenos imunogénios como por exemplo o péptido sintético da malária, as protéinas maiores ou outros veículos para aumentar a reacção imune. A relação entre a dimensão da molécula e a ccmplexicidade do antigénio relativo ã imunogenicidade reflete a capacidade dos determinantes antigé nicos da molécula. Esta relação foi notada primeiramente por Landsteiner quando demonstrou a necessidade de pequenos radicais complexos com moléculas (veículos) maiores para estimular a resposta imune. Contudo, a base do mecanismo para esta con dição foi aguardar experiências que demonstraram o efeito do veículo e a necessidade de um mínimo de dois determinantes antigênicos na molécula para que expresse imunogenicidade. Estes determinantes representam o veículo e os determinantes hapténi. cos que actuam entre os linfócitos T e B, respectivamente. Con tudo a influência da fracção do veículo abrange para lá da antigenicidade simples através da activação das células T nas res postas humorais dependentes destas células.

A associação de determinantes numa molécula de antigé-12nio pode influenciar a resposta imune por activação diferente de tipos diversos de células T auxiliares e supressoras. Um sistema experimental que demonstra este efeito é a resposta hu moral controlada geneticamente em murganhos reactivos (C57B1/6) e murganho não reactivo (DBA/1) ao terpolímero sintético o ácido l-glutãmico^O-L-alanina^a-L-tirosinalO (GAT). Enquanto que o murganho C57B1/6 reage a este polipéptido, o murganho DBA/1 responde apenas quando o GAT está ligado à albumina de soro bo vino metilada (MBSA). Contudo, se os murganhos são injectados com GAT antes da imunização com GAT-MSBA, não ocorre resposta de anticorpos detectãvel, por reacção a GAT. A explicação para estas observações é que o GAT estimula as células T auxilia res nos murganhos reactivos mas activa preferencialmente as células T supressoras nos murganhos não reactivos. Esta predominância das células supressoras impede uma resposta a GAT ainda que ligado a MBSA. Contudo, se a primeira imunização é com GAT-MBSA, a activação das células T auxiliares pelo grupo do veículo proporciona o auxílio que anula o efeito de quaisquer células supressoras activadas por GAT.

Também tem sido demonstrado que os determinantes associados com uma molécula de proteína natural contribui indiferentemente para auxílio e supressão. A conjugação de um veículo imunogénico com um antigênio pode alterar o isotipo dos anticorpos produzidos como resposta a esse antigênio. Os polis sacáridos purificados provenientes de muitas bactérias encapsuladas são antigénios independentes do timo devido ã sua natureza polimérica com repetições múltiplas de determinantes antigénicos. Embora estes representem antigénios protectores destas bactérias, os anticorpos de IgM produzidos têm limitado a efi-13cácia para a prevenção da doença. Este facto é grandemente devido à sua incapacidade para estimular a memória imunolõg_i ca ou a resposta imune adequada em indivíduos muito jovens ou idosos que estão em alto risco de infecções. Portanto, os po lissacãridos de Neisseria meningitidis e Haemophilus influenza do tipo b têm sido conjugados com proteínas, como por exem pio o toxóide tetânico. Estas preparações conjugadas actuam como antigénios dependentes do timo e induzem respostas IgG ao grupo polissacãrido assim como memória imunológica. Também in duzem respostas nos indivíduos jovens ou idosos. Identicamente, os veículos polissacaridícos dependentes do timo têm pouco .potencial para reforçar a imunogenicidade de péptidos, tais como os envolvidos com a malária que necessitam respostas imunes de IgG dependentes do timo.

As publicações de Feldman e Lee e outros afirmam que os antigénios dos flagelos de organismos de Salmonela são tipicamente antigénios independentes do timo que estimulam acentuadas respostas de anticorpos Igí^ 3· Estes estimulam apenas as células B maduras que não existem nas crianças. Estes imunogénios também tendem a induzir tolerância nas crianças e não induzem memória ou outros aspectos das respostas imunes comple xas induzidas por antigénios dependentes do timo nos adultos. Estes dados publicados conduzem a concluir que estes têm peque nos potenciais como adjuvantes ou veículos para péptidos da ma lária ou outros antigénios pequenos que são necessários para respostas de anticorpos IgG dependentes do timo.

Não existe provavelmente um ponto exacto de transição que permita distinguir um veículo de um adjuvante. A fracção do veículo contribui para uma propriedade dos antigénios que tem

-14sido designada por adjunvaticidade intrínseca. A capacidade de certos materiais para converterem um tolerogénio em um imunogénio tem sido designada como adjunvaticidade extrínseca .

A adjunvaticidade pode ser aumentada pelo aumento do tamanho do antigênio mediante a agregação ou absorção de proteínas a veículos imunogénicos ou inertes. Assim, os materiais, tais co mo o hidróxido de alumínio, partículas de latex, bentonite, ou lipossomas que absorvem antigénios e reforçam a resposta imune, são designados como adjuvantes. Contudo, este efeito observado de agregação dos antigénios representa apenas um aspecto limita, do das acções do adjuvante que são presentemente reconhecidas como extremamente complexas.

Os pequenos péptidos e outros haptenos são incapazes de provocarem uma resposta imune forte sem se utilizar um adjuvante. A maioria dos adjuvantes que são habitualmente disponíveis são tóxicos e/ou não provocam umarespos ta imune que é eficaz para proteger o animal ou o ser humano contra a infecção provocada pelo agente infeccioso. Assim, necessita-se de uma vacina que possa ser administrada a um animal ou a um ser humano e que pro voque uma resposta do sistema imunológico prolongada e potente do tipo correcto para o antigênio apropriado.

Provou-se que os agentes tensioactivos constituídos por blocos copoliméricos não iónicos hidrofóbicos são eficazes como agentes adjuvantes imunológico que são potencialmente úteis no homem ' ' . Estes parecem actuar como adesivos que ligam os an tigénios de proteína ã superfície de gotas de óleo e/ou células de forma a facilitar a apresentação do antigênio. Estudos ante riores demonstraram que estes copolímeros podem induzir títulos elevados de respostas de anticorpos com longa duração. De uma

-15forma interessante, os copolímeros proximamente aparentados têm apenas fraca actividade, não são adjuvantes nem induzem respostas apropriadas ou tolerâncias. Este facto torna a previsão de actividade do adjuvante complexa e imprecisa.

Deve prever-se que os adjuvantes cuja actividade princi pal foi a estimulação da células ou a imunomodulação devem actuar correctamente em associação com adjuvantes copoliméricos aderentes. A associação de copolímero PLURONICA ®L 121 com um derivado de treonilo de MDP tem sido referida como induzindo me lhor resposta, particularmente uma reacção imune mediada pela

- - 7 célula do que apenas o propno L121 .

Os lipopolissacáridos são bem conhecidos como mitogénios θ de células B com efeitos acentuados sobre os macrófagos . As suas actividades de adjuvante são conhecidas de hã muitos anos, mas o seu uso tem sido limitado devido à toxicidade e eficácia variáveis. Tem sido descrito em vários artigos e revistas que a actividade biológica dos lipopolissacáridos reside na porção 9 de lípido A da molécula lipopolissacandica . Têm-se desenvol. vido diversas estratégias para reduzir a toxicidade de prepara ções de LPS embora mantendo a sua actividade adjuvante. Estas incluem a remoção de um grupo fosfato lípido A para se obter um monofosforil lípido A (MPL) ou a remoção de uma ou mais ca deias de ácido gordo da fracção lípido A. Alguns tipos lipopo lissacáridos, particularmente de Rhodopseudomonas sphaeroides, possuem um lípido A laterado e são inerentemente, não tóxicos.

isotipo de anticorpo é muito importante para a resis tência a muitas infecções, mas pouco se sabe acerca da forma de produzir uma resposta de um isotipo particular. Tem sido associada IgG2a como sendo um isotipo protector para diversos agen-16tes patogénicos, incluindo o tripanosoma cruzi^' , T. muscu12 - li e plasmodium Yoelii (malarxa) e a bactéria Brucella. Anticorpos IgE são particularmente tóxicos para os parasitas dos murganhos. Muitos parasitas, incluindo helmintas, chistosomas e larvas de nematodos estimulam naturalmente de forma predominante anticorpos Iggl e anticorpos IgE. Parecem estar relacio nadas as produções de IgGl e IgE. Cada isotipo tem vantagens funcionais que podem ser apropriadas para neutralizar um agente infeccioso particular. IgG2a liga-se de forma muito activa aos macrófagos, que podem influenciar a citotoxicidade mediada pela célula dependente do anticorpo e a fagocitose e activar o complemento. 0 isotipo IgG3 murino é particularmente eficaz para a protecção de infecções com bactérias encapsuladas como S. pneumoniae.

Finalmente, as doenças causadas por Streptococcus pneumoniae encontram-se entre as infecções bacterianas mais importantes da infância e da juventude. Pxesentemente é muito utilizada uma vacina multivalente contendo polissacáridos capsula res de 23 tipos de pneumococcus. Diversos estudos demonstraram que a eficácia da vacina para prevenir as doenças bacterémi. cas era 0% nas crianças entre 2 e 10 anos de idade e 45% em in divíduos com mais de 10 anos. Não à prova convincente de que a vacina é eficaz para doenças crónicas e os estudos demonstraram que não existe benefício para os idosos e doentes institucionalizados .

Por eles próprios, os polissacáridos capsulares são antigénios do tipo 2 independentes do timo (Tl-2) que têm pouca imunogenicidade nas pessoas muito jovens ou muito velhas. Os antigénios Tl-2 induzem apenas um número restrito de isotipos, principalmente IgM. Estes induzem apenas uma resposta de memória e facilmente ê induzida a tolerância.

Assim, o que se necessita nas vacinas e uma composição e um método de administração das vacinas de forma a que seja in duzido o isotipo de anticorpo mais protector e eficaz. A vacina deve também estar apta a induzir um título de anticorpos alto e de longa duração.

Resumo da Invenção

A presente invenção consiste num adjuvante de uma vacina que quando misturado com um antigénio e ‘administrado a um ser humano ou animal, induza uma reacção imune mais intensa ao antigénio do que a obtida quando o antigénio é administrado de forma isolada. Em muitos casos, o adjuvante que é descrito co mo da presente invenção aumentará o título global de anticorpos específicos do antigénio da vacina. Por exemplo, quando a presente invenção se realiza com um antigénio convencional, o isotipo que ê induzido é modificado de um isotipo IgGl predominante para um isotipo IgG2 mais protector e, em alguns casos, o isotipo IgG3 ou o isotipo correspondente em outras espécies . Assim, na realização da presente invenção, poder-se-á melhorar o efeito protector global de vacinas convencionais.

Além disso, a presente invenção é particularmente eficaz para induzir anticorpos protectores contra antigénios peptídicos incluindo, mas não limitando a, (antigénio da malária) (asparagina-alanina-glicina-glicina)-5-tirosina[(NAGG). Este é eficaz para um grande espectro de antigénios e tipos de antigénios. Estes incluem os polissacáridos, tais como o polissacã

-18rido pneumocócico, oligossacáridos, proteínas, péptidos e haptenos naturais ou sintéticos ou associação destes materiais.

A presente invenção consiste em um adjuvante e uma vacina que é constituída por um antigénio e um adjuvante aperfei_ çoado. Num aspecto da presente invenção um antigénio é misturado com uma quantidade eficaz de um copolimero tenso-activo de fórmula geral:

HO(C₂H₄O)_b(C₃H₆O)_a(C₂H₄O)_bH na qual o peso molecular da fracção hidrõfoba (C^H^O) está com preendido entre 4.500 e 9.000, aproximadamente e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O) tem um peso entre 3% e 15% aproxi^ raadamente.

A vacina melhorada da presente invenção também contém um antigénio e um adjuvante em que o adjuvante consiste num co polímero tenso-activo com a fórmula geral seguinte:

HO(C₂H₄O)_b(C₃H_gO)_a(C₂H₄O)_faH na qual o peso molecular da fracção hidrõfoba (C^HgO) se situa entre 3.000 e 9.000 aproximadamente e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H^O) tem um peso entre 3% e 15% aproximadamente e que é formulada sob a forma de uma emulsão de água em óleo. Os copolímeros destabilizam correntemente as emulsões de vacinas de água em óleo mas, surpreendentemente, aumentam a sua eficácia e estabilidade se omitirem agentes de emulsificação habituais .

É ainda abrangido como uma parte da presente invenção um adjuvante que consiste em um lipopolissacárido não tóxico .

-190 lipopolissacárido não tóxico pode ser um lipopolissacárido de ocorrência natural tal como um lipopolissacárido derivado de Rhodopseudomonas sphaeroides, ou um lipopolissacárido destoxifiçado. Considera-se que o adjuvante é preparado a partir de um lipopolissacárido nao tóxico em que a fracção de açúcar da molécula fica intacta e a fracção de lípido A da molécula foi modificada tornando porcanto o lipopolissacárido muito menos tóxico.

A vacina aperfeiçoada da presente invenção também contêm um antigénio e um adjuvante em que o adjuvante consiste num copolímero tenso-activo com a fórmula geral seguinte:

HO(C₂H₄O)_b(C₃HgO)_a(C₂H₄O)_bH no qual o peso molecular da fracção hidrófoba (C^HgO) se situa entre 3.000 e 9.000, aproximadamente e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O) tem um peso entre 3% e 15% aproximadamente e ainda um derivado de um lipopolissacárido. 0 adjuvante que con siste numa associação de um lipopolissacárido com um copolímero tenso-activo produz efeitos sinergícos no que se refere ao título máximo, tempo para alcançar esse máximo do título e dura ção da resposta. Além disso, a associação tende para aumentar os isotipos IgG2 protectores.

A associação do polissacárido conjugado com lípido com o copolímero e um agente imunomodulante, como por exemplo o monofqs foril límido, induz a produção de uma resposta de IgG forte em que estão presentes todas as subclasses de IgG. Em particular, são predominantes as subclasses IgG2 e IgG3 que protegem contra infecções pneumocócicas.

Este é um achado inesperado porque não existe proteína

-20ou péptido na preparação de imunogénio. Acredita-se que os radicais peptídicos são essenciais para estimular as células T que são necessárias para a produção destes isotipos. Têm sido referidos polissacáridos incapazes de estimularem as células T. No entanto, a associação de copolímero, polissacárido conjugado com lípido e agente imuno-indutor está apta a produzir essa res posta.

A presente invenção também abrange uma vacina que é e_s pecialmente útil para a imunização de um animal ou de um ser hu mano contra uma proteína, pequeno péptido, polissacárido ou ha£ teno. De acordo com a presente invenção, a proteína, pequeno péptido, polissacárido ou hapteno é conjugado com flagelos que derivam de um microrganismo. Os flagelos podem ser derivados de qualquer microrganismo flagelado; contudo os provenientes das espécies de Sabnonella são os preferidos.

Além disso, os flagelos podem ser obtidos por recombin£ ção genética. Deste modo, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar uma vacina que é particularmente eficaz para proporcionar uma reacção imunológica potente e prolongada a determinantes imunogénicos pequenos. Os flagelos conjugados com antigénio são ainda mais eficazes quando misturados com um copolímero de fórmula geral:

^HO<^C2^H4°’b^,C3^H6^O,a^<C2^H4^O’b^H em que o peso molecular da fracção hidrófoba (Ο^ΗθΟ), se situa entre 3.000 e 9.000 aproximadamente e a percentagem da fracção hidrófila (CgH^O), está entre 3% e 15% em peso, aproximadamente e um derivado de lipopolissacárido (LPS). O agente adjuvan te consiste numa associação de LPS e copolímero tenso-activo

-21que produz uma sinergia dè efeitos quer no máximo do titulo quer no tempo necessário para alcançar esse máximo. Além dis^ so, a associação tende a aumentar os isotipos IgG2 protectores .

Deste modo, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar um adjuvante melhorado para administração com antigénios que consiste num adjuvante capaz de induzir uma reac ção imunológica mais intensa a esses antigénios.

Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar uma vacina que induz respostas de anticorpo mais fortes aos antigénios, em crianças e jovens e também em idosos que reagem fracamente ãs vacinas convencionais.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um adjuvante que induza os isotipos de anticorpos pretendidos.

Outro objectivo da presente invenção ê proporcionar um adjuvante e uma vacina que induzem reacções imunológicas protec toras em indivíduos muito jovens e indivíduos idosos que pouco reagem a vacinas convencionais.

Outro objectivo da presente invenção ê proporcionar um adjuvante e uma vacina que induza um equilíbrio apropriado de imunidade mediada por anticorpos e células, proporcionando deste modo uma protecção máxima contra uma doença particular.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um adjuvante que induza populações de anticorpos de maior duração.

Outro objectivo da presente invenção ê proporcionar uma vacina eficaz que possa utilizar uma proteína recombinante ou um péptido sintético para produzir uma resposta imunológica pro longada capaz de proteger um indivíduo de uma infecção provocada pelo parasita da malária.

