CN103548571A - 一种高产酸性多糖的虫草菌丝体的培养方法及酸性多糖 - Google Patents

一种高产酸性多糖的虫草菌丝体的培养方法及酸性多糖 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产酸性多糖的虫草菌丝体的培养方法及酸性多糖。属于医药领域，培养方法的特征在于，取种子液于液体养基中(含0.03-1230ug/mL盐)，在15℃-28℃条件下，培养10-14天。酸性多糖中包含中性糖，氨基糖和糖醛酸，总多糖的含量不少于85％，糖醛酸占总糖的质量百分比为4.68-16.8％，硫酸根占总糖的质量百分比为1.56-11％，多糖的重均分子量为30KD-6000KD，其中50KD以下的多糖含量不少于60％。用本发明方法培养出的菌丝体中酸性多糖抗血管活性强，培养原料来源丰富，培养成本低，发酵温度容易达到，具有较大的经济价值。

Description

一种高产酸性多糖的虫草菌丝体的培养方法及酸性多糖
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种高产酸性多糖的虫草菌丝体的培养方法及酸性多糖。
背景技术
冬虫夏草(Cordyceps)，又名虫草、冬虫草、夏草冬虫。属于真菌界，真菌门，子囊菌纲，肉座菌目，麦角菌科，虫草属。主要分布在我国青海、西藏、四川、云南、贵州、甘肃海拔4000米左右的高海拔地区。天然虫草生长环境特殊，价格较高，人们已用生物发酵技术培养虫草菌丝体来替代冬虫夏草。其成分、药用价值与冬虫夏草类似，具有抗炎，抗氧化，抗流感病毒，免疫调节，降血糖，抗肿瘤和抗血管生成等活性，是冬虫夏草的理想代用品，菌丝体中的虫草多糖药用价值很高，主要由甘露糖，葡萄糖和半乳糖组成。
现研究的酸性多糖(如含有糖醛酸和/或硫酸根)的活性有很多，其中抗血管生成活性与酸性多糖中的糖醛酸和硫酸根有关。现有技术中已经报道如果将岩藻糖过硫酸化，可以增加岩藻糖本身的抗血管及抗肿瘤的能力。众所周知，若没有血液供应，肿瘤细胞由于缺血缺氧会发生死亡，肿瘤尺寸不会超过2-3mm3。在化疗间期肿瘤细胞加速再增殖过程中，若给予抗血管生成治疗可抑制残存肿瘤细胞的再增殖，可达到提高化疗药物治疗效果，延缓疾病进展的目的。
目前，多数的报道集中在虫草多糖的提取方法，虫草的培养条件，通过改变培养条件，提高虫草中的某一种活性成分如虫草多糖、虫草素等的含量。如专利CN201210353679公开了一种从蛹虫草提取虫草素和多糖的方法。专利CN200910093938公开了一种蛹虫草菌种的培养方法。专利CN201110184265公开了一种以青稞为主要原料培养蛹虫草的方法，使蛹虫草的有效成分虫草素的含量由现有的0.5％提高到1％，虫草酸含量由现有的6.1％提高到9％，虫草多糖含量由现有的7.4％提高到10.5％，蛹虫草的有效成分含量总提高200-250％。只有少数报道中提到糖醛酸的存在，目前没有关于虫草中硫酸多糖存在的报道。用现有的培养方法培养的菌丝体，其虫草多糖的抗血管活性并不理想。
发明内容
本发明涉及一种高产酸性多糖的虫草菌丝体的培养方法，培养出的虫草菌丝体产品中含有较高浓度的酸性多糖，与普通培养基培养的多糖相比糖醛酸含量提高了0.12-2.99倍，硫酸根含量提高了0.44-9.19倍。该酸性多糖的抗血管生成活性比普通培养方法得到的多糖活性提高了0.1-4倍，并且培养温度易达到，培养原料来源丰富，培养成本低，适合任何虫草菌丝体，具有较高的应用价值和较好的市场前景。
实现上述发明目的的技术方法是：
1.一种培养高产酸性多糖的虫草菌丝体的方法，具体包括如下步骤：
(1)菌株扩增：采用固体培养基将菌株扩增；
(2)种子液培养：从固体培养基上挑取菌丝体于液体培养基中培养；
(3)发酵培养：取种子液于液体养基中(含0.03-1230ug/mL盐)，在15℃-28℃条件下，培养10-14天；
所述的盐包括MgCl2、MnCl2、KCl、NaCl、Na2SO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4中的一种或几种的混合物。
2.进一步地，步骤(3)中盐的含量为170-610ug/mL，培养温度为16℃-23℃或25℃-28℃。
3.更进一步地步骤(3)中盐的含量为210-500ug/mL，培养温度为27℃或19℃。
