CN114907494A

CN114907494A - 一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114907494A
Application number: CN202210468807.2A
Authority: CN
Inventors: 李超; 周世林; 扶雄; 黄强; 金燕琳
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Wuhan Time Seed Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2042-04-29
Also published as: CN114907494B

Abstract

本发明公开了一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖及其制备方法与应用。本发明通过对刺梨鲜果原料脱脂、碱法提取、脱蛋白、脱色、透析、醇沉和冷冻干燥，制备出刺梨多糖；其中，碱法提取是将脱脂处理的刺梨粉与碱液按质量体积比1:20～1:40g/mL混合，于80～95℃下浸提2～4次。本发明与传统水提法制备的刺梨多糖相比，本发明制备的碱提刺梨多糖，平均分子量为37～42kDa，分子量低且纯度高，具有较强的吸附胆固醇和胆酸盐能力，且能显著降低消化过程中油脂的酶解速率和脂肪酸释放量，减轻高脂HepG2细胞的甘油三脂和胆固醇含量，可应用于预防和治疗肥胖的健康食品。

Description

一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食品营养健康技术领域，具体涉及一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖及其制备方法与应用。

背景技术

刺梨(Rose roxburghii)是蔷薇科蔷薇属的药食同源植物，主要生长在中国西南部的山区(海拔500～2500m)，其果实类似长满小刺的金色小石榴，富含矿物质、酚类化合物、多糖、三萜、维生素、超氧化物歧化酶和有机酸等营养成分，是最经济的第三代水果。刺梨作为具有地域特色的植物，在传统医学主要以刺梨根、叶以及果实等入药，具有消食健脾、止泻、解暑、降三高、增强免疫力等诸多功能。随着对刺梨的深入研究，刺梨的活性价值逐渐得到证实，目前发现刺梨具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、预防和治疗糖尿病、增强免疫、抗辐照、抗癌、抗衰老等功能，相关食品和保健品深受消费者的喜爱。

刺梨多糖作为刺梨果实中的重要功能成分之一，近些年来得到了广泛的研究。例如，中国发明专利CN201010550315.5公开了一种刺梨多糖具有电离辐射防护的药用活性；中国发明专利CN200510110737.X公开了刺梨多糖在治疗神经干细胞损伤中的新功能；中国发明专利CN201811209724.1公开了刺梨多糖的益生元作用和抑制α-葡萄糖甘酶活性，可用于肠道疾病和糖尿病的辅助治疗。然而，目前关于刺梨多糖降脂和降胆固醇的功效没有得到证实和研究。

肥胖是一种脂肪组织积累过多引起的慢性疾病，同时伴随着脂肪肝、炎症、心血管疾病、糖尿病、肠道紊乱等诸多慢性疾病，严重影响了肥胖人群的健康生活。目前市场上用于治疗该疾病的药物主要作用靶点在抑制胰脂肪酶和摄食中枢，如奥利司他和西布曲明，但长期服用会有一定的副作用，引起身体不适。多糖已经被证实有治疗和预防肥胖的功效，且副作用小，可消化吸收，作用靶点多，效果多层次，开发具有降脂功效的多糖对于治疗和预防肥胖具有重要意义。

因此，从天然资源中制备具有多种功能活性的多糖具有重要意义。现有植物多糖的提取技术主要以水作为萃取溶剂，其他方法辅助结合以提高多糖的利用率，如超声、微波、酶辅助提取等方法。相比之下，用碱液处理原料，可以使植物细胞壁膨胀裂解，更高效的促进酸性多糖溶解，制备出不同结构和生物活性的多糖，而不需要额外的设备成本和工序。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖及其制备方法与应用。本发明以碱液提取多糖，显著提高了该多糖的提取率，并制备出低分子量的刺梨多糖，研发出一种具有降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖，对于开发预防和治疗肥胖的健康食品具有重要意义。

本发明的目的通过以下技术方案之一实现。

一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖，所述刺梨多糖的平均分子量为37～42kDa，颗粒尺寸为200～220nm。

优选的，所述刺梨多糖是一种杂多糖，由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖糖醛酸和半乳糖醛酸组成，摩尔百分比含量分别为3～4％、16～17％、15～16％、5～6％、1～2％、5～6％、52～53％。

