CN112402292B

CN112402292B - 一种天然活性成分抗炎修复精华液及其制备方法

Info

Publication number: CN112402292B
Application number: CN202011343324.7A
Authority: CN
Inventors: 付晓婷; 陈晓丹; 宋文佳
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: ZA202104381B; CN112402292A

Abstract

本发明提供了一种天然活性成分抗炎修复精华液，其特征在于，含有D‑半乳糖‑4‑硫酸酯。具体的制备方法为，首先从条斑紫菜中提取制备D‑半乳糖‑4‑硫酸酯冻干粉末；然后按重量份数计，取D‑半乳糖‑4‑硫酸酯0.5~10，卡波姆0.05~0.15，褐藻胶0.01~0.02，透明质酸0.01~0.1，甘油6~12，香精0.01~0.1，去离子水补足到100，搅拌均匀后杀菌消毒，制得精华液。本发明的显著特点为，以紫菜中提取的D‑半乳糖‑4‑硫酸酯为核心的抗炎活性成分，此为单一纯净的小分子化合物，便于吸收，也便于精准设计配方，稳定功效及品控。经动物实验和人体实验证明，本发明方案提供的精华液有助于粉刺、丘疹、脓疱等皮肤炎症损伤的治疗和修复。

Description

一种天然活性成分抗炎修复精华液及其制备方法

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种天然活性成分的抗炎精华液及其制备方法。

背景技术

大量皮肤问题都与炎症有关。例如常见的痤疮，便是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，主要与皮脂腺分泌过多、痤疮丙酸杆菌定植与过度繁殖、毛囊皮脂腺导管的角化异常等因素相关。痤疮丙酸杆菌在痤疮粉刺形成中能直接调节角质形成细胞的分化，在局部炎症反应中通过刺激角质形成细胞产生前炎症细胞因子IL－1、IL－8、TNF－α等建立一个正反馈来维持促进炎症过程，在瘢痕修复过程中影响金属蛋白酶MMP的表达。

除此以外，炎症也会带来红斑、皮屑、丘疹、脓疱等皮肤问题。因此，护肤品中普遍添加抗炎成分来改善皮肤炎症。但是抗炎成分的安全性和副作用问题一直受人关注，因此白藜芦醇、燕麦仁提取物等具有抗炎功效的天然提取物是目前广受市场欢迎的主流配方成分。

海藻多糖、多肽、酶等藻类提取物，已被证实很多都具备保湿、抑菌、消炎等多种活性功效，且此类物质大多生物相容性好，同时具有丰富的天然来源，因此一直是功能性化妆品活性成分的重点研究领域之一。例如在抗炎领域，专利201580023077.3《透明质酸和硫酸化多糖的组合》、专利申请201911099904.3《一种应用于化妆品的海藻抗炎提取物的制备方法》均披露了应用岩藻提取物——岩藻聚糖硫酸硫酸酯作为化妆品活性抗炎物质的技术方案。但多糖为聚合物，分子量高，且多为杂聚结构，活性成分并不单一，因此其皮肤吸收效率、安全性和抗炎功效的可控性仍不够理想。因此，仍需对藻类活性成分进一步分离纯化并加以应用。

斑马鱼是幅鳍亚纲鲤科短担尼鱼属的一种硬骨鱼，目前化妆品的评价模型主要有两大类：以细胞、组织为对象的体外评价模型以及动物和人体评价模型。其中，动物评价是以实验动物为研究对象进行科学试验，是细胞与人体评价之间的过渡，具有非常重要的意义。斑马鱼是常用的脊椎模式生物，具有哺乳动物无可比拟的优点，是公认的化妆品评价模型。

发明内容

针对背景技术中的问题，本发明提供了一种天然活性成分抗炎修复精华液，其特征在于，含有D-半乳糖-4-硫酸酯，D-半乳糖-4-硫酸酯结构式为

同时本发明提供了这种精华液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备D-半乳糖-4-硫酸酯冻干粉末；

