CN103608034A - 用于制备疫苗组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备包含一种或多种吸附至氨基酸的抗原的组合物的方法，其中所述方法包括：(i)在中和溶液混合物的情况中混合一种或多种抗原的溶液与氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一种或多种抗原和所述氨基酸的吸附物；(ii)通过交叉流过滤将所述吸附物分出入期望的缓冲液中，由此形成所述组合物；并(iii)回收所述组合物；其中在无菌环境中且在闭合系统内实施步骤(i)至(iii)。

Description

用于制备疫苗组合物的方法
发明领域
本发明涉及用于制造无菌组合物的方法，所述无菌组合物包含结合至氨基酸的经修饰的抗原。
发明背景
疫苗接种是免疫学原则对人类健康的公知且最成功的应用。为了得到引入和批准，疫苗必须是有效的，并且所有疫苗的效力经常受到审查。有效的疫苗必须：诱导期望的免疫应答；在贮存时是稳定的；并且具有足够的免疫原性。在非活疫苗的情况中，特别地，经常必需控制施用后的抗原释放。
已经显示了抗原与悬浮氨基酸的结合导致施用后抗原的缓慢释放，由此通过延长暴露在优化效力的情况中提高安全性。然而，包含此类抗原的配制剂的制造是成问题的，因为抗原吸附至氨基酸生成需要除去的不想要的化学副产物。此外，必须在无菌条件下实施方法。由于终产物是悬浮液，它不能通过过滤来灭菌，且由于活性成分是生物学的，它不能热灭菌。因而，经常通过在无菌套间内离心制造无菌悬浮液。
美国专利4,070,455描述了细碎的酪氨酸微粒，其具有其中分散的经戊二醛处理的变应原。该微粒通过混合酪氨酸在含水强酸中的溶液与经戊二醛处理的豚草花粉的溶液，然后中和所得的溶液来制备。通过离心取出含有经修饰的变应原的酪氨酸微细颗粒。
EP0988862描述了用于免疫接种的抗原、TH-1诱导性佐剂和水微溶性氨基酸的配制剂。该配制剂如下制备，即在中和溶液混合物的情况中混合抗原和TH1诱导性佐剂的溶液与微溶性氨基酸或衍生物在含水强酸中的溶液，由此共沉淀微溶性氨基酸和抗原。将所得的沉淀物通过离心自溶液取出，用新鲜缓冲液重建，并添加佐剂。
使用离心取出氨基酸/抗原沉淀物需要实质性程度的无菌暴露和对操作员交互(operator interaction)的高度依赖性。本发明解决此问题。
发明概述
本发明克服了现有技术的问题，其通过创建使用交叉流过滤分出抗原/氨基酸吸附物的系统实现。该系统改编死端式(dead end)过滤中常规使用的蒸汽可灭菌的烧结不锈钢滤器，这通过在定制设计的闭合循环回路系统中纳入它们来进行。由于添加新的缓冲液以维持体积和规格，这容许抗原/氨基酸吸附物和化学副产物经由滤器取出。
技术要求基于不能末端灭菌或过滤经修饰的变应原酪氨酸吸附物(MATA)产物而发生，所述产物是不溶性的，并且必须在无菌设施中制造。为了确保无菌性，必需开发密闭的原地清洗(CIP)原地蒸汽(SIP)系统。该系统的密闭性质意味着不得不将不溶性MATA成分在配制和缓冲液更换步骤期间在溶液中维持悬浮。为了实现这点，如本文中描述的那样开发连续交叉流过滤系统。
由于闭合性质和蒸汽灭菌的能力，有可能在无菌套间外部定位硬件（尽管仍在受控生产区内）。因此，本发明与现有生产方法相比具有独特的优点。本发明的方法通过具有闭合无菌系统来实质性降低抗原产物对环境的暴露。该方法还降低对物理干预的需要，这使该方法避免错误(error)和微生物污染两者的风险。
依照本发明的第一方面，提供了一种制备包含一种或多种吸附至氨基酸的抗原的组合物的方法，其中所述方法包括：
(i)在中和溶液混合物的情况中混合一种或多种抗原的溶液与氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一种或多种抗原和所述氨基酸的吸附物；
(ii)通过交叉流过滤将所述吸附物分出入缓冲液中，由此形成所述组合物；并
(iii)回收所述组合物；
其中在无菌环境中且在闭合系统内实施步骤(i)至(iii)。
