JP2018514221A - アオウキクサにおけるビタミンb12の産生手段および方法 - Google Patents
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Abstract
【要約書】本発明は、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)組成物の製造システムおよび方法に関する。前述の方法は、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、前記少なくとも1つのウキクサ亜科種および前記少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、最も高いビタミンB12含有量を有するDBCにより特徴付けられる前記プロット内で時間間隔を決定するステップと、前記所定の時間間隔で前記DBCを採取し、これによりビタミンB12富化DBC組成物をもたらすステップとを含む。本発明は、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)を含む組成物であって、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種を含み、さらに前記組成物中の前記ビタミンB12含有量が前記DBC100g当たり約0.01〜約100μgの範囲内である、組成物をさらに開示する。
Description
本発明は一般的には、ビタミンB12富化アオウキクサの産生手段および方法に関する。特に、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物の産生手段および方法に関する。
ビタミンB12は、いくつかの食品中に天然に存在し、他の食品に添加され、栄養補助食品および処方箋医薬品として入手可能な、水溶性ビタミンである。ビタミンB12は、いくつかの形態で存在し、鉱物コバルトを含有するので、ビタミンB12活性を有する化合物は集合的に「コバラミン」と呼ばれる。メチルコバラミンおよび5−デオキシアデノシルコバラミンは、ヒトの代謝において活性なビタミンB12の形態である。
ビタミンB12は、赤血球形成、神経機能、およびDNA合成に必要である。これはメチオニンシンターゼおよびL−メチルマロニル−CoAムターゼの補因子として作用する。メチオニンシンターゼは、ホモシステインのメチオニンへの変換を触媒する。メチオニンは、DNA、RNA、ホルモン、タンパク質、および脂質を含む、100近くの異なる基質の万能メチルドナー、S−アデノシルメチオニンの形成に必要である。L−メチルマロニル−CoAムターゼは、脂質およびタンパク質代謝における必須生化学反応である、プロピオン酸エステルの分解においてL−メチルマロニル−CoAをスクシニル−CoAに変換する。スクシニル−CoAもヘモグロビン合成に必要である。
食品中でタンパク質と結合しているビタミンB12は、胃において塩酸および胃プロテアーゼの活性により解放される。合成ビタミンB12が強化食品および栄養補助食品に添加される場合、これはすでに遊離形態であり、よってこの分離ステップを必要としない。遊離ビタミンB12は次に内因子、胃壁細胞により分泌される糖タンパク質と結合し、得られた複合体は受容体介在性エンドサイトーシスにより遠位回腸内で吸収される。ビタミンB12の1mcgの経口用量の約56%が吸収されるが、(ビタミンB12の1〜2mcgで)内因子の容量を超える場合、吸収は大幅に低下する。
内因子の機能不全の影響の一例は悪性貧血であり、これは胃粘膜に影響を及ぼし、胃萎縮を引き起こす自己免疫疾患である。これは壁細胞の破壊、無酸症、内因子の産生不能を引き起こし、ビタミンB12吸収不良をもたらす。悪性貧血を治療せずに放置すると、ビタミンB12の適切な食事摂取があっても、ビタミンB12欠乏症、ひいては巨赤芽球性貧血および神経障害を引き起こす。この特定の症状は、ビタミンB12の適切な食事摂取、すなわち合成形態のビタミンB12の経口摂取による消費が、体内へのビタミンの十分またな適切な吸収を確保しないことを示す。
ビタミンB−12欠乏症は、菜食主義者および完全菜食主義者の間では特に一般的であるが、意外にも肉食主義者にもよく起こる。ビタミンB−12は小腸でしか吸収することができず、高濃度のB−12を消費する多くの肉食主義者は、一般的な腸疾患のため、腸内でこれを吸収することができず、それゆえにビタミンB12欠乏症を患う。
広い意味で、B12とは、コバラミンとして知られるコバルト含有ビタマー化合物の群を指し、これらとしてはシアノコバラミン(ヒドロキシコバラミンが精製される場合、常に微量のシアン化物を含有する、活性炭を用いて形成される人工物)、ヒドロキソコバラミン(細菌により産生される、別の医薬形態)、ならびに最後に、ヒト体内で天然に発生するB12の2つの補因子形態、5’−デオキシアデノシルコバラミン(アデノシルコバラミン−AdoB12)、メチルマロニルコエンザイムAムターゼ(MUT)の補因子、およびメチルコバラミン(MeB12)、ホモシステインのメチオニンへのおよび5−メチルテトラヒドロ葉酸塩のテトラヒドロ葉酸塩への変換に関与する、酵素メチオニンシンターゼの補因子が挙げられる。
シアノコバラミンは、食品中および栄養補助食品に用いられる主要なB12形態である。この形態は、視神経損傷のまれな事例、または体が、喫煙により引き起こされる血中の高シアン化物濃度のため、辛うじてこの形態を用いることができる場合において、望ましくない影響をもたらし得る。疑似ビタミン−B12とは、ヒトにおいて生物学的に不活性であり、(動物を含む)多くの食物供給源、ならびにあるいは栄養補助食品および強化食品中でB12とともに存在が確認されている、B12様類似体を指す。
ビタミンB12の主な供給源は、食品、栄養補助食品、および処方箋である。
ビタミンB12は、魚、肉、鶏肉、卵、乳、乳製品を含む、動物由来製品中に天然で見られる。しかしながら、卵黄および卵白の結合能は熱処理後に著しく低下する。生物学的に活性なB12の非動物性食物供給源は現在いくつかしか示唆されておらず、これらのいずれにもヒト試験は行われていない。
藻類は、従属栄養細菌との、細菌が固定炭素と引き換えにB12を供給する、共生関係を通してB12を獲得すると考えられる。スピルリナおよび乾物アサクサノリ(ポルフィラ・テネラ(Porphyra tenera))は、生物学的な活性なB12ではなく、ほぼ疑似ビタミンB12を含有することが確認されている。アサクサノリ(ポルフィラテネラ(Porphyratenera))は、乾物状態ではほぼ疑似ビタミンB12を含有し、新鮮状態ではほぼ生物学的に活性なビタミンB12を含有することが報告されているが、その新鮮状態のビタミン活性でさえも動物酵素アッセイでは検証されていない。
スサビノリ(ピロピア・イェゾエンシス(Pyropia yezoensis))として知られる紫色のアマノリ属の海藻は、その新鮮状態で、ラットモデルにおいてB12活性を含有することが報告されており、これはこの供給源がヒトにおいて活性であることを示す。これらの結果は確証されていない。
ビタミンB12は一般的には植物性食品中には存在しないが、ビタミンB12で強化された食品も、ビタミンはシアノコバラミンのような商業的な細菌産生源から栄養補助食品形態で添加されるので、それらをB12の真の食物供給源とみなすことはできないが、ビタミンの供給源である。B12強化食品の例としては、強化朝食シリアル、強化大豆製品、強化エナジーバー、および強化ニュートリショナルイーストが挙げられる。これらのすべてが標示量のビタミン活性を含有し得るわけではない。別の研究では、飲料に添加された補助B12は分解し、さまざまな濃度の疑似ビタミン−B12を含有することが見出された。
B12の非在来型の天然供給源も存在するが、B12の食物供給源としてのそれらの有用性は疑わしい。例えば、地面から引き抜かれ、丁寧に洗っていない植物は、周囲の土壌中に存在する細菌からのB12の残留物を含み得る。B12は、水が消毒されていない場合、湖でも見られる。シロアリのような特定の昆虫は、反芻動物に類似した方法で、その腸内細菌により産生されるB12を含有する。ヒトの腸管自体は、小腸にB12産生細菌を含有し得るが、栄養要求を満たすのに十分な量のビタミンを産生することができるかは不明である。
栄養補助食品において、ビタミンB12は通常、シアノコバラミン、体が活性形態メチルコバラミンおよび5−デオキシアデノシルコバラミンに容易に変換する形態として存在する。栄養補助食品は、メチルコバラミンおよびビタミンB12の他の形態を含有することもできる。既存の証拠は、吸収またはバイオアベイラビリティについて形態間のいかなる差異も示さない。しかしながら、栄養補助食品からビタミンB12を吸収する体の能力は、内因子の容量により大いに限定される。例えば、500mcgの経口栄養補助食品の約10mcgのみが実際に健康な人々に吸収される。
経口栄養補助食品に加えて、ビタミンB12は、錠剤またはトローチ剤として舌下製剤で入手可能である。これらの製剤優れたバイオアベイラビリティを有するとしてよく販売されているが、証拠が示すところによると経口および舌下形態の間で有効性に差はない。
ビタミンB12は、シアノコバラミンおよび時にはヒドロキソコバラミンの形態で、処方箋医薬品として、通常は筋肉内注射により、非経口投与することができる。非経口投与は典型的には、悪性貧血により引き起こされるビタミンB12欠乏症ならびにビタミンB12吸収不良および重篤なビタミンB12欠乏症をもたらす他の症状を治療するのに用いられる。
ビタミンB12は、処方箋医薬品として、鼻腔内に塗布されるゲル製剤、患者によっては好まれ得るビタミンB12注射の代替として販売される製品でも入手可能である。この剤形は、ビタミンB12血中濃度]を上昇させるのに効果的であると考えられるが、十分な臨床試験は行われていない。
合成ビタミンB12は、シアノコバラミンを形成するコバルトおよびシアン化物発酵により産生される。よって合成ビタミンB12はシアン化物を含有する。これはごく少量だが、依然として体に対して毒性がある。このビタミンの一般的な合成形態、シアノコバラミンは、天然では発生しないが、その低コストを理由に、多数の医薬品および栄養補助食品において、ならびに食品添加物として用いられている。体内では、これはシアン化物の形成により、生理学的形態、メチルコバラミンおよびアデノシルコバラミンに変換される。シアン化物分子をビタミンから除去し、その後これを体外へ除去するには、(高濃度で心疾患を引き起こす)ホモシステイン濃度の低減のような他の重要な生理活性に必要な体内の分子の「メチル基」を用いる必要がある。より最近では、ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、およびアデノシルコバラミンは、より高価な薬理学的製品および栄養補助食品中に見られる。それらの追加の有用性については現在議論されている。
現行のB12の工業産生は選択された微生物の発酵による。ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)細菌は、長年ビタミンB12の商業的な供給源であった。今日より一般的に用いられているのは、シュードモナス・デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)およびプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)亜種シェルマニ(shermanii)である。これらの細菌種は収率を向上させる特別な条件下でたびたび増殖され、これらの種の一方または両方の遺伝子組み換えバージョンがいくつかの会社で使用されている。プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)の多数の種は外毒素または内毒素を生成せず、米国の食品医薬品局により一般的に安全とみなされ(GRAS認証を取得し)ているため、それらは現在FDAにとって好ましいビタミンB12産生のための細菌発酵生物である。
