CN1341126A - 硫酸化岩藻半乳聚糖 - Google Patents

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Abstract

硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐作为一种用于糖链工程或HGF产生诱导物的试剂的用途;通过用硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶处理硫酸化岩藻半乳聚糖获得的消化产物或其盐;硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶在糖链工程中的用途;通过用上述酶处理硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐生产降解产物的方法;和生产硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的方法。

Description

硫酸化岩藻半乳聚糖
技术领域
本发明涉及作为一种用于糖技术的试剂是有用途的硫酸化岩藻半乳聚糖，来自硫酸化聚糖的较小分子及其生产方法，还涉及在糖技术领域是有用途的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶和生产该酶的方法。
背景技术
褐藻含有多种含有聚糖的硫酸化岩藻糖。例如，如(1)由岩藻糖和硫酸基团组成的硫酸化岩藻聚糖；(2)含有葡萄糖醛酸、甘露糖、岩藻糖和硫酸基团等的硫酸化fucoglucuronomnans，例如在WO97/26896中所描述的那样含有多糖-U的硫酸化岩藻糖(组成性糖的近似的摩尔比为岩藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸基团＝10∶7∶4∶5∶20；在下文中称作U-岩藻多糖)；和(3)包括岩藻糖和半乳糖的硫酸化岩藻半乳聚糖，例如在WO97/26896中所描述的那样含有多糖-F的硫酸化岩藻糖(组成性糖的近似的摩尔比，岩藻糖∶甘露糖＝10∶1；在下文中称作F-岩藻多糖)的含有多糖的硫酸化岩藻糖是已知的。几乎所有的这些包含多糖的硫酸化岩藻糖都是大分子阴离子。因此，在多种纯化步骤中它们表现出在物理和化学上地相似的方式，使得它们相互之间难于分离。为此，通常一直检测没有使它们相互分离的得自褐藻的含有多糖的硫酸化岩藻糖的生物学活性。因此，难于鉴定对观察到的生物学活性起作用的含有多糖的硫酸化岩藻糖。
迄今为止，已经知道了如在《农业的和生物的化学》，44(8)：1965-1966(1980)中所描述的硫酸化岩藻聚糖部分的活性和分子之间的相互关系，其与抗凝血活性有关，并且如在WO97/26896中描述的U-岩藻多糖，其与诱导凋亡的抗肿瘤细胞的活性有关。
已经检测了硫酸化岩藻聚糖部分作为替代肝素的抗凝剂的用途。但是，如果硫酸化岩藻聚糖要被用作成药，那么为了避免由于不能预料的活性而出现的副作用需要获得高纯的硫酸化岩藻聚糖。因此，一直期望获得用于此的一种方法。
关于U-岩藻多糖，为了利用诱导凋亡的抗肿瘤细胞的活性制备药物，类似地需要方便地获得高纯度的含有多糖-U的硫酸化岩藻糖。因此，一直期望获得用于此的一种方法。
通常，酶消化是用于多糖结构分析和寡糖生产的最有效的方法。而且，只有一种多糖可以轻易地从如下几乎不能相互分开的多糖混合物中去除。将要被去除的多糖通过用特异地消化多糖的酶消化它转化成小分子。然后混合物进行如超滤法等的分子量分级分离。
如果可获得特异地消化硫酸化岩藻半乳聚糖的酶，那么就可容易地进行硫酸化岩藻半乳聚糖的结构分析和硫酸化岩藻半乳聚糖寡糖的生产。
如上所述，一直期望获得硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶和酶法生产硫酸化岩藻半乳聚糖寡糖的方法。
发明目的
因此，本发明的主要目的是提供(1)硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐，其可用作用于糖技术或肝细胞生长因子(HGF)产生的诱导物的一种试剂；(2)通过由硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐获得的较小的分子；(3)可用于糖技术的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶；(4)通过由上述酶作用于硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐获得的生产较小分子的方法；和(5)生产硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的方法。发明概述
作为深入研究的结果，本发明人已发现包含在褐藻中的硫酸化岩藻半乳聚糖、消化硫酸化多糖的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶及其生产方法。而且，本发明人已发现来自可被用作用于糖技术的试剂的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子及其生产方法，因此完成了本发明。
本发明的第一各方面涉及具有下面化学和物理性质的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐。硫酸化岩藻半乳聚糖含有以1∶1至6∶1摩尔比的半乳糖和岩藻糖作为组成性糖并且含有通式(XI)的硫酸化糖作为组成性糖的基本成分：
Figure A0080415700081
其中R是H或SO3H。
而且，通过本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶将硫酸化岩藻半乳聚糖转化为较小的分子以产生至少一种选自通式(I)至(IV)的化合物：
Figure A0080415700101
其中R是H或SO3H。
本发明的第二个方面涉及具有选自通式(II)、(III’)和(IV)的化学结构的糖或其盐：
Figure A0080415700111
其中R是H或SO3H。
本发明的第三个方面涉及具有下面化学和物理性质的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶：此酶能做用于将含有以1∶1至6∶1摩尔比的半乳糖和岩藻糖作为组成性糖的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐来转化硫酸化岩藻半乳聚糖成小分子并且在它的还原末端产生具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖；具有约7到9的最适pH和约25到45℃的最适温度。
本发明的第四个方面涉及由硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐生产较小分子的方法，特征在于此方法包括由根据第三个方面的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于得自褐藻的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐并且获得较小分子。使用酶获得的较小分子的例子包括根据第二个方面的寡糖或其盐。
本发明的第五个方面涉及生产第三方面的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的方法，特征在于此方法包括培养能够产生硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的黄杆菌属细菌和收集来自培养物的该酶。
附图简述
图1示本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶pH和相对活性(％)之间的关系。
图2示本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶温度和相对活性(％)之间的关系。
图3阐明来自根据本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(A)的1H-NMR图谱。
图4示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(A)的13C-NMR图谱。
图5示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(A)的质谱图。
图6示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(B)的1H-NMR图谱。
图7示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(B)的13C-NMR图谱。
图8示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(B)的质谱图。
图9示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(C)的1H-NMR图谱。
图10示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(C)的13C-NMR图谱。
图11示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(C)的质谱图。
图12示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(D)的1H-NMR图谱。
图13示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(D)的13C-NMR图谱。
图14示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(D)的质谱图。
图15示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(E)的1H-NMR图谱。
图16示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(E)的13C-NMR图谱。
图17示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(E)的质谱图。
图18示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(F)的1H-NMR图谱。
图19示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(F)的13C-NMR图谱。
图20示来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(F)的质谱图。
图21示本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的1H-NMR图谱。
图22示本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的13C-NMR图谱。
图23示本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的的红外吸收图谱。
图24示来自用0.4M氯化钠洗脱的含有多糖的硫酸岩藻糖的较小分子部分的质谱图。
图25示来自用0.4M氯化钠洗脱的含有多糖的硫酸岩藻糖的较小分子部分的1H-NMR图谱。
图26示来自用0.4M氯化钠洗脱的含有多糖的硫酸岩藻糖的较小分子部分的13C-NMR图谱。
图27示来自用0.6M氯化钠洗脱的含有多糖的硫酸岩藻糖的较小分子部分的1H-NMR图谱。
发明详述
下面将详细地解释本发明。
海藻(Seaweed)属于含有多种含有多糖的硫酸化岩藻糖的褐藻。已经报道了包括硫酸化岩藻聚糖和硫酸化fucoglucurnomannans的这样的多糖的几种分子类型。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖主要包含以1∶1至6∶1摩尔比的半乳糖和岩藻糖作为组成性糖的硫酸化岩藻半乳聚糖(在下文中称作本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或G-岩藻多糖)。其例子包括含有以2∶1的摩尔比的半乳糖和岩藻糖的硫酸化岩藻半乳聚糖。硫酸化岩藻半乳聚糖是具有如用HPLC凝胶过滤确定的约为130,000(分子量分布：约100,000至约200,000)平均分子量的硫酸化多糖。硫酸化岩藻半乳聚糖的分子量、糖组成和硫酸基团的含量依硫酸化岩藻半乳聚糖原料收获的时间、用于干燥原料的方法和用于贮存原料的方法而变化。另外，它们依用于提取硫酸化岩藻半乳聚糖的加热条件、pH等而变化。例如，硫酸化岩藻半乳聚糖可以被酸水解。因此，如这里所描述的硫酸化岩藻半乳聚糖的分子量、分子量分布、糖组成或硫酸基团含量只是例子并且依用于提取硫酸化岩藻半乳聚糖的条件可以轻易地改变。例如，当通过使用如这里所描述的含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖和含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖制备本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖时，可获得具有如上所述的糖组成和分子量的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。因此，可使用适当的可选择的制备条件制备具有任何分子量、分子量分布、糖组成或硫酸基团含量的硫酸化岩藻半乳聚糖。例如，在本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的6个主要组成性糖中含有约5个硫酸基团残基。通常，通过酯键连接到糖上的硫酸基团在化学上是不稳定的并且容易用酸、碱或热裂解。例如，通过在酸或碱的条件下加热可减少硫酸基团的含量。相应地，可将本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖有意识地脱硫酸。裂解硫酸基团的数量可通过选择酸或碱的类型和/或浓度还有根据脱硫酸盐作用的加热的温度和/或时间来控制。因此，本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖包括是具有如上所述的特征的硫酸化岩藻半乳聚糖的那些得自褐藻的全部和通过本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶转化成小分子的硫酸化岩藻半乳聚糖。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖主链由下面的通式(XII)代表。本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖包括那些其中n是1或更大数字的整数的通式，例如1到1000，优选地1到500。本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖包括具有通式(XII)是连续地重复的那些结构和具有只要它们是在如上所述的定义之内的不连续地包括被其他结构插入的通式(XII)的那些结构。
Figure A0080415700141
其中R是H或SO3H。
例如，可以由其制备本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的褐藻包括，但不只限于，Kjellmaniella crassifolia，裙带菜(Undariapinnatifida)，海带(Laminaria japonica)，双环羽叶藻(Eiseniabicyclis)，Ecklonia cava，鹅掌菜(Ecklonia Kurome)，Lessonianigrescence，Giant kelp和durvillaea。没有限制，例如得自Kjellmaniella crassifolia的岩藻多糖含有U-岩藻多糖和F-岩藻多糖也有本发明的G-岩藻多糖。
