CN104066833A - 封闭的生物反应器 - Google Patents

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Abstract

本发明报道使用再循环废气的单次使用的封闭的生物反应器，所述生物反应器可在不受控制的环境中操作，其用于使用在代谢过程中产生二氧化碳或需要二氧化碳的基因修饰的生物培养物制造生物产物。

Description

封闭的生物反应器
技术领域
本发明涉及一种生物反应器设计，其可用于ISO14644类别9或更高的不受控制的环境，实质上降低生物反应器操作的成本；本发明报道一种完全封闭的系统，其中废气在所述生物反应器内再循环并且过量的二氧化碳通过化学吸收去除，并且通过提供新鲜的气体供应维持营养培养基中氧或二氧化碳的所需张力。
背景技术
活性药物实体经常来源于生物培养物，包括人类和动物细胞、细菌、酵母、植物细胞、杂交瘤以及能够复制和进行代谢的任何这样的生物组合物。另外，生物实体长成器官以及细胞和基因疗法产物。生物实体通常使用传统的生物反应器并且近年来使用一次性生物反应器生长。
生物反应器是使用生物催化剂(生物培养物)，例如人类和动物组织细胞、微生物、杆状病毒以及昆虫细胞等将营养元素转变成适用产物的装置。生物反应器的主要功能是提供一个供生物催化剂生长以获得所希望的产物的受控环境。通过针对生物反应器的特定设计要素而颁予的数百专利所证实，大量的生物反应器设计是可利用的。这些年来已经研发多种容器和方法进行化学、生物化学和/或生物加工。
虽然生物反应器系统和相关工艺众所周知，但对所述系统和工艺的改良将适用于制备多种由生物来源产生的产物。一种所述改良是生物反应器的操作环境。在药物和疫苗制造中，需要每平方英尺不超过100,000个0.5μm粒子的ISO14644类别8或类别区域分类。为了维持此大气质量，空气连续通过HEPA过滤器并且需要每小时换气约20次。为了维持此空气质量标准，所需的HVAC系统、HEPA过滤器以及连续的空气净化增加了大量的资金和能源成本，时常使得小公司或研究组织无法产生用于人类中的药物和疫苗。例如需要每小时1百万立方米气流的制造工厂，一天操作24小时，全年持续，并且利用率为$0.135kW/h(美国政府劳动统计局(Bureau of Labor Statistics，US Government)2011年8月)，单单操作风扇的成本就将超过五十万美元。其它重大成本是HEPA过滤器，其必须周期性地更换，总成本又增加五十万美元。HVAC系统的资金成本也是很高的；对于HVAC系统，每平方英尺增加大约$200。在一个100,000平方英尺的工厂中，此给项目成本增加了约$2000万。虽然这些成本对于大的医药和生物技术公司来说并不太显著，但这些对于无法负担得起这些成本的较小公司和研究机构研发药物来说是主要的屏障。
还有药物或疫苗可能需要在紧急的时候进行制造的情况并且在那些情况下，净化室环境的需求阻碍研发和制造。
对产生一种可在适当净化的环境中操作而无需昂贵的HVAC系统的生物反应器系统存在急迫的未满足的需要。大气每平方英尺具有约250万个粒子并且室内空气具有约1百万个尺寸为0.5μm或更大的粒子。根据世界卫生组织(the World Health Organization)提供的cGMP指南，室内空气被分为ISO14644类别9或水平1；其也被标记为不受控制区域分类。需要受控环境的原因包括保护产物免受环境破坏以及保护工作人员免受产物伤害。HVAC系统也防止交叉污染并且一般被认为是保证制造的药物安全的最重要步骤之一。
为了使生物反应器在ISO14644类别9环境中操作，其必须具有对于生物反应器的每个操作步骤将生物反应器与环境完全密封的关键特征。一旦此可被验证并且因此保证环境与生物反应器的内含物之间无法有任何接触，那么这些生物反应器将可能在ISO14644类别9环境中操作。然而，生物反应器需要营养供应，包括氧和二氧化碳，并且在无环境污染下维持生物反应器内流动是一个挑战，尚未令人满意地得以解决。
现有技术指向爱克塞乐斯公司(Xcellerex)提供的系统(http://www.xcellerex.com/flexfactory-design.htm)，所述系统旨在使用专有FlexFactory工艺流程(process train)，它包含基于废弃物的单元操作，使交叉污染的风险最小化。每个单元操作封入受控环境模块(CEM)中，所述模块共定位在共同的受控制造空间中。CEM提供了一个环绕设备并且对房间具有正压力的定位净化环境。FlexFactory CEM的环境标准是基于传统的净化室标准。操作员站在CEM外面并且通过虹膜口接近设备入口。消除了对多个气锁以及生长和再生长室的需要。虽然此系统提供了操作的分离，但所述计划有瑕疵，因为没有明确的方式来保证系统中的破坏不会发生并且如果发生破坏，那么将立即污染产物。此概念具有一些应用，但管理机构不可能允许使用FlexFactory用于生物药物的商业化生产。
本发明提供了一种完全封闭的生物反应器，其中所有入口都通过一个0.22微米过滤器提供，废气再循环并且营养培养基出口保持密封，直到生物反应器准备用于排出。另外，需要净化室暴露的所有那些接触，例如引入生物培养物和处置制造的产物，都在受控环境中进行。
本发明的封闭的生物反应器可在没有其必须定位的物理空间的FlexFactory限制下操作，其可以具有任何尺寸(FlexFactory的限制)并且提供连续的保护防止产物被环境破坏和环境被产物破坏。FlexFactory与本发明之间的主要差异是本发明直接保护产物，而FlexFactory提供盛放产物的容器周围的保护。
本发明还报道单次使用或一次性生物反应器。在生物反应器设计中传统的缺点已经引起一次性生物反应器的研发。在过去数十年期间，已经显著朝使用一次性或单次使用生物反应器(SUB)方向前进以避免交叉污染并且降低批料之间的验证(净化)成本；病毒污染的风险已经进一步加速这些单次使用生物反应器的研发。单次使用生物反应器的设计可模拟使用具有包埋或磁性驱动的搅拌器的一次性套筒时的搅拌罐，同时使用无内部搅拌的摇摆运动类型生物反应器。尽管在此领域中显著发展，但这些类型生物反应器的利用尚未非常成功地用于需要高氧化速率的细胞或生物体，因为需要强力搅拌，这是一次性系统不太容易实现的。SUB的实例是基于波浪搅动的系统。参见例如美国专利6,544,788；PCT公开案WO00/66706。此类型生物反应器可用于在单个一次性容器中培养相对敏感细胞，例如CHO细胞(例如皮尔斯公司(Pierce)，生物工艺学报(BioprocessingJ.)3：51-56(2004))、杂交瘤细胞(例如凌(Ling)等人，生物技术进展(Biotech.Prog.)，19：158-162(2003))、昆虫细胞(例如维伯(Weber)，细胞技术(Cytotech.)38：77-85(2002))和贴壁细胞(例如辛格(Singh)，细胞技术30：149-158(1999))。所述一次性单元相对便宜，由于其单次使用而降低感染风险并且无需内部搅拌部分来促进气体交换。用于混合营养培养基的更常见技术包括摇动、震荡、振动、压缩容器壁以及在鼓泡反应器中，使用气体搅拌液体。