优选地，氨基酸是微溶性氨基酸。
优选地，氨基酸是酪氨酸、色氨酸或其衍生物。更优选地，氨基酸是酪氨酸。
优选地，所述一种或多种抗原是用戊二醛修饰的。
在一个特别优选的实施方案中，所述一种或多种抗原自花粉、螨、霉、细菌或病毒衍生。
在一个实施方案中，所述方法包括制备组合物，该组合物包含一种或多种用戊二醛修饰且吸附至酪氨酸的花粉抗原，所述方法包括：
(i)用戊二醛修饰一种或多种花粉抗原；
(ii)使用交叉流过滤除去过量的戊二醛以形成经修饰的花粉溶液；
(iii)在中和溶液混合物的情况中混合所述经修饰的花粉溶液与酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述经修饰的花粉和所述酪氨酸的吸附物；
(iv)通过交叉流过滤将所述吸附物分出入缓冲液中，由此形成所述组合物；并
(v)回收所述组合物；
其中在无菌环境中且在闭合系统内实施步骤(iii)至(v)。优选地，在EU GMP‘C’级/ISO7类环境中实施步骤(iii)至(v)。优选地，在EU GMP‘B’级/ISO5类环境内实施步骤(i)和(ii)。
在另一个实施方案中，所述方法包括制备组合物，该组合物包含一种或多种用戊二醛修饰且吸附至酪氨酸的花粉抗原，其中所述方法包括：
(i)将所述一种或多种花粉抗原提取到溶液中以形成花粉提取物溶液；
(ii)过滤所述花粉提取物溶液以除去固体；
(iii)实施交叉流过滤，并分离包含所述花粉抗原的保留物；
(iv)用戊二醛修饰所述一种或多种花粉抗原；
(v)使用交叉流过滤除去过量的戊二醛以形成经修饰的花粉溶液；
(vi)无菌过滤所述经修饰的花粉溶液；
(vii)在中和溶液混合物的情况中混合所述经修饰的花粉溶液与酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述经修饰的花粉和所述酪氨酸的吸附物；
(viii)通过交叉流过滤将所述吸附物分出入缓冲液中，由此形成所述组合物；并
(ix)回收所述组合物；
其中在无菌环境中且在闭合系统内实施步骤(vii)至(ix)。优选地，在EU GMP‘C’级/ISO7类环境中实施步骤(vii)至(ix)。优选地，在EU GMP‘B’级/ISO5类环境内实施步骤(i)和(vi)。
花粉抗原可以是但不限于剪股颖(Bent)花粉、狐尾草(Foxtail)花粉、黄花茅(Sweet vernal)花粉、三毛草(False oat)花粉、雀麦(Brome)花粉、洋狗尾草(Crested dogstail)花粉、鸭茅(Cocksfoot)花粉、羊茅(Fescue)花粉、绒毛草(Yorkshire fog)花粉、麦草(Rye grass)花粉、梯牧草(Timothy)花粉、草甸(Meadow)花粉和栽培黑麦(Cultivated rye)花粉。
优选地，所述一种或多种抗原由剪股颖花粉、狐尾草花粉、黄花茅花粉、三毛草花粉、雀麦花粉、洋狗尾草花粉、鸭茅花粉、羊茅花粉、绒毛草花粉、麦草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麦花粉组成。
优选地，使用0.2μm孔径滤器过滤花粉提取物溶液；
换言之，优选地，组合物包含下组中的所有花粉，所述组由剪股颖花粉、狐尾草花粉、黄花茅花粉、三毛草花粉、雀麦花粉、洋狗尾草花粉、鸭茅花粉、羊茅花粉、绒毛草花粉、麦草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麦花粉组成。
优选地，将花粉于约2至约8℃，更优选地，约5℃提取到酚缓冲盐水溶液，优选为pH6.5(优选地，其含有氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸二钠、80%w/w液化酚和注射用水(WFI))中。
优选地，将提取实施约12-30小时，更优选地约14至约24小时，仍更优选约18小时。
优选地，使用5-10kDa分子量截留的膜实施如本文中描述的用于分离保留物和/或除去过量戊二醛的交叉流过滤。更优选地，膜具有10kDa分子量截留。
