CN109400745B - 一种低分子量条斑紫菜多糖的制备及其在抗人宫颈癌细胞肿瘤中的应用 - Google Patents

一种低分子量条斑紫菜多糖的制备及其在抗人宫颈癌细胞肿瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种低分子量条斑紫菜多糖的制备及其在抗人宫颈癌细胞肿瘤中的应用，其属于生物化学领域；其技术要点在于先用热水煮提法提取大分子的条斑紫菜多糖，通过γ‑射线辐射将其降解成小分子多糖；其主要用途在于抗人宫颈癌细胞肿瘤中的应用；本发明提供的一种低分子量的条斑紫菜多糖的制备方法提取工艺简单，适宜工业化生产；其制备出来的条斑紫菜多糖则具有较好的抗肿瘤功能，无细胞毒性，安全可靠。

Description

一种低分子量条斑紫菜多糖的制备及其在抗人宫颈癌细胞肿 瘤中的应用
技术领域
本发明涉及到生物化学领域，具体涉及一种低分子量条斑紫菜多糖的制备方法和应用。
背景技术
条斑紫菜来源广泛，在沿海大部分地区都有分布，包括中国、韩国和日本。它是一种营养丰富的可食用海藻，含有大量的蛋白、多糖等物质。其中，条斑紫菜多糖应用广泛，涉及到工业和医用材料等方面。条斑紫菜多糖还具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂的生物学功能。近年来，伴随着生物技术的发展，条斑紫菜多糖的制备方法日新月异，包括膜分离法、煮提法(水、碱液)等。但是这些制备方法大都提取的是大分子多糖。大分子多糖的生物利用度低，不利于条斑紫菜多糖进一步往功能性食品或药品等方向发展。近来，酶法和超声提取法广泛应用于小分子多糖的制备。但是这些制备方法的成本较高，工艺要求高，并且稳定性差，耗时长。同时，制备小分子多糖的过程中，活性基团和多糖组成被破坏严重，而且降解过程中变量过多，例如硫酸根、分子量等的同时变化，造成产品的可控性较差。这些给进一步的活性研究和结构解析造成了一定的困难，所以这些方法不适合小分子多糖制备工艺的扩大应用和深入的活性研究。
人体时常处于有害的环境中，当自身抵御能力降低时，容易引起肿瘤的发生和发展。虽然机体自身具有抵抗的能力，但是这种能力是有限的。为了避免造成不可逆的损伤，机体可以摄取具有抗肿瘤能力的食品或药品，协助并增强机体自身的抵御能力，更好地抵抗有害物质的损伤。但不同生产工艺生产的多糖，生物学功能不同，生物利用度也不同。低分子量的多糖生物利用度高，容易消化吸收，减轻机体的代谢负荷，能够更好的发挥其生物学功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的技术状况，提供一种低分子量的条斑紫菜多糖的制备方法。该多糖具有较好的抗肿瘤功能，无细胞毒性，安全可靠，提取工艺简单，适宜工业化生产。
针对条斑紫菜多糖本身，一种低分子量条斑紫菜多糖制备方法，其特征在于包括下述步骤：
1)冷冻的条斑紫菜在70℃下烘干，打碎成粉，过40目筛；
2)将步骤1得到的藻粉按照粉末(m):95％乙醇(v)＝1:5的料液比在60℃的条件下回流，脱脂2h，除去乙醇，重复上述步骤2次，最后烘干藻粉；
3)将脱脂的藻粉按照粉末(m):去离子水(v)＝1:30的料液比，在80℃的条件下煮提，2h/次，分离料渣并重复上述煮提步骤1次，收集并合并2次煮提液；
4)将上述煮提液，在60℃的条件下减压浓缩，浓缩至煮提液总体积的1/4，得到浓缩液；
5)将上述浓缩液，按照浓缩液(v):95％乙醇(v)＝1:4的液体体积比，在4℃的条件下醇沉12h后，得到固液混合物；
6)将上述的固液混合物，4000r/min离心15min，得到沉淀；
7)将上述沉淀在60℃条件下，烘干，得到条斑紫菜多糖；