发明内容
本发明的生物反应器容器被设计成能在不受控制的环境(ISO14644类别9)中生长所有类型的细胞和生物体。提供一种封闭的系统，其中可获得充足量的养分和所需的气体，例如氧和二氧化碳。在药物制造中大多遭遇两种类型的反应，一个是其中细胞或生物体在其生长过程中产生二氧化碳，例如在细菌情况下，或其中细胞需要二氧化碳作为碳来源，例如在哺乳动物细胞情况下。
在生物体需要氧的情况下，最终产物时常是二氧化碳，并且用于细菌发酵的一次性生物反应器的设计已经呈现出巨大的挑战，因为其需要将极大体积的空气或氧气通过营养培养基，部分用以提供氧并且部分用以去除对细菌生长不利的二氧化碳(溶于营养培养基中的)。高水平的二氧化碳产物产生低pH值，此对细菌生长进一步不利。室内空气一般含有约0.035％二氧化碳，而呼出的人类空气具有约5％二氧化碳。健康个体长时间暴露于1.5百分比二氧化碳将引起轻微的问题，而暴露于7百分比到10百分比二氧化碳将在几分钟内引起无意识。此是因为在较高浓度下，二氧化碳可取代空气中的氧。由此，二氧化碳被称为“简单窒息”，对制造工厂的通风需求需要调节标准。举例来说，ASHRAE62每平方英尺占地面积需要至少0.12CFM的新鲜空气入口。
我们呼吸的空气主要由四种气体组成：氮气(78％)、氧气(21％)、氩气(0.94％)、二氧化碳(0.04％)。当我们在空气中呼吸时，身体消耗其氧气并且将它转变成二氧化碳。呼出的空气含有约4.5百分比的二氧化碳。身体对氮气或氩气未做任何事。对于利用氧气进行代谢的生物体来说同样如此。因为仅有两种具有重要意义的气体，氧气和二氧化碳，所以毫无疑问从生物反应器的废气中出来，氮气和氩气无法再使用。这是一个创造性的步骤，其中仅利用空气中的有用组分，同时允许使用完全封闭的系统。
尽管标准生物反应器操作将废气排到环境中，但废气的开口端产生一种永久性的污染生物反应器内含物的风险；重要的是认识到，当使用一次性柔性容器作为生物反应器时，来自室内的空气可能吸入容器中；从生物反应器排出气体提供了可能需要使用受控环境的污染可能性。一种解决此问题的方案是消除生物反应器中的所有废气；作为替代，生物反应器中的空气再循环，但在营养培养基中产生二氧化碳的情况下，需要从空气再循环去除二氧化碳。存在一种大的现有技术正在使用的方法，用于从空气去除二氧化碳或从空气洗去二氧化碳。这些通常包括使用牛皮纸浆制法的变体。洗涤工艺可基于氢氧化钠。首先，二氧化碳被碱性NaOH溶液吸收以产生溶解的碳酸钠。碳酸根离子通过与氢氧化钙(Ca(OH)2)反应从溶液去除，产生方解石(CaCO3)沉淀。航天飞机轨道上再生性二氧化碳去除系统(RCRS)使用一种双床装置，其提供二氧化碳的连续去除而无消耗性产物。可再生系统允许在太空中更长时间停留执行穿梭任务，而无需补充其吸附剂筒。不可再生的更老旧的基于氢氧化锂(LiOH)的系统正在被可再生的基于金属氧化物的系统更换。基于金属氧化物的系统主要由金属氧化物吸附剂筒和再生器组合件组成。其通过使用吸附材料去除二氧化碳并接着使吸附材料再生来工作。金属氧化物吸附剂通过抽吸在7.5scfm下被加热到大约400°F的空气通过其筒达10小时来再生。因为本发明是基于完全封闭的系统，所以可再生的系统不能使用并且规定了盛放副产物的洗涤器装置的设计，副产物一般是可回到生物反应器的水。
活性碳可用作二氧化碳洗涤器。各种强碱，例如碱石灰、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂，能够通过与二氧化碳进行化学反应来去除其。具体来说，在宇宙飞船上使用氢氧化锂来从大气去除二氧化碳。其与二氧化碳反应，产生碳酸锂。
本发明包括一种用于从在生物反应器中产生的废气去除二氧化碳的方法，其是通过安装一个含有例如碱石灰的化学物质的筒；一旦二氧化碳已经去除，气体就可带回到生物反应器中(为了搅动溶液和在需要的情况下为了氧化)。值得注意的是，与生物反应器有关的唯一组分是氧和二氧化碳，并且因此操纵其水平的能力允许空气在封闭系统中再循环，因为这些是通过新鲜气体的引入来补充。
在需要一定量的二氧化碳(例如哺乳动物细胞)的生物反应器中，不需要从废气去除二氧化碳的构件。
营养培养基中氧张力对于许多生物反应器来说是重要的，并且此在本发明中通过在需要时提供通过杀菌过滤器添加氧气(氧气与空气或氮气的混合物)的构件来控制。远程控制的营养培养基中的传感器允许营养培养基在需要时氧化。在需要较高水平二氧化碳的情况下，例如在哺乳动物细胞情况下，注入气体可以是空气与二氧化碳的混合物或纯二氧化碳；再次入口气体的目的仅仅是提供这些气体在营养培养基中的所需水平，而生物反应器内气体的再循环提供混合功能以及作为推动气体、更尤其二氧化碳通过在再循环的循环期间进行化学洗涤离开的手段。
本发明由一个容器组成，所述容器可由柔性或半柔性防水材料，优选地塑料建造。可针对光传播质量挑选塑料。某些细胞可能对亮白光或紫外线辐射敏感，并且对于这些细胞，容器可由吸收这些波长的塑料制成。同样地，其它种类的细胞，比如植物细胞，可通过光的光谱质量试验性地调节，并且对于这些细胞，培养容器可由选择性地传播所希望的光的波长的塑料制成。用于制造容器的材料的其它特征在培养各种类型的细胞或微生物中可为重要的。容器内部可用增加或减少细胞粘附的物质处理，取决于所希望的培养条件和细胞种类。
在一个优选实施例中，所述容器将由低密度聚乙烯内层、乙烯乙烯醇气体屏障、低密度聚乙烯外层和由聚乙烯制成的端口形成；其将具有325μm膜厚度，5％混浊度(ASTM D-1033)、0.4克/平方米.天的水蒸汽传输速率(ASTM F-1249)、0.1立方厘米/平方米.天.巴的氧渗透性(ASTM D-3985(23℃，0％RH))、0.2立方厘米/平方米.天.巴(膜康公司(Mocon)Permatran C-IV(23℃，0％RH))的二氧化碳渗透性并且通过50KGy的最大γ辐射剂量杀菌。袋将在4℃到40℃下使用。
容器包含一或多个端口用作气体或液体的入口或出口。端口由与用于建造容器的材料相容的刚性或半刚性材料建造。在优选实施例中，任何标准塑料管道或模制塑料都可用于建造端口，并且其根据标准技术焊接到容器的缝。多种这样的端口可购得，例如用于医学袋和相似的容器。形成端口的结构也可变化，例如以容纳不同体积的培养基、高压灭菌技术和端口功能。