药物可接受的盐可以被用作本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的盐。盐的例子包括如钠和钾等碱金属盐、如钙和镁的碱土金属盐和如锌的过渡金属的盐，也包括胺盐。
如这里所使用的，来自硫酸化岩藻半乳聚糖的小分子指在它的还原末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖，其通过由本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖来获得。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖来转化硫酸化岩藻半乳聚糖成较小分子并且产生在它的还原末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖。如在WO97/26896中所述的内型含有多糖消化酶的硫酸岩藻糖，其消化含有多糖-F的硫酸化岩藻糖，不消化本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。另外，本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶是消化在本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖中的硫酸化D-半乳糖或半乳糖和硫酸化D-半乳糖或半乳糖之间的β1-6键和β1-4键的酶。
通过首先获得含有包含来自褐藻的多糖的硫酸化岩藻糖的部分，然后从其中纯化本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖可方便地生产作为本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的底物的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。例如，为了生产含有包含多糖的硫酸化岩藻糖部分，首先从褐藻中获得水溶性部分的提取物。在这种情况下，为了防止含有多糖的硫酸化岩藻糖转化成较小分子，优选地在pH4-9、100℃或低于100℃的温度下进行提取。
用于从提取物中除去褐藻酸的方法包括利用通过在酸性条件下处理褐藻酸的等电点沉淀的方法、在其中加入盐(例如，钙盐)与褐藻酸形成沉淀的方法、用褐藻酸降解酶消化褐藻酸的方法等。而且如氨基酸和甘露醇的小分子可以使用超滤有效地除去。活性炭处理可有效的用于疏水物质的除去。
如上所述可获得含有多糖的硫酸化岩藻糖的混合物。本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖可以通过如在WO97/26896中所描述的含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖作为内型含有多糖消化酶的硫酸岩藻糖和如在WO97/26896中所描述的含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖作为内型岩藻多糖消化酶来做用于含有多糖的硫酸化岩藻糖的混合物而从混合物中制备，然后使用超滤去除较小分子部分。
因此获得的硫酸化岩藻半乳聚糖制品可能含有除硫酸化岩藻半乳聚糖之外的几种含有多糖的硫酸化岩藻糖。在这种情况下，例如，通过使用阴离子交换树脂的分离和纯化可以分离本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。这一过程的应用使得要使用的树脂的量少于用于含有多糖的硫酸化岩藻糖的混合物直接用阴离子交换树脂进行分离的过程的量。而且，由于没有污染上述两种含有多糖的硫酸化岩藻糖而明显地改善了分离。
当本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶得到纯化时如上所述获得的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖可用作确定活性的底物。可替代地，它可用作生产本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖寡糖的原料。上述含有多糖的硫酸化岩藻糖混合物可用作生产硫酸化岩藻半乳聚糖寡糖的原料。
任何细菌菌株都可用于生产本发明的酶，只要它们产生转化本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖成较小分子的酶。例如，可优选地使用如在WO97/26896所描述的黄杆菌SA-0082(Flavobacterium sp.SA-0082)。该菌株于1995年3月29日保藏于通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所，保藏于FERM P-14982(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，邮编305-8566)，并于1996年1月15日转为国际保藏，保藏号FERM BP-5402。根据包括革兰氏染色、DNA的GC含量和主要的苯醌的细菌学性质确定了这一菌种属于黄杆菌属。另一方面，由于近来在分类标准中经常考虑到16S rDNAs碱基序列，本发明人使用在因特网上可得到的生物技术信息国家中心(NCBI)的高级BLAST搜索进行了本细菌16S rDNA碱基序列的同源性搜索。
对基因序列与上述碱基序列高度同源的细菌的搜索显示Polaribacter filamentus的基因在整个区域具有最高的同源性(在1424个碱基的区域有89％同源性)。没有发现其它在整个区域具有高度同源序列的细菌。来自Polaribacter irgensii(在1360个碱基的区域有89％同源性)、噬纤维菌类(Cytophaga sp.)(在1249个碱基的区域有92％同源性)和海洋黄杆菌(Flexibacter maritimus)(在1247个碱基的区域有91％同源性)的序列显示相对高的同源性。通常，如果在16S rDNAs碱基序列之间的同源性是90％或更少则不能确定细菌为相同属。于是，如果使用这一遗传分类，判定本细菌不属于已知细菌的属。因此，因为本细菌的大多数细菌学性质与那些属于噬纤维菌目(Cytophagales)的黄杆菌属的细菌相匹配并且因为16S rDNAs碱基序列与本细菌的16S rDNAs碱基序列高度同源的全部的这四个细菌属于噬纤维菌目，所以认为本细菌是属于噬纤维菌目的一个新的细菌。如这里所使用的，黄杆菌属细菌包括在细菌学上归类于黄杆菌属的细菌也包括依据序列同源性在遗传学上归类于噬纤维菌目的细菌。因此，生产本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的方法包括培养属于噬纤维菌目的细菌来生产本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的方法。
在生产本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的方法中任何培养基都可用于细菌菌株，只要它们被用于生产本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的细菌菌株所代谢。例如，可利用硫酸化岩藻半乳聚糖、含有多糖的硫酸化岩藻糖混合物、海藻粉、海藻酸、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇、甘油、蔗糖、麦芽糖等作为碳源。优选的使用蛋白胨、酵母提取物、肉浸膏等作为氮源。而且，本细菌在含有上述营养的海水或人造海水中生长良好。
生产量依用于培养本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的生产菌株的条件而变化。优选的培养条件是15到30℃的培养温度和6到9的培养基的pH。通气搅拌培养5到72小时候获得本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的最大产量。自然地，确定培养条件以使本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的产量变成最大程度地依赖所用的细菌菌种、培养基组成等。在细胞和培养基上清中都存在硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶。
通过在适当的培养基中培养黄杆菌SA-0082、收集细胞、和通过例如超声处理的细胞裂解的常规的方法裂解细胞获得无细胞提取物。然后可以从提取物中通过常规的纯化方法获得纯化的酶制剂。通过使用例如，盐析、离子交换柱层析、疏水键柱层析、凝胶过滤等的纯化可获得基本上不含其他含有多糖消化酶的硫酸化岩藻糖的纯化的形式的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶。而且，可以使用类似于细胞内酶纯化的纯化过程从也含有大量酶的和从培养物中除去细胞而得到的培养上清液中来纯化本发明的酶。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的化学和物理性质如下：
(I)作用于含有以1∶1到6∶1的摩尔比的半乳糖和岩藻糖作为组成性糖的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐以转化硫酸化岩藻半乳聚糖成为较小分子并且产生在其还原性末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖；
(II)具有约7到9的最适pH(图1，阐明本发明的酶的反应pH和相对活性之间关系的图形，其中纵轴代表相对活性(％)，横轴代表pH)；和
(III)具有约25到45℃的最佳温度(图2，阐明本发明的酶的反应温度和相对活性之间关系的图形，其中纵轴代表相对活性(％)横轴代表温度(℃))。
例如，通过分析由酶作用于硫酸化岩藻半乳聚糖获得的消化产物、使用HPLC和确定转化成小分子的程度可确定本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的活性。可替代地，通过根据常规的方法通过测量还原末端的产生可确定活性。即可使用来自生产菌株的细胞提取物也可用色谱纯化后获得的酶溶液确定活性。
可通过由本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶去作用于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或含有硫酸化岩藻半乳聚糖的原料来制备来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐的较小分子。例如，来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的部分纯化产物、来自褐藻的含有多糖的硫酸化岩藻糖的部分、通过用水溶剂提取褐藻得到的产物、或褐藻本身可被优选地用作含有本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的原料。
根据传统方法可以溶解本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或含有硫酸化岩藻半乳聚糖的原料。可以最大浓度在溶液中溶解本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或含有硫酸化岩藻半乳聚糖的原料。但是，通常选择的浓度考虑到它的可操作性和酶的滴度。可依据目的从水、缓冲液等中选择本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的溶剂。通常，溶液的pH近中性。酶反应通常是在约30℃进行。可通过调节酶量反应时间等来控制较小分子的分子量。通过将较小分子进行分子量分级分离可制备具有更均一分子量分布的来自本发明硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子。可应用如凝胶过滤和分子量分级分离膜的分子量分级分离的常规的方式。可选择地，较小分子可使用离子交换树脂处理、活性炭处理来进一步纯化，或者它们可以被脱盐、灭菌或冻干。
没有限制，例如，来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子包括通过由本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖获得的二糖至六糖。在本发明的较小分子中用硫酸基团取代的位置依赖于制备方法。通过本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的作用获得的所有的较小的分子都包括在本发明的较小分子中。例如，较小分子的化学结构由下面的通式(I)至(IV)表示。在这些中，认为通式(III)是硫酸化岩藻半乳聚糖组成性单位。
Figure A0080415700201
其中R是H或SO3H。
本发明的较小分子在分子内具有硫酸基团，这一基团与多种碱反应形成盐。来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子当其是以盐的形式的时候是稳定的。其通常以钠和/或钾和/或钙盐的形式提供。游离形式的来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子可通过应用如Dowex 50W(Dow Chemical)阳离子交换树脂从其盐中获得。任选地，可进一步进行常规的盐交换以转化其为想要的多种盐的任何一种。
药学上可接受的盐可被用作来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子的盐。盐的例子包括如钠和钾等碱金属盐、如钙和镁的碱土金属盐和如锌的过渡金属在内的盐，也包括胺盐。
只有包含在任何含有包含多糖的硫酸化岩藻糖的部分中的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖可通过使用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶转化成较小分子。因此，本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖可通过使用酶结合分子量分级分离选择性地除去。例如，已报道含有硫酸化岩藻聚糖的部分具有如抗凝活性、抑制肿瘤转移活性和抑制病毒感染活性的多种生物学活性。按照常规方法从褐藻中获得的含有硫酸化岩藻聚糖的部分含有硫酸化岩藻聚糖和其它多糖。通过应用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶可从含有硫酸化岩藻聚糖的部分中除去硫酸化岩藻半乳聚糖。结果，可获得高纯的硫酸化岩藻聚糖。
而且，已报道了例如，硫酸化fucoglucuronmannans具有抗肿瘤细胞的诱导凋亡的活性。在从褐藻中获得的硫酸化fucoglucuronmannans中污染的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖可通过应用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶轻易地除去。结果，可方便的获得高纯度的硫酸化fucoglucuronmannans。