8)检测该条斑紫菜多糖的性质，得到该条斑紫菜多糖分子量为2.3-350kDa，该条斑紫菜多糖是具有硫酸基的α-和β-构型吡喃基团构成的杂多糖，主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，硫酸基含量为10％；
9)将上述的条斑紫菜多糖，用去离子水配置成5％的条斑紫菜多糖溶液，使多糖含量达172μg/mL，利用γ-射线进行辐射降解，每组辐射率为10kGy/h，总辐射量为20kGy-100kGy；
10)将上述步骤9)中降解的液体，低温减压干燥，得到降解的小分子量条斑紫菜多糖粉末，降解后的条斑紫菜多糖分子量范围为1.5-18kDa，总糖质量含量86％，硫酸基含量为11％。
低分子量条斑紫菜多糖在制备抗人体宫颈癌细胞肿瘤功能性食品或药物中的应用，有较好的抗肿瘤能力并且对正常细胞无毒害。将上述条斑紫菜多糖作为原料，按照食品或者药品领域的常规生产方法，制备用于抗人体宫颈癌细胞肿瘤的功能性食品或药品。
该制备方法是γ-射线降解大分子多糖的方法。其制备工艺简单，工艺试剂用量少，价格低廉，污染小，耗时短，多糖的生物利用度高，在降解的过程中，硫酸基含量，单糖组成等改变不明显，无显著变化。只有分子量随着辐射剂量的改变有显著差异的变化，并且分子量范围可控。
附图说明
图1条斑紫菜多糖的单糖分析图谱。
图2条斑紫菜多糖的分子量分布图谱。
图3条斑紫菜多糖的红外吸收光谱图。
图4条斑紫菜多糖对肝癌细胞增殖能力的影响。
图5条斑紫菜多糖对宫颈癌细胞增殖能力的影响。
图6条斑紫菜多糖对乳腺癌细胞增殖能力的影响。
图7条斑紫菜多糖对肝细胞增殖能力的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细描述。
一种低分子量条斑紫菜多糖的制备方法
1)冷冻的条斑紫菜在70℃下烘干，打碎成粉，过40目筛；
2)将步骤1得到的藻粉按照粉末(m):95％乙醇(v)＝1:5的料液比在60℃的条件下回流，脱脂2h，除去乙醇，重复上述步骤2次，最后烘干藻粉；
3)将脱脂的藻粉按照粉末(m):去离子水(v)＝1:30的料液比，在80℃的条件下煮提，2h/次，分离料渣并重复上述煮提步骤1次，收集并合并2次煮提液；
4)将上述煮提液，在60℃的条件下减压浓缩，浓缩至煮提液总体积的1/4，得到浓缩液；
5)将上述浓缩液，按照浓缩液(v):95％乙醇(v)＝1:4的液体体积比，在4℃的条件下醇沉12h后，得到固液混合物；
6)将上述的固液混合物，4000r/min离心15min，得到沉淀；
7)将上述沉淀在60℃条件下，烘干，得到条斑紫菜多糖；
8)检测该条斑紫菜多糖的性质，得到该条斑紫菜多糖分子量为2.3-350kDa，该条斑紫菜多糖是具有硫酸基的α-和β-构型吡喃基团构成的杂多糖，主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，硫酸基含量为10％；
9) 将上述的条斑紫菜多糖，用去离子水配置成5％的条斑紫菜多糖溶液，分为三组，使多糖含量达172μg/mL，利用γ-射线进行辐射降解，每组辐射率为10kGy/h，总辐射量分别为0kGy，20kGy，100kGy；
10)将上述步骤9）中降解的液体，低温减压干燥，得到降解的小分子量条斑紫菜多糖粉末，降解后的条斑紫菜多糖分子量范围为1.5-18kDa，总糖质量含量86％，硫酸基含量为11％。
选用高效液相色谱法测定多糖样本中的单糖组成，用Waters HPLC系统，HYPERSIL ODS-2色谱柱，流动相PBS:乙腈＝83：17(％：％)为0.1mol/L的硫酸钠，流速为0.8mL/min，进样体积为20μl，检测波长为254nm。用9种已知单糖作为标准品，包括岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李塘、甘露糖。