-22Outro objectivo da presente invenção é proporcionar uma vacina eficaz que possa utilizar um péptido sintético do vírus da SIDA para produzir uma resposta imunológica eficaz na prevenção da doença.

Ainda um outro objectivo da presente invenção é propor cionar uma vacina capaz de estimular o sistema imunológico de um animal ou de um ser humano para produzir uma resposta de IgG potente e prolongada a pequenos determinantes imunogénicos como por exemplo um péptido, hapteno ou polissacárido ou uma grande molécula tal como uma proteína ou um polissacárido.

Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar uma vacina que possua toxicidade muito baixa para seres humanos e animais.

Constitui ainda um objectivo da presente invenção proporcionar uma vacina que não provoque reacção alérgica local ou que provoque uma reacção muito pequena.

Ainda outro objectivo da presente invenção é proporcionar uma vacina capaz de ser liofilizada.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um substituinte do adjuvante completo de Freund para a produção de anticorpos em animais.

Constitui ainda um objectivo da presente invenção proporcionar um adjuvante que induza os isotipos de anticorpos de sejados.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um adjuvante que possa ser utilizado com uma preparação de vacina convencional.

Estes e outros objectivos, aspectos e vantagens da pre sente invenção tornar-se-ão evidentes apõs a leitura da descri

-23ção pormenorizada dos aspectos descritos e das reivindicações apensas.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1

Figura 2

Fighra 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8 constitui um grãfico que ilustra o título de anticor po num murganho imunizado com trinitrofenol (TNP) con jugado com uma proteína flagelar de Salmonella. representa um grãfico que apresenta a resposta ã do se de um murganho imunizado com TNP conjugado com uma proteína flagelar de Salmonella.

constitui um grãfico comparativo da resposta imunolõ gica de um murganho imunizado com TNP conjugado com albumina de ovo de galinha (HEA) e TNP conjugado com uma proteína de flagelos de Salmonella. 0 grãfico também compara a utilização de dois compostos com e *

semoa-djuvante T150R1.

é um gráfico que representa a produção de uma respo£ ta de anticorpos IgG em murganhos como reacção ã imu nização com ΤΝΡ^θΗΕΑ e vários adjuvantes.

é um grãfico que representa os efeitos adjuvantes de copolímeros com antigênio de ΤΝΡ^θΗΕΑ liofilizado em emulsões de óleo em água com 2% de esqualeno. é um grãfico que representa os efeitos adjuvantes de uma emulsão de sílica em óleo com e sem copolímeros escolhidos.

representa um grãfico que compara adjuvantes copoliméricos administrados com antigênio solúvel, TNP^gHEA. apresenta a influência do peso molecular de POP no título de anticorpos para ΤΝΡ^ΗΕΑ.

-24Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura

Figura representa a estrutura química de derivados de lípido A incluindo lípido X, lípido IVA, monofosforil-lípido A e ((hexacil MPL).

apresenta as estruturas de lipopolissacáridos de qui_ miotipo rugoso de Esterobacteriacias (SR a Re). Abre, viaturas: S, açúcar; Glc, glucose; GlcNAc, N-acetil glucosamina; Gal, galactose; Hep, L-glicero-D-mano-heptose; P, fosfato; ETN, etanolamina; KDO, 2-ceto-3-deoxioctanato; GlcN, glucosamina; R, e R₂ fosfoetanolamina; ou amiarabinose, (não presente em E. coli) . SR a Re indicam formas incompletas ou quimiotipos rugosos de LPS. Rc e Rd₁ representam quimiotipos com ausência de fosfato ligado a Hep.

apresenta a estrutura de LPS de R. sphaeroides.

apresenta a estrutura de RaLPS destoxifiçados.

apresenta a resposta de IgG aos dias 28 quando se administrou TNP-HEA a murganhos com ou sem RaLPS de_s toxificados e/ou copolimero L141.

apresenta a resposta de isotipo a ΤΝΡ^θ-ΗΕΑ induzido por lipopolissacárido totalmente tóxico e RaLPS destoxifiçados com e sem a presença de copolimeros.

apresenta as concentrações de isotipo IgG a ΤΝΡ^θΗΕΑ induzidas por L141 e/ou TDM em associação com MPL.

apresenta o efeito adjuvante de derivados de LPS pe nos como reacção a ΤΝΡ-^θΗΕΑ.

apresenta o efeito adjuvante para ΤΝΡ^θΗΕΑ de grandes LPS mutantes de comprimentos de cadeia definidos em associação com copolimero L141.

mostra o efeito adjuvante de ΤΝΡ^θΗΕΑ de fracções dos

-25Figura 19

Figura 20

Figura 21

Figura 22 Figura 23

Figura 24 maiores LPSs que contêm quantidades variáveis de O-polissacárido em associação com o copolímero L141. apresenta as alterações na intensidade e distribuição de isotipo de IgG para diferentes proporções mo lares de péptido conjugado com flagelos.

apresenta a comparação entre uma preparação de adjuvante de acordo com a presente invenção e diversas preparações de adjuvantes comercializadas.

apresenta o efeito de LPS destoxifiçado numa reacção imunológica.

apresenta a resposta ã dose de LPS destoxifiçado. mostra o efeito de LPS mais L141 numa reacção imunológica .

apresenta o efeito de LPS isolado de Rgelatinosa em associação com L141 numa reacção imunológica.

Descrição Pormenorizada

A presente invenção consiste em um adjuvante aperfeiçoa do. Em um aspecto da presente invenção, mistura-se um antigénio com uma quantidade eficaz de um adjuvante o qual contém um copolímero tensioactivo de fórmula geral seguinte:

HO(C₂H₄0)_b(C₃H₆0)_a(C₂H₄0)_bH cujo peso molecular da fracção hidrófoba (C^HgO), se situa apro ximadamente entre 4.500 e 9.000 e a percentagem da fracção hidrófila (C2H4O), aproximadamente entre 3% e 15% em peso. Os co polímeros podem obter-se de BASF Corporation, Parsippany, New

Jersey ou de CytRx Corporation, Atlanta, GA.

-26Um copolímero tensioactivo preferido é um copolímero de signado por PLURONIC L141 que apresenta a fórmula geral seguinte :

HO (C₂H₄O) _b (C₃H_gO) _a (C₂H₄O) \ cujo peso molecular da fracção hidrófoba (C^HgO), é aproximadamente 4.600 e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O), é cer ca de 10% em peso.

Outro copolímero tensioactivo preferido é um copolímero designado por PLURONIC ® L180,5 de fórmula geral seguinte:

HO(C₂H₄0)_b(C₂H₆0)_alC₂H₄0)_bH cujo peso molecular da fracção hidrófoba (C^HgO), é cerca de 5.200 e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O), é de aproximadamente 5% em peso.

Outro copolímero tensioactivo preferido é um copolímero designado por PLURONIC LI81,5 de fórmula geral seguinte:

HO(C₂H₄O)_b(C₃HgO)_a(C₂H₄O)_bH cujo peso molecular da fracção hidrófoba (C^HgO), é cerca de 5.200 e a percentagem da fracção hidrófoba (C₂H₄O), é aproxima damente 15% em peso.

Outro copolímero tensioactivo preferido é um copolímero designado por PLURONIC L190,5 de fórmula geral seguinte:

^HO(C2^H4^O)b^(C3^H6^O)a^(C2^H4^O)b^H cujo peso molecular da fracção hidrófoba (C^HgO), é aproximadamente de 8.600 e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O), é cerca de 5% em peso.

-27Uma composição de adjuvante que é abrangida como parte da presente invenção consiste em um óleo, como por exemplo um óleo animal, como por exemplo o esqualeno ou o esqualano, um óleo vegetal ou um óleo mineral, um agente tensioactivo não ió nico apropriado para formar emulsões de ãgua em óleo, como por exemplo, Span 80 (monooleato de sorbitano) , sílica e um copolí. mero de tensioactivo com a fórmula geral seguinte:

^HO<^C2^H4^O)b^(C3^H6^O)a^(C2^H4^O)b^H cujo peso molecular da fracção hidrófoba (Ο^ΗθΟ), se situa apro ximadamente entre 3.000 e 9.000 e a percentagem da fracção hidrófila (C2H4O) entre, aproximadamente, 3% e 15% em peso. Além disso, o copolímero de tensioactivo pode ser um copolímero de oito blocos com a fórmula geral seguinte:

^(C2^H4^O)a^(C3^H6^O)b _//^(C3^H6°⁾b^(C2^H4^O)a

NH-C-CNHy 2 2 <^C2^H4°’ a <^C3^H6^O) </ >^C3^H6°> b ^ÍC2^H4°> a na qual:

o peso molecular da fracção hidrófoba do copolímero de oito blo cos constituída por (C^HgO), se situa entre 5.000 e 7.000 daltons aproximadamente, a representa um número como por exemplo uma fracção hi drófila representada por (C2H4O) que constitui entre 10% e 40% aproximadamente do peso molecular do composto ;

b representa um número tal como uma fracção (C^HgO.; de

-28um copolímero de oito blocos constituído aproximadéi mente, entre 60% e 95% do composto e um derivado de um lipopolissacárido.

Quantidades preferidas dos componentes são, aproximada mente, 40% a 90% em peso de esqualeno, 2% a 50% em peso de monooleato de sorbitano, cerca de 0,5% a 10% em peso de sílica e, aproximadamente, 2% a 10% em peso do copolímero tensioactivo .

O copolímero tensioactivo preferido é o PLURONIC L141. As par tículas de sílica apresentam de preferência, um diâmetro aproximado compreendido entre 0,5% e 2 0ji.

Outros adjuvantes que são abrangidos com parte da presente invenção são os lipopolissacáridos não tóxicos e lipopolissacáridos tóxicos destoxifiçados. Estes são lipopolissacáridos que ou são inerentemente atóxicos ou que são lipopoliss^ cãridos tóxicos foram modificados por via química afim de redu zir a toxicidade. Isto inclui, a hidrólise alcalina moderada de ácidos gordos.

Os lipopolissacáridos de ocorrência natural atóxicos , mas embora não limitados a estes, são os lipopolissacáridos as sociados com Rhodopseudomonas species, incluindo R. sphaeroides, R. acidophilia, R. blastica, R. gelatinosa, R. capsulata,

R, palustris e R. viridis. Existem diversos métodos para destoxificar os lipopolissacáridos tóxicos comercializados. Alguns destes métodos estão referidos nos exemplos. Estes métodos incluem de um modo geral a modificação química da parte do lípido A da molécula. É importante notar que o lipopolissacárido destoxificado é um lipopolissacárido tóxico em que a fracção polis sacarídica da molécula permanece intacta e a parte do lípido A da molécula foi modificada para remover a fracção de ácidos gor

-29dos, tornando portanto este lipopolissacárido muito menos tõxi.

co.

Os adjuvantes melhorados da presente invenção também consistem em derivados lipopolissacáridos associados com copolímero tensioactivo de fórmula geral seguinte:

^HO<^C2^H4^O)b'^<C3^H6^O)a^<C2^H4°’b^H em gue o peso molecular da fracção hidrõfoba, (C^HgO), se situa entre 3.000 e 9.000 aproximadamente e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O), entre 3% e 15% em peso. A presente invenção também abrange um derivado de lipopolissacárido combinado com um copolimeto de oito blocos de fórmula geral seguinte:

(c₂h₄o) (c₂h₄o) a^(c3^H6^O)b

NH₂C-CNH₂ a^IC3^H6°>b (^C3^H6^O)b(^C2^H4^O)a (^C3^H6^O)b^(C2^H4^O)a em que:

o peso molecular da fracção hidrõfoba do copolímero de oito bio cos constituída por (C^HgO), se situa aproximadamente entre 4.000 e 9.000 daltons, de preferência entre 5.000 e 7.000 daltons ;

a representa um número de forma tal que a fracção hidro fila representada por (C₂H₄O), constitua aproximadamente entre 5% e 40% do peso molecular total do cornpo^ to;

-30b representa um número de tal forma que a fracção representada por (CgHgO) do copolímero de oito blocos constitua aproximadamente entre 60% e 95% do compo£ to.

A fracção (^ΗθΟ) do copolímero pode constituir até 95% do composto. A fracção (C₂H₄O) do copolímero pode constituir uma quantidade tão diminuta como 5% do composto.

O adjuvante que consiste numa associação de LPS e copo límero tensioactivo produz efeitos sinérgicos quer relativamen te ao título máximo quer ao tempo para alcançar esse título má ximo. Em alguns casos, especialmente com lipop.olissacáridos de peso molecular mais baixo, o título inicial é mais alto e en tão o tempo é ligeiramente menor. Com lipopolissacáridos de pe so molecular mais alto, o título inicial ê maior e a resposta permanece alta durante todo o período. Com todos os lipopolissa cãridos, a associação tende a aumentar os isotipos protectores IgG2a e IgG2b. Este facto é inesperado porque o LPS, por si só, tem sido referido como actuando de adjuvante para induzir uma resposta imunológica predominantemente de IgGl.

O adjuvante aperfeiçoado também consiste em um copolímes ro tensioactivo de fórmula geral seguinte:

^HO(C2^H4^O,b^ÍC3^H6^O)a^,C2^H4^O)b^H em que o peso molecular da fracção hidrófoba (C^HgO), se situa aproximadamente entre 3.000 e 9.000 e a percentagem da fracção hidrófila (C^H^O), constitui aproximadamente entre 3% e 15% em peso e um copolímero de oito blocos inversos com a fórmula geral seguinte:

-31<^C3^H6^Olb^(C2^H4^O)a ^,C2^H4°>a^<C3^H6^O)b

NH₂C-CNH₂ <^C3^H6^O)b^(C2^H4^O)a'

^(C2^H4°)a^(C3^H6^O)b na qual:

o peso molecular da fracção hidrófoba do copolímero de oito blo cos constituídos por (Ο^ΗθΟ), se situa entre 5.000 e 7.000 daltons aproximadamente;

a representa um número de tal forma que a fracção hi_ drófila representada por (C^H^O) constitui entre 10% e 40% aproximadamente do peso molecular total do composto;

b representa um número de tal forma que a fracção (C^HgO) do copolímero de oito blocos constitui entre 60% e 90% do composto, aproximadamente.

A fracção (C^HgO) do copolímero pode constituir até 95% do composto. A fracção (C₂H₄O) do copolímero pode constituir apenas 5% do composto.

a representa um número de tal forma que a fracção hi drófila representada por polioxietileno (C^H^O) , constitui aproximadamente entre 5% e 40% do peso molecular total do composto;

o peso médio do agregado molecular da fracção hidró foba do copolímero de oito blocos constituídos por polioxipropiler.o (Ο^ΗθΟ), situa-se, aproximadamente entre 4.000 e 8.000 daltons^

-32b representa um número de tal forma que a fracção de polioxipropileno (C^HgO), do peso molcular total do copolímero de oito blocos· constitui aproximadamente entre 60% e 90%.

A fracção (C^HgO) do copolímero pode constituir até 95% do composto. A fracção (C₂H₄O) do copolímero pode constituir tão pouco quanto 5% do composto.

adjuvante aperfeiçoado também contêm um copolímero tensioactivo de fórmula geral seguinte:

HO(C₂H₄O)_b(C₃H₆O)_a(C₂H₄O)_bH em que o peso molecular da fracção hidrófoba (ΟβΗθΟ), se situa aproximadamente entre 3.000 e 9.000 e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O) entre, aproximadamente 3% e 15% em peso do copolímero de oito blocos de fórmula geral seguinte:

^(C2^H4°'a^,C3^H6°’b

V

NH,C-CNH /

<^c2^H4°’a^(C3^H6⁰⁾b ^(C3^H6^O)b^(C2^H4°’a <^C3^H6^Olb^(C2^H4^O)a na qual:

o peso molecular da fracção hidrófoba do copolímero de oito blo cos constituída por (C^HgO), se situa aproximadamente entre 5.000 e 7.000 daltons;

a representa um número tal que a fracção hidrófila re presentada por (C₂H₄O) constitui entre 10% e 40% aproximadamente do peso molecular total do composto;

-33b representa um número de tal forma que a fracção (C_oH,0) do copolímero de oito blocos constitui ,

J o aproximadamente, entre 60% e 90% do composto;

A fracção (Ο^ΗθΟ) do copolímero pode constituir até 95% do composto. A fracção (C2H4O) do copolímero pode constituir tão pouco quanto 3% do composto.

A presente invenção também abrange vacinas que contêm antigénios e os adjuvantes citados anteriormente.