例如，为了除去本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖在水溶剂中制备含有本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖原料的溶液。按照常规方法可以溶解含有本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的原料。可以最大浓度在溶液中溶解含有本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的原料。但是，通常选择的浓度考虑到它的可操作性和酶的滴度。可依据目的从水、缓冲液等中选择本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的溶剂。通常，溶液优选的pH近中性。然后加入本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶或已经固定在底物上的酶、或两者都加入并且与含有本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖原料的溶液反应以转化本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖成为较小分子。酶反应通常在约30℃进行。依据在后来的步骤中分子量分级分离的能力可以适当地调整酶量、反应时间等。可通过将结果混合物进行分子量分级分离来制备已经轻易地去除了来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子的目的产品。可应用如凝胶过滤和利用分子量分级分离膜的超滤的分子量分级分离的常规方式。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。因此，它可用于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的结构分析。例如，通过使用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖获得了具有上面通式(I)至(IV)化学结构的较小分子。
可通过由本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶选择性地从含有本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的含有多糖的硫酸化岩藻糖中除去本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。例如，可优选地将已经除去了本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖成分的高纯的硫酸化岩藻聚糖或硫酸化fucoglucuronomannans用作药品原料。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶可与如在WO97/26896所描述的含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖和/或如在WO97/26896所描述的含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖结合使用。没有限制，例如，当用上述的含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖和本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶处理通过在pH4到9在100℃或低于100℃条件下的Kjellmaniella crassifolia的提取获得的含有多糖的硫酸化岩藻糖的混合物时，可获得含有下面通式(XVI)以重复的方式的作为组成性糖的基本成分的硫酸化糖的硫酸化多糖。获得了其中n是1或更大数字的整数，例如1至10,000，优选地1到5,000的下面通式的硫酸化糖。
Figure A0080415700231
其中R是H或OSO3H。
上述硫酸化多糖含有岩藻糖作为组成性糖。例如，在pH6到8在95℃提取2个小时产生约200,000的平均分子量(分子量分布：约10,000至约1,000,000)。而且，例如，在pH6到8在25℃提取24个小时产生约13,000,000的平均分子量(分子量分布：约100,000至约20,000,000)。平均分子量和分子量分布依赖上述的提取条件而变化。但是，通过含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖将结果硫酸化多糖转化成较小分子与所用的提取条件无关。硫酸化多糖的分子量和硫酸基团的含量依赖于硫酸化多糖原料收获的时间、用于干燥原料的方法和用于贮存原料的方法而变化。另外，它们依赖于用于提取的加热条件、pH等而变化。例如，用酸可以水解硫酸化多糖。因此，如这里所述的硫酸化多糖分子量、分子量分布或硫酸基团的含量只是些例子并且依据提取硫酸化多糖的条件可以轻易地改变。因此，使用适当地可选择的制备条件可制备具有任何分子量、分子量分布或硫酸基团含量的硫酸化多糖。例如，在硫酸化多糖的7个主要的组成性糖中含有约12个硫酸基团。通常，通过酯键连接到糖上的硫酸基团在化学上是不稳定的并且容易用酸、碱或加热裂解。例如，通过在酸或碱的条件下加热减少了硫酸基团的含量。相应地，可将硫酸化多糖可有意地脱硫酸盐。通过选择酸或碱的类型和/或浓度还有脱硫酸盐作用时加热的温度和/或时间可控制裂解的硫酸基团的量。
而且，通过联合使用硫酸化岩藻半乳聚糖、含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖和含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖可获得新的硫酸化糖。另外，通过上述三种消化酶的联合使用可将硫酸化糖以不同于常规的方式分类。没有限制，例如，当由酶作用于得自如Kjellmaniella crassifolia的褐藻的含有多糖的硫酸化岩藻糖时可获得下面的部分：
(1)不能用含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖消化酶或含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖消化但是能用硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶(本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶)消化的硫酸化糖的部分；
(2)不能用硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶或含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖消化但是能用含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖消化的硫酸化糖的部分；
(3)不能用硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶或含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖消化但是能用含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖消化的硫酸化糖的部分；和
(4)不能用硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶、含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖或含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖消化的硫酸化糖的部分。不联合使用含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖或含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖和本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶将不能获得硫酸化糖的这些部分。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐具有诱导生长因子产生的活性，尤其是诱导肝细胞生长因子(HGF)产生的活性。
在进行部分肝切除术后肝迅速地再生至原始大小。知道肝再生涉及的必须的因子已很长时间了。然后，在来自患有爆发型肝炎的患者的血浆中发现了HGF并且从那里分离和纯化(临床调查杂志(J.Clin.Invest.)，88：414-419，1988)。而且，克隆了人HGF的cDNA，并且揭示了HGF的一级结构(生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，163：967-973，1989)。而且，证明了激活细胞运动性的分散因子和肿瘤细胞毒素因子(TCF)与HGF是相同的物质(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7001-7005；生物化学生物物理学研究通讯，180：1151-1158，1991)。
HGF促进多种类型的包括除肝细胞外的胆管上皮细胞、肾小管上皮细胞和胃粘膜细胞的上皮细胞的生长。而且，HGF是一种多功能的活性物质，其显示了包括上皮细胞运动性激活还有如上皮细胞血管形成和腔形成的形态发生的诱导的种种广泛的生理学活性。换句话说，在用于损伤器官修复的上皮细胞生长促进和运动性激活、如在多种器官中血管形成等的形态发生诱导中涉及到HGF。HGF也显示了增殖肝细胞的活性、促进蛋白质合成的活性、改善胆汁郁积的活性、防止由于药物的肾损伤的活性等。以这些事实为依据，期望HGF被用作用于严重的肝炎、肝硬化和在肝中的胆汁郁积的治疗剂。
HGF的mRNA在脑、肾、肺等中合成。HGF显示了对肝细胞、肾小管细胞、上皮细胞等的生长活性。因此，HGF是中胚层细胞生长因子。于是，诱导肝细胞生长因子产生的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐可用作治疗或防止肝炎、严重肝炎、肝硬化、在肝中的胆汁郁积、慢性肾炎、肺炎和创伤的组合物的成分。
依据它的诱导HGF产生的活性可使用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐作为化妆品组合物的活性成分。例如，它作为诱导HGF产生的化妆品组合物是有用途的。因此，可提供具有诱导HGF产生活性的生物学化妆品组合物。
根据常规的方法可将含有本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐的用于诱导生长因子产生的化妆品组合物(例如，诱导HGF产生的化妆品组合物)配制成，例如，洗液、乳状洗液、乳膏、填塞物、沐浴剂、面部清洁剂、沐浴清洁剂、洗发剂、生发油和香波。
本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖、来自硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐的较小分子可被用作抗原。根据常规的方法生产抗体。例如，多克隆抗体可通过用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖、来自硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐的较小分子和佐剂一起免疫如兔的动物制备。而且，单克隆抗体可通过融合黑素瘤细胞和用抗原免疫获得的产生抗体的B细胞、挑选产生目的抗体的杂交瘤和培养细胞制备。这一抗体可用于纯化本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖、来自硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐的较小分子。同样地，此抗体可用于鉴定在海藻中的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。例如，使用识别本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的抗体可轻易地确定在海藻提取物中的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的含量。因此，可有效地制备具有高含量的提取物。而且，识别本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖、来自硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐的较小分子的抗体对于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖、来自硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐的较小分子的抑制受精的作用方式、抑制病毒感染的作用方式、在体内新陈代谢等的分析是有用途的。
此外，通过由本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐获得的较小分子、或寡糖可被用作糖技术试剂。例如，通过使较小分子进行如在JP-B5-65108中描述的吡啶基-(2)-氨化作用以制备较小分子的吡啶基-(2)-氨化产物可用作糖技术试剂的物质是非常有用途的。
实施例
下面的实施例进一步详细地阐明了本发明，但不能解释为限制其范围。
实施例1：硫酸化岩藻半乳聚糖的制备
(1)按下面方法制备硫酸化岩藻半乳聚糖。
使用配有具有1mm直径孔的筛网的碾磨剪切机(Masuko Sangyo)将2kg的干燥的Kjellmaniella crassifolia破碎、在20L的80％的乙醇中在25℃搅拌3小时、过滤并洗涤。结果残渣悬浮于20L的含有50mM氯化钙、100mM氯化钠、10％乙醇和1U含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖的30mM的咪唑缓冲液(pH8.2)中。含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖从如在WO97/26896中所描述的交替单孢菌sp.SN-1009(Alteromonas sp.SN-1009)(保藏于通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，邮编305-8566，保藏号FERM P-15436，保藏日期1996年2月13日，并于1996年11月15日转为国际保藏，保藏号FERM BP-5747)的培养物中获得。悬浮液在25℃搅拌2天后完全失去了由于具有高分子量的含有多糖的硫酸化岩藻糖的高粘度和弹性。通过具有32μm直径孔的不锈钢筛网过滤悬液以从含有多糖的硫酸化岩藻糖中除去较小的分子、然后洗涤。结果残渣悬浮于40L的含有100mM氯化钠、10％乙醇和4g褐藻酸盐裂解酶(Nagase Biochemicals)的磷酸钠缓冲液(pH6.6)中。悬液在25℃搅拌4天，然后离心以获得上清液。使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维以从在上清液的褐藻酸中除去较小分子的超滤装置将上清液浓缩至2L。将浓缩的溶剂交换成含有10％乙醇的100mM氯化钠。将等体积的400mM醋酸钠加入至溶液中。搅拌后，将混合物离心。当在冰上冷却后将1N的盐酸加入至结果上清液中以调节pH至2。通过离心除去形成的沉淀。将1N的氢氧化钠加入至结果上清液中以调节pH至8。通过超滤将溶液浓缩至1L并且将溶剂交换成100mM氯化钠。通过离心除去形成的沉淀。为了除去在结果上清液中的疏水物质进行了下面的过程。将氯化钠以1M的浓度加入到上清液中。将混合物上样至用1M氯化钠平衡的3-L苯基-Cellulofine(SeikagakuCorporation)上并且收集流过的部分。此部分使用超滤装置浓缩、将溶剂交换成20mM氯化钠并且冻干。冻干产品的重量是29.3g。