シアノコバラミンは細菌発酵により商業的に調製される。さまざまな微生物による発酵は、メチル−、ヒドロキソ−、およびアデノシルコバラミンの混合物をもたらす。これらの化合物は、亜硝酸ナトリウムおよび熱の存在下でのシアン化カリウムの添加により、シアノコバラミンに変換される。シアノコバラミンの経口使用は、呼吸困難、顔、唇、舌、または喉の腫れのようないくつかのアレルギー反応を引き起こし得る。それほど重篤でない副作用は、頭痛、嘔気、胃もたれ、下痢、関節痛、痒み、または発疹を含み得る。
いくつかの形態の貧血(例えば、巨赤芽球性貧血)の治療において、シアノコバラミンの使用は、貧血解消の際の細胞内カリウム移動により、死に至る場合もある重篤な低ナトリウム血症を引き起こし得る。ビタミンB12で治療される場合、レーベル病を有する患者は急速な視神経萎縮にかかり得る。アオウキクサ種は、世界中で見られる小さな浮葉性水生植物であり、波立たない栄養豊富で新鮮な汽水上で厚い毛布のようなマット状に増殖するものがよく見られる。それらは、間違えて藻と呼ばれることが多いが、植物科ウキクサ科に属する単子葉植物であり、高等植物、または大型植物と分類される。
アオウキクサ、またはウキクサ科(Lamnaceae)は、波立たないまたはゆっくり動く新鮮な水体および湿地の表面上またはそのすぐ下に浮く水生顕花植物である。ウキクサ属ウォルフィア(Wolffia)の花は、わずか0.3mm長で最も小さいことが知られる。
アオウキクサは、下水道、集約型畜産または集約型灌漑作物産生から生じる廃水から鉱物汚染物質を除去するというその大きな可能性のため、研究上注目を受けてきた。アオウキクサは、最適な増殖速度を得るには、管理、風からの保護、および最適な密度の維持を必要とする。世界の多くの地域において、アオウキクサは家畜および野生(家禽、魚、草食動物およびヒト)により消費される。最も小さいウキクサ(ウォルフィア・アリザ(Wolffia arrhiza))は、ミャンマー、ラオスおよびタイ北部の人々により栄養価の高い野菜として代々用いられている。アオウキクサは素晴らしいサラダの具となり、とてもおいしい。
ウキクサ(属種のほとんど)は、他の水生、陸生植物と比較しても、それらの増殖培地からのさまざまな鉱物(カチオンおよびアニオン)の高い結合能(固定)を有する。この特性は給水の清浄(水の脱汚染)に利用されるが、同時に、この特性はこうした植物をヒト食物代替物の供給源として用いる上で大きな制限となる。
共生的アオウキクサ−細菌培養物は、アオウキクサによる廃水からの栄養分除去(廃水処理)およびデンプン−バイオマス製造(エネルギー/化学原料の製造)を向上させるのに用いられてきた。(http://duckweed2013.rutgers.edu/presentations/16_toyama_tadashi.pdf)。内部共生的桿菌培養物からの抽出物によりコウキクサ(duckweed L.minor)に対する除草活性が示されたことがさらに報告された(K.Gebhardt,J.Schimana,J.Muller,H.P.Fiedler,H.G.Kallenborn,M.Holzenkampfer,P.Krastel,A.Zeeck,J.Vater,A.Holtzel,D.G.Schmid,J.RheinheimerおよびK.Dettner,Screening for biologically active metabolites with endosymbiotic bacilli isolated from arthropods.FEMS Microbiology Letters 217(2002)199−205。日本国特許第JPS6352960号公報(COLLECTING METHOD OF ALCOHOL AND METHANE BY WOLFFIA ARRHIZA AND DUCKWEED)は、光合成細菌および微細藻類を有機廃液中で培養し、得られた培養液にワムシおよびミジンコを添加し、ウォルフィア・アリザおよびアオウキクサをそれらとその間の食物連鎖の存在下で培養し、アオウキクサおよびウォルフィア・アリザのデンプン形成能力を利用することによる、デンプン形成植物体からのアルコールの発酵について教示する。
上記を踏まえ、ビタミンB12富化天然由来組成物およびその方法を提供するという、長い間満たされていない必要性が依然として存在する。
したがって、本発明の1つの目的は、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)組成物の製造方法であって、(a)少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、(b)少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、(c)ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(d)少なくとも1つのB12産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(e)DBC中のビタミンB12含有量を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(f)最も高いビタミンB12含有量を有するDBCにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するステップと、(g)所定の時間間隔でDBCを採取し、これによりビタミンB12富化DBC組成物をもたらすステップとを含む、方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、インキュベートするステップが、(i)少なくとも1つのウキクサ亜科種植物の最適な増殖、および(ii)これと関連したビタミンB12合成細菌の最適な発酵のために設計された所定の条件を選択するステップをさらに含む、上記で定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、インキュベートするステップが、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を、少なくとも1つの細菌種と少なくとも1つのウキクサ亜科種との関連をもたらす所定の条件下で増殖させるステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、関連を、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、接種するステップが、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種を回分または連続培養物として増殖させるステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、接種するステップが、一定体積の増殖培地を水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択するステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、接種するステップが、一定体積の増殖培地をプール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択するステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、インキュベートするステップが、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための所定の条件を、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、pH、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、鉱物を、Mg2+、Mn、Zn、Fe2+、Zn2+、Mn2+、CaCl2、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、水処理手順を、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、インキュベートするステップが、細菌種の共生的な発酵およびビタミンB12合成のための所定の条件を、約0.01〜3.0%w/vの範囲内の糖濃度、約0.01〜3.0%w/vの濃度範囲内のアミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、糖を、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、アミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源を、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、アミノ酸またはこれらの混合物を、L−アルギニンoHCl、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジンoHCloH2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシンoHCl、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン2Nao2H2O、L−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、微量元素を、塩化コリン、葉酸、myo−イノシトール、ナイアシンアミド、D−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、細菌を、P.アルギノーザ(P.aeruginosa)、P.フルオレッセンス(P.florescenza)、P.