CN110511292B

CN110511292B - 冬虫夏草提取物与用途

Info

Publication number: CN110511292B
Application number: CN201910817631.5A
Authority: CN
Inventors: 钱正明; 李文佳; 李春红; 甄达明
Original assignee: Yichang Shanchengshuidu Cordyceps Co ltd; Dongguan Dongyangguang Cordyceps Research And Development Co ltd
Current assignee: Dongguan dongyangguang Cordyceps research and Development Co., Ltd; YICHANG SHANCHENGSHUIDU CORDYCEPS Co.,Ltd.
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: CN110511292A

Abstract

本发明提出了冬虫夏草提取物与用途。该冬虫夏草提取物中的β‑葡聚糖的含量为42％～46％。该冬虫夏草提取物中的β‑葡聚糖的含量远高于现有技术中的冬虫夏草多糖提取物中的β‑葡聚糖含量、免疫活性高。

Description

冬虫夏草提取物与用途

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地，本发明涉及冬虫夏草提取物与用途，更具体地，本发明涉及冬虫夏草提取物、制备冬虫夏草提取物的方法、药物组合物或保健品以及冬虫夏草提取物的制药用途。

背景技术

冬虫夏草Cordceps sinensis(BerK.)Sacc是生长在西藏、四川、青海等高海拔地区的一种名贵药材，具有补肺益肾、滋补强身功效。现代药理研究证实冬虫夏草具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗氧化及调节免疫功能等多种功效，并可以通过提高免疫细胞活性、抑制肿瘤生长因子的表达、促进细胞凋亡等多种途径发挥其抗肿瘤作用。近年来，随着需求的增加、冬虫夏草市场价格的不断攀升，对其药理作用研究越来越广泛和深入，尤其对其免疫调节及抗肿瘤作用的研究已成为研究的热点。大量研究表明，冬虫夏草水溶性多糖提取物对免疫功能具有双重调节作用，既能持续增强免疫力，以提高机体抵抗疾病的能力，也可以发挥免疫抑制作用，在器官移植术后有效的抑制排斥反应。如文献《Effects of the acidpolysaccharide fraction isolated from a cultivated Cordyceps sinensis onmacrophages in vitro》(Cellular Immunology，2010,262:69-74)报告了冬虫夏草酸性多糖提取物浓度为25和50μg/ml(p<0.05)显著提高巨噬细胞RAW264.7释放细胞因子NO；文献《Immunomodulatory effect of exo-polysaccharides from submerged culturedCordyceps sinensis:enhancement of cytokine synthesis,CD11b expression,andphagocytosis》(Applied Microbiology and Biotechnology,2007,75:769–775)报道了来自深层发酵的冬虫夏草胞外多糖(0.025～0.1mg/mL)可剂量依赖性地诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白细胞介素(IL)-6和IL10的产生，冬虫夏草细胞内多糖在与胞外多糖在相同浓度下仅适度诱导TNF-α释放、CD11b表达和吞噬作用。

然而，目前鲜有研究对冬虫夏草非水溶性多糖的药理功效进行研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种免疫活性较好的冬虫夏草非水溶性多糖提取物。

需要说明的是，本申请所述的“冬虫夏草非水溶性多糖提取物”是指利用冬虫夏草水提后的不溶于水的滤渣进行后续的提取获得的提取物；本申请所述的“冬虫夏草水溶性多糖提取物”是指利用冬虫夏草水提后的上清液进行后续的醇沉提取获得的提取物；本申请所述的“冬虫夏草碱溶性多糖提取物”是指利用冬虫夏草碱提后的提取液进行后续的浓缩醇沉获得的提取物；本申请所述的“冬虫夏草酸溶性多糖提取物”是指利用冬虫夏草酸提取后的提取液进行后续的浓缩醇沉获得提取物。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种冬虫夏草提取物。根据本发明的实施例，所述冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖的含量为42％～46％。根据本发明实施例的冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖的含量远高于现有技术中的冬虫夏草多糖提取物中的β-葡聚糖含量、在免疫调节方面表现更优。

根据本发明的实施例，上述冬虫夏草提取物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖的含量为43％～45％，优选地43.5％～44.5％，更优选地43.82％～44.18％。

根据本发明的实施例，所述冬虫夏草提取物中的几丁质含量为12～13％，优选地12.15～12.3％。

根据本发明的实施例，所述冬虫夏草提取物中的总糖含量为72％～78％，优选地73％～77％，更优选地73.96％～76.62％。根据本发明实施例的冬虫夏草提取物中的总糖含量远高于现有技术中的总糖含量。