优选地，使用多烧结不锈钢滤器，更优选5μm多烧结不锈钢滤器，优选用1.1-1.3巴的压力实施用于分出吸附物的交叉流过滤。
通过在中和混合物（优选用NaOH进行）的情况中混合抗原与强酸，优选无机酸，优选氢氯酸(HCl)中的氨基酸形成包含抗原和氨基酸的吸附物。中和意指将pH调节至范围6.5至7.5，优选6.8至7.2内的数值。期望的是，在中和期间pH无时离开平衡或至少不长时间离开平衡，即移到pH范围6.5至7.5外部或更优选pH范围6.8至7.2外部。
优选地，强酸是具有约3.5M至约4.5M，优选约3.8M的摩尔浓度的HCl。优选地，NaOH具有约3至约3.5，优选约3.2M的摩尔浓度。
优选地，组合物是疫苗组合物。
在一个优选的实施方案中，组合物用作疫苗，并且抗原是可用于此类疫苗的抗原。
在多个实施方案中，可以将佐剂添加至组合物，诸如MPL、3-DMPL或其衍生物或盐。
依照本发明的另一个方面，提供了通过本发明的方法制备的组合物。
发明详述
本发明的多个优选特征和实施方案现在会作为非限制性例子描述。
除非另有指示，本发明的实践会采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域普通技术人员的能力内。此类技术在文献中解释。参见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Books1-3,Cold SpringHarbor Laboratory Press;Ausubel,F.M.等(1995和定期增刊;Current Protocolsin Molecular Biology,第9章，第13章，和第16章,John Wiley&Sons,New York,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons;J.M.Polak and James O’D.McGee,1990,In Situ Hybridization:Principles and Practice;Oxford University Press;M.J.Gait(编),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press;D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA StructurePart A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press;及E.M.Shevach and W.Strober,1992及定期增刊,CurrentProtocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,NY。通过提及将这些通用教科书之每篇收入本文。
抗原
术语“抗原”用于指免疫应答的适应性(adaptive)元件（即B细胞或T细胞或两者）可以特异性识别的任何分子。
优选地，本发明中使用的抗原是免疫原，即活化免疫细胞以产生针对自身的免疫应答的抗原。
抗原可以通过重组手段或肽合成获得，或者获自天然来源或提取物，并且可以自任何活的或非活的生物体衍生。
抗原可以自细菌衍生，所述细菌诸如例如炭疽(anthrax)、弯曲杆菌(campylobacter)、霍乱(cholera)、白喉(diphtheria)、产肠毒素性大肠杆菌(E.coli)、贾第虫(giardia)、淋球菌(gonococcus)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、乙型流感嗜血菌(Hemophilus influenza B)、不可定型的流感嗜血菌、脑膜炎球菌(meningococcus)、百日咳(pertussis)、肺炎球菌(pneumococcus)、沙门氏菌(salmonella)、志贺氏菌(shigella)、链球菌B、A组链球菌、破伤风(tetanus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、耶尔森氏菌(yersinia)、葡萄球菌(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种和梭菌属(Clostridia)物种。