マリーナ(P.murina)のようなシュードモナス(Pseudomonas)種、バチルス(Bacillus)種、メタノバクテリウム(Methanobacterium)種、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)種、アセトバクテリウム(Acetobacterium)、エアロバクター(Aerobacter)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、アゾトバクター(Azotobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ミクロモノスポラ(Micromonospora)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、ノカルジア(Nocardia)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、プロトアミノバクター(Protaminobacter)、プロテウス(Proteus)、シュードモナス(Pseudomonas)、リゾビウム(Rhizobium)、サルモネラ(Salmonella)、セラチア(Serratia)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、キサントモナス(Xanthomonas)、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、決定するステップが、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種の時間に対する増殖曲線を決定し、少なくとも1つのウキクサ亜科種の最も高いバイオマスおよび少なくとも1つの細菌種の最も高い細菌細胞数により特徴付けられる時間間隔を特定するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、バイオマスを、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つのウキクサ亜科種を、ランドルティア(Landoltia)、レムナ(Lemna)、スピロデラ(Spirodela)、ウォルフィア(Wolffia)、ウォルフィエラ(Wolffiella)、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる属群に属する種から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つのウキクサ亜科種を、ウォルフィア・アングスタ(Wolffia angusta)、ウォルフィア・アリザ(Wolffia arrhiza)、ウォルフィア・アウストラリアナ(Wolffia australiana)、ウォルフィア・ボレアリス(Wolffia borealis)、ウォルフィア・ブラシリエンシス(Wolffia brasiliensis)、ウォルフィア・コロンビアナ(Wolffia Columbiana)、ウォルフィア・シリンドラセ(Wolffia cylindracea)、ウォルフィア・エロンガテ(Wolffia elongate)、ミジンコウキクサ(Wolffia globose)、ウォルフィア・ミクロスコピカ(Wolffia microscopica)、ウォルフィア・ネグレクタ(Wolffia neglecta)、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、DBC100g当たり約0.01〜約100μgのビタミンB12を含むビタミンB12富化DBC組成物をもたらすステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することである。
本発明のさらなる目的は、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)を含む組成物であって、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種を含み、さらに組成物中のビタミンB12含有量がDBC100g当たり約0.01〜約100μgの範囲内である、組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、組成物中のビタミンB12含有量が、ビタミンB12推奨1日摂取量(DV)の少なくとも20%の所定の割合である、上記で定義される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、組成物中のビタミンB12含有量が、1日当たり約0.4μg〜約3μgの範囲内の成人のビタミンB12推奨1日摂取量(RDI)標準に従う、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つのB12産生細菌種が少なくとも1つのウキクサ亜科種と関連している、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、関連が、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、B12産生細菌種が、P.アルギノーザ、P.フルオレッセンス、P.マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つのウキクサ亜科種が、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つのウキクサ亜科種が、ランドルティア、レムナ、スピロデラ、ウォルフィア、ウォルフィエラ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される属に属する、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つのウキクサ亜科種が、ウォルフィア・アングスタ、ウォルフィア・アリザ、ウォルフィア・アウストラリアナ、ウォルフィア・ボレアリス、ウォルフィア・ブラシリエンシス、ウォルフィア・コロンビアナ、ウォルフィア・シリンドラセ、ウォルフィア・エロンガテ、ミジンコウキクサ、ウォルフィア・ミクロスコピカ、ウォルフィア・ネグレクタ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)を含む組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、所定の条件が、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための条件、細菌種の発酵およびビタミンB12合成のための条件、ならびにこれらの組み合わせから選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、一定体積の増殖培地が回分または連続培養物である、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、一定体積の増殖培地が水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、一定体積の増殖培地が、プール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための所定の条件が、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、pH、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、鉱物が、Mg2+、Mn、Zn、Fe2+、Zn2+、Mn2+、CaCl2、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、水処理手順が、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、細菌種の発酵およびビタミンB12合成のための所定の条件が、約0.01〜3.0%w/vの範囲内の糖濃度、約0.01〜3.0%w/vの濃度範囲内のアミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、糖が、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、アミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源が、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、アミノ酸またはこれらの混合物が、L−アルギニンoHCl、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジンoHCloH2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシンoHCl、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン2Nao2H2O、L−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、微量元素が、塩化コリン、葉酸、myo−イノシトール、ナイアシンアミド、D−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することである。
本発明のさらなる目的は、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)組成物の製造システムであって、(a)一定体積の増殖培地での培養のための、ウキクサ亜科種の少なくとも1つの接種原およびビタミンB12産生細菌種の少なくとも1つの接種原と、(b)少なくとも1つのウキクサ亜科種接種原および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種接種原を、アオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす所定の条件下でインキュベートするための、インキュベーション手段と、(c)最も高いビタミンB12含有量を有するDBCにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するための手段と、(d)所定の時間間隔でDBCを採取し、これによりビタミンB12富化DBC組成物をもたらすための手段とを備える、システムを開示することである。
本発明のさらなる目的は、(a)ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、(b)少なくとも1つのB12産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、および(c)DBC中のビタミンB12含有量を所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段からなる群から選択される少なくとも1つのプロット手段をさらに備える、上記で定義されるシステムを開示することである。
本発明のさらなる目的は、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種のビタミンB12富化抽出物を含む組成物であって、さらに組成物中のビタミンB12含有量がDBC100g当たり約0.01〜約100μgの範囲内である、組成物を開示することである。
ここで図面を参照しながら本発明について説明する。
下記の説明では、本発明のさまざまな態様について記載する。本発明の十分な理解を提供するため、説明を目的として具体的な詳細を記載する。その本質的な性質に影響を及ぼすことなく、詳細が異なる本発明の他の実施形態が存在することは、当業者には明らかである。したがって本発明は、図面で例示され、明細書で説明されるものではなく、添付の特許請求の範囲において、この特許請求の範囲の最も広い解釈によってのみ決定される適切な範囲をもって、指示されるものとしてのみ限定される。
本発明の本質は、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)の、その培養、増殖および維持のための、新規アオウキクサ−細菌共生または関連システムおよびプロトコルの確立による、提供である。前述のシステムおよびプロトコルは、B12合成細菌の産生性の高い培養と組み合わせたアオウキクサバイオマスの最適な増殖のために設計される。ビタミンB12はアオウキクサにより、またはその中で産生することができないことが強調されるべきであるが、本発明によって、前述の細菌による合成後にアオウキクサ植物中に効果的に吸収またはアオウキクサバイオマスと関連させることができることが示される。得られたビタミンB12富化DBCは、ビタミンB12推奨1日摂取量(RDI)標準の所定の割合として、ヒト消費のための天然由来ビタミンB12供給源として用いられる。好ましくは、ビタミンB12富化DBC組成物は、DBC100g当たり約0.01μg〜約100μgのビタミンB12を含有する。