如图1所示，多糖样本与9种单糖的混合标准品进行对比，三种多糖中都含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖，其中半乳糖峰面积较高，所以样本中半乳糖为主。
选用高效液相凝胶排阻色谱法测定多糖样本的分子量，用Waters HPLC系统，TOSOH TSK-GELG-5000-PWXL分子筛色谱柱，流动相为0.1mol/L的硫酸钠，流速为0.5mL/min，进样体积为20μl。以不同分子量右旋糖苷作为标准品制作分子量标准曲线，标准曲线为y＝-0.3801x+2.1807，R2＝0.99；
如图2所示，0kGy样本中含有两个峰，第一个峰的出峰时间为7～11min时，峰值处分子量为350kDa，但峰的分布较宽，第二个峰的出峰时间为13～16min，峰值处分子量较小，为2.3kDa；20kGy样本中同样含有两个峰，与0kGy样本峰比较，由于辐射量增加，多糖链被打断，原分子量较大峰的出峰时间后移至9～13min左右，峰值处分子量为67kDa，峰宽变窄，但分布仍较宽，峰高增加，第二个峰的出峰时间仍为13～16min，小分子的分子量几乎不变但是含量增多，峰高增加；100kGy样本中含有四个峰，第一、二个峰的出峰时间为11～13min，与0kGy样本峰比较，由于辐射量大大增加，多糖链被打断过多，原分子量较大峰的出峰时间后移至11～13min左右，分子量变小并且分布变窄，多糖的分子量分布范围大约为12～19kDa，第三个峰和第四个峰的出峰时间为13～16min，分子量几乎不变，但是含量增多，峰高增加。
红外光谱法分析低分子量条斑紫菜多糖
取4mg干燥多糖加入0.4g溴化钾，充分研磨，压片机压成薄片，在4000-500cm-1的范围内进行红外扫描，分辨率为4cm-1。
如图2所示，三种样本的红外图谱都显示相似的吸收峰，在波长大约为3429cm-1处都出现了较强的-OH伸缩振动吸收峰，为多糖上-OH形成的分子间、分子内的氢键；在2934cm-1处都出现了饱和的C-H伸缩振动信号(-CH、-CH2、-CH3的吸收峰)；在1246cm-1处都具有S＝O伸缩振动吸收峰，表明三种多糖中含有硫酸基团；在1649cm-1处都具有多糖水合震动吸收峰；在1397处的吸收峰是因为-C-H变角振动引起的；在1070cm-1处以及附近的吸收峰是吡喃环的特征性吸收；927cm-1处出现的吸收峰，是醚键(C-O-C)的吸收峰，可能是这三种多糖中含有3，6-内醚桥；810cm-1处的峰是C-O-S伸缩振动吸收峰，在大约820cm-1，870cm-1处的特征吸收峰是α-吡喃环和β-吡喃环异头吸收峰，在768cm-1处的弱吸收峰表明含有吡喃糖残基。该条斑紫菜多糖是具有α-和β-构型吡喃基团的硫酸化的杂多糖。
检测抗肿瘤功能：MTT法检测细胞增殖
分别选取对数生长期的细胞HL-7702，Hep3B，HepG2，Hela，MDA-MB-231细胞，0.25％胰酶制成单细胞悬液，调整细胞浓度为3*105个/L，接种于96孔板，每孔100μl，培养
24h带其贴壁后，吸去培养基，加入含有浓度为200μg/mL多糖的培养基，以浓度为10μg/mL的
5-FU作为阳性对照。相同条件下培养48h后，加入20μl浓度为5mg/mL的MTT溶液，培养4h后，吸去培养基，加入100μl的DMSO，摇床上避光溶解15min，利用酶标仪在490nm下测定其吸光度值。
如图4所示，在Hep3b肝癌细胞中，与空白组比较，5-FU有显著的抑制癌细胞增长的能力，癌细胞存活率大约为50％；对于0kGy、20kGy、100kGy的多糖样品，在浓度为200μg/mL时，与空白组比较，0kGy多糖样品有显著的抑制癌细胞增长的能力，并且癌细胞存活率大约为50％；20kGy、100kGy的多糖样品有显著的抑制癌细胞增长的能力，并且癌细胞存活率大约为60％。