A presente invenção também abrange uma vacina que é especialmente útil para a imunização de um animal ou de um ser hu mano contra um polissacárido, proteína, pequeno péptido ou outro hapteno. De acordo com a presente invenção, os péptidos ou pequenos haptenos são conjugados com flagelos derivados de microrganismos. Cs flagelos podem ser provenientes de qualquer microrganismo flagelado; contudo, os provenientes da Salmonella species são os preferidos. Deve entender-se que as espécies bac terianas preferidas de cujos flagelos derivam para qualquer parti cular aplicação depende das exigências do antigênio em causa, da aplicação e não são críticas para a presente invenção.

Algumas bactérias possuem um único flagelo enquanto outras têm um tufo de flagelos e ainda outras têm flagelos distri^ buídos por toda a superfície celular. Os flagelos bacterianos têm entre 10 e 35 nm de diâmetro e podem, algumas vezes exceder entre 10 e 15 jim de comprimento ou, frequentemente, o diâmetro da célula. A maioria dos flagelos bacterianos apresentam um en rolamento regular e uniforme com um comprimento de onda cerca de 2,5 pm.

Quando se acidifica um flagelo bacteriano de natureza proteínica, para pH=3, este dissocia-se em subunidades monoméri.

-34cas idênticas designadas por flagelina, que apresenta um peso molecular aproximado de 40.000 na maioria das espécies. Sob condições apropriadas de pH e concentração salina, os monómeros de flagelina reagrupam-se espontaneamente para formarem es truturas que parecem idênticas aos flagelos intactos apresentando enrolamentos periódicos com o mesmo comprimento de onda dos flagelos naturais.

Os flagelos bacterianos intactos na forma natural ou fi_ xada por meioj de agentes fixantes, podem ser utilizados na prã. tica da presente invenção. Além disso, a flagelina repolimerizada é satisfatória para a prática desta invenção. Considera-se que o componente essencial da presente invenção é aquele em que na preparação constitui um polímero composto por moléculas de flagelina regularmente espassadas com um esquema geométrico para produzir uma estrutura flagelar alongada típica de um micror ganismo particular.

Alguns processos para a preparação de flagelos a partir de culturas bacterianas têm sido desenvolvidos e são conheci, dos. 0 processo preferido consiste numa modificação do processo de Kobayashi, et al, como referido aqui¹^.

Os organismos de Salmonella typhi da estirpe Ty2 foram desenvolvidos em agar móvel. Os organismos com grande motilidade são os escolhidos porque produzem a maior quantidade de flagelos. Os organismos em seguida são inoculados em 20 litros de caldo de tripticase de soja e incubados à temperatura de 37°C por um período aproximado de 30 horas até ao fim do desenvolvimento da fase logarítmico. Os organismos podem ser mortos neste momento mediante a adição de formaldeído de forma a produzir-se uma suspensão a 0,3%. Os organismos são recolhidos de pre-35ferência por centrifugação; contudo, deve cuidar-se de evitar a produção de uma força excessiva. Os flagelos são em seguida retirados dos organismos por agitação vigorosa durante 20 minutos, num agitador. Podem utilizar-se outros misturadores e dispositivos que produzam uma força de forma a separar os flagelos sem destruir o organismo, sendo igualmente satisfatório .

Em seguida separam-se os flagelos dos corpos celulares por centrifugação diferencial. Retiram-se os corpos das células por centrifugação a uma velocidade aproximada de 2.000 rotações por minuto numa centrífuga de laboratório convencional. Os flagelos são depois recolhidos por ultracentrifugação a 30.000 rpm. Depois, os flagelos são ressuspensos e novamente centrifugados numa ultracentrífuga, sendo separados os materiais contaminantes solúveis. Os grandes materiais contaminan tes formam uma mancha escura no fundo do aglomerado de flagelos transparente. Este material é retirado por meio físico e inutilizado. O produto finai proveniente de 20 litros de cultura bacteriana será aproximadamente 100 mg de flagelos purificados.

A flagelina pode ser obtida por acidificação de flagelos não fixados a um pH aproximado de 2, durante uma noite. Este tratamento separa as proteínas flagelares produzindo monómeros de flagelina com um peso molecular aproximado de 30.000. Os monómeros reunem-se formando flagelos polimerizados quando per manecem a pH neutro por um período não inferior a 24 horas. A flagelina repolimerizada é aproximadamente tão eficaz quanto os flagelos naturais como a do adjuvante e veículo para grupos antigénicos pequenos. A flagelina monomérica ou os fragmentos de cisão proteolítica da proteína flagelina são muito menos efioa zes.

-360 antigénio, isto é, a proteína, polissacárido, hapteno ou fracção peptidica, pode ser conjugado quimicamente com os flagelos por meio de qualquer processo convencional conheci do. Um dos meios mais simples e eficaz é a utilização de gluteraldeido. 0 gluteraldeído é um composto divalente de ligação cruzada que se liga de forma covalente com os péptidos dos flagelos e fixa a preparação de flagelos. São eficazes outros rea gentes de ligação química cruzada ou derivados antigénicos qu_i micos, como por exemplo o dimitrofluorobenzeno. Os métodos de conjugação de um antigénio, hapteno ou fracção peptidica são conhecidos nesta área técnica.

As quantidades de antigénio ligadas com os flagelos va. riam com a aplicação particular e não constituem um componente critico da presente invenção. De preferência, é suficiente uma preparação com 2 a 10 unidades peptidicas ou hapteno por monómero de flagelina, na preparação de flagelos. São necessá rias quantidades menores para proteínas ou antigénios polissacãridos maiores.

A preparação de flagelos conjugados é purificada por diãlise, centrifugação ou qualquer outro método convencional.

Em seguida, o material é ressuspenso em solução de cloreto de sõdio com uma concentração aproximada de 100 yig/ml.

Esta preparação é eficaz em doses baixas, entre 1 e 100 yjg por injecção. Uma dose de 10 ^ig produz uma resposta satisfa^ tõria, em muitas das situações. O material pode ser injectado através de qualquer via adequada, endovenosa, subcutânea, intra muscular ou intraperitoneal. As vias mais convenientes são usualmente a subcutânea ou intramuscular para a maioria das vacinas .

-37Como exemplo, as injecções de 20 jig de flagelos de Salmonella typhi conjugados com dinitrofenol resultam em títulos de anticorpos específicos de IgG para o hapteno DNP que aparecem no fim da primeira semana após a injecção e persistem durante um ano.

A persistência da reacção imunológica aos flagelos e a grupos antigénicos conjugados com flagelos é invulgar e inespe rada. O material não forma um depósito local de antigénio no sítio da injecção. Aproximadamente entre 90 a 95% da dose de flagelo injectada é fragmentada e excretada nas 24 horas. Uma porção do material é retirada por um período prolongado em centros germinativos com nodos linfáticos locais. Considera-se que a presença deste antigénio nos centros germinais é respon sável pela produção prolongada de anticorpos.

A presente invenção tem numerosas vantagens relativamen te a outras preparações de adjuvantes disponíveis. Produz muito pouca inflamação no sítio da injecção e é totalmente biodegradável. Este facto contrasta vivamente com as emulsões oleosas ou sais minerais como por exemplo de alumínio. São necessárias muito pequenas doses de antigénio para produzir uma reacção imunológica prolongada. Uma fraeção significativa do anticorpo é de IgG que fixa complemento cujo tipo é requerido para protecção contra infecções importantes como malária, esporozõi. tos e outras. 0 produto é estável especialmente quando preparado com agentes fixadores como por exemplo o. gluteraldeído. Pc> de ser liofilizado e conservado indefinidamente, à temperatura ambiente. Quando se reconstitui com solução de cloreto de sõdio, ê estável durante várias semanas com refrigeração e duran te vários dias ;ã temperatura ambiente.

-38Diferentemente das vacinas vivas atenuadas que podem pro duzir infecções em hospedeiros súsceptíveis, esta preparação de vacina consiste apenas numa proteína polimerizada com vestígios ce polissacárido.

A dose preferida de uma vacina preparada de acordo com a presente invenção situa-se entre 5 pg e 500 jig. Para qualquer vacina, a dose óptima depende do antigênio que é conjugado com a proteína flagelar e a situação imunolõgica do animal ou do ser humano a que se destina a vacinação.

A vacina da presente invenção também inclui a administra ção de uma vacina com um adjuvante para reforçar a reacção imuno lógica. O adjuvante preferido que pode ser utilizado com a vac_i na desta invenção é constituído por um copolímero de blocos que contêm um polímero de polioxietileno hidrofílico sobre um inici£ dor de etileno diamina. Os polímeros de polioxipropileno hidrofóbicos são depois associados com um bloco de polioxietileno hidrofílico. Daqui resulta um copolímero de oito blocos com a fórmula geral seguinte:

(C₂H4^O)a(C3^H6O)

^(C3^H6°’b^(C2^H4^O)a ^IC3^H6°’b^,C2^H4^O’a na qual:

o peso molecular da fracção hidrófoba do copolímero de oito blo cos constituída por (C^HgO) se situa aproximadamente entre 5.000 e 7.000 daltons;

a representa um número de tal forma que a fracção hidró

-39fila representada por (CgH^jO) , constitui aproximadamente entre 10% e 40% do peso molecular do composto;

b representa um número de tal forma que a fracção (CgHgO) do copolímero de oito blocos constitui apro ximadamente entre 60% e 90% do composto.

A fracção (C^HgO) do copolímero pode constituir até 95% do composto. A fracção (CgH^O) do copolímero pode constituir tão pouco quanto 5% do composto.

Os adjuvantes preferidos têm a fórmula geral seguinte:

^(C2^H4^Ola^(C3^H6^O)b

NH₂C-CNH₂ ^(C2^H4^O)a^(C3^H6°’b <^C3^H6^O)b<^C2^H4°>a <^C3^H6^O)b^(C2^H4^O)a na qual a representa aproximadamente 5 e b representa aproximamente 32.

Outro polímero que pode ser utilizado com a vacina que constitui a presente invenção tem a fórmula geral seguinte:

HO(C₂H₄O)_b(C₃H₆O)_a(C₂H₄)_bH na qual o peso molecular da fracção hidrófoba (C^HgO), se situa aproximadamente entre 2.000 e 5.500 e o peso molecular total do composto entre aproximadamente 2.300 e 5.500.

O adjuvante preferido tem a fórmula geral seguinte:

I i

HO(C₂H₄O)_Í3(C₃H_gO)_a(C₂H₄O)_bH na qual o peso molecular da fracção hidrõfoba (C_oH-0), é aproxi madamente 4.600 e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O), é aproximadamente de 10% em peso.

Outro adjuvante preferido tem a fórmula geral seguinte:

r

HO(C₂H₄O)_b(C₃H₆O)_a(C₂H₄O)_bH

X na qual o peso molecular da fracção hidrõfoba, (C^H^O) é aproximadamente 5.200 e a percentagem da fracção hidrófila (C₂H₄O), é aproximadamente de 10% em peso.

Os blocos poliméricos são formados pela condensação do óxido de etileno com o óxido de propileno com um iniciador de etileno diamina tetrafuncional a temperatura e pressões elevadas na presença de um catalisador básico. Existe alguma varia ção estatística no número de unidades monoméricas que se combi^ nam para formar uma cadeia polimérica em cada copolimero. Os pesos moleculares fornecidos são aproximações do peso médio da molécula de copolimero em cada preparação. Uma descrição maior da preparação destes copolímeros encontra-se nas patentes de in venção Norte Americanas nSs. 2.674.619 e 2.979.528 cuja referên 14 cia aqui se cita

O peso molecular publicado para poloxameros e polaxaminas é correntemente determinado pelo método de hidroxilo. Os grupos terminais das cadeias de poliester são grupos hidroxilo.

O número de peso molecular médio pode ser calculado por determi. nação analítica do número de radicais OH expresso em mg KOH/mg amostra. Deve entender-se que o valor absoluto do peso molecular de um composto polidisperso pode ser diferente dependendo do método utilizado para determinar o peso molecular. Des te modo, é importante conhecer qual o método utilizado para a

-41determinação do peso molecular do copolímero. Como aqui se re fere, cs pesos moleculares de todos os copolímeros foram detej: minados pelo método de hidroxilo. Obteve-se um número ligeira mente diferente quando se determinou o peso molecular por outro método como por exemplo por cromatografia líquida de alta resolução.

A vacina que constitui a presente invenção é misturada com um copolímero de oito blocos e administrada a um ser humano ou a um animal. A quantidade preferida de adjuvante adminis trado com a vacina da presente invenção situa-se aproximadamente entre 0,1 mg e 5,0 mg sendo a quantidade mais preferida a quantidade situada entre 0,5 mg e 2 mg, aproximadamente.

Um outro aspecto de adjuvantes da presente invenção são os derivados diversos de lípido A. As estruturas de espécies vá rias de lípido A estão descritas num artigo de Takayama, K., et al e Raetz, C. R. H. que aqui se incorporam pelas referências O monofosforil-lípido A tem menor toxicidade do que a molécula total do lípido A mas tem uma toxicidade inferior para os animais quando o lípido A não é completo. Na biosíntese do lípido A, são precursores o lípido IVA e o lípido X. As estruturas de alguns derivados do lípido A que são abrangidas como parte da presente invenção estão apresentadas nas figuras de 10 a 13.

Descrições diversas recentes têm responsabilizado anticorpos IgG2a como conferindo protecção contra diversas infecções virais e bacterianas. Os anticorpos IgG2b têm sido sujeitos a muito menor investigação embora estejam referidos como sendo pro tectores. Os anticorpos da subclasse IgGl não fixam complemento e pensam conferir muito menos eficácia protectora, em muitas situações. Consequentemente, a capacidade dos derivados de lipopo

-42lissacáridos para modofiçarem a reacção de anticorpos relativamente a isotipos IgG2, especialmente quando misturados com copo límeros, espera-se que aumente a eficácia das vacinas.

Os antigénios que se podem utilizar na presente invenção são compostos que, quando introduzidos num mamífero, resu_l tam na formação de anticorpos. Podem-se utilizar antigénios re. presentativos de acordo com a presente invenção, tais como os produtos naturais, recombinantes ou sintéticos derivados de ví. rus, bactérias, fungos, parasitas e outros agentes infecciosos, além de doenças autoimunes, hormonas ou antigénios tumorais que podem ser utilizados como vacinas profilácticas ou terapêuticas embora não estando limitados a estes. Os produtos virais ou bacterianos podem ser componentes que o organismo produziu por cisão enzimática ou podem ser componentes do organismo que foram produzidos por técnicas de recombinação de ADN e que são técnicas convencionais conhecidas. Em seguida fornece-se uma lista parcial de antigénios representativos.

Viruses

HIV

Rotavirus

Foot and mouse disease

Influenza

Parainfluenza

Herpes species, Herpes simplex, Epstein Barr virus Chicken pox, pseudorabies

Rabies

Polio

Hepatitis A Hepatitis B Hepatitis C Measles

-43Distemper

Venezuelan equine encephalomyelitis

Rota virus

Feline leukemia virus

Reovirus

Respiratory sycytial virus Lassa fever virus Polyoma tumor virus Canine parvovirus Bovine papilloma virus Tick borne encephalitis Rinderpest

Human rhinovirus species Enterovirus species, Mengo virus Paramyxovirus

Avian infectious bronchitis virus

Bactéria

Bordetella pertussis Brucella abortis Escherichia coli

Salmonella species, Salmonella typhi

Streptococci

Cholera

Shigella

Pseudomonas

Tuberculosis

Leprosy

Ricketsial Infections

Rocky mountain spotted fever Thyphus

Parasites

Malaria(Plasmodium, falciparum, P. vivax, P. malarie)

Schistosomes

Trypanosomes

Fungus

Cryptococcus neoformans

-44Subunit recombinant proteins Herpes simplex Epstein Barr virus Hepatitis B Pseudorabies

Flavivirus, Denge, Yellow fever Neisseria gonorrhoeae

Malaria: circumsporozoite protein, merozoite protein

Trypanosome surface antigen protein

Petussis

Alphaviruses

Adenovirus

Proteins

Diphtheria toxoid Tetanus toxoid

Meningococcal outer membrane protein(OMP) Streptococcal M protein Hepatitis B

Influenza hemagglutinin

Synthetic peptide Malaria Influenza

Foot and mouth disease virus Hepatitis B, Hepatitis C

Polysaccharide

Pneumococcal polysaccharide Haemophilis influenza polyribosyl-ribitolpnosphate(PRP)

Neisseria meningitides

Pseudomonas aeruginosa

Klebsiella pneumoniae

Oligosaccharide

Pneumococcal

-45Os haptenos são compostos que quando ligados a um veículo imunogénico introduzido em um cordado, provocará a formação de anticorpos específicos para o hapteno. Haptenos representativos são os esteroides como por exemplo os estrogéniosecortis£ nas, péptidos de baixo peso molecular e outros compostos biolõgicos, fârmacos como os antibióticos e os compostos quimioterapêuticos, poluentes industriais, agentes apaladantes, aditivos alimentares e contaminantes dos alimentos e/ou os seus metaboli.

tos ou derivados.