本発明は、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)組成物の製造方法であって、(a)少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、(b)少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、(c)ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(d)少なくとも1つのB12産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(e)DBC中のビタミンB12含有量を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(f)最も高いビタミンB12含有量を有するDBCにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するステップと、(g)所定の時間間隔でDBCを採取し、これによりビタミンB12富化DBC組成物をもたらすステップとを含む、方法を提供する。
本明細書において用いられるとおり、「約」の語は以下、参照値の25%下または上の範囲を指す。
「アオウキクサ」の語は以下、水および湿地の表面上またはそのすぐ下に浮く、水生顕花植物を指す。これらはサトイモAraceae)科に属し、したがってサトイモ科内のウキクサ(Lemnoideae)亜科と分類されることが多い。他の分類によると、これらは独立したウキクサ(Lemnaceae)科として分類される。
ウキクサ科の最も知られた属種を次に挙げる。
レムナ(LEMNA)(例えば、Lギバ(L gibba)、L.ディスペルマ(L.disperna)、Lギバ(L gibba)、Lジャポニカ(L japonica)、Lミニマ(L minima)、Lミノル(L minor)、Lミニスキュラ(L minuscula)、Lポーシコスタタ(L paucicostata)、Lペルプシラ(L perpusilla)、Lポリリザ(L polyrrhiza)、Lツリオニフェラ(L turionifera)、Lトリスルカ(L.trisulca)、Lヴァルジヴィアナ(L valdiviana))。
スピロデラ(SPIRODELA)(例えば、S.ビペルフォラタ(S.biperforata)、S.インテルメディア(S.intermedia)、S.オリゴリザ(S.oligorrhiza)、S.ポリリザ(S.polyrrhiza)、S.プンクタタ(S.punctata))。
ウォルフィア(WOLFFIA)(例えば、W.アリザ(W.arrhiza)、W.アウストラリアナ(W.australiana)、W.コロンビアナ(W.Columbiana)、W.ミクロスコピア(W.microscopia)、W.ネグレクタ(W.neglecta)、ウォルフィア・アングスタ(Wolffia angusta)、ウォルフィア・ボレアリス(Wolffia borealis)、ウォルフィア・ブラシリエンシス(Wolffia brasiliensis)、ウォルフィア・シリンドラセ(Wolffia cylindracea)、
ウォルフィア・エロンガタ(Wolffia elongata)、ウォルフィア・グロボサ(Wolffia globosa)、およびウォルフィア・ミクロスコピカ(Wolffia microscopica))。
ウォルフィエラ(WOLFFIELLA)(例えば、W.カウダタ(W.caudate)、W.デンティクラタ(W.denticulate)、W.リングラタ(W.lingulata)、W.オブロンガ(W.oblonga)、W.ロツンダ(W.rotunda))。
「新鮮重量」の語は以下、含水量が93〜97重量%の範囲内で含まれる、新鮮野菜の形態のアオウキクサ植物を指す。
「乾物重量」の語は以下、含水量が2〜8重量%の範囲内で含まれる、乾物野菜の形態のアオウキクサ植物を指す。
「ビタミンB12」の語は以下、B12またはビタミンB−12の語を指し、コバラミンとも呼ばれる。ビタミンB12は、適切な赤血球形成、神経機能、およびDNA合成に必要な水溶性ビタミンである。これは通常、特にDNA合成および制御に影響を及ぼすヒトの体の各細胞の代謝、また脂肪酸代謝およびアミノ酸代謝に関与する。ビタミンB12は、いくつかの形態で存在し、鉱物コバルトを含有するので、ビタミンB12活性を有する化合物は集合的に「コバラミン」と呼ばれる。
真菌も、植物または動物も、ビタミンB12を産生することができない。細菌および古細菌のみがその合成に必要な酵素を有するが、多くの食物は細菌共生によってB12の天然供給源である。このビタミンは、最も大きく最も構造的に複雑なビタミンであり、細菌発酵−合成によってのみ工業的に産生することができる。
メチルコバラミンおよび5−デオキシアデノシルコバラミンは、ヒト代謝において活性なビタミンB12の形態であることがさらに認識されている。
栄養補助食品において、ビタミンB12は通常、シアノコバラミン、体が活性形態メチルコバラミンおよび5−デオキシアデノシルコバラミンに容易に変換する形態として存在する。栄養補助食品は、メチルコバラミンおよびビタミンB12の他の形態を含有することもできる。しかしながら、栄養補助食品からビタミンB12を吸収する体の能力は、内因子の容量により大いに限定される。例えば、500mcgの経口栄養補助食品の約10mcgのみが実際に健康な人々に吸収される。
疑似ビタミン−B12とは、ヒトにおいて生物学的に不活性であり、ヒト、(動物を含む)多くの食物供給源、ならびにあるいは栄養補助食品および強化食品においてB12とともに存在が確認されている、B12様類似体を指す。
「ビタミンB12産生細菌種」の語は以下、それが発酵により細胞内または細胞外でビタミンB12を産生することができる細菌種を指す。本明細書では、下記属、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、およびキサントモナスの種はB12を合成することが知られることが認識されている。
ビタミンB12産生細菌種の非限定的な例として、P.アルギノーザ、P.フルオレッセンス、P.マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられることは、本発明の範囲内である。
「アオウキクサ細菌培養物」または「DBC」の語は以下、一定体積の増殖培地における少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種のいずれかのタイプの増殖を指す。前述の共培養は、本明細書に開示される、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種の間のいずれかのタイプの相互作用、関連または関連相互作用を含む。
本明細書において用いられる「関連相互作用」または「関連」または「共生」の語は一般的には以下、2つ以上の異なる生物種間の密接で長期の相互作用を指す。この語は、これらに限定されないが、共生、永続的な相利共生、および相利的、片利的、または寄生的な共生のような永続的な生物相互作用を含む、いずれかのタイプの種相互作用を指す。
特定の態様では、種間の関係は絶対的であり、両方の共生体が生存について完全に互いに依存していることを意味する。あるいは、それらは条件的であり、他の生物と共生することができるが、そうしなくてもよいことを意味する。種間の関係が、一方が他方の上で生活する関連、すなわち外部共生、または一方のパートナーが他方の内部で生活する関連、すなわち内部共生を含むことは、さらに本発明の範囲内である。より具体的には、内部共生とは、一方の共生体が他方の、細胞内または細胞外の、組織内で生活するいずれかの共生関係である。また、外部共生とは、共生体が、消化管または外分泌腺の導管の内表面を含む、宿主の体表上で生活する、いずれかの共生関係である。
ここで、両方の個体が利益を得る、異なる種の個体間の関係を指す、相利共生または種間の相互利他現象を参照する。相利共生的な関係とは、両種にとって絶対的であっても、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的でも、両種にとって条件的でもよい。特定の態様によると、相利的な共生中、宿主細胞は栄養素のいくつかを欠き、これは内部共生体により提供される。結果として、宿主は、いくつかの特殊化細胞を提供することにより、自身の内部での内部共生体の増殖プロセスを助け得る。これらの細胞は、増加する内部共生体数を制御するため、宿主の遺伝子組成に影響を及ぼし得、これらの遺伝子変化が垂直伝播によって子孫に継承されることを確保する。
ここで、一方が利益を得て、他方が顕著な危害も援助も受けない、2つの生体間の関係を表す、片利共生を参照する。
ここで、関連の一方のメンバーが利益を得て、他方が危害を受ける、寄生関係を参照する。この語は、敵対的または対立的な共生としても知られる。寄生的な共生が、宿主の体内で生活する内部寄生から、その体表上で生活する外部寄生まで多数の形態を含んでもよいことは、さらに本発明の範囲内である。また、寄生体が、その宿主を殺すことを意味する死体栄養性であっても、宿主の生存に依存することを意味する生体栄養性であってもよいことは、本発明の範囲内である。
ここで、一方の種が阻害または完全に抹消され、一方が影響を受けない場合に存在するタイプの関係である、片害作用を参照する。2つのタイプの片害作用、競争および抗生があることは、本発明の範囲内である。競争とは、より大きいまたは強い生物がより小さいまたは弱い生物から資源を奪う場合である。抗生とは、一方の生物がもう一方により化学分泌物によって損傷または殺傷される場合に起こる。
ここで、種間の相互作用が関与する両方の生物にとって有害である、共死を参照する。これは、相互作用が最終的には死をもたらすので、短命な条件である。
種間の相互作用または関連を生物の物理的な接続により分類してもよいことは、さらに本発明の範囲内である。生物が身体的な結合を有する相互作用は接続的と称され、結合していない相互作用は離接的な共生と称される。
「バイオマス」の語は以下、生物の総質量、すなわち所定の面積または体積の少なくとも1つのウキクサ亜科種を指し、体積、新鮮重量、乾物重量、またはアオウキクサ植物の増殖に関するいずれかの従来の測定値を指し得る。
「細菌数」の語は以下、細菌数のいずれかの定量決定または細菌増殖および細胞数の指数(バイオマス)を指す。これは、これらに限定されないが、細菌数を決定するための2つの広く用いられる方法、すなわち標準、または可変、平板計数法および分光光度(比濁)分析を含む。平板計数の非限定的な例は、コロニー形成単位(CFU)法である。分光光度(比濁)分析は培養物中の濁度の増加を参照してもよい。分光光度計を用いることにより、細胞数が増加すると透過光の量が減少する。透過光は電気エネルギーに変換され、これは検流計上に表示される。吸光度または光学密度と呼ばれる指示値は、間接的に細菌数を反映する。