根据本发明的实施例，所述冬虫夏草提取物中包括70％～74％的D-葡萄糖，9％～9.5％的D-半乳糖，6％～7％的D-甘露糖，0.1％～0.2％L-鼠李糖，0.4％～0.6％L-阿拉伯糖，10％～12％葡萄糖胺，0.4％～0.6％半乳糖醛酸；

根据本发明的实施例，所述冬虫夏草提取物中包括72.26％的D-葡萄糖，9.03％的D-半乳糖，6.37％的D-甘露糖，0.01％L-鼠李糖，0.5％L-阿拉伯糖，10.19％葡萄糖胺，0.45％半乳糖醛酸。

根据本发明的实施例，所述冬虫夏草提取物中的多糖具有图2或表2所述的分子量分布。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备前面所述冬虫夏草提取物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将冬虫夏草粉末进行醇提处理，以便获得第一滤渣；将所述第一滤渣进行水提处理，以便获得第二滤渣；将所述第二滤渣进行碱提处理或酸提处理，以便获得第三滤渣；将所述第三滤渣进行酸提处理或碱提处理，以便获得第四滤渣；将所述第四滤渣水复溶后进行pH调节和沉淀处理后，获得第五滤渣，所述第五滤渣构成所述冬虫夏草提取物。根据本发明实施例的方法，创造性地采用水提处理的滤渣进行后续的提取，并且后续提取也创造性地收集滤渣(沉淀)进行操作，意外地发现，通过上述提取方式获得的冬虫夏草提取物的活性远高于现有技术中的冬虫夏草提取物，且获得的冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖和多糖的含量远高于现有技术。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述醇提处理是通过如下方式进行的：将所述冬虫夏草粉末在95％乙醇中浸泡过夜，优选地，所述冬虫夏草粉末与95％乙醇的质量体积比为1g:(5～8mL)；将浸泡过夜产物进行过滤；将过滤后滤渣在95％乙醇中进行渗漉，任选地，所述过滤后滤渣与95％乙醇的质量体积比为1g:(12～16mL)，任选地，所述渗漉流速为10～20mL/L；将渗漉后粉末在80％乙醇中进行高温回流和抽滤，以便获得滤渣，任选地，所述渗漉后粉末与80％乙醇的质量体积比为1g:(7～10mL)，任选地，所述高温回流是在温度为80℃中进行1.5～2.5h；将抽滤后滤渣再次在80％乙醇中进行高温回流和抽滤1～2次，优选2次，以便获得第一滤渣；优选地，进一步包括将所述第一滤渣进行乙醇挥发和烘干处理。发明人发现，冬虫夏草粉末与95％乙醇的质量体积比在1g:(5～8mL)范围内，可进一步提高冬虫夏草的有效物质的提取率；将抽滤后滤渣再次在80％乙醇中进行高温回流和抽滤2次，可进一步提高冬虫夏草多糖的提取率。

根据本发明的实施例，所述水提处理是通过如下方式进行的：将所述第一滤渣在蒸馏水中进行高温回流和抽滤处理，以便获得滤渣，任选地，所述第一滤渣与所述蒸馏水的质量体积比为1g:(8～12mL)，任选地，所述高温回流是在温度为95℃的条件下进行1.5～2.5h；将抽滤后滤渣再次在蒸馏水中进行高温回流和抽滤处理1～2次，优选2次，以便获得第二滤渣；任选地，进一步包括将所述第二滤渣进行烘干处理。发明人发现，将抽滤后滤渣再次在蒸馏水中进行高温回流和抽滤处理2次，可进一步提高冬虫夏草多糖的提取率。

根据本发明的实施例，将所述第二滤渣进行碱提处理，以便获得第三滤渣；将所述第三滤渣进行酸提处理，以便获得第四滤渣。

根据本发明的实施例，所述碱提处理是通过如下方式进行的：将所述第二滤渣在3％NaOH溶液中搅拌提取和抽滤，以便获得滤渣，任选地，所述第二滤渣与3％NaOH溶液的质量体积为1g:(8～12mL)，优选地，所述搅拌提取是在温度为8～12℃和氮气流保护的条件下进行20～30h，任选地，所述抽滤的次数为2～3次；将所述滤渣再次在3％NaOH溶液中搅拌提取和离心2～3次，以便获得沉淀，所述沉淀构成所述第三滤渣，任选地，所述滤渣与3％NaOH溶液的质量体积为1g:(8～12mL)，优选地，所述搅拌提取是在温度为70～80℃和氮气流保护的条件下进行5～8h，任选地，所述离心是在7500rpm的转速下进行5min。搅拌提取过程中，采用氮气进行保护，可有效防止提取物被氧化，提高有效成分的提取率。