如图5所示，在Hela宫颈癌细胞中，与空白组比较，5-FU有显著的抑制癌细胞增长的能力，癌细胞存活率为55％；对于0kGy、20kGy、100kGy的多糖样品，在浓度为200ug/mL时，与空白组比较，多糖样品有显著的抑制癌细胞增长的能力，并且癌细胞存活率为55％；并且随着分子量的降低，癌细胞的存活率降低，其中100kGy的多糖样品比5-FU的抑制效果还强，使癌细胞存活率不到50％。
如图6所示，在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，与空白组比较，5-FU有显著的抑制癌细胞增长的能力，癌细胞存活率为75％；对于0kGy、20kGy、100kGy的多糖样品，在浓度为200ug/mL时，与空白组比较，多糖样品有显著的抑制癌细胞增长的能力，其中0kGy、100kGy的多糖样品，癌细胞存活率为50％，比5-FU的抑制效果还强，20kGy的多糖样品，癌细胞存活率为80％。
如图7所示，在HL-7702肝细胞中，与空白组比较，5-FU可以显著的抑制正常细胞增长的能力，使正常细胞的存活率不到50％；对于0kGy、20kGy、100kGy的多糖样品，在浓度为200ug/mL时，与空白组比较，多糖样品不影响正常细胞的存活率，对正常细胞无毒害，其正常细胞的存活率较空白组稍高，有促进正常细胞增殖的趋势。
综上所述，在上述几株癌细胞中，0kGy、20kGy、100kGy的多糖样品对宫颈癌细胞的生长有显著的抑制效果，并且不会损伤正常细胞的生长繁殖。而且大分子多糖降解后，抗肿瘤活性并未受到显著影响，在宫颈癌细胞中的抑制癌细胞生长效果变得更强，低分子量多糖的生物利用度更高，该低分子量多糖能够开发为具有抗人体宫颈癌细胞的功能性食品或者药品。
以上所述仅是本发明的制备实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，上述假设的这些改进和变型同应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种低分子量条斑紫菜多糖制备方法，其特征在于包括下述步骤：
1)冷冻的条斑紫菜在70℃下烘干，打碎成粉，过40目筛；
2)将步骤1得到的藻粉按照粉末(m):95％乙醇(v)＝1:5的料液比在60℃的条件下回流，脱脂2h，除去乙醇，重复上述步骤2次，最后烘干藻粉；
3)将脱脂的藻粉按照粉末(m):去离子水(v)＝1:30的料液比，在80℃的条件下煮提，2h/次，分离料渣并重复上述煮提步骤1次，收集并合并2次煮提液；
4)将上述煮提液，在60℃的条件下减压浓缩，浓缩至煮提液总体积的1/4，得到浓缩液；
5)将上述浓缩液，按照浓缩液(v):95％乙醇(v)＝1:4的液体体积比，在4℃的条件下醇沉12h后，得到固液混合物；
6)将上述的固液混合物，4000r/min离心15min，得到沉淀；
7)将上述沉淀在60℃条件下，烘干，得到条斑紫菜多糖；
8)检测该条斑紫菜多糖的性质，得到该条斑紫菜多糖分子量为2.3-350kDa，具有硫酸基的α-和β-构型吡喃基团构成的杂多糖，主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成，硫酸基含量为10％；
9)将上述的条斑紫菜多糖，用去离子水配置成5％的条斑紫菜多糖溶液，使多糖含量达172μg/mL，利用γ-射线进行辐射降解，每组辐射率为10kGy/h，总辐射量为20kGy-100kGy；
10)将上述步骤9)中降解的液体，低温减压干燥，得到降解的小分子量条斑紫菜多糖粉末，降解后的条斑紫菜多糖分子量范围为1.5-18kDa，总糖质量含量86％，硫酸基含量为11％。
2.根据权利要求1所述的制备方法得到的低分子量条斑紫菜多糖在制备抗人宫颈癌细胞肿瘤功能性食品或药物中的应用，有较好的抗肿瘤能力并且对正常细胞无毒害。
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