「増殖培地」の語は以下、これらに限定されないが、約0.01〜3.0%w/vの範囲内の窒素、リン、カリウム、カルシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、マグネシウム、尿素、亜硝酸塩、硝酸塩、アンモニア、(デキストロース、グルコース、ラクトースのような)糖濃度、約0.01〜3.0%w/vの濃度範囲内の(酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物のような)アミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内の(L−アルギニンoHCl、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジンoHCloH2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシンoHCl、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン2Nao2H2O、L−バリンのような)アミノ酸またはこれらの混合物、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内の(塩化コリン、葉酸、myo−イノシトール、ナイアシンアミド、D−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムのような)微量元素、ビタミン、(NH4)2S04、Ca(NO3)2.4H2O、CaCl2.6H2O、CoCl2.6H2O、CoSO4.7H2O、CuCl2.2H2O、CuSO4.5H2O、FeCitrat、FeCl3.6H20、FeSO4.7H2O、FeTartrat、H2MoO4.4H2O、H3BO3、H3PO4、KI、K2HPO4、K2SO4、KCl、KH2PO4、KNO3、Mg(NO3)2、MgSO4.7H2O、MnCl2.4H2O、MnSO4.H2O、Na2MoO4.2H2O、NaCl、NH4H2PO4、NH4NO3、ZnSO4.7H2O、無機(NH4)2SO4、Ca(NO3)2.4H2O、CaCl2.6H2O、H3BO3、H3PO4、KCl、K2SO4、K2CO3、MgSO4.7H2O、Na2MoO4.2H2O、NaCl、NaHCO3、Fe−EDTA、Zn−EDTA、Cu−EDTA、肥料、尿素、Na2EDTA、ハトナー、ホーグランド−A、ホーグランド−B、Pirson、ホーグランド−C、スタインバーグ、シェンク・ヒルデブラント、ムラシゲ、およびこれらのいずれかの組み合わせのような成分を補充した水を指す。
いくつかの実施形態によると、増殖培地は、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、含水量および(脱窒、機械的、濾過のような)処理手順、照度、曝気、酸素濃度、pH、ならびにこれらのいずれかの組み合わせのような所定の条件およびパラメータを達成するように制御および操作される。
「食事摂取基準」もしくは「DRI」または「推奨1日摂取量」もしくは「RDI」の語は以下、健康な個体を維持するための必要量を満たすのに十分であると考えられる栄養素の1日摂取レベルに関するいずれかの標準を指す。RDI標準は、非限定的な例において、推奨食事許容量(RDA)、推定平均必要量(EAR)、適正摂取量(AI)、および上限摂取量(UL)標準を含み得る。
本明細書では、ビタミンB12食事摂取基準が1日当たり0.4〜約3μgの範囲内であることが認識されている。特定の実施形態では、成人のビタミンB12食事摂取基準は米国保健機関によると1日当たり約2〜約3μgの範囲内であり、英国保健機関によると1日当たり約1.5μgである。比較的新しい研究によると、DRIは1日当たり約4〜約7μgとするべきである。
ここで、ビタミンB12の現行RDAマイクログラム(mcg)をまとめる、表1を参照する。0〜12か月の乳児について、全米アカデミーズ(旧全米科学アカデミー)の医学研究所(IOM)の食品栄養委員会(FNB)は、健康な哺乳中の乳児におけるビタミンB12の平均摂取量に等しい、ビタミンB12の適正摂取量(AI)を確立した。
本発明の1つの実施形態により、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)組成物の製造方法であって、(a)少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、(b)少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、(c)ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(d)少なくとも1つのB12産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(e)DBC中のビタミンB12含有量を所定の条件で時間に対してプロットするステップと、(f)最も高いビタミンB12含有量を有するDBCにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するステップと、(g)所定の時間間隔でDBCを採取し、これによりビタミンB12富化DBC組成物をもたらすステップとを含む方法が開示される。
インキュベートするステップが、(i)少なくとも1つのウキクサ亜科種植物の最適な増殖、および(ii)これと関連したビタミンB12合成細菌の最適な発酵のために設計された所定の条件を選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
インキュベートするステップが、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を、少なくとも1つの細菌種と少なくとも1つのウキクサ亜科種との関連をもたらす所定の条件下で増殖させるステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
関連を、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
接種するステップが、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種を回分または連続培養物として増殖させるステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
接種するステップが、一定体積の増殖培地を水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択するステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
接種するステップが、一定体積の増殖培地をプール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択するステップを含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
インキュベートするステップが、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための所定の条件を、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、pH、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
鉱物を、Mg2+、Mn、Zn、Fe2+、Zn2+、Mn2+、CaCl2、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
水処理手順を、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
インキュベートするステップが、細菌種の共生的な発酵およびビタミンB12合成のための所定の条件を、約0.01〜3.0%w/vの範囲内の糖濃度、約0.01〜3.0%w/vの濃度範囲内のアミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
糖を、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
アミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源を、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
アミノ酸またはこれらの混合物を、L−アルギニンoHCl、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジンoHCloH2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシンoHCl、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン2Nao2H2O、L−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
微量元素を、塩化コリン、葉酸、myo−イノシトール、ナイアシンアミド、D−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
細菌を、P.アルギノーザ、P.フルオレッセンス、P.マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
決定するステップが、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種の時間に対する増殖曲線を決定し、少なくとも1つのウキクサ亜科種の最も高いバイオマスおよび少なくとも1つの細菌種の最も高い細菌細胞数により特徴付けられる時間間隔を特定するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
バイオマスを、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
少なくとも1つのウキクサ亜科種を、ランドルティア、レムナ、スピロデラ、ウォルフィア、ウォルフィエラ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる属群に属する種から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
少なくとも1つのウキクサ亜科種を、ウォルフィア・アングスタ、ウォルフィア・アリザ、ウォルフィア・アウストラリアナ、ウォルフィア・ボレアリス、ウォルフィア・ブラシリエンシス、ウォルフィア・コロンビアナ、ウォルフィア・シリンドラセ、ウォルフィア・エロンガテ、ミジンコウキクサ、ウォルフィア・ミクロスコピカ、ウォルフィア・ネグレクタ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
DBC100g当たり約0.01〜約100μgのビタミンB12を含むビタミンB12富化DBC組成物をもたらすステップをさらに含む、上記のいずれかにおいて定義される方法を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
本発明は、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)を含む組成物であって、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種を含み、さらに組成物中のビタミンB12含有量がDBC100g当たり約0.01〜約100μgの範囲内である、組成物をさらに提供する。
1つの実施形態により、組成物中のビタミンB12含有量が、ビタミンB12推奨1日摂取量(DV)の少なくとも20%の所定の割合である、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