根据本发明的实施例，所述酸提处理是通过如下方式进行的：将所述第三滤渣水复溶后进行pH调节和离心处理，所述pH调节是通过盐酸进行调节的，所述调节处理后的pH为7，任选地，所述离心处理在转速为7500rpm的条件下进行5min；将离心处理后沉淀再次水复溶后进行pH调节、搅拌提取和离心处理1～2次，以便获得沉淀，所述沉淀构成所述第四滤渣，所述pH调节是通过盐酸进行调节的，所述调节处理后的pH为3，任选地，所述离心处理后沉淀与水的质量体积比为1g:(8～12mL)，任选地，所述搅拌提取是在温度为80℃的条件下进行1.5～2.5h，任选地，所述离心是在转速为7500rpm的条件下进行5min。

根据本发明的实施例，所述pH调节是通过NaOH进行调节的，所述调节处理后的pH为7；任选地，所述沉淀处理是在转速为7500rpm的条件下进行离心5min。

根据本发明的实施例，进一步包括将所述第五滤渣进行水洗涤和烘干处理。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种冬虫夏草提取物。根据本发明的实施例，所述冬虫夏草提取物是通过前面所述的方法获得的。根据本发明实施例的冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖和多糖的含量远高于现有技术中的冬虫夏草多糖提取物，且活性远高于现有技术，在激活Dectin-1或诱导THP-1细胞产生TNF-α方面表现出明显的剂量依赖性。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的冬虫夏草提取物。

在本发明的第五方面，本发明提出了前面所述的冬虫夏草提取物在制备药物或保健品中的用途，所述药物或保健品用于调节免疫力、降血糖、降血脂、抵抗衰老或抗氧化。根据本发明实施例的冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖和多糖的含量远高于现有技术中的冬虫夏草多糖提取物，其所制备的药物或保健品在调节免疫力、降血糖、降血脂、抵抗衰老或抗氧化方面具有显著优势。

在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的冬虫夏草提取物在制备药物中的用途，所述药物用于激活Dectin-1或诱导THP-1细胞产生TNF-α。根据本发明实施例的冬虫夏草提取物可以用来制备药物，所述药物既可以作为临床应用药物，也可作为科研用药物。根据本发明实施例的冬虫夏草提取物在激活Dectin-1或诱导THP-1细胞产生TNF-α方面具有显著优势。

根据本发明的实施例，所述药物用于剂量依赖性激活Dectin-1或诱导THP-1细胞产生TNF-α。发明人发现，根据本发明实施例的冬虫夏草提取物刺激Dectin-1活性随着浓度的增高而提高，高浓度(200μg/mL)的刺激活性与低浓度(50μg/mL)相比，具有极显著的差异；同样，高浓度提取物(200μg/mL)诱导THP-1细胞产生TNF-α的量显著高于低浓度。根据本发明实施例的冬虫夏草提取物在激活Dectin-1或诱导THP-1细胞产生TNF-α方面具有明显的剂量依赖性。

附图说明

图1是根据本发明实施例的标准单糖(上)和冬虫夏草非水溶性多糖CEP单糖组分(下)的HPLC图谱；

图2是根据本发明实施例的EmimAc处理后的冬虫夏草非水溶性多糖CEP中多糖的凝胶色谱图。

具体实施方式

本发明针对现有技术的不足，提供了一种免疫活性较好的冬虫夏草非水溶性多糖提取物，该提取物不仅能激活hDectin-1受体还可以激活巨噬细胞释放细胞因子。

(1)本发明首次对冬虫夏草非水溶性多糖进行了研究，得到了免疫活性较好的非水溶性多糖提取物(CEP)，适合工艺大规模生产。以往多糖都是水提后醇沉，就是水提取后抽滤，得到上清，然后往上清液中加乙醇沉淀得到多糖。本申请的CEP是要的水提后的滤渣，将滤渣中的多糖提取出来了，意外地发现，从滤渣中提取的多糖的活性还比现有技术中多糖的活性好。

(2)本发明获得的冬虫夏草非水溶性多糖提取物CEP含有的β-葡聚糖含量高达44.37±0.18，总糖含量为75.29±0.18。

(3)本发明获得的冬虫夏草非水溶性多糖提取物CEP刺激Dectin-1活性随着浓度的增高而提高，高浓度(200μg/mL)的刺激活性与低浓度(50μg/mL)相比，具有极显著的差异；同样，高浓度的提取物CEP(200μg/mL)诱导THP-1细胞产生TNF-α的量显著高于低浓度。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1冬虫夏草非水溶性多糖提取物(CEP)的制备

1)称取50g冬虫夏草粉末(来源于湖北宜都)(过3号药筛)，加入6倍(w/v)(5倍-8倍)95％乙醇中浸泡过夜；之后过滤，收集滤渣，并往其中加入14倍(12倍-16倍)体积95％乙醇渗漉，渗漉速度为10-20mL/h；