(2)将15g冻干产品溶于1.5L含有400mM氯化钠和9U的含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖的50mM Tris-盐酸缓冲液中。含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖从如在WO97/26896中所描述的黄杆菌sp.SA-0082(Flavobacterium sp.SA-0082)(保藏于通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，邮编305-8566，保藏日期1995年3月29日，保藏号FERM P-14872，并于1996年2月15日转为国际保藏，保藏号FERM BP-5402)的培养物中获得。将溶液在25℃反应6天然后使用蒸发器浓缩自约300ml。将浓缩液置于具有3500排阻分子量的透析管中并且充分地透析以除去来自硫酸化fucoglucuronomannans的较小分子。将留在透析管中的溶液上样于用50mM氯化钠平衡的4-L DEAE-Cellulofine A-800(Chisso corporation)。用50mM氯化钠充分洗涤后，用50到650mM氯化钠的梯度进行洗脱。用650mM氯化钠进一步地从柱上进行充分的洗脱。收集用650mM氯化钠洗脱的部分作为硫酸化岩藻半乳聚糖部分，使用具有100,000排阻分子量的超滤装置浓缩、将溶剂交换成10mM氯化钠和冻干以获得0.85g的硫酸化岩藻半乳聚糖部分的冻干产品。分析此部分的糖组合物。如在生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，175：595(1948)中所描述的确定岩藻糖的量。
将硫酸化岩藻半乳聚糖的干燥的产品以0.5％的浓度溶于1N的盐酸中。溶液在110℃处理2小时以水解成组成性单糖。使用GlycoTAG(Takara Shuzo)和GlycoTAG试剂盒(Takara Shuzo)将由水解作用产生的单糖的还原末端进行吡啶基-(2)-氨化作用以使用HPLC确定组成性糖的比率。HPLC按下面条件进行。
仪器：L-6200(Hitachi)；
柱：Palpak A型(4.6mm×150mm；Takara Shuzo)；
洗脱液：700mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)∶乙腈＝9∶1；
检测：使用荧光检测器F-1150(Hitachi)在310nm的激发波长和在380nm的发射波长；
流速：0.3ml/分钟；和
柱温：65℃。
如在分析化学，4：330(1962)中所描述的那样确定糖醛酸的量。而且，如在生物或学杂志，84：106(1962)中所描述的那样确定硫酸盐的含量。
结果，硫酸化岩藻半乳聚糖含有以约2∶1的摩尔比作为组成性糖的半乳糖和岩藻糖。在其中基本上不含糖醛酸或其它的中性糖。岩藻糖和硫酸基团的的摩尔比约为1∶2。
(3)测量硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶活性的方法
使用在(2)中获得的硫酸化岩藻半乳聚糖部分测量本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的活性按如下方法。
扼要地，将60μl 50mM盐酸咪唑缓冲液(pH7.5)、4.8μl 2.5％的硫酸化岩藻半乳聚糖部分的溶液、6μl 4M的氯化钠、37.2μl水和12μl本发明的第一个方面的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶混合在一起。在37℃反应3小时后，将反应混合物在100℃处理10分钟。离心后，使用HPLC分析100μl的上清液以确定转化成较小分子的程度。作为对照，制备在相似的条件下通过用溶解本发明的第一个方面的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的缓冲液替代酶和用水替代硫酸化岩藻半乳聚糖部分的反应获得的反应混合物、并且使用HPLC进行相似的分析。
酶的1个单位定义为在上述反应系统中在1分钟内在1μmol的硫酸化岩藻半乳聚糖部分中裂解半乳糖键的酶的量。按照下面的公式计算裂解半乳糖键的量。
{(4.8×1000×2.5/100)MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.012)}＝U/ml4.8×1000×2.5/100：加入到反应系统中的硫酸化岩藻半乳聚糖(μg)；MG：在作为底物的部分中硫酸化岩+藻半乳聚糖的平均分子量；M：反应产物的平均分子量；MG/M)-1：在1摩尔的硫酸化岩藻半乳聚糖中被酶裂解的键的数目；180：反应时间(分钟)；和0.012：酶溶液的体积(ml)。
HPLC按下面条件进行。
仪器：L-6200(Hitachi)；
柱：OHpak SB-806HQ(8×300mm；Showa Denko)；
洗脱液：含有5mM叠氮化钠的50mM氯化钠；
检测：示差折射率检测器(Shodex RI-71，Showa Denko)；
流速：1ml/分钟；和
柱温：25℃。
为了确定反应产物的平均分子量进行了下面的过程。在如上述的HPLC分析一样的相同的条件下分析市场上买得到的分子量已知的普鲁兰(Pullulan)(标准P-82，Showa Denko)。将普鲁兰的分子量和保留时间之间的关系表达成曲线，用其作为确定酶反应产物分子量的标准曲线。
通过测量酶溶液在280nm的吸收确定蛋白质的量。规定含有1mg/ml浓度的蛋白质溶液的吸收为1进行计算。
实施例2：硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用方式的确定
(1)硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的制备
为硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的生产，将黄杆菌sp.(FERM BP-5402)接种至已在120℃灭菌20分钟的包括含有0.1％葡萄糖、1.0％蛋白胨和0.05％酵母提取物(pH7.5)的人造海水(JamarineLaboratory)的600ml培养基中，并且在24℃培养23小时以制备种子培养物。将包括含有0.2％如在下面的实施例3(1)中所描述的从Kjellmaniella crassifolia中制备的含有多糖的硫酸化岩藻糖部分、2.0％蛋白胨、0.01％酵母提取物和0.01％消沫剂(KM70，Shin-EtsuChemical)(pH7.5)的人造海水的20L的培养基置于30L的小型发酵罐中并且在120℃灭菌20分钟。冷却后，将600ml的种子培养物接种至培养基中并以每分钟10L的通气量和125转/分钟的搅拌在24℃培养23小时。培养后，将培养物离心以收集细胞。
将细胞悬于含有0.4M氯化钠的1,200ml的10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中、超声处理并离心以获得细胞提取物。将细胞提取物用相同的缓冲液充分透析并离心以获得上清液。以90％饱和度的终浓度加入硫酸铵至上清液中。将通过离心收集的沉淀溶于150ml的含有50mM氯化钠的10mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中并用相同的缓冲液充分透析。将通过离心获得的上清液上样至用相同的缓冲液平衡的500-ml DEAE-琼脂糖FF柱(Amersham Pharmacia)。用相同的缓冲液洗涤后，接着用50mM至600mM的氯化钠的梯度进行洗脱以收集活性部分。
活性部分用含有0.1M氯化钠的10mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)充分透析、上样至用相同的缓冲液平衡的100-ml DEAE Cellulofine柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用0.1M至0.4M的氯化钠的梯度进行洗脱以收集活性部分。以4M的浓度将氯化钠加入到活性部分中。将此部分上样至用含有4M氯化钠的10mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡的20-ml苯基-Cellulofine柱(Chissocorporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用4M至1M的氯化钠的梯度进行洗脱。用含有1M氯化钠的10mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)进一步进行充分的洗脱以收集活性部分。以3M的浓度将氯化钠加入到活性部分中。将此部分上样至用含有3M氯化钠的10mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡的10-ml苯基-Cellulofine柱(Chissocorporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用3M至0.5M的氯化钠的梯度进行洗脱。用含有0.5M氯化钠的10mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)进一步进行充分的洗脱以收集活性部分。如此获得的纯化的酶被用作硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶。
(2)来自硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子的制备
通过由纯化的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于如在实施例1(2)中描述的硫酸化岩藻半乳聚糖制备较小分子。扼要地，将1.94g硫酸化岩藻半乳聚糖部分溶于含有0.2M氯化钠的25mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中。将如在实施例2(1)中描述的186mU的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶加入其中。混合物在25℃反应6天。使用蒸发器将反应混合物浓缩自80ml并使用Cellulofine GCL-1000柱(ChissoCorporation)(4×90cm)进行分子量分级分离。将相当于15,000或更少的分子量的部分收集以获得来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化的部分。
将来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化的部分的一份使用GlycoTAG(TakaraShuzo)和GlycoTAG试剂盒(TakaraShuzo)进行还原末端吡啶基-(2)-氨化作用。结果吡啶基-(2)-氨化糖通过在2N的盐酸中在100℃处理它们3小时得到水解。使用HPLC检查在还原末端的糖。HPLC按下面条件进行。
仪器：L-6200(Hitachi)；
柱：Palpak A型(4.6×150mm；Takara Shuzo)；
洗脱液：0.7M硼酸盐缓冲液(pH9.0)∶乙腈＝9∶1；
检测：使用荧光检测器(F-1150 Hitachi)在310nm的激发波长和在380nm的发射波长；
流速：0.3ml/分钟；和
柱温：65℃。
结果，只检测到半乳糖。因此，表明在来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化部分中在还原末端的所有的糖都是硫酸化半乳糖或半乳糖。
而且，为了分析在来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化部分中的中性糖组成将在还原末端已经进行过糖分析的样品的一份再一次进行吡啶基-(2)-氨化作用并使用如上所述的HPLC分析。结果，表明来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化部分包括约以2∶1摩尔比的半乳糖和岩藻糖。上述结果表明本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶是内型半乳糖苷酶，其裂解在硫酸化岩藻半乳聚糖中的半乳糖键以产生在其还原末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖。
实施例3
(1)从Kjellmaniella crassifolia制备含有多糖的硫酸化岩藻糖部分。扼要地，使用配有具有1mm直径孔的筛网的碾磨剪切机(Masuko Sangyo)将2kg市场上买得到的的干燥的Kjellmaniellacrassifolia破碎并悬于20L的80％的乙醇中。悬液在25℃搅拌3小时并通过滤纸过滤。将结果残渣悬浮于40L的含有100mM氯化钠的30mM的磷酸钠缓冲液中(pH6.5)。悬液在95℃处理2小时并通过具有106μm直径孔的不锈钢筛网过滤。将200g活性炭、4.5L的乙醇和12,000U的藻酸盐裂解酶(Nagase Biochemicals)加入到滤液中。混合物在25℃搅拌20小时，然后离心。使用使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置将结果上清液浓缩至4L，离心以除去不溶物并使在5℃保持24小时。通过离心除去沉淀。使用超滤装置将结果上清液的溶剂交换成100mM的氯化钠。将溶液冷却至4℃或更低，并且用盐酸调节pH至2.0。通过离心除去形成的沉淀。用氢氧化钠将结果上清液的pH调节至8.0。将上清液浓缩至4L。使用超滤装置将溶剂交换成20mM的氯化钠。通过离心除去溶液中得不溶物。将82ml 50％的乙醇加入到溶液中。将混合物冻干获得76g的来自Kjellmaniella crassifolia的含有多糖的硫酸化岩藻糖部分的干燥产品。
(2)将黄杆菌sp.SA-0082(FERM BP-5402)接种至已在120℃灭菌20分钟的在500-ml的锥形瓶中的包括含有0.2％如在实施例3(1)中所描述的来自Kjellmaniella crassifolia含有多糖的硫酸化岩藻糖部分、1.0％蛋白胨和0.01％酵母提取物(pH7.5)的人造海水的100ml的培养基中，并在24℃振荡培养23小时。培养后，将培养物离心以获得细胞和培养物上清液。
将细胞悬于5ml的含有0.4M氯化钠的10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中、超声处理并离心以获得细胞提取物。
在培养物上清液和细胞提取物中检测到的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的活性分别为2mU/ml培养基和2mU/ml培养基。表明在上述条件下在培养的黄杆菌属的细菌的细胞的内部和外部获得了几乎等量的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶。
实施例4
将在实施例3(1)中获得的7g含有多糖的硫酸化岩藻糖部分溶于700ml的含有50mM氯化钠和10％乙醇的20mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8.0)中。将溶液上样至用相同的缓冲液平衡的5-L DEAE Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用50至1550mM的氯化钠的梯度进行洗脱。收集在550至1550mM的盐浓度洗脱的含有多糖的硫酸化岩藻糖部分。