1つの実施形態により、組成物中のビタミンB12含有量が、1日当たり約0.4μg〜約3μgの範囲内の成人のビタミンB12推奨1日摂取量(RDI)標準に従う、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
別の実施形態により、少なくとも1つのB12産生細菌種が少なくとも1つのウキクサ亜科種と関連している、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
別の実施形態により、関連が、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
別の実施形態により、B12産生細菌種が、P.アルギノーザ、P.フルオレッセンス、P.マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
別の実施形態により、少なくとも1つのウキクサ亜科種が、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
別の実施形態により、少なくとも1つのウキクサ亜科種が、ランドルティア、レムナ、スピロデラ、ウォルフィア、ウォルフィエラ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される属に属する、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
別の実施形態により、少なくとも1つのウキクサ亜科種が、ウォルフィア・アングスタ、ウォルフィア・アリザ、ウォルフィア・アウストラリアナ、ウォルフィア・ボレアリス、ウォルフィア・ブラシリエンシス、ウォルフィア・コロンビアナ、ウォルフィア・シリンドラセ、ウォルフィア・エロンガテ、ミジンコウキクサ、ウォルフィア・ミクロスコピカ、ウォルフィア・ネグレクタ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される組成物が開示される。
上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)を含む組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
所定の条件が、ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための条件、細菌種の発酵およびビタミンB12合成のための条件、ならびにこれらの組み合わせから選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
一定体積の増殖培地が回分または連続培養物である、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
一定体積の増殖培地が水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
一定体積の増殖培地が、プール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための所定の条件が、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、pH、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
鉱物が、Mg2+、Mn、Zn、Fe2+、Zn2+、Mn2+、CaCl2、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
水処理手順が、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
細菌種の発酵およびビタミンB12合成のための所定の条件が、約0.01〜3.0%w/vの範囲内の糖濃度、約0.01〜3.0%w/vの濃度範囲内のアミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
糖が、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
アミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源が、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
アミノ酸またはこれらの混合物が、L−アルギニンoHCl、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジンoHCloH2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシンoHCl、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン2Nao2H2O、L−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
微量元素が、塩化コリン、葉酸、myo−イノシトール、ナイアシンアミド、D−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記のいずれかにおいて定義される方法により製造される組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)組成物の製造システムであって、(a)一定体積の増殖培地での培養のための、ウキクサ亜科種の少なくとも1つの接種原およびビタミンB12産生細菌種の少なくとも1つの接種原と、(b)少なくとも1つのウキクサ亜科種接種原および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種接種原を、アオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす所定の条件下でインキュベートするための、インキュベーション手段と、(c)最も高いビタミンB12含有量を有するDBCにより特徴付けられるプロット内で時間間隔を決定するための手段と、(d)所定の時間間隔でDBCを採取し、これによりビタミンB12富化DBC組成物をもたらすための手段とを備えるシステムを開示することは、さらに本発明の範囲内である。
(a)ウキクサ亜科植物バイオマスを所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、(b)少なくとも1つのB12産生細菌種の細菌数を所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、および(c)DBC中のビタミンB12含有量を所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段
からなる群から選択される少なくとも1つのプロット手段をさらに備える、上記で定義されるシステムを開示することは、さらに本発明の範囲内である。
からなる群から選択される少なくとも1つのプロット手段をさらに備える、上記で定義されるシステムを開示することは、さらに本発明の範囲内である。
少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種のビタミンB12富化抽出物を含む組成物であって、さらに組成物中のビタミンB12含有量がDBC100g当たり約0.01〜約100μgの範囲内である、組成物を開示することは、さらに本発明の範囲内である。
ここで、従来技術において知られる典型的な細菌増殖曲線または動的曲線を示す、図1を参照する。この曲線は一般的には、選択された増殖培地への細菌の接種後の時間に対する細菌増殖期を表す。明らかなとおり、増殖曲線における第1段階は、誘導期と呼ばれる適応期間である。誘導期中、細菌は増殖培地に適応する。これは、個別の細菌が成熟中であり、まだ分裂できない期間である。細菌増殖サイクルの誘導期中は、RNA、酵素および他の分子の合成が起こる。
誘導期後、生物の増殖速度は順調に増加する。この期間は対数期である。対数期は細胞複製により特徴付けられる期間である。複製速度は特定の細胞数に比例する。増殖が制限されない場合、倍加は一定の速度で継続するので、細胞数および細胞数増加速度の両方は、連続時間毎に倍加する。このタイプの対数増殖について、時間に対して細胞数の自然対数をプロットし、直線をもたらす。この線の傾斜は生物の比増殖速度であり、単位時間当たりの細胞毎の分裂数の指標である。この増殖の実際の速度(すなわち図の線の傾斜)は、細胞分裂事象の頻度および両娘細胞の生存可能性に影響を及ぼす、増殖条件に依存する。対数増殖は、培地の栄養素が枯渇し、廃棄物が豊富になるので、無限に継続することはできない。
よって、特定の時間の対数期後、栄養素の濃度の連続的な低下および/または毒性物質の濃度の連続的な増加(蓄積)のため、増殖速度は遅くなる。増殖増加が停止するこの期は、静止または定常期と呼ばれる。バイオマスは、培養物中の特定の蓄積された化学物質が細胞を溶解する場合(化学分解)を除き、一定のままである。よって、静止期は、必須栄養素の枯渇のような増殖限定因子、および/または有機酸のような阻害生成物の形成による。静止期は、増殖速度および死滅速度が等しい状況からもたらされる。作製された新しい細胞の数は増殖因子により制限され、結果として細胞増殖速度は細胞死滅速度と一致する。曲線の水平直線部が静止期中の結果である。
他の微生物が培養物を汚染しない限り、化学構成は変わらないままである。培地中の栄養素のすべてが消費される場合、または毒素の濃度が高すぎる場合、細胞は老化し、死滅しはじめ得る。この死滅期において、バイオマスの総量は低下しない場合があるが、生存生物の数は低下する。死滅期では、(死滅期)細菌は死滅する。これは栄養素の欠如、高すぎるまたは低すぎる温度、等のためであり得る。
本発明の主要な態様によると、高い細菌ビタミンB12濃度の時間間隔は、図1に例示される細菌増殖曲線に従って特定されている。より高いビタミンB12濃度の期間は、栄養素の濃度の連続的な低下および/または毒性物質の濃度の連続的な増加(蓄積)によって増殖速度が遅くなる、対数期および静止期の間の間隔で特定されることがわかる。この間隔で、増殖速度の増加が確認される。より高いビタミンB12濃度の別の期間または時間間隔は、静止期の終了および死滅期の開始前の間で特定される。
ここで、本発明の一実施形態として、例示的なアオウキクサ−細菌培養物(DBC)増殖曲線またはプロファイルを示す、図2を参照する。少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種が、(i)ウキクサ亜科種バイオマスの最大有効な増殖、ならびに(ii)細菌種の最大かつ有効な発酵およびビタミンB12合成のための所定の条件下で増殖されることは、本発明の範囲内である。図示されるとおり、最大B12産生およびアオウキクサバイオマスの時間間隔が特定される。これらの時間間隔は、最大DBCB12産生により特徴付けられる。換言すると、これらの時間間隔で、富化ビタミンB12濃度を有するDBCが採取される。この栄養価の高いビタミンB12供給源は、ヒト消費のための高濃度の天然ビタミンB12により特徴付けられる新鮮または乾燥物質として用いてもよい。