4.以该方法培养出的菌丝体，其中的酸性多糖，其特征在于，酸性多糖中包含中性糖，氨基糖和糖醛酸，总多糖的含量不少于85％，糖醛酸占总糖的质量百分比为4.68-16.8％，硫酸根占总糖的质量百分比为1.56-11％，多糖的重均分子量为30KD-6000KD，其中50KD以下的多糖含量不少于60％；
所述的中性糖包含甘露糖，葡萄糖，半乳糖，木糖，鼠李糖和阿拉伯糖；
所述的氨基糖包含葡萄糖胺；
所述的糖醛酸包含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益技术效果：
(1)本发明涉及的培养虫草菌丝体的培养方法，发酵温度接近室温，容易达到，培养原料来源丰富，培养成本低，易于大规模培养，具有较大的经济价值。
(2)由本发明所述培养方法培养出的菌丝体高产酸性多糖，多糖中糖醛酸和硫酸根含量高，与普通培养基培养的多糖相比糖醛酸含量提高了0.12-2.99倍，硫酸根含量提高了0.44-9.19倍，经细胞实验研究表明该酸性多糖比普通培养方法得到的多糖抗血管生成活性提高了0.1-4倍。
(3)用本发明方法培养出的菌丝体可作为冬虫夏草的替代品，保护了天然虫草资源，从根本上解决了野生冬虫夏草资源缺少的问题。
(4)本发明方法适用于任何菌丝体，应用范围广。
附图说明
图1是酸性多糖糖醛酸含量测定结果。
图2是酸性多糖的分子量及分子量分布测定结果。
图3是酸性多糖单糖组成测定结果。
图4是酸性多糖的红外光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细阐述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例所用的虫草菌株均选用蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)，菌种编号3.7845，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例1
菌株扩增：采用PDA固体培养基将菌株扩增，27℃，培养7天；
种子液培养：从固体培养基上挑取菌丝体于150mL马铃薯液体培养基中，放摇床上180r/min，27℃，培养10天；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有170ug/mL MgCl2)，23℃，培养10天。
实施例2
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有0.03ug/mL MgCl2)，28℃，培养10天。
实施例3
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有0.09ug/mLMnCl2和0.05ug/mL KCl)，15℃，培养14天。
实施例4
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有520ug/mLKCl)，26℃，培养14天。
实施例5
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有210ug/mLNaCl)，27℃，培养14天。
实施例6
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有500ug/mLNa2SO4)，19℃，培养10天。
实施例7
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养；取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有1230ug/mL K2SO4)，15℃，培养12天。
实施例8
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有610ug/mL K2SO4)，25℃，培养12天。
实施例9
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有850ug/mL MgSO4)，24℃，培养12天。
实施例10
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中(含有600ug/mL MnSO4)，16℃，培养10天。