本发明的一次性生物反应器优选地在使用前预杀菌。可使用各种杀菌技术。技术的挑选部分地取决于所挑选的塑料类型(李(Lee)等人，1995，高分子生物材料手册(Handbook of Polymeric Biomaterials)，CRC出版社(CRC Press)，博卡拉顿(Boca Raton)，第581-597页)。此项技术中常见的杀菌技术包括(但不限于)干热、高压灭菌、辐射和环氧乙烷气体。
本发明的生物反应器可通过若干构件实体支撑。容器可通过容器顶部中在缝外部的孔洞或通过连接到容器顶部的钩子悬挂。或者，可将柔性塑料容器放入刚性外部容器中，所述刚性外部容器包括诸如商业55加仑塑料圆筒等简单系统。最终，容器可由可自身支撑的半柔性塑料建造。
生物反应器可装备有任选的帮助培养细胞和微生物生长的装置。这些装置包括(但不限于)温度计、气体评价系统(即二氧化碳或氧气)以及评估细胞密度的构件和体积校正标记。
空气或其它气体经由进气口引入容器中。连接端口到气泵的管道配备有至少一个过滤器，以在气体引入生物反应器前从气流过滤微生物。管优选地适用于市售气泵，限制条件为无论在培养物开始生长和培养基密度增加后累积的背压有多少，抽吸生物反应器内恒定量的空气。
鼓泡器包含适当直径的管或圆盘，取决于待扩散到容器中的空气的量；鼓泡器一般由陶瓷或氧化铝材料、塑料、硅或金属建造。推测鼓泡功能去除为了混合而震荡或摇动容器的需要。然而，在一些情况下，可能需要震荡营养培养基的外部构件。此可通过多种现有方法，例如摇动、震荡、旋转、推动容器壁来提供。
本发明进一步包括入口端口，其用于最初用生长培养基填充生物反应器或在灌注系统中，用再循环的培养基或接种物填充。
在容器顶部的液体端口通常连接到足够长而到达培养基工作液面以下的封液管以防止废气进入此端口。此端口也可用于在发酵工艺期间(例如当使用馈料-培养技术时)添加养分或在灌注生物反应器操作过程中提供去除的任何培养基的更换。
值得注意的是，用以添加生物培养物的端口在循环结束时去除营养培养基，并且营养馈料的添加是通过在另一个末端处在净化环境中开口的管进行；此可容易为安装在生物反应器附近的层流罩。
本发明中提供的生物反应器可用于生长多种细胞，包括(但不限于)植物细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞。其它的应用可见于器官生长和基于个体化医疗产生治疗介入术中。所属领域的技术人员应了解，培养基和接种体的组成可进行选择以需氧培养多种细胞和生物体。生长温度、空气流动和培养持续时间也可调整到适合特定细胞。其它的调整可包括用不同的气体通气，例如在植物细胞情况下二氧化碳，或对于硫细菌是硫化氢；或在哺乳动物细胞情况下处理生物反应器壁以促进细胞粘附。
本发明不局限于以上描述和例示的实施例，而是能够在不偏离随附权利要求书的范围下变化和修改。
附图说明
图1为用于不需要去除二氧化碳的反应的单次使用封闭生物反应器的侧视图。
图2为用于需要去除二氧化碳的反应的单次使用封闭生物反应器的侧视图。
具体实施方式
生物反应器一般在建造和操作昂贵的ISO14664类别8环境中操作。其中所有操作都在支撑营养培养基的容器内进行的封闭的生物反应器可在建造和维持廉价得多的不太控制或ISO14644类别9环境中使用。本发明提供一种扩大生物反应器使用并且使其更可承受的理想解决方案。此在紧急事件中制造药物和疫苗、研发新药、制造临床试验供应品以及一般地以较低成本生产商业规模生物药物时尤其具有价值。近来以上考虑已经变得非常重要，因为这些药物的创新者专利到期后通用生物药物已经开始出现在市场上。通用生产者必须能够以更低廉的成本制造这些分子以进行竞争并且本发明满足此需要。
在一个方面，本发明提供一种适于从预定体积的营养培养基制备生物产物，同时在ISO14664类别9环境中操作的生物反应器，以及相关使用方法。更具体地说，本发明提供一种设备和方法，它在所述设备无论生物培养物的性质如何都可用于制备生物产物的意义上为通用的。
最初转到图1，说明本发明生物反应器的一优选实施例。在此实施例中，说明一种优选的容器1，此容器内部包含营养培养基2、至少一个鼓泡构件4所连接的新鲜空气入口18、通过新鲜空气入口的新鲜气体来源8、安置在进气口18与新鲜空气入口8之间的气体杀菌过滤器7以及在进气口18与杀菌过滤器7之间的旋塞阀12、通过入口5连接到营养培养基来源的液体端口17、安置在入口5与液体端口17之间的液体培养基杀菌过滤器6以及安置在杀菌过滤器6与液体端口17之间的旋塞阀12。废气通过出气口11逸出并且通过使用蠕动泵9移动，并且通过旋塞阀12，用于通过进气口18和鼓泡器4再循环。一组用以监测二氧化碳或氧的传感器3和10安置在容器1中和出气口11中；所述容器具有支撑表面15，支撑表面15又支撑在立柱14上。提供一种加热构件13，其连接到支撑表面15的下表面。
图2展示图1中所有特征的细节，具有额外的特征，所述额外的特征包含安装在出气口11与进气口18之间的二氧化碳洗涤器19。
正如前面所提及，希望容器包括一或多个传感器或探针，用于监测容器内部的一或多个工艺参数，例如比如细胞密度、温度、压力、pH值、溶解氧(DO)、溶解二氧化碳(DCO2)、混合速率以及气体流动速率。希望DO、pH值以及DCO2的传感器是光学传感器，其中开头两个更希望是一次性的(例如加利福尼亚州圣克拉拉市芬尼斯溶液有限公司(Finesse Solutions LLC，Santa Clara，California)的TruFluor传感器或马萨诸塞州01775斯托市福鲁米斯公司(Fluorometrix Corporation，Stow，Massachusetts)的CellPhase传感器)。每个传感器都意图与用于计算和控制各种参数以及显示和用户界面的计算机执行的控制系统(例如计算机)通信。此类控制系统也可包括电子、机械和/或气动系统的组合以按要求控制以上提及的加工参数，从而稳定化或控制参数(例如pH值可通过添加CO2或氨调节)。应了解控制系统可执行其它功能并且本发明不局限于具有任何具体功能或成组功能。
本文所述的一或多种控制系统可以多种方式执行，例如使用专用硬件和/或韧件，使用处理器，所述处理器使用微码或软件编程序，以执行上述功能或上述功能任何适合的组合。
加工装置也可与可调节工艺参数到预定可接受水平的各种装置通信，比如启动加热器、启动进气口阀以调节氧或CO2水平、启动出气口阀以降低顶部空间中的气体压力等等。