S2，按重量份数计，取D-半乳糖-4-硫酸酯0.5～10，卡波姆0.05～0.15，褐藻胶0.01～0.02，透明质酸0.01～0.1，甘油6～12，香精0.01～0.1，去离子水补足到100，搅拌均匀后杀菌消毒，制得精华液。

具体的，制备D-半乳糖-4-硫酸酯冻干粉末的方法是：

S21，以紫菜为原料，经乙醇除杂，制备提取紫菜琼胶提取物；

S22，向1～5％的紫菜琼胶提取物溶液中加入稀酸至终浓度为0.01～0.1％，60～70℃降解1～3h；

S23，用碱溶液调节pH值至6.0～8.0，加入半乳聚糖糖链降解酶，30～40℃下搅拌或震荡反应3～5h；

S24，向S23制备的溶液中加入稀酸至终浓度0.01％～0.1％，30～40℃温和反应1～3h；

S25,将S24产物使用阴离子交换色谱柱层析进行单糖分离纯化，收集第三个色谱峰的组分，除盐，减压浓缩，冷冻干燥，得半乳糖硫酸酯化合物。

具体的，所述紫菜为条斑紫菜，优选的，为江苏以北山东产的条斑紫菜。北方海水温度低于南方，其所产紫菜生长周期长，琼胶多糖结构与南方紫菜不同，琼胶中分离所得硫酸半乳聚糖的硫酸根含量高。

具体的，所述稀酸为稀盐酸、稀硫酸、稀磷酸、柠檬酸中的一种或几种组合。适中浓度的稀酸能够破坏聚合结构，同时不会造成硫酸根的大量解离。

具体的，所述半乳聚糖糖链降解酶为α琼胶酶、β琼胶酶、紫菜多糖降解酶、卡拉胶酶的一种或几种组合。半乳聚糖糖链降解酶能够将琼胶分子进行外切，将寡糖进一步分解得到新琼二糖。但是其制备效率低，且无法进一步制备单糖，必须与酸法相互结合多步降解。

优选的，所述半乳聚糖糖链降解酶用量为500～1000U。

具体的，所述调节pH值的碱溶液可以为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

具体的，S21紫菜琼胶提取物的制备步骤具体为：

S211，将紫菜粉碎过筛，用95％乙醇在40℃搅拌2h，除去多酚、色素等脂溶性小分子杂质；

S212，脱脂后的紫菜粉末加入纯水于高压灭菌锅中120℃加热提取2h,冷却至室温，浓缩过滤；

S213,向浓缩液中加入数倍体积的95％乙醇，并于4℃下醇沉，离心后将沉淀物复溶于水，冻干，得紫菜琼胶提取物。

这样，通过乙醇处置，去除杂质，高温水提取，不会破坏硫酸根等有效结构，也不会引入其他物质。

具体的，所述S25单糖分离纯化具体设备和工艺为：

S251，在采用阴离子交换色谱柱对单糖进行分离；

S252，收集第三个色谱峰的组分，除盐；

S253，收集含糖各管合并后减压浓缩，冷冻干燥得到纯品。

主要收集含有硫酸根结构的第三个色谱峰组分。

本发明的有益效果在于，采用紫菜中提取的D-半乳糖-4-硫酸酯为核心的抗炎活性成分。此为单一纯净的小分子化合物，便于吸收，也便于精准设计配方，稳定功效及品控。通过化妆品评价模式动物斑马鱼的相关试验，证明其生物相容性好，抗炎效果好。

同时，透明质酸具有保湿、提高创口愈合再生，减少瘢痕的作用，再加入能够保湿、滋润皮肤的甘油、褐藻胶以及增稠剂卡波姆。经人体实验证明，本发明方案提供的精华液有助于粉刺、丘疹、脓疱等皮肤炎症损伤的治疗和修复。