或者，抗原可以自病毒衍生，所述病毒诸如例如腺病毒、登革热1至4血清型、埃博拉病毒(ebola)(Jahrling等,Arch Virol Suppl,11:135-140,1996)、肠道病毒、肝炎A至E血清型(Blum,Digestion56:85-95,1995;Katkov,Med ClinNorth Am80:189-200,1996;Lieberman and Greenberg,Adv Pediatr Infect Dis11:333-363,1996;Mast等,Annu Rev Med47:257-266,1996)、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒(Deprez等,Vaccine14:375-382,1996)、流感、日本马脑炎、麻疹、诺沃克(Norwalk)、乳头瘤病毒、细小病毒B19、脊髓灰质炎、狂犬病、轮状病毒、风疹(rubella)、麻疹(rubeola)、痘苗、含有编码其它抗原诸如疟疾抗原的基因的痘苗构建体、水痘(varicella)、和黄热病(yellow fever)。寄生物包括例如：溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)(Zhang等,InfectImmun63:1349-1355)；疟原虫(Plasmodium)(Bathurst等,Vaccine11:449-456,1993)、弓形体病(Toxoplasmosis)、和蠕虫(Helminth)。
在一个优选的实施方案中，抗原是变应原。术语“变应原”用于描述引发不想要的免疫超敏感性或变应性反应的抗原。变态反应是对环境抗原（变应原）的超敏感性应答。
本发明中使用的变应原可以自任何引起变态反应的物质衍生，所述物质诸如但不限于：花粉（例如剪股颖花粉、狐尾草花粉、黄花茅花粉、三毛草花粉、雀麦花粉、洋狗尾草花粉、鸭茅花粉、羊茅花粉、绒毛草花粉、麦草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麦花粉、豚草花粉、北艾(Mugwort)花粉、桦树(Birch)花粉、桤木(Alder)花粉、榛树(Hazel)花粉、橄榄树(Olive)花粉、墙草(Pariateria)花粉、槭树(Maple)(梣叶槭(Acer negundo))花粉、柏树(Cypress)花粉和日本雪松(Japanese Cedar)(日本柳杉(Cryptomeria japonica))花粉、食物、昆虫毒液、霉和动物衍生材料诸如动物软毛或螨诸如房尘螨(例如粉尘螨(D.farinae)或屋尘螨(D.pteronyssinus)或热带无爪螨(Blomiatropicalis))。
优选地，本发明中使用的抗原是花粉抗原。优选地，花粉抗原是剪股颖花粉、狐尾草花粉、黄花茅花粉、三毛草花粉、雀麦花粉、洋狗尾草花粉、鸭茅花粉、羊茅花粉、绒毛草花粉、麦草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麦花粉。
抗原可以通过与在帮助避免不想要的不利效应的情况中保留或增强抗原的期望的免疫原性特性的已知物质（例如但不限于甲醛或戊二醛，优选戊二醛）的反应来化学修饰。
氨基酸
优选地，本发明中使用的氨基酸于25℃具有约1.1或更小的g/100ml H2O的水溶解度。特别优选的氨基酸是酪氨酸或色氨酸；更加不溶的酪氨酸是优选的。这些氨基酸的药学可接受衍生物也包括在本发明的范围内，诸如苯甲基-O-十八烷酰基-L-酪氨酸。
制备
如下制备本发明的组合物，即混合抗原的水溶液与氨基酸在含水强酸中的溶液，并中和溶液混合物，由此共沉淀氨基酸和抗原。