此部分含有被硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶转化成较小分子的组分，即，在约10％浓度的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖。使用配有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置将此部分脱盐。将溶剂交换为含有200mM氯化钠的20mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8.0)。将600mU的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶加入其中。混合物在25℃反应3天并进行超滤。超滤一直进行到在滤液中含有的糖的量如按照苯酚-硫酸法测量检测不到为止。被本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶转化成较小分子的组分，即本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖可以从含有多糖的硫酸化岩藻糖部分中通过这些步骤除去。
实施例5
(1)来自硫酸化岩藻半乳聚糖(i)的酶消化物的制备
将70g在实施例3中获得的来自Kjellmaniella crassifolia的含有多糖的硫酸化岩藻糖部分溶于含有300mM氯化钠、20mM氯化钙和10％乙醇的20mM的盐酸咪唑缓冲液(pH7.5)中并使用配有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去可以被超滤的物质。使用与上面用于溶解的相同的缓冲液用于超滤。
将5U的从如在WO97/26896中所描述的交替单孢菌sp.SN-1009(FERM BP-5747)的培养物中获得的含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应3天。反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去由含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖转化成较小分子的物质，即，来自岩藻多糖的较小分子。使用与上面用于反应混合物的相同的缓冲液用于超滤。
将20U的从如在WO97/26896中所描述的黄杆菌sp.SA-0082(FERMBP-5402)的培养物中获得的含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应5天。反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去由含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖转化成较小分子的物质，即，来自硫酸化fucoglucuronomannan的较小分子。水被用于超滤，最终将其交换为含有200mM氯化钠的tris-盐酸缓冲液(pH8)。
将2U的如在实施例2(1)中所描述的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应5天。将反应混合物分成两等份。一份使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底超滤由硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶转化成较小分子的物质，即，来自硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子。超滤使用含有50mM氯化钠的10mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)。由此获得的滤液被命名为来自硫酸化岩藻半乳聚糖(i)的酶消化物。
(2)来自硫酸化岩藻半乳聚糖(ii)的酶消化物的制备
将550mU的如在实施例2(1)中所描述的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶加入到在实施例5(1)中均分的混合物的剩余部分中。混合物在25℃反应7天并确定较小分子的转化。反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底超滤来自硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子。超滤使用含有50mM氯化钠的10mM的tris-盐酸缓冲液(pH8.0)。由此获得的滤液被命名为来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化物(ii)。
(3)来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化物(i)的分离和纯化。
使用蒸发器将在实施例5(1)中获得的来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化物(i)浓缩至500ml、使用电透析装置脱盐并上样至用含有10mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)平衡的1-L DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。在用相同的缓冲液洗涤后，用10mM到900mM的氯化钠梯度进行洗脱。每部分收集62ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。用约130mM氯化钠和约220mM氯化钠洗脱的部分构成含有糖的峰。分别收集这些部分并命名为130mM-洗脱部分(i)和220mM-洗脱部分(i)。
使用电透析装置将130mM-洗脱部分(i)脱盐。以50mM的浓度将氯化钠溶于此部分中。将溶液上样至用含有50mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用50至200mM的氯化钠的梯度进行洗脱。每部分收集10ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。用约55mM氯化钠至约75mM氯化钠洗脱的部分构成含有糖的峰。收集用约60mM氯化钠洗脱的部分、用SpeedVac(SAVANT Instruments Inc.)浓缩至2ml、上样至用10％乙醇平衡的200-ml Cellulofine  GCL-25柱(Chisso corporation)、并用相同的缓冲液洗脱。每部分收集2ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。收集构成含有糖的峰的部分并命名为(A)。
另一方面，使用电透析装置将220mM-洗脱部分(i)脱盐。以100mM的浓度将氯化钠溶于此部分中。将溶液上样至用含有100mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)平衡的100-ml DEAE-CellulofineA-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用100至350mM的氯化钠的梯度进行洗脱。每部分收集10ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。收集用约160mM氯化钠洗脱的部分、用SpeedVac(SAVANT Instruments Inc.)浓缩至2ml、上样至用10％乙醇平衡的200-ml  Cellulofine  GCL-25柱(Chissocorporation)、并用相同的缓冲液洗脱。每部分收集2ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。收集构成含有糖的峰的部分并命名为(B)。
(4)来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化物(ii)的分离和纯化
使用蒸发器将如在实施例5(2)中描述的来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化物(ii)浓缩至500ml、使用电透析装置脱盐并上样至用含有10mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)平衡的1-L DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。在用相同的缓冲液洗涤后，用10mM到900mM的氯化钠梯度进行洗脱。每部分收集61ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。用约130mM氯化钠、约220mM氯化钠和约270mM氯化钠洗脱的部分构成含有糖的峰。分别收集这些部分并命名为130mM-洗脱部分(ii)、220mM-洗脱部分(ii)和270mM-洗脱部分(ii)
使用电透析装置将130mM-洗脱部分(ii)脱盐。以20mM的浓度将氯化钠溶于此部分中。将溶液上样至用含有20mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)平衡的200-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用20至150mM的氯化钠的梯度进行洗脱。每部分收集13ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。将用约50mM至约70mM氯化钠洗脱的部分收集、用蒸发器浓缩至30ml、上样至用10％乙醇平衡的1,200-mlCellulofine GCL-25柱(Chisso corporation)、并用相同的缓冲液洗脱。每部分收集10ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。收集构成含有糖的峰的部分。以10mM的浓度将醋酸加入此部分中。用盐酸调节pH至3.5。将氯化钠加入其中以使电导率与含有20mM氯化钠的10mM的醋酸盐缓冲液(pH3.5)相同。将溶液上样至用含有20mM氯化钠的10mM的醋酸盐缓冲液(pH3.5)平衡的30ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用20至120mM的氯化钠的梯度进行洗脱。每部分收集3ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。将用约65mM至约80mM氯化钠洗脱的部分收集、并用水稀释以使电导率与含有40mM氯化钠的10mM的醋酸缓盐冲液(pH3.5)相同。将溶液上样至用含有40mM氯化钠的l0mM的醋酸盐缓冲液(pH3.5)平衡的20ml DEAE-CellulofineA-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用40mM至80mM的氯化钠的梯度进行洗脱。每部分收集3ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。将用约50mM至约65mM氯化钠洗脱的部分收集、用SpeedVac(SAVANT Instruments Inc.)浓缩至2ml、上样至用10％乙醇平衡的200-ml  Cellulofine  GCL-25柱(Chissocorporation)、并用相同的缓冲液洗脱。每部分收集2ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。对构成含有糖的峰的部分的质谱分析表明前部分含有与(A)相同的物质而后面部分基本上不含与(A)相同的物质。收集后面部分并命名为(C)。
另一方面，将水加入到220mM-洗脱部分(ii)中以使电导率与含有100mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液相同。溶液上样至用含有100mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)平衡的200-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。在用相同的缓冲液洗涤后，用100mM到300mM的氯化钠梯度进行洗脱。每部分收集13ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。将用约140mM至约170mM氯化钠洗脱的部分收集、用蒸发器浓缩至30ml、上样至用10％乙醇平衡的1,200-ml  Cellulofine  GCL-25柱(Chissocorporation)、并用相同的缓冲液洗脱。每部分收集10ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。对构成含有糖的峰的收集的部分的质谱分析表明此部分含有与如在实施例5(3)中所描述的(B)相同的物质。
此外，将水加入到270mM-洗脱部分(ii)中以使电导率与含有150mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)相同。溶液上样至用含有150mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)平衡的200-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。在用相同的缓冲液洗涤后，用150mM到300mM的氯化钠梯度进行洗脱。每部分收集12ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。将用约160mM至约180mM氯化钠洗脱的部分收集、用SpeedVac(SAVANT Instruments Inc.)浓缩至2ml、上样至用10％乙醇平衡的200-ml  Cellulofine GCL-25柱(Chisso corporation)、并用相同的缓冲液洗脱。每部分收集2ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。收集包括含有糖的峰的部分并命名为(D)。
实施例6
(1)来自硫酸化岩藻半乳聚糖(iii)的酶消化物的制备
将15g在实施例3中获得的来自Kjellmaniella crassifolia的含有多糖的硫酸化岩藻糖部分溶于含有300mM氯化钠、20mM氯化钙和10％乙醇的20mM的盐酸咪唑缓冲液(pH7.5)中并使用配有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去可以被超滤的物质。使用与用于上面反应混合物的相同的缓冲液用于超滤。将1U的在实施例5(1)中使用的含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应3天。
反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去由含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖转化成较小分子的物质，即，来自岩藻多糖的较小分子。使用与上面用于溶解的相同的缓冲液用于超滤。
将1U的在实施例5(1)中使用的含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应5天。
反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去由含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖转化成较小分子的物质，即，来自硫酸化fucoglucuronomannan的较小分子。含有200mM氯化钠和10％乙醇的10mM盐酸咪唑缓冲液(pH8)被用于超滤。
将600mU的如在实施例2(1)中所描述的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应5天。反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底超滤由硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶转化成较小分子的物质，即，来自硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子。超滤使用含有20mM氯化钠的10％的乙醇。由此获得的滤液被命名为来自硫酸化岩藻半乳聚糖(iii)的酶消化物。