优选的，所述刺梨多糖具有吸附胆固醇和胆酸盐能力，并降低消化过程中油脂的酶解速率和脂肪酸释放量，减轻HepG2细胞的脂质积累。

上述的一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)脱脂：将刺梨鲜果清洗、去籽、干燥、磨粉、过筛得刺梨粉末，与体积浓度80～95％的乙醇溶液按质量体积比为1:3～1:10g/mL混合，于60～75℃下加热回流1～4h，过滤得到残留物，残留物重复脱脂1～3次，然后干燥；

2)多糖提取：将步骤1)干燥残留物按质量体积比为1:20～1:40g/mL与碱液混合，于80～95℃下浸提1～3h，提取液离心得上清液，滤渣重复提取1～3次；将提取上清液合并，调节pH至中性，减压浓缩到原体积的1/3～1/6，得到刺梨粗多糖浓缩液；

3)脱蛋白：将Sevag试剂与步骤2)的刺梨粗多糖浓缩液按体积比为1:3～1:4混合，振荡30～40min，离心得上层刺梨多糖溶液，重复8～15次，减压蒸发除去残留的Sevag试剂；

4)脱色：将步骤3)中脱蛋白后的刺梨多糖提取液与大孔树脂按体积比5:1～8:1混合，室温下摇荡脱色6～12h，抽滤分离大孔树脂得到脱色的多糖滤液；

5)透析：将步骤4)中刺梨多糖滤液移入1000～5000Da的透析袋，于0～5℃蒸馏水中透析24～48h，减压浓缩至原体积；

6)醇沉和干燥：往步骤5)中刺梨多糖溶液加入无水乙醇并不断搅拌至乙醇体积浓度为60～90％，于0～5℃中静置12～24h，离心得到刺梨多糖沉淀，用去离子水复溶，-45～-75℃下冷冻干燥后得到刺梨多糖。

优选的，步骤2)、3)和6)所述离心的离心力为4500～8000g，离心时间5～15min。

优选的，步骤1)两次干燥方式均为鼓风干燥，干燥温度为60～80℃；所述过筛为过60～100目筛。

优选的，步骤2)，所述碱液为0.3～0.5mg/mL的NaOH溶液，pH为12.0±0.3；调节pH至中性所用试剂为盐酸溶液，浓度为2～6M。(pH12.0对应NaOH溶液浓度为0.01M，即0.4mg/mL)

优选的，步骤3)所述Sevag试剂为按体积计氯仿:正丁醇＝3:1～5:1；

优选的，步骤4)所述大孔树脂的型号为AB-8、D101或阴离子交换树脂。

优选的，步骤4)所述摇荡的速率为120～180rpm。

上述的具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖应用于制备具有预防和治疗肥胖功能的健康食品。

优选的，所述健康食品的形态为液体、固态、粉末、片剂、冲剂或胶囊。

与现有技术相比，本发明具有如下效果和优点：

(1)本发明采用碱液提取的刺梨多糖为一种低分子量新型酸性多糖，分子量均一可控、所用装置设备简单易操作、反应条件温和，可以显著提高多糖提取率，可达6.26％。黄远东等对水浸法提取刺梨多糖提取流程进行优化，最高得率为4.7％[黄远东，等.水浸法提取刺梨中多糖[J].吉首大学学报,2014,35]。中国发明专利CN201811209724.1中报道的热水浸提刺梨多糖的提取率为3.57％。

(2)本发明得到的刺梨多糖平均分子量为37～42kDa，该多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖糖醛酸和半乳糖醛酸组成，摩尔百分比含量分别为3～4％、16～17％、15～16％、5～6％、1～2％、5～6％、52～53％等组成，与已知报道的刺梨多糖相比，分子量和单糖组成均相差很大，完全区别于现有的刺梨多糖，可确定为一种新型的酸性杂多糖,主链由阿拉伯糖基或半乳糖基组成。同时由于分子量较低，具有良好的水溶性，粘度较低，有利于在食品、保健品或医药领域的应用。