2)渗漉后的粉末用8倍(w/v)(7倍-10倍)80％乙醇，80℃回流提取2h(1.5-2.5h)，冷却后布氏漏斗抽滤，弃乙醇提取液，重复热提一次，抽滤后得到滤渣1；

3)挥去乙醇，80℃烘干；

4)以1:10(w/v)(1:8-1:12)料液比往步骤(2)所得滤渣1中加入蒸馏水，95℃回流提取2h(1.5-2.5h)，布氏漏斗抽滤，收集滤渣2；

5)重复步骤4一次，共2次，然后将得到的滤渣3在80℃干燥；

6)以1:10(w/v)(1:8-1:12)料液比往步骤(5)所得滤渣3中加入3％NaOH，在10℃和氮气流保护下，搅拌提取24h(20-30h)；

7)布氏漏斗抽滤，得到滤渣，再重复2次抽滤，得到滤渣4；

8)以1:10(w/v)(1:8-1:12)料液比往步骤(7)得到的滤渣4中加入3％NaOH，于75℃和氮气流保护下搅拌提取6h(5h-8h)，冷却后，离心，7,500rpm(5,840g)，5min，收集沉淀；

9)重复步骤8两次，共碱提3次；

10)冷却后，将得到的滤渣碱溶液重悬于450mL蒸馏水中，用1M HCl调节pH为7.0，然后7,500rpm离心(5,840g)5min，得到沉淀，再用蒸馏水反复洗至pH不再变化，最后得到的沉淀取名为滤渣5；

11)将滤渣5以1:10(w:v)(1:8-1:12)料液比加入水，用HCl预先调节pH到3.0，80℃提取2h(1:8-1:12)，离心7,500rpm(5,840g)，5min，收集沉淀；

12)重复步骤11一次，共酸提2次；

13)冷却后，将得到的沉淀酸溶液重悬于450mL蒸馏水中用NaOH溶液调节pH为7.0，然后离心7,500rpm(5,840g)，5min，用8倍体积蒸馏水反复洗至pH不再变化，最后得到的沉淀取名为滤渣6；

14)滤渣6于80℃烘干，得冬虫夏草非水溶性固体多糖，命名为CEP，得率为9.8％(即得到总量是50g x9.8％＝4.9g)。

实施例2冬虫夏草非水溶性多糖提取物(CEP)所含β-葡聚糖、总糖、几丁质的含量

1)采用酶法对β-葡聚糖进行定量分析。按照β-葡聚糖试剂盒(Yeast andMushroom beta-Glucan assay(K-YBGL)试剂盒，Megazyme公司产品)使用说明操作。

A：总葡聚糖测定：

①将样品CEP研磨后至通过3号药筛(筛孔内径约为355μm)；②分别准确称量50mg样品及标准品(固体酵母-葡聚糖)到具旋盖的试管中，加0.75mL浓盐酸(37％，GR)，30℃水浴45min，每15min混匀一次，每个样品平行做2次；③每管加5mL超纯水，沸水浴2h；④冷却后，加5mL 2mol/L KOH，并定量转移管内所有内容物至50mL容量瓶，以200mmol/L醋酸钠缓冲液定容；⑤定量滤纸(中速)过滤，收取滤液；⑥取0.1mL样品或标准品滤液，加0.1mL 1,3-外切葡聚糖酶(20U/mL)和葡萄糖苷酶(4U/mL)于试管中；取0.2mL 200mmol/L醋酸钠缓冲液作为空白对照；取0.1mL 0.6mg/mL葡萄糖标准品加0.1mL 200mmol/L醋酸钠缓冲液；混匀后，40℃水浴60min；⑦每管试管中加3mL GOPOD试剂，40℃水浴20min；⑧冷却至室温后，510nm处测定吸光度。

B：α葡聚糖测定：

①将样品CEP研磨后通过3号药筛(筛孔内径约为355μm)；②分别准确称量50mg样品及标准品(固体酵母-葡聚糖)到具旋盖的试管中，加1mL 2mol/L KOH，冰浴中搅拌20min；③加4mL 1.2mol/L醋酸钠溶液，混匀，加0.1mL葡萄糖苷酶(1,630U/mL)和转化酶(500U/mL)混匀后，40℃水浴30min；④直接试管内容物离心，1500g，10min，得样品和标准品上清液；⑤取0.2mL 200mM醋酸钠缓冲液作为空白对照；0.1mL 0.6mg/mL葡萄糖标准品加0.1mL 200mM醋酸钠缓冲液；0.1mL样品及标准品上清加0.1mL200mM醋酸钠缓冲液，上述均一式两份，混匀；⑥每管加入3mL GOPOD试剂，40℃水浴20min；⑦510nm处测定吸光度OD。