Além dos aspectos anteriores da presente invenção, a adi. ção de certos copolímeros ãs suspensões de sílica têm proporcio nado um aumento inesperado da actividade adjuvante da composição .

A sílica é um adjuvante conhecida, mas a sua utilização tem sido limitada devido ã toxicidade, especialmente ã fibrose. Esta toxicidade é reduzida e a eficácia acrescida por incorpora ção na silica de um veículo oleoso com ou sem outros grupos adjuvantes, como por exemplo copolímeros com actividade. superficial ou LPS. A dose e a toxicidade da sílica são reduzidas em bora a eficácia esteja aumentada, devido à presente invenção.

De preferência, a emulsão oleosa contém um óleo e partículas de sílica com a emulsão constituída por 40% a 99% de õleo. Um óleo preferido é o esqualeno (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Além do óleo, pode, eventualmente, adicionar-se um tensioactivo ou uma mistura de tensioactivos a esse óleo. Exemplos de tensioactivos que se podem utilizar na presente invenção são o polioxietileno sorbitano (Tween) e o Sorbitano (Span), (Sigma Che mical Company, St. Louis, MO). Contudo, os copolímeros como PLURONIC L121 têm frequentemente preferência.

-46Deste modo, certos componentes de adjuvantes de vacinas são responsáveis por oxidação, tendo sido incluídos como agentes conservantes antioxidantes. 0 esqualeno, veículo oleoso , é particularmente sensível â oxidação. Os copolímeros em blocos podem também ser afectados. Muitos dos agentes antioxidan tes estão comercializados e são potencialmente aceitáveis como impedidores da degradação oxidativa dos componentes da vacina. Exemplos destes, são os tocoferol (vitamina E) ouc os derivados de tocoferol, que se consideram terem capacidade para reforçar a actividade adjuvante além de impedirem a oxidação . Descobriu-se que os antioxidantes são particularmente eficazes para aumentaras respostas imunes e reduzirem inflamação local além de servirem como agente antioxidante quando utilizados em associação com copolímeros ou emulsões de sílica. Deste modo , constitui uma parte da presente invenção a mistura de agentes antioxidantes, tais como o tocoferol ou os seus derivados, com agentes adjuvantes e vacinas aqui descritas.

Os exemplos específicos seguintes ilustraram a presente invenção que é aplicada para aumentar a resposta imunológica de um organismo aos pequenos haptenos. Deve notar-se que outros exemplos devem ser evidentes para as técnicas nesta matéria e que a presente invenção não se limita aos exemplos explicativos específicos aqui descritos.

Exemplo 1

Organismos Salmonella typhi da estirpe TY2 foram desenvolvidos em agar móvel. Em seguida, inocularam-se estes organismos em 20 litros de caldo de soja-tripticase e incubaram-se

-47ã temperatura de 37°C durante 30 horas até ao fim da fase logarítmica de desenvolvimento. Mataram-se estes organismos neste momento pela adição de formaldeído para se obter uma suspensão a 0,3%. Os organismos foram recolhidos por centrifugação. Deve tomar-se cuidado para evitar a produção de uma força excessiva. Os flagelos podem depois ser retirados dos organismos por agita ção vigorosa durante 20 minutos no agitador. Outro misturador e dispositivo que produza uma força de fragmentação suficiente para separarem os flagelos sem fragmentarem os organismos, são igualmente satisfatórias. Em seguida separaram-se os flagelos do corpo celular por centrifugação diferencial. Os corpos das células são depois retirados por centrifugação a 2000 rotações por minuto numa centrífuga laboratorial convencional. Em seguida, re colheram-se os flagelos por ultracentrifugação a 30.000 rpm.

Apõs a ultracentrifugação ressuspenderam-se os flagelos e recen trifugaram-se numa ultracentrífuga, separando-se os materiais contaminantes solúveis. Grandes materiais contaminantes formam uma mancha negra ao fundo do aglomerado de flagelos transparente. Este material é retirado fisicamente e inutilizado. O produto final, proveniente de 20 litros de cultura bacteriana foi aproximadamente 100 mg de flagelos purificados.

Exemplo 2

Acidificando-se os flagelos a um pH aproximadamente de 2, durante 12 horas, obtém-se a produção de flagelina. Este tratamento dissocia as proteínas flagelares produzindo monõmeros de flagelina que têm um peso molecular de 30.000, aproximadamente. Os monõmeros reagrupam-se em flagelos polimerizados quando perma necem em repouso a pH neutro por um período não inferior a 24 horas.

-48Exemplo 3

O gluteraldeído é um composto de ligação cruzada divalen te que, por covalência, liga o péptido aos flagelos e depois fixa a preparação de flagelos. Estes métodos de conjugação do grupo funcional com uma proteína são conhecidos e convencionais.

São também eficazes outros reagentes de ligação cruzada química ou derivados de antigenes químicos como, por exemplo, o dinitrofluorobenzeno.

Exemplo 4

Purificou-se uma preparação de flagelos conjugados , por diálise, centrifugação ou outro método convencional. Em segui, da, ressuspendeu-se o material em solução de cloreto de sódio com uma concentração aproximada de 100 jig/ml. Esta preparação é eficaz em doses baixas, entre 1 e 100 ^ig/ml, por injecção. Uma dose de 10 yjg produz uma resposta satisfatória em muitas das situações 0 material pode ser injectado por qualquer dia conveniente, endovenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal. A via mais conveniente é, de um modo geral, a via subcutânea ou intramuscular para a maioria das finalidades da vacina.

Exemplo 5

Realizou-se a destoxificação de Ra-LPS (Ra-detox), do seguinte modo:

Suspenderam-se 10 mg de Ra-LPS obtidos de E. coli EH-100, em 5,0 ml de ãgua, sonicaram-se durante 15 minutos e incubaram-se ã tem peratura de 100°C durante 5 minutos. Adicionou-se um terço do vo lume de trietilamina ã amostra imediatamente apõs a remoção da incubação e misturou-se bem. Esta amostra permaneceu em repouso

-49ã temperatura ambiente (22°C), durante 4 dias. Em seguida liofilizou-se a amostra e os ácidos gordos livres foram libertados pelo tratamento e extraídos com hexano. 0 resíduo que permaneceu constituía Ra-detox. A análise por crornatografia em camada fina da amostra hidrolisada em ãcido clorídrico 0,1 M revelou que o esquema de MPL se tinha alterado das formas hexa-acil-penta-acil para penta-acil-tetra-acil. Considerou-se que um único ác_i do 3-hidroximirístico na posição 3 do lípido A, tinha sido liber tado resultando na formação de Ra-LPS-penta-acilo, predominante- -18 mente, com redução da actividade endotõxica

Podem preparar-se lipopolissacáridos destoxifiçados de uma grande variedade de outras formas de LPS, incluindo, mas não limitando a, Ra-LPS de S. minnesota R60 ou S. typhinurium TV 119 assim como SR-LPS de S. typhinurium SF 1512, e utilizarem-se como adjuvantes.

Exemplo 6

Um ensaio ELISA foi utilizado para a determinação de an ticorpos dirigidos contra o hapteno trinitrofenol. Este método é uma modificação do método publicado originalmente por Saun ders . O ensaio utiliza uma proteína, albumina de soro bovino, hidrogel para reduzir a desnaturação das proteínas aderentes ao suporte de plástico e a utilização de proteínas e agentes tensio activos para reduzir a absorção não especifica de proteínas que tendem a aumentar o substrato e reduzir a sensibildiade. Utiliza-se o gluteraldeído para ligar o antigénio âs placas microtituladoras de 96 cavidades revestidas com BSA. O gluteraldeído que não se liga é retirado. O antigene adiciona-se às placas e liga-se por covalência através de grupos aldeídos livres do glu-50teraldeído.

Os grupos aldeídicos restantes são bloqueados com lisina e a placa está pronta para utilização. As placas são incuba das com diluições variáveis de antisoro, lavadas e em seguida adicionadas com um segundo anticorpo, tal como IgG anti-murganho de caprino conjugada com peroxidase ou uma das subclasses. As placas são lavadas e adicionado o substrato, por exemplo or tofenilenodiamina com perõxido. A absorvãncia resultante é l_i da ã 492 nm num fotómetro Titertek Multiscan. Calcula-se o t_x tulo de anti-corpo pela diluição de antisoro necessária para produzir um terço ws-em· de densidade óptica máxima do subs trato. Isto é normalizado pela comparação com o antisoro de referência, simultaneamente com a amostra. Isto facilita a com paração dos títulos obtidos, em dias diferentes. A avidez rela tiva de anticorpos em relação um ao outro é avaliada pela análi. se da inclinação da curva da densidade óptica versus diluição do soro.

Ensaios ELISA idênticos podem desenvolver-se para muitos antigeneos, incluindo proteínas, pêptidos e polissacáridos, de acordo com a prática corrente. Além disso, pode adicionar-se de um a quatro moles de tiocianato de amónio às cavidades ELISA após o primeiro anticorpo, para facilitar a separação dos anticorpos de baixa avidez e, deste modo, proporcionar uma medi_ da mais quantitativa da avidez.

Exemplo 7

Na experiência seguinte, administraram-se 25 jig de flagelos conjugados com uma média de 4 moléculas de TNP por flage-51lo a murganhos, através da almofada da pata. Os flagelos conju gados com TNP foram administrados num volume de 5 ml de solução de cloreto de sódio. Mediu-se o anticorpo específico para TNP nos momentos seguintes, após a administração dos flagelos conju gados com TNP: 8 dias, 19 dias, 30 dias, 50 dias e 90 dias. Os resultados desta experiência estão apresentados na figura 1. Co mo se pode observar, a resposta imunológica aos flagelos conju gados com TNP é ainda significativamente alta embora após 90 dias. A resposta a conjugados TNP convencionais, tais como al. bumina de ovo de galinha conjugada com TNP é de muito menor duração e os títulos de anticorpo são muito mais baixos. Os animais, frequentemente, não têm reacção de anticorpos detectáveis a um hapteno em um veículo de proteína solúvel após uma única injecção.

Exemplo 8

Mediu-se a resposta ã dose de.murganho mediante a administração de doses variáveis de flagelos' conjugados com TNP. Os flagelos conjugados com uma média de 4 moléculas de TNP por molécula de flagelina, (peso molecular aproximado 40.000) foram administrados a murganhos através da almofada da pata. Os flagelos conjugados com TNP foram administrados num volume de 0,5 ml de cloreto de sódio. As concentrações seguintes de flagelos conjugados com TNP administrados a murganhos foram: 4 jig, 10 yug, 25 yjg e 50 jig. Os anticorpos produzidos como resposta aos flage los conjugados com TNP foram medidos aos 8 dias e aos 19 dias após a administração dos flagelos conjugados com TNP. Os 7 tados desta experiência apresentam-se na Figura 2.

-52Exemplo 9

A comparação da resposta imunológica de murganhos a TNP conjugado com albumina de ovo de galinha (HEA) e a TNP conjugada com proteína dos flagelos de bactérias, apresenta-se na Figu ra 3. Nesta experiência conjugou-se TNP com HEA utilizando-se como derivado reactivo o ãcido trinitrotrobenzenossulfónico (TNBS), da mesma forma que os flagelos. Administraram-se 100 jag de HEA conjugado com TNP ou 25 jug de flagelos conjugados com TNP, a murganhos, através da almofada da pata. Decorridos 10 dias sobre a administração das proteínas conjugadas com TNP, me diu-se o título de anticorpos de acordo com o método descrito no Exemplo 6. Como se apresenta na Figura 3, os flagelos conjugados com TNP induziram uma resposta imunológica significativamente maior, medida de acordo com o título do anticorpo, do que produziram HEA conjugada com TNP. Deve notar-se que a quantida de de HEA-TNP administrada nesta experiência, é quatro vezes a quantidade de flagelos conjugados com TNP {100 jjg de HEA-TNP ver sus 25 jjg d® flagelos conjugados com TNP).

Exemplo 10

Administraram-se as mesmas preparações como utilizadas no exemplo 9, a murganhos, com adição de 1,0 mg de adjuvante T150R1. Através da almofada da pata, administraram-se a murga. nhos 100 ^ig de HEA conjugado com TNP ou 25 jug de flagelos conjugados com TNP. Decorridos 10 dias apõs a administração das proteínas com TNP com adjuvantes, mediu-se o título de antico_r pos, de acordo com o método descrito no Exemplo 6. Os resulta dos desta experiência estão reunidos na Figura 3. Como se apre

-53senta, o adjuvante aumentou a resposta imune de HEA conjugada com TNP e de flagelos conjugados com TNP. Contudo, os flagelos conjugados com TNP induziram uma resposta imune significa tivamente maior do que o fez o HEA conjugada com TNP. Realiza ram-se experiências idênticas com hemocianina de lapa (KLH) em substituição de HEA, obtendo-se resultados similares. A KLH foi mais eficaz do que HEA, mas menos eficaz que os flagelos , como veículo.

Exemplo 11

Como os copolímeros de blocos, parecem actuar, cofno adjuvantes, através de mecanismos diferentes, existe uma poss_i bilidade da incorporação destes em composições mais complexas para optimizar a actividade de aplicações particulares. Preparou-se ΤΝΡ^θ/ΗΕΑ em emulsões de óleo em água com 1 mg de copolímero como agente tensioactivo de fórmula geral seguinte:

HO(C₂ ^H4°lb· (C₃H₆O) _a (C₂H₄O)_bH em que o peso molecular da fracção hidrofoba, Ο^ΗθΟ, é aproximadamente 4600 e a percentagem da fracção hidrófila, C₂H₄O é aproximadamente 10%, em peso.

Preparou-se o copolímero tensioactivo em emulsões de óleo em água com ΤΝΡ^θ-ΗΕΑ e uma variedade de derivados <ie lípido A incluindo Re-LPS e lípido A-monofosforilo, proveniente de duas origens. Além disso, avaliaram-se dois percursores de lípido A, lípido IV A e lípido X. As preparações de lipopolissacáridos e de lípido A produziram um acréscimo inesperado na resposta de anticorpos relativamente â resposta ao copolímero de três blo-54cos, isolado. O óleo, esqualeno a 2%, e os copolímeros foram misturados com albumina de ovo de galinha conjugada com trinj. trofenilo (ΤΝΡ^θ-ΗΕΑ) e, subsequentemente, homogeneizados em PBS, pH 7,4 com 0,2% de Tween-80. Administraram-se 50 jil a murganhos distribuídos pelas almofadas das patas traseiras. As doses por animal foram de 50 yig de antigeneo, 0,6 mg L141 e 0,1 mg T150R1. A associação de copolímeros aderentes e de copolímeros ionofores produziu um aumento acentuado na resposta de anticorpos relativamente ã de qualquer dos produtos isolados. Os resultados desta experiência estão apresentados nas Figuras 4 e 5.

As barras designadas com MPL-TDM e TDM correspondem a preparações comercializadas por Ribi Immunochemical (Hamilton, Montana) . Estes adjuvantes são preparados de acordo com as ins. truções fornecidas.

Como se pode observar, os adjuvantes comerciais MPL-TDM e TDM provocaram uma resposta mínima no murganho quando compara da com as outras preparações. Contudo, as várias associações de copolímeros e derivados de lípido A causam títulos de anticorpo inesperadamente, altos.

Exemplo 12

Avaliam-se os efeitos de adjuvante de copolímeros com antigenes liofilizados em emulsões de óleo em água de esqualeno a 2%. Misturaram-se o óleo e o copolímero com ΤΝΡ^θ-ΗΕΑ anidro e homogeneizaram-se em seguida em PBS, pH 7,4 com 0,2% de Tween-80. Administraram-se 50 ^il a murganhos distribuídos peias duas patas traseiras. As doses por animal são de 50 de antigene,

-550,6 mg de copolímero de três blocos, designado por L141 e 1 mg de copolímero designado por T150R1.

O copolímero designado por LI41 apresenta a forma de es trutura geral seguinte:

^HO<^C2^H4^O)b^,C3^H6^O)a^(C2^H4^O,b^H em que o peso molecular da fracção hidrófoba, C^HgO, é 4600 aproximadamente e a percentagem da fracção hidrófila, C₂H₄O , é 10% em peso, aproximadamente.

O copolímero designado por T150R1 é um ionofero e apre senta a fórmula geral seguinte:

<^C3^H6^O)b^(C2^H4°>a ^,C2^H4^Ola^(C3^H6^O)b

NHjC-CNH, ‘^C3^H6^O)b^,C2^H4°’a' ^(C2^H4^O’a^<C3^H6°’b na qual a representa aproximadamente 5 e b representa, aproxima damente, 32.

Os resultados desta experiência apresentam-se na Figura 5. Como se pode observar, a combinação dos três blocos copoliméricos e o copolímero de oito blocos inverso, provoca um efeito adjuvante sinérgico.

