CN108689744A - 富硒虫草的培养基及其培养方法 - Google Patents

Abstract

一种富硒虫草的培养基，按重量份数计，包括以下组分：葡糖糖20～40份、蛋白胨8～12份、KH₂PO₄1.8～2.2份、NaCl4.6～5.4份、MgSO₄0.6～1.4份、CaCl₂0.8～1.6份、复合维生素B1.6～2.4份、富硒大米多肽液4.0～5.6份、维生素C0.3～0.7份、活性炭146～154份、木糖5～9份、水930～970份。上述培养基能够提高了虫草对硒元素的吸收，同时，维生素C也能够对大米多肽起到保护作用，延缓了大米多肽的氧化速率，并且，活性炭能够对二氧化碳进行吸收，从而也就减少了二氧化碳对虫草生长的抑制，提高了虫草生长效率，而且，木糖不仅有助于虫草菌体的新陈代谢，同时，其可以与钙离子发生配伍，有助于虫草对钙离子的吸收。

Description

富硒虫草的培养基及其培养方法

技术领域

本发明属于微生物真菌的人工培养领域，具体涉及一种富硒虫草的培养方法。

背景技术

硒是第21位氨基酸(硒代半胱氨酸Sec，U)的成分，也是体内重要的过氧化物酶谷胱甘肽过氧化酶的组成部分，因而对人体健康至关重要，是人体必需的微量元素。它在抗氧化防御体系、免疫细胞功能、甲状腺激素功能等方面具有不可替代的作用。并且如果人类缺硒会导致患癌症，中国有大约七成地区的居民缺硒，针对人体缺硒的状况，主要是通过饮食获得硒，人工补硒的方法是口服含硒制剂，即用无机硒化合物(亚硒酸钠和硒酸钠)制成口服制剂。

蛹虫草又名北冬虫夏草，在生物分类学上与中华冬虫夏草同属真菌的子囊菌纲、虫草属。虫草素是在1950年从北虫草的培养液中分离出来的一种3′-脱氧腺嘌呤核苷，它具有显著的药理作用，如抑菌作用、抗肿瘤作用、抑制病毒作用，以及增强免疫功能、防治心脑血管疾病等。现代科学研究表明，虫草素是蛹虫草重要的活性成分，蛹虫草中虫草素含量为冬虫夏草的数十倍，是获得虫草素的主要来源。蛹虫草具有抗疲劳、抗肿瘤、耐缺氧、增强免疫力、增强性功能以及抑制人血小板的凝结等作用。蛹虫草作为野生虫草的替代品，市场空间大。蛹虫草人工栽培投资少、效益高，生产周期短，一年四季均可培养。因此，目前很多企业和科研单位都努力开发带有有机硒的冬虫草，从而更好提高虫草对抗癌效果和营养价值。

虽然，硒是人体和动物的必需微量元素，具有重要的生物利用性，但并不是所有的硒都具有生物性，毒性和生物利用性主要取决于它的状态。自然界中，硒主要以4种价态存在：还原态的硒化物(-2)、单质态的硒(0)和氧化态的亚硒酸盐(+4)及硒酸盐(+6)，其中又以亚硒酸盐(+4)毒性最强，以单质硒(0)的毒性最弱，并且无机硒强化剂吸收和利用的效果不理想，生物有效性低，而且具有较强的毒副作用，最低致死量相对较小，中毒量与需要量之间范围小，存在较大的安全隐患，因而被严格限制其使用。

目前，多采用的生产方式即在培养基中添加无机硒，通过虫草菌的繁殖萌发过程将无机硒转化为其自身的有机硒，从而生产出带有有机硒的冬虫草。如公开号：CN1861782A，专利申请号：20061004667.3“富硒虫草的人工培养方法及子实体的应用”培养富硒蛹虫草的技术方案，上述技术方案中硒都采用的是用亚硒酸钠作为硒元素的硒肥营养液，虫草培养的特殊性决定虫草本身的生长全过程都在亚硒酸钠作为硒元素来源的营养液中。采用亚硒酸钠作为硒元素的来源虫草又因难以吸收，必需加大亚硒酸钠的含量，但高浓度亚硒酸钠本身就会抑制虫草的生长和毒害作用，关键这种无机硒营养液的环境生长出的虫草自身带有亚硒酸钠而带来食用的风险性。