通常，将抗原的水性溶液（优选为pH6.3至7.2）与氨基酸在含水强酸中的溶液混合。强酸通常是无机酸，优选是氢氯酸。此步骤中使用的抗原溶液通常含有多至0.15g/ml抗原蛋白质。在一个实施方案中，使用的氨基酸溶液是约24%w/v。
将抗原和氨基酸的溶液的所得混合物中和。期望的是，在中和期间溶液的pH无时偏离平衡或至少不长时间偏离平衡。若想要的话，此条件可以通过有力搅拌溶液并通过仅使用需要量的碱满足。有用地，可以将各种缓冲剂诸如缓冲盐水溶液添加至抗原溶液以帮助混合和中和阶段期间的pH控制。
实施中和的特别有用的方法分开要流入抗原溶液中的氨基酸和中和性碱溶液的流。添加的溶液的流速受到pH状态，即受到设备控制，所述设备调节一种或两种溶液的流动，使得反应混合物的pH在预先确定的水平保持基本上恒定。我们已经发现了最佳结果通常通过范围6.5至7.5，优选6.8至7.2内的pH控制获得，尽管精确的pH可以随抗原的性质而变化。
中和的结果是氨基酸的立即沉淀，在所述氨基酸之内和/或之上吸留和/或吸附抗原溶液。
交叉流过滤
可用于分级各种颗粒的方法是交叉流过滤或切向流过滤(TFF)。交叉流过滤是一种使用膜以基于大小或分子量差异来分出液体溶液或悬浮液中的组分的分离方法。在交叉流过滤中，将要过滤的溶液或悬浮液以交叉流模式通过膜表面。过滤的驱动力是跨膜压。滤液通过膜表面的速度也控制过滤速率，并且帮助防止膜堵塞。由于交叉流过滤使保留物再循环通过膜表面，使膜阻塞最小化，维持高过滤速率，并且增强产物回收。
交叉流过滤装置一般包含泵、进料溶液贮器、过滤模块和用于连接这些元件的导管。使用中，将进料溶液从进料溶液贮器引导至过滤模块，此时将来自过滤模块的保留物从过滤模块再循环到进料溶液贮器，直到获得期望体积的保留物。
优选地，维持1.1至1.3巴的压力使用5μm孔径多烧结不锈钢滤器实施本发明中用于分出包含经修饰的抗原和氨基酸的吸附物的交叉流过滤。
闭合系统
闭合系统是一种分离的系统，其防止组合物暴露于系统外部的环境。组合物仅暴露于构成闭合系统的管道和机器组件的紧接环境。本发明的闭合系统防止组合物的污染。它通过确保组合物相对于系统外部的环境密封，防止污染物进入该系统来实现这点。
佐剂
可以将佐剂添加至通过本发明的方法生成的组合物。优选地，佐剂是TH1诱导性佐剂。TH1诱导性佐剂是增强针对抗原的TH1应答的佐剂。
可以通过测定针对抗原的抗体的概况(profile)测定佐剂作为TH1诱导性佐剂的有效性，所述抗体源自施用也包含各种佐剂的疫苗中的此抗原。
优选地，佐剂是经修饰的脂多糖。如美国专利No.4,912,094中描述的，肠细菌脂多糖(LPS)是一种有力的免疫刺激物。然而，它也能引发有害的且有时致命的应答。现在已知与LPS有关的内毒素活性源自其脂质A组分。因而，更优选地，本发明使用脂质A的脱毒衍生物。Ribi ImmunoChem生产一种最初称为精制脱毒内毒素(RDE)，但是已经被称为单磷酰脂质A(MPL)的脂质A衍生物。如美国专利No,4,912,094中描述的，MPL通过在中等强度矿物酸溶液（例如0.1N HCl）中将自革兰氏阴性细菌（例如沙门氏菌）的无庚糖突变体获得的LPS或脂质A回流30分钟左右的时段来生成。此处理导致还原性末端葡糖胺的位置1处的磷酸模块的丧失。另外，在此处理期间从非还原性葡糖胺的6’位置除去核心碳水化合物。
然而，优选地，使用经修饰的LPS或脂质A，其中脱毒脂质A保留附着于非还原性葡糖胺的6’位置的核心模块。LPS和脂质A的此类衍生物也记载于美国专利No.4,912,094。更详细地，美国专利4,912,094披露了一种经修饰的脂多糖，其通过仅选择性除去脂多糖中与所述脂多糖的位置3’处的还原性末端葡糖胺酯连接的β-羟基肉豆蔻酰基残基的方法获得，所述方法包括使所述脂多糖进行碱水解。可以在本发明中使用此类脱-O-酰化单磷酰脂质A(MPL)、二磷酰脂质A(DPL)和LPS。如此，在一个优选的实施方案中，本发明使用MPL、DPL或LPS，其中还原性末端葡糖胺的位置3’是脱-O-酰化的。这些化合物分别称为3-DMPL、3-DDPL和3-DLPS。