Exemplo 13

Nesta experiência, administraram-se 50 ^.g de ΤΝΡ^θ-ΗΕΑ liofilizado (10,4 TNP por mole ) a murganhos numa dose distribuída por ambas as patas traseiras. O antigénio liofilizado foi

-56misturado com óleo antes para emulsionar-se com solução de cio reto de sõdio. Preparou-se adjuvante completo de Freund (FCA, Grand Island Biologicals), a 60% de óleo em solução de cloreto de sõdio, sem aditivos. Todas as preparações eram constituídas por óleo a 60% com 50 jil de Span-80, 10 jil de Tween-80 e 15 ng de sílica (5 yxm Minusil) numa dose de emulsão dé 1,6 jil. Quando se utilizaram copolímeros de três blocos, estes foram incluídos numa concentração de 0,6 mg e copolímeros de oito blo cos inversos tinham uma concentração de 0,1 ng por murganho .

Os dados são o resultado de duas experiências com 5 a 15 murga nhos por grupo. (Ver Figura 6).

O copolímero de três blocos, designado por L121 apresen ta a fórmula geral seguinte:

HO (C₂H₄O) (C₃H₆O) _a (C₂H₄O) _bH em que o peso molecular da fraeção hidrõfoba, (C^HgO) é 4000 apro ximadamente e a percentagem da fraeção hidrófila, C₂H₄O, e 10% em peso, aproximadamente.

O copolímero designado por L141 apresenta a fórmula geral seguinte:

HO(C₂H₄O)_b(C₃H₆O)_a(C₂H₄O)_bH em que o peso molecular da fraeção hidrõfoba, C^H^O, é 4600, aproximadamente e a percentagem da fraeção hidrófila, C₂H₄O, é

10% em peso, aproximadamente e os oito blocos copoliméricos com copolímero inverso designado por T150R1 apresenta a fórmula geral seguinte:

-57<^C3^H6^O,b^(C2^H4^O)a ^(C3^H6^O)b^(C2^H4^O)a

NH₂C-CNH₂

(c₂h₄0) <c₂h₄0) a<^C3^H6°>

a^(C3^H6^O) na qual a representa 5, aproximadamente e b representa, aproxima damente, 32.

Todas as composições tinham por base a sílica excepto o Adjuvante Completo deFreund (FCA). Como se pode observar todas as composições com copolímeros apresentaram uma actividade adjuvante acrescida e foram mais eficazes do que FCA. (ver Fig. 6).

A associação de óleo e sílica é mais eficaz que qualquer destas isoladamente. A emulsão de óleo a 60%, por si, produz um título médio de 100 e a sílica produz, isolada, um título médio inferior a 20, embora a associação induza um título superior a 300 aos 30 dias após uma única injecção. A emulsão de sílica, por si só, ou com copolímeros, também se verificou ser mais eficaz do que apenas a emulsão oleosa, na imunização de frangos contra o vírus da borsite ou para a imunização de coelhos com diversos an tigéneos de proteína. Finalmente, verificou-se que outros agentes tensioactivos podem substituir o Span e o Tween desde que produzam emulsões estáveis. As emulsões de sílica produzem apenas rea£ ções locais moderadas comparadas com as reacções inflamatórias crónicas intensas induzidas pelo Adjuvante Completo de Freund. Também, as misturas de sílica são incapazes de induzirem a artri. te de adjuvante autoimune. Esta, constitui a principal vantagem sobre o adjuvante mais correntemente utilizado na produção de an ti-soros, o Adjuvante Completo de Freund.

-58Exemplo 14

Imunizaram-se grupos de cinco a dez murganhos com TNP-HEA numa emulsão de esqualeno a 2% em água contendo 1 mg de cada um dos copolímeros indicados na figura 7. 0 período das respostas de anticorpo foram idênticas em cada grupo excepto no L81 que induziu apenas uma resposta transitória. Os títulos atingiram um máxi mo aproximadamente um mês após a injecção e permaneceram por mais três meses. Os animais foram desafiados aos dias 90 após a imuni_ zação. Uma semana após este desafio foram de novo sangrados. Os copolímeros com 10% ou menos de polioxietileno (POE) induziram todos respostas imunológicas fortes. O copolímero L122 ê um adju vante fraco. A actividade adjuvante dos copolímeros com comprimentos de cadeias de polioxietileno e cadeias de polioxipropileno (POP) com um limite de pesos moleculares de 5200 (1,180,5, L181,5 e L182,5) seguiram o esquema estabelecido previamente pa ra a série de copolímeros mais pequenos, L121, L122 e L123. Os copolímeros com mais de 10% de polioxietileno (POE) verificou-se de novo serem adjuvantes ineficazes.

Os títulos médios estimulados pelos copolímeros com 10% ou menos de POE para cada cadeia de POP., aumentam com o peso molecular de POP hidrófobo, como apresentado na Fig. 7. Embora exista uma variabilidade entre os grupos, observou-se repetidamente o esquema geral de aumento do título com o aumento do peso molecular de hidrófabo.

Avaliou-se o isotipo de anticorpo em vários momentos utilizando-se um ensaio ELISA com anti-soros de classe específica calibrados. Como se apresenta na Fig·.· 8, as preparações de copolímero em que os adjuvantes foram eficazes para a indução de anticorpo, induziram esquemas distintamente diferentes de isotipo.

-59A preparação de peso molecular mais baixo, L101, induziu uma res posta predominantemente de IgGl com quantidades menores de IgG2a e IgG2b. 0 aumento do peso molecular do hidrófobo aumenta a proporção de IgG2, especialmente IgG2b. É interessante que a produção do isotipo IgG3 segue o esquema oposto com títulos mais altos produzidos pelas preparações de peso molecular inferior, L121, es pecialmente L101. A proporção de anticorpo IgGl para anticorpo IgG2b, aumenta muito aproximadamente de forma linear com o peso molecular da fracção hidrófoba como se mostra na Figura 8. A dis^ tribuição de isotipos foi avaliada com intervalos múltiplos após o fim do dia 28. Os esquemas de isotipo produzidos por cada copo límero tendem a permanecer.durante os ensaios subsequentes.

Exemplo 15

Imunizaram-se grupos de murganhos com 50 pg de TNP-HEA numa emulsão de esqualeno em água contendo 1 mg de copolímero 141 e/ou 100 jig de RaLPS destoxifiçados. A Figura 3 apresenta a resposta sinergica quando RaLPS destoxifiçados e L141 se misturam com TNP-HEA e administraram aos murganhos. A Fig. 14 apresenta o isotipo de IgG induzido por cada uma das associações de adjuvantes mais uma comparação com LPD tóxicos. Após 30 dias, o isotipo de anticorpo determinou-se para diversos derivados de endotoxina e fracções com toxicidade reduzida. O copolímero 141, isoladamen te, produziu uma resposta de anticorpo do isotipo predominante IgGl com quantidades menores de IgG2a e IgG2b e apenas um vestígio de IgG3. Os RaLPS destoxifiçados reduziram a quantidade de anticorpo IgGl para TNP-HEA embora aumentassem acentuadamente dos anticorpos IgG2a e IgG2b. Em licenças idênticas, LPS de S. Sphaeroides não tóxicos, não aumentaram significativamente o tí.

-60tulo de IgG total, mas reduziram a quantidade de anticorpo IgGl e aumentaram as quantidades de IgG2a e IgG2b. Outros derivados de LPS não tóxicos e destoxifiçados aumentaram o título e alteraram o equílibrio de isotipos relativamente a IgG2a e IgG2b. 0 antigéneo injectado sem qualquer adjuvante não produziu anticor pos detectãveis.

Exemplo 16

Compararam-se o dimicolato de trealose e o copolímero L141 em associação com mcnofosforil-lípido A. Imunizaram-se mur ganhos com 50 yjg de ΤΝΡ-ΗΞΑ numa emulsão de óleo em água com adjuvantes, como descrito. As emulsões continham 50 jig de MPL e/ou TOM por dose. Sangraram-se os murganhos no dia 28.

A associação de L141 com MPL produziu títulos mais altos do que a associação TDM-MPL. Os títulos eram, predominantemente, da subclasse IgG2a. Como se apresenta na Figura 15, a associação dos três materiais produziu os títulos mais altos de IgG2 com uma adição significativa de IgG3.

Exemplo 17

Tanto quanto se sabe os lipopclissacáridos provenientes de bactérias gram negativas são eficazes como agentes imunoindutores e adjuvantes imunológicos. Contudo, a toxicidade destes materiais tem impedido o seu desenvolvimento como adjuvantes. Recentemente, foi.descrito um meio de reduzir a sua toxicidade embora permanecen do a actividade adjuvante substancial. Este método, inclui a remo ção de um grupo fosfato do lípido A para se produzir monofosforil -lipido A (MPL). Além disso, a remoção de uma ou mais cadeias de ácido gordo do grupo do lípido A também reduz a toxicidade. Al-61guns tipos de lipopolissacáridos, particularmente os provenientes de Rhodopseudomonas Sphaeroides (ver a Figura 11 para a estrutura) são inerentemente não tóxicos. A sua estrutura é muito idêntica à do lípido A tóxico. Rietchsel propôs que a estrutura completa do lípido A é necessária para a presença de toxicidade e demonstrou que muitas modificações podem reduzir a sua toxic_i , . 20 dade

A presente experiência é designada para avaliar o poten ciai de uma série de derivados de lipopolissacáridos para actua rem como adjuvantes em associações com copolimeros não iónicos tensioactivos. Os derivados dos lipopolissacáridos são escolhidos para avaliar um espectro de modificações estruturais que são escolhidas para avaliar vários meios de reduzir a toxicidade e determinar a estrutura com o isotipo e a intensidade da resposta imunológica. Estes agentes são utilizados por si só, ou em associação como adjuvante copolimêrico, L141, para determinar a sinergia entre agentes que parecem actuar através de mecanismos diferentes.

Finalmente, tem sido referido o 6,6'-dimicolato de trea lose (TDM) para constituir um adjuvante adesivo que liga o anti. géneo ã superfície das gotas de óleo. Apresentaram-se estudos pa ra comparar a actividade adjuvante de TDM com a dos copolimeros em associação com derivados de lipopolissacáridos.

Animais:

Utilizaram-se grupos de murganhos fêmea ICR (estirpe) com a 10 semanas provenientes de Charles River Laboratories, Raleigh,

NC.

-62Preparação do antigéneo:

Ligou-se o hapteno trinitrofenilo (TNP) a albumina de ovo de galinha recristalizada (HEA). Conjugou-se TNP com HEA utilizando-se sulfonato de trinitrobenzeno 5 mM em tampão de borato, pH 8,2 .A quantidade de trinitrofenilaçao foi determinada por espectrofotometria utilizando-se um coeficiente de extinção de 15.400 a 350 nm. Estavam ligadas oito a nove unidades TNP por ca da mole de HEA.

Adjuvantes:

Adquiriram-se Rd^-LPS de S. minnesota R7, Rc-LPS de tuphimunium SL684, e Ra-LPS de E. coli EH-100, de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. MPL de S. minnesota RS95 foi adquirida de Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT. As culturas de S. minnesota P345, S. minnesota R60 e S. typhimurium SF1512 foram obtidas de Institute fúr Experimentelle Biologie und Medizin, Borstel, West Germany. As culturas de E. coli 09 e 058 foram obtidas de Staters Senuminstitut, DK-2300 Copenhagen, Dinamarca. A cultura E. coli D31m4 obteve-se de Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Yale University School of Medicine, NewHaven,

CT.

desenvolvimento de mutantes sensíveis ã temperatura de E. coli MN7 e de S.typhimunium i50 assim como a preparação de lí pido X e lípido precursor IV A, respectivamente, foram descritas anteriormente por Takayama, K., et al. e Raetz, CRH, et al., cuja referência aqui se cita ' . 0 desenvolvimento da E. coli D31m4 e a preparação de Re-LPS purificada estão descritos por Qureshi, et al., cuja referência aqui se cita^^. Preparou-se MPL de D31m4 e Re-LPS de acordo com o processo descrito por Qureshi,N., et al., cuja referência se cita^S . Este produto continha uma mistura de

-63hexaacilo e uma quantidade menor de penta-acilo-MPL.

Prepararam-se os químiotipos rugosos de lipopolissacáridos de S. minnesota R345, S. minnesota R60, S. typhimurium SF1512 e R. Sphaeroides ATCC 17023, de acordo com o método descrito por Galanos, et al., com modificações ' . As estruturas das séries de LPS químiotipo rugoso de Re-LPS menor ou maior (SR-LPS) apresentam-se na figura 10. A estrutura de LPS de R. Sphaeroides apre senta-se na Fig. 11.

E. coli 09 e 058 desenvolveram-se em caldo LB e os lipopolissacáridos de químiotipo liso preparados por extracção com 28 água-fenol aquecidos pelo método de Westphol e Jann . Os rendimentos foram 8,0 e 14,9%, em peso seco, respectivamente para LPS de E. coli 09 e 058. A estrutura da região do antigéneo O de LPS de E. coli 058 determinou-se como:

[->3)GIcNAc - S(l-M) - Man - O< (l-»4)-Man-θ(( 1 —> ] _n ' ^(1—3) \ 2(3)

RhaLA OAc em que RhaLA representa 3-0-(R-l’-carboxietil)-L-ramnose (ácido rhamnolactílico).

Dissolveram-se 100,7 mg de LPS09 em 2 ml de 0,2M Tris-HC1, pH 7,8 contendo 0,6% de ácido desoxicólico e fraccionou-se em uma coluna de 2,8 x 5,4 de Bio-Gel P-100 (Bio-Rad, Richmond, CA) ã temperatura de 37°C aplicando-se o mesmo tampão. Este processo é idêntico ao descrito por Vukaijlovich, et al. cuja refe29 rencia aqui se incorpora . Recolheram-se fracções de 2 ml e ana lisaram-se para KDO e mannose. Com base nestas análises, reuniram

-se as fracções 27 a 35 (I), 36 a 43 (II) e 44 a 51 (III) e dializaram-se exaustivamente contra ãgua. Estas amostras foram fi-64nalmente dessalificadas em uma coluna Bio-Gel P-4 para se obterem 43,5 mg de I, 27,2 mg de II e 6,6 mg de III. Estas três amostras foram analisadas por electroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida. A electroforese exibiu uma fracção I contendo predominantemente LPS de químiotipo liso, a II contendo uma mistura de LPS de químiotipo liso e rugoso e III contendo na sua maioria LPS de químiotipo rugoso. Estes resultados são consisten tes com mannose para relações moleculares de fósforo que são de 9,2:1,0 para I; 5,3:1,0 para II; e 2,9:1,0 para III. A região de hexose do núcleo exterior de LPS09 apresenta-se como tendo o tipo E. coli Rl enquanto que a parte mais interior do núcleo é como para Salmonella e E. coli. A estrutura da região de antigéneo-O de LPS09, determinou-se como:

[—>3)-Man -o((l—>3) - Man-o^( l-*2) -Man^í l->2) -Mam<( l-»2) -Man~c((l->]₁₂_₁₄

Os precursores de lípido A e derivados, incluindo MLP, obtiveram-se de Dr. Kuni Takayama, VA Hospital, .Madison, WI. As preparações de MPL e de MPL-TDM adquiriram-se de Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT. O copolímero tensioactivo não iónã. co, L141, obteve-se de CytRx Corporation, Atlanta, GA. Este consiste em eum polímero central de polioxipropileno (POP) com peso molecular de 4600 daltons e cadeias hidrofílicas de polioxietile no (POE) em cada extremidade com um peso molecular total médio de 500 daltons.

Estimulação da Resposta Imunológica:

Os aditivos mencionados anteriormente, isolados ou em a_s sociação liofilizaram-se e incorporaram-se em emulsões de óleo em água contendo 2% de esqualeno (hexametiltetracosano). A concentra

-65ção final foi de 50 jig TNP-HEA, 100 jig de LPS, 50 jig de MPL e MPL-TDM e 1 mg de copolímero L141, por murganho. Injectaram-se os animais por via subcutânea na almofada da pata com um volume entre 40 a 50 jil, contendo as doses de antigéneo mencionadas an teriormente e adjuvante de acordo com grupos específicos testados. Os murganhos foram sangrados em vários momentos durante o período de estudo através do plexu retro-orbital utilizando-se tubos capilares de Natelson heparinizados e o plasma conservado ã temperatura de -70°C.