或者，本发明可缺乏任何传感器以及对通过端口16收集的样品进行的培养基特征的测量，端口16也用以引入生物培养物在容器1中并且在生物反应循环结束时去除营养培养基。值得注意的是，端口16需要足够长的延长以允许传递用于测试或进一步加工的营养培养基到受控环境，可能ISO14644类别7或较低。
本文所述的生物反应器适用于从预定体积的营养培养基产生生物产物。在一个相关实施例中，本发明提供一种方法，其涵盖提供如本文中描述的生物反应器，用营养培养基填充每个容器；启动选择性地鼓泡的过滤器和加热或冷却装置，添加生物培养物并且允许生物反应器静置特定时间，以预定时间间隔检测容器中营养培养基中的细胞密度；以及当容器中营养培养基中的细胞密度到达预定值时从生物反应器去除营养培养基和由此产生的生物产物。废气通过容器再循环，同时补充适当量的氧或二氧化碳；当生物反应中产生二氧化碳时，提供二氧化碳洗涤器以从废气去除二氧化碳。
本发明生物反应器和相关方法的优点之一为操作生物反应器所需的环境控制的成本降低。与这些操作一般需要的类别8环境相对比，本发明可在ISO14644类别9环境中操作。
相对降低的量的引入的气体(相对于巳知的工艺)具有在容器的顶部空间中产生更少的紊流和泡沫的进一步优点。
每个容器都具备亚微米过滤器，所述亚微米过滤器帮助维持营养培养基和引入的气体的无菌性。过滤器可具有任何适合的尺寸和孔隙率，但优选是具有约0.3μm到约0.1μm并且更优选地约0.22μm的平均孔隙率的HEPA过滤器。
一般说来，本发明提供生物反应器和方法，它们在本发明适合和可适用于加工多种组合物，包括生物与非生物组分的意义上为通用的。实际上，为适用于哺乳动物细胞而设计的本发明的生物反应器比如可用于培养细菌，使制造容易。
历史上，通过首先利用离心或过滤工艺去除生物培养物，将在营养培养基中表达的生物产物与培养基分离。在此步骤后为减少培养基体积到约1/10到1/20，使得在合理时间内将营养培养基装载在纯化柱上成为可能。虽然这些工艺步骤已经广泛地验证并且运行很好，但使用这些步骤的实用性在要处置大体积培养基时变得很难。现在，生物反应器一次加工上千升并且甚至几十万升培养基并不罕见。为了容纳此，公司使用非常大规模的过滤和体积减小方法，这些耗费数百万美元来安装并且又耗费数百万美元来操作和维持。对以下存在极大的未被满足的需要，即简化这些工艺、降低生产成本以及使无法担负得起如此大的投资的数千研究人员和较小公司可使用所述技术。克服这些工艺的障碍也将使得能够基于这些生物药物产生制造更廉价的药物并且因此提高全世界无法担负得起这些药物的上亿人的负担能力。
本发明的关键在于根据背道而驰的教示。虽然所有制造商都根据上述包括从准备纯化的发酵液去除组分的途径，但检验首先去除目标生物产物作为替代并且弃去不需要的东西的实用性将是谨慎的，而不是如目前所实施的，逐步去除不需要的东西。
本发明利用能够大量结合生物产物的许多树脂的新近可用性。大部分现代树脂每毫升树脂将结合20-125mg之间的生物产物。许多这些树脂对生物产物具有高度特异性并且其中多者可组合以通过物理化学结合的简单过程从溶液去除任何类型和数量的生物产物，所述物理化学结合足够强烈以保留连接到树脂的生物产物，而营养培养基从生物反应器去除。所属领域也已经在生物产物纯化领域得到显著发展，其中现在具有优良得多的通过调节pH值、离子强度或洗脱缓冲液的其它特征以打破树脂与生物产物之间的结合从树脂洗脱这些结合的生物产物的能力。此允许生物产物呈高度浓缩溶液形式从生物反应器去除，准备用于进一步纯化并且在一些情况下，其甚至可为最终使用产物。
亲和色谱法是基于分子构象的一种分离技术，其经常利用专用的树脂。这些树脂具有连接到其表面的配体，所述配体对待分离的化合物具有特异性。最经常地，这些配体以类似于抗体-抗原相互作用的方式起作用。配体与其目标化合物之间的此“锁和钥匙”配合使其具有高度特异性。
许多膜蛋白是糖生物产物并且可通过凝集素亲和色谱法来纯化。清洁剂溶解的蛋白质可以被允许结合到色谱树脂，所述树脂已经被改性以具有共价连接的凝集素。
免疫亲和色谱树脂采用抗体与目标生物产物的特异性结合以选择性地纯化生物产物。程序包括将抗体固定到柱材料，接着选择性地结合生物产物，而所有其它东西流过。
溶解后的内含体暴露了疏水基，而变性蛋白上残存能够结合于树脂的化学基团(辛格(Singh)和潘达(Panda)，2005)，允许这些蛋白质在再折叠到天然状态的阶段期间分离。
一些现行技术树脂结合技术包括：
a.诺维信(Novozyme)的新专利双重亲和力多肽技术平台用相似但一次性的技术更换蛋白质A工艺步骤。
b.刺激反应性聚合物能够复合和操纵生物产物并且允许控制聚合物和生物产物复合物溶解性，此使得在无离心或蛋白质A培养基(来自密理博公司(Millipore Corp.))下直接捕捉产物。
c.混合模式吸附剂更换传统的蛋白质A和离子交换，以提高选择性和容量并且滞留时间较短。这些具有新颖的化学作用的培养基包括疏水电荷诱导色谱，例如MEP，以及来自帕尔公司(Pall Corp.)的Q和S HyperCel。
d.莫诺利斯(Monoliths)，包括色谱介质作为单件均相柱，例如来自必蔼公司(BIASeparations)的对流相互作用介质整体式柱(Convective Interaction Media monolithiccolumn)。
e.模拟的移动床，包括多层柱逆流色谱，例如来自塔彭生物系统公司(TarponBiosystems)的BioSMB。
f.蛋白质G(多个供应商)。
g.IgG的单域骆驼来源(骆驼科)抗体，例如来自巴克公司(BAC)的CaptureSelect。
h.新的无机配体，包括合成染料，例如来自普美替克生物科学公司(PrometicBiosciences)的Mabsorbent A1P和A2P。
i.膨胀床吸附色谱系统，例如来自前沿色谱公司(Upfront Chromatography)的Rhobust平台。
j.超耐久的氧化锆结合的亲和配体色谱介质，来自佐克公司(ZirChromSeparations)。
k.Fc-受体模拟配体，来自特诺格公司(Tecnoge)。
l.ADSEPT(先进分离技术)，来自尼萨膜技术公司(Nysa Membrane Technologies)。
m.膜亲和纯化系统，来自普瑞法姆技术公司(PurePharm Technologies)。
n.专门设计的用于亲和色谱的肽配体，来自普美替克生物科学公司(PrometicBiosciences)、达克斯公司(Dyax)以及其它公司。
o.蛋白质A和G涂布的磁性珠粒，例如来自英杰公司(Invitrogen)/达尼尔公司(Dynal)。