计算方法：

总葡聚糖％＝E×F×50/0.1×1/1000×100/W×162/180

α葡聚糖％＝E×F×5.1/0.1×1/1000×100/W×162/180

β葡聚糖％＝总葡聚糖％-α葡聚糖％

(E＝样品OD510nm-空白OD510nm；F＝100g标准葡萄糖OD510nm；W＝样品及标准品真实质量(mg))

实验结果：β-葡聚糖的含量为44±0.18％。

2)采用苯酚-硫酸法测定CEP总糖含量。结果发现，总糖含量为75.29±1.33％。

3)测定几丁质含量。CEP样品(5mg)悬浮于3mL饱和KOH中，130℃加热1h，冷却至室温后加8mL预冷至4℃的75％乙醇水溶液，混匀，冰浴15min，再加入300μL 13.3％(w/v，in75％乙醇)Celtite545试剂，2℃离心(1500g)5min。沉淀用10mL预冷(4℃)40％乙醇洗一次，再用10mL冰水洗两次，然后于2℃离心(1500g)5min。将沉淀重悬在0.5mL蒸馏水中，加0.5mL5％(w/v)KHSO₄和0.5mL 5％(w/v)NaNO₂，混匀，15min，同法离心。取150μL上清液，加450μL蒸馏水稀释，然后与0.2mL 12.5％(w/v)氨基磺酸铵充分混匀5min，再加0.2mL 3-甲基苯并噻唑啉酮-2-腙(5mg/mL水溶液)，130℃下加热3min。冷却后，加0.2mL 0.83％(w/v)氯化铁水溶液，室温显色25min后在650nm测吸光度，通过对比盐酸氨基葡萄糖标准曲线，计算几丁质含量。

结果：冬虫夏草固体多糖中几丁质含量为12.15±0.15％。

实施例3冬虫夏草非水溶性多糖提取物(CEP)单糖组分分析

1)精密称取10mg样品CEP于安瓿瓶中，加2mL 4mol/L三氟醋酸，封管，120℃水解6h。

2)样品水解液加1-2mL MeOH，减压蒸干，反复多次至无三氟醋酸味。

3)上述水解液干燥物用1mL超纯水溶解，10000rpm离心10min，精密量取上述单糖水解物100μL，加0.6mol/L NaOH溶液50μL，再加入0.6mol/L PMP甲醇溶液100μL，充分混匀后置于70℃水浴反应6 0min。反应结束冷却至室温后加入0.3mol/L HCl溶液100μL中和，加入超纯水650μL，取500μL上述溶液至2mL离心管，加1mL二氯甲烷涡旋混合萃取1min。离心(12000rpm，5min)，取上清液(水相)，用0.22m滤膜过滤，得到CEP的衍生物。

4)混合对照品混合液制备：精密称取单糖标准品(D-葡萄糖，Glc；D-半乳糖，Gal；D-甘露糖，Man；L-岩藻糖，Fuc；D-木糖，Xyl；L-鼠李糖，Rha；D-阿拉伯糖Ara；D-盐酸氨基葡萄糖，GlcN；D-葡萄糖醛酸，GlcUA；D-半乳糖醛酸，GalUA)，适量，精密称定，用水溶解，配制成浓度分别为20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的混合对照品溶液。然后按照步骤(3)方法进行衍生，最后得到对照品的衍生物。

5)采用C18反相HPLC分析衍生物。将上述多糖酸水解后的衍生物、标准单糖衍生物进行C18反相HPLC柱分析，其中色谱条件为：色谱柱：Hypersil ODS-C18(250×4.6mm，5μm)；流动相A：15％(v/v)乙腈-磷酸缓冲液(100mmol/L，pH6.9)，流动相B：40％(v/v)乙腈磷酸缓冲液(100mmol/L，pH 6.9)；流速：1mL/min；梯度洗脱条件：0min-25min，18％B→25％B；25min-27min，25％B→100％B；27min-30min，100％B→100％B。对比两个色谱图确定单糖组成和含量及摩尔比。(见图1和表1)

表1：冬虫夏草不可溶性多糖CEP单糖组分含量(％)

单糖组分

Glc

Gal

Man

Rha

Ara

GlcN

GalUA

含量

72.26％

9.03

6.37

0.01

0.50

10.19

0.45

实施例4冬虫夏草非水溶性多糖提取物(CEP)多糖分子量分析

溶液制备：取50mg非水溶性多糖CEP，加5mL用1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐(EmimAc)处理成水溶性样品，按照1:4(v/v)加入乙醇沉淀16-24h，离心收取沉淀，并用水溶解，冷冻干燥。称取10mg干燥物，加1mL 0.02mol/L醋酸钠溶液溶解。另取不同分子量的右旋糖酐标准品D0、D1、D2、D3、D5、D6、D8(D0、D1、D2、D3、D5、D6、D8、D2000，分子量依次为180、2500、4600、7100、21400、41100、133800、2000000)按照上述方法制备得到对照品溶液。所有样品均用0.22μm滤膜过滤后上样。