Processo de Detecçâo de Anticorpos:

Fez-se uma avaliação da resposta imune induzida por cada preparação, utilizando-se um Ensaio de Imunoabsorção Ligada a En zima (ELISA) . Preparou-se o antigéneo por reacção de ácido picril^ sulfónico com a fracção V de BSA. As placas microtituladoras foram tratadas com 100 jil por cavidade de TNP-BSA (25 unidades por mole BSA) a 0,5 jig/ml de PBS, pH 8,4 durante a noite à temperatu ra de 4°C. Substituiu-se a solução de antigéneo com BSA 1% em PBS, pH 7,4 e incubaram-se as placas durante 1 hora ã temperatura ambiente afim de bloquear quaisquer sítios que permanecessem dispo níveis para ligação não específica do anticorpo. Lavaram-se as placas por 4 vezes com poloxamero 188 0,05% em PBS, pH 7,4. Em seguida, adicionaram-se diluições em série de 100 yil de soros a testar com 0,1% BSA e poloxamero 188 0,1 em PBS, pH 7,4, incuban do-se durante 1 hora ã temperatura ambiente num agitador orbital de 200 rotações por minuto. Em.seguida lavaram-se as placas por três vezes e incubaram-se durante 90 minutos ã temperatura de 3 7°C com anticorpo de caprino conjugado com peroxidase de rábano purificada, de afinidade, dirigido contra IgG de murganho ou

-66sub-classe de IgG específica. Utilizou-se uma diluição a 1:2000 de conjugado para tudo excepto para IgG3 cuja diluição utilizada foi de 1:1000. A seguir a esta fase, lavaram-se as placas por três vezes e obteve-se desenvolvimento de cor com ortofinilenodiamina (OPD), HCL a 0,4 mg/ml em tampão de citrato/fosfato, pH 5,0. Deteve-se a reacção utilizando-se ácido sulfúrico 2,5N 15 minutos após a adição de OPD e leu-se a 490 nm utilizando-se um leitor de microplacas BIORAD modelo 3550. Definiram-se os títulos com uma diluição do antisoro necessária para produzir uma absorvãncia de 1,0. Calculou-se o efeito sinérgico pela fórmula seguinte: título de LPS + Ll41/Título de PLS ou L14.

Resultados:

Imunizaram-se os grupos de murganhos fêmeas ICR nas almofadas das patas traseiras com 50 de TNP-HEA em uma emulsão de esqualeno a 2% em ãgua contendo 1 mg de copolimero L141 mais 100 ^ig de uma das séries de derivados de lípido A como se apresenta na Figura 16. O derivado menor, o lípido X, suprimiu a res posta imunológica em qualquer dos períodos em que se fez a medição. Cada um dos outros derivados produziu uma resposta acelerada com títulos mais altos aos dias dez após a imunização, mas em seguida produziu respostas moderadamente suprimidas aos 30 e aos dias.

Realizaram-se estudos idênticos com preparações de LPS de organismos mutantes que diferiam do tamanho e no polissacárido do núcleo, Fig. 17. Estes derivados de LPS produziram um aumento na resposta de anticorpos aos dias 10 após a injecção. A preparação menor, Re-LPS, resultou numa resposta suprimida aos dias 60. Outros derivados produziram um reforço moderado. Finalmente, os efeitos adjuvantes das fracções LPS contendo quantidades variá-67veis de polissacãrido-0 foram avaliados em associação com o copo límero L141, Fig. 18. Cada uma destas preparações produziu uma resposta imune rapidamente acrescida que se prolongou durante t£ do o período de avaliação.

Várias das observações com cada uma das fracções LPS e derivados isolados e em associação com o copolímero L141 estão resumidas no Quadro I.

QUADRO 1

LPS precursor

Origem

Percentagem de título de sobrevivência anticorpos'

Preparação de 4 sinergismo dias 28

Lípido X	E. coli MN7	100	14,201^4,753	0,60
Precursor Lípido IVA	S. typhimurium i50	100	11,140^2,350	0,50
MPL	E. coli D31m4	100	27,184±5,845	1,13
Re-LPS	E. coli D31m4	100	14,985±2, 695	0,62
Rdl-LPS	S. minnesota R7	83	52,925±15,799	2,20
Rc-LPS	S. typhimurium SL684	66	50,518±13,555	2,10
Rb2-LPS	S. minnesota R345	NA	NA	NA
Ra-LPS	S. minnesota R60	16	72,169±0	3,00
Ra-LPS detox-	E. coli EH-100	100	122,668±29,635	5,10
SR-LPS	S. typhimurium SF1512	0	NA	NA
R-LPS	R. sphaeroides ATCC 17023	100	21,651±5,233	0,90
S-LPS-I5	E. coli 09	100	81,792±15,800	3,40
S/R-LPS-II5	E. coli 09	50	103,444±14,291	4,30
R-LPS-III5	E. coli 09	66	50,518±10,219	2,10
S-LPS	E. coli Q5.8	80	81,793±18,253	3,40

A estrutura das formas várias de LPS e de lípido A estão descri, tas na secção de Materiais e Métodos. S = liso , R = rugoso

Percentagem de animais que sobreviveram à injecção de 100 ug. de

-68derivado de LPS em emulsão de esqualeno em água com l,0mgdeL141 e 50 jig de TNP-HEA.

'

Título do anticorpo IgG para TNP aos dias 28 ± SE de animais imunizados com emulsões de LPS mais LI41 de TNP-HEA.

Proporção de sinergismo de anticorpo anti-TNP induzido por LPS mais L141 dividido por a induzida por emulsão idêntica com L141 mas isenta de LPS.

LPS de E. coli 09 fraccionada em coluna Bio-Gel P100 para se obterem as fracções I, II e III.

S = liso ; R = rugoso.

Os títulos foram normalizados neste quadro para facilitar a comparação dos resultados das diferentes experiências. A relação do sinergismo está calculada para avaliar a capacidade relativa das preparações de LPS e derivadas para aumentar a reacção de an ticorpos IgG para além da esperada quando se utilizar qualquer dos agentes apenas como adjuvante.

A toxicidade dos imunogenes que contêm LPS variou acentua damente como se avaliou pela sobrevivência. As preparações com me nos de 100% de sobrevivência, de um modo geral, produziram pelagem alterada e outros sinais de desconforto induzido por endotoxinas. Várias das preparações, contudo, não produziram mortalidade ou pro duziram poucos sinais clínicos de toxicidade. Estas incluiam mono fosforil-lípido A, e derivados de lípido A, lípido X. lípido IV A, Ra destoxificado e LPS de Rhodopseudomonas sphaeroides. A capacidade destas preparações para aumentar a resposta de anticorpos re lativamente às produzidas por preparações de um copolímero L141 ou de LPS apenas variou acentuadamente entre as diversas preparações de LPS utilizadas. Algumas das preparações suprimiram a resposta imunológica e outras exerceram pouca acção. Contudo, aquelas que

-69aumentaram os títulos de anticorpos, produziram aumentos que se mantiveram durante um período de observação por três meses. Uma preparação particularmente promissora é a de derivado de Ra-LPS destoxificado que constitui por si só um adjuvante fraco mas que aumenta acentuadamente os títulos quando associada com o copolímero L141 (Fig. 13).

Isotipo do Anticorpo:

isotipo de um anticorpo é determinado por vários derivados de endotoxina em fracções de toxicidade reduzida (Fig. 13 e 14). Como esperado, o próprio copolímero L141 produziu uma res posta de anticorpos do isotipo IgGl predominantes com menores quan tidades de IgG2A e 2b e apenas vestígios de IgG3. 0 antigêneo in jectado sem adjuvante não produziu anticorpos detectáveis. Os de rivados de LPS tiveram um efeito variável na produção de anticor pos IgGl. 0 resultado final foi a produção de uma resposta IgG2 predominante. Embora na utilização de preparações que não produzem o reforço dos títulos de anticorpos, houve uma variação nos isotipos de IgGl para IgGa e b.

Exemplo 18

Animais:

Adquiriram-se de Charles Rider Breeding Laboratories (Ra leigh, N.C.), murganhos brancos da estirpe ICR fêmeas com 6 sema nas e deixaram que se climatizassem nas instalações de animais durante uma semana antes das imunizações. Os alimentos e a água foram fornecidos ad libitum.

Copolímeros e outros Reagentes:

Obtiveram-se copolímeros de blocos sintéticos L121, L141 e L180,5 de CytRx Corporation, Norcross, GA, e derivados de treo

-70nilo do dipeptido de muramilo (MDP) de Syntex Corporation (Paio Alto, CA), e LPS de Rhodopseudomonas Sphaeroides proveniente de Dr. Kuni Takayama, VA Hospital (Madison, Wl).

Péptido de Malária e Conjugação Peptídica:

O péptido (NAGG)^ é sintetizado nas instalações da Emo ry University (Atlanta GA) utilizando-se um sintetizador de Péptidos modelo 430A (Applied Biosystems, Inc.) e avaliou-se a pureza por análise de aminoácidos e HPLC. O péptido NAGG^ constitui uma repetição em tandem da proteína do circunsporozoito dos esporozoitos do Plasmodium cynomolgi da estirpe N1H.

A conjugação do péptido (P) com albumina de soro bovino (BSA) ou com albumina de ovo de galinha (HEA) (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO) realizou-se utilizando-se uma modificação do método de uma só fase de ligação por gluteraldeído descrito por Rougon et al., 1984. Resumidamente, dissolveram-se 4x10 θ mo les de péptido em 0,8 ml de PBS, pH 8,7 misturados com 1,5x10 moles de BSA ou HEA em 1,2 ml de PBS, pH 8,7. A esta mistura, adicionaram-se 2 ml de uma solução 0,02M de gluteraldeído (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) em alíquotas de 0,05 ml durante 15 minutos à temperatura ambiente, com agitação por Vortex entre cada duas adições. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente no agitador orbital a 150 rpm. Retirou-se o gluteraldeído e o péptido não ligado por passagem da mis tura através de uma coluna de Sefadex G-25 com PBS, pH 7,3. Recolheu-se P-BSA ou P-HEA e conservou se ã temperatura de -20°C.

Ensaio ELISA para Títulos de Anticorpos e Quantificação do Isotipo:

-71Obtiveram-se os títulos de anticorpos contra o péptido aplicando-se uma modificação do método de Saunders^k Revesti^ ram-se placas microtituladoras de 96 cavidades (Flow Laboratories, McLean, VA) durante a noite à temperatura de 4°C, com 0,1 ml por cavidade de uma solução a 0,002 ng/ml de péptido conjugado com albumina ?de ovo de galinha (P-HEA) em PBS, pH 7,3 Todas as incubações posteriores se realizaram à temperatura ambiente. As cavidades revestidas com o antigeneo foram bloquea das com 0,1 ml de uma solução de albumina humana a 1% (Sigma Che mical Co., St. Louis, MO) em PBS, pH 7,3, por um período de 1 hora. Após lavagem com PBS, pH 7,3, com 0,05% do tensioactivo (r)

PLURONIC F68 (poloxamero 188), adicionaram-se as cavidades em duplicado 0,1 ml de 3 diluições em série de plasma de murga nhos imunizados. Também se adicionaram em duplicado três dilui ções de plasma de murganho proveniente de murganhos não imuniza dos e anticorpos monoclonais dirigidos contra o péptido NAGG^, de acordo com ELISA negativo e controlos positivos, respectivamente. Incubaram-se as placas durante 1 hora a 200 rpm num agitador orbital. Após a alavagem, adicionaram-se a cada cavidade 0,1 ml de IgG, IgGl, IgG2a ou IgG2b diluídas a 1:2000, anti-mur ganho de caprino conjugado -com peroxidase ou anti-IgG3 (FisherBiotech, crangeburg, NY) diluída a 1:10001 e incubaram-se duran te 1 hora e 30 minutos a 200 rpm. Após nova lavagem, adicionaram-se 0,1 ml de ortofenilenodiamina a 2,5 ng/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e peróxido de hidrogénio a 0,03% (Sigma Chemical CO. , St., Louis, MO), em tampão de citrato, pH 5,0, em cada cavidade, incubando-se durante 15 minutos e deteve-se a reac ção corada com ácido sulfúrico 2,5 M. Determinaram-se a absorvân cia a 490 nm utilizando-se um leitor BioRad Microplate e determi-72naram-se os títulos por análise de regressão utilizando-se a d_i luição resultante de uma absorvãncia com um valor 1. Procedeu-se à quantificação do isotipo por conversão dos títulos ELISA para nanogramas por mililitro de plasma de cada sub-classe referindo-se a uma curva padrão. Utilizaram-se dez microgramas por nl de IgG anti-murganho de caprino policlonal (Fisher Biotech, Orangeburg, NY) diluído em PBS a pH 7,3, para revestir as cavidades de uma placa microtituladora de 96 cavidades. Os tempos de lavagem, bloqueio e incubação foram idênticos aos do ensaio ELISA, citado anteriormente. Utilizaram-se como padrões diluições de proteínas mieloma de murganho de cada isotipo (Si£ ma Chemical CO., St. Louis,· MO). Para se determinar a absorvân cia dos padrões com concentrações de 119 ng a 0,03 ng, utilizou-se um conjugado de isotipo específico anti-murganho de caprino-peroxidase de rabano (Fisher Biotech.., Orangeburg, NY) . As concentrações dos padrões específicos do isotipo, resultaram numa absorvãncia de valor 1, foram determinadas de acordo com a curva padrão da absorvãncia (490 nm) versus a concentração, mediante a aplicação de análise de regressão. A concentração do isotipo específico do peptido com a absorvãncia de 1, multiplicou-se pelo título ELISA com uma absorvãncia de 1 para se obterem as concentrações em ng/ml.

Preparação de flagelos:

Obteve-se Salmonella typhi, tipo TY2 (tipo 29) da American Type Culture Collection. Desenvolveram-se culturas de stock liofilizadas em placas de Agar Soja Tríptica (Difco Laboratories, Detroit, Ml) e fizeram-se passagens, 4 a 5 , em Agar

-12Móvel de Soja Trxptica a 0,3%. Escolheram-se as bactérias com grande mobilidade porque estas produzem mais flagelos. Inocu laram-se os organismos em caldo tríptico de soja e incubaram-se ã temperatura de 37°C durante 6 horas. Inocularam-se alí quotas da suspensão de caldo em placas de Agar Mueller Hinton (Can Scarlborough) e incubaram-se à temperatura de 37°C durante 16 horas. Recolheram-se as células das placas com PBS contendo 0,1% de tinerosal (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO). Retiraram-se os flagelos das células por agitação vigorosa durante 20 minutos num agitador mecânico (Red Devil Paint Shaker) e separaram-se dos corpos das células por centrifugação diferencial do seguinte modo: aglomeraram-se os corpos celulares por centrifugação a 6000 x 9 durante 30 minutos em uma Superspeed Centrifuge refrigerada Sorvai RC-5B (Dupont Instruments) com um rotor G5A seguida de centrifugação a 16.000 x 9 durante 10 minutos para destruir o aglomerado celular e outros pequenos fragmentos. Em seguida reuniram-se os flagelos a 90.000 x 9 em uma ultracentrifuga Beckman L8-70M com um rotor de cuba oscilan te, ressuspenderam-se em timerosal-PBS, reuniram-se de novo e ressu^enderam-se de novo em timerosal-PBS. Determinou-se a con centração em proteína de acordo com Lowry's Protein Determination³·¹·. Congelaram-se ã temperatura de -70°C alíquotas de flagelos de 5,2 ng/ml.

Conjugação de flagelos:

A conjugação do peptido com flagelos de Salmonella (P-fla gelo) realizou-se utilizando-se uma adaptação do processo de duas 3 2· fases de ligação ccm gluteraldeído de Liang et al . Dissolveram-74-se l,5xl0^-7 moles de peptido em 1,2 ml de PBS, pH 8,7, e trataram-se com igual volume de gluteraldeído 0,02M, adicionado em alíquotas 0,05 ml com agitação em vortex entre cada duas ad_i ções deixando-se em agitação rotativa durante a noite, ã temperatura ambiente num agitador orbital de 150 rpm. Apôs diálise durante a noite contra PBS â temperatura de 4°C, para retirar o gluteraldeído que não reagiu, adicionaram-se aos flagelos dial_i 6 -6 — 5 zados 4x10 , 2x10 ou 1x10 moles de peptido em 0,8 ml de

PBS, pH 8,7 que representavam proporções molares de peptido-flagelos de 26:1, 13:1 e 6,5:1, respectivamente. Submeteu-se a mistura a agitação rotativa durante a noite ã temperatura ambiente. Separou-se o peptido que não estava ligado aos flage los por ultracentrifugação a 90.000 x 9 durante 1 hora numa ultracentrífuga Beckman L8-70M com um rotor de cuba oscilante SW27. O aglomerado de flagelos ressuspendeu-se em PBS de pH 7,3, voltou-se a centrifugar e a ressuspender em PBS seguida da adição de lisina 0,02M (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Dei xou-se o conjunto em reacção durante a noite ã temperatura de 4°C, seguindo-se a recentrifugação e ressuspensão em 2 ml de PBS.