附图说明

图1为本发明一种天然活性成分抗炎修复精华液的核心抗炎活性成分D-半乳糖-4-硫酸酯结构式；

图2为D-半乳糖-4-硫酸酯制备过程中在Akta Pure纯化仪上采用DEAE-Sepharose阴离子交换色谱柱对单糖进行分离的分离色谱图。

图3为测试例1中斑马鱼胚胎存活率实验结果。

图4为测试例1中斑马鱼胚胎心跳速率实验结果。

图5为测试例1中斑马鱼胚胎卵黄囊大小实验结果。

图6为测试例1中的斑马鱼细胞死亡率实验结果。

图7为测试例1中斑马鱼体内NO含量实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细的说明。

实施例

一种天然活性成分抗炎精华液，其成分按重量份数计，D-半乳糖-4-硫酸酯冻干粉末2份，卡波姆0.1份，褐藻胶0.02份，透明质酸0.05份，甘油12份，作为香精的薰衣草精油0.05份，去离子水补足到100份。

其制备方法为，将所有组分搅拌均匀后杀菌消毒，制得精华液。

其中，D-半乳糖-4-硫酸酯的制备方法为：

首先，是琼胶的制备。以山东产条斑紫菜为原料，将干燥的条斑紫菜经粉碎机粉碎后，过60目筛，准确称取紫菜粉末15g于1L烧杯中，加入300mL 95％乙醇，40℃搅拌2h，以除去多酚，色素等脂溶性小分子杂质。脱脂后的紫菜粉末加入450mL的纯水于高压灭菌锅中120℃，提取2h。冷却至室温，提取液经过滤、浓缩，向浓缩液中加入4倍体积的95％乙醇。浓缩液于4℃醇沉过夜后，于3500r/min离心15min，所得沉淀复溶于水后冻干，得到紫菜琼胶提取物。

然后，向2％的紫菜琼胶提取物溶液中加入稀盐酸至终浓度0.01％，60℃降解2h。

将溶液用氢氧化钠溶液调节pH值至约7.0，加入500U Agariorans albus YKW-34产β琼胶酶AgaA34，在40℃温度下200rpm搅拌或震荡反应3h。

再向溶液中加入稀盐酸至终浓度为0.02％，30℃温和反应1h。

在Akta Pure纯化仪上采用DEAE-Sepharose阴离子交换色谱柱对单糖进行分离，分离色谱图见图2。其中F1应为3'6内醚-L-半乳糖，F2为L-半乳糖或D-半乳糖，F3为D-半乳糖-4-硫酸酯。

收集F3组分，在Akta Pure纯化仪上采用Bio-gel P2进行除盐，收集含糖各管合并后减压浓缩，冷冻干燥得到D-半乳糖-4-硫酸酯冻干粉末。

测试例1

核心抗炎活性成分D-半乳糖-4-硫酸酯对化妆品评价模式动物斑马鱼的抗炎作用评价。

(1)斑马鱼喂养及胚胎收集。斑马鱼饲养于全自动循环系统中，参照Westerfield的方法养殖、培育，(26±1)℃水环境，光周期为照明14h/黑暗10h交替进行，每日以一定量的丰年虾(卤虫)于早晚固定时间各饲喂一次。实验用胚胎由健康雌雄斑马鱼自然交配获得。收集300～400枚胚胎于干净培养皿中并移除排泄物、杂质及未受精胚胎，加入胚胎培养液(10％NaCl，0.3％KCl，0.3％CaCl₂，0.79％MgSO₄，0.1％亚甲基蓝)，转移于(28.5±1)℃恒温培养箱中培养7～9h。

(2)胚胎给药。筛筛选受精且发育至7～9hpf(hours post fertilization)时期斑马鱼胚胎，移入细胞培养板中。根据实验设计，空白组标记为不给药，LPS诱导组加入终浓度为10μg/mL的LPS，实验组在LSP之外分别加入0、50、100、200μg/mL的D-半乳糖-4-硫酸酯，给药方式均是将诱导物或活性物溶于胚胎培养液进行浸泡处理。给药后，将细胞培养板板转移于(28.5±1)℃恒温培养箱中继续培养且每日更换培养液，待后续观察及检测。