(3)本发明制备的刺梨多糖属于杂多糖，不仅可以在肠道中调节能量摄入，还可以进入到下肠道中被肠道菌群利用发挥益生作用，功能活性丰富。

(4)本发明制备方法制备的多糖产率高，工艺简单易行，耗时短，并且适合大规模的工业化生产；本发明与其它公开的纯化技术相比，无需再经离子交换层析柱对多糖进一步分离纯化，就能得到分子量均一、蛋白质和色素含量低的刺梨多糖；该方法同样适用于从刺梨果渣中提取多糖，以提高刺梨的综合利用率，从而提高刺梨的附加值，具有广阔的市场应用前景。

(5)与传统水提法制备的刺梨多糖相比，本发明制备的刺梨多糖具有较好的降脂和降胆固醇功效，能够较强的吸附胆酸盐和胆固醇能力，抑制油脂在消化过程中的酶解效果，减少HepG2细胞脂质积累。

附图说明

图1为实施例1刺梨多糖分子量的离子色谱图。

图2为实施例1刺梨多糖粒径分布图。

图3为实施例1刺梨多糖产品单糖组成的GPC谱图。

图4为实施例1刺梨多糖的红外光谱图。

图5为实施例1刺梨多糖对油脂消化的抑制图。

图6为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞甘油三脂含量的影响。

图7为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞胆固醇含量的影响。

图8为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞代谢通路关键蛋白印迹图。

图9为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞AMPK蛋白表达的影响。

图10为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞p-AMPK蛋白表达的影响。

图11为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞SIRT1蛋白表达的影响。

图12为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞PPARα基因表达的影响。

图13为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞FAS基因表达的影响。

图14为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞ACC基因表达的影响。

图15为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞CPT1基因表达的影响。

图16为实施例1刺梨多糖对HepG2细胞HMGCR基因表达的影响。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1)脱脂：将刺梨鲜果清洗后去籽，在70℃下鼓风干燥30h，粉碎过60目筛，与体积浓度为95％的乙醇溶液按质量体积比(w/v)1:5g/mL混合，于70℃下加热回流2h，过滤得到残留物，残留物脱脂重复1次后置于60℃的鼓风干燥箱中干燥24h；

2)提取：取步骤1)的脱脂刺梨干粉100g，加入3L的0.4mg/mL的NaOH碱提取液，在95℃下浸提2h，离心得到上清液，滤渣重复浸提1次；两次提取上清液离心后合并，用浓度为2M的盐酸溶液调节提取液pH至中性，于55℃下旋转蒸发减压浓缩至原体积的1/4，得到刺梨多糖的浓缩液；

3)脱蛋白：将步骤2)的刺梨多糖的浓缩液与Sevag试剂(氯仿:正丁醇＝3:1，v/v)按体积比为4:1混合，剧烈振荡30min，离心除去变性蛋白质，重复操作8次，直至肉眼观察无蛋白残留，减压蒸发上层多糖溶液除去残留的Sevag试剂；

4)脱色：将步骤3)中脱蛋白后的刺梨多糖提取液加入AB-8大孔树脂，轻微摇荡进行脱色6h；刺梨多糖提取液与大孔树脂的体积比为5:1，抽滤得到脱色的多糖滤液；

5)透析：将步骤4)脱色的多糖滤液中移入3000Da的透析袋，4℃蒸馏水中透析48h，每隔6h换一次蒸馏水；透析完后再次减压浓缩至原体积；

6)醇沉和冻干：往步骤5)中多糖浓缩滤液加入无水乙醇并不断搅拌至乙醇体积浓度为85％，在4℃下静置12h，然后5000g离心10min得到多糖沉淀，去离子水复溶，于-50℃冷冻干燥后得到刺梨多糖；经称量计算刺梨粗多糖的产率为6.48％(以刺梨原料干粉重量计)。相同条件下以95℃热水提取的得率为3.66％。

实施例2

1)脱脂：将刺梨鲜果清洗后去籽，在80℃下鼓风干燥24h。粉碎过60目筛，与体积浓度为93％的乙醇溶液按质量体积比(w/v)1:6g/mL混合，于70℃下加热回流3h，过滤得到残留物，残留物脱脂重复2次，然后放入65℃的鼓风干燥箱中干燥18h；