ここで、本発明の一実施形態として、例示的なアオウキクサ−細菌培養物(DBC)増殖曲線またはプロファイルを示す、図2を参照する。少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種が、(i)ウキクサ亜科種バイオマスの最大有効な増殖、ならびに(ii)細菌種の最大かつ有効な発酵およびビタミンB12合成のための所定の条件下で増殖されることは、本発明の範囲内である。図示されるとおり、最大B12産生およびアオウキクサバイオマスの時間間隔が特定される。これらの時間間隔は、最大DBCB12産生により特徴付けられる。換言すると、これらの時間間隔で、富化ビタミンB12濃度を有するDBCが採取される。この栄養価の高いビタミンB12供給源は、ヒト消費のための高濃度の天然ビタミンB12により特徴付けられる新鮮または乾燥物質として用いてもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、上記DBC中のビタミンB12含有量は、ビタミンB12食事摂取基準(DRI)標準の所定の割合である。
本発明の他の実施形態では、上記DBC中のビタミンB12含有量は、ビタミンB12の1日摂取量(DV)の所定の割合である。
本明細書では、ビタミンB12および他の栄養素の推奨摂取量は、全米アカデミーズの医学研究所(IOM)の食品栄養委員会(FNB)により開発された、食事摂取基準(DRI)で提供されると認識されている。「DRI」の語は、本明細書では一般的には、健康な人々の栄養摂取を計画、評価するのに用いられる一連の基準値を指す。これらの値は、年齢および性別によって異なり、下記を含む。
ほぼすべて(97%〜98%)の健康な個体の栄養所要量を満たすのに十分な平均1日摂取レベルと定義される、推奨食事許容量(RDA)。
RDAを展開するには証拠が不十分である場合に確立され、適正栄養量を確保すると仮定されるレベルで設定される、適正摂取量(AI)。
健康への悪影響を引き起こす可能性の低い最大1日摂取量と定義される、許容上限摂取量(UL)。
成人のビタミンB12の食事摂取基準(DRI)は、米国では1日当たり0.4〜3μgの範囲内であり、英国では1日当たり約1.5μgであることがさらに認識されている。しかし最近の研究によると、DRIは1日当たり4〜7μgとするべきである。なお、食品安全応用栄養センターは、成人および4歳以上の子どもについて、2,000カロリーのカロリー摂取量に基づき、1日当たり6μgを推奨している。
ビタミンB12は、推奨食事許容量(RDA)を超えない量で経口使用される場合、安全であると考えられることがさらに知られている。
いくつかの態様によると、ビタミンB12推奨食事許容量(RDA)は、14歳以上について1日2.4マイクログラムであり、妊娠中の女性について1日2.6マイクログラムであり、授乳中の女性について1日2.8マイクログラムである。50歳を超える年齢の成人は、B12強化食品を食べる、またはビタミンB12サプリメントを摂ることにより、RDAを満たすべきである。高齢の人々においてビタミンB12レベルを維持するためには、1日25〜100マイクログラムの補足が用いられていることが報告された。
ここでビタミンB12の1日摂取量(DV)を参照する。本明細書では、DVは、消費者が標準的な1食分中のさまざまな栄養素のレベルをそのおよそ必要量に関して決定するのを助けるため、米国食品医薬品局(FDA)により開発されたことが認識されている。ビタミンB12のDVは6.0mcgである。しかしながら、FDAは、食品がこの栄養素で強化されてない限り、食品ラベルにビタミンB12含有量を含めることを求めていない。DVの20%以上をもたらす食品は、栄養素の高または富化供給源であると考えられるが、もたらすDVの割合が低い食品も健康的な食事に貢献している。
本発明は、予め設計された条件でアオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす、少なくとも1つのウキクサ亜種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を含むビタミンB12富化アオウキクサバイオマス組成物の製造手段および方法を提供する。ビタミンB12富化組成物は、1日当たり約0.4mcg〜約3mcgの推奨ビタミンB12食事摂取基準(DRI)を満たすため、所定の用量の上記組成物を1日当たり1回以上摂取することにより消費することができる。
特定の態様によると、本発明の組成物は、ビタミンB12DVの20%以上をもたらし、よってこの重要な栄養素の高または富化供給源であると考えられる。
他の態様によると、本発明の組成物は、DBC100g当たり約0.01〜約100μgのビタミンB12を含む。
上述したとおり、ビタミンB12富化組成物が、単回用量の組成物中で高濃度のビタミンB12を得るため、好ましくは乾燥物質として提供されることは、本発明の範囲内である。
Claims (46)
- ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)組成物の製造方法であって、
a.少なくとも1つのウキクサ(Lemnoideae)亜科種および少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を一定体積の増殖培地に接種するステップと、
b.前記少なくとも1つのウキクサ亜科種および前記少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を、アオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす所定の条件下でインキュベートするステップと、
c.ウキクサ亜科植物バイオマスを前記所定の条件で時間に対してプロットするステップと、
d.前記少なくとも1つのB12産生細菌種の細菌数を前記所定の条件で時間に対してプロットするステップと、
e.前記DBC中のビタミンB12含有量を前記所定の条件で時間に対してプロットするステップと、
f.最も高いビタミンB12含有量を有するDBCにより特徴付けられる前記プロット内で時間間隔を決定するステップと、
g.前記所定の時間間隔で前記DBCを採取し、これによりビタミンB12富化DBC組成物をもたらすステップと、を含む、方法。 - 前記インキュベートするステップが、(i)前記少なくとも1つのウキクサ亜科種植物の最適な増殖、および(ii)これと関連した前記ビタミンB12合成細菌の最適な発酵のために設計された前記所定の条件を選択するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップが、前記少なくとも1つのウキクサ亜科種および前記少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種を、前記少なくとも1つの細菌種と前記少なくとも1つのウキクサ亜科種との関連をもたらす所定の条件下で増殖させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記関連を、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 前記接種するステップが、前記少なくとも1つのウキクサ亜科種および前記少なくとも1つのB12産生細菌種を回分または連続培養物として増殖させるステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記接種するステップが、前記一定体積の増殖培地を水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記接種するステップが、前記一定体積の増殖培地をプール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップが、前記ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための前記所定の条件を、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、pH、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記鉱物を、Mg2+、Mn、Zn、Fe2+、Zn2+、Mn2+、CaCl2、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記水処理手順を、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップが、前記細菌種の共生的な発酵およびビタミンB12合成のための前記所定の条件を、約0.01〜3.0%w/vの範囲内の糖濃度、約0.01〜3.0%w/vの濃度範囲内のアミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記糖を、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記アミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源を、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記アミノ酸またはこれらの混合物を、L−アルギニンoHCl、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジンoHCloH2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシンoHCl、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン2Nao2H2O、L−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記微量元素を、塩化コリン、葉酸、myo−イノシトール、ナイアシンアミド、D−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記細菌を、P.アルギノーザ(P.aeruginosa)、P.フルオレッセンス(P.florescenza)、P.