(3)斑马鱼存活率统计。各实验组加药后注意每日8：30-22:00，每隔2小时观察胚胎发育状况，及时移除死亡胚胎并记录，统计各组胚胎发育至72hpf时期存活率情况。存活率＝存活胚胎数/总胚胎数×100％。

实验结果如图3所示，与空白对照组(100％)相比，LPS诱导受精后第三天的胚胎，其存活率显著下降至60％左右，而不同浓度D-半乳糖-4-硫酸酯预处理后，胚胎存活率呈现剂量依赖性升高。当达到200μg/mL时，D-半乳糖-4-硫酸酯预处理的斑马鱼胚胎存活率达到89.33％。

(4)幼鱼心跳速率检测。实验幼鱼胚胎达48hpf时期(彻底脱膜后)，通过显微镜观察胚胎心脏发育情况，检测心跳速率的大小。具体的对各组幼鱼心跳进行30s人工计数(注意环境温度在28.5±1℃的恒温条件下)，并计算各组与空白组心跳速率之比。

实验结果如图4所示，与空白对照组(100％)相比，LPS诱导胚胎心跳速率显著增加(p<0.05)，达到125.53％左右，说明LPS刺激胚胎出现炎症表型，导致心跳速率增加。而一定浓度D-半乳糖-4-硫酸酯预孵育后，胚胎心跳速率随浓度的升高而降低，表现出剂量依赖性趋势。当D-半乳糖-4-硫酸酯浓度为200μg/mL时，与空白对照组相比，心跳速率降至105.93％。

(5)幼鱼卵黄囊大小测定。对各组出膜幼鱼进行卵黄囊大小测定。实验幼鱼胚胎达48hpf时期(彻底脱膜后)，用带摄像头的体式显微镜(25×)对摆位后的幼鱼拍照并计算各组与空白组卵黄囊大小之比。卵黄囊大小＝给药组卵黄囊面积/空白组卵黄囊面积×100％。

实验结果如图5，LPS诱导组的胚胎48h后发育迟缓，卵黄消耗少，卵黄囊大小是空白组的1.468倍。而D-半乳糖-4-硫酸酯处理组的卵黄囊大小随着其浓度的增加逐渐降低，在D-半乳糖-4-硫酸酯浓度为200μg/mL时，与空白对照组相比，卵黄囊大小降至111.34％。说明D-半乳糖-4-硫酸酯能抑制LPS诱导造成的胚胎发育缓慢的炎症反应，提高胚胎发育速度，使卵黄消耗逐渐恢复正常，表明D-半乳糖-4-硫酸酯对LPS诱导的斑马鱼炎症反应造成的发育迟缓有抑制作用，进一步证明D-半乳糖-4-硫酸酯能在斑马鱼胚胎受到LPS等外界刺激时起到积极的保护作用。

(6)斑马鱼幼鱼体内荧光染色及各荧光强度的分析。对各组胚胎发育至72hpf幼鱼时期，随机选择各组胚胎数条对其进行荧光染色。荧光染料观察幼鱼体内NO水平变化的DAF-FM DA以及观察幼鱼体内细胞死亡率的吖叮橙。28.5±1℃的恒温条件下，利用DAF-FMDA(20μg/ml)和吖啶橙(7μg/mL)对各组幼鱼分别避光染色孵育1h、2h和30min。染色孵育后，先用胚胎培养液洗涤幼鱼3～5次，后用0.03％三卡因麻醉幼鱼，最后将幼鱼置于荧光显微镜下捕获相应荧光图片，并用image J软件分析、统计相对荧光强度。NO生成率/细胞死亡率＝给药组荧光强度/空白组荧光强度×100％。

LPS诱导的斑马鱼细胞死亡率实验结果如图6所示，空白对照组幼鱼经吖啶橙染色后，荧光强度很弱，而LPS诱导后荧光强度显著增高，其细胞死亡率升高至288.14％。预孵育50、100、200μg/mL的D-半乳糖-4-硫酸酯均显著降低了由LPS诱导的炎症损伤所引起的细胞死亡，其抑制作用呈剂量依赖性趋势。此外，当浓度为200μg/mL时，与LPS组相比，斑马鱼幼鱼的荧光强度最弱，细胞死亡率最低，可降低153.48％，这表明200μg/mL的D-半乳糖-4-硫酸酯有效抑制了斑马鱼幼鱼体内的细胞死亡。