实施例11
菌株扩增与种子液培养步骤同实施例1；
发酵培养：取6mL种子液于200mL马铃薯液体养基中，培养基中不含盐，27℃，培养10天。
将实施例1-11每种条件培养2瓶，培养出的虫草菌丝体分别按照下列提取方法提取多糖。
(1)脱脂：将同一条件培养液合并，悬蒸浓缩至1/4体积，加入4倍无水乙醇脱脂，80℃回流3h，冷却后离心10min，取沉淀，再加入5倍80％乙醇脱脂，反复三次，烘干，称重。
(2)冷水提：取脱脂产物2g，加入40mL水，磁力搅拌3h，离心10min，反复三次。上清过0.22um滤膜，MW3500透析袋透析，透析液过0.22um滤膜，浓缩，加入4倍无水乙醇醇沉，离心取沉淀，干燥，称重。
试验一抗血管生成活性分析：
96孔板每孔加入基底膜Matrigel 55uL，在37℃下固化60min。每孔加入200uL人类脐静脉内皮细胞悬液(3×104/孔)，其中含有100ug/mL实施例1-11的样品，设置一组只有细胞悬液，不加多糖的空白组。37℃，5％CO2培养12h。用倒置差像显微镜40倍镜下记录图像。统计形成的管数，并都与不加多糖的空白组进行百分比。结果见表1。
表1抗血管生成活性检测结果
形成管数占总管数的百分比(％)
空白组 100.00
实施例1 55.15
实施例2 71.27
实施例3 70.58
实施例4 16.93
实施例5 16.11
实施例6 15.92
实施例7 58.29
实施例8 16.30
实施例9 61.46
实施例10 16.85
实施例11 77.17
由表1结果可知，进一步优选实施例5和实施例6与培养基不含盐的实施例11相比抗血管生成活性提高了3.79和3.85倍，优选实施例1、实施例4、实施例8和实施例10与培养基不含盐的实施例11相比抗血管生成活性提高了0.4-3.73倍。本发明实施例1-10与培养基不含盐的实施例11相比抗血管生成活性提高了0.1-4倍。
试验二酸性多糖的元素分析及其中等酸降解产物的液质联用(LC-MS)分析
实施例1-11的酸性多糖在暨南大学化学系进行元素分析，得到硫酸根的含量，见表2。在安瓿瓶中，对所得酸性多糖进行中等酸降解。实施例1-11的降解产物加入10uL苯胺进行还原胺化，产物离心取上清液，进行LC-MS分析，得到糖醛酸的含量，实验结果见表3。实施例4的质谱图见图1。
表2酸性多糖硫酸根含量占总糖含量的百分比
硫酸根含量(％)
实施例1 9.63
实施例2 6.08
实施例3 1.56
实施例4 9.83
实施例5 10.98
实施例6 11.00
实施例7 9.16
实施例8 10.00
实施例9 9.21
实施例10 10.57
实施例11 1.08
由表2结果可知，进一步优选实施例5和实施例6与培养基不含盐的实施例11相比硫酸根含量提高了9.17和9.19倍。优选实施例1、实施例4、实施例8和实施例10与培养基不含盐的实施例11相比硫酸根含量提高了7.92-8.79倍，本发明实施例1-10与培养基不含盐的实施例11相比硫酸根含量提高了0.44-9.19倍。
表3酸性多糖糖醛酸含量占总糖含量的百分比
糖醛酸含量％
实施例1 12.98
实施例2 8.42
实施例3 4.68
实施例4 15.37
实施例5 16.33
实施例6 16.67
实施例7 10.88
实施例8 16.29
实施例9 10.13
实施例10 16.15
实施例11 4.18
由表3可知，糖醛酸占总糖的质量百分比为4.68-16.8％。进一步优选实施例5和实施例6与培养基不含盐的实施例11相比，糖醛酸含量提高了2.91和2.99倍。优选实施例1、实施例4、实施例8和实施例10与培养基不含盐的实施例11相比糖醛酸含量提高了2.10-2.90倍，本发明实施例1-10与培养基不含盐的实施例11相比糖醛酸含量提高了0.12-2.99倍。
试验三酸性多糖分子质量分析
用十八角度激光散射法测定酸性多糖的分子质量，结果见表4。
表4酸性多糖的分子质量检测结果
相对分子质量(KD)
实施例1 35-5000
实施例2 32-5500
实施例3 35-5700
实施例4 34-6000
实施例5 30-5000
实施例6 37-590
实施例7 40-5900
实施例8 39-5550
实施例9 38-5500