マリーナ(P.murina)のようなシュードモナス(Pseudomonas)種、バチルス(Bacillus)種、メタノバクテリウム(Methanobacterium)種、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)種、アセトバクテリウム(Acetobacterium)、エアロバクター(Aerobacter)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、アゾトバクター(Azotobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ミクロモノスポラ(Micromonospora)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、ノカルジア(Nocardia)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、プロトアミノバクター(Protaminobacter)、プロテウス(Proteus)、シュードモナス(Pseudomonas)、リゾビウム(Rhizobium)、サルモネラ(Salmonella)、セラチア(Serratia)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、キサントモナス(Xanthomonas)、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記決定するステップが、前記少なくとも1つのウキクサ亜科種および前記少なくとも1つのB12産生細菌種の時間に対する増殖曲線を決定し、前記少なくとも1つのウキクサ亜科種の最も高いバイオマスおよび前記少なくとも1つの細菌種の最も高い細菌細胞数により特徴付けられる時間間隔を特定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記バイオマスを、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのウキクサ亜科種を、ランドルティア(Landoltia)、レムナ(Lemna)、スピロデラ(Spirodela)、ウォルフィア(Wolffia)、ウォルフィエラ(Wolffiella)、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる属群に属する種から選択するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのウキクサ亜科種を、ウォルフィア・アングスタ(Wolffia angusta)、ウォルフィア・アリザ(Wolffia arrhiza)、ウォルフィア・アウストラリアナ(Wolffia australiana)、ウォルフィア・ボレアリス(Wolffia borealis)、ウォルフィア・ブラシリエンシス(Wolffia brasiliensis)、ウォルフィア・コロンビアナ(Wolffia Columbiana)、ウォルフィア・シリンドラセ(Wolffia cylindracea)、ウォルフィア・エロンガテ(Wolffia elongate)、ミジンコウキクサ(Wolffia globose)、ウォルフィア・ミクロスコピカ(Wolffia microscopica)、ウォルフィア・ネグレクタ(Wolffia neglecta)、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記DBC100g当たり約0.01〜約100μgのビタミンB12を含むビタミンB12富化DBC組成物をもたらすステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)を含む組成物であって、少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種を含み、さらに前記組成物中の前記ビタミンB12含有量が前記DBC100g当たり約0.01〜約100μgの範囲内である、組成物。
- 前記組成物中の前記ビタミンB12含有量が、ビタミンB12推奨1日摂取量(DV)の少なくとも20%の所定の割合である、請求項22に記載の組成物。
- 前記組成物中の前記ビタミンB12含有量が、1日当たり約0.4μg〜約3μgの範囲内の成人のビタミンB12推奨1日摂取量(RDI)標準に従う、請求項22に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのB12産生細菌種が前記少なくとも1つのウキクサ亜科種と関連している、請求項22に記載の組成物。
- 前記関連が、共生的な相互作用、永続的な相利共生、永続的な生物相互作用、相利共生、種間の相互利他現象、片利的な相互作用、寄生的な共生、絶対的な相互作用、条件的な相互作用、両種にとって絶対的なもの、一方にとって絶対的だが他方にとって条件的なもの、両種にとって条件的なもの、外部共生、内部共生、片利的な外部共生、相利的な外部共生、外部寄生、接続的な共生、離接的な共生、敵対的または対立的な共生または関係、死体栄養性相互作用、生体栄養性相互作用、片害作用、競争関係、抗生関係、共死、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項22に記載の組成物。
- 前記B12産生細菌種が、P.アルギノーザ、P.フルオレッセンス、P.マリーナのようなシュードモナス種、バチルス種、メタノバクテリウム種、プロピオニバクテリウム種、アセトバクテリウム、エアロバクター、アグロバクテリウム、アルカリゲネス、アゾトバクター、クロストリジウム、フラボバクテリウム、ラクトバチルス、ミクロモノスポラ、マイコバクテリウム、ノカルジア、プロピオニバクテリウム、プロトアミノバクター、プロテウス、シュードモナス、リゾビウム、サルモネラ、セラチア、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、キサントモナス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項22に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのウキクサ亜科種が、全ウキクサ亜科種バイオマス、新鮮ウキクサ亜科種バイオマス、乾物ウキクサ亜科種バイオマス、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項22に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのウキクサ亜科種が、ランドルティア、レムナ、スピロデラ、ウォルフィア、ウォルフィエラ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される属に属する、請求項22に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのウキクサ亜科種が、ウォルフィア・アングスタ、ウォルフィア・アリザ、ウォルフィア・アウストラリアナ、ウォルフィア・ボレアリス、ウォルフィア・ブラシリエンシス、ウォルフィア・コロンビアナ、ウォルフィア・シリンドラセ、ウォルフィア・エロンガテ、ミジンコウキクサ、ウォルフィア・ミクロスコピカ、ウォルフィア・ネグレクタ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項22に記載の組成物。
- 請求項1に記載の方法により製造される、ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)を含む組成物。
- 前記所定の条件が、前記ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための条件、前記細菌種の発酵およびビタミンB12合成のための条件、ならびにこれらの組み合わせから選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記一定体積の増殖培地が回分または連続培養物である、請求項31に記載の組成物。
- 前記一定体積の増殖培地が水系植物増殖設備および微生物増殖設備からなる群から選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記一定体積の増殖培地が、プール、チャネル、アクアリウム、ファーメンタ、バイオリアクタ、コブル、およびいずれかの他の基質からなる群から選択される、請求項31に記載の組成物。
- 前記ウキクサ亜科種バイオマスの増殖のための前記所定の条件が、増殖培地の鉱物組成、増殖培地の鉱物濃度、尿素濃度、亜硝酸塩および硝酸塩濃度、総アンモニア濃度、増殖培地の温度範囲、雰囲気の温度範囲、水処理手順、照度、曝気、酸素濃度、pH、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項32に記載の組成物。
- 前記鉱物が、Mg2+、Mn、Zn、Fe2+、Zn2+、Mn2+、CaCl2、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項36に記載の組成物。
- 前記水処理手順が、脱窒、機械的、濾過、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項36に記載の組成物。
- 前記細菌種の発酵およびビタミンB12合成のための前記所定の条件が、約0.01〜3.0%w/vの範囲内の糖濃度、約0.01〜3.0%w/vの濃度範囲内のアミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内のアミノ酸またはこれらの混合物、約0.0001〜0.3g/lの濃度範囲内の微量元素、ビタミン、ならびにこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項32に記載の組成物。
- 前記糖が、デキストロース、グルコース、ラクトース、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項39に記載の組成物。
- 前記アミノ酸および/またはペプチドおよび/またはビタミン供給源が、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、ゼラチンの酵素消化物、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項39に記載の組成物。
- 前記アミノ酸またはこれらの混合物が、L−アルギニンoHCl、L−システイン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジンoHCloH2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシンoHCl、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン2Nao2H2O、L−バリン、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項39に記載の組成物。
- 前記微量元素が、塩化コリン、葉酸、myo−イノシトール、ナイアシンアミド、D−パントテン酸ヘミカルシウム、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項39に記載の組成物。
- ビタミンB12富化アオウキクサ細菌培養物(DBC)組成物の製造システムであって、
a.一定体積の増殖培地での培養のための、ウキクサ亜科種の少なくとも1つの接種原およびビタミンB12産生細菌種の少なくとも1つの接種原と、
b.前記少なくとも1つのウキクサ亜科種接種原および前記少なくとも1つのビタミンB12産生細菌種接種原を、アオウキクサ細菌培養物(DBC)をもたらす所定の条件下でインキュベートするための、インキュベーション手段と、
c.最も高いビタミンB12含有量を有するDBCにより特徴付けられる前記プロット内で時間間隔を決定するための手段と、
d.前記所定の時間間隔で前記DBCを採取し、これによりビタミンB12富化DBC組成物をもたらすための手段と、を備える、システム。 - a.ウキクサ亜科植物バイオマスを前記所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、
b.前記少なくとも1つのB12産生細菌種の細菌数を前記所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段、および
c.前記DBC中のビタミンB12含有量を前記所定の条件で時間に対してプロットするための、プロット手段
からなる群から選択される少なくとも1つのプロット手段をさらに備える、請求項44に記載のシステム。 - 少なくとも1つのウキクサ亜科種および少なくとも1つのB12産生細菌種のビタミンB12富化抽出物を含む組成物であって、さらに前記組成物中の前記ビタミンB12含有量が前記DBC100g当たり約0.01〜約100μgの範囲内である、組成物。
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