所以采用上述方法培养出的虫草，硒的含量极其微少，难以提高虫草的营养和药用价值，还降低了食用的安全性和工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种富硒虫草的培养基及其培养方法，其不仅能够避免无机硒在虫草内的残留，同时，也有利于提高虫草对有机硒的吸收。

本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：一种富硒虫草的培养基，按重量份数计，包括以下组分：葡糖糖20～40份、蛋白胨8～12份、KH₂PO₄1.8～2.2份、NaCl4.6～5.4份、MgSO₄0.6～1.4份、CaCl₂0.8～1.6份、复合维生素B 1.6～2.4份、富硒大米多肽液4.0～5.6份、维生素C0.3～0.7份、活性炭146～154份、木糖5～9份、水930～970份。

优选为，按重量份数计，包括以下组分：葡糖糖30份、蛋白胨10份、KH₂PO₄2份、NaCl5份、MgSO₄1份、CaCl₂1.2份、复合维生素B 2份、富硒大米多肽液4.8份、维生素C 0.5份、活性炭150份、木糖7份、水950份。

通过采用上述技术方案，由于富硒大米多肽液中的硒是以有机硒的形式存在的，并且，其与多肽相结合，这样就其能够与虫草的细胞壁相溶合，从而也就更容易被虫草的菌体所吸收。

同时，维生素C在进入虫草菌体后能够促进硒的转运提高谷胱甘肽过氧化酶的活性作起用。并且，维生素C还具有抗氧化的能力，其能够延缓大米多肽液被氧化的速率。

而活性碳能够在虫草培养的过程中吸收靠近广口瓶底部的二氧化碳，这样能够避免二氧化碳对虫草的生理性造成抑制，而且活性炭与液体多肽混合为虫草提供了一个生长子实体的基质。

再者，木糖一方面能够作为营养物质被虫草利用起来，加快了虫草菌体的增殖，另一方面，木糖还能够与培养基中的钙离子发生配伍，加快了虫草菌体对钙离子的吸收，从而也就有助于虫草菌体内钙元素的含量。另外，钙离子能够与二氧化碳发生碳酸钙沉淀，因此，其在培养基中的存在也能够适当地控制广口瓶中的二氧化碳的含量，从而也能够进一步避免二氧化碳浓度过高而抑制虫草生长的问题。

优选为，所述复合维生素B包括维生素B₁和维生素B₂，所述维生素B₁和维生素B₂的重量比为2∶1。

通过采用上述技术方案，维生素B₁能够在培养基作为生长因子，其能够促进虫草三羧酸循环。并且，其也具有良好的还原能力，所以也可以延缓大米多肽的氧化率。

而维生素B₂分子中异咯嗪上1，5位N存在的活泼共轭双键有关，既可作氢供体，又可作氢递体。其能够在虫草菌体中参与呼吸链能量的产生，并且也具有抗氧化活性，从而保证了培养基和虫草菌体的正常生长。

优选为，所述富硒大米多肽液是由富硒大米、富硒酒糟和富硒酵母发酵而成。

通过采用上述技术方案，这样富硒酒糟能够作为富硒酵母发酵的的引发剂，从而加快了富硒酵母对富硒大米的发酵作用。

优选为，所述发酵的温度控制在25～28℃。

在该种温度状态，富硒酵母的新陈代谢是较为正常的，这样能够保证富硒酵母能够稳定且快速地对富硒大米进行发酵，从而也就能够在短时间内尽可能地将富硒大米分解为多肽。

一种富硒虫草的培养方法，包括以下步骤：

S1、将权利要求1至权利要求4中任意一项权利要求所述的子实体富硒培养基加入到广口瓶中；

S2、用玻璃纸对广口瓶进行封口，然后通过巴氏消毒法进行灭菌消毒；

S3、向广口瓶内接入液体菌种，并将广口瓶用封口膜进行密封，并培养40天；

S4、待子实体高度达到5～8cm，且有45～55％子实体顶端膨大即可采收烘干。

优选为，S3中菌种的培养过程包括发菌期和转色期：

发菌期，菌丝培养温度控制在15～20℃，空气湿度73％～78％，完全黑暗条件培养，培养时间为20天；

转色期，培养温度在21～23℃，每天光照时间12小时以上，光照强度保持在140～160Lx，强光与弱光交替照射，同时进行连续变温刺激，昼夜温差在13～17℃之间，培养时间为20天。