2)提取：取步骤1)的脱脂刺梨干粉100g，加入4L的0.5mg/mL的NaOH提取液(pH12.10)，在95℃下浸提3h，离心得到上清液，滤渣重复浸提1次；两次上清液离心后合并，用浓度为3M的盐酸溶液调节pH至中性，于55℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，得到刺梨多糖的浓缩液；

3)脱蛋白：将步骤2)的刺梨多糖的浓缩液与Sevag试剂(氯仿:正丁醇＝5:1，v/v)按体积比为4:1混合，剧烈振荡30min，离心除去变性蛋白质，重复操作9次，直至肉眼观察无蛋白残留，减压蒸发上层多糖溶液除去残留的Sevag试剂；

4)脱色：将步骤3)中脱蛋白后的刺梨多糖提取液加入AB-8大孔树脂，轻微摇荡进行脱色8h，刺梨多糖提取液与大孔树脂的体积比为6:1，抽滤得到脱色的多糖滤液；

5)透析：将步骤4)中脱色的多糖滤液移入5000Da的透析袋，4℃蒸馏水中透析36h，每隔6h换一次蒸馏水；透析完后再次减压浓缩至原体积；

6)醇沉和冻干：往步骤5)中多糖浓缩滤液加入无水乙醇，并不断搅拌至乙醇体积浓度为90％，在0℃下静置12h，然后5500g离心10min得到多糖沉淀，用去离子水复溶，-50℃冷冻干燥后得到刺梨多糖；经称量计算刺梨粗多糖的产率为6.60％(以刺梨原料干粉重量计)。相同条件下以95℃热水提取的得率为3.72％。

实施例3

1)脱脂：将刺梨鲜果清洗后去籽，在75℃下鼓风干燥24h。粉碎过60目筛，与体积浓度90％乙醇溶液按质量体积比(w/v)1:7g/mL混合，于75℃下加热回流3h，过滤得到残留物，残留物，重复脱脂1次，残留物放入65℃的鼓风干燥箱中干燥24h。

2)提取：取步骤1)的脱脂刺梨干粉100g，加入4L的0.3mg/mL的NaOH碱提取液(pH11.88)在95℃下浸提2.5h，离心得到上清液，滤渣重复浸提1次；两次上清液离心后合并，用浓度4M的盐酸溶液调节pH至中性，于55℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，得到刺梨多糖的浓缩液。

3)脱蛋白：将步骤2)的刺梨多糖的浓缩液与Sevag试剂(氯仿:正丁醇＝3:1，v/v)按体积比3:1混合，剧烈振荡30min，离心除去变性蛋白质，重复操作10次，直至肉眼观察无蛋白残留，减压蒸发上层多糖溶液除去残留的Sevag试剂。

4)脱色：将步骤3)中脱蛋白后的刺梨多糖提取液加入AB-8大孔树脂，轻微摇荡进行脱色10h；浓缩液与大孔树脂的体积比为7:1，抽滤得到脱色后的多糖滤液。

5)透析：将步骤4)脱色的多糖滤液移入4500Da的透析袋，4℃蒸馏水中透析24h，每隔6h换一次蒸馏水；透析完后再次减压浓缩至原体积。

6)醇沉和冻干：往步骤5)中多糖浓缩滤液加入无水乙醇并不断搅拌至乙醇体积浓度为90％，在3℃下静置12h，然后6000g离心10min得到多糖沉淀，用去离子水复溶，-60℃冷冻干燥后得到刺梨多糖；经称量计算刺梨粗多糖的产率为6.35％(以刺梨原料干粉重量计)。相同条件下以95℃热水提取的得率为3.56％。

实施例4

多糖的分子量和粒径

多糖样品的分子量采用HP-GPC进行检测，色谱柱为TSK-G5000PW_XL和TSK-G3000PW_XL串联柱，流动相：0.02mol/L KH₂PO₄；流速：0.6mol/L；柱温45℃，进样量：20μL，检测器：Agilent 1260示差检测器。普鲁兰标品用于制作分子量分布标准曲线。