(2)来自硫酸化岩藻半乳聚糖(iii)的酶消化物的分离和纯化
使用电透析装置将在实施例6(1)中获得的来自硫酸化岩藻半乳聚糖(iii)的酶消化物脱盐、使用蒸发器浓缩至50ml并上样至用50mM醋酸铵(pH5.5)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chissocorporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用50mM到4M的醋酸铵梯度进行洗脱。每部分收集10ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。用约420mM至约620mM醋酸铵洗脱的部分构成含有糖的峰。收集这些部分并命名为420mM至620mM洗脱部分。
(3)420mM至620mM洗脱部分的纯化
使用电透析装置将此部分脱盐。将电导率调节至50mM醋酸铵溶液的电导率。将溶液上样至用50mM醋酸铵(pH5.5)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液接着用100mM醋酸铵(pH5.5)洗涤后，用l00mM到800mM的醋酸铵梯度进行洗脱。每部分收集l0ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。收集约440mM到约530mM醋酸铵洗脱的部分。
使用电透析装置将此部分脱盐。将电导率调节至200mM醋酸铵溶液的电导率。将溶液上样至用200mM醋酸铵(pH5.5)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用200mM到700mM的醋酸铵梯度进行洗脱。每部分收集l0ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。收集约420mM到约470mM醋酸铵洗脱的部分。此部分的质谱分析和核磁共振谱(NMR)分析表明此部分含有与在实施例5(3)中所描述的(B)相同的物质。使用API-III质谱仪(Perkin-Elmer Sciex)进行质谱分析。使用核磁共振仪器JNM-α500(Nippon Denshi)进行NMR分析。
(4)来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化物的进一步的酶消化和分离/纯化
由于在实施例6(2)中的除了420mM到620mM-洗脱的部分的部分含有具有相对高分子量的物质，因此再一次用硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶将它们消化。扼要地，收集除了420mM到620mM-洗脱的部分的洗脱部分，并使用电透析装置脱盐。调节溶液组合物至含有10mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)、200mM氯化钠和10％乙醇。将460mU的如在实施例2(1)中描述的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶加入其中并在25℃反应8天。反应混合物使用电透析装置脱盐。将电导率调节至50mM醋酸铵溶液的电导率。将溶液上样至用50mM醋酸铵(pH5.5)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的缓冲液洗涤后，用100mM到1M的醋酸铵梯度进行洗脱。每部分收集10ml的洗脱物。按照苯酚-硫酸法测量每部分的糖含量。分别收集用约180mM到约280mM醋酸铵和约360mM到约430mM醋酸铵洗脱的部分并命名为(E)和(F)。
实施例7：来自硫酸化岩藻半乳聚糖的酶消化物的结构确定
将在实施例5和6中获得的这6个部分(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)使用电透析装置脱盐、冻干、并进行糖组成分析和质谱分析。使用API-III质谱仪(Perkin-Elmer Sciex)进行质谱分析。使用核磁共振仪器JNM-α500(Nippon Denshi)进行NMR分析。按照常规方法在重水交换后将样品进行结构分析。使用HMBC方法，1H-检测的异核多键连通性的方法，分析组成性糖的键。DQF-COSY方法和HOHAHA方法被用于在1H-NMR中的鉴定。HSQC方法被用于在13C-NMR中的鉴定。
(1)较小分子(A)的物理性质
将质谱分析和在NMR中的鉴定结果显示如下。在图3、4和5中分别阐明了来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(A)的1H-NMR谱、13C-NMR谱和质谱。图3是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(A)的1H-NMR谱的图形。图4是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(A)的13C-NMR谱的图形。图5是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(A)的质谱的图形。在图3和4中，纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。在图5中，纵轴代表相对强度(％)和横轴代表m/z值。分子量：632MSm/z  653.2[M＋Na+－2H+]-，315.0[M－2H+]2- 1H-NMR(D2O)δ；5.15(1H，d，J＝4.3Hz，F1-1-H)，4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F2-1-H)，4.53(1H，d-d，J＝10.4，4.3Hz，F1-3-H)，4.49(1H，d，J＝7.6Hz，G1-1-H)，4.46(1H，d-d，J＝10.7，3.1Hz，F2-3-H)，4.36(1H，q，J＝6.7Hz，F2-5-H)，4.14(1H，q，J＝6.7Hz，F1-5-H)，4.09(1H，d，J＝2.4Hz，F1-4-H)，4.03(1H，d，J＝3.1Hz，F2-4-H)，3.97(1H，d-d，J＝10.4，4.3Hz，F1-2-H)，3.90(1H，br-s，G1-4-H)，3.81(1H，d-d，J＝10.7，3.7Hz，F2-2-H)，3.59(1H，m，G1-3-H)，3.59(1H，m，G1-5-H)，3.59(2H，m，G1-6-H)，3.56(1H，m，G1-2-H)，1.19(3H，d，J＝6.7，F1-6-H)，1.14(3H，d，J＝6.7，F2-6-H)13C-NMR(D2O)
在13C-NMR分析中各自碳的化学位移值列于表1中。
表1
碳位置 13C-NMR化学位移值(ppm)
G1-1 97.1
G1-2 71.9
G1-3 81.8
G1-4 69.6
G1-5 76.0
G1-6 61.8
F1-1 101.6
F1-2 67.4
F1-3 77.2
F1-4 78.2
F1-5 68.9
F1-6 16.4
F2-1 100.8
F2-2 67.4
F2-3 78.5
F2-4 71.3
F2-5 67.9
F2-6 16.2
糖组成：L-岩藻糖∶D-半乳糖＝2∶1硫酸基团：2个分子
在1H-NMR中峰鉴定的数如在下面公式(V)中所显示的那样。
Figure A0080415700411
(2)较小分子(B)的物理性质
将质谱分析和在NMR中的鉴定结果显示如下。在图6、7和8中分别阐明了来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(B)的1H-NMR谱、13C-NMR谱和质谱。图6是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(B)的1H-NMR谱的图形。图7是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(B)的13C-NMR谱的图形。图8是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(B)的质谱的图形。在图6和7中，纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。在图8中，纵轴代表相对强度(％)和横轴代表m/z值。分子量：1116MSm/z 1181.2[M＋3Na+－4H+]-，579.0[M＋2Na+－4H+]2-，378.6[M＋Na+-4H+]3- 1H-NMR(D2O)δ；5.20(1H，d，J＝4.3Hz，F1-1-H)，4.95(1H，d，J＝3.7Hz，F2-1-H)，4.64(1H，与HOD重叠，G1-1-H)，4.60(1H，d，J＝7.9Hz，G2-1-H)，4.55(1H，d-d，J＝10.7，1.8Hz，F1-3-H)，4.47(1H，m，F2-3-H)，4.45(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.42(1H，br-s，G2-4-H)，4.38(1H，q，J＝6.4Hz，F2-5-H)，4.28(1H，m，G2-3-H)，4.20(1H，m，G3-3-H)，4.17(1H，br-s，G3-4-H)，4.14(1H，q，J＝6.4Hz，F1-5-H)，4.11(1H，d，J＝1.8Hz，F1-4-H)，4.06(1H，d，J＝1.8Hz，F2-4-H)，4.01(1H，m，G2-6-H)，3.97(1H，d-d，J＝10.7，4.3Hz，F1-2-H)，3.90(1H，br-s，G1-4-H)，3.88(1H，m，G2-5-H)，3.83(1H，m，G2-6-H)，3.82(1H，m，F2-2-H)，3.68(1H，m，G1-3-H)，3.66(1H，m，G2-2-H)，3.65(2H，m，G3-6-H)，3.62(1H，m，G3-5-H)，3.61(2H，m，G1-6-H)，3.59(1H，m，G1-2-H)，3.55(1H，m，G1-5-H)，3.54(1H，m，G3-2-H)，1.21(3H，d，J＝6.4，F1-6-H)，1.15(3H，d，J＝6.4，F2-6-H)13C-NMR(D2O)
在13C-NMR分析中各自碳的化学位移值列于表2中。
表2
碳位置 13C-NMR  化学位移值  (ppm)
G1-1  103.4
G1-2  71.4
G1-3  81.0
G1-4  69.6
G1-5  75.6
G1-6  61.6
G2-1  97.0
G2-2  70.3
G2-3  80.9
G2-4  73.9
G2-5  74.3
G2-6  70.7
G3-1  103.8
G3-2  69.6
G3-3  81.0
G3-4  67.4
G3-5  75.5
G3-6  61.7
F1-1  101.3
F1-2  67.4
F1-3  77.2
F1-4  78.2
F1-5  68.8
F1-6  16.3
F2-1  100.8
F2-2  67.4
F2-3  78.5
F2-4  71.2
F2-5  67.7
F2-6  16.2
糖组成：L-岩藻糖∶D-半乳糖＝2∶3硫酸基团：4个分子
在1H-NMR中峰鉴定的数如在下面公式(VI)中所显示的那样。
Figure A0080415700441
(3)较小分子(C)的物理性质
将质谱分析和在NMR中的鉴定结果显示如下。在图9、10和11中分别阐明了来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(C)的1H-NMR谱、13C-NMR谱和质谱。图9是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(C)的1H-NMR谱的图形。图10是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(C)的13C-NMR谱的图形。图11是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(C)的质谱的图形。在图9和10中，纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。在图11中，纵轴代表相对强度(％)和横轴代表m/z值。分子量：502MSm/z  523[M＋Na+－2H+]-，250[M－2H+]2- 1H-NMR(D2O)δ4.57(1H，d，J＝7.9Hz，G1-1-H)，4.43(1H，d，J＝7.9Hz，G2-1-H)，4.20(1H，br-s，G1-3-H)，4.20(1H，br-s，G1-4-H)，4.20(1H，br-s，G2-3-H)，4.15(1H，br-s，G2-4-H)，3.95(1H，m，G1-6-H)，3.82(1H，m，G1-5-H)，3.80(1H，m，G1-6-H)，3.63(2H，m，G2-6-H)，3.62(1H，m，G2-5-H)，3.55(1H，m，G2-2-H)，3.50(1H，m，G1-2-H)13C-NMR(D2O)
在13C-NMR分析中各自碳的化学位移值列于表3中。
表3
碳位置 13C-NMR  化学位移值  (ppm)
G1-1  96.7
G1-2  70.4
G1-3  80.7
G1-4  67.6
G1-5  74.0
G1-6  69.7
G2-1  103.4
G2-2  69.4
G2-3  80.7
G2-4  67.4
G2-5  75.3
G2-6  61.4
糖组成：  D-半乳糖硫酸基团：2个分子
在1H-NMR中峰鉴定的数如在下面公式(VII)中所显示的那样。
Figure A0080415700461
(4)较小分子(D)的物理性质
将质谱分析和在NMR中的鉴定结果显示如下。在图12、13和14中分别阐明了来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(D)的1H-NMR谱、13C-NMR谱和质谱。图12是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(D)的1H-NMR谱的图形。图13是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(D)的13C-NMR谱的图形。图14是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(D)的质谱的图形。在图12和13中，纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。在图14中，纵轴代表相对强度(％)和横轴代表m/z值。分子量：1358MSm/z  711.2[M＋3Na+－5H+]2-，466.6[M＋2Na+－5H+]3-，344.2[M＋Na+－5H+]4- 1H-NMR(D2O)δ；5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F1-1-H)，4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F2-1-H)，4.62(1H，与HOD重叠，G1-1-H)，4.59(1H，与HOD重叠，G2-1-H)，4.54(1H，d-d，J＝10.6，2.7Hz，F1-3-H)，4.46(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.46(1H，m，F2-3-H)，4.41(1H，br-s，G2-4-H)，4.41(1H，d，J＝7.6Hz，G4-1-H)，4.37(1H，q，J＝6.4Hz，F2-5-H)，4.27(1H，m，G2-3-H)，4.24(1H，br-s，G3-4-H)，4.21(1H，m，G3-3-H)，4.19(1H，m，G4-3-H)，4.15(1H，br-s，G4-4-H)，4.13(1H，q，J＝6.7Hz，F1-5-H)，4.09(1H，d，J＝2.7Hz，F1-4-H)，4.04(1H，d，J＝2.8Hz，F2-4-H)，3.98(1H，m，G2-6-H)，3.96(1H，d-d，J＝10.6，4.3Hz，F1-2-H)，3.93(1H，m，G3-6-H)，3.88(1H，br-s，G1-4-H)，3.86(1H，m，G2-5-H)，3.81(1H，m，G2-6-H)，3.81(1H，m，F2-2-H)，3.80(1H，m，G3-5-H)，3.80(1H，m，G3-6-H)，3.66(1H，m，G1-3-H)，3.65(1H，m，G2-2-H)，3.64(1H，m，G1-6-H)，3.64(1H，m，G4-6-H)，3.61(1H，m，G4-5-H)，3.58(1H，m，G1-2-H)，3.56(1H，m，G1-6-H)，3.56(1H，m，G4-6-H)，3.55(1H，m，G4-2-H)，3.54(1H，m，G1-5-H)，3.54(1H，m，G3-2-H)，1.20(3H，d，J＝6.7，F1-6-H)，1.14(3H，d，J＝6.4，F2-6-H)13C-NMR(D2O)