凝胶色谱分析：色谱条件为：色谱柱为TOSOH TSK-GEL G4000SW(7.5mm×300mm)；流动相为0.02mol/L醋酸钠，柱温：25℃；GILSON 132RI DETECTOR示差折光检测器，流速为0.5mL·min-1，记录洗脱峰的保留时间，由GPC专用软件绘制标准曲线，以标准分子量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得回归方程。根据GPC专用软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间采用GPC专用软件计算样品各组分的重均分子量及其分子量分布。(结果见图2和表2)。

表2：EmimAc处理后CEP不同分子量段分子量及峰面积百分比

对比实验1冬虫夏草水溶性多糖(HW)、碱溶性多糖(CAP)、酸溶性多糖(ACP)的制备、多糖含量测定

1)冬虫夏草水溶性多糖(HW)的制备：称取50g冬虫夏草粉末，加6倍体积(w/v)95％乙醇浸泡过夜；之后过滤，收集滤渣，并往其中加入14倍体积的(w/v)95％乙醇渗漉，收集渗漉过后的粉末。粉末以1:10料液比(w/v)用蒸馏水加热到95℃提取2h，抽滤，得到提取液，滤渣在重复提取3次，收集提取液。往提取液中加4倍体积的4℃乙醇，立即搅匀，4℃静置过夜，10000rpm离心5min，收集沉淀，依次用95％乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，挥去乙醚，50℃烘干，即得水提多糖固体，编号：HW。得率：5.09％。

2)冬虫夏草碱溶性多糖(CAP)的制备：称取50g冬虫夏草繁育品粉末，加6倍体积(w/v)95％乙醇浸泡过夜；之后过滤，收集滤渣，并往其中加入14倍体积(w/v)95％乙醇渗漉，收集渗漉过后的粉末。往粉末中加8倍体积(w/v)的80％乙醇，80℃回流提取2h，抽滤，得到滤渣，再将滤渣重复热回流一次，得到滤渣1，挥去乙醇，得干燥滤渣2。滤渣2以1:10料液比(w/v)用蒸馏水加热到95℃提取2h，抽滤，得到滤渣，再将滤渣重复提取3次，得到滤渣3。滤渣3以1:10料液比(w/v)加入3％NaOH水溶液，充氮气后在10℃提取24h，抽滤，得到提取液，将滤渣重复提取2次，合并提取液，滤渣4留着备用。往提取液中加1mol/L的HCl中和，10000rpm离心5min，收集上清，浓缩到原体积的1/5。往浓缩液加4倍体积的4℃乙醇，立即搅匀，4℃静置过夜，10000rpm离心5min，收集沉淀，依次用95％乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，挥去乙醚，50℃烘干，即得碱提多糖固体，编号：CAP。得率：8.45％。

3)冬虫夏草酸溶性多糖(ACP)的制备:上述步骤(2)碱提取后的滤渣4用2mol/LHCl中和，以1:10料液比(w/v)加入去离子水溶液，用2mol/L HCl调节pH为3.0，80℃回流提取2h，离心7,500rpm(5,840g)，5min，收集上清液，并用2mol/L NaOH中和；沉淀在80℃条件下提取2次，合并三次得到的上清液，浓缩到原体积的1/5。往浓缩液加4倍体积的4℃乙醇，立即搅匀，4℃静置过夜，10000rpm离心5min，收集沉淀，依次用95％乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，挥去乙醚，50℃烘干，即得酸提多糖固体，编号：ACP。得率：4.02％。；

4)β-葡聚糖、总糖、几丁质的含量的测定：按照实施例2的方法测定β-葡聚糖、总糖含量，结果如下表3所示。

表3：冬虫夏草水溶性多糖HW、碱溶性多糖(CAP)、酸溶性多糖(ACP)含量

样品	β-葡聚糖含量(％)	总糖含量(％)
			HW	9.33	46.34
CAP	7.81	39.35
			ACP	8.53	43.60

由表3结果可以看出，冬虫夏草非水溶性多糖提取物(CEP)中的β-葡聚糖含量和总糖含量远高于冬虫夏草水溶性多糖(HW)、碱溶性多糖(CAP)、酸溶性多糖(ACP)。