将实施例1、2、3制备的刺梨多糖样品配制成1mg/mL，然后用纳米粒度仪(Nanosizer，NS3000)测定多糖的粒径。

如附图1和图2所示，根据标准曲线计算得实施例1碱提刺梨多糖的平均分子量为37kDa，粒径为211nm。相同条件下实施例1以95℃热水浸提的刺梨多糖分子量为87kDa，粒径为295nm，表明碱提方法显著降低刺梨多糖的分子量，且粒径更低，有利于提高多糖的生物利用率和溶解度。

实施例5

刺梨多糖的单糖组成分析

多糖的单糖组成分析包括样品通过强酸高温水解后采用离子交换色谱测定等步骤。将5mg样品和5mL三氟乙酸(2M)密封在安培瓶中，置于108℃下水解6h，水解物于50℃条件下减压蒸干，加入色谱纯甲醇溶解，重复减压蒸干操作5次，保证完全去除三氟乙酸。残留物用超纯水溶解并定容到50mL容量瓶，过0.22μm水相滤膜进行色谱分析。采用离子色谱仪(ICS 3000，美国戴安公司)进行检测，离子色谱条件如下：柱温：30℃；进样量10μL；流动相：500mM醋酸钠；流速0.5mL/min，脉冲安培检测器检测30min。配置不同浓度的单糖标准品(鼠李糖、木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖，阿拉伯糖，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)，按照上述离子色谱测定条件测定各浓度梯度的单糖和糖醛酸混合标样，最终根据峰面积和单糖含量计算出各样品单糖的摩尔百分比。

由图3刺梨多糖的离子交换色谱可知，实施例1的碱提刺梨多糖主要由甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸组成，摩尔百分比含量分别为1.88％、5.43％、3.41％、15.12％、16.41％、5.00％和52.74％，表明该多糖为杂多糖，其主链可能由阿拉伯糖基或半乳糖基组成。测得实施例1的热水浸提的刺梨多糖主要由甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸组成，但摩尔百分比含量分别为2.20％、2.51％、13.28％、17.09％、20.17％、5.74％、38.99％。实施例1的碱提刺梨多糖比水提刺梨多糖含有更多的木糖和糖醛酸，表明两者为完全不同的刺梨多糖，且许多研究表明，糖醛酸含量越高，多糖的活性越好。

实施例6

刺梨多糖的红外光谱分析

取4mg实施例1的刺梨多糖与适量干燥的KBr粉末混合压片，采用FT-IR傅里叶红外变换光谱仪在400-4000cm^-1区间进行扫描，采集样品的红外吸收光谱图。

如附图4所示，实施例1的碱提刺梨多糖样品在3456cm^-1附近有一个强而宽的峰，这是属于-OH的特征吸收振动峰；在2929cm^-1附近的吸收峰是属于C–H的吸收振动特征峰，这些特征峰的出现可以初步判定该物质属于多糖类化合物；此外，在1744cm^-1和1613cm^-1附近的吸收峰分别属于羧酸中的C＝O伸缩振动吸收峰和和结合水的特征吸收峰；1414cm^-1对应的吸收峰为羧基的C-O伸缩振动特征峰，表明糖醛酸含量的存在；1240cm^-1附近的吸收峰是属于C–O–C伸缩振动吸收峰；1051～1078cm^-1附近的吸收峰是属于吡喃糖环的特征振动吸收峰；830cm^-1附近的吸收峰表明中存在α-构型的葡萄糖苷键。与水提刺梨多糖相比，实施例1的碱提刺梨多糖官能团种类没有显著改变，但糖醛酸的吸收峰明显增强，表明糖醛酸含量更高，具有更好的生物活性。

实施例7

刺梨多糖对胆酸盐吸附效果

实施案例7、8、9中消化液均按照适用于食品的标准化半动态体外消化方法配置(Food&Function,2020,11,1702-1720)。测定多糖对胆酸盐吸附法略有改动。