实施例10 35-5400
由表4可知，酸性多糖的重均分子量为30KD-6000KD，其中50KD以下的多糖含量不少于60％；实施例5检测结果见图2。
试验四酸性多糖的单糖组成测定
用高效液相色谱法测定多糖的单糖组成，结果见图3。由图3可知该酸性多糖中中性糖包含甘露糖，葡萄糖，半乳糖，木糖，鼠李糖和阿拉伯糖；氨基糖包含葡萄糖胺；糖醛酸包含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
试验五酸性多糖的红外光谱检测
对酸性多糖进行红外光谱检测，结果见图4。由图4可知，3200-3600cm-1处为O-H伸缩振动吸收峰，峰形较宽；1400-1600cm-1处为C=O吸收峰；1200-1400cm-1处为C-H的变角振动；1000-1200cm-1处为C-O的伸缩振动吸收峰，以上全部为糖的特征吸收峰。
试验六酸性多糖的总糖含量测定
用硫酸苯酚法测定酸性多糖的总糖含量，葡萄糖标准曲线为Y=21.199X+0.0533R2=0.9976，结果见表
表5酸性多糖的总糖含量测定结果
吸光度1 吸光度2 平均吸光度 总糖含量(mg) 总糖含量(％)
实施例1 1.954 2.124 2.039 0.0937 93.7
实施例2 1.976 1.987 1.9815 0.0910 91.0
实施例3 1.937 2.012 1.9745 0.0906 90.6
实施例4 1.986 1.789 1.8875 0.0865 86.5
实施例5 1.912 1.833 1.8725 0.0858 85.8
实施例6 1.982 2.1 2.041 0.0938 93.8
实施例7 1.967 1.894 1.9305 0.0886 88.6
实施例8 1.946 1.903 1.9245 0.0883 88.3
实施例9 1.966 2.228 2.097 0.0964 96.4
实施例10 1.966 2.186 2.076 0.0954 95.4
由表5可知该酸性多糖的总糖含量不少于85％。

Claims (4)

1.一种培养高产酸性多糖的虫草菌丝体的方法，具体包括如下步骤：
(1)菌株扩增：采用固体培养基将菌株扩增；
(2)种子液培养：从固体培养基上挑取菌丝体于液体培养基中培养；
其特征在于它还进行：
(3)发酵培养：取种子液于液体养基中(含0.03-1230ug/mL盐)，在15℃-28℃条件下，培养10-14天；
所述的盐包括MgCl2、MnCl2、KCl、NaCl、Na2SO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4中的一种或几种的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种培养高产酸性多糖的虫草菌丝体的方法，具体包括如下步骤：
(1)菌株扩增：采用固体培养基将菌株扩增；
(2)种子液培养：从固体培养基上挑取菌丝体于液体培养基中培养；
其特征在于它还进行：
(3)发酵培养：取种子液于液体养基中(含170-610ug/mL盐)，在16℃-23℃或25℃-28℃条件下，培养10-14天。
3.根据权利要求1所述的一种培养高产酸性多糖的虫草菌丝体的方法，具体包括如下步骤：
(1)菌株扩增：采用固体培养基将菌株扩增；
(2)种子液培养：从固体培养基上挑取菌丝体于液体培养基中培养；
其特征在于它还进行：
(3)发酵培养：取种子液于液体养基中(含210-500ug/mL盐)，在27℃或19℃条件下，培养10-14天。
4.用权利要求1至3任意一项所述的虫草菌丝体的培养方法培养出的菌丝体，其中的酸性多糖，其特征在于，酸性多糖中包含中性糖，氨基糖和糖醛酸，总多糖的含量不少于85％，糖醛酸占总糖的质量百分比为4.68-16.8％，硫酸根占总糖的质量百分比为1.56-11％，多糖的重均分子量为30KD-6000KD，其中50KD以下的多糖含量不少于60％；
所述的中性糖包含甘露糖，葡萄糖，半乳糖，木糖，鼠李糖和阿拉伯糖；
所述的氨基糖包含葡萄糖胺；
所述的糖醛酸包含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
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