对比实验2免疫活性对比检测

1)冬虫夏草非溶性多糖和水溶性多糖激活Dectin-1受体(大鼠肺组织树突状细胞相关C型凝集素-1)的免疫活性检测

溶液配制：非溶性多糖CEP使用1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐溶解后配成浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，水溶性多糖(HW、CAP、ACP)使用水溶解配成浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。LPS、Curdlan和Yeast glucan溶液使用水分别配制成浓度为1μg/mL LPS，100μg/mL的Curdlan，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的Yeast glucan溶液。

HEK-Blue hDectin-1b细胞系购自Invivogen公司，培养在含10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100g/mL链霉素、0.1mg/mL Normocin、1g/mL puromyxin和2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基内(cDMEM)，并定期传代。测定时细胞用加含Detection medium的cDMEM调整密度为2.8x10⁵个/mL接种于96孔板内(180μL/孔)，并立即加入180μL等量的配制在相同培养基内的样品溶液(CEP浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，HW、CAP和ACP浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，Curdlan 100μg/mL，Yeastglucan溶液50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)，混合均匀。另加入不含样品的培养基作为阴性组对照，仅含培养基或样品、不含细胞的孔作为样品或阴性组的空白。细胞在37℃、含5％CO₂培养箱中培养16h，用酶标仪测定655nm处的吸光度值，计算Dectin-1b刺激指数公式如下：

刺激倍数＝(样品组OD-样品组空白OD)/(阴性组OD-阴性组空白OD)，

结果发现，不溶性多糖CEP的Dectin-1刺激活性随着浓度的增加而提高，高浓度(200ug/ml)的刺激活性与低浓度(50μg/ml)比较，差异极显著，p<0.001，见下表4。

2)冬虫夏草非溶性多糖和水溶性多糖激活巨噬细胞释放细胞因子TNF-α(肿瘤坏死因子)的免疫活性检测

TNF-α是一种由激活的巨噬细胞产生的能抑制成骨细胞和刺激破骨细胞的细胞因子,THP-1细胞购自ATCC公司(菌株号TIB-202)培养在含10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100g/mL链霉素的RPMI1640培养基内(cRPMI)，并定期传代。实验时将细胞悬浮在含100ng/mL佛波酯(PMA)的cRPMI中，使密度为2×10⁵个/mL，接种于24孔板中，每孔500μL。板在在37℃、含5％CO₂培养箱中培养48h，然后更换成500μL等体积含不同样品浓度(CEP浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，HW、CAP和ACP浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，LPS浓度为1μg/mL)的cRPMI溶液，继续培养24h。加入不含样品培养基的孔作为阴性对照组。培养结束后培养基中的TNF-α浓度用Invitrogen公司的Human TNF-alpha ELISA Kit进行测定。具体操作方法按照kit说明书进行，即酶标板每孔加100μL含捕获抗体的1×包被溶液,4℃过夜孵育。过夜后，甩干包被溶液，用洗涤液洗涤三次；每孔加100μL的细胞培养液、TNF-alpha标准液或PBS(空白组),室温孵育1h，用洗涤液洗涤5次；各孔加100μL检测抗体溶液，室温孵育1h，用洗涤液洗涤5次；最后加入1×Avidin-HRP，孵育30min，洗涤7次；各孔加100μL 1×TMB，密封避光、室温孵育15min；各孔加50μL Stop Solution(1M的H3PO4溶液)，读取450nm处的OD值，计算TNF-α刺激指数公式如下：TNF-α刺激倍数＝样品组浓度/阴性组浓度。

结果发现，与溶剂组比较，CEP高浓度的诱导THP-1细胞产生TNF-α的量显著高于低浓度的，p<0.001。见下表4。而水溶性提取物HW、CAP和ACP诱导THP-1细胞产生TNF-α的量三个浓度没有显著差异。

表4:冬虫夏草多糖组分刺激Dectin-1受体和诱生TNF-α活性

注：LPS是针对TNF-a释放效果最好的，Curdlan和Yeast glucan是针对Dectin-1的阳性对照。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖的含量为42％～46％，所述冬虫夏草提取物中包括70％～74％的D-葡萄糖，9％～9.5％的D-半乳糖，6％～7％的D-甘露糖，0.1％～0.2％L-鼠李糖，0.4％～0.6％L-阿拉伯糖，10％～12％葡萄糖胺，0.4％～0.6％半乳糖醛酸。

2.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖的含量为43％～45％。

3.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖的含量为43.5％～44.5％。

4.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的β-葡聚糖的含量为43.82％～44.18％。

5.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的几丁质含量为12～13％。

6.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的几丁质含量为12.15～12.3％。

7.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的总糖含量为72％～78％。

8.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的总糖含量为73％～77％。

9.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的总糖含量为73.96％～76.62％。

10.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中包括72.26％的D-葡萄糖，9.03％的D-半乳糖，6.37％的D-甘露糖，0.01％L-鼠李糖，0.5％L-阿拉伯糖，10.19％葡萄糖胺，0.45％半乳糖醛酸。