实施例1的5mL初始刺梨多糖溶液(20mg/mL)与模拟口腔(pH 7.0，含100U/mL的α-淀粉酶)、模拟胃消化液(含400U/mL的胃蛋白酶和120U/mL的胃脂肪酶)按1:1混合完成消化后，调节pH至7.0，加入18mL肠电解质液(含200U/mL的胰酶，不含胆酸盐)，37℃下振荡1h(模拟肠道环境)，最后再加入2mL的牛磺胆酸钠溶液(6mM)或甘氨胆酸钠溶液(6mM)，在37℃下连续搅拌1h，溶液离心后取上清液，按照标准曲线方法在387nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线测定上清液中胆酸盐的含量。胆酸盐的结合能力被定义为每毫克样品吸附的胆酸盐的重量计算。胆酸盐标准曲线根据如下制作：

牛磺胆酸钠和甘胆酸钠标准品溶解于磷酸盐缓冲液(pH 6.3)中，制成0.3mM胆盐原液。将不同浓度的胆盐原液与硫酸溶液(60％，w/v)按体积比1:3(v/v)混合均匀，在70℃水浴中孵化20min，水浴冷却后在387nm处测量光谱。以胆盐浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

测试结果表明，实施例1的碱提刺梨多糖对模拟肠道消化过程中对牛磺胆酸钠和甘胆酸钠的吸附量分别为4.74mg/g、5.05mg/g，而实施例1的热水浸提的刺梨多糖对牛磺胆酸钠和甘胆酸钠的吸附3.05mg/g、3.16mg/g，表明刺梨多糖可以吸附胆酸盐，促进肠道中胆酸循环,且碱提方法制备的刺梨多糖具有更好的胆酸盐吸附效果。

实施例8

刺梨多糖对胆固醇吸附效果

由于胆固醇太难溶于水，所以用鸡蛋蛋黄代替分析级胆固醇来测定多糖吸附胆固醇的结合能力。新鲜蛋黄用蒸馏水稀释至10倍体积，均质成乳状液，将25mL蛋黄乳液与500mg实施例1的刺梨多糖充分混合均匀，然后与等体积的模拟口腔消化液(pH 7.0，含100U/mL的α-淀粉酶)混合均匀，在37℃下模拟消化5min；接着与模拟胃消化液(含400U/mL的胃蛋白酶和120U/mL的胃脂肪酶)混合均匀，调节pH至2.0，在37℃下模拟消化2h；完成模拟胃消化后与模拟肠消化液(含200U/mL的胰酶)等体积混合均匀，调节pH至7.0，在37℃下模拟消化2h。等质量的蒸馏水代替多糖作为空白对照。在完成模拟胃消化和肠消化后，分别取总体积4mL的混合物，与16mL无水乙醇混合，4000g下离心20min，得到上清液。上清液旋蒸除去乙醇，用90％的冰乙酸以1：6的体积比稀释浓缩液，然后用邻苯二甲醛(OPA)法在550nm波长下测定吸光度。胆固醇溶解于冰乙酸制备0.1～1mg/mL的胆固醇标准液，然后与混合酸(硫酸和90％冰乙酸等体积混合)、邻苯二甲醛试剂(邻苯二甲醛溶解于90％的冰乙酸制备0.1mg/mL的邻苯二甲醛试剂)按体积比2:20:1混合均匀静置10min，于550nm下测定吸光度，并根据胆固醇和吸光度值制定胆固醇溶液标准曲线。多糖的胆固醇结合能力计算公式如下：

CBC(mg/g)＝25×(C1-C2-C3)/M₀

其中，胆固醇吸附含量定义为每毫克样品吸附的胆盐的重量。C1、C2、C3分别是初始蛋黄胆固醇浓度、未添加多糖和添加了实施例1刺梨多糖的消化液中的胆固醇浓度(mg/mL)，25mL是吸附体积，M₀是样品的干重(g)。

测试结果表明，实施例1的碱提刺梨多糖在模拟胃消化和肠道消化过程中对胆固醇的吸附量分别为4.58mg/g和16.83mg/g，而实施例1的热水浸提的刺梨多糖在模拟胃消化和肠道消化过程中在对胆固醇的吸附效果为3.04mg/g、12.90mg/g，表明刺梨多糖在模拟胃消化过程中具有更好的胆固醇吸附效果，且碱提刺梨多糖的吸附效果优于水提的刺梨多糖。