p.新的亲和纯化方法，其基于生物产物或作为融合生物产物的MAb的表达，所述产物具有对色谱介质具有亲和力的可去除部分(标签)，例如罗氏公司(Roche)(基因泰克公司(genentech))许可的组氨酸标签。
q.发展中的蛋白质A替代物，包括反向胶束(脂质体)、液体-营养介质提取系统、结晶、固定金属亲和色谱以及新颖的膜色谱系统。
r.具有一次性组分的即插即用溶液(例如ReadyToProcess)、具有实验设计能力的工艺开发以及多层柱连续捕捉，来自通用电气医疗集团(GE Healthcare)。
令人惊讶的是，虽然在可用于捕捉生物产物的树脂的设计上已经有了巨大的发展，但是这些树脂仅用于纯化的下游加工。将树脂添加到生物产物与宿主细胞的粗混合物中与简单地浓缩相同培养基并且在所有杂质都在其中的情况下将其装载到柱上的当前工艺没有不同。唯一的差异将是，当在生物反应循环结束时实践时，此将需要足够树脂来结合几乎全部生物产物。针对产生1mg/mL蛋白质并且所用树脂的结合能力是50mg/mL的细胞系，当操作1000L生物反应器时，此将需要20L树脂。适于制造单克隆抗体的树脂的成本可在每升$15-$20,000范围内，例如蛋白质A。因此，大部分制造商宁愿使用较小量的树脂进行若干子批料的纯化。然而，考虑到这些树脂可使用数百次，成本容易分摊使用并且避免了子批料制备中冗长的调控障碍。
虽然在工艺处理结束时添加较大量的树脂，但如果使用其中用树脂捕捉更换经典的灌注方法的本发明，那么这些添加随时间散布。通过在生物反应进行时添加各种量的树脂，从营养培养基去除所表达蛋白质。重要的是在任何给定时间添加的树脂的量都不超过所需，因为如果所用树脂具有非特异性结合特性，那么营养培养基中的其它组分也会不可避免地损失在树脂中。如果使用免疫亲和或特异性结构树脂，例如蛋白质A，那么不会出现这种情况。如果养分不可避免地损失于树脂中，那么应在将树脂添加到生物反应器的同时更换这些养分。当在生物反应过程期间使用树脂结合蛋白质时需要谨慎一些，因为这些蛋白质必须恰当地杀菌。因此，可有利地使用更具特异性的结合树脂，其可在通过γ辐射对容器进行杀菌期间添加。
另外，本发明的一个实施例可通过以下来实施：使用最便宜的树脂来普遍性地结合所有可溶性有机组分，并且接着在洗脱型态无关下立即使用缓冲液洗脱其以分离这些组分。所述通用树脂非常廉价并且甚至可不必再使用。
本发明提供一种在产生生物产物的相同生物反应器中收获和纯化生物产物的方法。
应用
在本发明中，包含非生物组分的组合物包括(但不限于)包含以下的组合物：微载体(例如聚合物球、实心球、凝胶粒子、微珠粒和微盘，其可为多孔或无孔的)、带有特定化学基团(例如叔氨基)的交联珠粒(例如葡聚糖)、包括捕集在无孔聚合物纤维中的细胞的2D微载体、3D载体(例如载体纤维、空心纤维、多筒反应器以及可包含多孔纤维的半透膜)、离子交换能力降低的微载体、细胞、毛细管以及聚集体(细胞聚集体)。
可根据本发明加工的生物组分描述于随后段落中并且包括(但不限于)来源于例如以下来源的细胞培养物：动物(例如仓鼠、小鼠、猪、兔、犬、鱼、虾、线虫以及人类)、昆虫(例如蛾和蝴蝶)、植物(例如藻、玉米、番茄、稻米、小麦、大麦、苜蓿、甘蔗、大豆、马铃薯、莴苣、羽叶豆、烟草、油菜籽(柯罗纳(canola))、向日葵、芜菁、甜菜糖蜜、种子、红花以及花生)、细菌、真菌以及酵母。
例示性动物细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)、小鼠骨髓瘤、M0035(NSO细胞系)、杂交瘤(例如与骨髓瘤肿瘤细胞融合的B-淋巴细胞)、幼仓鼠肾(BHK)、猴COS、非洲绿猴肾上皮细胞(VERO)、小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)、小鼠结缔组织成纤维细胞(L929)、牛主动脉内皮细胞(BAE-1)、小鼠骨髓瘤成淋巴细胞样(NSO)、小鼠B细胞淋巴瘤成淋巴细胞样(WEHI231)、小鼠淋巴瘤成淋巴细胞样(YAC1)、小鼠成纤维细胞(LS)、小鼠肝脏细胞(例如MC/9、NCTC克隆1469)以及大鼠肝脏细胞(例如ARL-6、BRL3A、H4S、Phi1(来自Fu5细胞))。
例示性人类细胞包括视网膜细胞(PER-C6)、胚肾细胞(HEK-293)、肺成纤维细胞(MRC-5)、宫颈上皮细胞(HELA)、二倍体成纤维细胞(WI38)、肾上皮细胞(HEK293)、肝上皮细胞(HEPG2)、淋巴瘤成淋巴细胞样细胞(Namalwa)、白血病成淋巴细胞样细胞(HL60)、骨髓瘤成淋巴细胞样细胞(U266B1)、成神经细胞瘤成神经细胞(SH-SY5Y)、二倍体细胞系细胞(例如脊髓灰质炎病毒的传播)、郎格罕氏岛细胞(pancreatic islet cell)、胚胎干细胞(hES)、人类间充质干细胞(MSC，其可分化成比如生骨、软骨形成、生腱、生肌、生脂以及骨髓基质系)、人类神经干细胞(NSC)、人类组织细胞淋巴瘤成淋巴细胞样细胞(U937)以及人类肝细胞，例如WRL68(来自胚细胞)、PLC/PRF/5(即，含有乙型肝炎序列)、Hep3B(即，产生血浆蛋白：纤维蛋白原、α-胎蛋白、运铁蛋白、白蛋白、互补C3和/或α-2-巨球蛋白)以及HepG2(即，产生血浆蛋白：凝血酶原、抗凝血酶III、α-胎蛋白、互补C3和/或纤维蛋白原)。
来自昆虫(例如杆状病毒和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢(Sf21细胞产生Sf9细胞系))的细胞和来自植物或食品的细胞也可根据本发明进行培养。来自例如稻米(例如水稻(Oryza sativa)、水稻栽培品种孟加拉愈伤组织培养(Oryza sativa cv Bengal callusculture)以及水稻栽培品种台北309(Oryza sativa cv Taipei309))、大豆(例如大豆栽培品种威廉82(Glycine max cv Williams82))、番茄(西红柿栽培品种瑞光(Lycopersicumesculentum cv Seokwang))以及烟叶(例如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，包括嫩黄2(BY-2)、普通烟草(Nicotiana tabacum)栽培品种NT-1、普通烟草栽培品种BY-2以及普通烟草栽培品种SR-1)的来源的细胞是例示性实例。