Emulsões e Forma de Imunização:

Ilunizaram-se grupos de 5 a 8 murganhos com emulsões de óleo em ãgua contendo uma mistura de esqualeno a 2% (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) e PBS de pH 7,2 com 0,2% de Tween-80 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Quando presente, as concen trações dos copolimeros adjuvantes L121 e L141 eram de 1 mg/ /0,04 ml, LPS R. Sphaeroides a 0,1 mg/0,4 ml e peptido liofilizado ou PBSA a 0,1 mg/0,04 ml ou P-flagelos a 0,05 mg/0,05 ml

-75Prepararam-se todas as emulsões com as mesmas concentrações ex cepto numa experiência em que P-BSA encontrava a 0,05 ml. 0 an tigêneo liofilizado misturou-se durante 2 minutos com esqualeno e copolímero num homogenizador de vidro de 2 ml com uma mó ligada por motor. Adicionaram-se a fase aquosa e outros adjuvantes ã fase oleosa e emulsionaram-se durante mais 2 minutos para todas as experiências excepto uma em que PBSA ou P-flagelos não estavam liofilizados mas adicionados em PBS na fase aquosa. Injectaram-se 0,04 ml de emulsão contendo 0,1 mg de P-BSA numa única almofada da pata traseira ou 0,025 ml de P-BSA ou P-flagelos (0,05 mg/ml) nas almofadas de cada uma das patas traseiras. Numa experiência que comparava as vias de imunização, injectaram-se 0,1 mg de P-BSA em 0,04 ml de uma emulsão de esqualeno em ãgua, com ou sem L121 ou L141, na almofada de uma única pata ou em 0,2 ml de uma emulsão IP ou SC. Todos os murganhos sofreram uma segunda imunização aos dias 29 ou com a mesma quantidade da composição idêntica, antigéneo e LI21 numa emulsão de óleo em água ou antigéneo em PBS. Numa experiência única, os três grupos de murganhos sofreram uma terceira imun_i zação com P-BSA em uma emulsão de óleo em água contendo L121.

A maioria dos grupos de murganhos foi sangrada no plexo retro-orbital para tubos heparinizados, aos dias 0, 10, 28 e 36 após a primeira imunização. Durante o período da experiência, recolheu-se o plasma nos dias 10, 28, 60, 90, 97, 111, 171, 201, 207 e 214 apõs a primeira imunização. Analisou-se o plasma de cada murganho por ELISA e determinaram-se as médias de erros padrão para cada grupo.

-76Exemplo 19

Imunizaram-se oito murganhos de cada grupo com 0,1 mg de peptido ou com peptido-BSA emulsionado com esqualeno em ãgua a 2% com ou sem copolimeros e/ou LPS de R. Sphaeroides a 0,01 mg por murganho. Todos os murganhos sofreram uma segunda imunização decorrido um mês recolhendo-se plasma após uma sema na. Realizaram-se os ensaios para isotipos de IgG e IgG total específica do peptido como descrito anteriormente. Apresentam-se os títulos de anticorpos IgG totais sob a forma da média + SEM de cada grupo. Os resultados estão resumidos no Quadro 2.

Quadro 2

	Título IgG	IgGl	Isotipo (%)	IgG3
IgG2a	IgG2b
Peptido	33	100	0	0	0
Peptido-BSA	2205+1732	99,3	0	0,7	0
+R.sph.LPS	7529+1996	96,8	0,1	2,5	6,6
+L121	17204+3156	83,4	2,4	12,4	1,8
+L141	17641+7527	86,2	9,1	4,6	0
+L121+LPS	13105+2384	66,2	8,0	24,7	0,2
+L141+LPS	48435+13283	51,4	6,8	39,1	2,8

O peptido da malária isolado produziu uma resposta claramente detectável com IgGl a 100%. 0 peptido conjugado com BSA provocou uma resposta IgG quase a 2 log-maior, próxima da qual quase era apenas IgGl, com menos de 1% de IgGb2. A adição

-77de LPS ao peptido-BSA produziu um aumento de 3,4 num total de IgG, na maioria IgGl com 2,5% de IgG2b e níveis francamente detectáveis de IgG2a e de IgG3. A adição de qualquer dos copo límeros ao peptido-BSA produziu um aumento maior do que 7 vezes num total IgG e quantidade significativa de IgG2b e IgG2a.

Com L121 estiveram sempre presentes pequenas quantidades de IgG3.

Quando se adicionou LPS com L121 e peptido-BSA a proporção de IgG2b quase duplicoue IgG2a aumentou para 8% do total de IgG embora o título de IgG total fosse ligeiramente inferior do que sem LPS. L141 e LPS exibiram sinergismo, quer relativamente à produção quase aumentada para o triplo no total do título de IgG, quer na influência para a distribuição de sub-classes. A proporção de IgG2b aumentou mais de 8 vezes acima de L141 isolado, alcançando mais de 39% de IgG total. Estavam presentes quantidades significativas de IgG2a e esta associação de adjuvantes produziu uma proporção de IgG3 de 2,8%.

Exemplo 20

Efeito da Densidade do Hapteno na Distribuição dos Isotipos IgG:

Examinou-se o efeito de relações molares diferentes de peptido/monómero flagelina utilizando-se preparações secas com L121. Imunizaram-se grupos de murganhos com emulsões contendo 0,05 mg de peptido/flagelos nas proporções molares de 25:1, 13:1 e 6,5:1 distribuídos por ambas as patas traseiras. Os murganhos foram desafiados decorrido um mês com peptido-flagela com a mesma den sidade de hapteno dissolvida em solução de cloreto de sódio e analisaram-se as concentrações de isotipos IgG específicos do pe£

-78tido.

As alterações nas proporções molares de peptido para flagelos influenciou quer a intensidade da resposta com anticorpo IgG, quer a distribuição de isotipo (Fig.19). 0 aumento da relação molar aumentou a concentração de IgG total 6 ve zes entre 6,5:1 e 26:1 e modificou de forma significativa o esquema dos isotipos. Os flagelos com uma relação peptídica de 26:1 induziram 11% de IgGl, 43% de IgG2a, 17% de IgG2b e 29% de IgG3. A redução da relação do peptido 13:1 afectou quase exclusivamente a diminuição de IGg3 para uma proporção de 4%.

abaixamento da relação para 6,5:1 eliminou o IgGl e o IgG3 e reduziu a concentração de IgG2a.

Exemplo 21

Animais: Utilizaram-se como animais de ensaio murganhos fêmea da estirpe ICR com sete a dez semanas provenientes de Charles River Laboratories. Obtiveram-se todos os copolímeros de CytRx Corporation, Atlanta, GA. Preparou-se TNP-HEA (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo) de acordo com o proces^ so descrito em Methods in Immunology^.

Preparação da Emulsão: As emulsões continham um volume final de 1 ml e um volume de injecção de 0,04 ml. Adicionou-se a quantidade indicada de TNP-HEA liofilizado, 0,05 mg/murga nho. Adicionou-se esqualeno a 2% em solução do cloreto de sódio. Adicionou-se a quantidade indicada de copolímero numa proporção de 1,0 mg/murganho. A homogeneização da mistura decorreu em 2 minutos. A quantidade suficiente para 1 ml utilizando-se PBS/ /Tween-80 (0,2%). Homogeneizou-se à temperatura ambiente em cer ca de 2 minutos.

-79Injecções: Os murganhos receberam inicialmente injecções subcutâneas de 0,04 ml na pata traseira. O desafio foi administrado aos dias 90 em alguns casos com Antigéneo+Copolímero

Medição das patas: As medições da linha de base foram realizadas antes das injecções. Após as injecções mediram-se em tempos determinados até que a inflamação permanecesse.

Recolha de Sangue: O sangue para detecçâo de anticorpos no plasma foi recolhido em momentos determinados durante o tempo do estudo. Esta realizou-se através do plexo retro-orbital para tubos Natelson heparinizados. As amostras foram centrifugadas durante 15 minutos a 2500 rpm. Conservou-se o soro à temperatura de -70°C.

Quadro 3

Copolímero	PM POP	%PO E	Anticorpo IgG Dias 28	Títulos Dias 97
L101	»3250	»10	24875+8751	267919+82631
L121	»4000	»10	11828+4407	20989+120490
L122	ÍS-4000	»20	184+45
L141	»4600	>5*10	112431+22728	510272+125563
L180.5	»5200	»5	307863+66575	360072+77470
L181.5	»5200	»15	. 6715 + 1604	153267+33649
P182.5	»5200	•»2 5	1500

-80Imunizaram-se grupos de cinco a dez murganhos com TNP-HEA numa emulsão de 2% de esqualeno em água contendo 1 mg de cada um dos copolímeros apresentados no Quadro 3. O período de desenvolvimento das respostas de anticorpos foram idênticos em cada grupo. Os títulos atingiram umniáximo aproximadamente um mês apõs a injecção e persistiram durante vários meses. Os animais foram desafiados apõs três meses. De novo foram sangrados decorrida uma semana. Os copolímeros com 10% de polio xietileno e pesos moleculares de polioxipropileno iguais ou in feriores a 4600, induziram respostas imunes fortes. As prepara ções maiores com polioxipropileno de pesos moleculares de 5200 são adjuvantes eficazes apenas com uma proporção menor de polioxietileno. As preparações com porções maiores de polioxileno são muito menos eficazes.

Exemplo 22

O exemplo seguinte compara uma das composições que cons titui parte da presente invenção com adjuvantes anteriores. A composição tem a fórmula geral seguinte:

	Componente	Concentração em peso
	Esqualeno	85%
	Span 80(monooleato de sorbitano)	10%
	Sílica (partículas de 5jig)	1%
	PLURONIC ^141	4%

-81Combinaram-se primeiro a sílica e o copolímero e mistu raram-se cuidadosamente até que a sílica revestisse completamen te o copolímero. Em seguida, adicionaram-se o Span 80 e o esqualeno e misturaram-se durante cerca de 45 minutos por meio de agitação magnética. Prepara-se uma emulsão de óleo em água com 50% de ãgua estando presente o antigéneo na água.

Os outros adjuvantes que foram utilizados neste exemplo incluem RAS proveniente de Ribi Immunochem Research, Inc. Hamil^ TM ton MT, ADJUVAX , Alpha-Beta Technology, Inc. Worcester, MA e Freund's Complete Adjuvant (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Prepararam-se todos os adjuvantes de acordo com as instruções do fabricante e administraram-se de forma apropriada.

Imunizaram-se grupos de coelhos fêmeas brancos da Nova Zelândia (N=4) com um conjugado de proteína do péptido (hormona libertadora da hormona luteinizante-albumina de soro bovino , LHRH-BSA) do seguinte modo:

Adjuvante	Administração
Presente invenção (desafio)	50 ^ig por via intramuscular de antigéneo em cada flanco traseiro (25 ^ig de antigénio/ /25 de emulsão x 2 injecções) no dia 1.
	50 jjg de antigéneo por via intramuscular em cada flanco traseiro (25 yug de antigéneo/ /25 jal de emulsão x 2 injecções) no dia 28.
Presente invenção	50 ^ig de antigénio por via intramuscular em cada flanco traseiro (25 ^ig de antigéneo/ /25 jil de emulsão x 2 injecções apenas no dia 1.

Adjuvante	Administração
Adjuvante	50 jiq de antigêneo por v.ia intramuscular
Freund	em cada flanco traseiro (25 jzq de antigéneo/250 yil de emulsão x 2 injecções) nos dias 1 em adjuvante completo de Freund.
TM ADJUVAX	50 yig de antigêneo emulsionado., e injectado de acordo com as instruções do preparador: 50 jzg de antigêneo por via subscutãnea em 2 sítios (25 de antigêneo/200 yil de adjuvante x 2 injecções) nos dias 1, 28 e 35.
RAS, Ribi	50 jiq de antigêneo emulsionado e injectado de acordo com as instruções do preparador. 50 jig de antigêneo/1 ml de emulsão do seguin te modo: 0,3 ml por via intradérmica (50 yalx 6 sítios) 0,4 ml por via intramuscular (0,2 ml/ em cada flanco traseiro) 0,1 ml por via subcutânea na região do pescoço 0,2 mi por via intraperitoneal aos dias 1 e 21 J

título do anticorpo antiBSA aos dias 14, 28, 42 e 56 para cada um dos adjuvantes está apresentado na Fig. 20. Como se pode observar na Fig. 20. aos dias 56, a composição de acordo com a presente invenção pr duziu títulos que foram 3 a 4 vezes

-83superiores aos do adjuvante completo de Freund. 0 volume da composição de acordo com a presente invenção foi apenas um quin to do volume injectado de adjuvante de Freund. A composição de acordo com a presente invenção, apresenta significativamente me nor toxicidade do que o adjuvante completo de Freund. Noutras espécies, a reposta imunológica observada com a composição de acordo com a presente invenção, foi pelo menos igual ou superior ã observada com o adjuvante de Freund.

Exemplo 23

Inesperadamente, verificou-se que o copolímero L18O,5 tinha propriedades físicas que Iherconferiam acção eficaz adjuvante, isento de óleo. 0 copolímero é insolúvel ã temperatura ambiente, mas solúvel ãs temperaturas de refrigeração, cerca de 4°C . Diferentemente das moléculas de adjuvantes menores, como por exemplo L101, L121 e L141, a forma insolúvel à temperatura ambiente é uma suspensão de partículas pequenas estável. Os copolímeros menores todos eles formam suspensões instáveis que c’coalescem em grandes massas amorfas. Estas preparações são candi datos deficientes como adjuvantes deavacinas. 0 exemplo seguin te demonstra a capacidade do copolímero 180,5 para ser utilizado como adjuvante, isoladamente, ou em associação com Ra-LPS destoxifiçados, isento de óleo. Misturou-se 0,1 ml de ΤΝΡ^θ-ΗΕΑ (25 mg/ml) com 0,4 ml de copolímero L180,5 (125 mg/ml). Colocou-se a mistura num refrigerador até se obter a solução do copolímero. Em seguida retirou-se e deixou-se retomar lentamente a temperatura ambiente para facilitar a ligação do antigéneo com as partículas do copolímero. Preparou-se uma preparação de igual

-84modo excepto na quantidade adicionada de RA-LPS destoxifiçados. Imunizaram-se grupos de 6 murganhos na almofada da pata traseira com 50 jig de ΤΝΡ^θ-ΗΕΑ, 1 mg de copolimero 180,5 e 10 yug de lipopolisacárido. Alguns dos grupos foram desafiados com inje£ ções idênticas aos dias 18. Estes foram sangrados para determi nação dos anticorpos nos dias 24 e 72. Os resultados resumem-se no Quadro 4.

Quadro 4

Títulos de anticorpos IgG

Adjuvante	Dias 24	+SE	Dias 72	+SE
L18O,5	184	+ 80	462	+288
L180,5 desafiado	1155	+255	577	+274
LPS	387	+ 18	413	+158
L180,5 + LPS	80136	+19207	51869	+18571
Nenhum	Z 20		Z 20

copolimero isento de óleo provocou uma resposta persistente primária moderadamente acentuada e uma resposta de an ticorpos secundária. Na presença de LPS, o copolimero iniciou animais relativamente a uma resposta secundária muito forte. Injecções similares do antigéneo, sem a presença de adjuvante não permitiram a indução de respostas primárias detectáveis e apenas se obtiveram respostas secundárias muito fracas.

Exemplo 24

Em outra experiência, imu.iizaram-se os animais com pa-85rasitas mortos no estádio de sangue de um murganho com malária (plasmodium yoelii) em adjuvantes contendo 1 mg de copolímero L180,5 ou com 10 jig de Ra-LPS ou com emulsões de esqualeno em ãgua de 1 mg de copolímero L18O,5 ou com 10 jig de Ra-LPS desto xifiçado. Num homogenizador, associaram-se o esqualeno, copolímero, LPS e antigéneo antes da adição de 0,5% Tween 80 em solução de cloreto de sódio para se formar uma emulsão de óleo em água. Os animais foram desafiados aos dias 35 e inoculados com organismos de plasmodium no estádio virulento presentes no 4 sangue, 10 , aos dias 70. Os animais de controlo e os animais imunizados com o antigéneo em adjuvante completo de Freund de senvolveram infecções progressivas de malária. Os animais imu nizados com o antigéneo em qualquer dos quatro adjuvantes que continham L180,5, com ou isentos de LPS estavam protegidos. A protecção definiu-se como a parasitemia menor que 10% nas célu las vermelhas do sangue e decrescendo aos dias 14 após aiinfecção.

A protecção relacionou-se com anticorpos do isotipo IgG2a para epitopes na superfície dos parasitas. Este estudo demonstra que os adjuvantes que contêm copolímero com ou sem a presença de óleo ou LPS estão aptos a provocar respostas imunes protectoras para a malária e são mais eficazes do que o adjuvan te completo de Freund. Estes também induzem títulos altos de anticorpos.