在13C-NMR分析中各自碳的化学位移值列于表4和5中。
表4
碳位置 13C-NMR  化学位移值  (ppm)
G1-1  103.4
G1-2  71.4
G1-3  80.9
G1-4  69.5
G1-5  75.6
G1-6  61.7
G2-1  97.0
G2-2  70.7
G2-3  80.9
G2-4  73.8
G2-5  74.1
G2-6  70.8
G3-1  103.7
G3-2  69.5
G3-3  80.8
G3-4  67.4
G3-5  73.6
G3-6  69.0
G4-1  103.6
G4-2  69.5
G4-3  81.1
G4-4  67.7
G4-5  75.5
G4-6  61.7
表5(续表4)
碳位置 13C-NMR  化学位移值  (ppm)
F1-1  101.4
F1-2  67.4
F1-3  77.1
F1-4  78.2
F1-5  68.8
F1-6  16.3
F2-1  100.8
F2-2  67.4
F2-3  78.4
F2-4  71.2
F2-5  67.8
F2-6  16.2
糖组成：L-岩藻糖∶D-半乳糖＝2∶4硫酸基团：5个分子
在1H-NMR中峰鉴定的数如在下面公式(VIII)中所显示的那样。
(5)较小分子(E)的物理性质
将质谱分析和在NMR中的鉴定结果显示如下。在图15、16和17中分别阐明了来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(E)的1H-NMR谱、13C-NMR谱和质谱。图15是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(E)的1H-NMR谱的图形。图16是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(E)的13C-NMR谱的图形。图17是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(E)的质谱的图形。在图15和16中，纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。在图17中，纵轴代表相对强度(％)和横轴代表m/z值。分子量：1036MSm/z 528.0[M＋Na+－3H+]2-，344.0[M－3H+]3- 1H-NMR(D2O)δ；5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F1-1-H)，4.87(1H，d，J＝3.7Hz，F2-1-H)，4.63(1H，与HOD重叠，G1-1-H)，4.59(1H，d，J＝7.9Hz，G2-1-H)，4.53(1H，d-d，J＝10.7，1.8Hz，F1-3-H)，4.44(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.40(1H，br-s，G2-4-H)，4.32(1H，q，J＝6.4Hz，F2-5-H)，4.27(1H，m，G2-3-H)，4.19(1H，m，G3-3-H)，4.16(1H，br-s，G3-4-H)，4.12(1H，q，J＝6.4Hz，F1-5-H)，4.06(1H，d，J＝1.8Hz，F1-4-H)，3.99(1H，m，G2-6-H)，3.88(1H，br-s，G1-4-H)，3.88(1H，d-d，J＝10.7，4.3Hz，F1-2-H)，3.86(1H，m，G2-5-H)，3.81(1H，m，G2-6-H)，3.81(1H，m，F2-3-H)，3.69(1H，d，J＝1.8Hz，F2-4-H)，3.66(1H，m，G1-3-H)，3.65(1H，m，G2-2-H)，3.64(1H，m，F2-2-H)，3.63(2H，m，G1-6-H)，3.61(1H，m，G3-5-H)，3.61(2H，m，G3-6-H)，3.60(1H，m，G1-2-H)，3.53(1H，m，G1-5-H)，3.53(1H，m，G3-2-H)，1.19(3H，d，J＝6.4，F1-6-H)，1.12(3H，d，J＝6.4，F2-6-H)13C-NMR(D2O)
在13C-NMR分析中各自碳的化学位移值列于表6中。
表6
碳位置 13C-NMR  化学位移值  (ppm)
G1-1  103.2
G1-2  71.2
G1-3  80.3
G1-4  69.3
G1-5  75.4
G1-6  61.3
G2-1  96.7
G2-2  70.4
G2-3  80.8
G2-4  73.7
G2-5  74.0
G2-6  70.6
G3-1  103.5
G3-2  69.4
G3-3  80.8
G3-4  67.4
G3-5  75.2
G3-6  61.5
F1-1  101.1
F1-2  67.3
F1-3  76.9
F1-4  77.8
F1-5  68.5
F1-6  16.1
F2-1  100.6
F2-2  69.2
F2-3  69.8
F2-4  72.7
F2-5  67.7
F2-6  16.0
糖组成：L-岩藻糖∶D-半乳糖＝2∶3硫酸基团：3个分子
在1H-NMR中峰鉴定的数如在下面公式(IX)中所显示的那样。
(6)较小分子(F)的物理性质
将质谱分析和在NMR中的鉴定结果显示如下。在图18、19和20中分别阐明了来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(F)的1H-NMR谱、13C-DEPT-135°谱和质谱。图18是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(F)的1H-NMR谱的图形。图19是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(F)的13C-DEPT-135°谱的图形。图20是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子(F)的质谱的图形。在图18和19中，纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。在图20中，纵轴代表相对强度(％)和横轴代表m/z值。分子量：1278MSm/z  660.0[M＋2Na+－4H+]2-，432.0[M＋Na+－4H+]3-，318.2[M-4H+]4- 1H-NMR(D2O)δ；5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F1-1-H)，4.87(1H，d，J＝3.8Hz，F2-1-H)，4.61(1H，与HOD重叠，G1-1-H)，4.59(1H，J＝7.9HzG2-1-H)，4.53(1H，d-d，J＝10.6，2.7Hz，F1-3-H)，4.46(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.42(1H，d，J＝7.6Hz，G4-1-H)，4.41(1H，br-s，G2-4-H)，4.32(1H，q，J＝6.4Hz，F2-5-H)，4.27(1H，m，G2-3-H)，4.24(1H，br-s，G3-4-H)，4.20(1H，m，G3-3-H)，4.20(1H，m，G4-3-H)，4.16(1H，br-s，G4-4-H)，4.12(1H，q，J＝6.7Hz，F1-5-H)，4.06(1H，d，J＝2.7Hz，F1-4-H)，3.98(1H，m，G2-6-H)，3.94(1H，m，G3-6-H)，3.89(1H，d-d，J＝10.6，4.3Hz，F1-2-H)，3.88(1H，br-s，G1-4-H)， 3.86(1H，m，G2-5-H)，3.86(1H，m，G2-6-H)，3.82(1H，m，F2-3-H)，3.80(1H，m，G3-5-H)，3.80(1H，m，G3-6-H)，3.69(1H，d，J＝2.8，F2-4-H)，3.66(1H，m，G1-3-H)，3.65(2H，m，G1-6-H)，3.65(2H，m，G4-6-H)，3.64(1H，m，G2-2-H)，3.64(1H，m，F2-2-H)，3.62(1H，m，G4-5-H)，3.59(1H，m，G1-2-H)，3.54(1H，m，G1-5-H)，3.54(1H，m，G3-2-H)，3.54(1H，m，G4-2-H)，1.19(3H，d，J＝6.7，F1-6-H)，1.12(3H，d，J＝6.4，F2-6-H)13C-NMR(D2O)
在13C-NMR分析中各自碳的化学位移值列于表7和8中。
表7
碳位置 13C-NMR  化学位移值  (ppm)
G1-1  103.2
G1-2  71.2
G1-3  80.4
G1-4  69.3
G1-5  75.3
G1-6  61.3
G2-1  96.7
G2-2  70.4
G2-3  80.5
G2-4  73.7
G2-5  73.8
G2-6  70.5
G3-1  103.5
G3-2  69.2
G3-3  80.5
G3-4  67.2
G3-5  73.4
G3-6  68.8
G4-1  103.4
G4-2  69.2
G4-3  80.8
G4-4  67.4
G4-5  75.3
G4-6  61.3
表8(续表7)
碳位置 13C-NMR  化学位移值  (ppm)
F1-1  101.0
F1-2  67.3
F1-3  76.9
F1-4  77.7
F1-5  68.5
F1-6  16.0
F2-1  100.5
F2-2  69.1
F2-3  69.7
F2-4  72.7
F2-5  67.7
F2-6  15.9
糖组成：L-岩藻糖∶D-半乳糖＝2∶4硫酸基团：4个分子
在1H-NMR中峰鉴定的数如在下面公式(X)中所显示的那样。
Figure A0080415700551
实施例8
(1)本发明硫酸化岩藻半乳聚糖主要结构的分析
为了确定如在实施例1(2)中制备的硫酸化岩藻半乳聚糖部分的全部结构和硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的裂解位点进行了NMR分析。
在NMR中的鉴定显示如下。在图21、22和23中分别阐明了本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的1H-NMR谱、13C-NMR谱和红外吸收(IR)谱。图21是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的1H-NMR谱的图形。图22是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的13C-NMR谱的图形。图23是阐明来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的红外吸收谱的图形。在图21和22中，纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。在图23中，纵轴代表透射率(％)和横轴代表波数(cm-1)。1H-NMR分析和13C-NMR分析的结果列于表9和10中。
表9
  碳位置   化学位移值  (ppm)13C-NMR                1H-NMR
G1-1  103.4  4.63
G1-2  71.3  3.61
G1-3  80.8  3.67
G1-4  69.6  3.89
G1-5  75.6  3.57
G1-6  61.7  3.62，3.68
G2-1  103.7  4.45
G2-2  69.6  3.56
G2-3  80.8  4.32
G2-4  74.1  4.44
G2-5  74.1  3.87
G2-6  71.3  3.83，3.97
G3-1  103.7  4.45
G3-2  69.6  3.56
G3-3  80.8  4.23
G3-4  67.4  4.24
G3-5  74.1  3.82
G3-6  69.6  3.85，3.99
G4-1  103.7  4.45
G4-2  69.6  3.56
G4-3  80.8  4.23
G4-4  67.4  4.17
G4-5  74.1  3.82
表10(续表9)
  碳位置   化学位移值  (ppm)13C-NMR                 1H-NMR
G4-6  68.8  4.07，4.17
F1-1  101.5  5.20
F1-2  67.4  3.97
F1-3  77.1  4.58
F1-4  78.5  4.11
F1-5  68.8  4.14
F1-6  16.3  1.21
F2-1  100.8  4.95
F2-2  67.4  3.82
F2-3  78.5  4.50
F2-4  71.3  4.05
F2-5  67.8  4.39
F2-6  16.2  1.15
以如在表9和10中显示的鉴定为依据，表明本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的主要的主链是在实施例7(4)中的化合物(D)，并且本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖具有化合物被重复地结合的结构。在重复结构之间的键是如在下面公式(XIII)中所显示的半乳糖G2到半乳糖G4位置6的β-键。因此，表明硫酸化岩藻半乳聚糖具有如下所示的主要主链的重复结构。
而且，以本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖化学结构和来自本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子为依据，表明本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶是降解在硫酸化岩藻半乳聚糖中在硫酸化D-半乳糖或半乳糖和硫酸化D-半乳糖或半乳糖之间的β1-6和β1-4键的酶endowisely。此外，本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖的平均分子量约为130,000，其具有如在实施例1(3)中所描述的条件下测量的从约10,000至约200,000的分子量分布的。
(2)本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖诱导HGF产生的活性