实施例9

刺梨多糖对油脂消化的影响

将玉米油与磷酸盐缓冲液(5mM，含2.5％的吐温20)按质量比1:4混合，经过高压均质机均质3次后制成稳定乳液，然后与2％(w/v)的实施例1刺梨多糖溶液按照质量比1:9混合均匀后用于后续模拟消化，磷酸盐缓冲液用于空白对照。混合液与模拟口腔消化液、模拟胃消化液按如上体积比1:1完成模拟口腔和胃消化后，调节pH至7.0，加入等体积的模拟肠道消化液(含2000U/mL的胰脂肪酶)在37℃下模拟消化2h。模拟小肠消化过程中不断加入0.05M的氢氧化钠溶液使pH始终保持在7.0，脂质消化的程度用释放的游离脂肪酸(FFAs)的量表示，由下式计算

FFA(％,w/w)＝100×(V_NaOH×C_NaOH×MW_Lipid)/(2×W_Lipid)

其中V_NaOH为氢氧化钠的滴定体积；C_NaOH为氢氧化钠溶液的浓度(0.05M)；MW_Lipid为玉米油的平均分子量(872g.mol^-1)；W_Lipid为玉米油的初始重量(0.4g)。这个方程假设两个分子FFA和一个单酰甘油分子是由所有三酰甘油水解产生的。

大多数多糖不直接作用于胰脂肪酶，但可以在消化过程中与油脂乳糜和胆酸盐结合，阻止胰脂肪酶与油脂接触发生酶解反应。图5表明，实施例1的碱提刺梨多糖不仅减缓了油脂水解速率，同时使游离脂肪酸的释放量降低了30％，而热水提取的刺梨多糖使脂肪酸的释放量降低了18.99％，表明该刺梨多糖对消化过程中油脂消化具有良好的抑制效果，可与油脂乳糜结合，减少油脂被胰脂肪酶水解成游离脂肪酸，进而减少人体对油脂的重组吸收。

实施例10

刺梨多糖体外降血脂作用

脂肪酸诱导的HepG2细胞与脂肪肝的病理学特征高度相似，因此广泛用于建立细胞高脂模型。取复苏后的HepG2细胞，接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养在37℃、含5％的CO₂培养箱中。取对数期生长细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于6孔板中，每孔加入3mL细胞悬液，待细胞生长贴壁后，移去含10％BSA的DMEM培养基，改用含0.5mM油酸的DMEM培养基诱导24h，再用含实施例1刺梨多糖的DMEM培养基治疗24h。以不含油酸和多糖溶液的DMEM培养基做空白对照，以先用含0.5mM油酸的DMEM培养基培养24h，然后用DMEM培养基处理24h作为模型组，所用油酸浓度和多糖浓度经过预实验证明对细胞无明显毒性作用。用胰酶消化细胞收集细胞沉淀，然后用RIPA裂解液裂解细胞直至完全破碎，用BCA法测细胞蛋白浓度，并用总胆固醇试剂盒和甘油三酯试剂盒及其说明书测定细胞总胆固醇含量和甘油三酯含量。

如图6图7所示，经过油酸处理的HepG2细胞组甘油三脂含量是正常细胞组的2.68倍，胆固醇含量是正常细胞的2.18倍；经过0.4～1.2mg/mL的实施例1的碱提刺梨多糖治疗后，甘油三脂含量比模型组降低了14.38％～37.41％，总胆固醇含量降低了20.28％～30.74％，且效果呈剂量依赖关系，而水提刺梨多糖组的甘油三酯和总胆固醇含量明显低于碱提刺梨多糖组，表明实施例1的碱提刺梨多糖对高脂HepG2细胞具有较好的降脂和降胆固醇作用。

实施例11

刺梨多糖对高脂HepG2细胞脂质代谢通路的影响

碱提刺梨多糖比水提刺梨多糖对高脂HepG2细胞具有更好的降脂效果，因此对其分子机制进行了深入研究。复苏后的HepG2细胞，接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养在37℃、含5％的CO₂培养箱中。取对数期HepG2细胞接种于10cm细胞培养皿中，接种密度为9×10⁴个/mL，接种量为10mL，待24h后细胞完全贴壁，改用含0.5mM油酸的DMEM培养基诱导24h，再用含实施例1刺梨多糖的DMEM培养基治疗24h。用胰酶消化细胞收集细胞沉淀，用BCA法测定蛋白含量，采用Western Blot和RT-PCR检测细胞脂质代谢通路的表达情况。以不含油酸和多糖溶液的DMEM培养基做空白对照(control)，以先用含0.5mM油酸的DMEM培养基培养24h，然后用DMEM培养基处理24h做为模型组(model)。