细菌、真菌或酵母也可根据本发明培养。例示性细菌包括沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyces)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、红球菌属(Rhodococcus sp)、链霉菌属(Streptomycessp)和产碱菌属(Alcaligenes sp)。可培养来自例如黑曲霉菌(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichoderma reesei)的物种的真菌细胞，并且酵母细胞可包括来自多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、甲醇酵母、酿酒酵母、与贝酵母(S.bayanus)杂交的酿酒酵母、与来自乳酸克鲁维酵母(K.1actis)的LAC4和LAC1-2基因杂交的酿酒酵母、与施柔曲霉(Aspergillus shirousamii)杂交的酿酒酵母、枯草杆菌、淀粉酶酵母(Saccharomycesdiastasicus)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、具有来自树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的基因的酿酒酵母以及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
产物
多种不同的产物也可根据本发明产生。例示性产物包括蛋白质(例如抗体和酶)、疫苗、病毒产物、激素、免疫调节剂、代谢物、脂肪酸、维生素、药物、抗生素、细胞以及组织。蛋白质的非限制性实例包括人类组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)、凝血因子、生长因子(例如细胞因子，包括干扰素和趋化因子)、粘着分子、蛋白质Bc1-2家族、多角体蛋白、人类血清白蛋白、scFv抗体片段、人类红细胞生成素、小鼠单克隆重链7、小鼠IgG2b/k、小鼠IgG1、重链mAb、布荣丁(Bryondin)1、人类介白素-2、人类介白素-4、篦麻毒素、人类α1-抗胰蛋白酶、biscFv抗体片段、免疫球蛋白、人类粒细胞、刺激因子(hGM-CSF)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人类溶菌酶、IL-12以及针对HBsAg的mAb。血浆蛋白的实例包括纤维蛋白原、α-胎蛋白、运铁蛋白、白蛋白、互补C3和α-2-巨球蛋白、凝血酶原、抗凝血酶III、α-胎蛋白、互补C3和纤维蛋白原、胰岛素、乙型肝炎表面抗原、尿酸氧化酶、升糖素、粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子、水蛭素/地西卢定(desirudin)、血管抑制素、弹性蛋白酶抑制剂、内皮抑制素、表皮生长因子类似物、胰岛素样生长因子-1、舒血管素抑制剂、α1-抗胰蛋白酶、肿瘤坏死因子、胶原蛋白结构域(而不是整个胶原蛋白醣蛋白)、无代谢副产物的蛋白质、人类白蛋白、牛白蛋白、凝血调节蛋白、运铁蛋白、血友病A的因子VIII(即，来自CHO或BHK细胞)、因子VIIa(即，来自BHK)、血友病B的因子IX(即，来自CHO)、人类分泌的碱性磷酸酶、抑肽酶、组织胺、白三烯、IgE受体、N-乙酰基葡糖胺基转移酶-III以及抗血友病因子VIII。
酶可由多种来源使用本发明产生。所述酶的非限制性实例包括来自酵母的YepACT-AMY-ACT-X24杂交酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)α-淀粉酶、木聚糖酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原活化因子(rt-PA)、牛凝乳酶、葡糖脑苷脂酶(高雪氏病(Gaucher′sdisease)的治疗酶，来自CHO)、乳糖酶、胰蛋白酶、抑肽酶、人类乳铁传递蛋白、溶菌酶以及油质蛋白。
疫苗也可使用本发明产生。非限制性实例包括用于以下的疫苗：前列腺癌、人类乳头状瘤病毒、病毒性流感、三价血凝素流感、AIDS、HIV、疟疾、炭疽、细菌性脑膜炎、鸡痘、霍乱、白喉、流感嗜血杆菌类型B、甲型肝炎、乙型肝炎、百日咳、瘟疫、肺炎球菌肺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、人类狂犬病、破伤风、伤寒、黄热病、兽医学FMD、纽卡斯尔氏病(New Castle′s Disease)、口蹄疫、DNA、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus)、癌症(结肠癌)疫苗(即，预防或治疗)、MMR(麻疹、腮腺炎、风疹)、黄热病、流感嗜血杆菌(Hib)、DTP(白喉和破伤风疫苗，具有百日咳亚单位)、连接到多醣的疫苗(例如Hib、奈瑟菌属脑膜炎球菌(Neisseria meningococcus))、肺炎葡萄球菌(Staphylococcus pneumoniae)、烟碱、多发性硬化、牛海绵状脑(疯牛病)、IgG1(膦酸酯)、IgM(神经肽半抗原)、SIgA/G(变异链球菌黏附素)、scFv-布瑞丁(bryodin)1免疫毒素(CD-40)、IgG(HSV)、LSC(HSV)、诺沃克病毒(Norwalk virus)、人类细胞巨大病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒F、胰岛素依赖性自体免疫糖尿病、腹泻、鼻病毒、单纯疱疹病毒以及个性化癌症疫苗，例如用于淋巴瘤治疗(即，以可注射、口服或可食用形式)。也可产生重组亚单位疫苗，例如乙型肝炎病毒包膜蛋白、狂犬病毒醣蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素、诺沃克病毒衣壳蛋白、糖尿病自身抗原、霍乱毒素B亚单位、霍乱毒素B(一种dA2亚单位)、轮状病毒肠毒素以及肠产毒性大肠杆菌、菌毛抗原融合以及猪传染性胃肠炎病毒醣蛋白S。
也可产生病毒产物。病毒产物的非限制性实例包括辛德毕斯(sindbis)、VSV、瘤、甲型肝炎、回科鱼病毒、RSV、冠状病毒、FMDV、狂犬病、脊髓灰质炎、呼肠孤病毒、麻疹以及腮腺炎。
激素也可使用本发明产生。激素的非限制性实例包括生长激素(例如人类生长激素(hGH)和牛生长激素)、生长因子、β和γ干扰素、血管内皮生长因子(VEGF)、生长抑素、血小板衍生生长因子(PDGF)、促滤泡激素(FSH)、黄体化激素、人类绒膜激素以及红细胞生成素。
也可产生免疫调节剂。免疫调节剂的非限制性实例包括干扰素(例如β-干扰素(用于多发性硬化)、α-干扰素以及γ-干扰素)和介白素(例如IL-2)。