如在实施例1(2)中所描述的那样获得的本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖诱导HGF产生的活性得到确定。诱导HGF产生的活性按下面方法测量。扼要地，将以1×105个细胞/ml浓度的500μl的在含有10％胎牛血清的DME培养基中的含有MRC-5细胞(CCL171；DainipponPharmaceutical，code.02-021)的悬液置于48-孔细胞培养板的每个孔中并将板在5％CO2存在下在37℃孵育24小时。然后将培养基用含有1％胎牛血清的DM培养基替换。将作为样品的如在实施例1(2)中所描述的那样获得的硫酸化岩藻半乳聚糖以1、10或100的终浓度加入到孔中。将板进一步孵育24小时。然后使用人肝细胞生长因子(HGF)酶连免疫吸附测定定量试剂盒(Quantikine Human Hepatocyte GrowthFactor(HGF)ELISA Kit)(Funakoshi，Code.RS-0641-00)  测量在收集的培养基中HGF的量。将与样品等量的蒸馏水加入用于对照。将对照的产生的量，4.3ng/ml，定义为100％。将样品加入的组产生的HGF的量列于表11中。所有的实验都重复两次。显示了平均值。
表11
      浓度                             HGF产生的增加
    (μg/ml)                                (％)
        1                                   194
       10                                   355
      100                                   429对照产生的HGF的量为4.3ng/ml
如在表11中所示，证实了本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖诱导HGF的产生，因此本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖可用作HGF产生的诱导物。
实施例9
(1)将70g在实施例3中获得的来自Kjellmaniella crassifolia的含有多糖的硫酸化岩藻糖部分溶于含有300mM氯化钠和10％乙醇的20mM的盐酸咪唑缓冲液(pH7.5)中并使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去可以被超滤的任何物质。使用与上面用于溶解的相同的缓冲液用于超滤。
将20U的从如在WO97/26896中所描述的黄杆菌sp.SA-0082(FERMBP-5402)的培养物中获得的含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应5天。反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去由含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖转化成较小分子的物质，即，来自硫酸化fucoglucuronomannan的较小分子。水被用于超滤，最终将其交换成为含有200mM氯化钠的10mM的盐酸咪唑缓冲液(pH8)。
将2U的如在实施例2(1)中所描述的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应5天。反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去由硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶转化成较小分子的物质，即，来自硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子。使用与上面用于反应混合物的相同的缓冲液用于超滤。
以20mM的终浓度将氯化钙和5U的从如在WO97/26896中所描述的交替单孢菌sp.SN-1009(FERM BP-5747)的培养物中获得的含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖加入到在超滤后保留的溶液中。混合物在25℃反应3天。反应混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以彻底除去由含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖转化成较小分子的物质。水被用于超滤。检测了包含在由此获得的滤液中的来自含有多糖的硫酸岩藻糖的物理和化学性质。
(2)收集在上面(1)中获得的滤液并使用配有具有3000排阻分子量的中空纤维的超滤装置进行超滤以从非滤液中分离滤液。
使用旋转蒸发器将滤液浓缩至约3L并离心以获得上清液。使用配有具有300排阻分子量的膜的电透析装置将上清液脱盐。以0.1M的终浓度将醋酸钙加入到脱过盐的溶液中。离心除去形成的沉淀。将结果上清液上样至用50mM醋酸钙平衡的DEAE-Gellulofine柱(树脂体积：4L)。在用50mM醋酸钙和50mM氯化钠充分洗涤后，用50mM至800mM氯化钠的梯度进行洗脱。每部分收集500ml的洗脱物。根据纤维素醋酸膜电泳方法[分析化学(Analytical Biochemistry)，37：197-202(1970)]分析收集的部分，并且发现用0.4M氯化钠洗脱的部分(在下文中称作0.4M-洗脱的部分)是均一的。另外，用0.6M氯化钠洗脱的部分(在下文中称作0.6M-洗脱的部分)同样地由电泳确定几乎是均一的。
将0.4M-洗脱的部分浓缩至150ml。以4M的浓度将氯化钠加入其中。将结果溶液上样至用4M氯化钠平衡的苯基-Cellulofine柱(树脂体积：200ml)。用4M氯化钠充分洗涤后，收集含有未吸附的硫酸化糖的部分并使用配有具有300排阻分子量的膜的电透析装置脱盐获得505ml的脱盐溶液。
将如此获得的40ml的脱盐溶液上样至用含有10％乙醇的0.2M的氯化钠平衡Cellulofine GCL-90柱(4.1cm×87cm)进行凝胶过滤。每个部分收集9.2ml的洗脱物。
按照苯酚-硫酸法[分析化学，28：350(1956)]测量每部分的总糖含量。
硫酸化糖形成一个峰。收集在峰的中间部分的部分，使用配有具有300排阻分子量的膜的电透析装置脱盐并冻干获得112mg的本发明的硫酸化糖的干品。将干品的一份进行糖组成分析和质谱分析。另外，在按照常规方法交换成重水后将l0mg的干品进行NMR分析。
糖组成分析的结果表明0.4M-洗脱的部分含有包含岩藻糖的硫酸化糖。
使用API-III质谱仪(Perkin-Elmer Sciex)的硫酸化糖的质谱分析的结果显示在图24中。分析结果显示如下。图24是显示了硫酸化糖质谱分析结果的的图形。纵轴代表相对强度(％)和横轴代表m/z值。分子量被确定是2264±1表明所有的硫酸基团都形成钠盐。硫酸化糖只含有岩藻糖作为它的组成性糖。因此，表明硫酸化糖是将7个分子岩藻糖和12个分子的硫酸基团结合的糖，并且具有2265的理论上的分子量表明所有的硫酸基团都形成钠盐。
可鉴定定义本物质为M的在图24中主要的信号如下。
m/z 1109.05---[M-2Na+]2-    (理论值：1109.5)
     731.45---[M-3Na+]3-    (理论值：732)
     542.75---[M-4Na+]4-    (理论值：543.25)
     430.05---[M-5Na+]5-    (理论值：430)
因此，本物质是包含7个分子岩藻糖和12个分子的硫酸基团的寡糖。
接着为了分析岩藻糖的键和确定硫酸基团连接的位置使用核磁共振仪器JNM-α500(Nippon Denshi)进行了NMR分析。使用HMBC方法，用于异核键的1H-检测的方法，分析组成性糖的键。DQF-COSY方法和HOHAHA方法被用于在1H-NMR中的鉴定。HSQC方法被用于在13C-NMR中的鉴定。
在NMR中鉴定的结果显示在下面。在图25和26中分别阐明了在0.4M-洗脱的部分中的硫酸化糖的1H-NMR谱和13C-NMR谱。表示了在1H-NMR中假定二氧六环的化学位移值为3.53ppm的化学位移值。表示了在13C-NMR中假定二氧六环的化学位移值为66.5ppm的化学位移值。两次测量都在60℃进行。图25是阐明在0.4M-洗脱的部分中的硫酸化糖的1H-NMR谱的图形。图26是阐明在0.4M-洗脱的部分中的硫酸化糖的13C-NMR谱的图形。在图25和26中，纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。1H-NMR分析和13C-NMR分析的结果列于表12和13中。
表12
  碳位置   化学位移值  (ppm)13C-NMR                 1H-NMR
A-1  89.3  5.30
A-2  75.4  4.30
A-3  73.9  4.17
A-4  78.6  4.67
A-5  67.5  4.14
A-6  15.3  1.12
B-1  98.3  5.23
B-2  74.5  4.33
B-3  75.9  4.18
B-4  80.6  4.72
B-5  68.0  4.10
B-6  15.9  1.08
C-1  98.9  5.18
C-2  73.6  4.35
C-3  70.9  4.32
C-4  77.5  4.62
C-5  66.9  4.24
C-6  16.0  1.11
D-1  89.3  5.16
D-2  73.9  3.98
D-3  74.2  4.16
D-4  73.0  4.64
D-5  70.6  4.25
D-6  13.1  1.34
表13(续表12)
  碳位置   化学位移值  (ppm)13C-NMR                 1H-NMR
E-1  97.1  5.20
E-2  73.0  4.37
E-3  69.9  4.17
E-4  77.4  4.65
E-5  67.5  4.21
E-6  15.8  1.15
F-1  94.6  5.19
F-2  74.8  4.27
F-3  66.5  4.18
F-4  81.3  4.49
F-5  66.3  4.27
F-6  15.8  1.06
G-1  99.2  5.09
G-2  65.6  3.78
G-3  77.9  4.36
G-4  70.1  3.97
G-5  66.7  3.96
G-6  15.4  1.04
在NMR中峰鉴定的数如在下面公式(XV)中所显示的那样。
以这些结果为依据，表明本物质是下面公式(XVI)的硫酸化糖。
(3)将如在实施例9(2)中所描述的来自DEAE-Cellulofine的0.6M-洗脱的部分如上面所描述的用于0.4M-洗脱的部分的那样纯化以获得冻干产品。
使用HPLC的产品的分析表明此产品是比包含在0.4M-洗脱的部分中的产品具有更高分子量的硫酸化糖。产品的NMR分析提供了与用0.4M-洗脱的部分获得的几乎相同的谱。
在图27中阐明了0.6M-洗脱的部分的1H-NMR谱。使用重水作为溶剂。表示了在1H-NMR中假定二氧六环的化学位移值为3.53ppm的化学位移值。测量在60℃进行。图27是阐明在0.6M-洗脱的部分的1H-NMR谱的图形。纵轴代表信号强度和横轴代表化学位移值(ppm)。
结果有力地暗示0.6M-洗脱的部分具有将0.4M-洗脱的部分的几个分子结合的结构。当使用HPLC分析用如在实施例9(1)中所描述的通过用含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖进一步消化0.6M-洗脱的部分获得的产物时，许多反应产物在与在如在实施例9(2)中所描述的来自DEAE-Cellulofine的0.4M-洗脱的部分中硫酸化糖相同的位置得到洗脱。
HPLC按如下条件进行。
柱：Shodex SB802.5(Showa Denko)；
柱温：25℃。
洗脱液：含有5mM叠氮化钠的50mM氯化钠；
检测：示差折射率检测器Shodex RI-71。
通过使用普鲁兰作为标准的凝胶过滤测量了0.6M-洗脱的部分和0.4M-洗脱的部分的分子量。结果，表明以普鲁兰的分子量为依据0.4M-洗脱的部分具有约8500的分子量，而以普鲁兰的分子量为依据0.6M-洗脱的部分具有约26000的分子量，显示了0.6M-洗脱的部分是在0.4M-洗脱的部分中硫酸化糖的三聚体。而且0.6M-洗脱的部分的1H-NMR谱的详细的分析表明每个重复的庚糖通过α-(1→3)键结合于在公式(XV)中岩藻糖F的3位。而且，按照上述方法从来自含有多糖的硫酸化岩藻糖的较小分子中获得了(XVI)的硫酸化糖的五聚体，即，下面通式(XIV)的硫酸化糖其中n是5。
Figure A0080415700661
其中R是H或OSO3H。
如上面所描述的，证实了通过用含有多糖-U-消化酶的硫酸化岩藻糖和本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶处理从如Kjellmaniellacrassifo1ia的褐藻获得的含有多糖的硫酸化岩藻糖获得了通过含有多糖-F-消化酶的硫酸化岩藻糖的作用转化成较小分子的和含有下面通式的硫酸化糖作为组成性糖的基本成分的硫酸化多糖。在pH6-8、在95℃约2小时的提取条件下如同按照在实施例1(3)中所描述的方法测量的硫酸化多糖的平均分析量约为200,000(分子量分布：约10,000至约1000,000)。在pH6-8、在25℃约24小时的提取条件下平均分子量约为13,000,000(分子量分布：约100,000至约20,000,000)。
产业应用性
本发明提供了来自硫酸化岩藻半乳聚糖的硫酸化岩藻半乳聚糖和较小分子，其可作为用于糖技术或HGF产生诱导物的试剂。本发明也提供了新的可用于结构分析和硫酸化岩藻半乳聚糖消化的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶和来自硫酸化岩藻半乳聚糖的较小分子的可再生的产品。本发明进一步提供了用于生产酶的方法。本发明也提供了使用本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶选择性地从含有多糖的硫酸化岩藻糖的混合物中除去的硫酸化岩藻半乳聚糖的方法。而且，本发明提供了通过本发明的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶与其它含有多糖消化酶的硫酸岩藻糖结合使用获得的新的硫酸化糖。

Claims (5)

1.具有下面化学和物理性质的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐：
(1)含有摩尔比为1∶1至6∶1的半乳糖和岩藻糖作为组成性糖；
(2)含有通式(XI)的硫酸化糖作为组成性糖的基本成分；其中R是H或OSO3H；和
(3)由硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶转化成较小分子以产生至少一种选自通式(I)至(IV)的化合物：
Figure A0080415700031
Figure A0080415700041
其中R是H或SO3H。
2.具有选自通式(II)、(III’)和(IV)的化学结构的糖或其盐： 其中R是H或SO3H。
3.具有下面化学和物理性质的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶：
(1)作用于含有摩尔比为1∶1至6∶1的半乳糖和岩藻糖作为组成性糖的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐以转化硫酸化岩藻半乳聚糖成较小分子并产生在其还原末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖；
(2)具有约7到9的最适pH；和
(3)具有约25到45℃的最适温度。
4.用于从硫酸化岩藻半乳聚糖生产较小分子的方法，其特征在于此方法包括由权利要求3的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶作用于得自褐藻的硫酸化岩藻半乳聚糖或其盐并获得较小分子。
5.用于生产权利要求3的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的方法，其特征在于此方法包括培养能产生权利要求3的硫酸化岩藻半乳聚糖消化酶的黄杆菌属的细菌和从培养物中收集该酶。
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