Exemplo 25

Realizaram-se experiências com proteína recombinante de

-86vírus de imunodeficiência humana, Gp 120 de HIV. Imunizaram-se murganhos com 25 de Gp 120 em esqualeno em água ou em composições isentas de óleo de 1 mg de copolímero L180,5 com ou sem 10 jig de RaLPS destoxifiçados. Associaram-se o esqualeno, o copolímero, LPS e antigéneo num homogenizador antes da adição de Tween 80 a 0,5% em solução de cloreto de sódio para se obter uma emulsão de óleo em água. Todos os grupos foram desafiados uma vez aos dias 28. Os títulos para a proteína de HIV aos dias 42 apresentam-se no Quadro 5 seguinte:

Quadro 5

Títulos de IgG para HIV Gp210

Adjuvante	Dias 42	+SE
o/w E180,5	6767	3689
o/w L180,5 + LPS	63818	18226
L180,5	7023	3100
L180,5 + LPS	26429	21395
nenhum l ---- 1	4217	2216

Exemplo 26

Realizaram-se duas preparações de RaLPS. Uma foi destoxif içada mediante o tratamento durante 30 minutos com borato.

A segunda foi destoxifiçada mediante o tratamento durante 7 ho ras com borato. Imunizaram-se grupos de 6 murganhos ICR fêmeas com cada emulsão de RaLPS em óleo e água de 50 yag de ΤΝΡ^θΗΕΑ.

Suspendeu-se 1 mg de copolímero L141, 5 mg de esqualeno em

Tween-80 a 0,5% em cloreto de sõdio. Reuniram-se o esqualeno, o

-87copolímero, LPS e o antigéneo num homogenizador antes da adição de Tween-80 a 0,5% em cloreto de sódio para se formar uma emulsão de óleo em água. Usou-se como volume de injecção 50 jil por animal. Sangraram-se-, os animais com intervalos para determina ção por ELISA dos tipos de anticorpos IgG. Como se apresenta na Fig. 21, a preparação de LPS moderadamente destoxifiçada produziu uma resposta precoce mais alta enquanto que a preparação exaustivamente destoxifiçada produziu um aumento moderado precoce, mas uma produção prolongada comparável à da preparação de LPS desto xifiçada parcialmente ou ã preparação de LPS totalmente tóxica. Este facto estã em evidente contraste com estudos prévios com HLP e outras preparações de LPS sem polisacáridos do núcleo que produziu aumento rápido nos títulos, mas suprimiu mais tarde os títulos quando comparados com a emulsão sem LPS.

Exemplo 27

Imunizaram-se os animais com duas composições idênticas ãs descritas no exemplo 26, com doses de 0,1, 0,05, 0,025 e 0,01 jxg de RaLPS moderada ou extensivamente destoxif içada. Sangraram-se os animais para determinação dos isotipos IgG aos dias 28. Como se apresenta na Fig. 22 todas as doses de ambas as pre parações produziram aumentos em todos os isotipos. O aumento de IgG foi dose dependente com RaLPS moderadamente destoxifiçado.

O aumento em IgG2b foi parcialmente dose dependente enquanto que o aumento em IgGl foi relativamente independente das doses nos limites de valores testados. Surpreendentemente a dose alta de destoxifiçado exaustivamente produziu o esquema de modificações isotipos comparável ao da dose mais baixa dos RaLPS parcialmente

-88destoxifiçados. Este facto demonstra que a indução do isotipo pode ser controlada ou optimizada para aplicações particulares quer pela dose quer pela extensão de destoxificação de LPS.

Exemplo 28

Realizaram-se experiências para testar a actividade adjuvante de LPS de Pseudoir.onas que por inerência possuem mais toxicidade. Esta baixa toxicidade pode ser avaliada ao facto dos LPS de Pseudomonas serem considerados como tendo apenas 5 ãcidos gordos que têm uma cadeia de 10 ãtomos de carbono. Iso laram-se de acordo com métodos convencionais LPS Pseudomonas aeruginosa. Uma amostra de LPS foi destoxifiçada por tratamento com TEA como descrito anteriormente. Imunizaram-se grupos de 6 murganhos fêmeas ICR com 50 ^ig de LPS, 50 jig ΤΝΡ^θΗΕΑ. Su_s pendeu-se 1 mg de copolímero, 5 mg de esqualeno em solução de cloreto de sódio com Tween-80 a 0,5% ou emulsões similares sem L141 ou sem LPS, como está indicado na Fig. 23. Reuniram-se o esqualeno, o copolímero, LPS e o antigéneo num homogenizador an tes da adição de Tween 80 em solução de cloreto de sódio a 0,5% para se obter uma emulsão em água. O LPS apareceu como um adjuvante fraco, por si próprio mas produziu um sinergismo evidente quando associado com L141 especialmente para os isotipos IgG2a e IgG2b. Funcionou de modo idêntico o RaLPS destoxifiçado moderadamente, descrito no Exemplo 27. LPS de Pseudomonas destoxifiçado funciona identicamente para RaLPS exaustivamente destoxifiçado, descrito no Exemplo 27.

-89Exemplo 29

Purificou-se LPS proveniente de R. gelatinosa que tem uma toxicidade intermédia inerente. Imunizaram-se grupos de 6 murganhos fêmea ICR com 50 jig de LPS, 50 }ig ΤΝΡ^θΗΕΑ. Suspendeu-se 1 mg de L121, L141, L18O,5, 5 mg de esqualeno em solução de cloreto de ssódio com Tween 80 a 0,5%. Reuniram-se o esqualeno, o copolímero, LPS e o antigéneo num homogenizador antes da adição da solução de cloreto de sódio com Tween 80a 0,5% para se obter uma emulsão de óleo em ãgua. Como se indica na Fig. 24, os copolimeros L121 e Ll80,5 induzem respostas idênticas ãs que se apresentaram para L141. A associação de LPS de R. gelatinosa para cada um destes copolimeros produziu grandes aumentos nos isotipos de IgG2a e IgG2b, mas pequeno ou nenhum aumento em IggGl. Além disso, o copolímero L18O,5 foi o mais eficaz.

Exemplo 30

Imunizaram-se grupos de 5 macacos Rhesus com uma vacina antisporozoito de malária constituída por um peptido sintético (NAGG)g, conjugado com toxoido de difteria, copolímero 180,5 e RaLPS destoxifiçado. Reuniram-se o esqualeno, o copolímero,

LPS e o antigéneo num homogenizador antes da adição de uma solu ção de cloreto de sódio com Tween 80 a 0,5% para se obter uma emulsão de óleo em água. Injectaram-se por via subcutânea por três vezes os animais com duas semanas de intervalo com 100 yig de conjugado peptídico, 100 ^ig de RaLPS, 5 mg de copolímero 180,5 numa emulsão de óleo em água com esqualeno a 2%. Os animais exibiram títulos altos de anticorpos IgG (DO aproximadamen-90te 3 às diluições de 1 para 500, por ELISA). Os títulos dos an ticorpos, determinados por imunofluorescência, contra epitopes superficiais de esporozoitos demonstraram um tipo de anticorpo de IgG médio de 10.000. As reacções locais nosítio de imuniza ção não foram detectadas ãs duas semanas após a imunização e não se observou provas de toxicidade sistémica.

Deve entender-se que os relatos anteriores relativos apenas a aspectos preferidos da presente invenção, não excluem numerosas modificações e alterações que se podem realizar sem se afastar do espírito e do âmbito da presente invenção, como estabelecido pelas reivindicações apensas.

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Justine S.G., et al., supra

Claims (3)

1. - Adjuvantes para vacina compreendendo um copolímero tensioactivo de fórmula

HO(C₂ ^{2 * *}4^0,b^IC3^S6^0la^(i:2^H4⁰⁾b^H

JL _c.

caracterizados pelo facto de o peso molecular de hidrófobo (C_H^O) estar comoreer.dido entre cerca de 4500 e 9000 e a percen o tagem de hidrófilo (C2H4Q) estar compreendida entre cerca de 3% e 15% em peso.

2. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivindicação 1, em cue o referido copolímero tensioactivo tem a fórmula

HO(C₂H₄°)_b(^c3H_s°)_a(C₂ ^B4⁰)_B ^H caracterizados pelo facto de o peso molecular do hidrofobo (C H_0) ser aproximadamente 5200 e a percentagem de hidrófilo (C₂H₄O) ser aproximadamente 5% em peso.

3. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivindicação 1, em que o referido copolímero tensioactivo tem a formu la

HO(C₂H₄0)_b(C₃H_sO)_a(C₂H₄0)_bH caracterizados pelo facto de opeso molecular do hidrofobo (CgHgO) ser aproximadamente 5200 e a percentagem de hidrófilo (C₂H₄<0) ser aproximadamente 15% em peso.

4. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivindicação 1, em que o referido copolímero tensioactivo tem a formu la

Ε0(0₂Η₄ΟΙ_Β(€₃3₅0)_Β(€₂Η₄0)_ΒΗ

O- £? -4 caracterizados pelo facto de o peso molecular do hidrofobo (C-,Η-Ο) ser aoroximadamsnte 4600 e a oercentagem de hidrófilo (C₂H₄<0) ser aproximadamente 10% em peso.

5. - Adjuvantes para vacinas, caracterizados pelo facto de compreenderem um lipopolissacarídeo não tóxico.

6.- Adjuvantes para vacinas de acorde com a reivindicação 5, caracterizados pelo facto de o lipopolissacarídeo não tóxico ser um lipopolissacarídeo em que a parte açúcar da molécu la está Intacta e a porção lípido A da molécula foi modificada, de modo a tomar o lipopolissacarídeo muito mencs tóxico.

7. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivindi. cação 5, caracterizados pelo facto de o lipopolissacarídeo ser isolado a partir de Rhodopseudomonas species.

8. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivindicação 7, caracterizados pelo facto de a Rhodopseudomonas species ser escolhida no grupo constituído por R. sphaeroides,

R. acidophills, R. blastlca, R. gelatinosa, R. capsulata,

R. palustrisand, R. viridls.

9. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivindicação 5, caracterizados pelo facto de o lipopolissacarídeo não toxico ser um lipopolissacarídeo destoxifiçado.

10.- Adjuvantes para vacinas compreendendo uma quantidade eficaz de um lipopolissacarídeo e uma quantidade eficaz de um copolimero tensioactivo de fórmula

HO(C₂H₄O)_s(C.H_sO)_a(C₂H₄Ol_bH caracterizados oelo facuo da c oeso molecular do hidro:

(C_H^O) estar comoresndido enzra cerca de 3000 e 9000 3 o :obo í a oe:

tagem de hidrófilo (C₂K₄O) estar compreendida entre cerca de 3% e cerca de 15% em peso.

11. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 10, caracterizados pelo facto de o lipopolissacarídeo ser um lipopolissacarídeo não tóxico.

12. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 11, caracterizados pelo facto de o lipopolissacarídeo não tóxico ser um lipopolissacarídeo em que a parte açúcar da mo lécula está intacta- e a parte lípido A da molécula foi modificada de modo a tomar o lincoolissacarídeo muito menos tóxico.

13.- Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 11, caracterizados pelo facto de o lipopolissacarídeo ser isolado a partir de Rhodopseudomonas species.

14. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 13, caracuerizados peio facto de a Rhodopseudomonas species ser escolhida no grupo constituído por sphaeroides,

R. acidophilia, R. olaszlca, R. gelatinosa, R. capsulata,

R. palustrisand, R. vlrldis.

15. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 10, caracterizados oeio faczo de o lincpolissacaraceo não tóxico ser um lipoçolissacarídeo destoxifiçado.

16.- Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 10, em que o referido copolímero tem a fórmula ^H°(^C2^H4^O)b^(C3^H6^O)a^(C2^H4^O)b^H caracterizados pelo facto de o peso molecular do hidrófobo (C^HgO) ser aproximadamente 5200 e a percentagem de hidrófilo (C₂H₄O) ser aproximadamente 5% em peso.

17. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 10, em que o copolímero tensioactivo tem a fórmula

HO(C₂H₄O)_b(C₃H₆O)_aC₂H₄O)_bH caracterizados pelo facto de o peso molecular do hidrófobo (C^HgO) ser aproximadamente 5200 e a percentagem de hidrófilo (C₂H₄O) ser aproximadamente 15% em peso.

18. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 10, em que o copolímero tensioactivo tem a fórmula =0(0,5,0). (0 ’ O) IC,H,O)<3 4 3 3 o a 24 o caracterizados oelo facto de o oeso molecular do hidrófobo ntas para vacinas de acordo ccm a reivin olímero tensioactivo tem a fórmula (Ο^ΗθΟ) ser aproximadamente 4600 e a percentagem de hidrófilo (C₂H₄O) ser aproximadamente 10% em peso.

dicação 10, em que o \ HO(C₂B O)_b(C₃B 0)_a(C_A0) Η ' *- «» α_ caracterizados pelo facto de o hidrófobo (C^HgO) ser aproximada mente 4000 e a percentagem de hidrófilo (C2H4O) ser aproximadamente 10% em peso.

20. - Adjuvantes para vacinas de acordo com a reivin dicação 10, em que o copolímero tensioactivo tem a fórmula

HOIC₂H₄O)_b(C₃H_sO)_a(C₂H₄O)_bH caracterizados pelo facto de o peso molecular do hidrófobo (C^HgO) ser aproximadamente 3250 e a percentagem de hidrófilo ser aproximadamente 10% em peso.

21. - Adjuvantes, caracterizados pelo facto de conterem:

a) óleo;

b) um ager.te tensioactivo não iónico apropriado para formar emulsões ãgua-em-óleo;

c) sílica;

d) um copolímero tensioactivo de fórmula ao(c₂a₄o)_b(c₃a_so)_a(c₂a₄oi_bH

O- _ XP em crue o neso molecular do hidrófobo (C,H_rO) está comnreendido entre aproximadamente 3 000 e 9000 e a percentagem de hidrófilo (C24°) está compreendida entre aproximadamente 3% e 15% em peso.

22. - Adjuvantes de acordo com a reivindicação 21, ca racterizados pelo facto de o óleo .ser um- óleo animal.

23. - Adjuvantes de acordo com a reivindicação 22, caracterizados peio facto de o óleo animal ser o esqualano.

24. - Adjuvantes de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o agente tensioactivo ser o monooleato de sorbitano.

25. - Adjuvantes de acordo com a reivindicação 21, em. que o copolímero tem a fórmula

HO(C₂H₄Olj_!(C₃H_sO)_a(C₂H₄0)_bH caracterizados pelo facto de o peso molecular do hidrófobo (C^HgO) ser aproximadamente 4600 e a percentagem de.hidrófilo (02^0) ser aproximadamente 10% em peso.

26. - Método para aumentar a resposta imunológica a um antigene num ser humano ou num animal, caracterizado pelo facto de:

a) se misturar o antigene com um adjuvante, sendo o adjuvante constituído por:

i) óleo;

ii) um agente tensioactivo apropriado para for mar emulsões de água-em-óleo;

iv) um copolímero tensioactivo de fórmula

HO(C₂H₄O)y(C₃H_gO)(C₂H₄O)_bH em que o peso molecular do hidrofobo (C₃HgO) esta compreendido entre 3000 e 9000 e a percentagem de hidrófilo (C₂H₄O) está compreendido entre aproximadamente 3% e 15% em peso;

b) e se administar a mistura do antigene e do adjuvante ao ser humano ou ao animal.

27. - Método de acordo com a reivindicação 26, carac terizado pelo facto de o óleo ser um óleo animal.

28. - Método de acordo com a reivindicação 27, carac terizado pelo facto de o óleo animal ser o esqualano.

29. - Método de acordo com a reivindicação 26, carac terizado pelo facto de o agente tensioactivo ser o monooleato de sorbitano.

3 0.- Método de acordo com a reivindicação 26, em que o copolímero tem a fórmula

H0(C₂H₄O)_;J(C₃a_s0)_a(C₂H₄O)_bH

-2caracterizados pele facto de o peso molecular do hidrófobo (C₃HgO) ser aproximadamente 4600 e a percentagem do hidrófilo (C₂H₄Q) ser aproximadamente 10% em peso.

Lisboa, 27 de Junho de 1991

R 2 S ϋ Μ Ο

ADJUVANTES 2 VACINAS APERFEIÇOADAS

A presente invenção refere-se a adjuvantes e a vacinas que contêm um antigene e um adjuvante aperfeiçoado. Numa forma de

Z“ realização da presente invenção, mistura-se o antigene com uma quantidade eficaz de um copo-límero de fórmula geral

HO<C₂ ^H4^O)i5^(C3^Hó^O)á^(C2^H4^O)b^a

Os adjuvantes, de acordo com a presente invenção, quan do misturados com um antigehe e administrados a um ser humano ou a um animal, induzem uma resposta imunolõgica ao antigene mais intensa do que quando sa administra só o antigene.