也可产生代谢物(例如紫草素和太平洋紫杉醇)和脂肪酸(即，包括直链(例如己二酸、壬二酸、2-羟基酸)、分支链(例如10-甲基十八烷酸和视黄酸)、含环脂肪酸(例如茼蒿酸和硫辛酸)以及复合脂肪酸(例如脂肪酰基-CoA))。
器官生长、细胞以及基因疗法。
生物反应器组合件
适用于本发明的各实施例的容器可具有适于含有营养培养基的任何尺寸。举例来说，容器可具有1-40L、40-100L、100-200L、200-300L、300-500L、500-750L、750-1,000L、1,000-2,000L、2,000-5,000L或5,000-10,000L之间的体积。在一些情况下，容器具有超过1L的体积，或在其它情况下，超过10L、20L、40L、100L、200L、500L或1,000L。超过10,000L的体积也是可能的。优选地，容器体积将介于约1L与1000L之间，并且更优选地在约5L与500L之间，并且甚至更优选地5L与200L之间。
希望与营养培养基或由此提供的产物接触的生物反应器的组件和本文所述的其它装置包含生物相容性材料，更希望是生物相容性聚合物，并且优选地是可杀菌的。
还应了解本文所述的许多组件也希望是柔性的，例如容器希望包含柔性生物相容性聚合物容器(例如可折叠的袋)，其中也希望管道包含此类生物相容性聚合物。进一步希望柔性材料是证明是USP类别VI的材料，例如硅酮、聚碳酸酯、聚乙烯以及聚丙烯。柔性材料的非限制性实例包括聚合物，例如聚乙烯(例如线性低密度聚乙烯和超低密度聚乙烯)、聚丙烯、聚氯乙烯、聚二氯乙烯、聚偏二氯乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、耐纶、硅酮橡胶、其它合成橡胶和/或塑料。必要时，柔性容器的部分可包含实质上刚性材料，例如刚性聚合物(例如高密度聚乙烯)、金属和/或玻璃。
希望容器包含生物相容性材料，更希望是生物相容性聚合物。当选择可折叠容器进行使用时，容器可通过支撑结构的内表面支撑或可内衬其，例如具有容器保持侧壁的外部支撑外壳。然而，本发明可使用不可折叠或刚性容器或管道实施。
容器可具有适于保持营养培养基于其内的任何厚度，并且可设计成具有在操作期间或在处理时一定的抗刺穿性。举例来说，容器壁可具有小于或等于250密耳(1密耳是25.4微米)、小于或等于200密耳、小于或等于100密耳、小于或等于70密耳(1密耳是25.4微米)、小于或等于50密耳、小于或等于25密耳、小于或等于15密耳或小于或等于10密耳的总厚度。在某些实施例中，容器可包括一个以上材料层，其可层压在一起或以其它方式彼此连接以给予容器某些性质。举例来说，一层可由实质上氧不能渗透的材料形成。另一层可由给予容器强度的材料形成。可包括又一层以给予容器中可含有的流体抗化学性。
因此应了解容器可由任何适合的层组合形成。容器(例如可折叠的袋)可包括比如1层、大于或等于2层、大于或等于3层或超过等于5层材料。每一层可具有比如小于或等于200密耳、小于或等于100密耳、小于或等于50密耳、小于或等于25密耳、小于或等于15密耳、小于或等于10密耳、小于或等于5密耳或小于或等于3密耳或其组合的厚度。
另外，容器优选地是无缝的，从而提高其强度并且避免生长细胞沉积在培养基中。
另外，容器优选地是圆柱形，以保持鼓泡过滤器与容器外壁之间的距离。
也希望容器全部或部分是半透明的，或更希望是透明的，以允许观察容器内部的内含物。当希望照射容器内的营养培养基时后者是优选的。
本文中所引用的所有参考文献，包括公开案、专利申请案以及专利都以引用的方式并入本文中，引用程度如同每个参考文献个别并特定地指示以引用的方式并入一般并且全文阐述于本文中。
除非本文中另外指示或上下文明显相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别在以下权利要求书的上下文中)术语“一(a)”和“一(an)”和“该”以及类似指示物视为涵盖单数与复数两者。除非另作说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”以及“含有(containing)”应理解为开放术语(即，意指“包括，但不限于”)。除非本文中另外指示，否则本文中数值范围的叙述仅意图充当个别提及在所述范围内的每一各别值的速记方法，并且每一各别值如同本文中个别叙述其一般地并入本说明书中。除非本文中另外指示或另外上下文明显相矛盾，否则所有本文所述的方法可按任何适合次序执行。本文所提供的任何和所有实例或例示性措辞(比如“例如”)的使用仅意图更好地说明本发明，并且除非另外要求，否则不会对本发明的范围构成限制。本说明书中无措辞应理解为指示任何未要求的要素对本发明的实施来说不可或缺。
本文描述本发明的优选实施例，包括本发明者已知用于进行本发明的最佳模式。那些优选实施例的变体可为所属领域的一般技术人员在阅读以上描述后变得显而易见。诸位发明人预期所属领域的技术人员酌情采用所述变体，并且诸位发明人意图本发明以除本文特定描述以外的方式实施。因此，本发明包括如适用法律所允许，随附权利要求书中叙述的主题的所有修改和同等物。此外，除非本文中另外指示或另外上下文明显相矛盾，否则其所有可能变体中上述要素的任何组合都涵盖于本发明中。
虽然本发明已经根据特定的实施例和应用描述，但熟习此项技术者可按照此教示，在不超过所要求的发明的范围或偏离其精神下产生其它实施例。灌注生物反应器系统的各种要素的特定组成比如不应视为是一个限制因素。因此，应了解提供本发明中的图式和说明以促进本发明的理解并且不应视为限制其范围。

Claims (24)

1.一种封闭的生物反应器，其适用于不受控制的环境中，其包含：
a.包含营养培养基和生物培养物的容器；
b.至少一个出气口；
c.至少一个进气口，其通过管连接到所述出气口以使气体在所述容器内再循环并且另外连接到气体来源；
d.至少一个液体端口；
e.安装在所述气体来源与所述进气口之间的杀菌过滤器；
f.安装在所述杀菌过滤器(e)与所述进气口之间的旋塞阀；
g.安装在所述液体端口的杀菌过滤器；
h.安装在杀菌过滤器(g)与所述液体端口之间的旋塞阀；
i.安装在连接在所述出气口与所述进气口之间的所述管中的蠕动泵；以及
j.至少一个鼓泡过滤器，其连接到所述进气口并且位于所述容器中。
2.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其中所述生物反应器处于ISO14644类别9或更高的不受控制的环境中。
3.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其进一步包含向所述容器提供支撑的外部支撑外壳。