在美国专利4,987,237中，描述了具有下式的MPL衍生物：
且其中R1和R2是H，R3是由C、H和任选地O、N和S构成的直链或支链碳氢化合物，其中超过一个原子可以是相同的或不同的，其中C原子的总数不超出60，且圆形代表MPL核。
或者，MPL衍生物具有下式：
Figure BDA0000441578600000092
其中以下式表示的衍生物区段
Figure BDA0000441578600000093
含有2-60个C原子，且其中R3是由C、H和任选地O、N和S构成的直链或支链碳氢化合物，其中超过一个原子可以是相同的或不同的，且x最小是1，并且可以是任何整数，使得所有x个区段中的C原子总数不超出60，且其中每个R3的化学结构在每个此类区段中可以是相同的或不同的，且其中圆形代表MPL核。
可用或变得可用的LPS或脂质A的所有此类衍生物或盐可以在本发明中使用。优选地，衍生物和盐是药学可接受的衍生物和盐。
组合物的剂量和施用
可以以与剂量配制剂相容的方式，且以会预防和/或治疗有效的量对受试者施用通过本发明生成的组合物。要施用的数量（其范围一般是每剂5μg至250μg抗原）取决于要处理的受试者、受试者免疫系统合成抗体的能力、和期望的保护程度。一种优选范围是每剂约20μg至约40μg。
一种合适剂量大小是约0.5ml。因而，例如，皮下注射的剂量会包含含有与0.5%佐剂混合的20μg免疫原的0.5ml。
需要施用的活性成分的精确量可以取决于从业人员的判断，并且可以是每个受试者特有的。
可以在单剂日程表中，或者优选在多剂日程表中给予组合物。多剂日程表是如下的日程表，其中疫苗接种的主要过程可以用1-20个分开剂量进行，接着是以维持和或加强免疫应答需要的后续时间间隔给予的其它剂量，例如以1至4个月的第二剂，及在需要时几个月后的后续剂量。剂量方案也至少部分会根据个体需要决定，并且依赖于从业人员的判断。
另外，可以与其它免疫调节剂（例如免疫球蛋白）联合施用含有抗原的组合物。
附图简述
图1：用于分离氨基酸吸附物的交叉流过滤系统的图示。
图2：交叉流过滤中使用的示意性多烧结不锈钢滤器；图显示了滤器外壳(filter housing)(A)和原位装配(assembly in-situ)(B)。
图3：将花粉抗原提取到提取物溶液中的示意图。将VL001中的Evans溶液冷却至5℃+/-3℃，抽取2000ml，并用于悬浮预先称取的花粉。然后，将此悬浮液添加至VL001，在那里它提取18小时，时间和温度通过PLC和关联数据记录器控制和记录。然后，经由0.2μm滤器列(filter train)过滤提取物溶液，之后移向下一阶段。
图4：交叉流过滤分离包含花粉抗原的保留物的示意图。将提取物溶液再循环通过TFF滤器盒，在那里渗滤将低mw物质移至废物，并在循环溶液中保留高mw物质。用泵入TNK01中的Evans溶液替换废物处接受的体积。这实施至发生5个体积变化。
图5：用戊二醛修饰花粉抗原的示意图。将预先称取的戊二醛添加至经渗滤的溶液。一旦添加，在搅动的情况下留置溶液以修饰1-2小时。
图6：除去过量戊二醛的示意图。一旦完成了修饰，再次重复渗滤，直到发生5个体积变化。这作用为除去修饰过程期间未使用的任何戊二醛。
图7：示意图显示了经修饰的溶液从TFF系统分配到磷酸盐添加容器CGV020中。然后，添加预先生成的磷酸盐缓冲液，并混合溶液。然后，它准备好进展至共沉淀阶段。
图8：示意图显示了PLC控制如何起作用以匹配NaOH和HCl/酪氨酸的添加速率来确保正确速率下的中和。在盐水清洗阶段期间，它确保添加盐水，替换到达废物的体积损失。所有重要数据以纸和电子拷贝两者记录。
图9：示意图显示了如何通过再循环流过5μm交叉流滤器降低VL003内的溶液的盐浓度。用低浓度盐水缓冲液替换到达废物的体积损失，如此降低总体盐含量。
图10：示意图显示了一旦完成了盐水清洗，将经无菌过滤的压缩空气应用于VL003，迫使悬浮液经由转移线离开至专用的保持容器VL005，其位于无菌套间中。