通过采用上述技术方案，当虫草刚处于发菌期的时候，由于虫草菌体比较柔弱，所以光得照射往往可能造成菌体受损，并抑制虫草抽丝。

而在转色期的时候利用强弱光交替照射，这样一方面能够有助于虫草的转色，同时也有利于营养物质在虫草体内的积蓄，从而有利于子实体的生长。

优选为，待S3完成后，将广口瓶上的封口膜撕掉，然后将环境温度调控到20～22℃，空气湿度83％～87％，光照强度保持在130～170Lx，并且向广口瓶中不断地通入新鲜空气。

通过采用上述技术方案，这样能够促进子实体的形成，以及有利于子实体的新陈代谢作用，从而子实体能够生长强壮，色泽鲜艳。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、上述的培养基中利用将硒以多肽的形式供虫草菌体进行吸收，这样吸收效率要远远大于以无机硒的方式供虫草菌体进行吸收；

2、培养基中添加了维生素C，这样能够进一步促进虫草菌体对硒的吸收，同时，也能够增强富硒大米多肽的抗氧化能力；

3、活性炭能够去除虫草培养过程中，靠近广口瓶底部的二氧化碳，从而能够降低二氧化碳对虫草生长的抑制作用；

4、在发菌期的时候，将虫草处于完全黑暗的环境中，这样能够减少光线对菌丝造成损伤；

5、在转色期的时候，利用强弱光交替的方式来照射虫草的子实体，这样能够保证营养物质在虫草体内的积累，并且有利于提高子实体的生长效率；

6、木糖不仅本身能够对虫草的生长起到促进作用，同时，其能够与钙离子发生配伍，进而促进虫草对钙离子的吸收。

附图说明

图1是富硒虫草培养的工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例一

1、虫草菌种的复苏及液体菌种的制备：

1.1、在PDA固体培养基进行菌种的活化，冰箱中保存的优良菌种，每两个月在PDA固体培养基上活化一次；PDA固体培养基配方按重量份数比：经过去皮煮汁取滤液的土豆200g，葡萄糖20g，KH₂PO₄2g，琼脂15g，水970ml；

1.2、液体菌种的培养：

经在PDA固体培养基进行活化的菌种，接种到液体培养基进行培养，培养时间2～4天，液体培养基的pH调为6.0；液体培养基的配方按重量份数比：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉5g，KH₂PO₄0.04g，NaCl 5g，MgSO₄0.04g，维生素B₁0.02g，水950ml；

2、子实体富硒培养基的配制：

配方按重量份数比：葡萄糖30g，蛋白胨10g，KH₂PO₄2g，NaCl 5g，MgSO₄1g，复合维生素B2g，CaCl₂1.2份，30ml富硒大米多肽液，维生素C 0.5g，活性炭150g，木糖7份，水950ml；此处，复合维生素B包括维生素B₁和维生素B₂，它们的重量为2∶1。

配方中的富硒大米多肽液的制备方法，包括以下步骤：

2.1、挑选新鲜优质的富硒大米，去除杂质，淘洗至无明显浑浊水，碾磨富硒大米成粉末状；

2.2、添加自制酒糟：

自制酒糟是通过富硒大米处理后加入自制的富硒酵母发酵产酒后余留下的富硒酒糟；

2.3、添加富硒酵母：

富硒酵母是利用微生物菌种筛选技术获得的，首先在硒矿附近挑选出能够利用无机硒并将无机硒转换为有机硒的酵母菌落，然后分离、富集培养为纯酵母菌种，再驯化为富硒酵母，再通过挑选选出在一定降解能力范围能使蛋白质降解为多肽但不会被彻底降解为氨基酸的富硒酵母；