其中，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是调生物能量代谢的关键因子，为了减少脂肪生成，激活的AMPK通过抑制固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的蛋白水解，直接或间接从而下调乙酰辅酶a羧化酶(ACC)、脂肪合成酶(FAS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)等表达，从而减少脂肪酸和胆固醇的积累；同时，ACC对脂肪酸分解酶-肉碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)的抑制作用也会减弱，加速脂肪氧化。激活的AMPK也可以调节其他能量传感器，激活代谢酶，如沉默调节因子(SIRT1)。SIRT-1在肝脏、肌肉、脂肪组织、心脏和内皮细胞中大量表达，可以激活过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)，以促进脂质和脂肪酸氧化。部分基因引物序列如下：

表1 HepG2细胞代谢基因引物信息

如图8-16所示，经过实施例1碱提刺梨多糖的处理，AMPK蛋白的表达量比模型组和空白组显著提高，且随着多糖浓度的增加，AMPK蛋白表达量比模型组增加了1.92～2.36倍；同时，p-AMPK蛋白比模型组增加了5.78～6.13倍，表明AMPK蛋白通过磷酸化激活，发挥关键的调节作用。磷酸化的p-AMPK显著抑制ACC、FAS、HMGCR等基因的表达，减少脂质和胆固醇合成。在1.2mg/mL实施例1的碱提刺梨多糖的治疗下，ACC、FAS、HMGCR基因表达量比模型组分别减少了49.46％、30.92％、37.11％，同时，ACC对CPT1的抑制效果减弱，CPT1基因表达增强1.80倍。AMPK的磷酸化还激活了沉默调节因子SIRT1蛋白表达，在刺梨多糖浓度大于0.8mg/mL时，SIRT1蛋白表达比模型组增加了至少1.21倍，PPARα基因表达量增加了1.19倍，而在0.4mg/mL，刺梨多糖不能促进SIRT1和PPARα的表达。总之，实施例1碱提刺梨多糖对HepG2细胞的降脂和降胆固醇效果随着多糖浓度的提高而提高，在较高浓度下，刺梨多糖通过AMPK/SIRT1通路促进了HepG2细胞脂质氧化代谢，并抑制脂质和胆固醇合成途径来降低细胞合成甘油三酯和胆固醇。

以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖，其特征在于，所述刺梨多糖的平均分子量为37～42kDa，颗粒尺寸为200～220nm。

2.根据权利要求1所述的具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖，其特征在于，所述刺梨多糖是一种杂多糖，由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖糖醛酸和半乳糖醛酸组成，摩尔百分比含量分别为3～4％、16～17％、15～16％、5～6％、1～2％、5～6％、52～53％。

3.根据权利要求1所述的具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖，其特征在于，所述刺梨多糖具有吸附胆固醇和胆酸盐能力，并降低消化过程中油脂的酶解速率和脂肪酸释放量，减轻HepG2细胞的脂质积累。

4.权利要求1-3任一项所述的一种具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)、3)和6)所述离心的离心力为4500～8000g，离心时间5～15min。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)两次干燥方式均为鼓风干燥，干燥温度为60～80℃；所述过筛为过60～100目筛。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)，所述碱液为0.3～0.5mg/mL的NaOH溶液，pH为12.0±0.3；调节pH至中性所用试剂为盐酸溶液，浓度为2～6M。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述Sevag试剂为按体积计氯仿:正丁醇＝3:1～5:1；步骤4)所述大孔树脂的型号为AB-8、D101或阴离子交换树脂。

9.权利要求1-3任一项所述的具有显著降脂和降胆固醇功效的刺梨多糖应用于制备具有预防和治疗肥胖功能的健康食品。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述健康食品的形态为液体、固态、粉末、片剂、冲剂或胶囊。