图11：示意图显示了然后，用来自切向流过滤系统的经修饰的提取物/磷酸盐缓冲液混合物重复共沉淀反应。
图12：共沉淀系统的示意图，其显示所有连接。
图13：设计阶段的图，其显示了泵、交叉流滤器和渗透物无菌滤器0.2μm之间的连接，在共沉淀固体的盐减少期间将清洗液抽吸通过所述渗透物无菌滤器0.2μm。
本发明的进一步优选的特征和实施方案现在会作为非限制性例子且参照其中的附图描述。
实施例
将13种粗制的草花粉（剪股颖花粉、狐尾草花粉、黄花茅花粉、三毛草花粉、雀麦花粉、洋狗尾草花粉、鸭茅花粉、羊茅花粉、绒毛草花粉、麦草花粉、梯牧草花粉、草甸花粉和栽培黑麦花粉）在装有Evans溶液(pH6.5)（氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸二钠、80%w/w液化酚和注射用水）的定制不锈钢容器中于5℃在搅动的情况中提取18小时。然后，经由Pall滤器或类似物将混合物过滤下至0.2μm以除去固体。过程控制器调节温度和对提取容器的流动冷却剂。在过程中的提取期结束时，实施滤液测试以测定该过程的有效性。这些包括pH、IgE反应性、IgG效力、变应原和聚合物概况。
花粉提取物现在经历渗滤，其通过使用10kDa分子量截留膜使用0.2-0.6巴的跨膜压达5个体积变化流过Cogent切向流系统进行。将保留物分配至干净的经消毒的容器，添加10%戊二醛溶液（按重量计），并且修饰现在进行2小时以形成类变应原。此过程的益处是IgE减少和保留IgG诱导能力。修饰的程度有所变化，但是应当为50至100%的等级。
然后，经修饰的提取物经历第二个渗滤步骤以除去过量的戊二醛，其使用具有5至10kDa分子量截留的膜针对Evans溶液pH7.0（氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸二钠、80%w/w液化酚和注射用水）通过Cogent切向流系统进行。将最终的提取物（药物物质）进行一批质量保证测试，包括伯胺损失；蛋白质含量；IgE反应性；IgG效力和聚合物概况。
将药物物质无菌过滤流过0.2μm孔径滤器，进入干净的经预先消毒的容器，对其添加别的无菌过滤的磷酸盐缓冲液（二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸二钠、注射用水）至需要的浓度。对装备有高剪切搅拌器的反应容器同时添加3.8M氢氯酸中的24%无菌L-酪氨酸和3.2M氢氧化钠，并发生共沉淀。此过程产生高盐含量，其通过在闭合系统中使用5um交叉流多烧结不锈钢滤器清洗酪氨酸沉淀物降低。使用5μm交叉流滤器来实现分离，并且用低浓度盐水缓冲液替换体积损失，然后将酪氨酸吸附的类变应原回收入新鲜的干净的经预先消毒的容器中，其通过对保持容器应用无菌压缩空气，迫使悬浮液离开进行。用于所有材料转移的管道工程(pipework)是原地清洗(CIP)/原地蒸汽(SIP)。
在制造后，将活性体积(active bulk)保持在定制的设备中，并转移至稀释容器以添加酪氨酸和MPL，从而混合并无菌填充到3ml丁基血清有塞管形瓶。
例示的方法对过程的重要方面具有逻辑控制，并且利用Nova Septum无菌连接来使假阳性污染结果的可能性最小化。该方法具有过程中控制和在线测试以确保顺从性。设备已经设计为使技工(operative)对危险材料的暴露最小化，并且利用原地清洁、原地蒸汽技术来提供完全证实的清洁且无菌方法。
通过提及将上述说明书中提及的所有出版物收入本文。所描述的本发明方法和系统的各种修改和变型在不偏离本发明的范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是显而易见的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案描述，但是应当理解，要求保护的发明不应过度限于此类具体的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意图在所附权利要求书的范围内。

Claims (16)