2.4下缸、发酵：

所述发酵的温度控制在为25～28℃；

2.5、样品过滤：

采用15％的三氯醋酸溶液将样品中大分子蛋白完全沉淀，同时小分子肽保留在该溶液中，并利用半透膜进行过滤，除去蛋白沉淀；

2.6、提取富硒大米多肽：

采用电泳分离的方法，将多肽从过滤液中提取出来。

所述配料中各组份的重量：富硒大米100g、富硒酒糟850g、酵母100g，获得富硒大米多肽液的浓度为160mg/mL。

3、子实体富硒培养方法：

3.1、将上述配方的子实体富硒培养基加入到广口瓶内，瓶容积为1L，向瓶内加入培养基300ml；

3.2、用玻璃纸对广口瓶进行封口，然后用巴氏灭菌法进行灭菌；

3.3、内接入上述发酵液体培养基培养出的液体菌种，液体菌种的重量是子实体富硒培养基内所含富硒大米多肽液的8％；将广口瓶用封口膜进行密封，培养时间40天；

3.31、发菌管理：菌丝培养温度控制在15～20℃，空气湿度73％～78％，完全黑暗条件培养，培养时间为20天；

3.32、转色期管理：培养温度在21～23℃，每天光照时间12小时以上，光照强度保持在140～160Lx，强光与弱光交替照射，同时进行连续变温刺激，昼夜温差在13～17℃之间；该阶段为子实体生长阶段，培养时间为20天。

4、子实体形成过程的环境管理：

4.1控制在20～22℃，空气湿度83％～87％，光照强度保持在130～170Lx，向广口瓶中不断地缓慢增加新鲜空气，促进子实体形成，且生长强壮、色泽鲜艳，该时间控制在5天左右；

4.2、采收：当子实体高度达到5～8cm，约50％子实体顶端膨大即可采收烘干。

将实施例二至实施例五的配方按照实施例一进行操作，获得以下数据：

检测方法：

(1)、将实施例一至实施例五所获得的虫草进行干燥处理，称量虫草的干重；

(2)、取实施例一至实施例五中干燥后的虫草1g，然后加入到50mL试管中，加入5mL水搅匀，并用5％NaOH溶液调节其pH为7.0，然后再加入5mL的乙醚，放入30℃水浴中恒温30min，然后将其放入离心机进行离心，取其有机相，并再萃取一次；将萃取后的有机项进行分离，并加入硝酸和高氯酸(4+1)的混合酸进行消化处理，消化完全后再加入6mol·L^-1的盐酸，将六价的硒还原成四价的硒，之后直接用色谱仪进行检测；

(3)、利用色谱仪对实验结束后的子实体富硒培养基中的无机硒进行检测；

(4)、利用二氧化碳检测仪对广口瓶中的二氧化碳含量进行检测；

(5)、钙元素的检测方法：

①样品前处理，称取0.2g虫草的灰分加入到离心试管中，并加入2mL浓硝酸，振荡。完全反应后，离心，取上层清液，用100mL容量瓶定容、保存；

②用10.00mL的移液管取10.00mL的样品试液于250mL锥形瓶中，加入10mL三乙醇胺，振荡，摇匀；再滴加2mol/L的NaOH溶液，调pH＝10～12，加入少量的钙指示剂，振荡要匀。用0.0050mol/L的EDTA溶液滴定，至溶液由紫色恰好变为蓝色。记下消耗的EDTA的体积，进行计算。

通过上述实施例的检测方法获得以下表3中的数据：

对比例A：根据实施例一的富硒虫草的培养方法，此处将子实体富硒培养基中的富硒大米多肽液换成同浓度的亚硒酸钠，然后根据上述的检测方法，获得下表4中的数据：

通过表3和表4的数据可以看出，利用富硒大米多肽液培养的虫草较亚硒酸钠培养的虫草而言，虫草的干重更重，从而也就说明，有机硒相对于无机硒更容易促进虫草的生长。同时，也可以从表中得出虫草对富硒大米多肽液的吸收要远远大于对亚硒酸钠的吸收；并且，富硒大米多肽浓度越高，则虫草对其的吸收就会越多，从而也就说明了富硒大米多肽液对虫草没有毒害作用。

并且，用富硒大米多肽液培养的虫草，其体内会有大量的虫草素和虫草酸的产生，而这些物质有助于人体提高免疫能力，增强抗癌的作用。

同时，维生素C主要通过促进硒的转运提高谷胱甘肽过氧化酶的活性作起用，培养基中的大米多肽液本身不够稳定，而维生素C具有抗氧化的能力，因此，有助于富硒大米多肽液在培养基的抗氧化性能力，降低了大米多肽液被氧化的概率。如以下对比例B所示，

对比例B：根据实施例一至实施例五的操作步骤，进行以下对比例B1至对比例B5的操作，对比例B1至对比例B5与实施例的区别仅省去了维生素C。待实验结束后，根据上述检测方法对虫草和培养基进行相应的检测，获得下表5的数据：