11.根据权利要求1所述的冬虫夏草提取物，其特征在于，所述冬虫夏草提取物中的多糖具有图2或表2所述的分子量分布。

12.一种制备权利要求1～11任一项所述冬虫夏草提取物的方法，其特征在于，将冬虫夏草粉末进行醇提处理，以便获得第一滤渣；

将所述第一滤渣进行水提处理，以便获得第二滤渣；

将所述第二滤渣进行碱提处理或酸提处理，以便获得第三滤渣；

将所述第三滤渣进行酸提处理或碱提处理，以便获得第四滤渣；

将所述第四滤渣水复溶后进行pH调节和沉淀处理后，获得第五滤渣，所述第五滤渣构成所述冬虫夏草提取物。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述醇提处理是通过如下方式进行的：

将所述冬虫夏草粉末在95％乙醇中浸泡过夜；

将浸泡过夜产物进行过滤；

将过滤后滤渣在95％乙醇中进行渗漉；

将渗漉后粉末在80％乙醇中进行高温回流和抽滤，以便获得滤渣；

将抽滤后滤渣再次在80％乙醇中进行高温回流和抽滤1～2次，以便获得第一滤渣。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述冬虫夏草粉末与95％乙醇的质量体积比为1g:(5～8mL)。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述过滤后滤渣与95％乙醇的质量体积比为1g:(12～16mL)。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述渗漉流速为10～20mL/L。

17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述渗漉后粉末与80％乙醇的质量体积比为1g:(7～10mL)。

18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述高温回流是在温度为80℃中进行1.5～2.5h。

19.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述第一滤渣进行乙醇挥发和烘干处理。

20.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述水提处理是通过如下方式进行的：

将所述第一滤渣在蒸馏水中进行高温回流和抽滤处理，以便获得滤渣；

将抽滤后滤渣再次在蒸馏水中进行高温回流和抽滤处理1～2次，以便获得第二滤渣。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第一滤渣与所述蒸馏水的质量体积比为1g:(8～12mL)。

22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述高温回流是在温度为95℃的条件下进行1.5～2.5h。

23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述第二滤渣进行烘干处理。

24.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，将所述第二滤渣进行碱提处理，以便获得第三滤渣；将所述第三滤渣进行酸提处理，以便获得第四滤渣。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述碱提处理是通过如下方式进行的：

将所述第二滤渣在3％NaOH溶液中搅拌提取和抽滤，以便获得滤渣；

将所述滤渣再次在3％NaOH溶液中搅拌提取和离心2～3次，以便获得沉淀，所述沉淀构成所述第三滤渣。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第二滤渣与3％NaOH溶液的质量体积为比1g:(8～12mL)。

27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述搅拌提取是在温度为8～12℃和氮气流保护的条件下进行20～30h。

28.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述抽滤的次数为2～3次。

29.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述滤渣与3％NaOH溶液的质量体积比为1g:(8～12mL)。

30.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述搅拌提取是在温度为70～80℃和氮气流保护的条件下进行5～8h。

31.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述酸提处理是通过如下方式进行的：

将所述第三滤渣水复溶后进行pH调节和离心处理，所述pH调节是通过盐酸进行调节的，所述调节处理后的pH为7；

将离心处理后沉淀再次水复溶后进行pH调节、搅拌提取和离心处理1～2次，以便获得沉淀，所述沉淀构成所述第四滤渣，所述pH调节是通过盐酸进行调节的，所述调节处理后的pH为3。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述离心处理后沉淀与水的质量体积比为1g:(8～12mL)。

33.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述搅拌提取是在温度为80℃的条件下进行1.5～2.5h。

34.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述pH调节是通过NaOH进行调节的，所述调节处理后的pH为7。

35.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述沉淀处理是在转速为7500rpm的条件下进行离心5min。

36.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述第五滤渣进行水洗涤和烘干处理。

37.一种冬虫夏草提取物，其特征在于，是通过权利要求12-36任一项所述的方法获得的。

38.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～11任一项或37所述的冬虫夏草提取物。

39.权利要求1～11任一项或37所述的冬虫夏草提取物在制备药物或保健品中的用途，所述药物或保健品用于调节免疫力。

40.权利要求1～11任一项或37所述的冬虫夏草提取物在制备药物中的用途，所述药物用于激活Dectin-1或诱导THP-1细胞产生TNF-α。

41.根据权利要求40所述的用途，其特征在于，所述药物用于剂量依赖性激活Dectin-1或诱导THP-1细胞产生TNF-α。