1.一种制备包含一种或多种吸附至氨基酸的抗原的组合物的方法，其中所述方法包括：
(i)在中和溶液混合物的情况中混合一种或多种抗原的溶液与氨基酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述一种或多种抗原和所述氨基酸的吸附物；
(ii)通过交叉流过滤将所述吸附物分出入缓冲液中，由此形成所述组合物；并
(iii)回收所述组合物；
其中在无菌环境中且在闭合系统内实施步骤(i)至(iii)。
2.依照权利要求1的方法，其中所述氨基酸是酪氨酸。
3.依照权利要求1或2的方法，其中所述一种或多种抗原是用戊二醛修饰的。
4.依照任一前述权利要求的方法，其中所述一种或多种抗原是自花粉衍生的。
5.依照权利要求1的方法，其包括制备包含一种或多种用戊二醛修饰且吸附至酪氨酸的花粉抗原的组合物，其中所述方法包括：
(i)用戊二醛修饰所述一种或多种花粉抗原；
(ii)使用交叉流过滤除去过量的戊二醛以形成经修饰的花粉溶液；
(iii)在中和溶液混合物的情况中混合所述经修饰的花粉溶液与酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述经修饰的花粉和所述酪氨酸的吸附物；
(iv)通过交叉流过滤将所述吸附物分出入缓冲液中，由此形成所述组合物；并
(v)回收所述组合物；
其中在无菌环境中且在闭合系统内实施步骤(iii)至(v)。
6.依照权利要求1的方法，其包括制备包含一种或多种用戊二醛修饰且吸附至酪氨酸的花粉抗原的组合物，其中所述方法包括：
(i)将所述一种或多种花粉抗原提取到溶液中以形成花粉提取物溶液；
(ii)过滤所述花粉提取物溶液以除去固体；
(iii)实施交叉流过滤，并分离包含所述花粉抗原的保留物；
(iv)用戊二醛修饰所述一种或多种花粉抗原；
(v)使用交叉流过滤除去过量的戊二醛以形成经修饰的花粉溶液；
(vi)无菌过滤所述经修饰的花粉溶液；
(vii)在中和溶液混合物的情况中混合所述经修饰的花粉溶液与酪氨酸在含水酸中的溶液，由此形成包含所述经修饰的花粉和所述酪氨酸的吸附物；
(viii)通过交叉流过滤将所述吸附物分出入缓冲液中，由此形成所述组合物；并
(ix)回收所述组合物；
其中在无菌环境中且在闭合系统内实施步骤(vii)至(ix)。
7.依照任一前述权利要求的方法，其中所述组合物包含下述花粉抗原：剪股颖(Bent)花粉、狐尾草(Foxtail)花粉、黄花茅(Sweet vernal)花粉、三毛草(False oat)花粉、雀麦(Brome)花粉、洋狗尾草(Crested dogstail)花粉、鸭茅(Cocksfoot)花粉、羊茅(Fescue)花粉、绒毛草(Yorkshire fog)花粉、麦草(Rye grass)花粉、梯牧草(Timothy)花粉、草甸(Meadow)花粉和栽培黑麦(Cultivated rye)花粉。
8.依照权利要求6或7的方法，其中使用酚缓冲溶液于约2至约8℃实施提取步骤(i)达约18小时。
9.依照权利要求5至8中任一项的方法，其中使用具有5至10kDa分子量截留的膜实施使用交叉流过滤除去过量的戊二醛。
10.依照任一前述权利要求的方法，其中使用多烧结不锈钢滤器实施使用交叉流过滤分出包含所述抗原和所述氨基酸的吸附物。
11.依照权利要求10的方法，其中所述多烧结不锈钢滤器是5μm孔径滤器。
12.依照任一前述权利要求的方法，其中通过在用摩尔浓度约3.2M的的NaOH中和混合物的情况中混合所述抗原与摩尔浓度约3.8M的HCl中的氨基酸形成包含所述抗原和所述氨基酸的吸附物。
13.依照任一前述权利要求的方法，其中将所述组合物稀释至期望的浓度以供胃肠外(parental)使用。
14.依照任一前述权利要求的方法，其中将佐剂添加至所述组合物。
15.依照权利要求14的方法，其中所述佐剂是MPL、3-DMPL或其衍生物或盐。
16.通过任一前述权利要求的方法制备的组合物。
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