所以，从表5中可以看出，没有维生素C的子实体富硒培养基，虫草生长的也比较缓慢，因此，可知维生素C本身又可以促进硒的转运和吸收。而且，加有维生素C的子实体富硒培养液所培养的菌丝体的菌丝干重和有机硒含量均高于不加维生素C的对比例B。

再者，通过对比例B和实施例可以看出，有机硒会有向无机硒转化的可能，但是添加维生素C的培养基中的无机硒含量非常稳定，且保持在一个很低的水平，不会对虫草的生长产生影响。因此，添加维生素C即保证了溶液中有机硒的稳定性又提高了有机硒的转化利用率。

此外，为了保证虫草在培养的过程中能够处于无菌的状态，因此，在广口瓶上覆盖了封口膜。这样虽然能够提供氧气实现虫草的生长，但是虫草自生长过程中产生的二氧化碳由于密度大，会在广口瓶底部慢慢积累，对虫草的生长会产生生理性抑制作用。因此，在广口瓶中放置活性炭既可以供虫草固定，又可以起到吸收广口瓶中二氧化碳的作用，并且活性炭与液体多肽混合为虫草提供一个生长子实体的基质作用。

对比例C：根据实施例一至实施例五的操作步骤，来进行以下对比例C1至对比例C5的操作，对比例C1至对比例C5与实施例的区别仅省去了活性炭。待实验结束后，根据实施例的检测方法对虫草进行检测，获得下表6的数据：

从表6可以看出，广口瓶中二氧化碳浓度过高会严重影响虫草的生长，从而不利于虫草的培养和生长，而且，可以看出，在维生素C和活性炭同时存在的情况，能够大大提高虫草对有机硒的吸收和转换，适合大规模进行生产。

对比例D：根据实施例一至实施例五的操作步骤，来进行以下对比例D1至对比例D5的操作，对比例D1至对比例D5与实施例的区别仅省去了木糖。待实验结束后，根据实施例的检测方法对虫草进行检测，获得下表7的数据：

从上述对比例D中可以看出，培养基中没有木糖，则所培养的虫草干重会比较的轻，并且该种虫草中的钙元素含量要比有木糖的培养基所培养出来的虫草少1/3的含量，从而可以得出，木糖能够大大加快虫草菌体对钙元素的吸收。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种富硒虫草的培养基，按重量份数计，包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的一种富硒虫草的培养基，按重量份数计，包括以下组分：

3.根据权利要求1所述的一种富硒虫草的培养基，其特征在于：所述复合维生素B包括维生素B1和维生素B2，所述维生素B1和维生素B2的重量比为2∶1。

4.根据权利要求1所述的一种富硒虫草的培养基，其特征在于：所述富硒大米多肽液是由富硒大米、富硒酒糟和富硒酵母发酵而成。

5.根据权利要求4所述的一种富硒虫草的培养基，其特征在于：所述发酵的温度控制在25～28℃。

6.一种富硒虫草的培养方法，包括以下步骤：

S1、将权利要求1至权利要求4中任意一项权利要求所述的子实体富硒培养基加入到广口瓶中；

S2、用玻璃纸对广口瓶进行封口，然后通过巴氏消毒法进行灭菌消毒；

S3、向广口瓶内接入液体菌种，并将广口瓶用封口膜进行密封，并培养40天；

S4、待子实体高度达到5～8cm，且有45～55％子实体顶端膨大即可采收烘干。

7.根据权利要求6所示的一种富硒虫草的培养方法，其特征在于：S3中菌种的培养过程包括发菌期和转色期：

发菌期，菌丝培养温度控制在15～20℃，空气湿度73％～78％，完全黑暗条件培养，培养时间为20天；

转色期，培养温度在21～23℃，每天光照时间12小时以上，光照强度保持在140～160Lx，强光与弱光交替照射，同时进行连续变温刺激，昼夜温差在13～17℃之间，培养时间为20天。

8.根据权利要求6所述的一种富硒虫草的培养方法，其特征在于：待S3完成后，将广口瓶上的封口膜撕掉，然后将环境温度调控到20～22℃，空气湿度83％～87％，光照强度保持在130～170Lx，并且向广口瓶中不断地通入新鲜空气。