LPS诱导的斑马鱼体内NO含量实验结果如图7所示，LPS诱导后斑马鱼幼鱼体内释放大量的NO，NO与相应荧光染料反应，表现出强烈的荧光现象，其荧光强度可达空白组的2.5倍以上，而D-半乳糖-4-硫酸酯预处理后则剂量依赖性的降低了幼鱼体内NO水平，且在200μg/mL的D-半乳糖-4-硫酸酯作用下，斑马鱼NO产生量达到最低，接近正常水平。

综上所述，由(3)～(6)实验结果可知，斑马鱼动物实验可证实，D-半乳糖-4-硫酸酯具备优异的抗炎功效，可作为抗炎活性成分用于化妆品中。

测试例2

对实施例的天然活性成分抗炎修复精华液进行功效验证。

24名年龄在20～30岁的痤疮患者，随机分为实验组16名(男4，女12)和对照组8名(男2，女6)，治疗前符合：Ⅰ级：颜面部粉刺为主，少量丘疹、脓疱，总皮损≤30个；Ⅱ级：颜面部粉刺和中等量丘疹、脓疱，总皮损数31～50个。

实验组：采用实施例中制备的精华液用于面部，每天早晚各1次，每次用吸管定量吸取并施用3mL，轻拍皮肤至精华液吸收。连续治疗4周，对治疗前及1、2、4周面部粉刺、丘疹、脓疱的数目进行计数，计算疗效指数。

对照组：采用不含D-半乳糖-4-硫酸酯、其余组分含量与实施例相同的精华液用于面部，其余实验方法与实验组相同。

实验结果如下表：

由实验结果可知，治疗2周后，疗效指数平均值31.39％，疗效为好转；治疗4周后，疗效指数平均值60.25％，疗效为显著。

由上述实施例和测试例，D-半乳糖-4-硫酸酯通过斑马鱼模型试验，证明其生物相容性好，抗炎效果好；且其作为单一纯净的小分子化合物，便于吸收，也便于精准设计配方，稳定功效及品控。本发明以此为核心成分制备的精华液具有显著的皮肤抗炎修复疗效，因此具备良好的市场价值和推广前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备D-半乳糖-4-硫酸酯冻干粉末；

2.如权利要求1所述的一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，制备D-半乳糖-4-硫酸酯冻干粉末的方法是：

3.如权利要求2所述的一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，所述紫菜为条斑紫菜。

4.如权利要求2所述的一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，所述稀酸为稀盐酸、稀硫酸、稀磷酸、柠檬酸中的一种或几种组合。

5.如权利要求2所述的一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，所述半乳聚糖糖链降解酶为α琼胶酶、β琼胶酶、紫菜多糖降解酶、卡拉胶酶的一种或几种组合。

6.如权利要求2所述的一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，半乳聚糖糖链降解酶用量为500～1000U。

7.如权利要求2所述的一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，所述碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液。

8.如权利要求2所述的一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，所述S21紫菜琼胶提取物的制备步骤具体为：

S211，将紫菜粉碎过筛，用95％乙醇在40℃搅拌2h脱脂除杂；

S212，脱脂后的紫菜粉末加入纯水，于高压灭菌锅中120℃加热提取2h，冷却至室温，浓缩过滤；

S213，向浓缩液中加入数倍体积的95％乙醇，并于4℃下醇沉，离心后将沉淀物复溶于水，冻干，得紫菜琼胶提取物。

9.如权利要求2所述的一种天然活性成分抗炎修复精华液的制备方法，其特征在于，所述S25单糖分离纯化工艺为：

S251，采用阴离子交换色谱柱对单糖进行分离；

S252，收集第三个色谱峰组分，除盐；

S253，收集含糖各管合并后减压浓缩，冷冻干燥得到纯品。