4.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其中所述营养培养基是通过充气、搅拌、摇动、震荡、振动和/或按压所述容器来混合。
5.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其进一步包含能够保留大于5μm的粒子的过滤管。
6.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其中所述生物培养物为人类细胞、动物细胞、细菌、植物细胞、昆虫细胞、酵母或真菌。
7.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物培养物在其代谢过程中产生二氧化碳。
8.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物培养物需要二氧化碳用于其代谢过程。
9.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其进一步包含多个远程操作的传感器。
10.根据权利要求9所述的封闭的生物反应器，其中所述远程操作的传感器包含氧和二氧化碳传感器。
11.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其进一步包含用于所述营养培养基的温度控制器。
12.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其中所述容器无菌。
13.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其中所述容器为一次性的。
14.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其中所述容器为柔性的。
15.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其中所述容器包含生物相容性聚合物。
16.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其中所述鼓泡过滤器在所述封闭的生物反应器操作期间浸在所述营养培养基中。
17.根据权利要求1所述的封闭的生物反应器，其进一步包含连接到所述出气口的直列式筒，所述直列式筒包含选自包含以下各物的吸收性材料群组的二氧化碳吸收性材料：碱石灰、氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、硅酸锂、锆酸锂、氧化锂、活性炭、沸石和离子交换树脂。
18.一种用于产生生物产物的方法，其包含：
a.提供包含容器的封闭的生物反应器，所述容器包含：
i.至少一个出气口；
ii至少一个进气口，其通过管连接到所述出气口以使气体在所述容器内再循环；
iii.至少一个液体端口；
iv.安装在所述进气口的杀菌过滤器；
v.安装在所述杀菌过滤器(iv)与所述进气口之间的旋塞阀；
vi.安装在所述液体端口的杀菌过滤器；
vii.安装在所述杀菌过滤器(vi)与所述液体端口之间的旋塞阀；
viii.安装在所述出气口与所述进气口之间的所述管中的蠕动泵；
ix.至少一个鼓泡过滤器，其连接到所述进气口并且位于所述容器中；以及
x.温度控制器；
b.添加营养培养基到所述容器；
c.将包含5％到100％二氧化碳的新鲜气体的供应连接到所述进气口，其中所述新鲜气体通过(a)(ix)的所述鼓泡过滤器通入营养培养基中并且打开所述供应；
d.当所述营养培养基中达到二氧化碳的预定浓度时断开所述新鲜气体的供应；
e.开启(a)(viii)的所述蠕动泵以使气体在所述容器中通过(a)(ii)的所述进气口再循环；
f.启动所述温度控制器；
g.添加足够量的生物培养物到所述营养培养基；
h.以时间间隔检测所述容器中所述营养培养基中所述生物培养物的密度；
i.当所述营养培养基中所述二氧化碳浓度降到低于预定水平时，间歇性开启新鲜气体的流动，并且继续所述新鲜气体的所述流动，直到所述二氧化碳浓度升高到所述营养培养基中的预定水平；以及
j.从所述容器去除所述生物培养物以及由此产生的生物产物。
19.一种用于产生生物产物的方法，其包含：
a.提供包含容器的封闭的生物反应器，所述容器包含：
i.至少一个出气口；
ii至少一个进气口，其通过管连接到所述出气口以使气体在所述容器内再循环；
iii.至少一个液体端口；
iv.安装在所述进气口的杀菌过滤器；
v.安装在(iv)的所述杀菌过滤器与所述进气口之间的旋塞阀；
vi.安装在所述液体端口的杀菌过滤器；
vii.安装在(vi)的所述杀菌过滤器与所述液体端口之间的旋塞阀；
viii.安装在所述出气口与所述进气口之间的所述管中的蠕动泵；
ix.至少一个鼓泡过滤器，其连接到所述进气口并且位于所述容器中；
x.温度控制器；以及
xi.包含二氧化碳吸收性材料的直列式筒，其安装在所述出气口与所述进气口之间；
b.添加营养培养基到所述容器；
c.连接包含5％到100％氧的新鲜气体的供应，其中所述新鲜气体通过(a)(ix)的所述鼓泡过滤器通入所述营养培养基中并且打开所述供应；
d.当所述营养培养基中达到氧的预定浓度时断开所述新鲜气体的供应；
e.开启(a)(viii)的所述蠕动泵以使气体在所述容器中通过(a)(ii)的所述进气口再循环；
f.启动所述温度控制器；
g.添加足够量的生物培养物到所述营养培养基；
h.以时间间隔检测所述容器中所述营养培养基中所述生物培养物的密度；
i.当所述营养培养基中所述二氧化碳浓度降到低于预定水平时，间歇性开启新鲜气体的流动，并且继续所述新鲜气体的所述流动，直到所述二氧化碳浓度升高到所述营养培养基中的预定水平；以及
j.从所述容器去除所述生物培养物以及由此产生的生物产物。
20.根据权利要求18或19所述的用于产生生物产物的方法，其中所述容器内部的压力通过所述新鲜气体的间歇性流动保持在预定范围内。
21.根据权利要求18所述的用于产生生物产物的方法，其中所述生物培养物为哺乳动物细胞。
22.根据权利要求19所述的用于产生生物产物的方法，其中所述生物培养物为细菌。
23.根据权利要求18或19所述的用于产生生物产物的方法，其中所述容器进一步包含过滤管。
24.根据权利要求23所述的用于产生生物产物的方法，其中能够捕捉所述营养培养基中的所述生物产物的树脂是通过所述液体端口添加，并且所述营养培养基在所述树脂已经捕捉到所述生物产物后通过所述过滤管排出。
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